KR100644078B1 - 양막과 생분해성 고분자로 구성된 이식용 진피대체물,이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐 등의 생분해성 고분자와 생체 소재인 양막으로 구성된 진피대체물 및 그의 제조와 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 태반으로부터 양막을 분리하여 이를 생체재료로 널리 사용되는 생분해성 고분자에 상호 부착 또는 삽입한 복합구조물 형태의 진피대체물을 제공한다. 본 발명의 진피대체물은 심부 2도 이상의 화상 등을 포함한 피부 이식을 필요로 하는 상처와 외과적수술시에 면역거부반응 없이 적용이 가능하다. 또한 기존 상용화 제품에 사용된 실리콘막 대신 양막을 사용함에 따라, 보다 생체친화성이 있고 상처 부위의 염증을 탁월하게 완화시킬 수 있으며, 양막의 각종 세포 성장인자와 세포 분화인자, 그리고 기저판(basal lamina)으로 구성된 기저막 성분을 이용함으로써 상처 치유 촉진 등의 잇점을 제공한다. 아울러 이 복합구조물은 광범위 중증화상 등에 이용되는 생인공피부의 기저막이 포함된 인공진피로서 환자들의 세포를 배양할 수 있도록 제공되어 이식용 진피대체물로서 사용이 가능하며, 인공장기의 제조를 위한 생분해성 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

진피 대체물, 양막, 생분해성 고분자, 콜라겐, 상처 치유 촉진, 항염증

Description

양막과 생분해성 고분자로 구성된 이식용 진피대체물, 이의 제조방법 및 용도{Dermal substitute consisting of amnion and biodegradable polymer, the preparation method and the use thereof}

도 1a 는 다공성 콜라겐 스폰지 단면의 주사식 전자현미경 사진이고,

도 1b 는 다공성 콜라겐 스폰지의 바닥면(창상면)의 주사식 전자현미경 사진이고,

도 2a 는 본 발명의 실시예 1에 의한 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물에서 양막과 콜라겐 스폰지가 부착된 부분의 주사식 전자현미경 사진이며,

도 2b 는 본 발명의 실시예 2에 의한 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물에서 양막과 콜라겐 스폰지가 부착된 부분의 주사식 전자현미경 사진이며,

도 3a는 토끼 각막의 스트로마내(intra-stroma)에 콜라겐 스폰지 만을 이식한 후 1달째의 H&E 염색 사진이고,

도 3b는 도 3a의 이식물 주변에 침윤된 염증세포 사진이고,

도 3c는 토끼 각막의 스트로마내에 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지의 복합구조물을 이식한 후 1달째의 H&E 염색 사진이며,

도 4a는 누드마우스의 등에 콜라겐 스폰지를 이식한 후 1주일째의 H&E 염색 사진이며,

도 4b는 본 발명의 양막 추출물에 침지된 콜라겐 스폰지를 누드마우스 등에 이식한 후 1주일째의 H&E 염색 사진이며,

도 5a는 기니어피그의 등(back)에 지름 2cm 원형의 전층 피부 결손 부위에 현재 상용되는 인공진피를 이식한 후 10일 째의 H&E 염색 사진이며,

도 5b는 기니어피그의 등(back)에 지름 2cm 원형의 전층 피부 결손 부위에 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 10일 째의 H&E 염색 사진이며,

도 6은 N-헵탄올로 손상된 토끼 각막 윤부에 콜라겐 스폰지와 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 3, 7일, 30일 째의 사진이며,

도 7a는 뉴질랜드 흰 토끼의 등(back)에 전층의 피부 결손을 유발한 후 콜라겐 스폰지만을 이식한 후 7일 째의 H&E 염색 사진이며,

도 7b는 뉴질랜드 흰 토끼의 등(back)에 전층의 피부 결손을 유발한 후 콜라겐 스폰지 이식과 동시에 자가표피이식을 한 후 7일 째의 H&E 염색 사진이며,

도 7c는 뉴질랜드 흰 토끼의 등(back)에 전층의 피부 결손을 유발한 후 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식함과 동시에 자가표피이식을 한 후 7일 째의 H&E 염색 사진이며,

도 8은 표준 EGF 양에 따른 기준 흡광도 그래프이며,

도 9a는 양막의 EGF-R에 대한 면역조직화학 염색 사진이며,

도 9b는 양막의 콜라겐 타입Ⅳ에 대한 면역조직화학 염색 사진이며,

도 10은 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물에 피부의 표피세포와 섬유모세포를 배양하여 제조한 생인공피부의 세포질케라틴(cytokeratin)에 대한 면역조직화학염색 사진이다.

본 발명은 콜라겐 등의 생분해성 고분자와 태반으로부터 분리된 생체 소재인 양막으로 구성된 진피대체물, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

일반적으로, 2도 이내의 가벼운 화상의 경우처럼 피부의 손상이 표피에 국한될 경우에는 피부조직의 재생이 가능하지만 심부화상과 같은 진피가 손상된 상처의 경우 재생이 되지 않기 때문에 자가피부를 이식하는 것이 통례이다. 그러나 이식하기 까지는 역시 일정기간 환부를 피복하여 보호하여야 한다. 따라서 이러한 창상피복제는 적당한 수분의 투과성을 유지하면서 세균 등과 같은 외부환경을 차단하며 인체를 보호할 수 있는 기능을 할 수 있어야 한다. 현재까지 임상에서는 이러한 손상부위를 보호하기 위한 창상피복제로서 우레탄중합체, 로이신중합체(poly-L-leucine)등과 같은 합성고분자 막을 사용하여 왔으나 이들 재료는 생물학적 기능을 가지고 있지 못하기 때문에 그 이용에 한계가 있을 수밖에 없다. 따라서 보다 적극적으로 피부를 재생하기 위해 적당한 수분투과성 고분자막과 생체적합성 구조체를 복합화한 막을 만들어 피부조직이 재생되면 탈락하도록 설계된 것들이 있으며, 그 가운데 비교적 성공적인 것이 1980년대 초에 발표된 바이오브레인(biobrane)으로서, 콜라겐으로 피복된 나이론 직조체와 미세한 다공성 실리콘막으로 구성된 2중 구조를 가지고 있으며, 피부와의 밀착성이 좋고 신축성도 있기 때문에 창상면에 잘 부착되며 실리콘막을 통해 일상적으로 도포한 항생제가 환부에 전달될 수도 있는 장점을 가지고 있어 2도 이내의 화상 또는 같은 정도의 피부박리 상태의 창상에 널리 사용되고 있다.

