KR100625102B1 - 대나무 잎 추출물을 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대나무 잎으로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 대나무 잎 추출물, 전기 추출물의 제조방법, 전기 추출물을 유효성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제 및 자가면역 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 대나무 잎 추출물은 대나무 잎을 물과 유기용매의 혼합용매로 추출한 다음, 활성탄을 처리하여 활성탄에 흡착되는 분획을 수득하고, 다시 물과 유기용매의 혼합용매로 추출하여 제조된다. 본 발명의 대나무 잎 추출물은 전골수구성 백혈병의 유발을 억제시킬 수 있고, IL-12 p40 유전자의 과발현에 의한 자가면역질환의 유발을 억제시킬 수 있으므로, 다양한 면역질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

대나무 잎, 백혈병 치료제, 자가면역 치료제

Description

대나무 잎 추출물을 포함하는 약제학적 조성물{A Pharmaceutical Composition Comprising Bamboo Leaf Extract}

도 1은 대나무 잎 추출물의 첨가와 세포의 분화와의 상관관계를 나타낸 그래프이다.

도 2a는 아무것도 첨가하지 않은 상태에서, 분화된 세포의 표면에서 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 2b는 대나무 잎 추출물만을 첨가한 상태에서, 세포의 표면에 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 2c는 1,25-디하이드록시 비타민 D₃만을 첨가한 상태에서, 세포의 표면에 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 2d는 대나무 잎 추출물과 1,25-디하이드록시 비타민 D₃를 동시에 첨가한 상태에서, 세포의 표면에 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 2e는 ATRA만을 첨가한 상태에서, 세포의 표면에 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 2f는 대나무 잎 추출물과 ATRA을 동시에 첨가한 상태에서, 세포의 표면에 발현되는 CD11b의 발현정도를 나타내는 그래프이다.

도 3은 대나무 잎 추출물의 첨가량에 따른, IL-12의 발현량의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 4는 대나무 잎 추출물의 첨가여부에 따른, IL-12 p40 mRNA의 발현량의 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 대나무 잎 추출물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대나무 잎으로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 대나무 잎 추출물, 전기 추출물의 제조방법, 전기 추출물을 유효성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제 및 자가면역 치료제에 관한 것이다.

대나무는 화본과 식물로 세계적으로 약 280여종이 알려져 있으며, 우리나라에는 약 70종의 대나무 종류가 자생 또는 재배되고 있다. 대의 종류에는 솜대, 왕대(참죽), 맹종죽(죽순대), 오죽, 반죽, 섬대, 해장죽(신우대), 갓대, 조릿대, 산죽, 이대 등 11종의 대표적인 품종이 있다. 동의보감, 본초강목, 신농본초경 등에 따르면, 대나무는 중풍, 고혈압을 치료하는데 탁월한 효과가 있고, 대나무 잎은 해열, 거담, 청량 등의 목적으로 폐렴, 기관지염 등의 구갈에 사용된다고 알려져 있 다.

최근까지의 연구에 의하면, 대나무 잎은 항암, 항염증, 항생제로서의 효과가 있고, 대나무 잎에서 추출된 리그닌(lignin)은 탁월한 항암효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 대나무 잎의 메탄올 추출물은 세포주에서 세포자멸에 의하여 유도된 항암활성을 나타낸다고 알려져 있다(참조: Kim et al., Anticancer Res., 23:2355-2361, 2003). 또한, 국내특허공개 제 2001-0069130호에는 항균활성을 나타내어 식품보존제로서 사용할 수 있는 대나무 잎 추출물 및 그의 제조방법이 개시되고 있고, WO 98/57545에는 죽순에서 추출한 피토스테롤을 함유하는 콜레스테롤 저하용 조성물에 대하여 개시되어 있으며, 미국특허 제 3,418,311호애는 대나무에서 추출된 항암활성을 나타내는 다당체가 개시되어 있다.

이처럼 대나무 잎 추출물이 항암, 항염증, 항생제로서의 효과를 나타내는 이유는, 대나무 잎 추출물이 면역계를 조절할 수 있는 역할을 수행하기 때문일 것이라고 예측되고 있다. 만일, 대나무 잎 추출물이 면역조절물질로서 작용한다면, 지금까지 알려진 효과 이외의 새로운 면역계 질환의 예방 및 치료에 활용할 수 있을 것으로 예상되어, 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 대나무 잎 추출물과 면역관련 질환과의 상관관계가 밝혀지지 않고 있는 실정이다.

