KR100637955B1 - 수용체의 생물학적 활성을 조절하는 화합물의 능력을예측하는 방법 - Google Patents
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Abstract
바이오키(BioKey) 패널을 구성하는 다양한 구성원의 존재 하에서, 다세포 유기체 내에 존재하는 수용체의 생물학적 활성을 조절하는 의문의 화합물과 수용체 간의 상호작용에 기초하여, 그 의문의 화합물의 능력을 예측한다. 그 바이오키는 리간드, 특히 수용체의 콘포메이션을 변형시키는 것으로 알려진 펩티드 또는 핵산이다. "핑거프린트"로서 알려진 이러한 상호작용 데이타를, 그 수용체에 의해 매개되는 공지의 생물학적 활성을 갖는 참조 화합물에 대한 핑거프린트와 비교한다.
본 발명의 "분자 점자법"(MB) 구체예에서, 참조 핑거프린트와 테스트 핑거프린트는 생체외(셀-프리) 분석법에 기초한다.
본 발명의 "세포 점자법"(CB) 구체예에서, 참조 핑거프린트와 테스트 핑거프린트를 다세포 유기체 전체, 또는 그 기관 또는 조직의 분석에 기초한 것이 아닌 세포 분석법에 기초한다.
참조 핑거프린트, 패널-기초 디스크립터, 오펀 핵 수용체, 핵 수용체 보조 활성인자
Description
본 발명은 표적 단백질의 생물학적 활성을 매개할 수 있는 약물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원의 상호 참조
Thorp, 일련번호 No.08/904,842, METHOD OF IDENTIFYING AND DEVELOPING DRUG LEADS WHICH MODULATE THE ACTIVITY OF A TARGET PROTEIN은 선도 약제를 동정하는 몇몇 방법을 개시한다. 본질적으로 하나 이상의 상태로 관심의 단백질을 (a) 하나이상의 특징결정 시약을 가지고 그 화학 반응성 및/또는 하나 이상의 물질(특히 핵산)에의 그 결합성에 의해 특징짓는데, 이는 등가의 디스크립터 배열이 형성된 참조 단백질에 다소 유사한 것으로 특징질 수 있는 디스크립터의 배열을 만들고, 여기서 하나 이상의 활성-매개 참조 약제는 공지된 것이다. 관심의 단백질에 대해 적당한 선도 약제는 더 유사한 참조 단백질에 대한 참조 약제에 유사한 것들이다.
Fowlkes, et al. PCT/US97/19638, 08/740,671, 09/050,359 및 09/069,827, IDENTIFICATION OF DRUGS USING COMPLEMENTARY COMBINATORIAL LIBRARIES는 표적 단 백질의 천연 리간드에 대한 대용물로서 기능할 수 있는 한 세트의 결합 펩티드를 얻기 위한 펩티드 등의 일차 조합 라이브러리의 이용을 개시한다. 작은 유기 화합물 라이브러리(바람직하게는 실제로 조합)는 표적 단백질에의 대용물의 결합을 저해하는 화합물에 대해 스크리닝된다.
1998년 4월 23일에 제출된 Paige, et al., 일련번호 No.60/082,756, 1998년 9월 9일에 제출된 Paige et al., 일련번호 No.60/099,656이 현 출원의 선행 출원이다.
상기 출원 모두는 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다.
정부 지원의 언급
여기 개시된 작업의 일부는 NIH Grant DK 48807을 통해 미국 정부에 의해 Donald P. McDonnell에게 투자된 자금에 의한 것이다. 미국 정부는 본 발명에 있어 일정 권리를 가질 수 있다.
배경기술의 설명
단백질 결합 및 생물학적 활성
단백질은, 그 자체가 단백질이거나 다른 생분자인 하나 이상의 결합 파트너(리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력으로 인해 많은 생물학적 활성을 갖게 된다.
단백질의 결합 파트너가 알려지면, 연구는 결합 단백질 및 그 결합 파트너의 상호작용이 생물학적 활성에 어떻게 영향을 미치는 가에 상대적으로 집중된다. 또한 복합체 형성을 경쟁적으로 저해하거나 이미 형성된 복합체를 해리시키는 능력에 대해 화합물들을 선별하기도 한다. 그러한 저해제들은, 적어도 그것들이 생체내에서 상호작용하는 부위로 전달될 수 있으면 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미칠 것이다.
결합 단백질이 수용체라면 그 결합 파트너는 생물학적 활성을 갖는 이펙터일 것이고, 그 저해제는 그 생물학적 활성을 길항할 것이다. 결합 파트너가 결합을 통해 어떤 생물학적 활성을 방해한다면, 그 상호작용의 저해제는 작용물질일 것이다.
수용체 활성의 조절인자에 대한 스크리닝
수용체 활성의 조절인자에 대한 스크리닝에 관한 현재의 기술 상태는, 수용체의 리간드 결합 포켓으로부터 표지된 리간드의 이동에 관한 것이다. 예컨대 스크린은 에스트로겐 수용체로부터 방사선표지된 에스트라디올의 이동에 대한 것일 수 있다. 이 분석을 통해서는, 수용체에 대한 화합물의 상대적 친화도에 관한 정보를 얻을 수 있을 뿐이고, 그 화합물이 수용체 활성의 작용물질로 작용하는지 아니면 길항물질로 작용하는지에 관한 수용체 상에서의 화합물의 활성을 알아낼 수는 없다. 이것이 수용체 활성 조절인자에 대한 스크리닝에 있어서 제약 회사들이 극복해야 할 주요 문제점이다.
작용물질과 길항물질을 구별할 수 있는, 지금까지 개발되어 온 분석들은 세포-기초 분석 및 수용체 유전자 시스템에 관한 것이다(McDonnell et al., Molec. Endocrinol., 9:659(1995)). 이러한 시스템들에 있어서, 그 수용체 및 한 리포터 유전자가 배양액 내의 세포로 공동-트랜스펙션된다. 그 리포터 유전자는 활성 수용체의 존재하에서만 활성화된다. 수용체 활성을 조절하는 화합물의 능력은 리포터 유전자 활성의 상대적 강도에 의해 결정된다. 이러한 분석은 시간을 요하는 작업이고, 다른 세포주에서 행하거나 또는 다른 리포터 유전자 또는 반응 요소를 가지고 행하면 다른 결과를 가져올 수 있다. 따라서 그 데이타는 주의를 갖고 해석해야만 한다.
수용체들의 다른 콘포메이션 상태의 잇점을 이용하는 방법들이 개발되어 왔다. 작용물질 또는 길항물질의 존재하에서 에스트로겐 수용체를 단백질분해 소화시켜 변성 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 개별 밴드 패턴을 얻는다. 특정 콘포메이션에서 수용체의 특정 부위는 소화로부터 보호되는 반면, 다른 콘포메이션에서는 그 부위가 노출된다. 따라서 밴드 패턴으로 수용체가 단백질분해 소화시 작용물질과 결합했는지 아니면 길항물질과 결합했는지를 알 수 있다. 이 방법은 각 샘플을 이동시킬 젤을 필요로 한다는 점에서, 다량의 수용체 단백질을 필요로 하고 시간을 요하는 작업이며 고가이다. 따라서 대량의 샘플을 스크리닝하는 데에는 부적당하다.
하기에 세포 기초의 스크리닝 방법에 대한 특허들을 예시하였다.
특허 제5723291호 - 에스트로겐 활성에 대해 화합물들을 스크리닝하는 방법
특허 제5298429호 - 스테로이드 호르몬 수용체에 대해 리간드를 동정하는 생분석법
특허 제5445941호 - 항-골다공증 약제를 스크리닝하는 방법
특허 제5071773호- 호르몬 수용체-관련 생분석법
특허 제5217867호 - 수용체들: 그들의 동정, 특성 결정, 제조 및 이용
핵 수용체
핵 수용체는 리간드 활성화된 전사 활성화제의 한 족으로서(Evans 및 Hollenberg, Cell, 52:1-3(1988)참조), 스테로이드 및 갑상선 호르몬, 레티노이드 및 비타민D를 포함하는 인자이다. 스테로이드 수용체 족은 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 안드로겐, 프로게스틴 및 에스트로겐으로 구성된다. 이러한 수용체들은 리간드 결합, 이량화, 트랜스액티베이션 및 DNA 결합을 위한 개별 도메인으로 조직되어 있다. 리간드가 결합하면 수용체가 활성화되고 이것은 콘포메이션 변화를 유도하며, 그 콘포메이션 변화로 인해 수용체의 이량화 및 보조-활성화 단백질의 결합이 일어난다. 이러한 보조-활성화제는 차례로 DNA에의 수용체 결합을 용이하게 하고, 이어서 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. 또한, 보조 활성화 단백질 뿐만 아니라, 리간드의 결합은 수용체 기능의 보조 억제제로서 작용하는 단백질의 결합을 해리하거나 결합을 방해하는 어떤 콘포메이션으로 수용체를 위치시키는 것으로 믿어진다(Lavinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 95:2920(1998)).
에스트로겐 수용체는 핵 수용체의 스테로이드 족 중 한 구성원이다. 인간 ERα는 여섯개의 기능적 도메인 또는 영역(A-F)으로 구성된 595 아미노산 단백질이다. A/B 영역은 전사 기능 AF-1을 포함하고, E 도메인은 전사 기능 AF-2를 포함한다. 이러한 기능들은 세포-특이적 방식 및 프로모터 문맥-특이적 방식으로 전사를 활성화시킨다. AF-1은 항상 활성인 반면, AF-2는 수용체에 호르몬이 결합함으로써 유도된다. C 영역은 DNA-결합 도메인 및 이량화 도메인을 포함한다. 그 DNA-결합 도메인은 조절된 유전자와 연합된 에스트로겐(수용체) 반응 요소(ERE)와 결합한다. DBD는 두개의 징크 핑거를 포함한다. C 영역은 또한 핵 위치지정 역할을 한다. EDUD역은 호르몬(리간드) 결합 도메인을 함유한다.
고전적인 ERE는 두개의 역위된 헥사뉴클레오티드 반복서열로 구성되고, 리간드가 결합된 ER은 호모다이머로서 ERE에 결합한다. ER은 또한 전사 활성화를 위해 리간드 및 AP1 전사 인자 Fos 및 Jun을 필요로 하는 AP1 전사 인핸서 요소로부터 유전자 전사를 매개한다. 타목시펜은 고전적인 ERE에 의해 조절되는 유전자들의 전사를 저해하지만, AP1 요소의 조절 하에서는 유전자들의 전사를 활성화시킨다. Paech, et al., Science, 277:1508-11(1997)를 참조하라.
호르몬의 부재 하에서, 에스트로겐 수용체는 그것이 저해 열 쇼크 단백질 복합체와 연합되어 있는 표적 세포의 핵 내에 위치한다(Smith, et al., (1993) Mol. Endocrinol., 7:4-11). 리간드가 결합되면 수용체가 활성화된다. 이 과정은 안정된 수용체 다이머를 형성하도록 하고, 이어서 표적 유전자의 조절 영역 내에 위치한 특이적 DNA 반응 요소와 상호작용하도록 한다(McDonnell, et al. (1991), Mol. Cell Biol., 11:4350-4355). 그런 다음 DNA에 결합된 수용체는 표적 유전자의 전사를 양성적으로 또는 음성적으로 조절한다. ER이 RNA 폴리머라아제 활성을 조절하는 정확한 메카니즘이 결정될 필요가 있지만, 작용물질이 결합된 ER이, 전사 어댑터 및 조절 정보를 세포전사기구로 전달하는 단백질들을 동원한다는 사실이 최초 밝혀졌다(Onate, et al. (1995), Science, 270:1354-1357; Norris, et al.(1998), J. Biol. Chem., 273:6679-6688; Smith, et al. (1997), Mol. Endocrinol., 11:657- 666). 역으로, 길항물질이 결합되면, 그 DNA에 결합된 수용체는, 세포가 작용물질 및 길항물질을 구별할 수 있도록 하는 보조-억제제, 단백질을 활발히 동원한다(Norris, et al. (1998); Smith, et al. (1997); Lavinsky, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2920-2925). 이러한 복잡성에 기초하여, 최근에는, ERα와 구별되지만 그와 유사한 것처럼 보이는 작용 메카니즘을 갖는 제2 에스트로겐 수용체 ERβ을 발견하였다(Greene, et al. (1996), Science, 231:1150-1154; Kuiper, et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5925-5930; Mosselman, et al. (1996), FEBS Lett., 392:49-53).
따라서 현재 알려진 바로는 이 수용체는 두 형태, α 및 β가 있지만 다른 형태가 존재할 수도 있다. 두 수용체 모두 에스트로겐에 반응하여 전사를 활성화시키는데, 에스트로겐은 성장, 분화 및 생식계의 기능성에 영향을 줄 뿐만 아니라, 뼈, 뇌 및 심장혈관계에도 영향을 미치는 스테로이드 호르몬의 중요한 군이다. 에스트로겐은 표적 세포의 이러한 별개의 세트에 넓은 범위의 영향을 미칠 수 있다. 이러한 별개의 영향은 부분적으로는 수용체의 아미노-터미널 및 카르복시-터미널 영역에 존재하는 두개의 다른 트랜스액티베이션(transactivation) 도메인의 조직 특이적 활성화에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 별개의 조직에서 수용체(α 및 β)의 두 형태가 작용하는 것으로 보이며, 이로써 유전자의 다른 서브세트의 트랜스액티베이션을 매개하는 것으로 생각된다(Paech, et al., Science, 277:1508, 1997; Kuiper and Gustafsson, FEBS Lett., 410:87, 1997; Nichols, et al., EMBO J., 17:765, 1998; Montano, et al., Mol. Endo., 9:814, 1995).
에스트로겐 수용체를 표적으로 하는 약제가 다른 표적 조직에서 다양한 영향을 나타낼 수 있다. 예컨대, 타목시펜은 유방 조직에서 ER 길항물질이지만(Jordan, V.C., (1992) Cancer, 70:977-982), 뼈(Love, et al. (1992), New Engl. J. Med., 326:852-856) 및 자궁(Kedar, et al. (1994), Lancet, 343:1318-1321) 조직에서는 ER 작용물질이다. 랄록시펜은 유방 조직에서 역시 ER 길항물질이면서, 뼈 조직에서는 작용물질 활성을 나타내지만, 자궁 조직에서는 작용물질 활성을 나타내지 않는다(Black, et al. (1994), J. Clin. Invest., 93:63-69). 실로 에스트로겐 수용체의 약리학을 이해하는 데에 가장 큰 과제 중 하나는, 어떻게 다른 ER 리간드가 그러한 별개의 생물학적 효과를 나타내는 가를 결정하는 것이다.
일반적으로 에스트로겐은 표적 조직에서 유전자 발현 및 세포 증식을 증가시키는 자극 인자이다. 그러나 많은 분자들이 수용체 상의 에스트라디올 결합 부위에 결합하는 것으로 기술되어 왔지만, 유전자 발현 및 세포 성장에 음성적인 영향을 미친다. 이러한 약제들은 역사적으로 "항에스트로겐"으로 칭해졌지만, 이 용어는 지나치게 단순화한 것으로 판명되었다(Tremblay, et al., Can. Res., 58:877, 1988; Katzenellenboge, et al., Breast Can Res. Treatm., 44:23, 1997; Howell, Oncology(Suppl. 1), 11:59, 1997; Gallo and Kaufman, Sem. in Oncol. (Supp1.1), 24:71, 1997). 이러한 약제들 중 가장 주목할 가치있는 것 중 하나는 타목시펜인데, 이는 ER-양성 유방암의 치료에 성공적으로 이용되었다. 트리페닐에틸렌의 한 유도체인 타목시펜은 세포에서 대사되어 4-OH 타목시펜을 생산하는데, 이는 ER의 에스트라디올 결합 포켓에 매우 높은 친화도를 갖는다. 이 화합물이 ER에 결합하기 위해 에스트라디올과 경쟁하지만, 그것은 유방 조직에서 전사 활성화를 유도하지 않으므로, 이 조직에서 세포 성장을 촉진하지 않고 고전적인 항에스트로겐으로 작용한다. 그러나 타목시펜은 다른 조직에서는 에스트로겐 유사 활성을 갖는다. 자궁에서 타목시펜은 치료된 환자에서 자궁내막 증식증 발생의 증가를 야기하는 자궁 조직의 성장을 촉진하는 수용체 활성의 길항물질로서 작용한다. 또한 타목시펜은 뼈 및 심장혈관계에서 에스트로겐 효과를 생산한다. 이 활성은 골다공증 위험의 감소 및 혈청 LDL 수준을 낮추는 등의 유익한 효과를 나타낸다. 타목시펜 등의 화합물에 의해 생산된 수많은 다른 효과들로 인해, 용어 "항에스트로겐"은 "선별적 에스트로겐 수용체 조절인자" 또는 SERM로 교체되었다. SERM는 그것이 발현되고 있는 수용체의 생물학 및 조직에 따라 ER 활성에 양성적 및 음성적 영향 둘다를 야기한다.
현재 연구의 목표는 뼈 및 심장혈관계에서 작용물질 또는 에스트로겐 영향을 갖거나 유방 및 자궁에서 길항물질 또는 항에스트로겐 효과를 갖는 SERM을 개발하는 것이다. 최근에 후-갱년기 증후군의 치료에 승인된 한 SERM이 랄록시펜이다. 랄록시펜은 벤조티오펜 유도체로서, 타목시펜과 유사하게 ER의 리간드 결합 포켓에 결합한다. 임상 연구는, 이 화합물은 유방 및 자궁에서는 에스트로겐 활성이 없는 반면 뼈 및 아마도 심장혈관계에서는 에스트로겐 활성을 갖는다는 것을 암시한다. 현재에는 후-갱년기 여성의 골다공증 치료에 처방되고 있다. 임상 시도에서 몇몇 부가적인 SERM이 있는데, 제약 산업에서 엄청난 노력이 부가적 SERM의 동정 및 특징화에 집중되고 있다.
SERM의 연구에는 주요한 장애가 따른다. SERM에 대해 화합물의 대규모 라이브러리를 스크리닝하기 위해서, 분자들이 원하는 효과를 갖도록 하는 간편한 동정 분석법이 필요하다. 현재에는 ER에 결합하기 위해 에스트라디올과 경쟁하는 화합물이 동정될 때, 그 활성을 결정하기 위해 많은 세포-기초 분석법을 행해야 한다. 이 연구는 생체외 분석보다 더 많은 노력을 요하고 SERM의 생물학적 활성의 완벽한 스펙트럼을 절대적으로 예측하는 것은 아니다. 따라서 종종 연구들은 SERM 의 작용의 선별적 방식이 결정될 수 있기 전에는 동물 모델 또는 임상 시도로서 행하여야 한다. SERM의 작용물질 및 길항물질 활성을 구별하는 간단한 생체외 시스템이 극도로 유용할 것이다.
그러한 시스템의 개발에는 SERM의 광범위한 영향을 도출시키는 메카니즘에 대한 지식이 필요하다. SERM의 ER 콘포메이션 변경 능력으로 인해 다른(작용물질 및 길항물질) 효과를 낼 수 있다는 증거가 있다. 일반적으로 수용체는 두 콘포메이션, 즉 활성 또는 비활성의 콘포메이션을 가지는 것으로 생각된다. 이러한 콘포메이션은 각각 리간드의 존재 또는 부재 시 형성된다. SERM은 수용체의 콘포메이션을 완전히 활성도 아니고 완전히 불활성도 아닌 한 콘포메이션으로 만든다. 이 중간 콘포메이션은 수용체와, 보조-활성화제, 보조-억제제 및 다른 조절 분자들과의 연합 패턴으로 변화하므로 다양한 효과를 창출한다. SERM에 의해 창출된 넓은 범위의 다양한 효과들은 또한 보조-활성화제 및 보조-억제제 뿐만 아니라 ER 알파 및 베타의 선별적 조직 발현에 기인할 수도 있다. 그것은 또한 두 수용체에 대한 SERM의 다른 친화도에 기인할 수도 있다.
전통적인 약제 스크리닝
전통적인 약제 스크리닝에 있어서, 천연 산물(특히 민간 요법에 이용되는 산물)이 생물학적 활성에 대해 테스트된다. 이러한 산물들의 활성 성분은 정제되고 특징이 결정된 다음에 이러한 "선도 약제"의 합성 아날로그가 지정, 제조되고 활성 테스트 된다. 이러한 아날로그 중 최상인 것은 "선도 약제"의 다음 세대가 되고 신규 아날로그가 형성되고 평가된다.
천연 산물 및 합성 화합물 둘다 단지 한 활성에 대해서만 테스트 될 수도 있지만, 테스트 하는 사람이 관심있는 모든 생물학적 활성에 대해 포괄적으로 테스트될 수도 있다. 테스트는 원래 동물에서 수행되었고, 그 이후에 분리된 기관, 조직 또는 세포, 또는 세포 배양액, 막 추출물 또는 정제된 수용체를 이용하는 덜 비싸고 더 간편한 시스템이 일부 약리학적 평가를 위해 개발되었다.
동물 전체 및 분리된 기관에서 테스트하기 위해서는 전형적으로 테스트할 대량의 화학적 화합물이 필요하다. 잠재적인 의약 화합물의 집합 내에 주어진 화합물의 양은 한정되어 있기 때문에, 이는 수행되는 스크린의 수를 제한할 필요가 있다.
또한, 동물 전체, 또는 분리된 기관 또는 조직 또는 좀 정도가 덜하지만, 배양된 세포를 사용하여 테스트된 화합물 사이의 구조/활성 관계(SAR)을 확립하기란 원래 어렵다. 이는 어떤 주어진 화합물이 작용하는 실제 분자 표적이 그 분석법에서 양성을 나타내는 다른 화합물의 그것과 꽤 다를 수 있기 때문이다. 매우 특이적인 표적 상에서의 화합물의 배터리를 테스트함으로써, 다양한 화학 잔기들의 작용을 양적 활성과 상호연관시킬 수 있고, 그 정보를 화합물의 특정 군 중에서 활성 화합물을 찾아내는 데에 이용할 수 있거나, 심지어 테스트된 활성 화합물에 의해 제공된 특성을 갖는 복합적인 신규한 화합물을 합성할 수도 있다.
동물 전체, 기관, 조직 및 세포 기초의 스크리닝의 또다른 단점은 특정 한계로 인해 활성 화합물이 그러한 상태가 되는 것이 방해된다는 것이다. 예컨대, 세포막을 통과하지 못하므로 테스트된 화합물 라이브러리 내의 잠재적 저해제는 활성화된 발암유전자(oncogene) 라스(ras)에 작용하지 못하고 세포 증식 분석에서 거짓 음성을 나타낸다. 그러나 분리된 계에서 라스를 테스트할 수 있다면, 그 잠재적 저해제는 양성 화합물로서 평가될 것이며 해당 SAR의 확립에 기여할 것이다. 따라서 화학적 변형이 막 투과성에 대한 화학 구조를 최적화하기 위해 수행될 수 있다. (세포-기초 분석의 경우에, 이 문제는 막 투과성을 변경시킴으로써 어느 정도 경감될 수 있다.)
약제 발견.
인간 게놈 연구는 70,000개 정도의 단백질, 각 잠재적 약제 표적을 코딩하는 유전자 서열을 산출해 낼 수 있고, 미생물의 게놈 연구는 이 수를 더 증가시킬 수 있다. 불행히도 대응 단백질의 생물학적 활성이 아닌, 게놈 연구가 유전자를 동정하기 때문에, 많은 유전자들은 그 활성화 또는 불활성화가 질병 진행에 아무런 영향이 없는 단백질을 암호화하는 것으로 판명될 것이다(Gold, et al., J. Nature Biotech., 15:297, 1997). 그러므로 단백질이 생리학적 매개를 위한 생산성 표적이 될만한 가능성이 큰지를 결정하는 방법이 요구된다.
관심있는 표적으로 거의 10,000개의 단백질을 이미 알고 있다해도, 이 10,000개 표적에 대해 유용한 활성을 부여할 가능성이 있는 몇만개의 약제를 효율적으로 스크리닝하는 것이 문제로 남아있다.
역사적으로 화학적 화합물 라이브러리를 얻어야 하는 것이 작은 회사가 약제 발견 분야로 진출하는 데에 장벽이 되었다. 동물 전체 및 배양액 중의 세포 상에서 테스트하기 위해서는 대량의 화학물질이 필요하기 때문에, 화합물이 생산될 때마다 그것은 상당히 대량으로 행해져야 한다. 따라서 일년에 화학자당 50개미만의 화합물 합성 및 정제 효율로 하여야 한다. 큰 회사는 무역 장벽으로서 그들의 거대한 수집을 유지하였다. 그러나 분자 수준으로 표적이 소형화되고 스크린이 자동화되면서, 분석에 필요한 특정 화합물의 양은 매우 소량으로 감소되었다. 이러한 변화로 인해 전통적 화학 라이브러리 대신에 소위 조합 화학 라이브러리의 이용을 위한 문이 열렸다. 조합 화학으로 인해, 많은 종류의 화합물을 빠르고 상대적으로 저렴하게 분자 표적에 관한 자동화된 분석에 적합한 소량을 합성할 수 있게 되었다. 수많은 작은 회사 및 대학 실험실에서 성공적으로 다양한 범위의 조합 화학 라이브러리를 생산하였다(Doyle, 1995, Gordon et al., 1994a, Gordon et al., 1994b).
조합 라이브러리
조합 라이브러리에서는, 화학 빌딩 블록이 많은 수(10E15정도)의 다른 화합물들로 랜덤하게 조합되고, 이것은 후에 하나 이상의 표적에 대한 결합(또는 다른) 활성에 대해 동시에 스크리닝된다.
랜덤한 올리고펩티드들로 이루어진 수천, 심지어 수백만 라이브러리들이 화학 합성(Houghten et al., Nature, 354:84-6(1991)), 또는 유전자 발현(Marks et al., J Mol Biol, 222:581-97(1991))에 의해 제조되는데 유전자 발현은 크로마토그래피 지지체 상에(Lam et al., Nature, 354:82-4(1991)), 박테리아 세포 내에(Colas et al., Nature, 380:548-550(1996)), 박테리아 필리 상에(Lu, Bio/Technology, 13:366-372(1990), 또는 파아지에(Smith, Science, 228:1315-7(1985)) 디스플레이되고; 항체(Valadon et al., J Mol Biol, 261:11-22(1996)), 세포 단백질(Schmitz et al., J Mol Biol, 260:664-677(1996)), 바이러스 단백질(Hong and Boulanger, Embo J, 14:4714-4727(1995)), 박테리아 단백질(Jacobsson and Frykberg, Biotechniques, 18:878-885(1995)), 핵산(Cheng et al., Gene, 171:1-8(1996)), 및 플라스틱(Siani et al., J Chem Inf Comput Sci, 34:588-593(1994))을 포함하는 다양한 표적에의 결합에 대해 스크리닝된다.
단백질(Ladner, USP 4,664,989), 펩토이드(Simon et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:9367-71(1992)), 핵산(Ellington and Szostak, Nature, 246:818(1990), 탄수화물 및 작은 유기 분자(Eichler et al., Med Res Rev, 15:481-96(1995))의 라이브러리 또한 약제 스크리닝 목적으로 제조되고 제안되어 왔다.
첫번째 조합 라이브러리는 펩티드 또는 단백질로 구성되어 있었고, 그 안의 모든 또는 선별된 아미노산 위치는 랜덤하였다. 펩티드 및 단백질은 높고 특이적인 결합 활성을 나타낼 수 있고 효소로서 작용할 수 있다. 결과적으로 그것들은 생물학적 계에서 가장 중요하다. 불행히도, 펩티드 그 자체는 치료법에 제한적으로만 이용된다. 그것들은 합성하는 데에 돈이 많이 들고, 프로테아제 존재 하에서 불안 정하며, 일반적으로 세포막을 통과하지 않는다. 다른 클래스의 화합물들이 약제 후보로서 더 좋은 특성을 갖는다.
핵산 또한 조합 라이브러리에서 이용되고 있다. 그들의 가장 큰 장점은 적절한 결합 활성을 갖는 핵산이 쉽게 증폭될 수 있다는 것이다. 결과적으로 핵산으로 구성된 조합 라이브러리는 낮은 반복성, 따라서 높은 다양성을 가질 수 있다. 그러나 결과적인 올리고뉴클레오티드는 몇가지 이유로 인해 약제로서 적당치 않다. 첫째, 올리고뉴클레오티드는 높은 분자량을 갖고 간편하게 대량 합성될 수 없다. 둘째, 올리코뉴클레오티드는 다가 음이온이므로 세포막을 통과할 수 없다. 마지막으로, 데옥시- 및 리보-뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 가수분해되는데, 이는 모든 생물계에서 일어나므로 표적에 도착하기 전에 통상 분해되어 버린다.
따라서 약제학적 이용에 더 적합한, 특히, 유용한 약리학적 약제를 생산했던 화학 클래스에 속하는 벤조디아제핀과 같은 작은 분자에 기초한 조합 라이브러리에 많은 관심이 집중되어 왔다. 조합 화학 기술은 이러한 표적에 작용하는 작은 분자들을 찾기 위한 가장 효율적인 수단으로서 인식되었다. 현재, 작은 분자 조합 화학은 통상의 비계 상에서 기능성을 갖는 다양한 배열을 나타내는 풀형성되거나 개별적인 분자들의 합성에 관한 것이다. 이러한 화합물들은 생물학적 활성의 결합 또는 저해를 위한 관심의 표적에 대해 스크리닝되는 라이브러리 내에 그룹지어진다. 몇만개의 화합물을 함유하는 라이브러리는 현재 루틴하게 합성되지만, 이러한 라이브러리를 모든 만개의 잠재적 표적과의 결합 또는 저해에 대해 스크리닝하는 것은 현재의 스크리닝 기술로는 논리적으로 불가능하고, 각 표적에 대해 스크리닝 되어야 하는 화합물의 수를 감소시키는 개선 하에서 수많은 실험적 그리고 계산적 방법들이 있다.
정보-집중적 약제 발견
Paterson, et al., J. Med. Chem., 39:3049-59(1996)에 의해 지적된 바와 같이, 의약 화학은 "선도 발견" 및 "선도 최적화"의 이중 과정을 통해 진보한다. "선도 발견"에서 조사 목적은 "활성 섬(island)", 즉 높은 빈도의 활성 분자를 갖는 화학 클래스(이 클래스는 다양한 분자 디스크립터에 의해 정의된 다차원적 공간 내의 어떤 부피로서 수학적으로 정의될 수 있다)를 발견하는 것이다. "선도 최적화", "활성 섬"은 상세히 연구된다. 합성되고 테스트된 각 화합물이 "선도 발견"에서 유사한 화합물의 "이웃"의 프로브로서 간주될 수 있다면, 그 이웃들이 중첩하는 물질을 테스트하는 것은 비효율적이다.
최근에 게놈 및 분자 생물학의 진보가 결합되어 정보 기술에서 혁명이 되었는데, 이는 관련 데이타베이스, 컴퓨터 그래픽 및 신경 네트워크(13)를 포함한다. 이러한 능력들로 인해 양적 관점에서 화합물 또는 표적을 디스크립하는 디스크립터의 데이타베이스를 구성할 수 있고, 이러한 디스크립터는 화합물의 구조, 그들의 생물학적 활성 및 그들이 작용하는 표적(5-8)에 대한 예측을 하는 것이 관련될 수 있다.
구조 디스크립터는 다양한 구조적 특징에 기초될 수 있다. 이러한 접근은 라이브러리 내 분자들의 유사도를 평가하는 데에 이용될 수 있는 분자적 디스크립터의 배열을 제공한다.
Patterson, et al., J. Med. Chem., 39:3049-59(1996), Klebe and Abraham, J. Med. Chem., 36:70-80(1993), Cummins, et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 36:750-63(1996), Matter, J. Med. Chem., 40:1219-29(1997); Weinstein, et al., Science, 275:343-9(1997)을 참조하라.
단백질에 있어서 구조적 디스크립터는 아미노산 서열로부터 직접 계산될 수 없다.
화합물들은 구조에 의해서보다는 그들의 활성에 의해 특징이 결정된다. 여덟개 단백질(이러한 단백질들은 쉽게 분석 가능한 활성, 작은 유기 분자와의 교차-반응성 및 결합 패턴에 있어서 서로간에 낮은 상관관계에 기초하여 선별되었다)의 참조 패널의 각 구성원과 각 화합물의 결합 잠재능(단백질의 활성의 50%가 저해되기 위해 필요한 농도)에 의해 5,000개 화합물 이상이 Kauvar, et al., Chemistry & Biology, 2:107-118(1995) "핑거프린트"되었다. 54개 화합물의 스크리닝 라이브러리는 이후에 그들의 "핑거프린트"(참조 패널 단백질에 대한 저해 활성)에 있어서의 다양성에 기초하여 선별되었다.
이 "트레이닝 세트"는 신규 단백질의 리간드 결합 특성과 참조 패널 단백질 의 그것과의 유사도를 높이기 위해 사용되었다. 역행 분석에 의해, 신규 단백질에 대한 계산적 대용물(둘 이상의 참조 패널 단백질의 가중된 합)이 결정된다. 신규 단백질의 활성을 저해하는 모든 핑거프린트된 화합물의 활성이 계산적 대용물의 구성 참조 단백질에 대한 그들의 적절히 가중된 저해 활성의 합으로서 예측된다. 예측은 신규 단백질에 대한 화합물의 부가적 세트를 테스트함으로써 향상될 수 있다. L. M. Kauvar, H. O. Villar. Method to identify binding partners, US 특허 제5587293을 참조하라.
상기 암의 분자 약리학의 연구에서 바인스타인(Weinstein)이 유사한 접근을 하였다. "활성" 데이타베이스(A)는 NCI에서 스크리닝된 60,000개 화합물에 대한 60개 세포주에 대한 활성을 함유한다. 세포주의 패널에 대한 활성 프로파일 내의 유사도는 어떤 두 화합물에 대해 계산될 수 있고, 일반적으로 한쌍씩 상관계수(PCC)가 평가되는데, 이것은 COMPARE라 불리우는 알고리즘에 의해 결정되고, 이는 데이타베이스 내의 모든 화합물과 사용자가 공급한 "종자" 화합물과의 유사도를 계산한다.
본 명세서에서 인용한 특허 또는 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌들은 여기에 통합되어 있다. 모든 참고문헌이 선행기술을 구성한다고 생각하지 않는다. 참고문헌들을 논의하는 것은 인용 서류들의 정확성 및 타당성에 대해 그 저자들이 주장하는 것에 대해 출원인들이 이의를 제기하기 위한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 작은 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 500달톤미만인 작은 유기 분자를 더욱 효율적으로 동정하기 위한 방법에 관한 것으로서, 그 분자는 약제학적으로 허용가능하고 단백질의 생물학적 활성의 잠재적 조절인자이다.
본 발명은 수용체 콘포메이션을 조사하기 위해 올리고머(특히 펩티드)를 사용하여 수용체 활성의 조절인자를 동정하고 특징을 결정하는 간단하고 일관된 수단 을 제공하는 것이다. 그것은 수용체의 활성을 조절하는 화합물에 대해 일차 및 이차 스크린 둘다에 있어서의 수단으로서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서는 그 방법은 완전히 생체외이므로, 화합물의 활성이 세포 기초 분석, 동물 전체 분석을 이용하지 않고서도 평가될 수 있다.
우리는 다양한 ER 리간드가 ER에서 별개의 콘포메이션 변화를 유도할 가능성을 조사하였다. 이러한 별개의 콘포메이션은, 차례로, 세포 및 조직 특이적 보조-활성화 또는 보조-저해 단백질 또는 에스트로겐 반응 요소와 수용체의 상호작용을 변화시킴으로써, 다양한 생물학적 효과를 야기한다. 제한된 단백질분해를 이용하여 사람들은 ER 작용물질 에스트라디올 및 ER 길항물질 Imperial Chemical Industries (ICI) 182,780이 별개의 ER 콘포메이션을 유도한다는 것을 보였다(McDonnell, et al.(1995), Mol. Endocrinol., 9:659-669; Beekman, et al. (1993), Mol. Endocrin., 7:1266-1274). 그러나, 실제는 이보다 훨씬 복잡하다. 다양한 ER 리간드, 소위 선별적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)는 순수한 작용물질도 길항물질도 아니다. 타목시펜 및 랄록시펜을 포함하는 이러한 리간드는 별개의 조직 특이적 생물학적 효과를 도출하지만 콘포메이션 차이는 프로테아제 분해 분석으로 알아낼 수 없다. 이러한 화합물은 또한 ER 활성에 영향을 미치는 별개의 콘포메이션 변화를 도출하는 것으로 생각되지만 그 변화는 프로테아제 분해 분석에 의해 감지되기에는 너무 희미하다(Brzozowski, et al.(1997), Nature, 389:753-758; Shiau, et al.(1998), Cell, 95:927-937).
본 발명은 에스트로겐 수용체에의 결합에 대해, 파아지-디스플레이된 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리된 펩티드가 수용체가 리간드된 여부, 또는 작용물질 또는 길항물질과 결합된 여부에 따라 현저하게 다른 결합 친화도를 나타낸다는 관찰에 기초한 것이다. 따라서 펩티드 결합은 단백질 콘포메이션의 지표, 따라서 수용체와 결합되는 화합물이 작용물질 또는 길항물질로서 작용할 것인지의 지표가 될 것이다.
본질적으로, 별개의 다른 방법들로 수용체의 콘포메이션을 변경시키는 "바이오키"(전형적으로 펩티드)의 한 패널이 그것의 다양한 바이오키-변경 콘포메이션으로 관심의 화합물과 수용체가 어떻게 상호작용하는지 하는 것에 관한 "핑거프린트"를 얻는 데에 이용되는데, 그 핑거프린트의 각 요소는 주어진 바이오키의 존재 하에서 수용체와 그 화합물의 상호작용 강도를 측정한다. 핑거프린트가 "금본위"(동물 전체, 또는 분리된 기관 또는 조직) 분석법에 의해 측정되는 것과 같이 공지의 생물학적 활성을 갖는 합리적인 수의 참조 화합물에 대해 얻어지는데, 신규 화합물의 핑거프린트와 참조 화합물의 핑거프린트의 유사도를 계산하여 신규 화합물의 생활성을 예측하는 데에 이용한다.
본 발명은 1) 다양한 다른 수용체에 같은 기술을 적용할 수 있다, 2) 그 시스템은 높은 효율의 스크리닝 및 화합물 특징결정에 이용될 수 있다, 그리고 3) 그 시스템은 매우 적은 단백질을 이용하여 수용체 활성의 작용물질 및 길항물질에 대한 아주 별개의 패턴을 제공한다는 점에서 상기 기술된 동물 전체-기초한 시스템 이상의 잇점을 갖는다.
본 발명의 "분자 점자법"(MB) 구체예에서, 대조 핑거프린트와 테스트 핑거프 린트는 생체외(셀-프리) 분석법에 기초한다.
본 발명의 "세포 점자법"(CB) 구체예에서, 대조 핑거프린트와 테스트 핑거프린트는 다세포 유기체 전체, 또는 그 기관 또는 조직의 분석에 기초한 것이 아닌 세포 분석법에 기초한다.
"분자 점자법"의 잇점은
* 단일 분석으로 친화도, 그리고 핑거프린트에 기초하여, 생활성에 대한 정보를 제공하는 점
* a) 단백질 구입 가격이 저렴하거나 b) 발현 및 정제가 쉬운 경우에는 더 신속하고 더 저렴하다는 점
* 구조-활성 관계에 대한 정보를 제공한다는 점
* 펩티드/수용체 상호작용이 그 방법에 도입된 어떤 외부 물질이 없기 때문에 더욱 고감도적이라는 점이다.
그것의 단점은
* 단백질이 활성이 되기 위해서 적절히 폴딩, 변형되거나 보조인자가 필요하면 안된다는 점
* CB에 의해 주어진 많은 정보를 제공하지 않는다는 점이다.
반대로 "세포 점자법"의 잇점은
* 이스트에서는 MB보다 저렴하다는 점
* 생활성(약용량:효능) 정보
* 동물 전체가 어떻게 반응하는 가에 대한 더 근접한 암시를 제공
* 활성 대사산물을 얻을 수 있다는 점
* 단백질 정제가 필요없다는 점이다.