또한 2도 이상의 심한 상처의 경우 현재는 진피대체물을 이식 후 약 2주 후에 부분층 식피편으로 덮어주거나, 배양한 표피세포로 덮는 방법을 이용하고 있으며, 이 때 필수적으로 선행되어야 할 진피대체물은 콜라겐을 스폰지나 젤형태로 만들어 이용하거나 생분해성 고분자를 이용하여 만들고 있다.

콜라겐 스폰지를 전층 피부 결손 상처에 사용하면, 상처 부위에서 섬유 모세포와 모세혈관이 스폰지 내에 침투해서 증식하고, 자가 콜라겐의 합성에 의하여 콜라겐 섬유가 형성되어, 진피 모양의 조직이 구축된다. 그 후 콜라겐 스폰지는 극히 순수하게 분해 흡수된다. 따라서 이 진피 모양의 조직은 완전한 자기 진피 조직이 된다. 재료 자체가 생체 진피 조직으로 바뀌어지기 때문에 이 스폰지는 진피대체물이라고도 불리우고, 일부에서 이미 상품화되었으며 여러 가지 연구와 임상 보고가 들어와 있다.

이러한 진피대체물에 관련된 종래 기술로는 다음과 같은 것들이 개시되어 있다. 대한민국 출원공개번호 제 2000-0013701호에는 콜라겐, 라미닌 및 히아루론산 으로 구성된 경질층과 다공성층의 이중구조로 된 진피재생 유도용 다공성 교원질 이중구조 창상 보호막이 개시되어 있고, 대한민국 출원공개번호 제 2000-0007983호는 콜라겐을 스폰지 및 망사의 복합구조로 제조한 강화된 콜라겐층을 포함하는 생체조직 및 이의 용도를 제시하고 있으며, 대한민국 출원공고번호 제 94-1379호의 생조직등가물은 겔상태의 콜라겐층 내에 섬유아세포로 수축시킨 콜라겐 격자형태로 구성된 진피층으로 이루어진 진피대체물을 개시하고 있다.

이 외에 현재 상품화된 진피대체물로는 미국의 FDA 및 국내 식약청으로부터 의료용품으로 수입 허가된 미국의 인테그라(Integra^TM)와 일본의 테루더미스(Terudermis^TM)가 있으며, 이러한 진피대체물은 실리콘막의 합성고분자와 소의 피부로부터 추출된 콜라겐 층으로 구성되어 있으며, 이 경우 위층은 실리콘막으로 구성되어 체액의 증발과 감염을 방지하며, 아래층은 콜라겐 등으로 구성되어 새로운 혈관과 결합조직의 재생을 유도하며, 그 자체는 인체내에서 분해 및 흡수된다.

이러한 기상품화된 진피대체물을 이용한 중증화상 등의 치료는 일반적으로 2회에 걸치는 이식 수술 절차를 필요로 하는데, 1단계는 진피 대체물을 창상에 이식하여 2~3주 내에 신생 진피를 형성하는 것이고, 2단계는 형성된 신생 진피 위에 표피층 형성을 위한 피부 이식 수술을 하는 단계이다. 이러한 전통적인 2회에 걸치는 이식의 경우 환자의 장기 입원 및 고통 등이 불가피하며, 이에 대한 감소 방안으로 진피 대체물의 이식과 동시에 자가표피이식 또는 배양표피이식을 시행함으로써 1회 의 이식 수술 방법으로의 대체를 모색 중에 있으나, 기존 진피대체물의 경우 피부의 기저막에 해당되는 부분이 없음에 따라 자가표피이식시 생착율이 제한되는 단점이 있다. 따라서 이의 대체 방안으로 피부의 기저막을 대체할 수 있는 성분의 막에 대한 필요성이 요구되어 지고 있다.

또한 기존 진피대체물의 경우 2차 부분층 이식시까지 일시적인 표피의 역할을 위하여 실리콘 막을 사용하고 있으나, 이는 단순한 체액손실 및 감염으로부터의 보호만을 위한 것으로 환자의 고통과 입원 기간 등을 고려한 보다 적극적인 상처 재생이 도모되어져야 한다.

따라서 표피 이식에 대한 생착율을 증가시키면서도 항염증 및 상처 치유 촉진 효과를 통한 보다 적극적인 상처 치유 효과와 더불어 진피대체물의 이식과 동시에 자가표피이식 또는 배양표피이식을 함으로써 1회의 이식 수술로 치료가 가능한 생체적합성 진피대체물의 개발이 오래 동안 희구되어 왔다.

본 발명자의 연구팀은 이미 콜라겐 실을 망사(mesh) 형태로 제조하여 이를 콜라겐 스폰지에 삽입함으로써 인장강도가 크게 개선된 강화형 콜라겐 스폰지를 제조한 바 있는데(한국특허출원공개번호 제2000-0007983호), 이에 대한 연구를 더욱 진전시켜, 본 발명자들은 생체적합성이 우수한 양막을 이용하여 상처의 감염방지, 물, 단백질 등의 손실 보호 효과를 포함한 양막 자체의 항염 특성과 각종 성장 및 분화인자에 의한 창상 주변의 표피세포의 이동을 촉진하는 것으로서, 보다 적극적인 창상 치유 효과를 확인하였으며, 또한 전통적인 2단계 이식 수술의 대체 방안으로 양막을 콜라겐 스캐폴드에 부착함으로써 1회의 이식수술이 가능한 진피대체물을 개발하였으며, 또한 광범위 중증화상이나 궤양 치료를 위하여 양막을 기저막으로서 이용한 생인공피부를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 생체적합성이 우수한 양막과 생분해성 재료를 이용하여 항염, 각종 성장 및 분화인자에 의한 창상 치유 촉진 효과를 가진 이식용 진피대체물과 양막을 기저막 성분으로 이용한 생인공피부의 생분해성 고분자 기질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 태반으로부터 분리된 생체적합성 양막과 생분해성 고분자 구조물이 상호 부착, 혼입 또는 삽입되어 복합 구조를 갖음을 특징으로 하는 진피대체물 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 생분해성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴 (fibronetin), 덱스트란의 천연재료와 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PLA(poly(lactic acid)) 및 유사 공중합체들, 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone), 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane)의 합성재료로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 포함하고, 이의 구조물은 바람직하게는 스폰지, 필 름, 섬유상 등의 형태이다.

상기 양막은 더블링(double ring), 인서트(insert) 또는 실리콘 링(ring)을 이용한 막(sheet) 형태 구조물 또는 망사(mesh) 형태 구조물 또는 양막의 추출물로 제조한 후, 이를 생분해성 고분자 기질에 상호 부착, 혼입 또는 삽입하는 것을 포함한다.

상기 정의에서 상호 "부착" 및 "삽입" 이라함은 양막 및 생분해성 고분자 구조물이 물리적으로 서로 인접 또는 층을 이룬 상태의 구조물사이에 들어가 결합되는 상태를 의미하며, "혼입" 이라함은 양막 또는 생분해성 고분자 구조물 중 어느 한 쪽 또는 양쪽이 액상으로 상대 구조물에 혼합, 예를 들어 침지된 상태로 상호 결합된 상태를 의미한다.

본 발명의 진피대체물을 제조하기 위해서는, 생분해성 고분자를 이용하여 스폰지를 제조하는 과정 중 양막을 부착하는 방법, 생분해성을 늦추기 위하여 종래 기술인 가교처리 방법을 이용하여 생분해성 고분자 스폰지 제조 후 양막을 부착하는 과정 및 생분해성 고분자 스폰지를 양막 추출물에 침지시켜 제조하는 방법으로 구분되며, 그 과정은 다음과 같다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기존에 인공기질로 사용되고 있는 생분해성 고분자 기질에 태반으로부터 분리된 양막을 상호 부착, 혼입 또는 삽입함으로써 양막 자체의 특성을 이용한 치료 효과를 향상시키고, 상품의 사용 편리성을 증대시킨 데에 그 특징이 있 다.

본 발명에서 사용 가능한 생분해성 고분자는 세포가 잘 부착하여 3차원적인 조직의 구조를 형성하는 뼈대의 역할을 하여야 하며, 이식 후 염증반응이나 이물반응을 일으키지 않도록 면역학적으로 불활성이어야 하며, 한편으로는 적극적으로 주위조직과 반응하여 주위에 존재하는 세포가 자라 들어오도록 유도할 수 있어야 하며, 또한 이식물에 대한 이물반응으로 인해 이식된 후, 이식된 세포와 조직의 역할이 다 끝나기도 전에 그 지지층인 재료가 분해되지 않도록 그 분해속도가 적절한 것을 사용하여야 하며, 일정기간 지난 후에는 스스로 분해되어 이물질로 남지 않아야 한다.

따라서 본 발명에 따른 생분해성 고분자 기질의 제조에 적용되는 생분해성 고분자 재료로는 생체 내에서 분해될 수 있는 고분자라면 모두 적용가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 생분해성 고분자 재료로 생체내 구조 단백질인 콜라겐을 사용하였다.

콜라겐 스폰지 제조과정 중 양막 구조물이 상호 부착되어 복합구조를 갖는 진피대체물을 제조하기 위해서, 예를 들면 본 발명은 콜라겐 섬유를 산용액, 바람직하게는 초산 또는 펩신에, pH 3 내지 4, 농도 0.3 내지 1% 로 용해시켜 제조하는 제 1단계; 양막이 부착된 몰드에 도포하는 제 2단계; -196℃ 내지 0℃ 의 냉동고에서 동결 후 36시간 이상 동결건조하는 제 3단계로 이루어진 공정을 포함하는 생분해성 고분자 및 양막으로 구성된 복합구조를 갖는 진피대체물의 제조방법을 제공한 다.

또한, 본 발명에서는 상기의 제조방법으로 본 발명의 콜라겐 스폰지 제조과정 중 양막 구조물이 상호 부착되어 복합구조를 갖는 진피대체물이 제공된다.

이에 부가적으로 생분해도 및 인장강도를 증가시키기 위해서, 상기에서 제조된 양막-콜라겐 스폰지 복합 구조물에 종래의 가교방법을 이용하여 콜라겐 및 양막을 가교 결합시켜 제조되는 양막-콜라겐 스폰지 복합구조체로 이루어지는 진피대체물의 제조방법을 포함한다.

상기의 종래 가교방법은 0.25% 글루타르알데하이드(GAD) 처리, 90% 아세톤에 33mM의 1,3-카보디이미드(carbodiimide)와 6mM의 하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)가 용해된 용액 처리, 40% 알코올에 33mM의 1,3-카보디이미드와 6mM의 하이드록시숙신이미드가 용해된 용액 처리, UV 및 감마선 조사(gamma irradiation) 처리 및 기타 화학적 가교 등을 포함한다.