그것의 단점은
* 세포 안으로 들어갈 수 없는 화합물이 자동적으로 선별되어 버린다는 점
* 친화도 정보를 직접 제공하지 않는다는 점
* 동물 전체 분석보다는 훨씬 낫지만, MB보다 효율이 떨어진다는 점이다.
"분자 점자법" 및 "세포 점자법" 둘다 동물 전체 생분석보다 더 신속하고 더 저렴하고 높은 효율을 위해 쉽게 자동화될 수 있고, 예비 스크린으로서 그들을 이용하면 동물 상에서의 실험을 최소화하는데, 이는 그 자체가 사회의 윤리적 목적에 부합하는 것이다.
두 기술 모두 순서대로 또는 동시에 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 예컨대 MB를 일차 스크린으로서 사용하고 CB는 일차 원형 양성의 이차 스크린으로서 사용될 수 있다. 또는 화합물들이 MB 및 CB 둘다에 의해 스크리닝될 수 있고, 둘 중 하나의 스크린에 의해 더 주의를 기울여 할 수도 있다. 유사도는 생체외 및 세포-기초 분석으로부터 각각 계산될 수도 있고, 또는 이러한 두 타입의 분석 결과가 각 참조 또는 테스트 화합물에 대해 단일 핑거프린트로 조합될 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 본 방법은 활성 및 불활성 수용체 둘다에서 생물학적 상호작용 부위를 드러내는 펩티드(바이오키)를 분리하기 위해 파아지 디스플레이를 이용한다. 이러한 바이오키는 수용체 콘포메이션의 변경에 대한 프로브로서, 활성, 불활성 및 부분적 활성인 수용체를 쉽게 구별할 수 있다. 펩티드를 가지고 얻어진 결합 패턴이 수용체 콘포메이션의 핑거프린트를 제공한다. 개개 펩티드의 결합은 수용체 활성의 작용물질 또는 길항물질의 존재 하에서 증가 또는 감소할 것이다. 그러한 활성은 조직-특이적일 수도 있고 아닐 수도 있다. 어떤 경우에, 분자가 작용물질이냐 길항물질이냐 하는 것은 그 조직이나(예컨대 SERM에 있어서), 다른 환경적 요소에 달려있을 것이다. 따라서 펩티드는 순수한 작용물질 또는 길항물질을 분류하는 데에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 더 복잡한 화합물을 분류하는 데에도 이용할 수 있다. 그 방법은 하기와 같이 적용할 수 있다:
1) 하나 이상의 이러한 단백질을 고 효율의 스크린으로 수용체 활성 조절인자를 동정하기 위한 경쟁적 대체 분석법에 이용할 수 있다.
2) 펩티드는 수용체 활성의 조절인자를 핑거프린트하는 데에 이용될 수 있고, 수용체 활성의 작용물질 또는 길항물질로서 조절인자들을 분류하는 데에 이용될 수 있다.
3) 오펀 수용체에 대해 동정된 펩티드는 이 수용체의 천연 리간드를 동정하는 데에 이용될 수 있다
4) 이 방법은 G-단백질 결합 수용체 등의 다른 수용체 뿐만 아니라, 핵 수용체에 대해서도 이용될 수 있다.
5) 리간드/기질 결합시 콘포메이션 변화가 일어나는 모든 단백질에 이 방법이 적용될 수 있다.
특별히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 에스트로겐 수용체 등의 핵 수용체에 대한 SERM 활성을 예측하는 데에 이용된다.
에스트로겐 수용체에서 SERM 활성의 특징을 결정하기 위해서, 우리는 생체외에서 ER α 및 β에 다양한 ER 연합 단백질이 결합하는 것을 모방하는 펩티드를 이용하는 한 시스템을 개발하였다. 그 펩티드는 우선적으로 수용체의 활성 또는 불활성 콘포메이션 중 하나에 결합하며, SERM의 결합으로부터 결과된 ER의 다른 콘포메이션 변화들 사이를 구별할 것이다. 그 시스템으로 인해 또한 ERα 및 ERβ 상에서의 SERM 영향을 비교할 수 있다. 이 분석은 새롭게 동정된 SERM의 상대적인 작용물질/길항물질 활성을 결정하기 위한 간단한 절차를 제공한다. 그 기술은 또한 모든 수용체의 선별적 조절인자의 분석에 적용될 수도 있다.
우리는 수용체 활성의 조절인자를 동정, 특징화 및 분류하기 위한 생체외 시스템을 개발하였다. 그 기술은 에스트로겐 수용체를 이용하여 개발되었고 파아지 디스플레이된 펩티드 라이브러리를 이용하여 활성 및 불활성 수용체 상에 생물학적 상호작용 부위를 맵핑하는 것에 기초한다. 이러한 부위에 결합하는 펩티드는 활성 또는 불활성 에스트로겐 수용체에 우선적으로 결합하는 단백질을 모방하는 것으로 보인다. 수용체 상의 특정 부위는 작용물질이 ER에 결합한 때에만 결합할 수 있다. 다른 부위들은 SERM 결합된 ER에 더 쉽게 결합할 수 있다. 에스트로겐 결합 수용체, 또는 SERM 결합 수용체 상에서 이 펩티드의 상대적 결합 친화도는 리간드가 결합되지 않은 수용체에 비해 SERM의 작용물질/길항물질 활성의 표시인 핑거프린트를 제공한다. 그 시스템은 몇몇 공지의 작용물질 및 SERM을 이용하여 ER 상에서 테스트되었다. 수용체 기능의 작용물질 및 SERM은 그들의 별개의 생체내 기능의 우리 시스템 표시로 별개의 핑거프린트를 만든다. 이 시스템은 적중된 것을 동정하고, 약제 스크린으로부터 선도 화합물을 분류하고 작용물질 및 길항물질의 관점에서 SERM을 특징화하며, 조직 및 수용체 특이성 등의 SERM의 가능한 임상 효과를 예측하기 위한 일차 스크리닝 수단으로서 이용될 수 있다. 이 방법은 또한 어떤 구성성분이 작용물질 및 길항물질 활성을 생산하는지를 결정하기 위해 SERM의 혼합물을 파편화하는 데에 적용될 수 있다. 이 방법은 또한 다른 수용체들(예컨대, 프로게스테론, 안드로겐, 글루코코르티코이드, 갑상선, 비타민D, 베타-아드레날린작동성, 도파민, 상피 성장 인자 등)을 가지고 수용체 활성의 조절인자를 동정, 특징화 및 분류하는 데에 이용될 수도 있다.
펩티드를 수용체 콘포메이션을 변형시키기 위한, 스크린 화합물 라이브러리를 돕기 위한 프로브로서 사용하기 위해 동정하면서, 이러한 펩티드들 중 특정의 것은 약제 또는 진단으로 이용될 수 있다.
게다가 비펩티드 모방물 또는 상기 펩티드들의 다른 아날로그가 약제 또는 진단에 이용될 수 있다.
스크리닝된 화합물 및 그 아날로그가 또한 관심의 대상이다.
도1은 작용의 다섯 부위에서 에스트로겐 수용체 활성을 조절하는 일곱 약제의 영향을 나타낸 것이다.
도2a 내지 도2d는 에스트라디올 또는 4-OH 타목시펜에 의해 영향을 받는 ERα(또는 그 부분)과 네 펩티드의 상호작용을 위한 결합 부위의 맵이다.
도3a 내지 도3b는 다른 리간드가 ER 알파 및 ER 베타에서 다른 구조적 변경을 유도하는 것을 나타낸 것으로서, 11개 다른 펩티드의 결합시 차이를 나타낸 것이다(이 도면에 기재된 데이타는 표14에 표로 나타내었다.)
도4a 및 도4b는 에스트라디올(작용물질) 및 랄록시펜(길항물질)의 ER알파 콘포메이션에의 영향을 비교한 것이다.
도5a 내지 도5e는 유사도를 계산하기 위해 도3 및 표14A의 데이타가 어떻게 이용되었는지를 보여주는 것이다.
도5a는 표14A를 복제한 것이다.
도5b는 원 유클리드 거리를 나타낸다.
도5c는 척도구성 후 계산된 유사도를 나타낸다.
유사도 = (최대 거리 - 실제 거리) / 최대 거리
8 디스크립터(바이오키) 및 스코어 0-7일 때, 최대 거리 SQRT(7*7*8), 또는 19.79899이다.
도5d는 도5c에 대응하는 3D 막대 그래프이다.
도5e는 에스트라디올 및 4-OH 타목시펜에 대한 유사도 데이타를 분리한 2D 막대 그래프이다.
도6a 내지 도6c는 유사한 방식으로 ER 베타 데이타에 기초한 유사도 계산을 나타낸다.
도7a 및 도7b는 포유동물의 투-하이브리드(two-hybrid) 분석 시스템을 이용하여 ERα 및 네개의 다른 펩티드(AB1, A2, AB3, AB5)와 일곱개의 약제의 상호작용을 분석한 것이다.
도8a 내지 도8d는 같은 분석 시스템을 사용하여 네개의 더 많은 핵 수용체 및 같은 네개의 펩티드와 다양한 약제의 상호작용의 특이성을 분석한 것이다.
도9a 내지 도9c는 일곱개 다른 약제에 의해 영향을 받은 돌연변이체 수용체(AF-2 기능이 손상된)와 네개의 펩티드의 상호작용을 조사한 것이다.
도10a 내지 도10c는 펩티드 농축의 기능으로서 ER 매개 전사 활성의 붕괴를 연구한 것이다.
도11a 내지 도11d는 타목시펜 활성화 ER의 A2 붕괴가 프로모터-의존성이 아니라는 것을 나타낸 것이다.
도12a 내지 도12b는 AP-1 경로에 의해 매개된 ER 전사 활성의 붕괴를 조사한 것이다.
도13a 내지 도13c는 타목시펜의 부분적 작용물질 활성을 방해하는, 펩티드 작용의 잠재적 메카니즘을 나타낸 도식적 모델이다.
도14a 내지 도14d는 에스트라디올(E2), 4-OH 타목시펜, ICI, DES, GW 7604, 에스트론, 이퀼린 및 D8,9DHE의 존재하에서, ER AF2에 대한 투-하이브리드 포유동물 시스템의 정상화된 루시페라제 활성을 나타낸다.
도15a 내지 도15h는 야생형 및 돌연변이체 ER 둘다에 다양한 펩티드가 결합한 것을 나타낸다.
도16a는 LXXLL-함유 펩티드의 작용의 결과로서 포유동물 세포 내에서 Eα 전사 활성화 기능의 붕괴를 나타내고, 도16b는 내인성 보조활성화제와 경쟁하기 위해 LXXLL 모티프 기능의 두 복사본의 상승적 상호작용을 나타낸다.
도17a 내지 도17c는 LXXLL 함유 펩티드가 HepG2 세포에서 AF2 기능을 붕괴시키는 것을 나타낸다.
도18a 내지 도18j는 핵 수용체가 LXXLL 모티프를 갖는 다른 펩티드들에 대해 다른 선호도를 갖는 것을 나타내는 것이다.
삭제
도19는 도7a 및 도7b에 도시된 데이타의 유사도 분석을 나타내는 것이다.
발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명
수용체-매개 약리학적 활성
많은 약리학적 활성 물질이 표적 세포의 수용체로서 알려진 요소와 상호작용함으로써 특이적 약리학적 반응을 도출한다. 수용체는 관측가능한 생물학적 효과를 유도하는 작용을 하기 위해 어떤 특이적 융합으로 화학 약제와 상호작용하는 유기체의 한 구성성분, 일반적으로는 고분자이다. 본 발명의 목적을 위해, 항체는 수용체로서 고려되지 않는다.
수용체 부위와 특이적 상호작용에 의해 반응을 도출할 수 있는 물질은 작용물질로서 알려져 있다. 전형적으로 수용체 부위에서 작용물질 농도가 증가하면, 최대 반응에 도달할 때 까지 그 증가에 따라 더 큰 반응이 유발된다. 최대 반응을 도출할 수 있는 물질은 완전한 작용물질로서 알려져 있고, 더 약한(그러나 인식할 수는 있는) 반응만을 도출하는 작용물질은 부분적 작용물질이다.
약리학적 길항물질은 반응을 도출함 없이 수용체와 상호작용 하는 화합물이고, 그렇게 함으로써 수용체가 작용물질과 반응하지 못하도록 한다. 경쟁적 길항물 질은 그 영향이 작용물질 농도를 증가시킴으로써 제거될 수 있는 것이고; 비경쟁적 길항물질은 그 작용이 작용물질 농도에 영향을 받지 않는 것이다. 격리 길항물질은 리간드에 결합함으로써 리간드 : 수용체 상호작용을 저해하여 리간드가 더이상 수용체에 결합할 수 없도록 한다. 경쟁적 격리 길항물질은 리간드에 대해 수용체와 경쟁하는 반면, 경쟁적 약리학적 길항물질은 수용체에 대해 리간드와 경쟁한다.
리간드는 수용체에 결합하는 물질이고, 이로써 작용물질 및 약리학적 길항물질 둘다를 포함한다. 그러나 수용체에 결합하지만 수용체를 작용시키지도 않고 길항시키지도 않는 리간드가 존재한다. 여기서는 수용체를 활성화시키는(작용시키는) 또는 저해하는(길항시키는) 리간드를 모두 조절인자라고 칭한다. 일부 조절인자는 환경에 따라서 작용물질 또는 길항물질로서 작용하는 역할을 변경한다.
천연 리간드는 인간의 간섭없이 자연에 존재하는 것으로 천연 수용체를 작용시키거나 길항시키는 역할을 한다. 천연 리간드는 그것이 결합하는 고유의 수용체를 갖는 유기체에 의해 생산될 수 있다. 병원균 또는 기생물에 고유한 리간드는 숙주에 고유한 수용체에 결합할 수 있다. 또는 숙주에 고유한 리간드는 병원균 또는 기생충에 고유한 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 모든 것들이 천연 리간드이다.
약제 길항작용의 임상적 개념은 작용물질 : 수용체 결합의 직접적인 저해에 관련되지 않은 현상을 포함하여, 약리학적 개념보다 더 넓다. "약리학적" 길항물질은 천연 작용물질의 생산, 방출 또는 수용체 부위로의 수송을 직접 또는 간적적으로 저해하거나, 수용체부위로부터 작용물질의 제거(물리적으로, 또는 비활성화 형태로 변형시킴으로써)를 직접 또는 간접적으로 용이하게 하거나, 또는 수용체의 생 산을 저해하거나 수용체의 회전 속도 증가를 저해하거나, 또는 활성화된 수용체로부터 신호 전달을 방해하는 물질이 될 수 있다.
한 수용체 (예컨대, 에스트로겐 수용체)의 약리학적 길항물질은 또다른, 예컨대, 전사 인자의 약리학적 길항물질일 수 있다. 한 수용체의 약리학적 길항물질은 또다른 수용체의 약리학적 작용물질이 될 수 있는데, 예컨대 일차 수용체의 천연 리간드를 분해하는 효소를 활성화시키는 것을 들 수 있다.
유사하게, 약리학적 작용물질은 천연 작용물질의 생산, 방출 또는 수용체 부위로의 수송을 직접 또는 간적접으로 증가시키거나, 수용체 부위로부터 작용물질의 제거를 직접 또는 간적접으로 저해하거나, 또는 수용체의 생산 또는 수용체의 회전 속도를 증가시키거나, 또는 어떤 방식으로 활성화된 수용체로부터의 신호 전달을 용이하게 하는 물질이라고 말할 수 있다.
"약리학적" 및 "생리학적" 조절 인자 둘다가 포함된다.
수용체의 기능적 길항물질은 반대로 작용하는 생물학적 반응을 유발하는 이차 수용체에 작용하거나, 일차 수용체의 활성화에 정상적으로 반응하는 것을 방해하는 물질이다. 따라서, 한 수용체의 기능적 길항물질은 또 다른 수용체의 약리학적 작용물질이 될 수 있다.
질병 상태가 수용체의 부적절한 활성화에 따른 결과라면, 그 질병은 생리학적 또는 약리학적 길항물질에 의해 예방 또는 치료될 수 있다. 또다른 질병 상태가 수용체의 불충분한 활성화를 통해 발생할 수 있는데, 이 경우에 그 질병은 적절한 생리학적 약리학적 작용물질에 의해 예방될 수 있다.
수용체의 중요한 클래스는 세포막의 인지질 이중막에 박혀있는 단백질이다. 수용체(전형적으로는 세포외 결합 부위)에 작용물질이 결합되면 세포내 부위에서 알로스테릭 변화가 유발되어 다른 고분자와 수용체의 상호작용을 변화시킨다. 생리학적 반응이 "이차 메신저"(작용물질이 "일차 메신저"이다) 또는 "이펙터" 분자와의 상호작용에 의해 개시된다.
효소는 수용체의 특별한 유형이다. 수용체는 생물학적 반응을 유발하는 복합체를 형성하기 위해 작용물질과 상호작용한다. 그런 다음 보통의 수용체는 작용물질을 원래대로 방출한다. 효소에 있어서, 작용물질은 효소 기질이고, 효소는 그 기질의 화학적 변형을 촉매시킨다. 따라서 효소 기질은 "리간드"이다. 효소는 반드시 막통과 단백질은 아니고; 그들은 분비된 또는 세포내 단백질일 수도 있다. 종종 효소는 수용체의 이차 메신저의 작용에 의해, 또는 더 간접적으로는 "상류" 효소 반응의 생산에 의해 활성화된다.
따라서 약제는 효소와의 상호작용으로 인해 유용할 수 있다. 약제는 효소에 대한 기질로서, 보조효소로서, 또는 효소 저해제로서 기능한다(역행불가능한 저해제는 "불활성제"이다). 약제는 또한 프로효소를 효소로 직접 또는 간접적으로 변환시킬 수 있다. 많은 질병은 특정 효소의 부적절하게 낮은 또는 높은 활성과 관련되어 있다.
본 발명은 수용체의 작용물질 및 길항물질 둘다를 동정하는 데에 이용될 수 있다. 상대적으로 작은 구조적 변화가 작용물질을 약리학적 길항물질로 변화시키거나, 그 반대의 경우가 드문 것은 아니다. 그러므로 약제가 참조 단백질과 상호작용 하는 것으로 알려져 있다고 해도, 의문의 약제가 그 참조 단백질 및 그 관련 단백질의 작용물질 및 길항물질 둘다로 동정될 수 있다. 유사하게, 공지된 길항물질이 부가적 길항물질 뿐만 아니라 작용물질을 위한 선도 약제로서 작용할 수 있다.
효능
수용체의 길항물질의 효능은 IC50으로 표현되고, 이는 생체외 또는 생체내 분석 시스템에서 수용체의 결합 또는 생물학적 활성의 50% 저해를 가져오는 길항물질의 농도를 말한다. 길항물질의 약제학적으로 유효한 약용량은 길항물질의 IC50, 및 수용체 및 그것의 임상적으로 뚜렷한 결합 파트너의 유효한 농도 둘다에 달려있다.
효능은 하기와 같이 카테고리가 나뉠 수 있다.
카테고리
IC50
매우 약함 >1μ몰
약함 100n몰 내지 1μ몰
중간 10n몰 내지 100n몰
강함 1p몰 내지 10n몰
매우 강함 <1p몰
바람직하게는 본 발명에 의해 동정된 길항물질은 상기 제시된 네개의 상위 카테고리 중 하나이고, 어느 경우라도 본 발명의 출원시에 의문의 단백질에 대해 알려진 어떤 길항물질보다도 더 효능있다.
유사한 방식으로, 작용물질의 효능이 수용체에의 최대 작용의 50%로 귀결되 는 약용량으로서 측량될 수 있다.
일반적 방법
본 발명에서, 특정 유기체 내의 특정 수용체에 의해 매개되는 테스트 물질의 생물학적 활성은 :
(I) "바이오키" 패널을 제공하는 단계로서, 그 "바이오키"는 하나 이상의 리간드의 존재 또는 부재하에서 수용체에 결합할 수 있는 다양한 능력을 갖고, 따라서 상기 패널은 하나 이상의 다른 수용체 콘포메이션 사이를 구별할 수 있는 단계;
(II) 수용체에 "바이오키"가 결합하는 것을 변경시키는 능력에 대해 하나 이상의 유기체 및 조직에서 수용체의 약리학적 작용물질 또는 길항물질로서 알려져 있는 둘 이상의 참조 물질의 세트를 스크리닝하는 단계로서, 각 참조 물질에 대한 참조 "핑거프린트"를 얻을 수 있고, 그 핑거프린트는 디스크립터의 배열이고, 각 디스크립터를 이용하여 수용체에 바이오키 패널 구성원이 결합하는 것에 대한 효과를 정성적 또는 정량적으로 결정하는 단계,
(III) 테스트 화합물이 수용체에 "바이오키"가 결합하는 것을 변경시키는 능력을 유사하게 스크리닝하는 단계로서, 테스트 핑거프린트를 얻는 단계,
(IV) 테스트 핑거프린트와 각 참조 핑거프린트와의 유사도를 결정하는 단계,
(V) 하나이상의 표적 유기체 및 하나이상의 그것의 표적 조직에서의 테스트 물질의 생물학적 활성을 테스트 물질 및 참조 물질 간의 유사도에 의해 적절히 측량된 참조 물질의 생물학적 활성에 기초하여 예측하는 단계를 포함하는 방법에 의해 예측할 수 있다.
단계(1)의 바이오키 패널은 (a) 리간드가 결합되지 않은 수용체 및 (b) 리간드가 결합된 수용체에 결합하는 능력에 대해 조합 라이브러리의 구성원을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 한 구체예에서, 조합 라이브러리는 (a)에 대해 먼저 스크리닝한 다음에, 전체 라이브러리 또는 리간드 결합되지 않은 수용체 결합 구성원 만을 (b)에 대해서 스크리닝한다. 또다른 구체예에서 전체 라이브러리를 (a) 및 (b)에 대해 동시에 스크리닝한다. (b)에 대해 먼저 스크리닝한 다음에 (a)에 대해 스크리닝 하는 것도 허용된다.
바람직하게는 조합 라이브러리는 증폭가능한 조합 라이브러리, 즉 핵산 또는 펩티드의 라이브러리이다. 바이오키 패널의 구성원들은 개개 분자, 또는 유사한 결합 특징을 갖는 분자들의 혼합물일 수 있다.
단계(II)는 주어진 수용체에 대해 단지 일회 수행되고 모든 참조 물질들이 동시에 핑거프린트될 필요는 없다. 또한 단계(II) 및 (III)는 순서를 바꾸어 수행될 수 있다.
단계(IV)에서 유사도가 정성적으로 그리고 핑거프린트를 "눈으로 관찰하는" 주관적 방법으로 더 유사하다는 경험으로부터 판단하여 결정될 수 있고, 또한 하기 기술할 유사도 측정을 이용하여 정량적 그리고 객관적 방식으로 결정될 수 있다.
유사하게, 단계(V)에서 생물학적 활성이 정성적 그리고 주관적 방법으로 예측되거나, 테스트 물질의 핑거프린트에 대한 각 참조 물질의 핑거프린트의 계산된 유사도에 의해 각 참조 물질의 활성 스코어를 수학적으로 매김으로써 더 정량적 그리고 객관적으로 예측될 수 있다.
예로서, ER에 결합하는 펩티드(바이오키)를 ER 작용물질의 존재 또는 부재하에서 ER에 결합할 수 있는 능력에 기초하여 분류할 수 있다. 그 펩티드들의 다른 친화도는 작용물질의 결합에 따른 수용체 콘포메이션의 변경에 기인한 것이다. SERM이 수용체 콘포메이션을 특유하게 변경시키므로 그것들은 다른 클래스 유래의 펩티드의 결합에 역시 영향을 줄 수 있을 것으로 보인다. 각 작용물질 또는 SERM은 관련된 약리학적 효과를 갖는다. 예컨대 에스트로겐은 유방 및 자궁, 뼈 및 심장혈관계에서 동시에 활성을 갖는다. 마찬가지로 타목시펜은 자궁, 뼈 및 심장혈관계에 동시에 영향을 미치지만 유방에서는 길항 효과를 갖는다. 각 화합물에 반응하여 ER에 결합하는 바이오키의 패턴은 각 화합물의 약리학적 효과와 일치할 수 있다. 부가적으로 ERα 및 β 상에서 바이오키 핑거프린트 간의 비교는 작용물질 및 길항물질 활성에 대한 정보를 보충할 것이고 조직 특이성의 예측이 될 것이다. 신규 에스트로겐 작용물질 및 길항물질이 ERα 및 ERβ에 그들의 바이오키가 결합하는 패턴에 기초하여 스크리닝되고 분류되고, 원하는 조직-특이적 활성을 갖는 화합물이 더 쉽게 동정될 수 있다. 하기 표는 가상적 핵 수용체에 대한 "바이오키 핑거프린트"의 가상적 표를 나타낸 것이다.
화합물 A | 화합물 B | 화합물 C | 화합물 D | 화합물 E | |
바이오키1 | + | + | + | + | + |
바이오키2 | + | + | + | + | - |
바이오키3 | + | + | + | - | - |
바이오키4 | + | + | - | - | - |
바이오키5 | + | - | - | - | - |
하기 표는 수용체 조절 화합물의 약리학적 효과의 가상적 표를 나타낸 것이다.
유방 | 자궁 | 뼈 | 심장혈관계 | |
화합물 A | + | + | + | + |
화합물 B | - | + | - | + |
화합물 C | - | + | - | - |
화합물 D | + | + | - | - |
화합물 E | + | + | - | + |
예컨대, 상기 표를 이용하여, 알려지지 않은 약리학적 효과를 갖는 화합물의 다양한 조직에서의 활성을 예측하기 위해 그 화합물을 "바이오키 핑거프린팅"에 의해 특징화할 수 있다. 화합물 A와 유사한 핑거프린트를 갖는 화합물 X는 화합물 A와 유사한 약리학적 효과를 갖는 것으로 예측될 것이다. 수용체에 특이적 바이오키가 결합하거나 결합하지 않는 것은 특이적 조직 유형에서의 활성을 암시하는 것이다. 상기 예에서, 한 화합물의 존재하에서 바이오키1이 수용체에 결합하는 것은 자궁에서의 활성을 암시하는 것이다. 반면 한 화합물의 존재하에서 바이오키5가 결합하는 것은 뼈에서의 활성을 암시하는 것이다.
물질
"물질"은 순수한 화합물이거나 화합물들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 적어도 본질적으로는 순수, 즉 임상적 이용에 허용될 수 있을 정도의 순수이어야 한다. 만약 혼합물이라면 그것은 적어도 생물학적으로 활성인 화합물의 유효한 양(즉, 생물학적 분석에서 감지가능한 생물학적 반응을 일으킬 수 있는)을 포함하거나, 생물학적으로 활성이 있을 거라 추측되는 그리고 활성이라면 선도 약제로서 적합한 화합물의 본질적인 양을 포함한다.
테스트 물질 및 선도 약제
테스트 물질은 약리학적 활성을 갖는 것으로 알려지지 않은 관심있는 약제의 원료로서, 물리적 특성(예컨대, 안정성)의 관점에서 일반적으로 적합한 구조적 클래스의 구성원인 화합물의 유효량을 포함한다. 선도 약제는 원하는 약리학적 활성을 갖는 것으로 추측되거나, 실제로 그러한 활성을 갖는 것으로 나타난 앞선 테스트 물질이므로, 약제로서 유용한 아날로그 및 유도체의 설계를 위해 출발점으로서 효과적으로 기능할 수 있다. "선도 약제"는 그것만으로도 유용한 약제일 수 있거나, 불충분한 효능 또는 원치않는 부작용 때문에 결함이 있는 물질일 수도 있다. 후자의 경우에 아날로그 및 유도체는 이러한 결함을 극복한 것으로 보인다. 전자의 경우에는 이미 유용한 약제를 더욱 개선시키는 것으로 보인다.
그러한 아날로그 및 유도체는 합리적인 약제 설계에 의하거나, 또는 아날로그 및 유도체의 조합 또는 비조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다.
바람직하게는 선도 약제는 1,000미만의 분자량, 더욱 바람직하게는 750미만, 더더욱 바람직하게는 600미만, 가장 바람직하게는 500미만인 화합물이다. 바람직하게는 그것은 -4 내지 +14 범위, 더 바람직하게는 -2 내지 +7.5 범위의 계산된 로그 옥탄올-물 분배 계수를 갖는다.
작은 유기 화합물 라이브러리는 1000미만의 분자량을 갖고, 펩티드 또는 핵산이 아닌 화합물의 라이브러리이다.
개별 구조적 클래스 유래의 SERM은 그것의 클래스에 유일한 핑거프린트를 만든다. 또한 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 클래스 유래의 SERM은 유사한 핑거프린트를 만든다. 동정된 수많은 SERM은 우리의 시스템 내에서 핑거프린트될 수 있다. 이것은 ICI 화합물 164,384 및 182,780 등의 스테로이드 항에스트로겐 화합물, 및 벤조티오펜 유도체 랄록시펜 및 트리페닐에틸렌 유도체 토레미펜, 드롤록시펜, TAT-59 및 이독시펜 등의 비-스테로이드 화합물을 포함한다. 스테로이드 SERM은 비-스테로이드 SERM과는 별개의 핑거프린트를 만든다(실시예2를 참조하라). ICI 화합물 등의 스테로이드 화합물은 이러한 화합물에 반응하는 어떤 에스트로겐 효과에 대해 잘 문서화된 증거가 없다는 점에서, 순수한 항-에스트로겐으로 카테고리된다. 이러한 핑거프린트는 리간드가 결합되지 않은(비활성의) 수용체에 유사할 수도 있고, 보조-억제제가 더욱 강하게 결합되어 있거나 보조-활성화제가 결합을 완전히 방해하는 것을 암시할 수 있다.
그 핑거프린트 시스템은 복합 혼합물로부터 작용물질 및 길항물질 구성성분을 동정하기에 유용하다. 처방 약제 프리마린은 후-갱년기 증후군의 치료에 유용하다. 그것은 가임 암말로부터 유도된 복합 혼합물이다. 이 혼합물의 활성 구성성분은 알려지지 않았다. 개개 구성성분의 핑거프린팅에 따른 프리마린의 파편화가, 구성성분들이 에스트로겐 수용체 기능을 조절하는 데에 활성 역할을 할 것이라고 암시한다. 또한 프리마린의 구성성분은 프로게스테론 수용체 등의 다른 핵 수용체와 상호작용할 것이다. 이 구성성분들의 효과 역시 결정될 수 있다.
참조 리간드
참조 리간드는 표적 수용체에 대한 리간드인 물질이다. 바람직하게는, 표적 유기체의 하나 이상의 표적 조직 내의 표적 수용체 단백질의 약리학적 작용물질 또는 길항물질이다. 그러나 참조 리간드는 그것이 작용물질 또는 길항물질이 아니라 하더라도, 그것이 그 수용체의 콘포메이션을 변경시킨다면, 유용할 것이며, 그 예 로서 리간드가 결합되지 않은 수용체에 결합된 적어도 일부의 바이오키가 리간드 결합된 수용체에도 마찬가지로 결합되지 않거나 또는 더 잘 결합하는 경우이다. 바람직하게는 참조 리간드는 바이오키에 다양한 효과를 미쳐서, 바이오키는 참조 리간드의 존재 하에 수용체와의 상호작용에 기초하여 분화될 수 있다. 참조 리간드는 한 수용체의 작용물질 및 다른 수용체의 길항물질이 될 수 있다. 또한 참조 리간드는 한 조직에서는 수용체의 작용물질, 다른 조직, 또는 다른 유기체에서는 같은 수용체의 길항물질이 될 수 있다.
참조 리간드는 수용체의 천연 리간드이지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
참조 리간드는 테스트 물질 및 선도 약제에 대해 상기 설명한 일부 또는 모든 요건을 만족시키지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
한 스크리닝으로부터 얻어진 테스트 물질이 선도 약제가 된다면, 그 화합물 또는 그 아날로그는 궁극적으로 적어도 한 유기체의 적어도 한 조직에서 적어도 한 수용체의 생물학적 활성을 매개하는 것으로 밝혀지고, 그것은 뒤따르는 다른 테스트 물질의 스크리닝에서 그리고 바이오키 패널을 재정의 하는 데에 참조 리간드로서 사용될 수 있다.
참조 콘포메이션
표적 수용체가 리간드가 결합되지 않은 상태일 때, 그것이 특정 콘포메이션, 즉 특정 3-D 구조를 갖는다. 수용체가 리간드에 결합되면 수용체의 콘포메이션은 변한다. 리간드가 약리학적 작용물질일 때, 새로운 콘포메이션은 생물학적 신호 전달 경로의 전사 인자 등의 다른 구성성분들과 상호작용하여, 표적 조직에서 생물학 적 반응을 도출한다. 리간드가 약리학적 길항물질이면, 새 콘포메이션은 수용체가 하나 이상의 작용물질에 의해 활성화될 수 없거나, 아니면 그 길항물질이 그 수용체를 활성화시키는 구조이다.
결합 배열에서 결합 표적으로서 사용되는 표적 수용체의 각 콘포메이션이 참조 콘포메이션으로 간주된다.
두개의 다른 리간드가 동시에 수용체를 같은 구조로 유도할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적을 위해서는, 다른 리간드과 관련되기 때문에, 그런 것들은 다른 참조 구조로 간주한다.
바이오키
본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 표적 수용체에 대한 하나 이상의 참조 리간드의 존재 및 부재시에 표적 수용체에 결합할 수 있는 능력을 갖는 물질인 바이오키가 참조 리간드를 분화하는 데에 이용될 수 있고, 궁극적으로는 테스트 물질(표적 수용체 단백질과 바이오키의 결합에 분석가능한 효과를 미치는 물질) 및 참조 물질(마찬가지고 그러한 결합에 분석가능한 효과를 미치지만 관심의 표적 유기체 및 조직의 수용체 단백질의 생물학적 활성에 미치는 그 효과가 알려진 물질) 간의 유사도 정도를 계산한다.
바람직하게는 바이오키는 조합 라이브러리의 구성원, 특히 펩티드 또는 핵산 라이브러리 등의 증폭가능한 조합 라이브러리이다. 그 라이브러리는 다양한 수용체 콘포메이션에의 결합에 대해 스크리닝된다. 바이오키는 그 자체가 선도 약제로서 적합할 필요는 없다.
바이오키 패널
참조 및 테스트 물질을 핑거프린팅하기 위해, 바이오키의 대표적 선별로 한패널을 모아야 한다. 만일 단일 참조 리간드만이 수용체에 대해 알려져 있다면, 그 패널은 하기 결합 클래스 중 적어도 두개의 각각 하나 이상의 대표 구성원을 포함할 수 있다.
클래스 | UL-R 결합 | 결합상의 변화 (리간드의 영향) |
A | + | + |
B | + | - |
C | + | 0 |
D | - | 0 |
E | - | + |
따라서 클래스 A, B 및 C는 리간드가 결합되지 않은 수용체(UL-R)에 결합하지만 그 리간드는 A의 결합을 증가시키고, B의 결합은 감소시키고 C의 결합에는 영향이 없다. 클래스 D 및 E는 UL-R에 결합하지 않는다. 그 리간드는 E가 수용체에 결합하도록 하지만 D에 대해서는 그렇지 않다.
상기 단지 두 경우만을 제외하고는, 적절한 특성을 갖는 바이오키가 동정될 수 있다면 그 패널은 그 클래스 중 셋, 넷 또는 다섯 모두의 대표 구성원을 포함할 수 있다.
상기 클래스는 정성적 방식으로만 결합을 관찰한다. 그러나 UL-R의 더 강한 그리고 더 약한 결합 사이, 리간드로 인한 결과로서 결합에 큰 그리고 작은 변화 사이를 구별할 수 있다. 원한다면 더 세분, 예컨대, 강함, 보통, 약함 등으로 세분할 수 있다.
한 리간드 이상이 가용이라면 조합적 가능성이 증가되고, 적합한 바이오키가 동정될 수 있다면 그 패널은 적절히 확장될 수 있다.
예컨대 리간드가 두개라면 하기 가능성이 존재한다.
바이오키 | UL-R | 리간드A | 리간드B |
Z | + | + | + |
Y | + | + | 0 |
X | + | + | - |
W | + | 0 | + |
V | + | 0 | 0 |
U | + | 0 | - |
T | + | - | + |
S | + | - | 0 |
R | + | - | - |
Q | - | 0 | 0 |
P | - | + | 0 |
O | - | 0 | + |
N | - | + | + |
더욱 구별될 수 있는데, 예컨대 Z-1에 대해서 B의 그것보다 A가 더 큰 효과, Z-2의 경우는 반대, Z-3의 경우는 동일하다 등으로 구별될 수 있다.
바람직하게는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 참조 리간드가 바이오키 패널을 한정하기 위해 사용된다.
특정 결합 클래스가 단지 하나의 바이오키에 의해 표현될 필요는 없다. 대신에 둘 이상의 바이오키의 혼합물에 의해 표시될 수 있고, 그 혼합물은 의문의 클래스에 대한 결합 기준을 만족시키는 바이오키 라이브러리 내의 모든 바이오키에 대응될 수 있다.
바이오키 패널의 구성원들은 패널의 구별력을 최대화하는 관점에서 선택된다. 예컨대 극한 경우를 들어, 만약 패널의 두 구성원이 같은 결합 성질, 수용체의 가능한 참조 콘포메이션 모두가 같다면 이러한 구성원은 반복성이다. 패널 내에 그것을 포함하는 것이 나쁘지는 않으나 당연히 스크리닝의 비용을 증가시킨다.
어떤 쌍의 잠재적 패널 구성원의 유사도는 하기 기술될 유사도 측정을 이용하여 결정될 수 있다. 주어진 패널의 전체 다양성은 각 쌍의 비유사도도 모두 계산함으로써 결정될 수 있다. 주어진 라이브러리로부터 추출된 주어진 크기의 패널에 대해, 생물학적 활성에 미치는 영향의 전체 다양성을 최대화 시킬 수 있다. 또는 라이브러리로부터 결합 구성원의 한 세트에 대해, 구성원의 수에 대한 전체 다양성의 비율을 최대화시키는 것의 크기 및 구성을 찾을 수 있다.
핑거프린트에서 패널-기초 디스크립터의 수는 일반적으로 패널 내의 구성원 수와 같을 것이다. 구성원의 최적 수는 참조 물질 및 그들을 분류하는 패널의 능력에 따라 다를 것이다. 참조 물질의 수가 크면 클수록, 참조 물질의 생물학적 활성이 예측되는 표적 유기체 및 조직의 수가 클수록, 패널은 커져야 한다. 전형적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 패널 구성원이 될 것이다. 더 많은 구성원이 사용될 수도 있지만 데이타의 예측력이 반드시 증가하지도 않으면서 분석 비용만 증가한다.
참조 물질
참조 물질은 의문의 수용체에 대한 약리학적 작용물질 또는 길항물질로서 알려져있고, 하나 이상의 유기체 및/또는 조직에서 공지의 또는 확인가능한 생물학적 활성을 갖는다.
전형적으로 주어진 수용체에 대해, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 참조 물질들이 핑거프린팅 된다.
테스트 및 참조 물질의 "핑거프린팅"
각 테스트 물질은 그것이 참조 물질과 비교됨으로써 복수개의 디스크립터("핑거프린트")에 의해 특징화될 것이다.
이러한 참조 물질들은 바이오키 패널을 한정하는 데에 이용되는 특정 참조 리간드일 수는 있지만 그러한 참조 리간드에 제한되는 것은 아니다. 따라서 실시예1에서는, 에스트라디올만이 다섯 클래스의 펩티드를 한정하는 데에 이용되었으나 그 참조 물질들은 에스트라디올, 에스트리올, 타목시펜, 나폭시딘 및 클로미펜이었다. 에스트라디올의 이용이 꼭 필요한 것은 아니다; 즉 참조 물질이 바이오 패널을 한정하기 위해 사용된 모든 참조 리간드를 포함해야 하는 것은 아니다.