또한, 콜라겐 스폰지 제조과정 후에 양막 구조물이 상호 부착되어 복합구조를 갖는 진피대체물을 제조하기 위하여, 예를 들면, 본 발명은 콜라겐 섬유를 산용액, 바람직하게는 초산 또는 펩신에, pH 3 내지 4, 농도 0.3 내지 1% 로 용해시켜 제조하는 제 1단계; 몰드(예. 12-웰 플레이트)에 도포하는 제 2단계; 이를 -196℃ 내지 0℃ 의 냉동고에서 동결 후 36시간 이상 동결건조시키는 제 3단계; 수득된 콜라겐 스폰지를 진공오븐에 넣고 실온에서 2시간, 110℃ 에서 24시간 동안 진공을 유지시킨 후 30℃ 에서 진공을 제거함으로써 DHT 가교결합(dehydrothermal crosslinking)을 수행하는 제 4단계; 다시 상기의 종래의 가교 처리방법을 사용하여 콜라겐을 가교 결합시키는 제 5단계; 그 다음 0.01% 내지 0.05%의 콜라겐 용액으로 가교된 콜라겐 스폰지 또는 양막을 코팅하는 제 6단계; 콜라겐 스폰지와 양막을 부착하는 제 7단계; -196℃ 내지 0℃ 의 초저온 냉동고에서 동결시킨 뒤에 36시간 이상 동결건조하는 제 8단계로 이루어진 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자 및 양막으로 구성된 복합구조를 갖는 진피대체물의 제조방법을 제공한다.

이 때, 콜라겐 스폰지의 기공크기는 40 내지 150㎛, 바람직하게는 60 내지 120㎛으로 제조한다.

상기의 제조방법을 통해, 본 발명은 콜라겐 스폰지 제조과정 후 양막 구조물이 상호부착되어 복합구조를 갖는 진피대체물을 제공한다.

생분해성고분자 스폰지를 양막 추출물에 침지시켜 제조하기 위해서, 예를 들면, 본 발명은 콜라겐 섬유를 산용액, 바람직하게는 초산 또는 펩신에, pH 3 내지 4, 농도 0.3 내지 1% 로 용해시켜 제조하는 제 1단계; 몰드(예. 12-웰 플레이트)에 도포하는 제 2단계; 이를 -196℃ 내지 0℃ 의 냉동고에서 동결 후 36시간 이상 동결건조시키는 제 3단계; 수득된 콜라겐 스폰지를 진공오븐에 넣고 실온에서 2시간, 110℃ 에서 24시간 동안 진공을 유지시킨 후 30℃ 에서 진공을 제거함으로써 DHT 가교결합을 수행하는 제 4단계; 다시 상기의 종래의 가교 처리방법을 사용하여 콜라겐을 가교 결합시키는 제 5단계; 양막 추출물을 제조하는 제 6단계; 콜라겐 스폰 지를 양막 추출물에 12시간 이상 침지시키는 제 7단계; -196℃ 내지 0℃ 의 초저온 냉동고에서 동결시킨 뒤에 36시간 이상 동결건조하는 제 8단계로 이루어진 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자 및 양막으로 구성된 복합구조를 갖는 진피대체물의 제조방법을 제공한다.

상기 6단계의 양막 추출물의 제조는, 급속냉동시킨 양막을 분쇄하고 균질화한 후 원심분리하여 상등액을 취하고, 그 다음 여과하여 제조할 수 있다.

상기 방법으로 제조된 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 진피대체물은 토끼의 각막 스트로마내에 이식하였을 때, 콜라겐 스폰지를 단독으로 이식하였을 때 보다 염증세포침윤을 억제하여 항염증효과를 보이며, 또한 누드마우스 등의 피하조직에 양막 추출물에 침지된 콜라겐 스폰지를 이식하였을 때도 또한 염증반응이 적고, 이식 후에도 콜라겐의 분해가 지연되어 내구성이 있다.

본 발명의 시험예로, 시판중인 테루더미스와 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 전층피부 결손된 기니어피그의 등에 이식부착하였을 때 혈관생성과 섬유모세포의 증식 효과를 보였으며, 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 진피대체물의 경우 재상피화에 더욱 뛰어난 효과를 보였다.

또한 토끼의 각막윤부에 화상을 입힌 후, 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 진피대체물을 이식하였을 때, 콜라겐 스폰지 구조물과 달리 이식물 주변의 염증세포의 침윤을 억제하는 항염증 효과가 있다.

또한 본 발명의 진피대체물 제조에 사용되는 양막의 동결 또는 동결건조 처리에도 표피 성장인자의 양이 크게 감소하지 않아 상처치유촉진효과가 있다.

이러한 본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 진피대체물 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물은 종래의 진피대체물에 비해 실리콘막 대신 양막을 사용함에 따라 보다 생체에 적합하여 생착율이 높으며, 양막 자체의 특성인 상처조직에 이식되어 항염효과와 창상치유촉진효과를 나타냄으로써 상처치유용 드레싱으로서 유용하게 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 진피대체물 제조방법으로 제조된 양막-생분해성 고분자 구조물에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 진피대체물을 제공한다.

상기 고분자 구조물에 배양되는 세포는 섬유모세포, 각질형성세포, 연골세포, 골세포, 근육세포, 각막간세포 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 양막-생분해성 고분자 구조물에 세포를 배양하여 인공진피를 제조한 후, 인공진피의 양막 위에 세포를 이중 배양하여 제조한 생인공피부 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 배양되는 세포는 섬유모세포, 각질형성세포, 연골세포, 골세포, 근육세포, 각막간세포 등을 사용할 수 있다.

양막을 생인공 피부의 기저막 성분으로 이용함에 따라 기존 상용되는 진피대체물의 기저막 성분이 없는 문제점을 극복할 수 있다.

양막 자체의 피부 기저막 역할에 따라 기존 진피대체물의 2회에 걸치는 이식 수술의 대체 방안으로서 1회의 이식 수술이 가능한 환경을 조성함으로써 환자의 고통감소 및 경비 절감이 가능한 진피대체물의 제공이 가능하다.

또한 본 발명에 의하여 제조된 인공진피대체물에 인체 섬유모세포를 배양함 으로써 상처 부위가 커서 상처 주변의 세포이동이 어려운 경우에 사용 가능한 생인공피부 개발에 대한 환자의 부분층 이식 또는 자가 및 동종의 배양된 표피 세포 이식에 대한 기저막이 포함된 지지체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 진피대체물은 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공뼈, 인공근육 등의 다양한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 적용범위의 일례로 본 발명의 생분해성 고분자 스캐폴드에 섬유모세포를 배양한 후 본 발명의 양막 위에 환자의 자가세포를 이식하거나 또는 인체에서 분리된 줄기세포주(stem cell) 또는 성체세포주(adult cell)를 배양하거나 불멸화세포주를 배양하는 기질로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 시험예로, 뉴질랜드 흰 토끼의 등에 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물 및 자가표피를 이식하였을 때, 콜라겐 스폰지만을 이용한 경우나 콜라겐 스폰지 및 자가표피 이식한 경우보다 생착율이 우수하고, 염증반응이 없고, 섬유모세포와 혈관의 생성, 증식이 뛰어나 진피대체물로서의 탁월한 기능을 보인다.

이하, 본 발명은 다음의 참조예, 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 내용이 하기 참조예, 실시예 및 시험예에 제한되지는 않는다.

<참조예 1> 양막의 제조예 1

양막은 국내법상 감염성 폐기물로 분류되어 있으며, 이의 안전성 확보를 위하여 일반적으로 적용되는 조직은행 규정에 준하여 태반 모체에 대한 혈청학적 스 크리닝을 한 후, 정상인 경우에 한해 양막을 태반으로부터 분리하였으며, 분리 후 멸균 식염수에 냉장 보관하여 운반하였다. 운반 후 약 400㎖의 멸균된 식염수(0.9% NaCl)에 분리된 양막을 넣고 10분 동안 교반기(shaker)에서 4회 세척 후, 새로운 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 담근 후 냉장상태로 하루밤 동안 보관하여 양막의 스폰지 층을 수화시킨 후 이를 제거하였다. 이를 다시 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 10분 동안 4회 세척하였다. 세척된 양막을 막(sheet) 형태로 사용을 하거나 또는 통상적인 의료기기인 격자제조기(mesher)를 사용하거나 인위적으로 천공(perforation)한 망사(mesh) 형태로 제조하여 이를 콜라겐 스폰지와 부착시 사용하였다.

<참조예 2> 양막의 제조예 2

양막 추출물은 참조예 1에서 세척된 양막을 액체 질소에서 급속 냉동시킨 후 막자 사발을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄물은 균등기를 이용하여 균질화한 후에 원심분리(6000rpm, 30분)하여 상층액을 취하며, 이를 한외 여과막 필터(Centrikon사)을 이용하여 여과함으로써 양막 추출물을 제조하였다.

<실시예 1> 양막-콜라겐 스폰지 복합체 제조예 1 (콜라겐 스폰지 제조 중 양막의 부착)

콜라겐(Matrixen-ASP, 바이오랜드)을 초산 또는 펩신으로 녹여 pH 3.0, 농도 0.5%인 용액을 제조한 뒤, 호모게나이저(homogenizer)로 1500rpm에서 5분 동안 교반하였다. 크림 형태가 된 용액을, 참조예 1에서 제조된 양막이 부착된 몰드인 12 웰 플레이트에 1.5㎖을 도포하고, -196℃ 내지 0℃ 의 초저온 냉동고에서 동결 후, 36시간 이상 동결건조시켰다. 그 다음, 생분해도 및 인장강도를 증가시키기 위하여 제조된 양막-콜라겐 스폰지 복합체에 종래의 가교방법인 0.25% 글루타르알데하이드(GAD)를 처리하여 콜라겐 및 양막을 가교 결합시켜 양막-콜라겐 스폰지 복합체를 제조하였다.

<실시예 2> 콜라겐 스폰지-양막 복합체 제조예 2 (스폰지의 가교 처리 후 양막 부착)

콜라겐(Matrixen-ASP, 바이오랜드)을 초산 또는 펩신으로 녹여 pH 3.0, 농도 0.5%인 용액을 제조한 뒤, 호모게나이저로 1500rpm에서 5분 동안 교반하였다. 크림 형태가 된 용액을 12웰 플레이트에 1.5㎖을 도포한 후, -196℃ 내지 0℃ 의 초저온 냉동고에서 동결시킨 다음, 다시 36시간 이상 동결건조시켰다. 동결건조된 다공성 형태의 스폰지를 진공오븐에 넣고, 먼저 실온에서 2시간 이상 진공을 걸어 스폰지의 미량의 수분을 제거한 후, 110℃ 까지 온도를 상승시켜 24시간 동안 진공을 유지시켰다. 24시간 경과 후, 온도가 30℃ 까지 내려간 뒤 진공을 제거함으로써, 일차적으로 콜라겐 분자내에 공유결합을 형성하여 DHT 가교 결합 (dehydrothermal crosslinking)을 수행하였다. 이로 인해 구조가 안정화되고 가교시에 구조의 변화가 억제된다. 이후 2차 가교처리로 종래의 가교방법인 0.25% 글루타르알데하이드(GAD) 또는 1,3-카보디이미드(CAD) 등을 이용하여 콜라겐을 가교 결합시킨 후 0.05%의 콜라겐 용액으로 콜라겐 스폰지의 표면을 코팅한 후 상기 참조예 1의 양막을 1면 내지 다면에 부착시킨 후, -196℃ 내지 0℃ 의 초저온 냉동고에서 동결시킨 뒤에 36시간 이상 동결건조시켰다.