참조 물질은 적어도 한 유기체 및 조직에서 약리학적 작용물질 또는 길항물질이어야 하지만, 참조 리간드는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 복수의 디스크립터는 참조 콘포메이션과 바이오키 패널의 한 구성원의 결합, 예컨대, 리간드가 결합되지 않은 수용체X, 수용체X/리간드 A, 수용체 X/리간드B, 리간드가 결합되지 않은 Y, 수용체Y/리간드C 등에 테스트 물질이 미치는 영향을 나타내야 한다. 여기서의 의미로는, 용어 "구성원"은 같은 결합 클래스의 바이오키의 혼합물을 말한다. 디스크립터는 정성적(결합안함, 증가, 감소, 영향없음 등) 또는 정량적일 수 있다. 바람직하게는, 적어도 2 내지 10 바이오키-기초 디스크립터가 이용된다.
테스트 기질은 당업계에서 알려진 구조적 디스크립터 등의 다른 디스크립터에 의해 부가적으로 특징화된다. 바람직하게는 적어도 5 내지 10개의 다른 참조 물질이 "핑거프린팅"된다.
참조 물질은 그들의 디스크립터가 유사도 정도가 계산될 정도의 방식으로 테스트 기질 디스크립터와 "짝형성"될 수 있도록, 테스트 물질과 유사한 방식으로 특징화될 것이다.
주어진 참조 또는 테스트 물질을 핑거프린팅할 때, 모든 패널 구성원에 대해 동시에 스크리닝될 수도 있고, 또는 개개 패널 구성원(패널 구성원의 하위세트)이 개별적으로 테스트될 수도 있다. 또한 모든 참조 물질은 주어진 수용체/패널 막 조합에 대해 동시에 스크리닝될 수도 있고, 개별적으로 스크리닝될 수도 있다. 그 같은 것이 테스트 물질의 스크리닝의 진실이다. 테스트 물질은 참조 물질 전에 또는 동시에 스크리닝될 수도 있다.
디스크립터
"디스크립터"(파라미터, 캐릭터, 변수 또는 변량으로도 알려짐)는 화합물(이것은 단백질 또는 단백질 리간드일 수 있다)을 수치로 표현한 특징으로서, 이는 다른 유래의 화합물들과 구별할 수 있게 한다. 디스크립터 값은 유용한 화합물에 대해 절대적으로 특이적일 필요는 없다. 그 특징은 순수한 구조 특징("구조 디스크립터"에서와 같이)일 수 있고, 또는 다른 화합물과 그 화합물의 상호작용을 말할 수도 있다. "짝형성된 디스크립터"는 두개의 다른 분자에서 측정하였는데 같은 특징을 갖는 디스크립터이다. "디스크립터 배열", "리스트" 또는 "세트"는 그 요소가 같은 분자에 대해 다른 디스크립터로 나타난 것을 말한다. 그러한 배열, 리스트 또는 세트를 여기서는 "핑거프린트"로서 언급한다.
두 화합물에 대해 짝형성된 복수개의 디스크립터가 두 화합물 사이의 유사도 를 계산하는 데에 사용될 수 있다.
유사도 수치
유사도 수치 또는 유사도 계수는 두 개체(화합물) 사이의 관계를 둘다에 공통적인 변량(디스크립터)들의 한 세트의 값으로 측량한다. 유사도 계수는 통상 0 내지 1의 범위의 값을 갖도록 한정된다.
통상 사용되는 유사도 수치는 산물 모멘트 상관 계수이다. 그 상관은 두 프로필이 유사하기만 하면 그들 수준이 얼마나 차이가 나는 지에 상관 없이 일정하다. 두 세트의 스코어가 정비례 관계라면, 두 프로필이 유사하지 않더라도 +1의 계수를 가질 것이다.
이진 디스크립터에 대해서 유사도의 가장 간단한 수치는 단순 일치 계수이다.
Sij = 일치의 개수/비교의 개수
자카드(Jaccard) 또는 스니쓰(Sneath) 계수는 i 및 j 둘다 0인 비트를 무시함으로써, 즉 음성 일치(상호 부재)를 무시함으로써 단순 일치 계수를 변경한다. 다른 말로하면 디스크립터 비트 열 둘다에 설정된 비트의 개수를 나눔으로써, 그리고 각각의 디스크립터 열에 설정된 비트의 총수로 나눔으로서 얻어진다. 이는 또한 비가중 타니모토(Tanimoto) 계수로 칭해진다.
디스크립터 k 및 개체 i 및 j 에 대한 가중 타니모토 계수는 하기와 같다.
고워(Gower)는 이진, 정성적 및 정량적 데이타에 사용될 수 있는 일반 유사도 계수를 정의하였다.
(개체 i 및 j 및 디스크립터 k에 대한 계수)
Wijk는 비교가 변수 k에 대해 유효하면 1, 그렇지 않으면 0으로 설정된다. Wijk가 0이면 Sijk는 0이다. 이진 데이타에 있어서, Wijk 및 Sijk는 변수가 두 개체에 있어 음수일 때 둘다 0이다. Sijk는 이진 변수가 두 개체에 대해 양수일 때만 양수이다. 정성적 데이타에 있어서, Sijk는 개체들이 k번째 특징에 대해 같다면 Sijk=1이고, 다르면 0이다. 정량적 데이타에 있어서, Sijk=1-|Xik-Xjk|/Rk이고, 여기서 Xik는 개체 i에 대한 디스크립터 k의 값이고, Rk는 변수 k의 총 범위이다.
디스크립터는 정량적 또는 정성적일 수 있다. 정량적 디스크립터는 정수 또는 실수일 수 있다. 정성적 디스크립터는 상대크기를 갖는 것으로 표현될 수도 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 이진 디스크립터는 정성적 디스크립터의 특별 케이스로서, 거기에는 전형적으로 특징의 존재 또는 부재를 나타내는 단지 두 카테고리가 있다. 변량이 여러 수준을 갖는 정성적 데이타(즉, 8비트로서 표현되는 8 수준의 변량)는 단일 이진 변수로서 간주되는 각 수준의 변량을 가지고 이진 데이타처럼 처리할 수 있다. 또는 그 수준이 수열(즉, 3비트로서 표현된 8 수준 변량)이 될 수 있다.
한 세트의 n-디스크립터는 n-차원의 디스크립터 공간을 정의하고, 디스크립터 세트가 이용될 수 있는 각 화합물이 디스크립터 공간 내의 한 점을 점유한다고 할 수 있다. 두 화합물의 비유사도는 그들이 디스크립터 공간 내에 점유하는 두 점 사이의 거리로서 표현될 수 있다.
거리 수치는 또한 메트릭(metric), 즉 (i) d(x,y) ≥0; 및 x=y일 때 d(x,y)=0; (ii) d(x,y)+d(y,x); 및 (iii) d(x,z)+d(y,z) ≥d(x,y)(메트릭 또는 삼각 부등식)의 조건을 만족시키는 유사도 수치이다. 물론 거리가 커질수록, 유사도는 낮아진다.
거리는 통계 분야에 공지된 다양한 거리 수치 중 어느 것에 기초하여 계산될 수 있다.
가장 일반적으로 사용된 거리 수치는 유클리드 메트릭으로 하기와 같다.
그것은 우리의 직관적 거리 개념에 가장 가깝다.
절대적, 시티 블록(city block), 또는 맨하탄 메트릭은 하기와 같다.
그것의 근거는 만일 변수들이 같은 값의 눈금 단위를 갖는다면, 그 엔티티는 두 단위가 두 변수 각각에 떨어져 있든 한 단위가 한 곳에 그리고 세 단위가 다른 곳에 떨어져 있든, 같은 거리를 가져야 한다는 것이다.
"코사인 쎄타"거리는 점 Xik에 대한 원점으로부터의 벡터 및 점 Xjk에 대한 원점으로부터의 벡터 사이의 각의 코사인이다.
일반화된 거리 수치는 하기와 같은 민코브스키(Minkowski) 메트릭이다.
이것은 r=2에 대한 유클리드 메트릭 및 r=1에 대한 시티 블록 메트릭이다.
마할로노비스(Mahalonobis) 거리 수치(D2)는 하기와 같은 형태이다.
dij = (Xi-Xj)' Σ-1(Xi-Xj)
상기 Σ는 그룹내 합동 분산-공분산 행렬이고, Xi 및 Xj는 엔티티 i 및 j에 대한 스코어의 벡터이다. 마할로노비스 거리는 만일 변수들이 비상관이고 D2가 표준 변수를 이용하여 측정된 유클리드 거리와 같다면, 변수들 간의 상관을 허용한다.
하기 나타낸 칸베라(Canberra) 메트릭은 변수 범위에 영향을 받지 않는 장점이 있다:
음수 상태를 조절한 변형된 형태는 하기와 같다.
칼호운(Calhoun) 거리는 순위만을 사용한다; 분자 i 및 j에 대해, 거리는 디스크립터 상태가 하나 이상의 디스크립터 k를 위해 i에 대한 것과 j에 대한 것 사이를 중재하는 전체 세트(i 및 j 제외한)의 비율이다.
거리 수치는 비-음수를 0..1 범위로 변환시키는 다양한 변환 중 어느 것에 의해 유사도 수치로 변환될 수 있다. 예컨대,
Sij = 1/(1+dij)
유사도 수치는 거리로 변환될 수 있다. 예컨대,
dij = 1 - Sij
구성성분인 디스크립터 각각에 대해 이론적으로 가능한 범위에 기초한 이론적 최대 거리(dtmax)가 있다면, 유사도는 하기와 같이 표현될 수 있다:
Sij = 1-(dij/dtmax)
대안적으로는 모든 쌍 간의 거리가 계산되고 그 다음 실제 최대 거리(damax)를 사용할 수 있다:
Sij = 1-(dij/damax)
실제 거리 대 실제 또는 이론적 최대 거리의 비율을 이용하는 대신에, 거리가 dij와 같거나 더 큰 쌍들의 분수로서 Sij를 표현할 수 있다. 이것이 상대 유사도의 수치이다.
디스크립터는 하기를 포함하는 몇몇 이유 중 하나때문에 가중(또는 변환)될 수 있다:
(a) 두 단백질이 구조적으로 유사한 약제에 의해 조절되는지 여부를 결정하기 위해 디스크립터의 인지된 값을 반영하기 위해;
(b) 디스크립터 데이타의 인지된 신뢰성을 반영하기 위해;
(c) 디스크립터 간의 눈금의 차이를 교정하여, 단지 디스크립터의 값이 더 높은 값을 나타내거나 더 넓은 범위로 퍼지기 때문에 그 디스크립터가 유사도 또는 거리 계산을 지배하지 않도록 하기 위해,
(d) 디스크립터 간의 상관에 대해 교정하기 위해서이다.
원 디스크립터 값은 거리를 계산하는 데에 이용하기 전에 먼저 변환될 수도 있지만 필수적인 것은 아니다. 전형적인 변환은 (a) 존재(1)/부재(0), (b) 1n(x+1), (c) 샘플내 빈도, (d) 루트, 및 (e) 상대범위, 즉, (값-최소)/(최대-최소)이다.
원 디스크립터 값은 제로 평균(x'=x-μx) 및/또는 단위 분산(x'=x/σx), 가능하게는 둘다(x'=(x-μx)/σx)를 갖도록 표준화될 수 있고, 0 내지 1의 범위로 떨어뜨리기 위해 표준화될 수 있다.
디스크립터 가중치는 경험상 특별히 설계된 테스트 세트의 기초하에 조절될 수 있다. 단백질의 트레이닝 세트가 인식된다. 디스크립터는 세트내 각 단백질에 대해 가치평가된다. 트레이닝 세트에 포함된 각 화합물에 대해 테스트된다. 이 화합물은 세트 내 어떤 단백질에 대해서도 그것에 작용 또는 길항하는 적어도 한 화합물이 존재하도록 선택된다. 디스크립터 가중치를 입력값으로 갖는 신경회로망은 계산된 단백질 유사도를 이용하여 각 단백질에 대한 각 화합물의 활성을 예측하는 데에 이용된다. 예컨대 그것은 단백질x와 모든 다른 단백질의 유사도를 계산한 후, 공지인 다른 단백질에 대한 그 화합물의 활성을 다루고, 그것을 단백질 x에 대한 화합물의 활성을 예측하는 데에 이용한다. 이것은 차례로 단백질x의 역할을 떠맡은 각 단백질을 가지고 반복적으로 수행된다.
변분 계수가 디스크립터 비교에 유용할 수 있다; 그것은 평균에 의해 나눠진 표준 편차이다. 디스크립터의 궁극적 유의성에 대한 유용한 정보가 없다면, 더 큰 CV를 갖는 그러므로 더 균일한 분포를 갖는 디스크립터에 더 큰 가중치를 줄 수 있다.
반드시 가중 디스크립터 사용, 가중치 유도의 어떤 특정 방법만의 사용이 필수적인 것은 아니라는 것이 강조되어야 한다.
어느 정도의 상관이 디스크립터 간에 존재할 것으로 보인다. 군집 분석, 주요성분 분석, 또는 부분 최소 스퀘어 분석 등의 표준 수학 방법이 어떤 디스크립터가 강하게 상관되었는지를 결정하고, 그것들을 원래 상관된 디스크립터의 가중된 합계인 새 디스크립터로 교체하는 데에 이용될 수 있다. 대안적으로 극도로 상관된 디스크립터의 각 쌍 중 하나를 선택(아마도 무작위적으로)하고 그것을 간단히 제거함으로써, 수집되어야 할 데이타의 양을 감소시킬 수 있다.
각 디스크립터 m에 대해 디스크립터 간의 상관을 교정하는 한 방법은, 모든 디스크립터n을 가지고(m=n을 포함, 계수는 반드시 단일의 것이어야 함) 그것의 제곱 상관 계수의 평균을 계산하고, "평균" 디스크립터n에 의해 설명되지 않는 디스크립터m에서 변분의 부분을 나타내는 가중치를 얻기 위해 이 수를 뺀다. 이 "평균r2" 방법으로, 만일 우리가 네개의 디스크립터를 갖는다면 두개는 서로 완벽히 상관되고, 그렇지 않으면 그 디스크립터들은 완전히 비상관이고, 그 상관된 디스크립터들은 각각 0.5의 가중치를 가질 것이고, 다른 두개는 각각 1.0의 가중치를 가질 것이다.
한 세트의 디스크립터에 의해 측정한 것과 같이 한 세트의 화합물의 다양성이 몇몇 방법에 의해 계산될 수 있다.
한 순수 기하학적 방법이, 각 화합물이 디스크립터 공간 내에 초구 (hypersphere)를 버린다는 추측에 관련있는데, 그 초구는 유사도 반경으로 알려진 반경을 갖는다. 하나이상의 화합물의 단위 유사도 반경 내의 점들의 디스크립터 공간 내의 총 초부피(hypervolume)가 계산된다. 이것은 초구의 중첩이 없다면, 즉 단일 초구의 n* 부피(여기서 n은 세트 내의 화합물의 개수이다)라면, 달성될 수 있는 초부피와 비교된다. 버려진 초부피가 직접 결정되거나 몬트 카를로(Monte Carlo) 방법에 의해 결정될 수 있다. 버려진 초부피 대 최대 초부피의 비율이 화합물 세트 다양성의 수치로서 그 범위는 1(최대) 내지 1/n(최소)이다.
또다른 접근법은 디스크립터 공간 내의 화합물들 간의 모든 쌍마다의 거리를 계산하는 것이다. 평균 거리는 다양성의 수치이다. 원한다면 이것은 평균 거리 대 최대 이론적 거리의 비율을 계산함으로써 비율화될 수 있다.
세번째 접근법은 화합물 세트에 군집 분석을 적용하는 것이다. 사용되는 방법은 군집 개수를 임의로 설정하지 않고 적합도 검정 기준에 기초하여 그 개수를 결정한 것이어야 한다. 군집의 결과된 개수가, 군집의 개수 대 화합물 개수의 비율과 같이 다양성 수치이다.
하기와 같이 디스크립터에 대한 무질서도 수치를 계산할 수 있다.
여기서 mk는 디스크립터k에서 다른 상태의 개수이고, Pkg는 디스크립터k에 대해 상태g를 나타내는 개체들의 관찰된 비율이다. 비상관 디스크립터에 있어서, 모든 k에 대한 H(k)의 총합이 전체 다양성의 수치이다. 표준 기술이 상관을 교정하는 데에 이용될 수 있다.
표적 수용체
표적 수용체는 바이러스 미생물(박테리아, 균류, 조류 및 원생동물), 무척추동물(곤충 및 웜), 또는 척추동물의 정상 또는 암세포(특히 포유동물, 조류 또는 어류 및 포유동물 중에서 특히 인간, 유인원, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 낙타, 양, 래트, 마웃, 토끼 기니피그, 고양이 및 개)를 포함하는 어떤 자연 공급원으로부터 얻어진 자연 발생 물질, 또는 그 서브유닛 또는 도메인이다. (일반적으로 그것은 단백질이며, 핵산일 수도 있다. 단백질에 대한 언급은 필요한 변경을 가하여 수용체로서 작용할 수 있는 핵산, 지질, 탄수화물 및 다른 고분자에 적용된다.) 대안적으로, 수용체 단백질은 천연 수용체의 변형된 형태일 수 있다. 변형은 표적 수용체의 표지 또는 고정화를 용이하게 하기 위해, 또는 그 생물학적 활성을 변경하기 위해(돌연변이 수용체의 저해제는 돌연변이 수용체의 원치않는 활성을 저해할 수 있고 다른 활성들을 실질적으로 원래대로 유지할 수 있다) 도입될 수 있다. 단백질의 경우에는, 변형이 돌연변이(유전적으로 암호화된 아미노산의 치환, 삽입 또는 결 실) 및 유도(당화, 인산화 및 지질화를 포함하는)를 포함한다.
표적 수용체는 그 중에서도 특히 글리코-, 리포-, 포스포- 또는 메탈로프로테인일 수 있다. 그것은 핵, 세포질, 막 또는 분비된 단백질일 수 있다. 그것은 효소일 수도 있지만 효소일 필요는 없다.
표적 수용체는 단백질 대신에, 고분자 핵산, 지질 또는 탄수화물일 수 있다. 핵산이라면 리보- 또는 데옥시리보핵산일 수 있고, 단일 또는 이중가닥일 수 있다. 효소활성을 가질 수 있지만 필수적인 것은 아니다.
표적 수용체는 단일 고분자일 필요는 없고, 하나 이상의 부가적 분자들, 특히 고분자들과 어떤 고분자의 복합체일 수 있다. 그 예로서 리보솜(RNA:단백질 복합체), 폴리솜(mRNA:리보솜 복합체), 및 크로마틴(DNA:단백질 복합체)를 들 수 있다. 결합 분자(또는 디스플레이 시스템으로서) 폴리솜을 이용에 대해서는 Kawasaki, USP 5,643,768 및 5,658,754; Gersuk et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:578(1997); Mattheakis, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:9022-6(1994)를 참조하라.
만약 있다면 표적 수용체의 공지된 결합 파트너는 그중에서도 특히, 단백질, 올리고 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 작은 유기 또는 무기 분자 또는 이온일 수 있다.
리간드 결합 상호작용에 참여하는 수용체의 작용기는 수용체의 리간드 결합 부위 또는 파라토프를 형성한다. 유사하게 이 상호작용에 참여하는 리간드의 작용기는 리간드의 에피토프를 형성한다.
단백질의 경우에는, 결합 부위가 전형적으로 상대적으로 작은 표면 조각이다. 단백질의 결합 특성은 종종 단백질 변성 없이 이 부위의 국소적 변형에 의해 변경된다.
수용체 상의 작용기 및 리간드 상의 작용기 사이에 공유결합으로 귀결되는 화학반응이 일어날 가능성이 있지만, 정상적으로는 몇몇 비공유 상호작용의 응집 영향의 결과로서 수용체 단백질-리간드 결합이 일어난다. 정전기적 상호작용은 염다리, 수소결합 및 반데르발스 힘을 포함한다.
소수성 상호작용이라 일컬어지는 것은 비극성 기 간에 선호적인 상호작용이 있다기 보다는, 실제로 비극성 기와 물 간에 수소결합이 없는 것을 말한다. 수소작용은 수용체 단백질의 콘포메이션을 안정화시키는 데에 중요하므로, 소수성 잔기들이 통상 묻혀있어서 결합 부위의 일부를 구성하지 않는다하더라도, 리간드 결합에 간접적으로 영향을 미친다.
수용체는 한 파라토프 이상을 갖고, 그것은 동일하거나 다르다. 다른 파라토프는 다른 결합 파트너의 에피토프와 상호작용한다. 개개 파라토프는 특정 결합 파트너에 특이적이거나, 몇몇 다른 결합 파트너와 상호작용할 수 있다. 수용체는 몇몇 다른 결합 부위를 통해 특정 결합 파트너와 결합할 수 있다. 그 결합 부위는 연속적이거나 불연속적이다(예컨대 수용체 단백질의 일차 서열에 관해).
많은 다른 수용체에 대한 작용물질, 길항물질, 래디오리간드(radioligand) 및 이펙터의 리스트가 King, Medicinal Chemistry : Principles and Practice, pp. 290-294(Royal Soc'y Chem, 1994)의 부록I에 나타난다. 부록II는 다양한 이온 채널(수용체의 또다른 특별한 유형인)에 대한 저해제들의 리스트이다. 일부 수용체 및 그들의 작용물질 및/또는 길항물질이 표A에 리스트되어있다.
프로게스틴, 안드로겐, 글루코코르티코이드, 갑상선 호르몬, 레티노이드, 비타민D3 및 미네랄로코르티코이드에 대한 수용체 등의 핵 수용체가 이 핑거프린팅 시스템에 이용될 수 있다. 펩티드 라이브러리의 친화도 선별이 상기 기술한 바와 같이 작용물질의 존재 또는 부재시 결합하는 펩티드 서열을 동정하는 데에 이용될 수 있다. 그 후 그 펩티드는 수용체 활성의 조절인자를 분류 및 특징화하기 위해 상기 기술한 방법에 이용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 프리마린의 구성성분은 프로게스테론 수용체와 상호작용할 것이다. 프로게스테론 수용체를 핑거프린팅하기 위한 시스템이 프리마린의 활성 구성성분에 대해서 테스트하기 위해 개선될 수 있다.
비-단백질성 수용체의 예로서, DNA를 들 수 있다. DNA는 예컨대 전사 인자 또는 작은 분자에 결합할 때 콘포메이션 변화를 야기할 수 있다. 예컨대 항종양제 시스플라틴이 DNA에 결합해 그 구조를 변경시킨다. 그 변경된 구조는 HMG 박스(높은 이동성 기)를 함유하는 세포 단백질을 유인한다. 그 단백질은 DNA 상에서 시스플라틴 손상의 회복을 입체적으로 방해하고 특정 유형의 암 치료에서 시스플라틴의 효능을 돕는다. 바이오키는 특정 콘포메이션으로 DNA에 특이적 결합하는 것으로 인식될 수 있다. 이러한 바이오키는 작은 분자 또는 단백질의 결합시 DNA에서 일어하는 콘포메이션 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
표적 유기체
본 발명의 목적은 이하 한정하는 바와 같이 표적 유기체의 하나 이상의 표적 조직에서 생물학적 활성을 예측하는 것이다.
그 표적 유기체는 식물, 동물 또는 미생물일 수 있다.
식물의 경우, 그것이 경제성 있는 식물일 수도 있는데, 이 경우에는 약제는 질병, 날씨 또는 기생충에 대한 저항성을 증가시키거나, 성장 특성을 변경시키거나, 유용한 특성 또는 식물의 표현되지 않은 바람직하지 않은 특성을 개선시키기 위한 의도를 갖는다. 또한 식물은 잡초일 수도 있는데, 이 경우에는 약제가 그 식물을 죽이거나 식물의 성장을 저해하거나, 그것의 특성을 잡초에서 경제성 있는 식물로 변경시키기 위한 의도를 갖는다. 식물은 교목, 관목, 농작물, 풀 등일 수 있다. 식물은 조류(이것은 경우에 따라 미생물이기도 함), 유관속 식물, 특히 겉씨식물(특히, 침엽수) 및 속씨식물일 수도 있다. 속씨식물은 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물일 수 있다. 가장 관심있는 식물들은 벼, 밀, 옥수수, 자주개자리, 콩, 감자, 땅콩, 토마토, 메론, 사과, 배, 서양자두, 파인애플, 전나무, 가문비나무, 솔나무, 개잎갈나무, 및 떡갈나무이다.
표적 유기체가 미생물이라면 그것은 조류, 박테리아, 균류 또는 바이러스(바이러스의 생물학적 활성이 바이러스-감염된 세포에서 결정되어야 하지만)일 수 있다. 그 미생물은 인간 또는 다른 동물 또는 식물 병원균일 수 있고 비병원성일 수도 있다. 그것은 토양 또는 물 유기체, 또는 통상 다른 생명체 내에 사는 것일 수 있다.
표적 유기체가 동물이라면, 그것은 척추동물 또는 비척추동물일 수 있다. 비 척추동물은 주로 그것들이 병원균 또는 기생충일 때 관심을 갖고, 약제는 살충 또는 신진대사 정지제 등으로서 작용하기 위한 의도이다. 관심있는 비척추동물은 곤충, 연체동물 및 절지동물을 포함한다.
표적 유기체는 또한 척추동물, 즉 포유류, 조류, 파충류, 어류 또는 양서류일 수 있다. 포유동물 중에서 표적 동물은 바람직하게는 영장류(예컨대, 인간, 유인원 및 원숭이), 우제류(예컨대, 소, 돼지, 양, 염소, 말), 쥐목(예컨대, 마우스, 래트), 토끼목(예컨대 토끼, 산토끼) 또는 식육류(예컨대 고양이, 개)에 속한다. 조류 중에서 표적 동물은 바람직하게는 기러기과(예컨대, 공작, 거위, 고니) 또는 순계목(예컨대, 메추라기, 들꿩, 꿩, 칠면조 및 닭)에 속한다. 어류 중에서, 표적 동물은 바람직하게는 청어류(예컨대, 정어리, 샤드, 멸치, 백상어, 연어)에 속한다.
표적 조직
용어 "표적 조직"은 생물학적 활성이 측정되는 표적 동물 전체, 그 기관 전체, 기관의 일부, 각종 조직, 세포 또는 세포 구성성분(예컨대, 세포막)을 말한다.
포유동물에서 대상 수용체 단백질을 발현시키는 실제로 어떤 조직 및 모든 조직에서의 생물학적 영향을 비교 및 대호하기 위해 흔하게 선택된다. 주유 조직은 뇌, 심장, 폐, 신장, 간, 이자, 피부, 장, 부신선, 유방, 전립선, 혈관, 망막, 각막, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 골수 등이다.
또 다른 분류로 세포 유형: B세포, T세포, 대식세포, 뉴트로필, 에오시노필, 비만세포, 혈소판, 거핵세포, 적혈구, 골수 스톰 세포, 섬유아세포, 뉴런, 성상세 포, 신경교질세포, 미세교질세포, 상피세포(피부, 유방, 전립선, 폐, 창자 등의 기관으로부터 유래된), 심근세포, 평활근 세포, 가로무늬근, 조골세포, 골세포, 조연골세포, 연골세포, 케라틴세포, 멜라닌세포 등이 이용될 수 있다.
"표적 조직"은 표B에 설명된 것을 포함하고, 단세포 유기체의 경우에는 "표적 유기체" 및 "표적 조직"의 구별이 없다.
생체외 및 생체내 분석
용어 "생체내"는 살아있는 유기체 내에서 발생하는 결합 또는 효소 작용 등의 사건을 서술하는 것이다. 그러나 의문의 유기체는 유전적으로 변형될 수 있다. 용어 "생체외"에서는 살아있는 유기체 외에서 일어나는 사건을 말한다. 유기체의 일부(예컨대 막 또는 분리된 생화학물질)이 인공적인 기질 및/또는 조건과 함께 사용된다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 용어 생체외는 단세포이건 다세포 유기체이건 상관없이 완전한 세포 내 또는 상에서 일어나는 사건을 배제한다.
생체내 시스템은 세포-기초 분석 및 유기체 분석 둘다를 포함한다. 용어 세포-기초 분석은 단세포 유기체에서의 분석 및 분리된 세포 또는 다세포 유기체로부터 유래된 세포 배양액을 포함한다. 세포 배양액은 그들이 조직 또는 기관으로 조직되지 않으면 혼합될 수 있다. 용어 유기체 분석은 다세포 유기체 전체에서 분석하는 것 및 그러한 유기체의 분리된 기관 또는 조직에서 분석하는 것을 포함한다.
생물학적 분석법
본 발명의 주요 목적이 생물학적 분석에 대한 요구를 최소화시키는 것일지라도, 그러한 분석이 전부 회피될 수는 없다. 어떠한 물질의 생물학적 활성을 예측 하기 위해서는, 적당한 수의 참조 물질의 활성을 알아야 한다.
생물학적 분석은 어떠한 물질에 대한 생물학적 존재의 반응을 측정 또는 감지한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 수용체에 의해 매개되는 반응과 관련되어 있다.
생물학적 존재(biological entity)는 완전한 개체, 분리된 기관 또는 조직, 신선한 분리세포, 무한증식세포, 하위세포적 구성요소(예컨대 세포막같은 것; 이 용어는 분리된 수용체를 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다)일 수 있다. 이 존재는 자연발생적 유기체 또는 그의 유도체일 수 있으며, 이는 어떤 방법에 의하여 변형될 수 있다. 변형은 유전자적인 것(방사선 조사, 화학적 돌연변이, 유전자 엔지니어링), 또는 체세포적인 것(예컨대, 외과적, 화학적인 것 등)일 수 있다. 다세포 존재의 경우에, 변형은 세포의 일부 또는 전체에 영향을 미칠 수 있다. 만약 표적 생물체의 생물학적 활성과 분석상의 생물학적 활성간에 적당한 상관관계가 있다면, 생물학적 존재는 표적 유기체 또는 그로부터 얻어낸 것일 필요는 없다.
생물학적 존재는 어느 정도 천연인 특정 환경에 두어진다. 예를 들어, 세포 배지는, 그럴 필요가 있는 것은 아니지만, 혈청 혹은 혈청 추출물을 포함할 수 있고, 또한 그것은, 그럴 필요가 있는 것은 아니지만, 일종의 고정성 또는 유동성 지지 매트릭스를 포함할 수도 있다. 그것은 생물학적 존재에 영양을 공급하거나 위협을 가하기 위하여, 특수한 생물학적 또는 화학적 작용제를 포함하거나 특수한 생리적 인자(예를 들어 온도)를 수반할 수 있다.
반응을 감지하는 탐지가능한 생물학적 마커도 또한 존재해야 한다. 세포 수 준에서 가장 보편적인 마커는, 세포 생존, 증식, 세포 행동(군집형성, 운동), 세포 위상(형태, 색상), 및 생화학적 활동(총 DNA합성, 총 단백질 합성, 예를 들어 산소 소비, 이산화탄소 생산, 유기산의 생산, 이온의 흡수 및 배출 등 특정 영양분의 이용과 같은 특이적 대사활동)이다.
생물학적 마커에 의해 만들어진 직접 신호는 신호 생산 시스템에 의하여 좀더 관찰이 용이한, 예를 들어 형광염색 또는 이온비색 신호와 같은 것으로 변조될 수 있다.
생물학적 존재, 환경, 마커 및 신호 생산 시스템은 임상적으로 만족스러운 감도, 특이성, 및 정확성을 달성할 수 있도록 선택된다.
참조 물질은 표적 수용체의 조직 분포와 관련하여 적당한 분석법으로 테스트되어야 한다. 예를 들어, 흉부 상피, 간의 간충직 세포, 용골세포, 및 자궁 상피 등에서 발현하는 에스트로겐 수용체에 적합한 분석법은, 다른 것들 중에서도, 흉부 및 자궁 상피 세포 증식. 용골세포 자괴, 및 트리글리세라이드 및 콜레스테롤과 같은 지질과, 고밀도 지단백질(HDL) 및 저밀도 지단백질(LDL)과 같은 지단백질의 간세포(hepatocyte) 생산을 포함한다.
만약, 다른 것들보다도, 전립선 상피, 간세포, 가로무늬근 세포에서 발현되는 안드로겐 수용체를 이용하고자 한다면, 다른 것들보다도, 전립선 이상증식, 이상비대 또는 전립선 상피세포증식, 근육세포 이상증식이나 이상비대, 및 간독성에 대한 참조물질의 셋트로 분석을 수행할 수 있다.
또 다른 예로, 만약 다른 것들보다도, 심장, 뇌, 말초혈관에서 발현되는 β- 2-아드레날린 작동성 수용체를 이용하고자 한다면, 심장 기능 분석(예를 들어 심박수 및 심전도 변화)에 사용되는 참조물질들, 그들이 혈압에 미치는 영향 분석 및 그들이 중추 신경계내 신경 활성에 미치는 영향 분석에 사용되는 참조물질들을 선택할 수 있다.
예비 스크리닝 분석
본 발명은 예비 분석을 위하여 세 가지 경우를 고찰한다.
(a) 공지의 수용체 및 하나 이상의 공지의 약학적 수용체 조절인자를 이용하여, 가능성 있는 "바이오키"을 스크리닝함(일반적인 방법의 단계 (Ⅰ)을 볼 것).
(b) 참조 핑거프린팅을 얻기 위하여, 공지의 수용체 및 구축된 "바이오키" 패널을 이용하여 공지의 수용체에 의해 매개되는 생물학적 활성을 가진 참조 화합물을 스크리닝(일반적인 방법의 단계 (Ⅱ)를 볼 것)함
(c) "바이오키" 패널의 리셉터에 대한 결합을 변형시키는 능력에 대하여 테스트 화합물을 스크리닝함으로써, 테스트 핑거프린트를 얻어냄(일반적인 방법의 단계 (Ⅲ)을 볼 것).
각 경우에 대하여 동일한 또는 다른 스크리닝 방법이 사용될 수 있다.
예비적인 스크리닝 분석법은 전형적으로 생채 외(셀-프리) 분석(고착화된 수용체에의 결합을 위한 것) 또는 세포-기반 분석(세포 표현형의 변화를 위한 것)이다. 이 분석법들은 온전한 다세포 유기체들 전부, 또는 분리된 기관 전부에 대한 스크리닝을 포함하지는 않는다. 생물학적 분석에 대한 의견은, 필요한 변경을 가하여 예비적 스크리닝 세포-기반 분석에 적용한다.
바람직한 세포-기반 분석법에서, 수용체는 내인성 또는 외인성 신호(생물학적 마커) 생산 시스템과 기능적으로 연관되어 있다.
"제로-하이브리드" 시스템들
이 시스템들에서는, 표적 단백질에 대한 펩티드의 결합이, 표적 단백질(또는 그것의 리간드 결합부위)이 내인성 단백질에 융합될 필요 없이, 스크리닝 가능한 또는 검출가능한 표현형의 변화를 유발한다. 표적 단백질은 내인성이거나, 또는 천연 신호 전달 경로의 잇점을 이용할 수 있도록 내인성 수용체와 실질적으로 동일한 것일 수 있다. 또는 일반적으로 표적 단백질과 연합된 신호전달 시스템의 풍부한 요소는, 신호가 표적 단백질과 결합될 수 있도록 세포로 가공, 변조될 수 있다.
"원-하이브리드" 시스템들
이 시스템들에서는, 키메라 수용체들, 즉 표적 단백질 및 내인성 수용체의 혼성물이 사용된다. 키메라 수용체는 표적 단백질의 결합 특성과 내인성 수용체의 신호 전달 특성을 갖는다. 따라서, 내핵성 수용체의 일반적인 신호 전달 경로가 뒤바뀐다.
바람직하게는, 내인성 수용체의 활성이 상실되거나, 이 분석의 조건이 내인성 수용체의 활성을 저해하여, 신호 대 잡음(시그날 투 노이즈) 비율이 상승된다.
(이스트 시스템과 관련하여, Fowlkes, USP 5,789,184를 보라)
"원-하이브리드" 시스템의 또 다른 시스템에서는 펩티드의 DNA 결합 도메인이 활성 도메인을 갖는 비융합 표적 수용체와 융합한다.
"투-하이브리드" 시스템들
바람직한 실시예에서, 세포-기반 분석법은 투-하이브리드 시스템이다. 펩티드 리간드의 한 구성부분인 수용체 결합 도메인은 DNA 결합 도메인(DNA binding domain, DBD)에의 융합으로 발현되고(이 융합 단백질을 "미끼"라고 한다), 다른 한 구성부분은 트랜스액티베이션 도메인(transactivation domain, TAD)에의 융합으로 발현된다(이 융합 단백질을 "물고기"라고 한다). 트랜스액티베이션 도메인은 DNA 결합 도메인과 상보적이어야 한다. 즉, 트랜스액티베이션 도메인은 특별히 디자인된 리포터 유전자의 전사를 활성화시키도록 DNA 결합 도메인과 상호작용해야 한다. 자연스럽게, 두 융합 단백질은 상보적일 것이다.
이 상보성은 단일 전사 활성 단백질로부터 기원한 상보적인 분리가능한 DNA 결합 도메인과 전사 활성 도메인을 이용하거나, 다른 단백질로부터 유도된 상보적인 도메인을 이용함으로써 얻어질 수 있다. 이들 도메인은 본래의 도메인과 같은 것이거나 이들의 돌연변이체일 수 있다. 분석 구성원들은 직접적으로 또는 매개 링커에 의해서 DBD나 TAD에 융합될 수 있다.
표적 DNA 오퍼레이터는 천연 오퍼레이터 서열이거나 돌연변이형일 수 있다. 오퍼레이터상의 돌연변이는 DBD 및 TAD상의 돌연변이와 조응할 것이다. 적당한 전사 활성화 시스템의 예는 박테리아 리프레서 LexA 및 이스트 전사인자 Gal4로부터 얻은 활성화 도메인을 포함하는 것으로서, 여기서 리포터 유전자는 LexA 오퍼레이터에 작동적으로(operably) 연결된다.
원상 그대로의 표적 수용체를 사용할 필요는 없다; 단지 리간드 결합 부분이면 충분하다.
두 융합 단백질은 동일 또는 다른 벡터로부터 발현될 수 있다. 마찬가지로, 활성가능한 리포터 유전자는 융합 단백질의 일방(또는 쌍방)의 것과 동일한 벡터로부터 발현될 수도 있고 제3의 벡터로부터 발현될 수도 있다.
가능한 DNA 결합 도메인은 Gal4, LexA, 및 상기와 실질적으로 동일한 돌연변이체를 포함한다.
가능한 활성 도메인은 E. Coli B42, Gal4 활성 도메인 Ⅱ, 및 HSV VP 16, 및 상기와 실질적으로 동일한 돌연변이체를 포함한다.
가능한 오퍼레이터는 목표된 활성 도메인에 대한 천연 오퍼레이터 및 천연 오퍼레이터와 실질적으로 동일한 돌연변이체를 포함한다.
융합 단백질은 핵 국재화(nuclear localization) 신호를 포함할 수 있다.
본 분석 시스템은 역시 신호 생산 시스템을 포함한다. 이 시스템의 첫 번째 요소는 DBD 및 TAD에 반응하는 오퍼레이터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자이다. 이 리포터 유전자의 발현은, 직접적으로 또는 간접적으로, 선별될 수 있는 또는 스크리닝될 수 있는 표현형(신호)의 결과를 만들어낸다. 신호 생산 시스템은, 리포터 유전자 외에도, 신호의 생산에 참여하는 추가적인 유전자적인 또는 생화학적인 요소를 포함할 수 있다. 그러한 요소는, 예를 들면, 세포 배양 배지내의 선택적인 약제일수도 있다. 하나 또는 그 이상의 신호 전달 시스템이 존재할 수 있고, 그 시스템은 하나 이상의 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
시스템의 민감도는 예를 들면, 활성화 또는 신호전달과정의 어떠한 단계상의 경쟁적 저해제의 사용, 오퍼레이터 숫자의 증가 또는 감소, 더욱 강한 또는 더욱 약한 DBD 및 TAD의 사용 등과 같은 방법에 의해 조절될 수 있다.
신호가 문제의 세포의 생존 또는 죽음, 문제의 세포의 증식 또는 비증식의 것일때, 그 분석법을 셀렉션(selection)이라고 한다. 그 신호가 단지 신호가 없는 상태(살아있는 세포의 또 다른 상태)의 동일한 세포로부터 구별시켜주는 탐지가능한 표현형의 신호에 불과할 때는, 그 분석법을 스크린이라고 부른다. 그러나, "스크리닝 분석법"이라는 용어는 셀렉션을 포함하는 넓은 의미로 쓰일 수 있다. 좁은 의미를 의도할 때는 "논셀렉티브 스크린"이라는 용어를 사용할 것이다.
다양한 스크리닝 및 셀렉션 시스템은 Ladner, USP 5,198,346에서 논의되어 있다.
스크리닝 및 셀렉션은 펩티드; 표적 단백질 또는 화합물; 표적 단백질 상호작용을 대상으로 하는 것과 대상으로 하지 않는 것이 있다.
바람직한 분석 세포들은 미생물(박테리아, 효소성, 해조, 원핵생물), 척추동물(특히, 포유동물, 특별하게는 인간)의 것이다. 가장 잘 발달된 투-하이브리드 분석법은 이스트와 척추동물 시스템이다.
일반적으로, 투-하이브리드 분석법은, DBD와 TAD의 상호결합을 재구성하는 단백질 X와 단백질 Y의 능력에 의하여 단백질 X와 단백질 Y가 상호작용하는지를 결정하기 위하여 사용된다. 그러나, 확장된 투-하이브리드 분석법은 제3의 비단백질 리간드에 좌우되는 상호작용을 탐지하기 위하여 사용된다.
투-하이브리드 분석법의 가이드를 위해서는 다음을 참조하라;(Brent and Finley, Jr., Ann.Rev.Genet., 31:663-704(1997); Fremont-Racine, et al., Nature Genetics, 277-281(16 July 1997); Allen, et al., TIBS, 511-16(Dec. 1995); LeCrenier, et al., BioEssays, 20:1-6 (1998); Xu, et al., Proc. Nat. Acad, sci. (USA), 94:12473-8 (Nov. 1992); Esotak, et al., Mol. Cell. Biol., 15: 5820-9 (1995); Yang, et al., Nucleic Acids Res., 23: 1152-6 (1995); Bendixen, et al., Nucleic Acids Res., 22: 1778-9 (1994); Fuller, et al., BioTechniques, 25: 85-92 (July 1998); Cohen, et al., PNAS (USA) 95: 14272-7 (1998); Kolonin and Finley, Jr., PNAS (USA) 95: 14266-71 (1998).; Vasavada, et al., PNAS (USA), 88: 10686-90 (1991) (우발적 복제 분석법), and Rehrauer, et al., J. Biol. Chem., 271: 23865-73 91996) (Lex A 리프레서 절단 분석법)
"실질적인 동일"
돌연변이 단백질은, (a) 그것이 참조 단백질의 특이적 결합 활동 또는 비영양성 생물학적 활동의 적어도 10%를 갖는다면, (b) 참조 단백질과 아미노산 서열이 적어도 50% 동일하다면, 참조 단백질과 실질적으로 동일한 것이다.
아미노산 동일성의 퍼센트 비율은, 유사도를 극대화하는 방향으로 서열을 광범위하게 배치하는 엄격한 동적 프로그래밍 알고리즘에 따라 돌연변이 및 참조 서열을 배열함으로써 결정되며, 그 유사도는 비편향(unbiased) PAM250에 따라 배열된 각 페어(pair)에 대한 점수(score) 및 각 최초 틈새(gap)에 부여되는 -12, 그 이후의 틈새에 대하여 부여되는 -4의 페널티(penalty) 점수를 합산하여 계산된다. 동일성 퍼센트는 참조 서열에 대응하는 비율(즉, 삽입된 공백을 셈)로 표현되는 일치 분(match)의 숫자이다.
돌연변이 DNA 서열은, 만약 그것이 구조 서열이고, 암호 돌연변이체와 참조 단백질이 앞서 기술된 바와 같이 실질적으로 동일하다면, 참조 DNA 서열과 동일하다.
대신에 만약, 조절 서열이라면, 돌연변이 서열이 적어도 참조 서열의 조절활성의 10%를 가지고 있고, 참조 서열과 뉴클레오티드 서열의 50%가 동일하다면, 실질적으로 동일하다. 퍼센트 동일성은 일치되는 단백질에 대하여는 +5, 불일치분에 대해서는 -4, 틈새 개방에 대해서는 -12의 패널티, 틈새 확장에 대해서는(공백마다) -4의 패널티를 부여하여 계산한다.
바람직하게는, 최소 동일성 50%, 예컨대 51%, 66%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 초과하는 서열은 실질적으로 동일하다.
DNA 서열들은 또한, 그들이 엄격한 조건하에서 서로 혼성화할 경우에, 즉, 돌연변이 한가닥과 참조 DNA의 더욱 상보적인 한가닥으로 이루어진 이종쌍가닥의 Tm이, 참조 DNA의 동종쌍가닥의 Tm보다 10℃ 정도 작게 나오지 않는 조건에서는, 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 전형적으로 이것은 퍼센트 동일성 85-90%에 해당한다.
조합적 라이브러리
"라이브러리"라는 용어는 일반적으로 기원, 구조, 및/또는 기능상으로 서로 연관되어 있고, 관심이 되는 어떠한 특성에 대하여 동시에 스크리닝될 수 있는 화학적 또는 생물학적 존재들의 집합체를 지칭한다.
"조합적 라이브러리"는 각 구성원이 한정된 셋트의 요소들의 계획적 또는 무작위적 조합으로서, 각 구성원들의 특성은 그것으로 편입되어 들어간 요소의 위치 및 선택에 따라 달라진다. 전형적으로, 라이브러리의 멤버는 적어도 동시에 스크리닝될 수 있다. 무작위화는 전부 또는 일부분일 수 있다; 일부 부위를 무작위로, 다른 부분은 미리 정해진 대로 구성할 수 있으며, 그리고 무작위 위치에서도, 미리 정해진 방식에 의해 선택이 제한될 수 있다. 조합적 라이브러리의 구성원들은, 그 구성 단량체의 선택, 연결 링키지, 또는 올리고머 또는 폴리머의 길이의 선택에 변화를 둔 일종의 올리고들 또는 폴리머들일 수 있다. 또는 그 구성원들은, 표준적인 중심 구조를 가시고 있는 비올리고머성 분자들로서, 1, 4-벤조디아제핀 구조와 같이, 특정 가변 부위에서의 치환분에 의해 도입되는 변이를 가지는 것일 수도 있다. 또는 그 구성원들은, 그림조각 퍼즐처럼 조합된, 그러나 그 각 조각은 하나 이상의 가변 부위(다양성에 기여하는 부위) 및 하나 이상의 보존적 부위(문제의 조각을 상호 결합하게 하는 기능성을 제공하는 부위)를 갖는 비올리고머성 분자들일수도 있다.
그러한 라이브러리들의 하나 이상의 구성원들이 표적 분자를 인식하는 능력을 "조합적 인식"이라고 한다. "단일 조합 라이브러리"에서는, 모든 구성원들이 같은 종류의 화합물(예를 들어, 펩티드)에 속하고, 동시에 합성될 수 있다. "혼성 조합 라이브러리"는 두 개 이상의 단일 조합 라이브러리(예를 들어 DNA와 펩티드, 또는 펩조디아제핀 및 카바메이트)의 혼합이다. 혼성 조합 라이브러리내 구성원인 단일 라이브러리의 숫자는, 당연히, 각 단일 라이브러리의 평균 구성원 숫자보다 일반적으로 작다. 이는, 그렇지 않으면 라이브러리를 이용하는 잇점이 개별 합성보다 작기 때문이다.
올리고뉴클레오티드 라이브러리
올리고뉴클레오티드 라이브러리는 조합적 라이브러리로서, 적어도 그 멤버들의 일부분은 포스포디에스테르 또는 유사한 결합에 의해 연결된 3개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드들은 선형, 고리형, 또는 가지형(branched)일 수 있으면, 또한 비핵산 부분을 가질 수 있다. 뉴클레오티드들은 DNA 또는 RNA에서 일반적으로 발견되는 것들에 제한되지 않는다. 예를 들어 변형된 뉴클레오티드들은 앱타머(aptamer)의 뉴클레아제 저항성 및 화학적 안정성을 증진시킨다(Chart 1 in Osborne and Ellington, Chem. Rev., 97: 349-70 (1997)); RNA 스크리닝과 관련하여서는 Ellington and Szostak, Nature, 346: 818-22(1990)을 보라.
이들 올리고뉴클레오티드들의 형식적인 최소 또는 최대 사이즈는 없다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 취할 수 있는 구조의 숫자는 염기의 길이에 따라 기하급수적으로 늘어난다. 따라서, 올리고뉴클레오티드가 길수록 그것이 단백질 표면에 조응하여 폴딩(folding)할 수 있는 가능성이 늘어난다. 반면에, 매우 긴 문자들은, 합성 및 스크리닝이 가능하기는 있지만, 더 짧은 분자들에 대하여 훨씬 더 큰 친화성을 제공하지 않는 한, Osborne 및 Ellington(1997)에서 설명된 것과 같은 이유로, 선택된 군집내에서 그들이 발견될 가능성이 없다. 따라서, 본 발명의 라이브러리는 바람직하게는 3-100 염기, 더욱 바람직하게는 15-35 염기를 지니는 올리 고뉴클레오티드로 구성된다. 어 떠한 주어진 라이브러리의 올리고뉴클레오티드들은 동일하거나 다른 길이를 갖는다.
올리고뉴클레오티드 라이브러리들은 고밀도(예를 들어 1015)의 라이브러리들을 쉽게 만들 수 있고, 결합 분자들이 쉽게 생체 외에서 폴리머라아제 체인 리엑션(PCR)에 의해 의해서 증폭될 수 있다는 장점을 갖는다. 나아가 핵산 분자들은 표적 분자들에 대하여 높은 특이성 및 친화도를 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 SELEX 방법(King and Famulok, Molec, Biol. Repts., 20: 97-107(1994); L.Gold. C. Tuerk. Methods of producing nucleic acid ligands, US#5595877; Oliphant et al. Gene 44: 177 (1986))에 의하여 올리고뉴클레오티드 라이브러리들을 마련하고 스크리닝한다.
"앱타머(aptamer)"라는 용어는 표적 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오티드들을 말한다. 이러한 앱타머들은 표적 단백질을 특징짓기 위하여 직접적으로(앱타머를 동정하고 앱타머와 단백질간의 접촉지점을 확인함으로써), 또는 간접적으로(단백질의 화학적 반응을 변조하기 위하여 앱타머를 리간드로 사용함으로써) 사용될 수 있다.
펩티드 라이브러리
펩티드 라이브러리는 조합적 라이브러리로서, 적어도 그 구성원들 중의 일부는 펩티드 결합으로 연결된 3개 이상의 아미노산을 가지고 있는 펩티드들이다. 바람직하게는, 그들은 적어도 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 길이이다. 바람직하게는, 그들은 50 이하, 더욱 바람직하게는 20 아미노산 이하이다.
펩티드는 선형, 고리형, 또는 가지형일 수 있으며, 비펩티드성 부분을 포함할 수 있다. 아미노산들은 천연의 아미노산들에 한정되지 않는다.
편향(biased) 펩티드 라이브러리는 하나 이상(전부는 아니다)의 펩티드 잔기가 불변 잔기인 것을 말한다. 각 구성원들은 펩티드 리간드들(PL)로 칭해진다. 한 구체예에서, 내부 잔기가 불변일 경우, 펩티드 서열은 다음과 같이 표시된다.
(Xaa)m-AA1-(Xaa)n
Xaa는 천연 아미노산이거나 또는 시스테인을 제외한 아미노산이고, m 및 n은 2-20의 범위 내에서 선택되고, Xaa는 동일하거나 다를 수 있고, AA1은 라이브러리 내의 모든 펩티드들에 대하여 동일한 천연 아미노산이지만 어떠한 아미노산일 수도 있다. 바람직하게는, m 및 n은 4-9의 범위 내에서 선택된다.
바람직하게는, AA1은 펩티드의 중앙 또는 그 근처에 위치된다. 더욱 상세하게는, m 및 n은 2 이상의 차이가 나지 않는 것이 바람직하며; m 및 n 이 동수인 것이 더욱 바람직하다. 선택된 AA1에 대하여 표적 단백질(target protein; TP) 결합 활동이 요구될지라도(적어도 결합 활동을 허용할 것), 그것이 적합하게 위치될 수 있도록 보장할 수 있는 특수한 측면 잔기가 필요할 수 있다. 만약 AA1이 어느정도 중앙부에 위치된 경우, 라이브러리는 측면 잔기에 대한 다양한 선택의 폭을 제공한다. 만약 AA1이 끝에 있다면, 이러한 유연성은 감소된다.
가장 바람직한 라이브러리들은 AA1이 트립토판, 프롤린 또는 티로신인 것들 이다. 두 번째로 바람직한 것은 AA1이 페닐알라닌, 히스티딘, 아르기닌. 아스파라긴산, 류신 또는 이소류신이다. 세 번째로 바람직한 것은, AA1인 아스파라긴, 세린, 알라닌 또는 메티오닌이다. 가장 바람직하지 않은 것은 시스테인 및 글리신의 경우이다. 이러한 우선성은 무작위 펩티드 라이브러리를 다수의 다른 TP들에 대하여 스크리닝한 결과의 평가에 기초한다.
기능성 도메인들에 결합하는 리간드들은 독특한 특성 뿐 아니라 불변부위를 가지는 경향이 있다. 따라서, "편향" 펩티드 라이브러리들을 사용함으로써, 리간드를 찾아내는 부담을 덜 수 있다. "편향" 또는 "비편향" 라이브러리들은, 반응성 디스크립터, 그리고 선택적으로, 펩티드 앱타머 디스크립터나 또 다른 선도 약제를 개발하는데 사용될 "바이오키" 펩티드들을 동정하기 위하여 스크리닝될 것이다.
오펀 수용체의 연구
오펀 수용체(orphan receptor)는 비-오펀(nonorphan) 수용체와의 서열 유사성을 갖는다는 측면에서 정의되었지만, 그 정의에서 알 수 있듯이, 천연 리간드를 지니지 않는다.
어떤 화합물의, 오펀 수용체에 의해 매개되는 생물학적 활성을 예측하기 위한 첫 번째 단계는, 오펀 수용체에 대한 적어도 하나의 약학적 작용물질 또는 길항물질을 규명하는 것이다(일단 그러한 화합물이 규명되면, 수용체는 더 이상 "오펀"이 아니다). 이 리간드는 그 수용체에 대한 천연 리간드일 필요가 없으며, 이것은 바이오키 패널 등을 결정하기 위한 참조 리간드로 이용된다.
길항물질과 작동물질을 동정하기 위하여, 우선, 조합적 라이브러리를 스크리닝, 수용체와 결합하는 구성원들을 걸러낸다. 적어도 5개, 더욱 바람직하게는 적어도 10개의 명료한 멤버들이 검출된다. 이것은, 바람직하게는, 하나이상의 결합 부위와 관련된 대조 실험을 통하여 뒷받침 될 수 있는 것이어야 한다.
그 다음, 상기 언급된 하나 이상의 조합적 라이브러리 구성원들이 오펀 수용체와 결합하는 것을 저해하는 능력에 대하여 화합물들을 스크리닝한다. 그렇게 처리하는 것은 수용체의 구조를 변화시켰을 가능성이 있다. 이러한 추정 리간드들을 작동물질 및 길항물질 능력여부에 대하여 스크리닝한다. 조사되는 생물학적 활성들은, 바람직하게는, 오펀 수용체와의 동일 기원 수용체에 고유한 활성을 포함한다. 조사는 또한, 바람직하게는, (수용체 또는 그에 대응하는 mRNA의 탐지에 의해) 상기 오펀 수용체가 발현되는 곳으로 알려진 각 세포에 대한 세포 증식 분석을 포함한다.
스크리닝된 화합물은 적당한 조합적 또는 비조합적 라이브러리로부터의 작은 유기 화합물일 수도 있고, 또는, 천연 리간드를 수반하는 천연의 혈청, 소변, 세레브로사이드액, 림프액, 또는 조직추출물로부터 기원한 것들일 수도 있다. 선택적으로, 이러한 천연 물질들을 전통적인 방법으로 분쇄한 후에, 각 분쇄물을 테스트할 수 있다. 화합물은 동일기원의 수용체에 대한 공지의 작용물질 또는 길항물질(또는 그들의 아날로그)일 수도 있으나 그렇지 않을 수도 있다.
미소 유기 화합물 라이브러리
미소 유기 화합물 라이브러리(약칭하여 "화합물 라이브러리")는, 그 구성원 들이 표적 단백질에 대한 생물학적 활성을 매개하는 경우, 약제로 사용하기에 적합한 조합적 라이브러리이다.
펩티드들은 약제로 사용되기에는 몇가지 불리함이 있다. 이것들에는 혈청 프로테아제에 의해 분해되기 쉽다는 점, 세포막 침투에 곤란한 점이 포함된다. 바람직하게는, 화합물 라이브러리의 모든 또는 대부분의 화합물이 펩티드들의 약학적 불리함을 동일한 수준까지 피하거나 극복할 수 있다.
화합물 라이브러리를 디자인함에 있어서는, 신 약제를 얻기 위해 사용되었던 전통적인 분자 변형방법을 염두에 두는 것이 도움이 된다. 변형의 세가지 기본적인 종류는 다음과 같이 정의될 수 있다: 분리(disjunction), 선도 약제 내의 약물작용 활성부분을 동정하기 위하여 선도 약제를 단순화한다; 결합(conjunction), 두 개 이상의 같거나 다른 공지의 약물작용 활성부분이 공유결합, 또는 비공유결합적으로 연합하여 신약을 형성한다; 변경(alteration), 한 부분이 분리 및 결합에 영향을 미치지 않는 유사하거나 다른 부분으로 대체된다. "분리". "결합" 및 "변경"이라는 용어의 사용은 최종 산물과 원래의 의도물과의 구조적 관계를 암시적으로 표현하기 위한 것이지. 신 약제가 실제로 합성되는 과정(실제로 두 경우가 일치하더라도)을 표현하기 위한 것은 아니다.
분리의 과정은 다음에서 설명되어 있다;the evolution of neostigmine (1931) and edrophonium (1952) from physostigmine (1925). 이후의 결합 (conjunction)은 다음에서 설명되어 있다; demecarium(1956) and ambenonium(1956)
변경은 본래의 크기, 극성, 전자분배를 변형하는 것을 포함한다. 변경은 환 의 개폐, 높거나 낮은 동족체의 형성, 포화 이중결합의 삽입. 광학적 활성 센터의 삽입, 거대 그룹들의 삽입, 제거, 교체, 동배체적 또는 생(bio)동배체적 치환, 그룹의 위치 및 향배상의 변화, 알킬화기의 삽입, 저해성 또는 촉진성 유도(정전기적 또는 접합적(공명)) 효과를 노리는 그룹의 삽입, 제거 또는 교체를 포함한다.
따라서, 치환물들은 전자 수용체 및/또는 공여체일 수 있다. 전형적인 전자 공여체 (+I)는 -CH3, -CH2R, -CHR2, -CR3 및 -COO-를 포함한다. 전형적인 전자 수용체 (-I)는 -NH3+, -NR3+, -NO2, -CN, -COOH, -COOR, -CHO, -COR, -COR, -F, -C1, -Br, -OH, -OR, -SH, -SR, -CH=CH2, -CR=CR2 및 -C=CH를 포함한다.
치환물들은 또한, 접합 시스템 내에서 전자밀도를 상승시키거나 감소시키는 것들을 포함한다. 전자 (+R) 그룹들은 -CH3, -CR3, -F, -CI, -Br, -I, -OH, -OR, -OCOR, -SH, -SR, -NH2, -NR2 및 -NHCOR을 포함한다. 후자 (-R) 그룹들은 -NO2, -CN, -CHC, -COR, -COOH, -COOR, -CONH2, -SO2R 및 -CF3를 포함한다.
종합적으로 말해서, 변형은 핵친화적, 전자친화적 치환, 환원과 산화, 추가와 제거, 이중 결합 절단, 및 고리화 반응을 포함하는 다양한 단일 과정들에 의해서 달성될 수 있다.
라이브러리를 구성하기 위하여, 하나 이상의 약학적 활성(반드시 공지되거나 예상된 표적 단백질의 활성과 관련을 가질 필요는 없다)을 가지는 화합물 또는 화합물 집합은, 두 개 이상의 공지의 또는 가능성 있는 약물작용 활성부분으로 분리 될 수 있다. 각 부분의 아날로그는 동정될 수 있으며, 원래의 선도 화합물과 유사성이 있는 화합물을 재조합하기 위하여 이러한 아날로그들의 혼합물을 서로 반응시킨다. 라이브러리들의 모든 구성원들이 선도 화합물의 부분들 모두와 유사한 부분들을 지니고 있을 필요는 없다.
라이브러리의 디자인은 벤조디아제핀의 예에 의해서 설명될 수 있다. 클로로디아제폭시드, 디아제팜, 옥사제팜을 포함하는 몇 개의 벤조디아제핀 약제는, 흥분억제제로 사용되어 왔다. 젠보디아제핀의 유도체는 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있다; 유도체는 불안 완화제 뿐 아니라, 경련제, 콜레시스토키닌 수용체 서브타입 A나 B, 카파 오피오이드 수용체, 혈소판 활성 인자, HIV 트랜스액티베이터 Tat 길항물질, GPIIbIIa, 역전사효소 및 라스 파네실기 전이효소 억제제로서 기능한다고 알려져왔다.
벤조디아제핀 구조는 2-아미노벤조페논, 아미노산, 및 알킬레이트제로 분리되어왔다(Bunin, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 4708 (1994)). 단지 몇 개의 2-아미노벤조페논 유도체만이 상업적으로 이용가능하기 때문에, 그것은 후에 2-아미노아릴스탄난. 염산, 아미노산, 및 알킬레이트제로 분리되었다(Bunin, et al., Meth. Enzymol., 267:448(1996)). 아릴스탄난은, 그것을 중심에 두고 다른 부분들이 치환되는, 중심 구조물로 여겨질 수 있다. 또는 4개 모두가 각 라이브러리 구성원을 만들기 위하여 동등하게 결합될 수 있다.
기본적인 라이브러리 합성 계획 및 구성원 구조는 다음 문헌을 보라;(그 전체가 참고문헌으로 포함되어 있는, Fowlkes, et al., U, S, serial No. 08/740,671 의 도1,). 염산 구성 블록은 R1 부위에 다양성을 부여한다. R2 부위에는 아미노산이 도입된다. R3 부위에는 알킬화제가 도입된다. R4 부위는 아릴스탄난의 고유 부위이다. 부닌(Bunin) 등은 20 염산, 35 아미노산, 16 알킬화제를 가지고 마련한, 11,200개의 서로 다른 유도체로 구성된 1, 4-벤조디아제핀 라이브러리를 만들었다(R4 부위에는 다양성이 없다; 이 그룹은 분자들을 결합시켜 고체상으로 만들기 위하여 사용된다). Available Chemical Directory(HDL Information Systems, San Leandro CA)에 의하면, 300 염산, 80 Fmoc-보호 아미노산 및 800 알킬화제가 구입 가능하였다(물론, 더 많이 합성될 수 있다). 마이크로타이터 플레이트 웰에서 용이하게 합성될 수 있는 숫자로 제한하는 한편, 구조적 분산을 최대화하기 위하여, 특정한 부분이 선택되었다. 구조적으로 유사한 화합물들 사이에서는, 치환이 덜 된 화합물이 우선적으로 선택되었다.
가변적 요소들은 지방성 및 방향성 그룹을 포함한다. 지방성 그룹들 중에서, 치환된 것이든 그렇지 않은 것이든간에, 비고리성 및 고리성(모노- 또는 폴리-) 구조물이 테스트되었다. (모든 비고리성 그룹들은 선형이었지만, 분지성(가지성) 방향족의 생산이 더욱 용이하였을 것이다) 방향성 그룹은 단일이나 복수, 융합이나 비융합, 치환이나 비치환, 이종원자나 비이종원자의 특징을 가졌다. 이차 치환물은 -NH2, -OH, -OMe, -CN, -C1, -F, -COOH를 포함하였다. 사용되지는 않았지만, -O-, -S-, -OO-, -CS-, -NH-, 및 -NR-을 포함하는 스페이서 부분(spacer moiety)이 합체되었을 수도 있다.
부닌 등은 1, 4-벤조디아제핀을 중심 구조를 사용하는 대신 1, 4-벤조디아제핀-2, 5-디온 구조를 사용할 수도 있음을 제시하였다.
부닌 등에 의하여 지적된 바와 같이, 필수적인 것은 아니지만. 다양성 있는 라이브러리의 구축을 위하여, 연결 기능성의 자취를 남기지 않는 연결 전략(linkage strategy)을 사용하는 것이 이득이 된다.
이 분야에서 공지되었거나 제시된 다른 조합적 비올리고머성 화합물 라이브러리들은, 카바메이트, 머캡토아실레이트화 피롤리딘, 페놀제, 아민이미드, N-아실아미노 에테르(아미노 알콜, 방향성 히드록실산, 및 카르복실산으로 만들어진 것), N-알킬아미노 에테르(방향성 히드록실산, 아미노 알콜 및 알데히드로 만들어진 것), 1, 4-피페라진, 및 1, 4-피페라진-6-온에 기초한 것이다.
DeWitt 등(Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 90: 6909-13 (1993))은 동시적인, 그러나 독립적인 40개의 분리 히단토인 및 40개의 분리 벤조디아제핀 합성에 대해 기술하였다. 그들은 고체상(가스 분산 튜브 내)에서 정렬형으로 합성을 행하였으며, 이는 전통적인 동시적 합성 기술(예를 들어, 웰 또는 핀 상에서의 합성)과 대치되는 것이다. 히단토인은, 먼저, 동시적으로 보호를 해제시키고, 각 5의 아미노산 수지에 대하여 8의 이소시나네이트를 처리함으로써 합성되었다. 벤조디아제핀은 보호가 해제된 아미노산 수지 각 5개에 대하여 2-아미노 벤조페논 이민 8개를 처리함으로써 합성되었다.
첸 등은 포름 에스테르의 예비적인(9 구성원) 조합적 라이브러리를 준비하는 방법을 제시하였다(Chen et al., J, Am, Chem, Soc., 116:2661-62 (1994)). 준비 된 폴리머 비드 결합 알데히드를 3분량으로 나누고, 각각을 다른 수율을 갖는 반응물과 반응시킨다. 반응 산물들을 결합시킨 후, 다시 3 분량으로 나누고, 각각을 마이클(Michael) 공여자와 반응시킨다. 화합물의 정체는, 기체 크로마토그래피/ 질량 분광 분석법에 의하여, 단일 비드 상에서 밝혀질 수 있다.
호르메스는 티아졸리디논 및 메타티아자논 라이브러리의 조합적 합성을 위한 방법론을 개시하였다. 이 라이브러리들은, 아민, 카보닐 화합물 및 티올이, 고리형성 조건에서 조합되어 만들어진다(Holmes, USP 5,549,974 (1996)).
엘만은 벤조디아제핀, 프로스타글란딘. 베타 회전 모방물, 및 글리세롤 기반 화합물의 조합적 합성을 기술한다(Ellman, USP 5,545,568 (1996)및 USP 5,288,514).
수머튼은 형태형성 서브유닛 구조물이 압도적으로 형성되는 조합적 라이브러리를 준비하는 방법을 개시한다(Summerton, USP 5,506,337 (1996)).
네프찌 등은 이종고리성 조합적 라이브러리들에 대한 개괄을 보여준다(Nefzi et al., Chem. Rev., 97: 449-472 (1997)). 다음 타입들 중의 하나이상이 라이브러 화합물들로 조합될 수 있고, 많은 약제들이 다음의 카테고리로 분리될 수 있다.
아세탈
산
알콜
아미드
아미딘
아민
아미노산
아미노 알콜
아미노 에테르
아미노 케톤
암모늄 화합물
아조 화합물
에놀
에스테르
에테르
글리코시드
구아니딘
할로겐화 화합물
하이드로카본
케톤
락탐
락톤
머스타드
니트로 화합물
니드로조 화합물
유기 미네랄
페논
퀴논
세미카바존(semicarbazones)
스틸벤(stilbenes)
설폰아미드
설폰
티올
티오아미드
티오우레아
우레아
우레이드
우레탄
모든 약제 또는 약제 구조의 약리학적 분류를 소모적으로 열거하지 않아도, 이하에 리스트된 하나 이상의 화합물들은 표시된 약리학적 활성을 행하는 것으로 알려졌으므로, 이 구조물들, 또는 그 유도체들은, 동일한 또는 다른 활성을 지닌 화합물들을 스크리닝하는 디자인 요소로 사용될 수 있을 것이다. (몇몇 경우에는 그 클라스의 선도 약제가 하나 이상 표시되었다)
수면제
고급 알코올 (클로메티아졸)
알데하이드 (클로랄 하이드레이트)
카바메이트 (메프로바메이트)
비고리성 유레이드 (아세틸카브로말)
바비투레이트 (바비탈)
벤조이나제핀 (디아제팜)
경련완화제
바비투레이트 (페노바비탈)
하이단토인 (페니토인)
옥사졸리딘디온 (트리메타디온)
숙신이미드 (펜숙시미드)
아실우레이드 (페나세마이드)
마약성 진통제
몰핀
페닐피페리딘 (메페리딘)
디페닐프로필아민 (메타돈)
페노티아진 (메토트리메프라진)
진통제, 해열제, 항류마티스제
살리실산염 (아셀틸 살리실산)
p-아미노페놀 (아세트아미노펜)
5-피라졸론 (디파이론)
3, 5-파라졸리딘디온 (페닐부타존)
아릴아세트산 (인도메타신)
아드레노코르티칼 스테로이드 (코르티존, 덱사메타존, 프레드니존. 트리암실론)
아트라닐산
신경이완제
페노티아진 (클로르프로마진)
티오크산틴 (클로르프로티젠)
리제르핀
부티로페논 (할로펜돌)
흥분안정제
프로판디올 카바메이트 (메프로바메이트)
벤조디아제핀 (클로르디아제폭시드, 디아제팜. 옥사제팜)
항디프테리아제
트리사이클릭스 (이미프라민)
근육이완제
프로파네디올 및 카바메이트 (메페네신)
CNS 자극제
크산틴 (카페인, 테오필린)
페닐알킬아민 (암페타민)
(페네틸린은 테오필린과 암페타민의 결합체임)
옥사졸리디논 (페몰린)
콜린효능성 물질
콜린 에스테르 (아세틸콜린)
N, N-디메틸카바메이트
아드레날린성 물질
방향성 아민 (에피네프린, 이소프로테레놀, 페닐fp프린)
알리사이클릭 아민 (사이클로펜타민)
알리파틱 아민 (메틸헥산아민)
이미다졸린 (나파졸린)
항아드레날린성 물질
인돌에틸아민 알칼로이드 (디하이드로에르고타민)
이미다졸 (톨라졸린)
벤조디옥산 (피페록산)
베타-할로알킬아민 (아자페틴)
하이드라지노프탈라진 (하이드랄라진)
항히스타민성 물질
에탄올아민 (디펜히드라민)
에틸렌디아민 (트리펠렌노민)
알킬아민 (클로르페니라민)
피페라진 (사이클리진)
페노티아진 (프로메타진)
국부마취제
벤조산
에스테르 (프로카인, 이소부카인, 사이클로메티카인)
기본 아미드 (디부카인)
아닐라이드, 톨루이다이드, 2, 6-크실리다이드 (리도카인)
3차 아미드 (옥세타카인)
혈관확장제
폴리올 나이트레이트 (니트로글리세린)
이뇨제
크산틴
티아자이드 (클로로티아자이드)
설폰아미드 (클로르탈리돈)
구충제
시아닌 염색제
항말라리아제
4-아미노퀴놀린
8-아미노퀴놀린
피리미딘
바이구아나이드
아크리딘
디하이드로트리아진
설폰아미드
설폰
항박테리아제
항생제
페니시린
세팔로스포린
옥타사이드로나프타센 (테트라사이클린)
설폰아미드
니트로퓨란
사이클릭 아민
나프티리딘
크실레놀
항암제
알킬화제
니트로젠 머스타드
아지리딘
메탄설포네이트 에스테르
에폭사이드
아미노산 길항물질
엽산 길항물질
피리미딘 길항물질
퓨린 길항물질
항바이러스성
아다만탄
뉴클레오사이드
티오세미카바존
이노신
아미딘 및 구아니딘
이소퀴놀린
벤지미다졸
피페라진
약학적 분류에 대해서는 다음을 보라; (Goth, Mediacal Pharmacology: Principles and Concepts (C.V. Mosby Co.: 8th ed. 1976); Korolkovas and Burckhalter, Essentials of Medicinal Chemistry (John Wiley & Sons, Inc.: 1976)). 합성법에 대해서는 다음을 보라; (Warren, Organic Synthesis: The Disconnection Approach (John Wiley & Sons, Ltd.: 1982); Fuson, Reactions of Organic Compounds (John Wiley & Sons: 1966); Payne and Payne, How to do an Organic Synthesis (Allyn and Bacon, Inc.: 1969), Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley-Interscience). 치환분의 선택에 대해서는 다음을 보라; (Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology (John Wiley & Sons: 1979))
라이브러리는, 바람직하게는, 각 구성원들이 동정될 수 있는 상태로 남아 있어서 만약 구성원이 활성을 보일 경우 그것을 분석할 필요가 없도록 합성되어야 한다. 제안된 동정의 몇 가지 방법은 다음의 것을 포함한다.
(1) 인코딩, 즉, 본래의 구성원보다 더욱 쉽게 동정될 수 있는 동정 부분을 각 구성원에 붙이는 것. 이것은 태그자체가 접합에 영향을 미칠 수 있다는 단점이 있다.
(2) 부분적 주소부여(spatial addressing), 예를 들면, 각 구성원은 매트리스 상의 특정 좌표 또는 특정 체임버에서만 합성되는 것. 이것은, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트상의 특정의 핀, 또는 특정의 벽, 또는 "티백(tea bag)" 내부일 수 있다.
본 발명은 어떠한 특정한 동정의 형태에 제한되지 않는다.
그러나, 다양한 빌딩 블럭상의 특징적인 분광학적 표시에 근거하여, 활성이 발견되는 라이브러리 구성원을 단순하게 특징짓는 것은 가능하다.
고체상 합성은, 유도체가 형성되는 상(phase)에 대하여 큰 제어력을 발휘할 수 있다. 그러나 고체상은, 활성을 저해할 수 있다. 이 문제를 극복하기 위해서, 각 구성원의 일부 또는 전부를, 합성 후 스크리닝 전에 유리시킬 수 있다.
평가의 대상이 되는 후보 단일 라이브러리들의 예는 다음의 유도체들을 포함한다.
단일 이종원자를 포함하는 고리 화합물
이종질소
피롤
펜타치환 피롤
피롤리딘
피롤린
인돌
베타-카볼린
피리딘
디하이드로피리딘
1, 4-디하이드로피리딘
피리도[2, 3-d]피리미딘
테트라하이드로-3H-이미다조[4, 5-c] 피리딘
이소퀴놀린
테트라하이드로이소퀴놀린
퀴놀론
베타-락탐
아자바이시클로[4.3.0] 노넨-8-온 아미노산
이종산소
퓨란
테트라하이드로퓨란
2, 5-이치환 테트라하이드로퓨란
피란
하이드록시피라논
테트라하이드록시피라논
감마-부티로락톤
이종황
설폴렌
두 개 이상의 이종원소를 가지는 고리 화합물
복수 이종질소
이미다졸
피라졸
피페라진
디케토피페라진
아릴피페라진
벤질피페라진
벤조디아제핀
1, 4-벤조디아제핀-2, 5-디온
하이단토인
5-알콕시하이단토인
디하이드로피리미딘
1, 3-치환-5, 6-디하이드로피리미딘-2, 4-디온
사이클릭 우레아
사이클릭 티오우레아
퀴나졸린
키랄3-치환-퀴나졸린-2, 4-디온
트리아조트
1, 2, 3-트리아졸
우린
이종질소 및 이종산소
디켈로몰핀
이속사졸
이속사졸린
이종질소 및 이종황
티아졸리딘
N-아실티아졸리딘
디하이드로티아졸
2-메틸렌-2, 3-디하이드로티아제이트
2-아미노티아졸
티오펜
3-아미노 티오펜
4-티아졸리디논
4-멜라티아자논
벤지소티아졸론
라이브러리 합성의 상세사항을 위해서는 다음을 보라; (Nefzi, et al., Chem. Rev., 97: 449-72 (1997) 및 여기에서 인용된 참조문헌)
아미노산과 펩티드
아미노산은 펩티드와 단백질을 구성하는 기초적인 빌딩 블록이다. 아미노산은 아미노기(-NH2)와 카르복실산기(-COOH)를 지닌다. 전부는 아니지만, 많은 아미노산이 NH2-CHR-COOH의 구조를 가지며, 여기서 R은 수소이거나 다양한 종류의 기능기이다.
20개의 아미노산; 알라닌, 아르기, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알 라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린이 유전적으로 암호화되었다. 이들 중에서 글리신을 제외한 모든 아미노산들은 광학 이성질체이나, L-형은 인간에서만 발견된다. 그럼에도 불구하고, 이들 아미노산들의 D-형은 생물학적 중요성을 갖지 못한다; 예를 들어 D-Phe은 공지의 진통제이다.
다음을 포함하는 많은 다른 아미노산들 또한 알려졌다; 2-아미노아디프산; 3-아미오아디프산; 베타-아미노프로피온산; 2-아미노낙산; 4-아미노부틸산(피페리딘산); 6-아미노카프로산; 2-아미노헵탄산; 2-아미노이소낙산; 3-아미노이소낙산; 2-아미노피멜산; 2, 4-디아미노낙산; 데스모신; 2, 2'-디아미노피멜산; 2, 3-디아미노프로피온산; N-에틸글리신; N-에틸아스파라긴; 히드록시리신; 알로-히드록시리신; 3-히드록시프롤린; 4-히드록시프롤린; 이소데스모신; 알로-이소류신; N-메틸글리신(사코신); N-메틸이소류신; N-메틸발린; 노르발린; 노르류신; 및 오르니틴
펩티드는 아미노산들 및/또는 더 작은 펩티드의 축합에 의해서 만들어진다. 아미노산(또는 펩티드)의 아미노기는 두 번째 아미노산(또는 펩티드)의 카르복실기와 반응하여 펩티드 결합(-NHCO-)를 형성하고 1분자의 물을 배출한다. 따라서, 아미노산이 펩티드로 축합할 때, 그것은 기술적으로 말하여, 아미노산 잔기라고 칭해진다.
펩티드는 펩티드 결합으로 연결된 복수의 아미노산 잔기로 구성된다. 유기적 펩티드는 그 잔기들이 유전적으로 해독된 아미노산 잔기로 구성된 것이다; 유기적 펩티드가 실질적으로 유전자 발현에 의해서 생산될 필요는 없다.
본 발명의 펩티드들은 그 서열이 본 상세한 설명에서 개시된 것, 또는 그것 들과 겨우 하나의 비보존적 치환 및/또는 하나이상의 보존적 치환, 바람직하게는 겨우 하나의 보전적 치환만을 보이는 차이를 갖는 서열을 포함한다. 치환은 유전적으로 해독되지 않은 (외래의) 아미노산의 치환일 수 있으며, 이 경우 결과 펩티드는 비유기적인 것이 된다.
보존적 치환은 하나의 아미노산을 같은 치환기를 갖는 다른 것으로 치환한 것으로서, 치환기는 다음과 같이 분류될 수 있다.
Ⅰ Gly, Pro, Ser, Ala (Cys) ( 및 상기 언급된 아미노산들의 친유성을 초과하지 않는 모든 비유기적인. 중성 아미노산)
Ⅱ Arg, Lys, His ( 및 모든 비유기적인 양-전하성 아미노산)
Ⅲ Asp, Glu, Asn, Gln ( 및 모든 비유기적인 음-전하성 아미노산)
Ⅳ Leu, Ile, Met, Val (Cys) ( 및 상기 Ⅰ에 비해 매우 높은 친유성을 가지고 있는 모든 비유기성, 지방성 중성 아미노산)
Ⅴ Phe, Trp, Tyr ( 및 상기 Ⅰ에 비해 매우 높은 친유성을 가지고 있는 모든 비유기성, 방향성 중성 아미노산)
Cys가 Ⅰ 및 Ⅳ에 모두 속한다는 사실에 주목하라.