도 1a와 도 1b는 종래 기술로 제조한 콜라겐 스폰지의 바닥면과 단면에 대한 주사식 전자현미경 사진이며, 세공 크기(pore size)는 약 60㎛ 내지 120㎛의 분포를 나타내었다.

또한 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지의 복합구조물의 양막과 스폰지의 부착된 형태를 도 2a 및 도 2b에 도시하였으며, 도 2a는 실시예 1의 방법이며, 도 2b는 실시예 2에 의해 제조된 것으로 부착된 형태에 있어 큰 차이는 없었다.

<시험예 1> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 항염증효과 관찰: 토끼 각막의 스트로마내 이식 시험

제조된 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 동물이식을 통한 염증세포의 정도를 확인하기 위하여, 토끼 각막의 스트로마내(intrastroma)에 콜라겐 스폰지와 본 발명의 실시예 2의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식함으로써 양막의 항염증 효과를 확인하였으며, 이식 후 1달째에 조직을 채취한 후 포르말린에 고정, 수세, 파라핀 포매과정을 거쳐 5㎛ 두께로 박절하여, H&E (Hematoxyline & eosin) 염색을 시행한 후, 광학현미경 하에서 항염증 효과를 관찰하였다.

도 3a는 각막의 스트로마내에 스폰지만을 이식한 전체 조직 내부 사진이며, 도 3b에서 이와 같은 이식물 주변의 염증세포의 침윤이 30일째 계속 진행된 것을 확인하였으며, 도 3c와 같이 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 경우, 염증 세포의 침윤을 억제하여 항염증 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<시험예 2> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 항염증효과 관찰: 누드마우스의 피하 이식 실험

양막의 항염증 효과를 확인하기 위하여 콜라겐 스폰지와 양막 추출물에 침지된 콜라겐 스폰지를 누드마우스의 등에 피하(subcutaneous) 이식시험을 시행한 후 1주일째 조직을 채취하여 H&E 조직검사를 통해 항염증 효과를 관찰하였다.

상기의 참조예 2에서 제조된 양막 추출물에 콜라겐 스폰지를 24시간 침지한 후, 이를 누드마우스 등에 이식하여 양막 추출물의 항염증효과를 관찰하였으며, 대조군으로는 콜라겐 스폰지만을 이식하였다.

도 4a는 콜라겐 스폰지만을 이식한 것이며, 도 4b는 양막 추출물에 침지된 콜라겐 스폰지를 이식한 것으로서 양막 추출물에 담군 콜라겐 스폰지의 경우 염증반응이 적었으며, 이식 1주일 후에도 분해되지 않고 스폰지의 원래 형태를 그대로 유지하였다.

<시험예 3> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 피부 창상 치유 효과 관찰: 전층 피부 결손된 기니어피그의 진피대체물 이식 실험

제조된 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 피부 결손에 대한 창상 치유 효과를 확인하기 위하여, 체중 350~400g의 기니어피그((주)샘타코))에 케타민 히드로클로라이드(ketamine hydrochloride)를 근육주사로 100mg/kg 투여하여 전신마취를 시 행한 후, 전기제모기로 기니어피그 등의 털을 제거하고 비누 및 물로 세척한 다음 다시 10% 포비돈 아이오딘(povidone-iodine)를 도포한 뒤 70% 에탄올로 소독하였다. 기니어피그의 등 부위에 직경 2cm 크기의 원형 전층 창상을 2개 만들고 한쪽에는 현재 인공진피로 상용되는 테루더미스(Terudermis^TM, Terumo사, 일본)를 대조군으로 이식하고, 다른 한쪽은 시험군으로 본 발명의 실시예 1의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 폴리우레탄 필름(polyurethane film)을 덮은 후 탄력붕대로 고정하였다. 이식 후 10일째에 조직 절편을 만들고, H&E (Hematoxyline & eosin) 염색을 실시한 후, 염색된 세포 형태를 통해 창상치유정도를 관찰하였다.

도 5a와 도 5b는 각각 대조군인 테루더미스와 시험군인 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지의 복합구조물을 전층 피부 결손 부위에 이식한 후 10일째의 조직검사 사진이며, 진피대체물 이식 후 10일째에 대조군과 시험군 모두 진피의 아래부위로 부터 혈관생성과 섬유모세포의 증식이 관찰되었으며, 또한 콜라겐의 합성이 증가되는 양상을 보였다.

또한 도 5a의 대조군에서는 실리콘 막 아래 각질형성세포의 이동이 관찰되지 않은 반면, 양막을 사용한 도 5b의 시험군에서는 가피가 얇고 상처 주위로부터의 각질형성세포의 이동이 관찰되었으며, 표피의 재상피화가 대조군에 비해 더 빠르게 이루어짐을 확인할 수 있었다.

<시험예 4> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 각막 창상 치유 효과 관찰: 각막 윤부가 손상된 토끼의 복합구조물 이식 실험

토끼의 각막 윤부를 N-헵탄올(heptanol)로 손상시켜 각막의 신생혈관이 자라 들어오게 한 후, 콜라겐 스폰지와 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 각각 3일, 7일, 30일 째에 콜라겐 스폰지와 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 효과를 비교 확인하였다.

도 6a, 6b, 6c는 콜라겐 스폰지만을 이식한 후 3일, 7일, 30일 째의 사진이며, 도 6d, 6e, 6f는 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 3일, 7일, 30일째의 사진으로서 콜라겐 스폰지만 이식한 것에 비해 양막-콜라겐 스폰지의 복합구조물에서는 이식 후 30일째 심각했던 혈관 증식이 억제되었으며, 또한 복합 구조물의 콜라겐 스폰지가 적게 분해됨을 확인할 수 있었다.