바람직한, 매우 보존적인 치환은, Arg/Lys/His, Asp/Glu, Asn/Gln, Leu/Ile/Met/Val, Phe/Trp/Tyr, 또는 Gly/Ser/Ala과 같다.
본 발명에서의 추가적인 펩티드들은 선도 펩티드들의 체계적인 돌연변이에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면,
(a) 가능한 모든 선도 펩티드에 대한 단일 치환체 돌연변이의 개별 합성(특 히 유전적으로 암호화된 AAs에 대한 치환)
(b) 각 아미노산들의 부위가 원래의 아미노산이거나 알라닌(다른 아미노산들에 대하여 반보존적인(semi-conservative) 치환체임)이 되도록 행하는, 이항분포적인 동시적 무작위 알라닌-주입 돌연변이 및/또는
(c) 각 선도 펩티드의, 일부 또는 모든 부위의 보존적 치환을 표본으로 하여 행하는, 동시적 무작위 돌연변이로서, 활성 서열이 있을 경우, 전체 서열 영역 중의 활성 서열 수가 탐지 한계내에 있도록(전형적으로, 서로 다른 1010의 서열을 의미한다) 행해지는 것
돌연변이체의 활성을 테스트하여, 만약 활성을 보일 경우, 본 발명에 의한 펩티드들로 인정된다. 비록 비활성의 돌연변이체라도 구조-활성간의 관계에 대한 지식에 기여할 수 있으므로, 펩티드, 펩토이드, 및 펩티도미메틱의 디자인에 도움이 된다.
바람직하게는, 원래의 아미노산을 외부성 아미노산으로 치환하는 것은 다음의 형태를 취한다.
(Ⅰ) 하나 이상의 친수성 아미노산 측쇄를, 원래 측쇄 부피의 두배를 넘지 않는 다른 친수성 유기 래디칼로 치환하는 것
(Ⅱ) 하나 이상의 친유성 아미노산 측쇄를, 원래 측쇄 부피의 두배를 넘지 않는 다른 친수성 유기 래디칼로 치환하는 것
외부성 아미노산들은 α 또는 비-α 아미노산들(예를 들어, 베타 알라닌)일 수 있다. 그들은, 같거나 다른 2R 그룹을 Cα상에 가진 알파 아미노산일 수 있다. 그들은 탈수 아미노산(HOOC-C(NH2)=CHR)일 수 있다.
외부성 아미노산을 포함하는, 펩티드 합성에 대한 더 많은 정보를 위해서는 다음을 보라;
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고리형 펩티드
많은 자연 발생적 펩티드는 고리형이다. 고리화는, 펩티드와 리간드간의 연합을 증강시켜 생물학적 활성을 증강시키는, 펩티드 콘포메이션의 구조를 안정화시키는 메카니즘이다. 고리화는 일반적으로, N 말단과 C말단의 측쇄간 펩티드 결합의 형성에 의한 인트라-체인(intra-chain) 시스테인 형성에 의해서 달성된다. 고리화는 일반적으로 용액상에서 이루어지나, 최근 비드상 펩티드 고리화를 보고한 출판물이 있다(아래의 참고를 보라).
1. Spatola, A.F., Anwer, M.K. and Rao, M.N. Phase transfer catalysis in solid phase peptide synthesis. Preparation of cycle [Xxx-Pro-Gly-Yyy-Pro-Gly] model peptides and their conformational analysis. Int. J. Pept. Protein Res. 40:322-332, 1992.
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펩토이드
펩토이드는, 하나 이상의 펩디드 결합이, 동일하거나 다른 의사펩티드(pseudopeptide) 결합으로 대체된 펩티드 아날로그이다.
그러한 의사펩티드 결합으로는 다음과 같은 것이 있다.
카르바 ψ(CH2-CH2)
뎁시 ψ(CO-0)
하이드록시에틸렌 ψ(CHOH-CH2)
케토메틸렌 ψ(CO-CH2)
메틸렌-오시 CH2-0-
환원 CH2-NH
티오메틸렌 CH2-S-
티오펩티드 CS-NH
N-변조-NRCO-
또한 다음을 보라.
1. Corringer, P.J., Weng, J.H., Ducos, B., Durieux, C.,Boudeau, P., Bohme, A. and Roques, B.P. CCK-B agonist or antagonist activities of structurally hindered and peptidase-resistant Boc-CCK4 derivatives. J. Med. Chem. 36:166-172, 1993. Amino acids reported: aromatic naphthylalaninimide (Nal-NH2); N-methyl amino acids.
2. Beylin, V.G., Chen, H.G., Dunbar, J., Goel, O.P., Harter, W., Marlatt, M. and Topliss, J.G. Cyclic derivativesof 3,3-diphenylalanine (Dip) (II), novel α-amino acids for peptides of biological interest. Tetrahedron Lett. 34: 953 -956,1993.
3. Garbay-Jaureguiberry, C., Ficheux, D. and Roques, B. P. Solid phase synthesis of peptides containing the non-gydrolysable analog of (O)phosphotyrosine, p(CH2PO3H2)Phe. Application to the synthesis of 344-357 sequences of the β2 adrenergic receptor. Int. J. Pept. Protein Res. 39:523-527, 1992.
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펩티도미메틱
펩티도미메틱이란, 펩티드 콘포메이션의 약학적 관련 부위를 실질적으로 복제함으로써, 펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 물질이지만, 정의된 바와 같이, 펩티드 또는 펩토이드는 아니다. 펩티도미메틱은 700 달톤이하의 분자량을 가지는 것이 바람직하다.
펩티도미메틱을 디자인하는 과정은 다음과 같다.
(a) 활성의 원인이 되는 약학적 그룹을 동정;
(b) 펩티드의 활성 콘포메이션 내 약학적 그룹의 공간적 배치를 결정함
(c) 펩티드의 활성 콘포메이션 내 공간적 배치를 계속 유지하게 하는 약물작용 활성그룹을 탑재할 수 있는 조제가능한 주형을 선택함
단계 (a)는 활성 펩티드의 돌연변이를 준비하여 그 돌연변이가 활성에 미치는 효과를 측정함으로써 수행된다. 펩티드와 수용체간의 3D 구조를 조사하여 상호작용의 증거를 얻을 수 있다(예를 들어, 펩티드의 측쇄가 수용체의 틈새로 끼어든 것; 수소결합의 잠재적 위치 등).
단계 (b)는 일반적으로, NMR 분광기 X-레이 편광 연구에 의한, 복합체 내 활성 펩티드의 3D 구조 측정을 포함한다. 초기 3D모델은 에너지 최소화 및 분자 운동 시뮬레이션에 의해서 정제될 수 있다.
단계 (c)는 주형 데이터베이스를 참고하여 이루어진다. 윌슨 등을 참고하라 (Wilson, et al. Tetrahedron, 49: 3655-63 (1993)). 주형에는 전형적으로 2-8개 정도의 약물작용 활성부분이 탑재되어, 상대적으로 견고한 구조를 지니게 된다. 후자와 같은 이유 때문에, 벤젠, 바이페닐, 페난트렌 및 벤조디아제핀방향족 구조가 바람직하다. 오르토고날(0rthogonal) 보호 기술에 대해서는 투크쉐레를 보라: Tuchscherer, et al. Tetrahedron, 17: 3559-75 (1993)
펩토이드 및 펩티도미메틱에 대한 더 많은 정보를 위하여 다음을 보라: USP 5,811,392, USP 5,811,512, USP 5,578,879, USP 5,817,757, USP 5,811,515.
아놀로그들
흥미를 끄는 활성을 보이는, 공지의 펩티드들 및 다른 화합물들의 아날로그들 역시 관심의 대상이다.
아놀로그들은, 그들의 화학적 구조에 기초하여, 뒤범벅된 비트맵의 구조 핑거프린팅을 구조물에 대응시키고, 그 핑커프린트와 광범위한 화학적 데이터베이스내 각 화합물의 핑거프린트간의 유사성을 측정함으로써 동정될 수 있다. 핑거프린트는 데이라이트 케미컬 인포메이션 시스템, Inc에 의해 1999. 1. 8. 현재부까지 출시된 상업적으로 배포된 핑커프린팅 소프트웨어를 가지고 측정할 수 있다. 핵심적으로, 이러한 방식은 각 원자 및 7 결합 길이까지의 근접한 이웃에 대한 약간의 패턴을 제공한다. 각 패턴은 의사 난수 생성기의 시드(seed)로서 기능하고, 그 결과물로 핑커프린트를 발전시킨다. 이 핑커프린트는 고정적 또는 가변적 크기이다.
데이터베이스는 SPRESI'95(InfoChem GmbH), Index Chemicus(ISI), MedChem(Pomona/Biobyte), World Drug Index(Derwent), TSCA93(EPA) May bridge organic chemical catalog(Maybridge), Available Chemical Dictionary (MDLIS Inc.), NCI97(NCI), Asinex catalog of organic compounds(Asinex Ltd.), 또는 IBIOScreen SC와 NP(Inter BioScreen Ltd.), 또는 사내(inhouse) 데이터베이스일 수 있다.
만약 어떠한 화합물이 참조 화합물의 데이라이트 핑거프린트와 적어도 (Tanamoto 계수) 0.85의 유사성을 가지고 있다면, 그 화합물은 참조 화합물의 아날로그이다.
만약 어떠한 화합물이, 동배체 치환에 의해 참조 화합물로부터 개념론적으로 유도되는 것이라면, 그 화합물은 참조 화합물의 아날로그이다.
동족체(homologue)란 알킬부분의 메틸렌 그룹 숫자가 감소 또는 증가하는 차이를 보이는 화합물들이다.
고전적인 동배체는 엘렌마이어(Erlenmeyer)의 정의 "부전자층이 동일한 것으로 여겨지는 전자, 이온, 분자"를 만족시키는 것들을 말한다.
고전적인 동배체는 다음을 포함한다.
1가 2가 3가 4가 고리
F, OH, NH2, CH3 -O- -N= =C= -CH=CH-
=Si=
Cl, SH, PH2 -S- -P= -N+= -S-
Br -Se- -As- =P+= -O-
i -Te- -Sb- +As+= -NH-
-CH= =Sb+=
비고전적인 동배체쌍은 -CO-와 -SO2-, -COOH와 -SO3H, -SO2NH2와 -PO(OH)NH2, -H와 -F, -OC(=O)-와 C(=O)O-, -OH와 -NH2를 포함한다.
조제방법 및 준비
본 발명의 바람직한 임상대상은 포유동물이다. "포유동물"이란 포유강에 속하는 개별 동물을 의미한다. 본 발명은 수의적 용도를 위한 것이기도 하지만, 특별히 인체를 대상으로 하는 처치에 특별히 유용하다. 바람직한 비인간성 대상은 영장목(예를 들어, 유인원 및 원숭이), 소목 또는 기제목(예를 들어, 소, 돼지, 양, 말, 염소), 식육목(예를 들어, 고양이, 개), 쥐목(예를 들어, 토끼, 쥐, 기니아피그, 햄스터), 토끼목(예를 들어, 토끼), 또는 다른 애완동물, 농장이나 실험실 동물이 될 수도 있다.
여기서 "보호"라는 용어는, 예방, 억제 및 치료를 포함한다. "저지"는 질병 유도(또는 다른 불리한 환경의 조성)에 앞서 단백질을 투여하는 것을 말한다. "억제"는 그 질병의 임상적 출현 전에 그 조성물을 투여하는 것이다. "치료"는 그 질병의 출현 후에 그 보호 단백질을 투여하는 것이다.
인체성 및 수의성 약제에 대해서는, 궁극적인 유도 사건 또는 사건들이 알려져 있지 않거나, 잠재성이거나, 또는 환자들이 그 사건 발생 훨씬 후에야 확인하게 되기 때문에, 저지와 억제를 구분하는 것이 항상 가능하지는 않다. 따라서, "치료"와 구분되는 "예방"이라는 단어를 사용하여, "저지"와 "억제"를 포괄하는 것이 일반적이다. 여기서 "저지"라는 용어는 "예방"을 포함한다. 만약 저지가 임상적 가치를 가질 정도라면, 반드시 저지가 완전무결할 필요는 없다. 경쟁제재보다 더욱 작은 저지효과를 갖는 제재라도, 특정 개체에 대하여 효과를 발휘하지 않거나, 그것이 다른 제재와 결합하여 저지의 수준을 높이거나. 다른 경쟁제재보다 더욱 안전할 경우에는, 가치가 있다. 약제는 치유효과, 개선효과 또는 그 모두를 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 약제들 중의 적어도 하나는, 대상을 질병 또는 불리한 조건으로부터 보호하기 위해, 의도된 목적을 달성할 수 있는 모든 종류의 수단을 동원하여 투여될 수 있다. 투여의 형태는 전체적 또는 국부적일 수 있다. 예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥, 피부내, 근육내, 복막내, 비강내, 피부, 구강 경로와 같은 다양한 비경구성 루트를 통하여 이루어진다. 대안적으로 또는 동시에, 투여는 경구성 루트를 통하여 이루어질 수 있다. 비경구성 투여는 시간을 두고 환약 투여 또는 관류 투여를 반복하는 것일 수도 있다.
전형적인 섭취는 유효한 투여량, 및 1회, 시간, 일, 주, 달, 해에 걸치는 복용의 기간으로 구성된다.
본 발명에 의한 약제의 적절한 1회 복용량은 복용자의 나이, 성별, 건강. 체중, 동시 진행중인 처지의 종류, 처치의 주기, 및 목적되는 효과의 성질에 따라 달라진다. 그러나, 가장 바람직한 1회 복용량은, 이 분야의 전문가들이 잘 알고 있 는 바와 같이, 부적절한 실험을 수반하지 않고 개별 대상에 맞추는 것이다. 이것은 예를 들어 환자가 체중이 작을 경우 투여량을 감소시키는 것과 같은 표준 투여량의 조정을 포함한다.
인간에게 약제가 사용하기에 앞서, 우선 실험실 동물에 대하여 안정성과 효율성이 검증되어야 한다. 인간에 대한 임상 연구에서는, 문제의 약에 대한 선-임상적 데이터 및 아날로그 약제의 관습적인 투여량(만약 있다면)에 기초하여, 인간에게 안전하다고 여겨지는 투여량으로 실험을 시작한다. 만약 투여가 효과적이라면, 최소 효과량을 측정하기 위하여 필요한 경우 투여량을 줄일 수 있다. 만약 투여가 효과적이지 않다면, 사이드 이펙트의 징후에 대하여 환자를 조심스럽게 관찰하면서, 조심스럽게 투여량을 증가시킨다. 다음을 보시오; (Berkow et al., eds., The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N. J., 1987; Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N. Y., (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore. MD. (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); 이 인용문헌 및 여기에 인용된 인용문헌들 및 그 안의 인용문헌들은 인용에 의해 전체적으로 서로 통합되어 있음)
각 처치에 필요한 총 투여량은 수회에 걸쳐 혹은 1회로 투여될 수 있다. 단백질은 그 단독으로, 또는 병의 치유 혹은 그 병의 징후군 치료에 목적이 있는 치 료제와 함께 투여될 수 있다;
적합한 투약의 형태는 질병, 단백질, 투여의 방식에 따라 달라진다. 다음과 같은 것이 가능하다; 정제, 캡슐, 마름모꼴 정제, 치과용 풀, 좌약, 흡입제, 용액, 연고, 비경구용 데포(depot); 다음을 보라; (상기 Berker, 상기 Goodman, 상기 Avery 및 상기 Ebadi; 그 안에 인용된 모든 참조문헌을 포함하여, 전체가 여기에서 참조문헌으로 인용되어 있음)
펩티드 약제의 경우에, 약제는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 발현벡터의 형태로 투여될 수 있다. 그러한 벡터는 환자의 세포내 유전적 보완물로 조합된 후에 펩티드의 합성을 유도한다. 적합한 벡터는 유전자적으로 조작된, 비병원성 폭스바이러스 (백신), 아데노바이러스, 아네노 결합 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
제약 조성물은, 여기에 기술된 적어도 하나의 약제 외에, 부형제, 운반체, 제약적으로 이용될 수 있는 제제로 활성 화합물을 가공하는 과정을 촉진하는 보조제와 같은, 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함할 수 있다. 다음을 보라;(상기 Berker, 상기 Goodman, 상기 Avery 및 상기 Ebadi; 그 안에 인용된 모든 참조문헌을 포함하여, 전체가 여기에서 참조문헌으로 인용되어 있음)
항암적 이용
본 발명에 의한, ER-결합 펩티드와 관련 펩티드, 펩티도미메틱과 그 아날로그, 및 이러한 펩티드와 ER간 상호작용에 감응을 보이는 것으로 핑거프린팅된 화합물의 실용성은, 타목시펜 저항성을 억제하는 데에 있다.
유방암으로 생명의 위협을 느끼는 미국 여성의 수는 8명 중 1명에 달하는 것으로 집계된다. 비록 이러한 숫자가 과거 50년간 두배로 증가하기는 했지만. 이 질병의 치명성은 동기간 동안 약간 감소되었다. 최근의 NSAPB-B14 실험에서 진단당시 음성결절로 판정받은 유방암 환자의 10년간 생존률은 80%를 훨씬 넘어섰다. 이러한 긍정적 반응은 상당부분, 전이성 질병을 앓는 여성들의 숫자를 더욱 용이하게 다룰 수 있는 초기 단계의 종양으로 감소시킨 효과를 나타낸 조기발견기술상의 진보 때문이다. 그러나 조기발견 외에도, 항에스트로겐 타목시펜을 전이성 질병에 대하여 보조 화학요법제로 전략적으로 활용한 것이 유방암 환자의 생존에 긍정적인 강한 영향을 미쳤다. 타목시펜의 가장 극적인 잇점은 그것이 반대측성 원발 종양을 일으킬 가능성을 50%이상 감소시켰다는 것이다. 이 발견은, NSABP-P1의 시도결과와 결합되어, 타목시펜을 유방암의 위험을 지니고 있는 여성들에 대하여 유방암 억제제로 사용하는 것을 승인하도록 이끌었다. 확실히, 아콕시펜은 지극히 성공적인 약물이다. 그러나, 모든 약물에 해당하듯이, 화학성치유제로서의 타목시펜의 효능은 시간과 함께 감소한다. 전이성 셋팅에서, 유방암에 민감한 대부분의 타목시펜은 결국에는 항에스트로겐적 반응에 저항성을 보이는 것으로 나타났다. 보조적 환경에서의 시간경과에 따른 효능의 감소는 NSABP-B14 타목시펜을 복용하도록 요구된 유방암 환자의 전반적인 생존률이 더 이상 좋아하지 않았고, 심지어 더 나빠졌다는 사실을 보여준 NSABP-B14 의 실험결과로부터도 역시 추측되었다. 후자의 결론은 장기간에 걸쳐 타목시펜을 복용한 환자의 암세포가 이 약제를 항에스트로겐으로 인식하는 능력을 상실함으로써 에스트로겐으로 작용하는 약제에 반응하는 기작 이 변형된 것이 아니냐는 착상을 낳게 했다. 타목시펜 투약을 중시한 일부 환자들에게서 이러한 반응이 사라졌다는 사실은 이 가설을 더욱 지지한다. 결과적으로 타목시펜이 유방암에 효과적이지 못하게 한 기작을 이해하고, 이 지식을 새로운 항에스트로겐에 적용하여 개선된 치유효과를 얻는 데에 큰 관심이 모아졌다.
몇 년 전에 타목시펜이 효과적이지 못했던 세포상의 에스트로겐 수용체(ER)가 유용한 표적이 될 가능성이 없다고 생각되었다. 그러나 타목시펜이 듣지 않았던 유방암에 유용하게 사용되었던 ICI182,780과 같은 순수한 항에스트로겐의 출현은, 질병의 현 단계에서 ER을 표적으로 유효화시켰다. 그러나, 그들은 모든 표적 기관에서 일어나는 비선택적으로 에스트로겐 반응을 차단하기 때문에, 골격계 및 순환계에는 부정적인 큰 영향을 미치고, 결과적으로 보조 화학요법제로 사용되기에는 적당하지 못할 것이다. 따라서, 흉부에서는 타목시펜과 기계적으로 명료하게 구분되지만, 골격계 및 순환계에서는 타목시펜의 에스트로겐적 활동의 긍정적인 면을 보유하는, 신규의 항에스트로겐에 대한 의학적으로 충족되지 않는 요구가 있다.
타목시펜은 원래, 유방암 세포상의 수용체 수준에서 에스트론겐의 작용을 차단하는 항에스트로겐으로 개발되었다. 따라서, 일반적으로 이 제재에 대한 저항성은 ER 돌연변이, 선택적인 세포로부터의 화합물의 배제의 결과, 또는 대사과정의 비활성화의 결과라고 여겨졌다. 그러나, 이러한 메카니즘은 단지 매우 일부 작은 경우의 타목시펜 저항성만을 설명할 수 있을 뿐이다. 다른 메카니즘이 현재 고려 중이다. 우리는 표적 세포가 타목시펜을 길항물질로 인식하는 능력에 영향을 미치는 개체생성적(epigenetic) 변화가 표적세포상에 일어나서 실제로 그 표적세포가 약제를 에스트로겐 리간드로 인식하게 된다는 모델을 선호한다. 이러한 가설은 타목시펜이, 실제로, 그것이 위치하는 환경에 따라 ER 길항물질로 또는 작용물질로 기능하는 선택적인 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)라는 발견으로부터 기원한 것이다. 따라서, 우리는, 흉부에서, 타목시펜에 대한 선택적 압력이, 적응 또는 선택을 통하여, 타목시펜을 길항제로 인식하는 세포의 이상증식을 촉진시킨다고 믿는다. 결과적으로, 우리는, 타목시펜 저항성, 결과적으로는 신규한 항에스트로겐의 개발에 목적을 두고, 타목시펜, 및 다른 SERM의 선택적 작용에 대한 분자적 기초를 규명하는데 중점을 두었다. 이러한 연구들은 ER이 리간도와 결합할 때 콘포메이션 변화를 겪고, 그 변화의 본질은 결합된 바인드의 구조에 의해 영향을 받는다는 사실을 밝혀내었다. 이러한 콘포메이션 변화의 중요성은 ER이, 아미노말단에 위치한 AF-1 및 호르몬 결합 도메인에 포함된 AF-2의 두 개의 활성 도메인을 포함하며, 그 활성은 세포 및 프로모터 정황에 의해 영향을 받음이 밝혀졌을 때 드러났다. 대부분의 세포에서, AF들은 최대의 전사 활성을 요구받는다. 따라서, 에스트라디올은 양 AF들과 전사기구와의 상호작용을 촉진하기 때문에 ER 작동물질로 기능한다. 타목시펜은 AF-2의 기능을 저해하는 방식으로 ER 구조를 변형시킨다. 따라서, AF-2가 요구되는 모든 상황에서, 타목시펜은 길항작용을 나타낸다. ER 전사를 위하여 AF-1만이 요구되는 세포상황에서는, 타목시펜이 부분적인 작용물질로 기능한다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 발견은, AF-1 우세상황에서는, 타목시펜의 작용물질적 활성이 유방암에서 이 약제가 항에스트로겐으로 작용할 수 없다는 사실과 연관되어있다는 가설을 세우도록 한다. 따라서, 우리는 AF-1을 활성화시키는 않는 화합물 들을 찾아서, 그들의 타목시펜의 부분적 작용물질적 활성을 저해시킬 수 있는 능력을 평가하였다. 이러한 작업은, 생체 외에서 실험했을 때 모든 조건에서 타목시펜의 부분적 작용물질적 활성을 저해함으로써, A-티믹 누드 마우스에 이종이식된 MCF-7 세포의 증식을 효과적으로 저지시킨 신규한 항에스트로겐제, GW5638을 발견하게 하였다. 이러한 특징들로 인하여, GW5638은, 타목시펜 불응성 유방암의 치료제로서의 평가를 위해 임상학적 실험을 거칠 것이다.
신규 항에스트로겐제 GW5638의 가장 놀라운 특징은, 비록 그것이 AF-1 및 AF-2 작용물질적 활성을 결여하기는 하였지만, 그것이 생체 내 실험에서 순수한 길항물질이 아니라는 것이다. 타목시펜과 달리 그것은, 난황위축 작용을 보이지 않는다. 그러나 타목시펜과 같이 그것은, 뼈와 순환계에서 에스트로겐으로서 기능한다. 이러한 결과는 AF-1 및 AF-2를 차별적으로 활성화시키는 능력이 중요할 것이라는 것을 지시한다. 그러나 이러한 종류의 항에스트로겐의 약물적 특성은 우리가 생각하는 것보다 훨씬 복잡하다. 결과적으로 우리는, 타목시펜과 GW5638를 구분하는 세포 메카니즘을 규명하는데 중점을 두었다. 비록 진행중이지만. 이것은 타목시펜의 부분적 작동물질적 활성을 저해하도록 하는 새로운 시도로 발전되었다. 특별히, 파지(phage) 디스플레이 기술을 사용하여, 우리는 ER과의 상호작용시 결합 리간드의 성질에 의해 영향을 받는 작은 펩티드를 동정해내었다. 어떠한 리간드의 존재하에서도, 어떠한 길항물질 또는 어떠한 작용물질의 존재하에서도 ER과 결합하는 펩티드를 찾아냈으며, 더욱 중요하게는, 우리는 타목시펜의 존재하에서만 ER과 결합하는 펩티드를 동정해내었다. 타목시펜 불응성 유방함을 치유하기 위한 전략 의 개발과 관련하여, 가장 후자의 펩티드는, 생체 외에서 이러한 펩티드들이 효과적으로 타목시펜의 부분적 길항물질적 작용을 저해하였기 때문에, 가장 관심의 대상이다. 이러한 펩티드들이 결합하는 ER상의 사이트를 맵핑하는 것은 특정의 보조 활성제 상호작용을 모의할 수 있는지를 결정하는데 도움을 준다. 어쨌든, 이 작업은 신약의 새로운 표적으로 작용할 수 있는 ER상의 부위를 발견해내었다. 비록 펩티드가 일반적으로 약제 개발상에 있어서 좋은 시작 지점으로 사용되지 않음에도 불구하고, 최근까지 단백질-단백질 상호 결합을 조절할 수 있는 미소 분자를 만들어내는데 있어서 지대한 변화가 있어왔다. 우리는 이제 새로운 펩티드와 관련된 표적부위와 상호작용하는 미소 분자들을 스크리닝하는 과정에 있으며, 또한 더 작은 펩티드들이 약제와 같이 적당하게 가공된 경우 그 자체로서 기능을 발휘할 수 있는지를 검증하는 과정에 있다.
결합 분자
하기에 기술되는 진단법 및 진단제를 다룸에 있어서, "결합 분자"는 펩티드, 펩토이드 또는 펩티도미메틱이다. 분석물은 표적 단백질이다.
생체 내 진단법 및 진단시약
본 발명의 생체 내 분석법은 어떠한 적당한 분석물을 포함하는 샘플에 적용될 수 있으며, 정성 또는 정량분석일 수 있다. 분석물의 존재나 양을 탐지하기 위하여, 분석은 분석물의 유무(또는, 정량분석의 경우에는, 분석물의 양)에 따라 생산되는 신호에 탐지가능한 차이가 생기는 신호 생산 시스템(SPS)에 대하여 행해져야 한다. 탐지가능한 신호는 가시적으로 탐지가능것이거나 기구에 의해서만 탐지 가능한 것일 수 있다. 가능한 신호는 색깔을 가진 또는 야광성 산물, 또는 분석물질에 의한 방사선 흡수 또는 방출의 특성(방위각 또는 극성)의 변화, 및 분석물질의 침전이나 응집을 포함한다. "신호"라는 용어는 존재하던 신호의 소멸, 절대변수보다는 관찰가능한 매개변수의 변화를 포함한다. 이러한 신호는 수동 또는 자동으로 모니터될 수 있다.
진단시약과 가장 친숙하게 결합되는 신호 생산 시스템의 구성요소는 "레이블"이라고 불린다. 레이블은 예컨대, 방사성 동위원소, 형광공, 효소, 조효소, 효소 기질. 전자밀집 화합물, 응집가능한 미립자일 수 있다. 하나의 진단시약은 본 발명의 결합 분자와 레이블이 직접 또는 간접적으로, 공유결합 또는 비공유결합적으로 합체된 것이다.
방사성 동위원소는 감마 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 오토래디오그라피와 같은 수단으로 감지될 수 있다. 본 발명에 대하여 특별히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S, 14C, 및 바람직하게는,
125I 이다.
형광물질로 화합물을 표지할 수도 있다. 형광 표지된 항체가 적정한 파장의 빛에 노출되며느 그 존체가 형광 때문에 탐지될 수 있다. 가장 널리 사용되는 형광표지용 물질은 플루오레신 이소티오시아네티드, 로다민. 피코에리쓰린. 피코시아닌. 알로피코시아닌. 0-프탈데히드 및 플루오레스카민이다.
대안적으로, 125Eu 또는 다른 란탄족 시리즈와 같은 형광 방사성 메탈이, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 같은 킬레이트기를 사용하여 결합 단백질에 부착될 수 있다.
결합 분자들은 또한 케밀루미센트 화합물과 결합함으로써 탐지가능하게 표지될 수 있다. 케밀루미센트 화합물은 적당한 반응물이 제공된 후의 화학반응동안 발생하는 루미네센스의 존재를 탐지할 수로서 확인할 수 있다. 화합물 표지에 특별히 유용한 화학성야광물질은 루미놀, 이소루미노, 테로마틱 아크리디니움 에스테르, 이미다졸, 아크리딘염 및 수산 에스테르이다.
유사하게 생물성야광물질이 결합 분자를 표지하는데 사용될 수 있다. 생물성야광물질은 효소 단백질이 화학성야광 반응의 효율을 증대시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 일종의 화학성야광물질이다. 생물성야광물질의 존재는 야광물질의 존재를 탐지함으로써 확인할 수 있다. 표지를 목적으로 사용되는 중요한 생물성야광물질은 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린이다.
홀스래디쉬 페록시다아제 및 알칼라인 포스파타아제와 같은 효소 표지가 바람직하다. 효소 표지가 사용될 경우, 신호 생산 시스템은 효소에 대한 기질을 포함하고 있어야 한다. 만약 효소 반응 산물 그 자체가 탐지가능한 것이 아닐 경우, SPS는 탐지가능한 산물이 나타날 수 있도록 하나 이상의 반응물을 포함할 것이다.
분석법은 동질 및 이질의 두 가지 기본 타입으로 나뉠 수 있다. 이질 분석법에서, 친화 분자와 분석물간의 상호작용은 표지에 영향을 미치지 않으므로, 분석물의 존재 또는 양을 측정하기 위해서는, 결합 표지가 자유 표지로부터 분리되어야 한다. 동질 분석법에서는, 상호작용이 표지의 활성에 영향을 미치므로, 분리 단계를 거칠 필요없이, 분석물의 수준이 유추될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 표적 결합 단백질은 표적 결합 항체가 사용되는 것과 같은 방식으로 진단학적으로 사용될 수 있다. 따라서, 분석법의 형식에 따라서, 그것은 표적, 또는, 경쟁적 억제에 의해, 표적과 결합하는 다른 물질들을 분석하는데 사용될 수 있다. 샘플은 혈액, 소변, 림프액. 정액, 젖, 또는 척수액과 같은 생체액이거나, 혹은 그 분쇄물이거나 그 유도체, 혹은 조직의 일부 또는 호모지네이트의 형태로 제공되는 생물 조직이다. 그러나, 식품이나 음료, 약학적 또는 진단학적 조성물, 흙. 표층수 또는 지하수, 또는 이들의 유도체와 같은 샘플도 생각해낼 수 있는 것이다. 만약 생물성 체액 또는 조직이라면, 그것은 인간이나 다른 포유동물, 척추동물이나 동물, 또는 식물로부터 얻을 수 있다. 바람직한 샘플은 혈액, 또는 그 분쇄물이거나 그 유도체이다.
한 구체예에서, 결합 단백질은 거대분자성 지지체에 결합됨으로써 불용화되고, 샘플 내의 표적은 양을 알고 있는 표지되었거나 명확히 표지할 수 있는 표적 아날로그와 경쟁하게 된다. (결합 분자와 거대분자성 지지체의 합체물은 본 발명의 또다른 진단제이다) "표적 아날로그"는 결합 단백질과의 결합에 있어서 표적과 경쟁할 수 있는 분자이다. 그리고 이 단어는 표적 그 자체를 포함하기 위해 사용된다. 그것은 이미 표지되었을 수도 있고, 또는 표적 아날로그를 진정한 표적으로부터 구분시키는 부분에 표지를 특이적으로 결합시킴으로써 나중에 표지될 수도 있다. 고체상과 액체상이 서로 분리되고, 한 상내의 표지된 표적 아놀로그를 정량한다. 고체상내, 즉 결합분자에 붙어있는 표적 아날로그의 수준이 높을수록, 샘플내 표적 단백질의 수준이 낮다.
"샌드위치 분석"에서는, 불용화된 표적 결합 단백질과 표지된 표적 결합 단백질이 모두 사용된다. 표적 분석물은, 3차 구조를 형성하면서, 불용화된 표적 결합 분자에 포획되고 표지된 결합 분자의 꼬리표를 달게된다. 반응제는 샘플에 순차적으로 또는 동시에 가해질 것이다. 표적 결합 분자들은 같은 것이거나 다른 것일 수 있다. 오직 하나만이 본 발명에 따른 표적 결합 단백질일 필요가 있다. (다른 것들은, 예를 들어, 항체나 또는 그것의 특이결합적 부분일 수 있다). 표지된 표적 결합 분자의 총량은 샘플내에 존재하는 표적 분석물의 양에 직접적으로 비례한다.
상기에 기술된 두 구체예는 모두 이질 분석법이다. 그러나 상동분석법도 생각해 낼 수 있는 것이다. 핵심은 복합체가 형성되느냐의 여부에 의해 표지가 영향을 받는다는 것이다.
표지는, 진단제를 만들어내기 위하여, 직접적이나 간접적으로(예를 들면, 표지된 항-표적 결합 분자성 항체를 통하여), 또는 공유결합적(예를 들면 SPDP로)이나 비공유결합적으로 표적 결합 분자에 합체될 수 있다. 유사하게, 고체상("포획") 진단제를 만들기 위하여, 표적 결합 물질이 고체상 지지체에 합체될 수 있다. 적당한 지지체는, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 또는 가공 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스, 및 마크네타이드를 포함한다. 운반체의 성질은, 본 발명의 목적을 위하여, 어느 정도 용해성이거나 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은, 지지체에 결합된 분자들이 표적에 결합할 수 있는 한 실질적으로 어떠한 구조적 형태라도 취할 수 있다. 그러 므로, 지지체 형태는 비드와 같은 구형 또는 테스트 튜브와 같은 실린더형, 또는 막대기의 외부 표면과 같을 수도 있다. 대안적으로, 표면은 종이나 테스트 스트립등과 같이 평평할 수도 있다.
생체 내 진단적 이용
분석물 결합 분자들은 생체 영상을 위해서도 사용될 수 있다.
방사선 표지된 결합 분자들은 인간 또는 동물 대상에 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 혈관주사나 정맥주사 또는 적당한 방법으로 행해지며, 방사탐지 기구를 이용한 역동적 및/또는 정지 영상을 가능케 하는데 충분한 양을 투여한다. 바람직한 복용량은 진단에 효과적인 영상을 제공할 정도의 최소량이며, 유도제로서 공지의 방사 영상제를 사용함으로써 이 분야에서 전형적인 방법에 의해 결정될 수 있다.
전형적으로, 영상은 대상의 전신에 대하여 행해지거나, 또는 연구대상인 조건 또는 질병에 관계있는 신체부위 또는 기관에 대해서만 행해질 수 있다. 특정시점에서 방사선 표지 결합 분자가 축적되면, 관계된 표적 기관이 정성분석될 수 있다.
특별히 적당한 방사 탐지 기구는 감마 카메라와 같은 신틸레이션 카메라이다. 신틸레이션 카메라는 방사 탐지 결합 분자의 분표를 영상화하는데 사용되는 정지 기구입니다. 카메라 내의 정지기구는 방사성 붕괴를 감지하여, 그 분포가 기록된다. 영상 기계에 의해 만들어진 데이터는 디지털화될 수 있다. 디지털화된 정보는 연속적으로 또는 비연속적으로 시간을 두고 분석된다. 디지털화된 데이터 는 불연속적인 시점에서 표적 기관에서의 방사선 표지 결합 단백질의 업테이크 이미지(프레임이라고 함)를 만들어내기 위해 가공될 수 있다. 대부분의 연속(동적)연구에서, 정량적 데이터는 표적 기관에서의 방사성 붕괴의 분포 변화를 관찰하여 얻어진다. 다른 말로 하면, 시간-활성 데이터 분석은, 시간의 경과에 따라, 표적 기관이 방사선 표지 결합 단백질 제거를 통해 업테이크하는 것을 보여줄 것이다.
적당한 방사성 동위원소를 선택하는 데에는 다양한 요소가 고려되어야 한다. 방사성 동위원소는 좋은 해상도의 영상을 얻을 수 있을 것, 사람과 동물에 대한 진단한적 이용에 안전할 것, 바람직하게는 짧은 물리적 반감기를 가짐으로써 신체로 흡수되는 방사능의 양을 감소시킬 것을 목적에 두고 선택되어져야 한다. 방사성 동위원소는 바람직하게는, 약물학적으로 활성이 없고, 투여된 양에 있어서 어떠한 실질적인 생리학적 효과도 나타내지 않는 것이어야 한다.
결합 분자들은 123I, 125I, 또는 131I(USP 4,609,725를 보라)와 같은 다양한 요오드 방사성 동위원소로 방사선 표지될 수 있다. 그러나 방사선 표지의 정도는 모니터되어야 한다. 왜냐하면 영상 결과에 기초한 계산에 영향을 미칠 수 있기 때문이다(즉, 이중 요오도화 결합 분자는 동시간 프레임에 대하여 단일 요오드화 결합 분자에 비해 두 배의 방사계수를 보여준다)
인간대상에 적용함에 있어, 신체의 방사선량 측정에 대한 노출을 감소시키고, 표지된 분자의 탐지가능성을 최적화하기 위하여, (비록 이 방사성 동위원소가 환경에 따라 필요한 경우도 있지만), 125I를 제외한 다른 방사성 동위원소를 사용하 는 것이 바람직하다. 임상적으로 이용될 수 있도록 준비된 것인지의 여부 또한 요소이다. 따라서, 인간에 대한 적용에 있어서, 바람직한 방사선 표지는, 예를 들어, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 90Y, 111In, 113mIn, 123I, 186Re, 188Re, 또는 211At다.
방사선 표지 결합 분자는 다양한 방법으로 마련될 수 있다. 이것은 클로라민-T 방법에 의한 방사-할로겐화, 탁토페록시다아제법과 그에 따르는 HPLC(high pressure liquid chromatography) 정제를 포함한다;(J. Gutkowska et al. in "Endocrinology and Metabolism Clinics of Amrica: (1987) 16 (1): 183) IODOBEADSTM과 같은 다른 공지의 방사선 표지법이 이용될 수도 있다.
방사선 표지 결합 단백질을 최종 이용자로 운반하는 다양한 방법이 있다. 활성제를 신체의 활성부위로 도달시킬 수 있는 어떠한 방법도 가능하다. 만약 분자가 경구투여에 의해 분해될 수 있다면, 흡수를 최적화하기 위하여, 혈관, 피하, 근육내 투여와 같은 비경구 투여가 보통 사용될 것이다.
기타 용도
본 발명에 의한 결합 단백질은 또한 혈액과 같은 체액으로부터 체취한 표적물질을 정제하기 위하여 사용될 수도 있다. 이러한 목적을 위하여, 표적 결합 단백질은, 바람직하게는, 고체상 지지체에 고착화된다. 이러한 지지체는 고체상 진단제를 마련하는데 있어 유용한 것으로 이미 언급되었던 것을 포함한다.
펩티드는 일반적으로 전기영동 또는 크로마토그래피에 의한 분리 또는 정제에 있어 참고용 분자량 표지로 사용될 수 있다. 많은 경우에, 펩티드는 분자량 표 지로 사용되기 위하여 변성되어야 한다. 펩티드의 일반적인 두 번째 용도는 가수분해된 펩티드의 영양분으로서의 활용이다. 가수분해된 펩티드는 흔히 미생물을 배양하기 위한 생장배지에 사용될 뿐 아니라, 인간이 소비하는 식품 조성분으로도 이용된다. 효소 혹은 산 가수분해는 일반적으로 완전분해되어 자유 아미노산을 만들거나. 또는 부분분해되어 펩티드와 아미노산을 만들어낸다. 그러나, 산 가수분해와 달리 효소 가수분해(프로테올리시스)는 비아미노산 작용기를 제거하지 않는다. 펩티드는 또한 용액의 점도를 높이기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명에 의한 펩티드는 앞서 기술된 본 상세한 설명에서 논의된 치료 또는 진단학적 목적 외에 어떠한 장래의 목적을 위해서도 사용될 수 있다.
<실시예 1> 에스트로겐 수용체에 대한 초기 연구들
에스트로겐 수용체(ER)은 핵 수용체들의 스테로이드 계열 중 하나이다. 다른 핵 수용체들과 마찬가지로, ER은 리간드 의존형 전사 활성화제이다. R. C. J. Ribeiro, P. J. Kushner, J. D. Baxter, Ann. Rev. Med. 46, 443, (1995); J.-M. Wurtz et al., Nat. Struct. Biol. 3, 87 (1996); D. Moras and H. Gronemeyer, Curr. Opin. Cell Biol. 10, 384 (1998). 세포 조절에서 별도의 역할들을 하는 것으로 보이는, 두 별개의 에스트로겐 수용체들 ER α와 ER β가 설명되어졌다. K. Paech et al., Science 227, 1508 (1997); G. G. J. M. Kuiper and J.-Å Gustafsson, FEBS Lett. 410, 87 (1997); J.T. Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 247, 75 (1998); V.Giguere, A. Tremblay, G.B. Tremblay, Steroids 63, 335 (1998). 천연적인 리간드인 에스트라디올 뿐만 아니라, 에스트로겐 수용체의 활성은, 집합적으로 보조-활성화제들 및 보조-억제자들로 불리우는 부가적인 단백질들의 연합/분리에 의하여 조절된다. J. Torchia et al., Nature 387, 677 (1997); C. K. Glass, D. W. Rose, M. G. Rosenfeld, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 222 (1997); J. Torchia, C. Glass, M. G. Rosenfeld, ibid. 10, 373 (1998). 에스트라디올과 결합하면, ER은 보조-활성화제 단백질들이 연합하는 부위를 노출하는 콘포메이션 변화를 겪는다. 이러한 변화는 또한 보조-억제자들 또는 비활성 수용체와 연합하는 다른 분자들이 결합하는 부위들을 감추게 되고, 따라서 그들과의 연합을 방해한다.
에스트로겐 수용체는 유방암이나 자궁암과 같은 질병의 치료적인 표적이고, 또한 골다증을 포함하여 폐경기의 증상 및 영향을 완화시키는 약품의 표적이다. 효과적임에도 불구하고, 에스트로겐 수용체를 타겟으로 하는 화합물들은 상이한 표적 조직들에서 다양한 효과들을 보인다. 예를 들어서, 타목시펜(tomoxifen)은 유방 조직에서 에스트로겐 수용체 길항물질이고 ER 양성 유방 종양들의 성장을 늦추는데 효과적이다. 그러나, 타목시펜은 자궁 세포 성장에 작용물질 효과들을 가질 수 있다. M. A. Gallo and D. Kaufman, Seminars in Oncology 24 (suppl.1), S1-71 (1997). 넓은 범위의 효과들로 인하여, 약에 의하여 표적화된 에스트로겐 수용체는 완전한 작용물질 또는 길항물질로 분류할 수 없고, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절인자, 즉 SERM(Selective Estrogen Receptor Modulators)라고 부르는 것이 더욱 적합하다. H. U. Bryant and W. H. Dere, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 45 (1998). SERM들은 완전히 활성화적이거나 비활성인 콘포메이션들안으로 수용체들을 밀어넣는 것으로 보인다. 생체외 환경에서 이러한 다양한 매개적인 콘포메이션들을 구분하는 것은 매우 어려운 일이었다. 우리는 다른 SERM들에 의하여 야기되는 ER의 콘포메이션들을 구분하는 것을 가능하게 하는 펩티드 프로브들을 개발하였다. 별도의 생물학적 효과를 가지는 각 SERM은, 핑거 프린트 분석에서 고유한 패턴을 보였다. 이러한 프로브들은 연구 및 약 발견에 중요한 도구를 제공하며, 수용체 콘포메이션과 생물학적 활성간의 연관성을 제공할 것이다.
이 실시예에서, 펩티드들은 리간드없는 에스트로겐 수용체 α(실시예 1.1; 표1) 또는 에스트라디올-활성화된 수용체 (실시예 1.2, 표2)에 결합되는 것으로 구분되었다. 그런 다음, 이러한 Erα-결합 펩티드들은, 에스트라디올이 있을 때와 없 을 때에, Erα 또는 Erβ에 결합하는 그들의 능력에 따라서 5가지의 클래스들로 구분되었다(실시예 1.3). (원래 그들은 모두 apo-ERα또는 에스트라디올-활성화된 Erα에 결합하였다.) 최종적으로, 각 클래스를 대표하는 펩티드들이, 알려진 ER SERM들인 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol), 나폭시딘(nafoxidine), 타목시펜(tamoxifen) 또는 클로미펜(clomifene)을 "핑거프린트"하는데 사용되었다(실시예 1.4)
실시예 1.1: 리간드없는(활성화되지 않은) 에스트로겐 수용체 α에 결합하는 펩티드들의 동정
ER 알파(Panvera Corp.)가, 특허 출원 Fowlkes, 09/050,359에서 설명되어 있는 바와 같이, 파아지 친화도 선택을 위하여 Immulon 4 플라스틱 플레이트들(Dynatech) 위에 고정되었다. 리간드없는(활성화되지 않은) 수용체에 결합하는 펩티드 서열이 아래의 표1과 같이 얻어졌다.
실시예 1.2: 에스트라디올 활성화된 에스트로겐 수용체 α에 결합하는 펩티드들의 동정
상기한 바와 같이 에스트로겐 수용체가 고정되었고, 친화도 선택을 위하여 파아지를 첨가하기 이전에 100 μM의 에스트라디올로 15분 동안 배양되었다. 에스트라디올의 존재시에 얻어진 서열은 표2와 같다.
에스트라디올의 존재시에, 콘센서스 LXXLL를 함유하는 많은 서열들이 분리되었다. 핵 수용체 보조-활성화제들에서 발견되는 이러한 모티프는, 핵 수용체들과 그들이 연합하는데 필요하고도 충분한 것으로 이미 알려져 있다. 에스트라디올이 결합하면 노출되는 ER의 리간드 결합 도메인에서 발견되는 나선형 영역을 통하여 이러한 연합이 수행된다. 결정학적 연구에 의하면, 이러한 영역은 어떤 SERM들의 존재하에서는 적당하게 위치하지 않아서 보조-활성화제가 이 부위에 연합하는 것을 방해한다. D. M. Heery, E. Kalkhoven, S. Hoare, M. G. Parker, Nature 387, 73 (1997); M. Nichols, J. M. J. Rientjes, A. F. Stewart, EMBO J. 17, 765 (1998); W. Feng et al., Science 280, 1747 (1998); A. M. Brzozowski et al. Nature 389, 753 (1997).
이것과 일관되게, 아포-수용체상에서 또는 4-OH 타목시펜의 존재시, LXXLL 모티프를 함유하는 펩티드 서열들이 분리되지 않았다.
실시예 1.3: 펩티드 서열들의 분류
a) 에스트라디올의 존재 또는 부존재시에 ER α및 β의 결합에 대한 파아지 결합의 비교
파아지 발현하는 별개의 펩티드 서열들은 다른 많은 파라미터들에 따라서 분류되어 왔다. 초기 연구들에서는 에스트라디올의 부존재 또는 존재하에 각 파아지의 ER α 및 β에 대한 상대적인 결합을 측정하였다. ER α및 β가 Immulon 4 플레이트들 위에서 고정되었고, 밤새 새로 배양된 파아지 상청액을 첨가하기 이전에, 100 μM 에스트라디올로 15분간 처리되었다. 결합된 파아지는 HRP와 결합된 항-M13 항체를 이용하여 감지되었다. 이러한 결과들로부터, 12 파이지들이 다음 연구를 위하여 선택되어졌다. 서열들은 ER α또는 ER β에 대하여 선호적으로 결합하는 것들에 따라 그리고, 에스트라디올의 존재 또는 부존재하에 선호적으로 결합하는 것들에 대하여 선택되었다.
b) LXXLL 모티프를 함유하는 펩티드와 파아지의 경쟁
지금까지 확인된 보조-활성화제 단백질들은, 콘센서스 LXXLL(L이 루신이고 X는 임의의 아미노산임)를 가지는 보조활성화제상의 루신이 많은 영역를 통하여 핵 수용체들과 상호 작용한다. 이러한 콘센서스 모티프를 함유하는 보조-활성화제들은 AF2 도메인(C-말단 트랜스액티베이션 도메인)내의 헬릭스 12에서 ER에 결합한다. 이러한 나선 영역은 수용체가 활성화될 때에 노출된다. 활성화된 수용체들에 대하여 분리된 많은 펩티드 서열들이 루신이 많았으며 LXXLL 모티프를 많이 함유하였다. 이러한 서열들 모두 활성화된 ER에 선호적으로 결합하였다. ER에 대한 LXXLL 펩티드의 결합이 파아지의 결합에 영향을 미치는지를 결정하기 위하여, LXXLL 모티프가 함유된 펩티드를 합성하여 파아지와의 경쟁 분석들에서 이용하였다. 펩티드 서열은 에스트라디올: SSNHQSSRLIELLSRSGSGK-비오틴의 존재하에 분리되었던 펩티드 서열은 펩티드 #4에 해당된다.
ER α 및 β가 상기한 바와 같이 고정되었고, 밤새 새로 배양된 파아지 상청액을 첨가하기 이전에, 100μM LXXLL 펩티드, 100 μM 에스트라디올, 버퍼만이 각각 있는 경우 또는 100 μM 에스트라디올과 100 μM의 펩티드가 조합되어 있는 경우에 대하여, 각각 20분간 선-배양되었다. 결합된 파아지는 상기한 바와 같이 감지되었다. LXXLL 함유 펩티드를 발현하는 모든 파아지들은, 그 펩티드에 의하여 경쟁되었고, LXXLL 모티프를 가지지 않는 다른 몇 개의 파아지 또한 그 펩티드에 의하여 경쟁되었다. 이러한 파아지들은 LXXLL 모티프를 모방하는 서열을 발현할 수 있 거나 그 펩티드의 결합에 의하여 알로스테릭적으로 영향을 받을 수 있다. 그 펩티드와 경쟁하지 않으며 LXXLL 모티프를 함유하지 않는 파아지 또한 존재하였다.
이러한 데이터를 바탕으로, 펩티드 서열들은 표 3 및 표 4에서 보이는 바와 같이, 5가지 클래스로 구분된다. 표 3은 각 클래스를 나열하고 있으며, 표 4는 각 클래스들을 정의한다. 리간드가 없는 ER α및 β에 대한 결합을 비교하면, 클래스 1 및 클래스 5 펩티드들이 ER β에 대하여 더 높은 친화도를 가지며, 클래스 2, 3 및 4 펩티드들은 ER α에 대하여 더 높은 친화도를 가진다. 리간드(에스트라디올)는 ER α 및 β에 대한 클래스 1 펩티드들의 친화도를 증가시키며, 두 수용체들에 대한 클래스 5 펩티드들의 결합을 감소시킨다. 리간드는 양 수용체들에 대한 클래스 2 펩티드들의 결합에는 영향을 미치지 않는다. 리간드는, ER α에 대한 클래스 3 펩티드들의 결합을 증가시키는 반면에, ER β에 대한 영향은 없으며, ER α에 대한 클래스 4 펩티드들의 결합을 감소시키는 반면에, ER β에 대하여는 역시 영향을 미치지 않는다. 상기에서 설명한 바와 같이, LXXLL 모티프를 함유하는 펩티드는, ER α및 β에 대하여 모두 클래스 1로부터의 파아지와 경쟁할 수 있었고, 클래스 4 및 5로부터의 파아지와는 ER α에 대하여만 경쟁한다. 클래스 2 및 3로부터의 파아지는 두 수용체 모두에 대하여 LXXLL 펩티드와 경쟁하지 않는다.
실시예 1.4 : 에스트로겐 수용체 작용물질들 및 SERM들의 핑거프린팅
에스트로겐 수용체에 대하여 알려진 작용물질들 및 SERM들이 많이 있다. 핑거프린팅 시스템의 초기 시험을 위하여, 두 작용물질들, 17-β에스트라디올 및 에스트리올 및 세 SERM들, 4-OH 타목시펜, 나폭시딘 및 클로미펜 들이 선택되었다. 세 SERM들은 모두 트리페닐에틸렌의 유도체들이다. 반응물은 모두 Sigma로부터 구입하였다.
상기에서 설명한 5 클래스들의 각 파아지의 결합에 대한, 작용물질들 및 SERM들의 영향이 조사되었다. 이를 위하여 고정된 ER α 및 ER β가, 밤새 새로 배양된 파아지 상청액을 첨가하기 이전에, TBST내의 100 μM의 에스라디올, 에스트리올, 나폭시딘, 타목시펜 또는 클로미펜으로 또는 TBST만으로 20분 동안 배양되었다. 그런 다음 1시간 동안 배양하고, 웰들은 TBST로 5번 세척하고 결합된 파아지를 HRP와 결합된 항-M13 항체를 사용하여 가시화하였다.
다음으로 핑거프린트들이 확인되었다(표6). 데이터는, 리간드가 결합되지 않은 수용체와 비교하였을 때, 결합에 대한 상대적인 변화(흡광도의 증가 또는 감소로 결정됨)에 의한 것이다. + 또는 - 표시의 수는 신호의 변화의 정도나 방향을 나타낸다; +/-는 별 다른 변화가 없는 것을 나타낸다.
작용물질들(에스트라디올 및 에스트리올)은 SERM들(타목시펜, 나폭시딘, 클로미펜)의 것들과 별개의 핑거프린트들을 보였다. 뿐만 아니라, ER α및 ER β에 대한 핑거프린트들이 상이하다. 예견된 바와 같이, 생물학적 효과들이 유사한 작용물질들은 각 수용체들상에서 유사한 핑거프린트를 보인다. SERM들은 모두 트리페닐에틸렌 유더체의 동일한 클래스이며 유사하지만 별개의 생물학적 효과들을 가진다. 핑거프린트 분석은 그들과 순수한 작용물질들을 구분하며, 생체내 활성에 있어서 그들이 유사하지만 별개인 것을 가르킨다.
클래스 1 펩티드의 결합이 증가하는 것이 작용물질 활성을 나타낸다면, 핑거 프린트는, 타목시펜은 ER α에 대하여 낮은 수준의 작용물질 활성을 생성하고, ER β에 대한 작용물질 활성이 없는 것을 생성하는 것을 암시한다. 유사하게, 클래스 4 펩티드의 결합의 감소가 작용물질 활성을 나타낸다면, 핑거프린트는, 타목시펜은 ER α및 β에 대하여 모두 길항물질 활성을 가지는 것을 암시한다. 각 펩티드 클래스의 신호들의 조합은 SERM에 대한 핑거프린트를 생성하는데 이는 작용물질 및 길항물질 활성의 상대적인 수준에 대한 정보를 제공한다. ER α와 ER β상의 신호 변화가 상이한 것은 SERM에 대한 수용체 활성의 변화가 조직 특이성이 있음을 가르킨다.
<실시예 2> 에스트로겐 수용체들에 대한 한층 더한 조사
다른 콘포메이션들(:아포-ER, ER에 결합된 에스트라디올 및 ER에 결합된 4-OH 타목시펜) 내에 ER을 두는 조건들하에서, 펩티드 라이브러리들을 디스플레이하는 파아지의 친화도 선택(Sparks, et al. (1996), Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, pp. 227-253)이 ER α및 β에 대하여 수행되었다. 각 조건하에서 친화도가 높은 펩티드의 고유한 셋트가 동정되었다. 가장 뚜렷하게는, 에스트라디올의 존재시 펩티드의 친화성 선택은 LXXLL 모티프를 가지는 많은 서열들을 밝혀냈다(표 100A). 핵 수용체 보조-활성화제들(표 100B)에서 발견되는 이 모티프는, 그들이 핵 수용체들과의 연합을 위하여 필요하고도 충분한 것으로 밝혀졌다(Heery, et al. (1997), Nature, 387: 733-736). LXXLL 모티프와 ER의 연합은, 에스트라디올에 결합하면서 노출되는 나선형 영역를 통하여 수행된다는 것이 알려져 있다. X-선 결정학을 이용한 연구에 따르면, 그 영역은 랄록시펜 (raloxifene)(Brzozowskl, et al.(1997)) 또는 4-OH 타목시펜(Shiau, et al. (1998))의 존재하에서 적합하게 위치하지 않고, 따라서 보조-활성화제 LXXLL 모티프의 작용을 방해한다는 것이 밝혀졌다. 에스트라디올의 존재하에 이러한 서열들의 동정은, ER이 생체내에서 발생할 것으로 예견되는 변화와 일치하게 생체외에서 리간드에 반응하여 콘포메이션 변화들을 거친다는 것을 가르킨다.
물질들
에스트로겐 수용체 α및 β는 PanVera 회사(Madison, WI)로부터 구입하였다. Immulon 4 96-웰 플레이트들은 Dynatech으로부터 구입하였다. 스트렙타비딘 (Streptavidin), 17-β에스트라디올, 4-OH 타목시펜, 나폭시딘, 클로미펜, 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 프로게스테론, 16-αOH 에스트론, 및 에스트리올은 Sigma로부터 구입하였다. 프리마린(Premarin)은 Wyest-Ayerst의 생산품이다. 랄록시펜은 Eli Lilly 회사의 생산품이다. ICI 182,780은 Tocris Cookson사 (Ballwin, MO)로부터 구입하였다. 항-M13 항혈청은 Pharmacia로부터 구입하였다. 단일 가닥 M13 DNA의 서열 분석은 Sequetech사(Mountain View, CA)에 의하여 수행되었다. 펩티드 합성은 AnaSpec(San Jose, CA)에 의하여 수행되었다.
실시예 2.1:
SERM들 4-OH 타목시펜, ICI 182,780 또는 둘 다 동시에 존재하에, 플라스틱-고정된 Er α에 결합되는 펩티드들의 부가적인 파아지 친화력 선택들이 이루어졌다 (표 7).
실시예 2.2:
순서대로 고정된, ERE(에스트로겐 반응 요소)에 접합된 ERα또는 ERβ를 가지고 한층 더한 파아지 친화력 선택들이 이루어졌다. Erα에서는 리간드가 없이(아포-수용체) 선택들이 수행되거나, 또는 17-β 에스트라디올, 4-OH 타목시펜, 랄록시펜, 또는 ICI 182,780의 존재하에 선택들이 수행되었다.
그 방법은 아래에서 상세하게 설명되어 있다. 에스트로겐 수용체의 다양한 콘포메이션에 대한 파아지 친화도 선택은 Sparks, et al. (1996)에서 설명된 바와 같이 본질적으로 수행되었다. 선택들은 TBST(10 nM Tris-HCl, pH 8.0, 150 nM NaCl, 0.05% Tween 20)내의 또는 1μM 17-β에스트라디올 또는 4-OH 타목시펜을 함유하는 TBST내에서 수행되었다. Immulon 4 96-웰 플레이트들이 0.1 소디움 바이카보네이트내의 스트렙타비딘으로 코팅되었다. 그런 다음 플레이트들은 웰 당 2 pmol 비오틴화된, 비텔로지닌(vitellogenin) 에스트로겐 반응 요소(ERE)를 가지고 1시간 동안 배양된 다음(Anderson (1998), Biochemistry, 37: 17287-17298), 웰 당 3 pmol의 (단량체) ERα또는 ERβ로 1시간 동안 배양되었다. 비텔로지닌 ERE에 해당되는 올리고뉴클레오티드들, 비오틴-GATCTAGGTCACAGTGACCTGCG (전방향으로) 및 비오틴-GATCCGCAGGTCACTGTGACCTA (역방향으로)가 Genosys에 의하여 합성되었다. 서열분석된 활성 펩티드들이 표 8에 표시되어 있다. ERβ에 대하여는, 리간드가 없이, 또는 에스트라디올 또는 타목시펜의 존재하에 선택들이 수행되었다. 결과적인 활성 펩티드들이 표 9에 표시되어 있다.
실시예 2.3
SERM들의 존재 또는 부존재하에서, ERα 및 ERβ에 결합하는 능력에 따라서, 모든 파아지들이 분류되었다. 이러한 분석들은 파아지 ELISA에 의하여 수행되었다. 본질적으로, 플라스틱 플레이트들은 스트렙타비딘(sigma)으로 코팅되었다. 비오틴화된-ERE들(상기 참조)은 고체-상 스트렙타비딘에 접합되었고, ER은 ERE에 접합되었다. 결합된 파아지는 양고추냉이 퍼옥시다아제-표지된 항-(M13 파아지) 항체들을 사용하여 감지되었다.
그런 다음, ER은 100μL TBST 또는 1μM의 적합한 조절인자가 함유된 TBST로 배양되었다. DH5αF' 셀들내에서 5시간 배양 성장된 파아지(40μL)를 웰들에 직접 첨가하고 상온에서 30분동안 배양하였다. 그런 다음 TBST로 5회 세척하여 결합되지 않은 파아지들을 제거하였다. 결합된 파아지는 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)와 결합된 항-M13 항체들을 사용하여 감지되었다. 분석들은 2,2'-아지노비스(3-에틸벤조티오졸린)-6 술폰산(ABTS) 및 수소 퍼옥사이드로 10분간 현상된 다음, 1% SDS를 첨가하여 정지시켰다. 분자 디바이스 마이크로플레이트 리이더내에서 405nm의 흡광도가 측정되었다.
그 결과들이 표 11 내지 표 13에 나타나있다.
표 11: ERα 수용체에 대한 ERα-선택된 펩티드들의 결합;
표 12: ERβ 수용체에 대한 ERα-선택된 펩티드들의 결합;
표 13: ERα 또는 ERβ수용체들에 대한 ERβ-선택된 펩티드들의 결합.
결합 활성도는 0 내지 7+ 스케일로 반정량적으로 나타냈다.
실시예 2.4
패널 펩티드들의 선택 및 특성 분석
상기에서 설명된 바와 같이, 에스트라디올 또는 4-OH 타목시펜의 존재하에, 아포- ERα 및 β에 대한 결합, ERα및 β에 대한 결합에 관하여 친화도 선택된 모든 파이지들의 결합이 ELISA에 의하여 평가되었다. 많은 파아지가 뚜렷한 우선적인 결합을 보였다. 어떤 서열들은 아포-수용체들에 더 강력하게 결합된 반면에, 다른 것들은 에스트라디올-활성화된 또는 4-OH 타목시펜 활성화된 수용체들에 대하여 우선적인 결합을 보였다. 이러한 분석을 근거로, 별개의 펩티드 서열들을 발현하고 별개의 결합 우선도를 보이는 11개의 파아지가 콘포메이션 프로브로서 사용하기 위하여 선택되었다.
이러한 프로브들중 5개는 ERα 및 ERβ에 모두 결합되고(α/β Ⅰ-Ⅴ), 셋은 ER α에 특이성을 가지고(α Ⅰ-Ⅲ), 셋은 ER β에 특이성을 가진다(β Ⅰ-Ⅲ)(표 10 참조). 각 클래스별로 몇 개의 대표들이 있는 세가지 클래스 패널로 볼 수도 있고, 각 구성원이 각 클래스를 대표하는 11개 클래스 패널로 볼 수 있다. 몇몇은 ERα및 ERβ양자에 의하여 인식되고, 어떤 것들은 수용체 특이성이 있는 것으로 구별되는 펩티드들의 별개의 클래스들의 구별은, 두 수용체들의 1차 구조들가 유사하지만 별개인 것과 일치한다.
α/β Ⅰ-Ⅴ 및 α Ⅰ-Ⅲ 프로브들의 결합 부위들은, 글루타티온-S-전이효소 (GST)에 융합된 ERα리간드 결합 도메인(잔기들 282-595), GST에 융화된 ERα 아미노말단 도메인(1-184) 및 전체 길이의 ER을 이용하여 ERα상에서 매핑되었다. 분석들은 실시예 2.3에서 설명된 형식으로 수행되었고, 다만 도메인들이 웰의 플라스틱 표면상에 바로 고정된 점만이 상이하다. 분석들은 파아지 ELISA에 대하여(실시예 2.3)에 대하여 수행되었다. 그 결과들이 도2에 나타나 있다.
αⅠ을 제외하고 모든 프로브들이 리간드 결합 도메인에 결합하였다. 전체 길이의 단백질에만 결합한 αⅠ 프로브는, 수용체 도메인들간의 상호 작용에 의하여 형성되는 3차 구조에 의하여 생성되는 부위에 결합할 것이다.
이 프로브들은 상기에서 설명한 바와 같은 분석법(ERE를 사용하는)에 의하여 다양한 다른 SERM들로 ER α 및 ER β의 상호 작용을 핑거프린트하는데 사용되었다. 다음으로, 우리는 별도의 생물학적 활성들을 가지는 다양한 ER 리간드들의 존재하에 각 프로브가 ERα와 ERβ에 대하여 결합하는 것을 평가하였다. 그 목적은, 각 리간드들이, 프로브들의 결합 패턴을 변화시키는, ER내에서 콘포메이션 변화를 야기하는지를 결정하는 것이고, 따라서 각 화합물에 대하여 "핑거프린트"를 형성하는 것이다. 이 연구에 사용되는 리간드들은, ER 작용물질들 에스트라디올, 에스트리올 및 디에틸스틸베스트롤(DES); SERM들 4-OH 타목시펜, 나폭시딘, 클로미펜 및 랄록시펜; 길항물질 ICI 182,780; 및 에스트라디올 대사 물질 16-α-OH 에스트론을 포함한다. 에스트로겐 대체 치료로서 사용되는 접합 에스트로겐들의 혼합물인 프리마린이 또한 포함된다. 그러나, 이는 프리마린의 많은 성분들이 대사적으로 활성화되어야 한다는 것을 유의하여야 한다. 따라서 그들의 작용은 이러한 생체외 분석법에서 감지되어야 한다. 버퍼로만(아포-수용체) 및 프로게스테론이 대조구로서 포함되었다. 이 연구에서 사용된 SERM들의 구조 및 생물학적 영향들에 관한 정보가 다음의 논문들에 제시되어 있다: B. S. Katzenellenbogen, M. M. Montano, K. Ekena, M. E. Herman, E. M. McInerney, Breast Can. Res. Treat. 44, 23 (1997) ; J. I. Macgregor and V. C. Jordan, Pharmacological Rev. 50, 151 (1998) ; B. T. Zhu and A. H. Conney, Carcinogenesis 19, 1 (1998) ; M. T. R. Subbiah, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 23 (1998) ; Sulistiyani, S. J. Adelman, A. Chandrasekaran, J. Jayo, R.W. St. Clair, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 15, 837 (1995) ; B. R. Bhavnani and A. Cecutti, J. Clin. Endocrinol. And Metab. 78, 197 (1994) ; B. Bhavnani, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 6 (1998) ; T. A. Grese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14105 (1997) ; T. A. Grese et al., J. Med. Chem. 41, 1272 (1998) ; A Howell, Oncology 11, suppl 1, 59 (1997).
표 14에서 보이는 바와 같이, 시험된 리간드들 각각이 프로브들의 결합 패턴을 변경하고, 각각에 대한 별개의 핑거프린트를 형성하였으나, 프로게스테론에 의하여 생성된 패턴은 버퍼에 의하여 생성된 패턴과 구별되지 않았다.
리간드 의존형 프로브들의 고유한 결합 패턴들은, 각 리간드가, 상이한 펩티드 결합 표면들을 노출하는 수용체 콘포메이션 변화를 야기한다는 것을 가르킨다. 에스트라디올 및 ICI 182,780에 대한 결합 패턴들은 ERα 및 β모두에 대하여 별개의 것으로 구분되어 일찍이 프로테아제 소화 연구들에 의하여 설명되었던 콘포메이션적인 변화를 확인시킨다. 프로테아제 소화 검증은, 콘포메이션 변화들의 감지를 위한 절단 부위들의 위치에 의존하는데, 에스트라디올과 4-OH 타목시펜에 의한 것 또는 에스트라디올과 ICI 182,780에 의하여 야기되는 콘포메이션 변화들을 구분할 수 있었다. 그러나, 그것은 4-OH 타목시펜과, ICI 182,780과 같은 다른 ER 조절인 자들에 의하여 야기되는 변화들은 구분할 수 없었다. 그러나, 핑거프린트 분석법은, ICI 182,780의 존재하에서는 노출되지 않는, 고유한 펩티드 결합 표면들이, 4-OH 타목시펜의 존재하에 ERα와 β양자에 대하여 노출되는 것을 명확하게 한다. 타목시펜, 나폭시딘 및 클로미펜이 동일한 트리페닐에틸렌 코아를 함유한다. 이러한 세 가지 화합물들은 구조상으로는 유사하지만, 별개의 생물학적 효과를 생성한다. 그러므로, 이러한 화합물들은 수용체들내에서 유사하지만, 구분되는 콘포메이션 변화들을 야기할 것임을 예견할 수 있다. 핑거프린트 분석은, 4-OH 타목시펜의 존재시, ER에 대한 높은 친화도를 가지는, 프로브들 α/β Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ이, 나폭시딘 및 클로미펜과 복합체를 형성한 ER에 대하여 낮은 친화도를 보이는 것을 밝혔는데, 이는 이러한 화합물들이 존재하는 경우, 이러한 펩티드 결합 표면들이 상이하다는 것을 가르킨다. αⅢ 프로브는 이러한 세 화합물들에 대하여 더욱 차별화된다. 핑거프린트 분석은 또한, 4-OH 타목시펜과 랄록시펜을 차별화한다. 프로브들 α/β Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ는, 4-OH 타목시펜에 비하여, 랄록시펜의 존재시 ER α및 β모두에 대하여 더 감소된 친화도를 가진다. 프로브들 α/βⅡ, βⅠ 및 βⅢ는 이러한 두 화합물들에 의하여 야기되는, ER β 콘포메이션 변화들을 더욱 차별화한다. 프리마린에 의하여 생성된 핑거프린트 패턴은 다른 작용물질들에 비하여 구분된다; 그러나, 프리마린의 활성들은 성분들의 혼합에 기인한 것이다. 프리마린의 정제된 각 활성 성분들의 각각의 존재하는 경우, 프로프들의 결합 패턴을 분석하는 것은 흥미로운 일일 것이다.
프로브 α/βⅠ은 LXXLL 모티프를 함유한다. ER에 대한 에스트라디올의 결합 은, ER α및 ER β 양자에 대한 이 프로브의 결합을 강하게 증강시킨다. 그러나, ER 작용물질들로 또한 여겨지는, 에스트리올, 프리마린 및 DES는, 이 프로브가 ER α에 결합하는 것을 에스트라디올 동일한 정도로 활성시키지는 못했다. ER β에 대하여, 모든 작용물질들과 프로브의 결합은 상당히 증강되었다. SERM들, 4-OH 타목시펜, 나폭시딘, 클로미펜, 랄록시펜 및 ICI 182,780은, ER α및 β에 모두에 대하여 이 프로브가 결합하는 것을 방해하였고, 버퍼만 있을 때에 관찰되는 정도의 낮은 수준으로 결합을 감소시키는 것으로 보였다.
프로브들 α/β Ⅲ-Ⅴ은, SERM들 특히 4-OH 타목시펜의 존재하에 결합을 증강시키는데, 이는 이러한 화합물들의 존재시 ER상에서 새로운 결합 부위가 노출되는 것을 가르킨다. 프로브들 α/βⅡ, αⅢ, βⅠ 및 βⅢ와 함께 이러한 세 프로브들의 결합 패턴들은 4-OH 타목시펜, 나폭시딘, 클로미펜 및 랄록시펜에 의하여 야기되는 수용체 콘포메이션상의 차이들을 설명한다. 이러한 SERM들의 존재시 프로브들이 ER에 결합하는 것은 변경되는 것이고 없어지는 것이 아니며, 수용체 콘포메이션상의 미묘한 차이들이 가시화될 수 있다. 이것은 이러한 4가지 화합물들간을 구분하는 최초의 생체외 분석이다. 프로브 αⅡ는, 에스트로겐 수용체에 결합하는 임의의 화합물의 존재시, ER α에 결합하는 점에서 고유한데, 이것은 어떤 수용체 콘포메이션 변화들은 조절인자에 대하여 고유한 반면에, 다른 것들은 더욱 일반적이다는 것을 가르킨다. 전체적으로, 이러한 프로브들은 ER 활성에 대한 많은 다른 조절인자들에 의하여 야기되는 미묘하고도 구분되는 콘포메이션 변화들을 감지할 수 있게 한다.
프로브가 ER에 결합하는 것이 파아지의 표면에 발현된 펩티드에 의존한다는 것을 확인하기 위하여, 그 서열들에 해당하는 비오틴화된 펩티드들이, 카르복실-말단 리신에 부착된 바이오틴을 가지고 합성되었다. 이 펩티드들은 유럽퓸(Eu) 표지된 스트렙타비딘에 결합되었고, 결합에 관한 연구들은 시간 분석 형광 분광기(TRF)를 사용하여 수행되었다.
시간 분석 형광(TRF) 분석들은 상온에서 다음과 같이 수행되었다: 코스타 하이-바인딩(Costar high-binding) 384 웰 플레이트들이 0.1M 소디움 바이카보네이트내에서 스트렙타비딘으로 코팅되었고, 소의 혈청 알부민으로 블럭되었다. 비오틴화된 ERE(2 pmol)이 각 웰에 첨가되었다. 1시간 배양후, 남은 결합 부위들을 확인하기 위하여 바이오틴이 첨가되었다. 플레이트들이 세척되고 각 웰에 2 pmol ERα가 첨가되었다. 1시간 배양후에, 플레이트들은 세척되고 피코몰로부터 마이크로몰 범위의 농도로 ER 조절인자들이 첨가되었다. 조절인자들과 함께 30분 동안 배양한 후, 유럽퓸 표지된 스트렙타비딘(Wallace)-비오틴화된 펩티드 접합체(아래에서 설명한 바와 같이 준비됨) 2pmol이 첨가되고 1시간 동안 배양되었다. 그런 다음, 플레이트들이 세척되고 유럽퓸 증강 용액이 첨가되었다. 400nm이하의 여기 필터 및 620nm 방출 필터들을 사용하여 POLARstar 형광계(BMG Lab Technologies)로 형광 값들이 얻어졌다. 유럽퓸 표지된 스트렙타비딘-비오틴화된 펩티드 접합체는 8 pmol의 비오틴화된 펩티드를 2 pmol의 표지된 스트렙타비딘에 첨가함에 의하여 준비되었다. 30분동안 얼음에서 배양한 후, ER 코팅된 플레이트에 첨가하기 이전에 남아있는 바이오틴 결합 부위들을 바이오틴으로 블럭하였다.
ER에 대한 프로브의 결합이 측정되었다. 그 결과는 표 15에 나타나있는데, 펩티드들이 결합 특이성을 진정으로 부여한다는 것을 나타낸다. TRF 결합 분석법으로부터 얻어지는 형광 값들과 파아지 ELISA 핑거프린트에서 얻어지는 신호들을 비교하면, 두 방법들이 유사한 패턴들을 보인다. 그러나, 결합 분석법은 또한 펩티드 결합에 필요한 콘포메이션 변화를 야기하는, 각 화합물의 잠재력을 알아낼 수 있다. 종합하면, 파아지로부터의 핑거프린트 분석을 펩티드로 전환한 것이, 콘포메이션 변화를 감지하기 위한 더욱 민감한 분석이 될 수 있음을 나타낸다.
TRF 결합 분석법들로부터의 가장 뚜렷한 관찰 결과들 중 하나는, βⅠ 프로브가 ER β에 결합하는 것이, SERM 4-OH 타목시펜의 존재시 증강되고, 랄록시펜, 나폭시딘 및 클로미펜과 같은 다른 SERM들의 존재시에는 감소된다는 점이다. 이러한 화합물들에서 관찰되는 결합의 감소는 에스트라디올, 에스트리올 및 DES 와 같은 작용물질에서 관찰되는 감소와 유사하다.
우리는, 에스트로겐 수용체 α및 β의 콘포메이션 프로브로서 작용하는 펩티드들을 동정하였다. 많은 프로브들이 두 수용체들에 모두 결합하지만, 다른 프로브들은 α또는 β 수용체의 어느 한 쪽에 선호적으로 결합한다. 두 수용체들이 높은 상동 영역들을 가지고, 다른 더 상이한 영역들이 많은 것과 일관되게, 이러한 결과들은 이 수용체들은 공통적인 어떤 결합 표면들을 가지는 것임에 반하여, 다른 것들은 고유하다는 것을 가르킨다. 이것은 두 수용체들이 새포내에서 동일한 조절 단백질들의 몇 몇과 접촉할 수 있으나, 각 ER α또는 β 중 어느 하나의 작용을 특이적으로 조절하는 단백질들도 있을 수 있다는 것을 암시한다.
우리는 우리의 펩티드 프로브들을 사용하여, 다른 리간드들과의 결합 결과로서, 양 수용체가 모두 별개의 콘포메이션 변화들을 겪는다는 것을 보였다. 이 프로브들은 친화도의 상대적인 변화들에 의하여 수용체 콘포메이션 변화를 밝힐 뿐만 아니라, 두 수용체들상의 고유한 결합 표면들을 알아낸다. 사실상, 이러한 결합 표면들은 다른 리간드들에 대응하여 다양한 보조-조절 단백질들과 상호 작용하는 표면들일 수 있다. 예를 들어서, LXXLL 모티프를 함유하는 펩티드들에 의하여 설명되어진 바와 같이(도1), 에스트라디올 활성화된 수용체를 가지고 선택된 많은 펩티드들은, 핵 수용체 보조-활성화제들에서 발견된 서열들을 함유하였다. 이러한 펩티드 프로브들은 아마 수용체와 보조-활성화제 단백질들간의 상호 작용을 모방할 것이다. 잠재적으로는, 이러한 프로브들은 앞으로 수용체-단백질 상호작용들을 밝히는데 사용될 수 있다.
이러한 프로브들의 ER 조절인자들을 감지하는 부가적인 응용이 있을 수 있다. 하나나 그 이상의 프로브들이 ER 활성의 조절인자들을 인식하는 높은 효율의 스크린을 만드는데 사용될 수 있다. 우리는, ER에 결합하는 화합물들이 수용체 콘포메이션을 변경시키고 따라서 프로브들의 결합 패턴을 변경시키는 것으로 기대한다. 스크린에 의하여 표적된 부위들은 진정한 단백질-단백질 상호 작용 표면들이 아니고, 특정 리간드의 존재하에 노출되는 부위를 대표하여 특정 콘포메이션들의 표지로서 작용하는 것일 것이다. 핑거프린트 기법은, 세포기초 분석에서 그들을 분석하기 이전에, 스크린으로부터 작용물질(에스트로겐 패턴을 닮음), 길항물질(ICI 182,780 패턴을 닮음), 혼합(타목시펜 패턴을 닮음) 또는 새로운 영향인자들을 신 속하게 구분하는데 사용될 수도 있다. 핑거프린팅은 구조 활성 관계들을 결정하여 선도하는 최적화 도중에 화학적 수정을 수반하는 화합물들을 신속하게 분석하는데도 사용될 수 있다.
이것은 리간드 클래스들간의 그리고 리간드 클래스들내에서의 리간드들에 의하여 야기되는 에스트로겐 수용체 콘포메이션들간을 구분할 수 있는 것으로 설명되는 최초의 방법이다. 이 분석으로 수집된 데이터는 에스트로겐 수용체의 생물학적 활성이 리간드가 결합되어 야기되는 콘포메이션에 연관될 수 있다는 것에 관한 강력한 증거를 제공한다. 이 핑거프린팅 기법의 장점은, 리간드 또는 기질이 결합되어 구조적 변화를 겪는 임의의 단백질 또는 수용체에 광범위하게 적용될 수 있다는 점이다.