<시험예 5> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 자가표피이식에 대한 생착 효과 관찰

본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물의 이식과 동시에 자가표피이식을 수행함으로써 표피이식에 대한 양막의 생착율 증대 효과와 제조된 인공진피와 자가표피이식의 동시 시행에 대한 창상 치유 효과를 확인하였다.

먼저, 체중 2.4kg의 뉴질랜드 흰 토끼(New Zealand White Rabbit, (주)샘타코)의 등에 지름 4cm 크기의 원형 전층 창상을 3개 만들고 한쪽에는 콜라겐 스폰지만을 이식하고 더마톰(dermatome)을 이용하여 0.25mm 두께의 자가표피이식을 시행 하였으며, 다른 한쪽은 본 발명의 실시예 2의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이식한 후 같은 두께의 자가표피이식을 시행한 후 압박드레싱을 하였다.

또한 대조군으로 상기의 자가식피술을 시행하지 않고 콜라겐 스폰지만을 이식하였으며, 군당 3마리를 비교 실험하였다.

이식 후 7일, 14일째에 조직을 채취한 후 H&E (Hematoxyline & eosin) 염색을 시행한 후, 창상치유정도를 관찰하였다. 창상 치유는 광학현미경하에서 생착정도, 염증세포, 신생혈관 형성, 섬유모세포의 증식을 관찰하여 그 정도에 따라 +, ++, +++, ++++의 네 가지로 나누어 평가하였다.

도 7a는 대조군으로 스폰지만을 이식한 것이고, 도 7b는 스폰지를 이식한 부위에 자가표피이식을 한 것이며, 도 7c는 본 발명의 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물에 자가표피이식을 한 것으로서, 조직검사를 통해 확인한 결과 자가표피이식을 한 군에서는 양막이 없는 콜라겐 스폰지를 이식한 경우 이식된 표피층이 부분적으로 탈락된 반면 양막-콜라겐 스폰지의 복합구조물에서는 이식한 표피층의 생착율이 우수하였으며, 2주 이내 이식된 부위의 양막은 염증 반응없이 생분해되었음을 확인하였다. 또한 본 발명의 복합구조물의 이식과 동시에 자가표피이식을 함에 따라 자가표피이식을 하지 않은 대조군에 비해 복합구조물 내로의 주변 섬유모세포와 혈관내피세포의 침윤이 빠르고 활발하게 진행됨을 확인하였으며, 그 결과는 아래 표 1과 같다.

	일	대조군 콜라겐 스폰지만 이식	콜라겐 스폰지 /자가표피이식	양막-콜라겐스폰지 /자가표피이식
피부생착율 (Skin Graftance) (Split-thickness)	7	-	+	++++
	14	-		+++
염증	7	++	++	++
	14	+	+	+
신생혈관생성 (New vascularization)	7	+	+	+++
	14	++	++	++++
섬유모세포 증식 (Fibroblast proliferation)	7	+	++	+++
	14	++	+++	++++
염증(침투된 류코사이트(leukocytes)의 숫자) : 0~10(+), 10~100(++), 100~500(+++), >500(++++) 신생혈관생성(내피세포 나란히 있는 루멘(lumen)의 숫자) : 0~10(+), 10~20(++), 20~30(+++), >30(++++) 섬유모세포 증식(증식된 섬유모세포 숫자) : 0~100(+), 100~500(++), 500~1000(+++), >1000(++++)

<시험예 6> 양막의 표피성장인자 정량

제왕 절개하여 얻은 태반에서 양막을 12시간 안에 수거하였다. 수거된 양막을 TSA 배지(Tryptic soybean casein digest medium) 내에서 미생물 배양하며, 배양은 최소 7일간 37℃ 의 온도로 배양하였다. 배양 후 미생물이 나올 경우에는 폐기하고, 미생물이 발견되지 않은 양막을 약 400㎖의 멸균된 식염수에 넣고 10분 동안 교반기(shaker)에서 4회 세척 후, 이를 새로운 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 담근 후 냉장상태로 하루밤 동안 보관하여 양막의 스폰지 층을 수화시킨 후 제거하였다. 이를 다시 멸균 식염수(0.9% NaCl)에 10분 동안 4회 세척하였다.

세척된 양막을 동결 및 동결건조하여 각각 무게를 달고 PBS에 추출하여 양막 추출물을 얻었다. 추출물을 15,000rpm, 5분의 조건으로 원심분리하여 상층액을 취해 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF, 고마바이오텍) 정량을 실시하였다. EGF 정량은 EGF 검출 키트(아산제약)를 사용하여 실시하였고, 도 8의 표준 EGF 양에 따른 흡광도(540nm) 값을 기준으로 하여 시료들의 EGF 양을 결정하였으며, 결과는 하기 표 2에 기재하였다.

	무처리군(pg/㎎)	동결(pg/㎎)	동결건조(pg/㎎)
시료 1	3.02	2.2	2.31
시료 2	2.53	2.27	2.54
시료 3	3.89	3.4	3.7

상기 표 2의 결과를 보면, 양막의 동결처리 및 동결건조 처리 등 목적하는 제품의 가공에서도 표피성장인자의 양이 크게 감소하지 않고, 보존 유지된다는 사실을 알 수 있었다. 이 양막의 표피성장인자로 인해 상처가 치유되는 것을 촉진하는 효과를 기대할 수 있다.