이러한 연구들은 그 분석법들이 파아지-결합된 및 파아지-발현된 펩티드들을 대신하여 합성 펩티드들을 가지고 용이하게 수행될 수 있다는 것을 확신시킨다.
실시예 2.5 패널을 이용하여 알려진 SERM들을 분석함
ER α 및 ER β상에서 에스트로겐 수용체 조절인자들을 핑거프린트 분석하기 위하여, 에스트로겐 수용체 (3 pmol)이, 2 pmol의 비오틴화된 ERE상에 고정되었다. 고정된 ER은, 파이지를 첨가하기 이전에, 에스트라디올(1μM), 에스트리올(1μM), 프리마린 (10μM), 4-OH 타목시펜(1μM), 나폭시딘(10μM), 클로미펜(10μM), 랄록시펜(1μM), ICI 182,780(1μM), 16α-OH 에스트론(10μM), DES(1μM) 또는 프로게스테론(1μM)으로 5분간 배양되었다. 파이지는 DH5αF'내에서 플라크상에서 5시간동안 증폭되었다. 결합된 파아지는 위에서 설명한 바와 같이 감지되었다. 분석들은 ABTS(2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린-술폰산)으로 10분 동안 전개되었다.
그 결과들이 표 14A와 14B에 나타나있다. 표 14A는 ERα수용체에 대한 결합을 보이고, 표 14B는 ERβ수용체에 대한 결합을 보인다. 어떤 것은 ERα에만 결합하고 어떤 것들은 ERβ에만 결합하므로, 각 테이블내에 11개의 모든 패널 펩티드들을 나열할 필요가 없다. 결합 친화도가 0 내지 7+로 반정량적으로 나타나있다.
실시예 2.6 SERM들간의 유사도 계산
표 14A 및 14B에 기초하여, 각 SERM에 대한 핑거프린트를 정의할 수 있다. 이 핑거프린트는, 디스트립터(descriptor)의 배열로서, 디스트립터는 문제되는 SERM의 존재시, ERα또는 ERβ 중 어느 하나에 대한 특정한 패널 펩티드의 결합 친화도를 나타내는 표 내의 값이다. 문제되는 테이블들은, 각 핑거프린트가 16 디스크립터들로 구성되도록 한다(테이블들내에서 각 열에 하나씩). 우리는 11SERM 들에 대하여 각각 하나와 버퍼에 대하여 총 12개의 핑거프린트들을 얻는다.
그러므로, 이러한 핑거프린트들의 가능한 12×12=144 쌍 각각에 대한 유사도를 계산할 수 있다. 우선, 각 핑거프린트간의 유클리드 거리를 계산한다. 이것은 테이블 14A와 14B의 각 행값들 간의 차이의 제곱의 합의 제곱근이다. 예를 들어서, 버퍼와 에스트라디올간의 거리는 다음과 같은 16개의 디스크립터 쌍 차이를 제곱한 것을 합한 값의 제곱근으로서, 즉 다음을 합한 값의 제곱근이다.
(1-6)^2, 25;
(7-2)^2, 25;
(1-1)^2, 0;
(1-1)^2, 0;
(1-1)^2, 0;
(7-7)^2, 0;
(1-6)^2, 25;
(5-2)^2, 9;
(2-7)^2, 25;
(7-2)^2, 25;
(2-1)^2, 1;
(1-1)^2, 0;
(6-3)^2, 9;
(1-5)^2, 16; 및
(7-7)^2, 0;
총 160이고 이것의 제곱근은 약 12.65이다.
이 예에서 가능한 최대 거리는 16*(7*7)의 제곱근인 28이다. 이것은 각 디스트립터 쌍이 최대 차이로 7을 가지고, 핑거프린트에는 16개의 디스크립터들이 있기 때문이다.
거리는 다음와 같이 유사도로 전환될 수 있는데,
현재 유사도 = (최대 거리 - 현재 거리)/최대 거리
이것은 현재 거리가 0일때에 1이되고, 현재 거리가 최대 거리와 동일한 경우에 0이 된다. 위의 예(버퍼:에스트라디올)에서, 유사도는 0.55이다.
이와 대조로, 클로미펜과 랄록시펜간의 핑거프린트들은 제곱근 40의 유클리드 거리를 가지는데, 이것은 6.32가 되고, 따라서 유사도는 0.77이다. 16α-OH 에스트론 및 DES는 한층 더 유사한데, 제곱근 7의 유클리드 거리를 가지고, 이것은 2.645이므로, 0.91의 유사도를 가진다.
반면에, 에스트라디올과 클로미펜간의 핑거프린트들은 제곱근 210의 유클리드 거리를 가지는데, 이것은 14.49이고, 이는 유사도가 0.48이다.
우리는 핑거프린트에 편입되는 디스크립터들 및 그 수를 선택하고, 임의의 방식으로 디스크립터들을 리스케일링하거나 측량하거나, 거리의 측정 방식을 달리하거나 거리를 유사도로 변환하는 방식을 달리할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 거리를 먼저 계산하지 않고서 유사도를 결정할 수도 있다.
위에서, 우리는 ERα 및 ERβ에 대한 데이터들을 한 덩어리로 했다. ER의 각 형식에 대한 핑거프린트들 및 유사도들을 분리하여 계산할 수도 있으며, 이것은 도 5 및 도6에 도시되어 있다.
따라서, 버퍼:에스트라디올에 대하여, ERα결합에 대한 그들의 핑거프린트들간의 거리는 제곱근 84, 즉 9.16이고, ERβ결합에 대한 거리는 제곱근 76, 즉 8.72이다. 최대 거리는 제곱근 (8*7*7)로서 이는 19.8이다. 따라서 유사도는 각각 0.54 및 0.56이고, 이것은 상이도가 큰 것은 아니다.
반면에, ICI 182,780:16α-OH 에스트론에 대하여, 계산 결과, ERα에 대하여는 거리는 제곱근(6)이고, ERβ에 대하여는 제곱근(76)이고 이는 각각 유사도 0.88 및 0.56에 해당된다. 따라서, 이러한 화합물들은 ERα에 결합하는 방식이 ERβ에 결합하는 방식보다 더 유사하다.
이러한 핑거프린팅 기술은, 단백질 콘포메이션의 변화들을 감지하는 신속하고도 감도높은 방법을 제공한다. 우리는 이러한 기술들을 ER α및 β에 적용하였고, 이러한 두 수용체들이, 다양한 활성 조절인자들에 대하여 상이한 콘포메이션 변화를 거치는 것을 증명하였다. 각 조절인자에 대한 프로브 결합 패턴이 고유하므로, 이 분석법은 조절인자 클래스간 또는 조절인자 클래스내에서 화합물들을 구분하는데 사용될 수 있다. 이 분석법은 수용체의 α또는 β 중 어느 하나에 대하여 특이성을 가지는 조절인자들을 동정하는데에도 사용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 프로브들이, ER 활성의 조절인자를 동정하는 고효율의 스크린(HTS)을 셋업하는데 사용될 수 있다. ER에 결합하고 수용체 콘포메이션을 변경시키는 화합물들은 프로브들의 결합 패턴을 변경할 것이다. 이러한 기술은, 세포-기초 분석법으로 그들을 분석하기 이전에, HTS로부터 작용물질(에스트로겐 패턴과 닮음), 길항물질(ICI 182,780 패턴과 닮음) 또는 혼합(타목시펜 패턴과 닮음)인지를 분류하는데 적용될 수 있다. 핑거프린팅은 또한, 구조 활성 관계들에 사용될 수 있는데, 선도 분자들에 화학적 수정들이 이루지는 때에, 핑거프린팅은 이 수정이 모화합물과 다른 방식으로 수용체 콘포메이션에 영향을 미치는지를 신속하게 결정할 수 있다.
이 연구에서 사용된 모든 화합물들은, 생체내에서 고유한 생물학적 활성을 생성하는 것으로 알려져있다. 많은 차별적인 효과들은 조직 특이적인데, 아마 조절 단백질들 및/또는 두 형식의 수용체들의 차별적인 발현에 기인한 것으로 보인다. 또한, 이러한 화합물들은 생체외에서, 각각 고유한 핑거프린트 패턴을 생성하는데, 이는 조절인자와 결합하면서 수용체들에 의하여 채택되는 콘포메이션으로부터 야기되는 것이다. 따라서, 생체 외에서의 SERM들에 의하여 야기되는 핑거프린팅 콘포메이션 변화들은, 조절인자들의 생체 내 생물학적 활성들을 예견하는데 유용할 것으로 기대된다.
실시예 3: 이스트 투-하이브리드 세포-기초 분석법을 이용한 핑거프린팅
Fields 및 Song에 의하여 최초로 설명되고(Nature 340: 245-246 (1989)) Gyrus 등에 의하여 변경된(Cell 75: 791-803 (1993)) 단백질/단백질 상호작용들을 조사하는 투-하이브리드 방법들이 유사한 기술들을 사용한다. 양 경우에 있어서, 업스트림 단백질 결합 부위(DNA 결합 부위)에 의하여 작동되는 리포터 유전자를 지니는 숙주 세포로서 이스트 세포가 제공된다. 이 숙주 세포들은, 또한 전사 활성 단백질 또는 도메인(활성화 도메인)과의 펩티드/단백질 융합을 발현하는 플라스미드를 지닌다. 만약 두 펩티드/단백질 융합들이 세포내에서 상호 작용들의 유도가 가능하다면, 리포터 유전자의 전사 활성이 일어난다. 리포터 유전자 전사의 수준은 두 단백질 융합들간의 상호 작용의 세기를 반영한다.
우리가 사용한 LexA 시스템은 박테리아 DNA 결합 단백질 도메인인, LexA를 사용하고, 박테리아적으로 유도된 전사 활성 서열, B42을 사용한다. 관심있는 단백질이나 펩티드들이 프레임내에서 이러한 도메인들과 융합되고 이스트 세포에서 에피소말 플라스미드들을 사용하여 발현된다. 이러한 관심있는 단백질/펩티드들간의 상호 작용들은, 효소 분석법에 의하여, 리포터 유전자 생성물인, β-갈락톡시다아제의 수준을 모니터링함에 의하여 등록된다. β-갈라톡시다아제 활성들의 수준들의 차이는 단백질 상호 작용들의 상대적인 세기를 반영한다.
우리는 작용물질 또는 길항물질들이 존재하는 경우, LexA 이스트 투 하이브리드 시스템을 사용하여, 펩티드 F6(ERα에 대한 높은 친화도를 가지는 친화도-선택된 펩티드), 알파2(A2), 알파/베타 3(AB3) 및 알파/베타 5(AB5)의, 에스트로겐 수용체 α와의 상호 작용들을 시험하였다. 이러한 펩티드들은 에스트로겐 수용체 α(ERα)을 표적으로 사용하는 파아지 디스플레이 라이브러리들로부터 미리 분리된 것이다. 생체외 파아지 디스플레이 시스템내에서, 작용물질 또는 길항물질이 존재하는 경우, 이러한 펩티드들과 ERα간의 상호 작용들이 변화되었다. 예를 들어서, 펩티드 α2는 에스트라디올과 4-OH-타목시펜의 존재하에 결합하지만, 그들이 없을 때에는 결합하지 않았으며, 펩티드 α/β 3은 4-OH-타목시펜의 존재하에서만이 ERα에 결합하였고, 에스트라디올이 있거나 다른 화합물이 없을 때에는 그렇지 않았다. 우리는 이러한 생체외 결과들이 생체내에서 재연될 것인가를 조사하기 위하여 이스트 투 하이브리드 분석을 수행하였다. 이스트 투 하이브리드 시스템으로부터의 결과들은, 정제된 ERα 단백질상에 디스플레이된 파아지를 이용한 결과들과 정성적으로 유사하였다.
이스트 균주들 및 유전적 처리들
플라스미드들 및 균주에 대한 참조들
클로닝 벡터 pJG4-5
Genbank Accesion 번호: U89961
Reference : Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. and Brent, R. Cdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75 (4), 791-803 (1993)
클로닝 벡터 pEG202 (pLexA), 완전한 서열
Genbank Accesion 번호: U89960
저자들 Golemis, E., Gyuris, J. 및 Brent, R.
제목: 상호 작용하는 단백질들을 동정하기 위한 상호작용 트랩/투 하이브리드 시스템들
논문: 미출판
pJK103
Reference : J. Kamens and R. Brent A yeast transcription assay defines distinct rel and dorsal DNA recognition sequences. New Biol. 3 : 1005-1013 (1991)
이스트 균주 EGY48
Reference : Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. and Brent, R. Cdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75 (4), 791-803 (1993)
이 연구에 사용된 이스트 균주들은, 이스트 투 하이브리드 분석을 위하여 OriGeneTechnologies로부터 구입한 EGY48(MAT αtrp1 his3 ura3 leu2:: 6lexApos- LEU2)이다. 이 균주는 이스트 게놈내에 LEU2 유전자의 6 LexA 오퍼레이터들 업스트림을 함유하고 LexA 투 하이브리드 시스템내에서 단백질-단백질 상호 작용들을 감지하는데 높은 감도를 제공한다. 이 연구에 사용되는 플라스미드들은 pEG202(LexA-DNA 결합 도메인), pJG4-5(B42-활성화 도메인), 및 β-갈락톡시다아제 리포터를 함유하는 플라스미드, pJK103 (OriGene Technologies) 등이다. 에스트로겐 수용체 전체 길이가 프레임내에서 EcoRI 및 XhoI 부위들내로 서브클론되어 ERα-B42 활성화 도메인 융합을 생성한다. ERα는 LexA DNA 결합 도메인에 융합되었을 때에 리포터를 자동 활성화할 수 있으므로 활성 도메인 플라스미드내에서 서브클론되었다.
이 연구에 사용된 펩티드 서열은 T7 시퀴나아제(Life Science)내에 채워진 합성 올리고들로부터 생성되었고, pEG202의 EcoRI-XhoI 부위들내로 서브클론되었다.
합성된 올리고들은 다음과 같다:
F6, 5'-
GACTGTGCGAATTCGGTCATGAACCATTAACTTTATTAGAAAGATTATTAATGGATGATAAACAAGCTGTTCTCGAGCGTGTCAG;
αⅡ, 5'-
GACTGTGCGAATTCTCTTCTTTAACTTCTAGAGATTTTGGTTCTTGGTATGCTTCTAGACTCGAGCGTGTCAG;
α/βⅢ, 5'-
GACTGTGCGAATTCTCTTCTTGGGATATGCATCAATTTTTTTGGGAAGGTGTTTCTAGACTCGAGCGTGTC AG;
α/βⅤ, 5'-
GACTGTGCGAATTCTCTTCTCCAGGTTCTAGAGAATGGTTTAAAGATATGTTATCTAGACTCGAGCGTGTCAG.
이중 가닥 DNA을 생성하기 위하여 사용된 상보적인 합성 올리고는 3'XhoPrim, 5'-CTGACACGCTCGAG이다. 각 5'-올리고는 90℃에서 15분동안 가열하여 3'-올리고로 어닐링되고, 35℃로 서서히 식혀졌다. T7 시퀴나아제가 첨가되고 30℃에서 30분 동안 필-인(fill-in) 반응이 진행되었다. 65℃에서 1시간 동안 효소를 열변성시켜서 반응을 종결한 다음, 제한 소화들이 수행되고 결과적인 DNA 조각들이 pEG202내로 서브클론되어 펩티드-LexA DNA 결합 도메인 융합들을 생성한다.
이스트 세포들은 Ito 등에 의한 방법(J. Bacteriol. 153: 163-168 (1983))에 의하여 형질 변환되었고 선택적인 배지에서 성장되었다.
β-갈라톡시다아제 활성 분석
pJG4-5 ERα pJK103 및 pEG202-F6, -αⅡ, -α/βⅢ, 또는 -α/βV을 함유하는 이스트 균주 EGY48의 10mL 배양액이 탄소원으로서 갈락토스를 가지는, 100 nM 에스트라디올, 4-OH 타목시펜, 또는 타목시펜 시트르산을 함유하는 선택적인 배지에서 30℃로 밤새 배양되었다. 배양액은 동일한 배지에서 ~2×106 세포들/ mL의 농도로 희석되었고 30℃에서 배양균이 ~1×107 세포들/ mL의 농도가 되도록 배양되었다(~4시간). 이스트 들은 원심 분리로 뭉쳐졌고, 추출 버퍼(60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4 , 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1mM PMSF, 7 mM 2-머캅토에탄올)로 세척되었고, 200 μL의 추출 버퍼내에서 서스펜션되었다. 100 μL의 산-세척된 유리 구슬들이 첨가되었고, 4℃에서 10분간 격렬하게 흔들어서 세포들은 용해되었다. 원심 분리에 의하여 세포 파편들이 뭉쳐졌고, 상층액은 깨끗한 튜브내로 옮겨졌다. 10 μg의 전체 세포 단백질이 완전한 Z 버퍼(60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4 , 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 7 mM 2-머캅토에탄올)내로 희석되어 96-웰 마이크로플레이트내에서 100 μL의 부피로 희석되었다. 20μL내의 80 μg의 오르토-나이트로페닐-β-D-피라노사이드 (ONPG)가 각 웰에 첨가되어 색상 전개를 시발시켰다. 30 μL의 1M Na2CO3을 첨가하여 반응을 중단시키고, 전개 시간을 기록하였다. β-갈락톡시다아제 활성은 405nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었다.
이스트 배양액들은, 100nM 에스트라디올, 4-하이드록시-타목시펜, 또는 타목시펜 시트르산 및 상기한 방법들에서 준비된 단백질 추출물들이 있는 경우 또는 없는 경우에 배양되었다. 각 단백질 추출물 10μg이, 오르토-나이트로페닐-β-D-피라노사이드를 기질로 사용하여 β-갈락톡시다아제 활성에 대하여 분석되었다. 활성 단위들은 1000* Abs405/분/mg/단백질로서 정의된다.
그 결과들이 표 99에 나타나 있다.
투 하이브리드 분석법에서 사용된 펩티드들은, ER α를 표적 단백질로 사용하는 파아지 디스플레이에 의하여 원래 분리되었다. 이 분리 과정은 작용물질 또는 길항물질(에스트라디올, 4-OH 타목시펜, ..)의 존재시에 수행되어 상호 작용하는 펩티드들의 차별된 세트들을 생성하였다. ER α와 이러한 단백질들의 상호 작용들이 여러 가지 작용물질 및 길항물질을 이용하여 생체외에서 조사되었다. 생체외에서 이러한 것들에 의하여 생성되는 상호 작용 프로파일은 이러한 펩티드들을 에스트로겐 수용체의 물리적인 상태를 검침하는 프로브들로서 사용할 수 있게 한다. 투-하이브리드 분석법은 이러한 상호 작용들이 세포내에서 유지되는지의 여부를 구분한다.
투 하이브리드 실험들로부터의 결과들로부터, 펩티드들과 ER α 사이의 상호 작용 프로파일이, 생체외에서 결정된 바와 정성적으로 유사하는 것을 알 수 있다. 그러므로, 구조상 작용물질들 및 길항물질들의 효과들과 ER α상의 펩티드 결합 부위들의 유용성이 생체외 및 생체내에서 유지된다. 이러한 결과들로부터 다양한 화합물들에 대한 ER α의 활성화된 또는 방해된 구조적인 상태를 해석할 수 있다. 알려진 활성화제들 및 길항물질을 사용한 결과들은 알려지지 않은 화합물이 작용물질인지 또는 길항물질인지를 약품 스크린에서 동정하는데 사용될 수 있다. 다른 펩티드들의 유용성 및 다른 알려진 작용물질들 및 길항물질들의 사용으로, 가능성있는 화합물들 및 선도 약제를 동정할 수 있는 더 나은 도구가 생성될 수 있다.
실시예 4 ER 활성화 탐구를 위한 포유동물의 투-하이브리드 분석법들
에스트로겐 수용체(ER)는 사람의 발생 및 질환의 정상적인 및 병적인 과정들에서 모두 중요한 역할을 한다. 임상적으로는, 타목시펜과 같은 ER 길항물질들은, ER 함유 유방암의 치료에서 가장 적합했다. 그러나, 통상적으로 초기 치료 후 2 내지 5 년내에 타목시펜에 대한 내성이 발생한다. 내성에 대한 가능한 기작은, 종 양 세포들이 타목시펜을 길항물질로서 인식하다가 이를 작용물질로 인식하는 것으로 전환하는 능력에 있는 것으로 보인다.
이러한 측면에서, 타목시펜 내성 유방암의 치료에, 임상적으로 유용한 새로운 조직 특이성 안티에스트로겐들이 개발되었다.
ER/타목시펜 복합체를 표적으로 하는 새로운 고 친화도 리간드들을 동정하고자 하는 시도에서, 우리는 타목시펜에 의하여 야기되는 특이적 ER 콘포메이션을 인식하는 임의의 펩티드들을 스크린하는데 파아지 디스플레이를 사용하였다. 우리는 이러한 복합체를 인식할 수 있는 일련의 15mer 펩티드들을 분리하였다. 더욱이, 이러한 펩티드들은, 포유동물 투-하이브리드 시스템에서 분석된 바와 같이, 생체내에서 ER과 복합체를 형성할 수 있다. 다양한 ER 돌연변이들을 사용하여, 호르몬 결합 도메인에 대한 펩티드 상호 작용 표면을 맵핑하였다. 중요하게는, 이러한 펩티드들의 발현이 ER로 감염된 세포내에서, 타목시펜의 부분적인 작용물질 활성을 방해할 수 있다는 것을 증명하였다. 이러한 펩티드들이 어떠한 메카니즘에 의하여 ER/타목시펜 전사 활성을 방해하는지에 관한 것이 알려지지 않은 상태로 남아있지만, DNA 결합과 ER 안정도는 펩티드 발현에 의하여 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 그러므로, 이러한 펩티드들이 ER/타목시펜 콘포메이션에서 존재하는 기능적 활성 부위를 타겟팅할 수 있는 것이 가능하다.
이것은 타목시펜 내성 유방암의 치료를 위한 합리적인 치료약 설계의 개발에서 새로운 접근 방식을 가능하게 한다. 전통적으로는, 리간드 결합 포켓과 상호 작용하는 분자들만이 새로운 신규한 ER 길항물질들의 개발을 위하여 고려되어왔다. 이러한 전통적인 "호르몬적" 시료에 부가적으로, 우리는 호르몬들에 의하여 유도되는 특이적 수용체 콘포메이션을 표적할 수 있는 능력을 제안하는데, 이는 치료학적으로 중요한 신규한 제약을 개발하는 결과가 될 수 있다. 더욱이 이러한 발견들은 전사적인 방해가 치료학적으로 유용한 다른 핵 수용체들에 적용될 수 있다.
실시예 4.1
펩티드-수용체 상호 작용들의 세포-기초 분석의 전개를 보여준다. 각 클래스를 대표하는 펩티드 서열들이, 이스트 전사 인자 Gal4의 DNA 결합 도메인(DBD)과 융합되었다. 그런 다음, HepG2 세포들이 ERα-VP16 및 Gal4-펩티드 융합 단백질들에 대한 발현 인자들로 일시적으로 감염되었다. 또한, 5개의 Gal4 업스트림 증강 요소의 제어하에, 루시퍼라아제 리포터 구조체가, 전사 효율을 정규화하기 위하여 pCMV-β갈락톡시다아제 벡터로 감염되었다. Gal4 DBD 만으로 감염된 것이 대조군으로 포함된다. 그런 다음 세포들은, 도면에서 제시되어 있는 바와 같이 다양한 리간드들로 유도되고, 루시퍼라아제 활성 및 β갈락톡시다아제 활성에 대하여 분석되었다. 정규화된 반응은, 루시퍼라아제 활성을 β 갈락토시다아제 활성에 의하여 나눔에 의하여 얻어졌다.
결과들. ERα는 어떠한 조건하에서도 Gal4 DBD 만과는 상호 작용하지 않는다. αβⅠ은, 에스트라디올의 존재하에 ER과 상호 작용하며, 아포-수용체와는 어느 정도 상호 작용한다. αⅡ는, 아포-수용체 및 최저 활성을 보이는 ICI 182,780 결합 수용체가 있는 모든 조건하에서 수용체와 상호 작용한다. αⅢ과 αβⅤ는 타목시펜 결합 수용체와 거의 배타적으로 결합한다. 일반적으로 이러한 데이터는 시 간 결정 형광 연구로부터 얻어지는 것으로 확인된다. 더욱이, 콘포메이션 감지자들로서 역할을 하는 이러한 펩티드들의 능력은, 다른 리간드들에 의하여 결합되는 경우, 수용체가 뚜렷한 콘포메이션 변화를 겪는 프로테아제 소화 및 결정화 연구로부터 얻어진 세포의 초기 관찰들에서 확인된다.
포유동물 투-하이브리드 시스템을 사용하여 펩티드-핵 수용체 상호 작용의 특이성이 분석되었다(도 8). 실험적인 설계는, 프로게스테론 수용체(PRB-VP16), 에스트로겐 수용체 베타(ERβ-VP16), 글루코코르티코이드 수용체(GR-VP16) 또는 부신 수용체 베타(TRβ-VP16)가 시험되는 것을 제외하고 도2와 같은 방식이다.
결과들. 예측한 바와 같이, 시험된 모든 수용체들이, 수용체의 적절한 작용물질의 존재하에 αβⅠ펩티드와 상호작용한다. 시험된 수용체들 중 어느 것도 αⅡ 또는 αβⅢ 펩티드와 상당한 정도로 상호작용하지 않는다. 이것은 αβⅢ가 원래 ERβ상에서 분리된 사실을 고려하면 다소 놀라운 사실이다. 이는 세포내에서 ERβ의 콘포메이션이, 정제된 수용체의 생체외에서의 콘포메이션과 다소 상이할 수 있다는 것을 암시한다. 흥미롭게는, αβⅤ는 PRB 및 ERβ 모두와 연합할 수 있었다. 이 펩티드는 타목시펜의 존재하에서만 ERβ에 결합하였으나, PR 길항물질들 RU 486 및 ZK 98299의 존재하에 PRB와 연합할 수 있었다. 이것은 αβⅤ가 핵 수용체 패밀리 구성원들의 서브셋의 길항물질 콘포메이션을 인식할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4.3
도 9로부터, 타목시펜 활성화된 에스트로겐 수용체와 상호 작용하는 어떤 펩 티드들은, 수용체의 AF-2(Helix 12)를 필요로 않는다는 것을 알 수 있다. 세개의 ERα돌연변이체들이 와일드-타입 ERα와 비교되었다. ER-LL은 돌연변이들 L540A/L541A에 의하여 특성 분석되었다. 돌연변이체 ER3X는 돌연변이들 D538N/E542Q/D545N에 의하여 특성 분석되었다. 마지막으로, 돌연변이체 ER-535 STOP는 잔기 V535이후가 잘려진 것이다. 이와 같은 돌연변이들은, ER AF-2 전사 활성 및 다른 몇가지 알려진 보조활성화제들과의 그들의 상호 작용을 상당히 감소시키는 것으로 알려져 있다. 돌연변이체 ER3X는 부분적으로 AF-2 활성적이고 ERLL 및 ER535-STOP는 AF-2 비활성이다. 실험적인 설계는, 콘포메이션 민감한 펩티드들에 결합하는 것에 대하여, (A) ER3X (B) ERLL 또는 (C) ER535-STOP가 분석된 점을 제외하고 도7과 동일하다.
결과들. αβⅠ펩티드가 에스트라디올의 존재시, ERLL 및 ER535-STOP 돌연변이체 수용체들과 상호 작용할 수 없는 것은, 이러한 돌연변이들이 보조활성화제 결합을 없애는 것을 의미한다. αβⅠ펩티드는 에스트라디올 존재시, ER3X 돌연변이체 수용체와 관여하는 능력이 어느 정도 남아 있는데, 이것은 이러한 돌연변이들이 보조활성화제들의 수용체 친화도를 상당히 감소시키지만 이러한 상호 작용을 아주 없애지는 않는다는 것을 암시한다. 이러한 발견들은 이러한 수용체들의 전사적인 특성들과 일관된다. αⅡ펩티드 결합 특이성은, 시험된 임의의 수용체 돌연변이들에 의하여 크게 영향을 받지는 않는다. 흥미롭게도, αβⅢ 및 αβⅤ펩티드들의 상호 작용 특이성이, 계속적인 각 돌연변이로 수정되고, 이는 타목시펜 특이성을 잃게 되는 결과가 되어, 시험된 많은 리간드들의 존재시, 이러한 펩티드들이 수용 체와 연관될 수 있게 되는 결론을 낳는다. 이러한 결과들은, 타목시펜에 의하여 야기되는 콘포메이션을 인식하는 펩티드들의 결합에 헬릭스 12가 필요하지 않음에도 불구하고, 통상의 헬릭스 12 구조가 αβⅢ 및 αβⅤ 펩티드들의 상호 작용의 특이성에 필요하다는 것을 암시한다
실시예 4.4
도10은, Gal4-펩티드 융합 단백질들에 의한 ER 매개된 전사 활성의 방해를 연구한 것이다. HepG2 세포들이, ERα및 β갈락토시다아제에 대한 발현 벡터들과 함께, 에스트로겐 반응성 C3-Luc 리포터 유전자로 감염되었다. 세포들은, 도면에서 제시된 바와 같이, 에스트라디올 또는 타목시펜으로 유도되었고 루시퍼라아제 및 β갈락토시다아제 활성에 대하여 분석되었다(10A).
그런 다음, HepG2 세포들이 10B에서 제시된 바와 같이, Gal4-펩티드 융합들에 대한 발현 벡터들이 포함된 점을 제외하고, 상기한 바와 같이 감염되었다. 대조군은, Gal4-DBD 만이 존재하는 경우, 에스트라디올 (10nM) 활성화된 ER의 전사적 활성으로 하고, 이를 100% 활성도로 맞추었다. 각 Gal4-펩티드 융합에 대한 입력 플라스미드의 증가양 또한 대조군의 % 활성도로서 결과적인 전사 활성도가 표시되었다. 데이터는 세 차례의 독립적인 실험들(각각의 삼중으로 시행됨)로부터 평균된 것이고, 오차 막대기는 평균의 표준 오차를 나타낸다. C는 4-OH 타목시펜이 수용체를 활성화시키는데 사용된 점을 제외하고는 (B)에서와 동일하다.
결과들. 타목시펜은 HepG2 세포들내에서 부분적인 작용물질 활성을 보인다. 이러한 활성은 에스트로겐에 의하여 나타나는 것의 30%까지에 이른다. 이 분석 조 건하에서, αβⅠ및 αⅡ 펩티드들은, 에스트라디올이 전사를 활성하는 능력을 50% 까지 방해할 수 있다. αβⅠ 펩티드가 보조활성화제 결합에 대하여 경쟁 가능한 사실로 미루어 보아, αβⅠ 펩티드가 ER 활성을 방해하는 것은 놀라운 사실은 아니다. ER 전사 활성을 방해하는 αⅡ 펩티드의 능력은, 이 펩티드가 수용체내에서 보조활성화제 결합에도 중요한 어떤 포켓을 인식한다는 것을 암시한다. αβⅢ와 αβⅤ가 에스트라디올 매개된 전사를 방해할 수 없다는 것은, 에스트라디올이 결합되었을 때에 그들이 수용체에 결합할 수 없다는 것과 관계가 있다. 흥미롭게도, αⅡ, αβⅢ 및 αβⅤ는, 타목시펜의 부분적인 작용물질 활성을 효율적으로 방해할 수 있음에 반하여, αβⅠ은 그렇지 않다. 이러한 발견들은, 이러한 펩티드들의 결합 특성들과 일치하는 것이며, 이러한 펩티드들에 의하여 인식되는 포켓(들)이, 타목시펜이 부분적인 작용물질로서 행동할 수 있는데 매우 중요한 것이라는 것을 암시한다.
실시예 4.5
도11은 αⅡ 펩티드에 의한, 타목시펜 활성화된 ER 전사 활성의 방해가 프로모터 의존형이 아니라는 것을 보인다. 실험적인 설계는, αⅡ 펩티드가 타목시펜(10nM) 활성화된 전사를 방해할 수 있는 능력이, 1x-ERE-Luc, 3X-ERE-Luc, TK-ERE-Luc 및 C3-Luc를 포함하는 별도의 프로모터들에 대하여 시험된 점을 제외하고 도6과 동일하다.
결과들. 타목시펜 활성화된 전사를 방해하는 αⅡ 펩티드의 능력은 프로모터 차원에서 의존적인 것이 아니다. 이 펩티드는 시험된 모든 프로모터들로부터 타목 시펜의 부분적인 작용물질 활성을 방해한다.
실시예 4.6
도12는, Gal4-펩티드 융합 단백질들에 의하여 AP-1 경로를 통하여 ER 매개된 전사 활성의 방해를 보여준다. (A) HepG2 세포들이 AP-1 반응형 콜라게나아제 리포터 유전자 구성(pCOL-Luc) 및 ERα 및 β-갈락토시다아제의 발현 벡터들로 감염되었다. 그런 다음, 세포들은, 도면에서 제시된 바와 같이, 에스트라디올이나 타목시펜으로 유도되었고, 도7에 상세하게 제시되어 있는 바와 같이, 루시퍼라아제 및 β-갈락토시다아제 활성에 대하여 분석되었고 정규화되었다. (B) 또한 도면에 제시된 바와 같이, Gal4-펩티드 융합 구성들이 감염된 것을 제외하고 (A)와 동일하다. 대조군은, Gal4 DBD만 있는 경우, 에스트라디올 또는 타목시펜(100nM) 활성화된 ER의 전사 활성을 나타내고 이를 100%로 활성으로 정했다. 각 Gal4-펩티드 융합이 존재하는 경우, 에스트라디올 및 타목시펜의 전사 활성을 보이고, 결과적인 전사 활성을 대조군의 % 활성화도로서 표시하였다. 제시된 데이터는 단일의 대표 실험으로부터 얻어진 것이다.
결과들. 에스트라디올 및 타목시펜이 모두, AP-1 반응형 콜라게나아제 리포터 유전자로부터 전사를 활성화시킬 수 있다. 이러한 활성은 에스트로겐 반응형 원소(ERE)가 없을 때에 더욱 증대되고, ER과 AP-1 단백질들 Fos 및 Jun간의 상호 작용에 연관된 어떤 기작을 통하여 일어나는 것으로 믿어진다. C3-Luc 리포터 유전자와 마찬가지로, 각 펩티드는, 리간드 의존형 방식으로 수용체와 상호 작용하는 그들의 능력에 따라서 ER 매개 전사 활성을 방해할 수 있다. 에스트라디올 결합 수용 체와 상호 작용하는 그러한 펩티드들은 에스트라디올 매개된 전사를 방해하고, 타목시펜 결합 수용체와 상호 작용하는 것들은 타목시펜 매개된 전사를 방해한다.
실시예 4.7
도13은 펩티드들이 타목시펜의 부분적 작용물질 활성을 방해하는 데에 관한 가능한 기작의 모델에 관한 것이다. (A) 타목시펜이 부분적인 작용물질 활성을 나타내는 활성 경로의 모델. 타목시펜(T)이 결합하면, 수용체는 콘포메이션 변화를 겪고, 이는 아직은 밝혀지지 않은 체세포 보조활성화제 단백질과 상호 작용하는 것을 가능하게 한다. 이 단백질은, 전사 활성화로 귀결되는 일반적인 전사 기구에 신호를 전송한다. (B) 이 방해 모델에서는, 타목시펜이 결합할 때에, 수용체는 콘포메이션 변화를 겪지만 보조활성화제 단백질은, 펩티드에 의한 동일한 부위에 경쟁으로 인하여 수용체에 연관되지 못한다. (C) 이 방해 모델에서는, 타목시펜의 존재하에서 수용체는 콘포메이션 변화를 겪고 이것은 수용체상의 뚜렷한 포켓들을 허용하게 된다. 보조 활성화제 결합 부위로부터 말단인 포켓이 펩티드와 결합한다. 이러한 상호 작용의 결과로, 보조활성화제와 수용체간의 상호 작용을 방해하는 부가적인 콘포메이션 변화가 발생한다.
실시예 5
도19는 도7에서 보여진 데이터의 유사도 분석을 보여준다. 각 리간드는 5개의 구성원 풋프린트를 가지고, 펩티드들, αβ1, α2, αβ3 또는 αβ5 중 어느 하나의 펩티드의 존재시, 아포-수용체(대조군) 또는 수용체를 나타내는 포유동물 투-하이브리드 시스템내에서 그것이 야기시킨, 정규화된 전사 반응에 대한 각 구성원 풋프린트이다.
실시예 101
에스트로겐 수용체(ER)에 의한 전사 활성화에 있어서 말초 단계들의 하나는, 많은 보조활성화제 단백질들중 하나의 리간드-결합 수용체에 의한 보강이다. 이러한 활성은, ER로 하여금 일반적인 전사 기구와 상호 작용하도록 하고 표적 유전자 프로모터들에 그의 조절 작용들을 발휘하게 한다. 작용물질 결합의 한 효과는, ER내에 콘포메이션 변화를 야기하고, ER 헬릭스 3 및 12와 상호 작용하게 하여 보조활성화제 단백질이 도킹할 포켓을 형성하게 한다. 이러한 관찰들은, 보조활성화제 결합 포켓을 형성하고 보조활성화제에 대한 ER의 친화도를 감소시킴에 의하여, 수용체 길항물질이 ER 전사 작용을 방해한다는 것을 암시한다. ER-특이성 보조 활성화제 단백질은, 동정되지 않은 상태로 남아있음에도 불구하고, ER 및 스테로이드 수용체 슈퍼패밀리의 다른 구성원들의 전사 활성을 증강시키는, 몇 가지의 보조 활성화제들이 동정되었다. 더욱이, 이러한 보조 활성화제들이, 수용체와 상호 작용하기 위하여, 매우 잘 보존된 LXXLL 모티프를 사용한다는 사실은, 수용체-보조인자 상호 작용들이 단순히 경쟁에 의하여 결정되는지 아니면 시스템내로 특이적으로 짜맞추어진 어떤 특이성이 있는 것인지에 관하여 명확하지 않게 한다.
이러한 가능성들을 조사하기 위하여, 우리는 LXXLL-ER 상호 작용을 분석하고 이러한 상호 작용들에 영향을 주는 측면 서열들의 역할들을 상세하게 분석하기 위하여 분자 관점의 시도를 하였다. 우리는 코아 LXXLL 모티프의 10*107 변이들을 스크린하기 위하여 파아지 디스플레이 기술을 이용하였다. 에스트라디올-활성화된 ER 을 표적으로서, 우리는 높은 친화도의 ER-상호 작용 펩티드들을 코딩하는 많은 수의 파아지를 동정하였다. 이러한 파이지로부터 얻어지는 서열 정보를 이용하여, 우리는 일련의 Gal4-펩티드 융합들을 형성하고, 포유동물 세포들내에서 투-하이브리드 분석을 이용하여 ERα, ERβ, GR 및 PR과 상호 작용하는 그들의 능력을 분석하였다. 이러한 분석 결과들은, LXXLL 모티프가 핵 수용체 결합을 위하여 허용된 것이라는 사실과 이 모티프 측면에 접하는 서열들이 매우 중요한 특이성 결정자들인 것임을 또한 밝혔다. 따라서, 예측한 바와 같이, 모든 LXXLL 모티프들이 동일한 것은 아니다. 이것은 세포 내에서, 단지 덩어리 작용이 아닌 특이성만이, 필요한 보조인자를 찾는 핵 수용체의 능력에 영향을 미치는 것을 암시한다. 이와 같이 관측된 특이성에 바탕이 되는 기작을 이해하기 위한 노력으로, 우리는 이러한 펩티드 융합들이 일련의 ER 헬릭스-12 돌연변이체들과 상호 작용하는 능력을 분석하였다. 이 접근 방식을 이용하여, 이 헬릭스내에 보존된 소수성 자기들의 돌연변이가 ER-AF-2 기능을 없앴고, 모든 LXXLL 펩티드들과 ER과의 상호 작용을 방해하는 것임을 알았다. 보존된 전하를 띤 세 개의 잔기들(D538N/E542Q/D545N)을 돌연변이시켜서 헬릭스를 방해하면 대부분의 펩티드들이 결합하지 못하고 AF-2 기능 역시 없어졌다. 그러나, 이 조작에 의하여 많은 수의 LXXLL-함유 펩티드들이 영향을 받지 않았다. 나중의 돌연변이가 또한 ER과 GRIP-1 및 SRC-1의 상호 작용을 방해하므로 이것은 중요한 관찰이다. 누적적으로, 우리 데이터는, 스테로이드 수용체들이 다른 클래스의 LXXLL 모티프들에 대한 별개의 선호도들을 나타내는 것을 가르키는데, 이는 분자적 기초의 보조인자-수용체 특이성을 의미한다. 그러나, 중요하게는, 그들은 또한 AF-2 기능과 보조 활성화제 결합이 유사한 것이 아님을 나타내고, SRC-1 및 GRIP-1과는 별개인 부가적인 보조인자들이 있을 수 있다는 결과를 나타낸다.
플라스미드들: 모든 Gal4DBD-펩티드 융합들은 아래와 같이 형성되었다: Xhol 및 Xbal 제한효소들을 사용하여 펩티드들의 DNA 서열 코드가 mBAX 벡터로부터 잘리워졌고, 클로닝을 위한 infram Sall 및 Nhel 부위들을 생성하기 위하여 연결 서열로, pM 벡터(Clontech)로부터 유도된 pMsx 벡터로 서브클론되었다. VP16ER-a 구성은 EcoRI 측면에 접한 5' 말단 및 3' 말단들을 함유하는 프라이머들을 가지고, 사람의 ER-α cDNA 전체 길이의 폴리머라아제 연속 반응(PCR)에 의하여 생성되었다. 그런 다음, PCR 생성물은 pVP16 벡터(Clontech)안으로 서브클론되어, ERα cDNA의 N-말단에 위치된 VP16을 가지는 VP16-ERα융합을 생성하였다. pVP16ER-β, pVP16-RARα및 pVP16-RXRα 는 유사한 방식으로 생성되었다. pVP16VDR은 J. W. Pike(University of Cincinnati, Cincinnati, OH)로부터의 기증받은 것이고; VP16TRβ 발현 플라스미드 pCMX-VP-F-hTRβ는 D. D. More(Baylor College of Medicine, Houston, TX)에 의하여 제공되었고; VP16Gr, VP16PR-a, VP16PR-b 및 VP16AR들은 J. Miner(GR), D.X. Wen(PR-a, PR-b), K. Marschke(AR) (Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA)로부터 기증된 것이다. VP16-ER 돌연변이체 구조물들은, ER 발현 플라스미드들(ER-TAF1, ER-LL, ER-535 STOP 플라스미드들, Tzukerman et al. Mol. Endocrinol. 1994(8): 21-30 및 Norris et al., J. Biol. Chem. (273): 6679-6688, 1998)로부터 돌연변이 ER cDNA들을 절단하여 얻어졌고, pVP16 벡터내로 서브클론되었다. 3xERELuc 수용체 구조물 뿐만 아니라, ERα, ER β 및 ER179C에 대한 포유 동물 발현 플라스미드들이 다른 곳에 설명되어 있다(Tzukerman et al. Mol. Endocrinol. 1994 (8): 21-30). 5xGal4Luc3 구조물이 5xGal4-TATALuc 플라스미드(X.F.Wang, Duke University, Durham, NC로부터 기증됨)로부터 변형된 것인데, 루시퍼라아제 유전자가 pGL3 기본 벡터(Promega)로부터의 루시퍼라아제 cDNA의 변형 버전에 의하여 대체된 것이다. GRIP-1 및 SRC-1 구조물들은, GRIP-1 아미노산 629-760 및 SRC-1 아미노산 621-765에 해당되는 PCR 생성물들을 pM 벡터내로 서브클론함에 의하여 생성되었다(P.H. Giangrande, 미출판). 모든 PCR 생성물들은 결과적인 구조물들의 확인을 위하여 서열 분석되었다.
실시예 101.1
집중된 임의의 펩티드 라이브러리(X7-LXXLL-X7 X=임의의 아미노산, L=Leu)이 만들어지고, M13 파이지상에서 디스플레이 되었다.
전체 길이의 ER-α을 발현하는 배큐로바이러스가 10-6M의 17β에스트라디올로 처리되고, 선택 표적으로서 96-웰 Immulon-4 플레이트들상에 고정되었다. M13 파아지-기초 임의의 펩티드 라이브러리들이 웰들내의 표적 단백질들과 함께 배양되었고, ER 결합 파아지는 남아있고, 결합되지 않은 파아지는 세척되어 제거되었다. 결합된 파아지는 낮은 pH 버퍼에 의하여 용출되었고, DH5αF' 세포들내에서 증폭되었으며, 계속되는 선택에 취하여졌다. 이 선택 과정들은 ER 결합 파아지가 풍부질 때까지 2 내지 3회 반복되었다. 각 파아지는 플라크 정제되었고, 증폭되고 ELISA에 의하여 그들의 결합 특성이 분석되었다. 에스트라디올이 존재하는 경우에만 ER에 결합하는 파아지가 선택되었고, DNA 서열 분석에 의하여 펩티드 서열들을 밝혔다(표 101).
에스트라디올 활성화된 ERα가 표적으로 사용된 때, LXXLL 모티프-함유 펩티드들이 친화도 선택에서 주요한 결합 종들이다. ER4(표 101)은 작용물질 점유된 ER에 결합하고, 부분적인 작용물질- 또는 길항물질-점유된 ER에는 결합하지 않는다.
실시예 101.2
포유 동물 세포들에서 ER-α와 상호 작용하는 ER4 펩티드의 능력이, 포유 동물 투-하이브리드 시스템에서 분석되었다. ER4 펩티드 서열이, Gal4 DNA 결합 도메인(GAL4DBD)에 융합되었고, 반면에 전체 길이의 ER은 VP16 트랜스액티베이션화 도메인에 융합되었다. ER4 펩티드와 ERα간의 상호 작용은, 5xGal4Luc3 리포터 유전자의 발현에 의하여 측정되었다. HepG2 세포들은 일시적으로 ERα 발현 벡터 및 리포터 3xERELuc(도 14A), 또는 Gal4DBD-ER4, VP16-ERα 및 5xGal4Luc3(도14B)으로 감염되었고, 다른 ER 리간드들로 처리되었다. 루시퍼라아제 활성은, 같이 감염된 pCMVβgal의 활성으로 정규화되었다. 다른 ER-작용물질들의 존재시, ER-α와 상호 작용하는 ER-4의 능력은, 3xERELuc 리포터로 분석된 바와 같이, ER 트랜스액티베이션 기능과 대등하였다. 그러나, 부분적인 작용물질들 또는 길항물질들은 이러한 상호 작용을 방해하였다(도 14C) 및 (도 14D). 그러므로, LXXLL 함유 펩티드들은 AF2 활성화를 위한 민감한 프로브를 제공한다.
실시예 101.3
다른 LXXLL 모티프 펩티드들이, ER의 동일 영역내에서 상호 작용하는지를 시 험하기 위하여, 포유동물 투 하이브리드 분석법이 사용되었다. 선택된 펩티드 서열들과 다른 ER 돌연변이체(ER-LL, ER-3X, ER-535 STOP)들이 Gal4DBD 및 VP16 (TAD)에 융합 단백질들로서 각각 발현되었다. 다른 펩티드들(ER4, F6, D47, C33, D22, D48)의 와일드 타입 ER 및 세가지 ER 돌연변이체들에 대한 결합 친화도가 5xGal4Luc3 리포터 구조물의 발현에 의하여 측정되었다. GRIP-1* 및 SRC-1* 구조물들은, Gal4DBD에 융합되는, 중앙에 세 번의 LXXLL 모티프를 함유한다(GRIP-1에서 아미노산 629-761, SRC-1에서 아미노선 622-765). 그 결과들이 도15에 나타나있다.
실시예 101.4
HeLa 세포들이, 상이한 펩티드-Gal4DBD 융합 구조물들과 함께, ERα발현 플라스미드(RST7ERα), 3xERELuc 리포터, pCMVβgal로 감염되었다. pM은 펩티드 융합이 없는 Gal4DBD 대조군이다. 루시퍼라아제 활성도가 측정되었고 정규화되었다(도 16). ERα전사 활성을 방해하는 다른 펩티드들의 능력은, 포유동물 투-하이브리드 분석법에서 측정된 바와 같이, ERα에 대한 이러한 펩티드들의 친화도와 상관 관계가 있다(도15(A)). GRIP-1 구조물이, 포유 동물 투-하이브리드 분석법에서 상대적으로 약한 결합 친화도를 보임에도 불구하고, ER 전사 활성을 방해하는 우수한 후보자인 것으로 증명되는 것이 예측된다. 두 LXXLL 모티프들이 ER 전사적 활성을 방해하는데 상승적으로 상호 작용을 한다 2XF6: F6 펩티드 두 개가, GRIP-1 NR box Ⅱ 및 NR box Ⅲ 사이에 있는 것과 동일한 서열을 가지는 54-아미노산 간격 연결자를 가지고 나란히 구성되었다. F6G: 단지 한 개의 F6 펩티드와 링커와의 Gal4DBD-F6 융합. 3xERELuc, RST7ERα, pCMVβgal을 가지고 HeLa 세포들내에서 일시적인 전 사가 수행되었고, Gal4DBD-펩티드 융합 구조물이 X-축에 표시되어 있다.
실시예 101.5
LXXLL 함유 펩티드들이, HepG2 세포들내에서 AF2 기능을 방해하였으나, AF-1 기능이 지배적인 HepG2 세포들내에서 wtER 트랜스액티베이션 기능을 완전히 없애지는 않았다(도 17). 그러나, 동일한 맥락에서, AF-1 도메인이 결여된 ER의 잘리워진 형식(ER179C)의 전사 활성은 LXXLL 함유 펩티드들에 의하여 감소되었다. HepG2가, 감염 효율을 정규화하기 위하여, 3xERELus 리포터, Gal4DBD-펩티드 융합 구조물들 및 pCMVβgal과 함께, wtER 또는 ER179C 발현 플라스미드들로 감염되었다. 감염 후에, 세포들은 분석전에, 17β-에스트라디올의 다른 농도로 16시간 동안 처리되었다.
실시예 101.6
상이한 LXXLL 모티프들과 상이한 핵 수용체들간의 상호 작용들이, 포유 동물 투-하이브리드 시스템내에서 분석되었다(도 18). 전체 길이의 수용체들 및 선택된 펩티드들이 VP16 및 Gal4DBD 융합들로서, 각각 발현되었다. 상호 작용들의 세기는, 5xGal4Luc3 리포터 유전자의 활성에 의하여 측정되었다. NH: 호르몬 없음; H: 호르몬 처리. 이 실험에서 사용되는 호르몬들은 다음과 같다: ER-α 및 ER-β에 대하여 10-7 M 17β에스트라디올, PR-a 및 PR-b에 대하여 10-7M 프로게스테론, GR에 대하여 10-7M 덱사메타손, RAR 및 RXR에 대하여 10-7M 9-cis 레티놀 산, TR에 대하여 10-7M T3, VDR에 대하여 10-7 M 1,25-디하이드록시 Vit.D3 및 AR에 대하여 10-6M 5α-디하 이드로테스토스테론.
실시예 101.7
펩티드 #293 (ER 베타 15e2, 서열 SSIKDFPNLISLLSR)이 에스트라디올 활성화된 ERβ의 파아지 디스플레이로부터 친화도 선택되었다. 그것은 LXXLL 모티프를 함유한다. 그것은, 도7에서 보이는 바와 같이, ERβ, TRβ 및 RARα와의 선택적으로 상호 작용하지만, 시험된 다른 수용체들과는 상호 작용하지 않았다. 이 펩티드의 발현은, ERα의 전사 활성을 방해하지는 않지만, ERβ에 의한 전사 활성은 심하게 방해하였다. HeLa 세포들이, 상기한 바와 같이, 3xERELus 리포터, pCMVβgal과 펩티드-DBD 융합 구조물들과 함께, ERα또는 ERβ 발현 플라스미드들로 감염되었다. 감염 후에, 세포들은 분석전에, 17β-에스트라디올의 다른 농도로 16시간 동안 처리되었다.
결론들:
·LXXLL 모티프들을 가지는 펩티드들은 연관성이 있지만 다른 활성을 가진다. 측면에 접하는 서열들은 다음을 결정한다:
1. 핵 수용체들에 대한 친화도.
2. 상호 작용을 위하여, ER-α내에서 기능적 AF2를 필요로 함.
3. 상이한 핵 수용체들간의 상호 작용의 그들의 특이성.
·LXXLL 모티프들이, 활성을 위하여 AF1 및 AF2의 양 기능들을 필요로 하는, HeLa 세포들에서 에스트라디올 유도된 ER-α전사 기능을 파괴시킬 수 있다. 그러나, AF1 기능이 주도적인 세포(HepG2 세포들과 같은) 맥락에서, LXXLL 모티프들은 에스트라디올 활성화된 전사 활성을 완전히 없애지 못한다. 이로부터 다음의 두 가지 가능한 설명이 가능하다:
1. HepG2 세포들내에서, AF1 활성은, 주로 AF1 영역에 접촉하는 다른 보조활성인자에 기인하는 것이다. 그러므로, ER-α와 LXXLL-함유 보조인자들간의 상호 작용의 방해가 AF1 기능을 방해하지 않는다.
2. HepG2 특이성 보조인자가, AF1 및 AF2 양 도메인들에 접촉한다. AF2 결합 부위의 방해는 보조인자-ER 상호 작용을 파괴하기에는 충분하지 않다.
·에스트로겐 수용체 특이적 LXXLL-함유 모티프들을 가지는 펩티드들은, 파아지 디스플레이 스크리닝에 의하여 얻어질 수 있고, 인간내에서 활성이 있고 약리학적으로 받아들여진다면, 수용체-특이적인 길항물질로서 사용될 수 있다.
실시예 201 기술을 G-단백질-결합된 수용체들 및 G α서브유닛들에 응용함
상기에서 설명된 생체외 동정 시스템은 또한, 교활한(serpentine) 수용체들 (G 단백질 결합된 수용체들 및 7개 트랜스멤브레인 스패닝 수용체들로도 알려짐) 및 그들의 동종 G 단백질들과 같은 생물학적인 신호 조절 단백질들의 다른 클래스로 확정될 수 있다. 이러한 것들을 GPCR들이라고 부르기로 한다. GPCR들은, 위장, 심혈관계, 신경계 질병들과 같은 많은 치료학적 분야에서 약제 발견의 표적으로서 개발되어왔다. GPCR들을 활성화하고 방해하는 약제를 신속하고 저렴하게 동정하는 것은 제약 산업에 매우 유용할 것이다.
모든 GPCR들은 적어도 두 개의 기능적인 도메인들을 가지고 있다. 하나는 외 부로 접하는 리간드 결합 도메인이고, 다른 하나는 세포내로 접하는 G 단백질 결합 도메인이다.
G 단백질이 활동하지 않는 상태에서, GPCR들에 의하여 활성화되는 G 단백질들은, Gα서브유닛들에 결합된 구아닌 디포스페이트(GDP)을 함유하는 G 단백질 (αβγ) 헤테로트라이머들로서 존재한다. GPCR들은, 구아닌 뉴클레오티드 변환 인자들(GEF)로서 작용함에 의하여, 그들의 동족 G 단백질들을 활성화시킨다. GPCR 활성화가 수행되면, 자유로운 GTP가 G 단백질의 α 서브유닛에 결합된 GDP를 대신한다. 그런 다음, GTP-결합된 Gα서브유닛과 Gβγ가 분리되고, 2차 메신저 효소들 및 이온 채널들의 기능을 조절한다. GPCR들은 구아닌 뉴클레오티드 변환 인자들(GEF)로서 작용함에 의하여, 그들의 동족 G 단백질들을 활성화한다. GPCR들이 G 단백질들을 활성하기 이전에, 그들은 적절한 리간드의 활성에 의하여, 비활성으로부터 활성 상태로 변환되어야 한다. GPCR들은 활성되기까지는, 그들의 동족 G 단백질들에 대한 친화도가 거의 없거나 감지되지 않는다. GPCR 리간드들의 활성을 모방하는 화학물질은 작용물질들로서 알려져 있고, GPCR상에서 변화를 유도하여 GPCR이 그의 동종 G 단백질에 대한 선택적인 친화도를 획득하게 한다. GPCR 리간드들의 활성을 방해하는 화학물질들은 길항물질들로 알려져 있고, GPCR이 동족의 G 단백질에 결합하는데 필요한 구조적 변화들을 야기하는 것을 방해한다.
GPCR들을 탐침하는 바이오키(BioKey)들(펩티드들 및 유사한 분자들)이, GPCR들 그 자체들로부터 또는 그들의 동족 Gα서브유닛들로부터 유도될 수 있다. Gα 서브유닛들은 GPCR 활성화를 나타내는데, 그 이유는, GPCR들이 활성일 때에 GTP가 Gα서브유닛에 결합하고, GPCR들이 비활성일 때에, GDT가 결합되기 때문이다. GPCR들에 대하여, 이러한 바이오키들은, G 단백질-결합 부위를 통하여, 리간드 결합 부위들 및 활성화된 수용체인, 두 기본적인 기능적인 도메인들을 특이적으로 인식할 것이다. Gα서브유닛의 경우, 바이오키들은 GDP 또는 GTP 결합 형식들을 특이적으로 인식할 것이다. 따라서, Gα서브유닛 및 GPCR들에 대하여 각각 둘 씩, 4 클래스들의 바이오키들이 동정될 수 있다. 그와 같은 바이오키들은, 생체외 스크리닝 방법들을 사용하는 신규한 치료제들(약제들)의 동정에 매우 중요한 가지를 가질 수 있다.
현재, GPCR들에 작용하는 약제들은, 일반적으로 두 가지 방법 중 하나로 동정된다. 그 중 하나는(세포 기초 분석), 수행하기에 매우 번거롭고 비용이 많이 드는 전체 세포 분석법을 이용하는 것이다. 나머지 하나는(리간드 대체 분석), GPCR에 대한 리간드 결합을 경쟁하는 테스트 물질의 능력을 결정하기 위하여 표지된 리간드들을 사용하는 것이다. 후자가 비용이 덜 들고 수행하기가 용이하지만, 작용물질과 길항물질을 구분할 수 없으며, 따라서 그러한 분석의 유용성이 한계가 있다.
GPCR들의 기본적인 기능적 도메인의 각각에 특이적인 바이오키들의 사용을 통하여, 우리는, GPCR들에 대한 작용물질 및 길항물질에 대한, 간단하고, 비용이 저렴한 생체외 스크린들을 수행할 수 있으며, 그러한 화합물들로부터 활성의 전체 범위 즉, 순수한 작용물질들, 부분적인 작용물질들, 완전한 길항물질들로 구분할 수 있다.
실시예 A: 베타-투 아드레날린성 수용체(β-two adrenergic receptor)(AR)에 대한 작용물질들 및 길항물질들에 대한 스크린. AR은 에피네프린 및 이소프로테레놀과 같은 리간드들에 의하여 활성화된다. 이러한 리간드들은 작용물질들이고, 천식 및 심각한 알레르기 반응들과 같은 질병의 치료에 유용하다. AR에 대한 길항물질들은 심장 기능의 조절 및 고혈압 및 심장 부정맥의 치료에 유용하다.
AR에 대한 클래스 Ⅰ 바이오키(BioKey)들이 바이오키 라이브러리들로부터 고 친화도(50 마이크로몰보다 좋은) 펩티드의 친화도 선택에 의하여 동정되었다. AR은, 곤충 세포들내의 배큘로바이러스 발현 시스템과 같은 시스템을 이용하여 통상 알려진 바와 같이 재조합 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 세포막 또는 정제된 AR를 함유하는 AR은, 리간드 결합 부위에 대한 바이오키들의 친화도 선택에 사용될 수 있다. 그 사이트에 대한 선택도는, 바이오키를 작용물질 이소프로테레놀로 대체함에 의하여 확인될 수 있다.
유사한 방식으로, 클래스 Ⅱ 바이오키가 활성화된 AR의 G 단백질 결합 도메인에 대하여 동정될 수 있다. 첫째로, AR은, AR을 "활성" 콘포메이션으로 만들기 위하여, 과량의 작용물질, 예를 들어서 이소프로테레놀로 먼저 처리된다. 여기에서 설명된 바와 같이 바이오키들이 선택되고, 처리된 작용물질에 결합하지만 처리되지 않은 AR이나, 길항물질 처리된 AR에 결합하는 그들의 능력에 의하여 선택성 및 친화도가 확인된다.
클래스 Ⅲ 바이오키들이 Gsα서브유닛들의 GDP-결합 형식으로 동정될 수 있다. 정제된 Gsα서브유닛들이 생성되고, 박테리아 세포들내에서의 재조합 기술들 및 발현에 의하여 정제된다. 정제된 Gsα서브유닛들은 "비활성" 콘포메이션 또는 Gsα의 GDP-결합 형식(GDP-Gsα)을 야기하기 위하여 과량의 GDP로 먼저 처리된다. 여기서 설명된 바와 같이, 바이오키들이 선택되고, GDP 처리된 것에 결합하지만 GDT 처리된 Gsα 서브유닛들에는 결합하지 않는 그들의 능력에 의하여 선택성 및 친화도가 확인된다.
유사한 방식으로, GSα서브유닛들의 GTP-결합 형식에 대하여 클래스 Ⅳ 바이오키들이 동정될 수 있다. "활성화된" 콘포메이션 또는 GSα의 GTP-결합 형식(GTP-GSα) 을 유도하기 위하여, 정제된 Gsα서브유닛들이 과량의 GTP로 미리 처리되었다. 여기에서 설명된 바와 같이, 바이키들이 선택되고 GTP 처리된 것에는 결합하지만 GTP 처리된 Gsα서브유닛들에는 결합하지 않는 그들의 능력에 의하여 선택성 및 친화도가 확인된다.
4개의 모든 클래스에 대한 대표적인 바이오키들이, 유럽퓸 표지된 스트렙타비딘과 같은, 설명된 바와 같은 방식으로 적당한 성분이 표지될 수 있고, 형광 측정 도구를 사용하여 약제 스크린에서 사용될 수 있다. 바이오키들을 대리 리간드들로서 사용하는 많은 방식들이, 약제 스크리닝의 기술에서 통상의 지식을 가지는 사람에게는 명백할 것이다.
표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 화학 화합물 콜렉션으로부터 세 클래스들의 화합물들을 구분하는 것은 매우 용이하다. 비활성 화합물들은, AR 상의 상대적인 기능 도메인들에 결합하지 않으며, 따라서, 바이오키들로부터의 신호들 상에 변화가 보이지 않는다. GPCR들에 대하여, 작용물질들은, G 단백질 결합 도메인이, AR 동족 G 단백질의 대용물, 클래스 Ⅱ 바이오키들과 결합할 수 있도록, AR를 콘포메 이션 상태로 유도하는 능력으로 인하여 용이하게 동정된다. 리간드 결합 부위에 결합하는 작용물질은 제1클래스 바이오키 결합을 현저하게 떨어뜨린다. 길항물질들은, 리간드 결합 도메인에 결합하여 천연 리간드가 결합하는 것을 방해하는 그들의 능력에 의하여 동정된다. 그러나, 작용물질과는 달리, 그들은 수용체의 활성화를 야기시키는 능력은 없으며, 따라서 AR의 G 단백질 결합 도메인의 콘포메이션 상에 변화가 없고 따라서 클래스 Ⅱ 바이오키들이 결합하는 능력에 변화가 없다.
대안적으로, 화합물이 작용물질인지 길항물질인지를 스크리닝하는 것은, AR-함유 막들, Gs 및 GTP-Gsα또는 GDP-Gsα에 특이적인 바이오키들을 사용하여 수행될 수 있다. 작용물질들은 수용체를 활성화시키고 결과적으로 GTP-Gsα를 형성한다. 만약 작용물질이 수용체에 결합된다면, GDT-Gsα에 특이적인 바이오키들로부터의 신호는 감소한다. 유사하게, GTP-Gsα특이적인 바이오키로부터의 신호는, 작용물질이 AR에 결합할 경우 증가한다. 길항물질들은 수용체를 활성화시키지 못하고, 따라서 G 단백질들을 활성화하지 못한다. 따라서, G 단백질은, Gsα서브 유닛에 GDP를 함유하는 헤테로트라이머로 남게된다. 작용 물질로 미리 처리된 AR-함유 막을 사용하여 길항 물질을 스크린하라. 만약 길항 물질이 수용체에 결합되면 GTP-Gsα에 특이적인 바이오키들로부터의 신호는 감소한다. 마찬가지로, 길항물질이 AR에 결합되면 GDP-Gsα에 특이적인 바이로키들로부터의 신호는 증가한다.
이 시스템은 자연적인 리간드 또는 작용물질들이 얻어지는 다른 GPCR들에 용이하게 확장할 수 있다.
실시예 401 글루코코르티코이드 수용체의 조절인자들의 핑거프린팅
수용체
펩티드 서열
F6: GHEPLTLLERLLMDDKQAV
α/βⅢ: SSWDMHQFFWEGVSR
α/βⅤ: SSPGSREWFKDMLSR
αⅡ: SSLTSRDFGSWYASR
이러한 펩티드들은, 에스트로겐 수용체에 결합하는 것으로 원래 동정되었으나, 글루코코르티코이드 수용체의 조절인자들의 핑거프린팅에 사용될 수 있다. 핵 수용체들이 구조적 유사성이 있으므로, ER 결합 펩티드들은 글루코코르티코이드 수용체로서 역할을 할 수 있다. 서열의 유사도가 있음에도 불구하고, 이러한 유사도들의 정확한 특성은 알려지지 않았다. 동일한 보조 활성화제 단백질들이 수용체 및 함유된 LXXLL 모티프에 모두 결합한다. 따라서, 우리의 LXXLL 펩티드들이 작용물질의 존재시, 양 수용체들에 모두 결합하는 것이 놀라운 사실은 아니다. McInerney, et al., Genes & Developement, 12: 3357-68 (1998); Nolte, et al., Nature, 395: 134-143 (September 10, 1998).
데옥시코르티코스테론 및 덱사메타손을 가지고 F6에 대한 GR의 적정
이스트 균주 EGY48(MATα trp1 his3 ura 3 leu2::6LexAop-Leu2)가 플라스미드들 pJK103(2μM, 2LexAop-LacZ), pJG4-5-F6(2μM, LexADBD-F6 펩티드), 및 pEG202-GR (2μM, B42AD-글루코코르티코이드 수용체 α)로 형질 전환되었다. 결과적으로 전환된 균주는, 갈락토스를 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지내에서 밤새 성장되어 GR의 발현을 야기하였다. 데옥시코르티코스테론 및 덱사메타손은, 96-웰 마이크로플레이트내에서 100μL로 연속적으로 희석되었다. 밤새워진 이스트 배양액의 100μL의 분량이 마이크로플레이트들내로 첨가되었고 30℃에서 3시간 동안 배양되었다. F6 펩티드와 GR의 상호 작용을 모니터링하기 위하여, β-갈락토시다아제 활성에 대한 키네틱 분석이 수행되었다. 각각의 세포 비중은 OD650을 읽어서 결정되었다. 이스트는 3000 rpm에서 5분 동안 원심 분리되어 펠렛화되었고 배지는 제거되었다. 2.5% CHAPS 세제를 함유하는 1xZ 버퍼(60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO
4 , 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 7 mM 2-머캅토에탄올)가 첨가되었고 흔들어서 혼합되었다. 상온에서 5분동안 배양한 후에, 40μg 오르토-나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드 (ONPG)를 함유한 100μL의 1xZ 버퍼를 각 웰에 첨가하였다. 10분 동안(20초 간격으로) OD650 대 OD405의 변화를 측정으로써 색상 전개가 모니터되었다. β-갈락토시다아제 활성은 Δ(OD405-OD650)/초기 OD650으로 표현된다.
GR과 펩티드들의 상호 작용
이스트 균주 EGY48(MATα trp1 his3 ura 3 leu2::6LexAop-Leu2)가 플라스미드들 pJK103(2μM, 2LexAop-LacZ), pEG202-GR (2μM, LexADBD-F6, -α/βⅢ, -α/βⅤ, 또는 -αⅡ 펩티드들)로 형질 전환되었다. 결과적으로 전환된 균주는 갈락토스를 유일한 탄소원으로서 함유하는 배지내에서 밤새 성장되어 GR의 발현이 유도되었다. 배양액은 10mL 배지에서 OD600이 0.1이 되도록 희석되고, 데옥시코르티코스테 론, 덱사메타손, 코르티코스테론 또는 β-에스트라디올이 첨가되어 최종 농도가 1μM이 되도록 한다. 배양액은 30℃에서 3시간 동안 배양되었다. 단백질은 이스트를 유리 구슬들과 함께 흔들어 이스트를 용해시켜 준비된다. 세포 잔해는 제거되고 4℃에서 30분간 50% 암모늄설페이트로 침전시켜서 농축화된다. 단백질 덩어리는 저장 버퍼(100 mM HEPES 50 mM EDTA 40% 글리세롤 7mM 2-머캅토에탄올, pH8)내에서 서스펜션되고, 단백질 농도가 결정된다. 펩티드와 GR간의 상호 작용을 결정하기 위하여, β-갈락토시다아제 활성에 대한 종말점 분석이 수행되었다. 10μg의 단백질 추출물이 최종 부피 100 μL 1xZ 버퍼로 희석되고 80μg의 ONPG를 첨가하여 색상 전개가 시작되었다. 30μL의 1M Na2CO3을 첨가하여 반응이 중지되고 전개 시간이 기록된다. β-갈락토시다아제 활성은 1000*OD405/분/mg 단백질로서 표현된다.
여기에서 언급된 모든 참조 문헌들은 참고를 위하여 포함되는 것이다.
표 A: 핑거프린팅 분석을 위한 단백질들의 리스트
수용체 활성조절인자
핵수용체
에스트로겐 수용체 α,β 에스트라디올 (작용물질)
타목시펜 (길항물질), ICI182,780
(길항물질), 라록시펜 (길항물질)
프로게스테론 프로게스틴, 에스트로겐 (작용물
질), RU486 (길항물질), ZX98299,
(길항물질), 오나프리스톤 (길항`
물질)
안드로겐 디하이드록시테스트스테론 (작용
물질), 하이드록시플루타미드 (길
항물질)
글로코코르티코이드 코르티존 (작용물질), 덱사메타존
(작용물질)
미네랄로코르티코이드 알도스테론 (작용물질)
스파이로노락톤 (길항물질)
레티놀산 9-시스-레티놀산 (작용물질)
부신 부신호르몬 (작용물질)
비타민 D3 비타민 D3 (작용물질)
PPAR(s) 에코시노이드 (작용물질), 산화
LDL (작용물질)
LXR 산화 콜레스테롤 대사물질 (작용
물질)
FXR 파네소이드 대사물질 (작용물질)
BXR 3-아미노메틸 벤조산염 (작용물질)
SXR 스테로이드 (작용물질), 피토에스
트로겐 (작용물질), 비생체물질
(작용물질)
오펀 핵 수용체
Nurr1
Nor1
NGF1-B
ERR1
SHP
HNF-4
Coup-TF II
티로신 키나아제 수용체
표피 EGF (작용물질), ATP
성장인자
인슐린 인슐린 (작용물질), ATP
혈소판 PDGF (작용물질), ATP
유도성장인자
G-단백질 결합 수용체
β- 아드레날린작동성 수용체 이소프레테레놀 (작용물질), 알프
레놀롤 (길항물질)
로돕신
도파민 D2 도파민 (작용물질), 할로페리돌
(길항물질)
오피오드 루신-엔케팔린 (작용물질), 날트
린돌 (길항물질)
엔도셀린 엔도셀린 1 (작용물질), BQ-123
(길항물질)
에리쓰로포에틴 수용체 에리쓰로포에틴
FAS 리간드 수용체 FAS 리간드
인터루킨 수용체 인터페론 (작용물질) IL-6 (작용
물질)
신호 전달 단백질
키나아제
단백질 키나아제
단백질 키나아제 C 디아실글리세롤 (작용물질) 스타
우로스포린 (길항물질)
티로신 키나아제 ATP, 제니스타인(길항물질)
세린 키나아제 ATP
트레오닌키 나아제 ATP
뉴클레오티드 키나아제 ATP
폴리뉴클레오티드 ATP, DNA, PO4
포스파타제
단백질 포스파타제
세린/트레오닌/티로신
뉴클레오티드 포스파타제
산 포스파타제
염기 포스파타제
피로포스파타제
세포주기 조절인자
사이클린 CDK-2
CDC2
CDC25
p53
망막모세포종(腫)
지티피아제(GTPase)
거대 G 단백질
Gα들 슈라민 (길항물질), 마스토파린
(작용물질)
미소 G 단백질 GAPs (작용물질), GEF (길항물질)
Rac
Rho
Rab
Ras
프로테아제
엔도프로테아제
엑소프로테아제
메탈로프로테아제
셀린 프로테아제
시스테인 프로테아제
뉴클레아제
폴리머라아제
이온 채널
샤페로닌
열 쇼크 단백질
바이러스성 단백질
디아미나아제
뉴클레아제
데옥시리보뉴클레아제
리보뉴클레아제
엔도뉴클레아제
엑소뉴클레아제
폴리머라아제
DNA 의존성 RNA 폴리머라아제
DNA 의존성 DNA 폴리머라아제
텔로머라아제
프리마아제
헬리카아제
탈수효소
아미노산-tRNA 합성효소
전이효소
펩타이드 전이효소
아미노기 전이효소
당 전이효소
리보오스기 전이효소
아세틸기 전이효소
산 전이효소
가수분해효소
카복실라아제
이소머라아제
디스뮤타제
로타아제
토포이소머라아제
글루코시다아제
엔도글루코시다아제
엑소글루코시다아제
디아미나아제
리파아제
에스테라아제
설파타아제
셀룰라아제
리아제
환원효소
합성효소
DNA 결합 단백질
RNA 결합 단백질
핵 수용체 보조활성제
리가아제
RNA
DNA
종양억제인자
응착분자
옥시게나아제
페록시다아제
전달체
전자 전달체
단백질 전달체
펩타이드 전달체
호르몬 전달체
세로토닌
DOPA
핵산 전달체
전사 인자
신경전달물질
정보운반체/저장
항원 인식 단백질
MHC I 복합체
MHC II 복합체
Antag=수용체의 작용물질
agon=수용체의 길항물질
표 B : 표적조직들
순환계 및 림프계
심장
심벽
심장판막
혈관
혈구
적혈구
혈소판
백혈구
림프절
림프관
지라
흉선
편도선
호흡계
폐
기관
기관지
세기관지
폐포
늑막
인두
후두
기관
내분비계
뇌하수체선
갑상선
부갑상선
부신
부신수질
부신피질
췌장
랑게르한스섬
간
쓸개즙
유선
중추신경계
뇌
뉴런
신경교세포
척수
신경
말초신경계
눈
망막
수정체
귀
고막
팽대부
코르티기관
코
후각신경구
혀
미뢰
소화계
혀
침샘
인두
식도
위
소장
대장
비뇨계
신장
네프론
방광
남성생식계
고환
전립선
망울요도샘
페니스
정자
근육골격계
뼈
골수
관절
근육
인대
여성생식계
난소
자궁
바토린선
부요도선
난자
표피계
피부
외피
진피
하피
땀샘
피지선
털
손톱
Anzick, S. L., Kononen, J., Walker, R. L., Azorsa, D. O., Tanner, M. M., Guan, X.-Y., Sauter, G., Kallioniemi, O. -P., Trent, J. M., and Meltzer, P. S. (1997) AIBI a steroid receptor coactivator amplified in breast and ovarian cancer. Science 277, 965-968.
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Claims (22)
- (a) 수용체에 리간드를 제공하는 단계;(b) 복수 개의 구성원들을 포함하는 일차 조합 라이브러리의 구성원이 두 개 이상의 다른 참조 콘포메이션에서 수용체에 결합하는 능력에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하는 단계;(c) 상기 스크리닝에 기초하여, 일차 라이브러리 구성원들의 한 패널을 제공하는 단계로서, 상기 패널은 수용체에 결합하는 능력이 그것의 콘포메이션에 따라 다른 구성원들을 포함하는 단계;(d) 상기 패널을 구성하는 각 구성원과 상기 수용체의 결합에, 상기 수용체의 생물학적 활성을 조절하는 것으로 알려진 참조 물질이 미치는 영향을 결정하기 위해, 복수개의 참조 물질을 스크리닝함으로써, 각 참조 물질에 대한 참조 핑거프린트를 얻는 단계로서, 상기 핑거프린트는 복수개의 패널-기초 디스크립터를 포함하고, 각 패널-기초 디스크립터를 이용하여 특정 패널 구성원의 상기 수용체에의 결합에 대해 참조 물질이 미치는 영향의 특성을 결정하고, 상기 참조 핑거프린트의 패널 기초 디스크립터들을 이용하여 모든 패널 구성원들 각각의 상기 수용체에의 결합에 대한 영향의 특성을 집합적으로 결정하는 단계;(e) 상기 패널을 구성하는 각 구성원과 상기 수용체의 결합에, 상기 수용체에 대해 알려지지 않은 활성을 갖는 테스트 물질이 미치는 영향을 결정하기 위해, 그 테스트 물질을 스크리닝함으로써, 상기 테스트 물질에 대한 테스트 핑거프린트를 얻는 단계;(f) 테스트 핑거프린트를 참조 핑거프린트와 비교하는 단계; 및(g) 테스트 물질의 생물학적 활성이, 핑거프린트가 유사한 참조 물질의 생물학적 활성과 유사할 것이라는 가정에 기초하여, 테스트 물질의 생물학적 활성을 예측하는 단계를 포함하는,수용체의 생물학적 활성을 조절하는 화합물의 수용체-조절 활성을 예측하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 참조 콘포메이션은 리간드가 결합되지 않은 수용체의 콘포메이션인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 참조 콘포메이션은 리간드가 결합된 수용체의 콘포메이션인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 콘포메이션들은 일차 리간드에 의해 유도된 일차 리간드결합 콘포메이션, 및 이차 및 다른 리간드에 의해 유도된 이차 리간드 결합 콘포메이션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 패널은 하기 중 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:(i) 리간드가 결합되지 않은 수용체에 결합하는 것으로 감지되지만, 리간드 결합되지 않은 수용체보다 리간드가 결합된 수용체에 더 강하게 결합하는 구성원;(ii) 리간드가 결합되지 않은 수용체보다 리간드가 결합된 수용체에 더 약하게 결합하는 구성원;(iii) 둘다에 결합하는 것으로 감지되며, 리간드가 결합되지 않은 수용체에 결합하는 정도로 리간드가 결합된 수용체에 결합하는 구성원.
- 제 1 항에 있어서, 복수개의 다른 리간드가 패널의 특징을 결정하는 데에 이용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 복수개의 다른 조직 내의 테스트 물질의 생물학적 활성을 예측할 수 있도록, 상기 수용체에 대한 참조 물질들의 생물학적 활성이 상기 복수개의 다른 조직에 대해 알려진 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 수용체는 핵 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 수용체는 에스트로겐 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 수용체는 G-단백질이 결합된 수용체, G-단백질, 또는 G-단백질의 서브유닛인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 리간드는 수용체의 약리학적 작용물질 또는 길항물질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 콘포메이션은 수용체의 천연 리간드에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 콘포메이션은 수용체의 합성 리간드에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 일차 조합 라이브러리는 올리고펩티드 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 일차 조합 라이브러리는 핵산 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 테스트 물질은 조합 라이브러리 형태로 제공되고 스크리닝되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 테스트 물질의 생물학적으로 활성인 구성성분은 500달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 스크리닝 단계인 (a), (d) 및 (e)는 생체외에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 스크리닝 단계인 (a), (d) 및 (e)는 다세포 동물 전체, 또는 그 동물로부터 분리된 조직 및 기관의 분석이 아닌 세포-기초 분석으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 스크리닝 단계인 (d) 및 (e)는 투-하이브리드 분석 시스템으로 수행되고, 패널의 구성원들은 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 수용체는 글루코코르티코이드 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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