<시험예 7> 양막의 생체활성인자에 대한 면역조직화학염색

생체활성 인자 중 표피성장인자 수용체 EGF-R와 기저판(basal lamina)의 주요 구성성분인 콜라겐 타입Ⅳ에 대한 양막 내 부위(localization)을 확인하기 위하여, EGF-R 항체(DAKO사, K0675) 및 콜라겐 타입IV 항체(NeoMarkers사, MS-747-S1)를 사용한 면역-퍼록시다제 방법(Immuno-peroxidase method)으로 면역조직화학염색을 시행하였다.

도 9a에서 진한 갈색으로 염색된 부분이 EGF-R에 대하여 염색된 부분이며, 도 9b의 진한 갈색 부분이 콜라겐 타입 Ⅳ에 대하여 염색된 부분이며, 염색 결과 양막 내 상피세포가 있는 기저막(basement membrane) 주위에서 강하게 염색됨을 관찰할 수 있었다.

<실시예 3> 양막-콜라겐 스폰지 복합구조물을 이용한 전층 생인공피부의 제조.

3-1. 인공진피의 제조

실시예 2의 양막-콜라겐 스폰지의 진피대체물을 지름 3cm의 원형 디스크(disk) 형태로 제조하여 직경 3.5cm의 배양접시에 놓았다. 제조된 진피대체물에 약 3×10⁶개의 진피세포를 10% FBS/DMEM 1㎖에 넣어 접종한 후 37℃ , 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 5시간 정도 지난 후 2㎖의 배지를 첨가하였으며, 다음 날 배지를 교환하고 이후 2일 마다 배지를 교환하면서 1주일간 배양하였다.

3-2. 전층 생인공피부의 제조

상기 3-1에서 제조된 인공진피의 양막 기저막 위에 각질세포를 이중 배양하여 인공피부를 제조하였다.

3㎛ 세공(pore)의 폴리카보네이트 막이 달린 배양플레이트 인서트(millicell, Millipore사)를 6-웰 플레이트에 넣은 후, 배양, 수축된 인공진피를 그 인서트 위에 올려 놓은 다음, 각질세포를 그 위에 접종하였다. 직경 30㎜ 의 인서트 1개당 5×10⁵ 개의 각질세포를 인공 진피 위에 접종하고, 인서트 안에는 각질세포용 무혈청 배지 2㎖을, 밖에는 배지 3㎖로 채웠다. 이와 같이 만들어진 조직을 배지에 잠긴 상태로 1주일간 배양하면 각질세포가 자라서 표면을 가득 채우게 된다. 이 후 인서트 안의 배지를 제거하고 인서트 밖에만 배지를 채웠다. 이는 모든 영양성분 및 성장인자들은 인공진피를 통해 확산에 의해서 표피세포층에 전달되므로 생체표피와 유사한 환경이라고 볼 수 있으며, 이와 같이 대기상과 액체 배지의 경계면에서 2주일간 배양하여 각질세포를 다층으로 성장 및 분화시켰다. 도 10은 상기와 같이 제조된 본 발명의 양막을 기저막으로 한 전층 생인공피부의 면역조직화학염색사진이며, 각질세포의 분화시 발현되는 사이토케라틴을 확인하기 위하여, 사이토케라틴항체(Biomedical Technologies사)를 사용한 면역-퍼록시다제 방법(Immuno-peroxidase method)으로 면역조직화학염색을 시행하였으며, 각질세포 전층에 걸쳐서 염색됨을 관찰할 수 있었다.

본 발명에 의하면, 기존 실리콘막과 콜라겐 스폰지로 구성되는 진피대체물과 비교하여 실리콘막 대신 양막을 사용함에 따라 보다 생체적합성이 있으며, 양막의 특성 중 하나인 항염증 작용에 의한 염증 반응 감소 및 이에 따른 생분해속도 지연을 통한 내구성 확보가 가능하다. 그리고 양막 자체의 각종 성장인자 및 분화인자 등에 의한 상처 치유 촉진 효과가 있으며, 또한 양막 자체의 피부 기저막 역할에 따라 기존 진피대체물의 2회에 걸치는 이식 수술의 대체 방안으로서 1회의 이식 수술이 가능한 환경을 조성함으로써 환자의 고통감소 및 경비 절감이 가능한 진피대체물의 제공이 가능하다. 그리고 더 나아가 본 발명에 의하여 제조된 인공진피에 인체 섬유모세포를 배양함으로써 상처 부위가 커서 상처 주변의 세포이동이 어려운 경우에 사용 가능한 생인공피부 개발에 대한 환자의 부분층 이식 또는 자가 및 동종의 배양된 표피 세포 이식에 대한 기저막이 포함된 지지체로서 사용할 수 있다. 따라서 양막과 생분해성 기질로 이루어진 본 발명은 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공근육 등의 다양한 조직공학을 이용한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 태반으로부터 분리된 생체적합성 양막과 콜라겐 스폰지가 상호부착, 혼입 또는 삽입되어 복합구조를 갖음을 특징으로 하는 진피대체물.
2. 삭제
3. 태반으로부터 분리된 생체적합성 양막과 콜라겐 스폰지가 상호부착, 혼입 또는 삽입되어 복합구조를 갖음을 특징으로 하는 진피대체물의 제조방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 3항의 진피대체물 제조방법으로 제조된 양막과 콜라겐 스폰지의 복합구조물에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 진피대체물의 제조방법.
8. 제 3항의 진피대체물 제조방법으로 제조된 양막과 콜라겐 스폰지의 복합구조물에 세포를 배양한 다음, 양막 위에 세포를 이중배양하는 것을 특징으로 하는 생인공피부의 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 세포는 섬유모세포, 연골세포, 골세포, 근육세포 및 각막간세포로 이루어진 그룹으로부터 하나이상 선택된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 세포는 섬유모세포, 연골세포, 골세포, 근육세포 및 각막간세포로 이루어진 그룹으로부터 하나이상 선택된 것임을 특징으로 하는 제조방법.

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