따라서, 대나무 잎 추출물과 면역관련 질환과의 상관관계를 규명하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 대나무 잎 추출물과 면역관련 질환과의 상관관계를 규명하고자 예의 연구노력한 결과, 대나무 잎으로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 대나무 잎 추출물이 비분화된 전골수구세포를 분화시키고, 대식구세포에서 비정상적으로 증가된 인터루킨-12(IL-12)의 생산을 감소시킬 수 있었는 바, 대나무 잎 추출물이 전골수구성(promyelocytic leukemia) 백혈병 및 자가면역질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 첫 번째 목적은 대나무 잎 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 대나무 잎 추출물의 제조방법은 대나무 잎을 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매에 침지하고, 상온에서 1 내지 3개월동안 방치한 다음, 여과하여 액상성분을 수득하는 단계; 전기 수득한 액상성분을 건조시켜 고형분을 수득하고, pH 4.0의 물에 용해시킨 다음 여과하여 액상성분 과 고형분을 각각 수득하고, 전기 고형분을 다시 pH 8.0의 물에 용해시킨 다음, 여과하여 수득한 액상성분을 수득하며, 전기 각 액상성분을 혼합하는 단계; 전기 혼합된 액상성분을 pH 8.0으로 적정하고, 활성탄을 가하여 교반한 다음, 여과하여 고형분을 수득하고, 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매를 가하여 교반한 다음, 여과하여 액상성분을 수득하는 단계; 및, 전기 수득한 액상성분을 건조시켜서 고형분을 수득하는 단계를 포함한다: 이때, 유기용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 아세톤 등을 사용함이 바람직하다.

본 발명자들은 대나무 잎에서 추출된 물질이 생리활성에 미치는 영향을 연구하던 중, 전기 추출물이 면역계 질환에 영향을 미칠 수 있다는 점에 주목하게 되었는데, 지금까지 알려진 바에 의하면, 대나무 잎은 항염증 활성을 나타내므로, 체내에서 면역계 활성을 보조할 수 있을 것으로 예상되었기 때문이다. 이에 다양한 면역활성에 대나무 잎 추출물이 미치는 영향을 연구하던 중, 전골수구세포(promyelocyte)의 비분화에 의하여 유발되는 전골수구성 백혈병에 촛점을 맞추어 연구를 진행하던 중, 대나무 잎 추출물이 비분화된 전골수구세포를 분화시킬 수 있음을 알게 되었다. 즉, 전골수구는 정상적으로 분화되어, 단식구세포, 대식구세포, 과립구세포 등으로 분화되는데, 전기 전골수구가 분화되지 못하면, 전골수구성 백혈병을 유발시킬 수 있다. 이에, 본 발명자들은 대나무 잎으로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 대나무 잎 추출물을 제조하고, 이를 사람의 전골수구성백혈병 세포주 HL-60에 처리하였다. 그 결과, 대나무 잎 추출물은 단독적으로 전기 세포주의 분화를 유도하지 못하였다. 그러나, 전기 세포주의 분화를 유도하는 물질로 알려진 1,25-디하이드록시 비타민 D₃(1,25-(OH)₂D₃) 또는 레티노인산(all-trans retinoic acid, ATRA)과 대나무 잎 추출물을 혼합하여 사용할 경우, 1,25-(OH)₂D₃ 또는 ATRA의 분화유도 효과를 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 전기 대나무 잎 추출물을 1,25-(OH)₂D₃ 또는 ATRA와 함께 HL-60에 처리하면, 분화된 세포의 비율이 급격히 증가되고, 분화된 세포에서 발현되는 세포표면 항원인 CD11b의 발현량이 급격히 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 전골수구성 백혈병의 치료제로서 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

이에 따라, 본 발명의 전골수구성 백혈병의 치료제는 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

한편, 전기 대나무 잎 추출물의 다른 효과를 연구하던 중, 전기 대나무 잎 추출물이, 대식구세포에서 비정상적으로 증가된 인터루킨-12(IL-12)의 생산을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다. 지금까지의 연구에 의하면, 대식구세포는 일정수준의 IL-12를 생산하는데, 전기 대식구세포에 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하면, IL-6 및 IL-12의 생산량이 급격히 증가되고, 과다한 양의 IL-12는 자가면역질환을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, LPS가 처리된 대식구세포에 대나무 잎 추출물을 처리하면, IL-6의 생산량은 감소되지 않으나, IL-12의 생산량 만이 급격히 감소되며, 세포의 활성이 감소되지도 않음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 과다한 IL-12로 인하여 유발된 자가면역질환의 치료제로서 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

이에 따라, 본 발명의 자가면역질환의 치료제는 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 전골수구성 백혈병 및 자가면역질환 치료제의 유효성분으로 함유되는 대나무 잎 추출물은 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다.

대나무 잎 추출물의 급성독성실험

6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 대나무 잎 추출물을 경구투여하여 24시간내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 전골수구성 백혈병 및 자가면역질환의 치료제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.

유효량

본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 대나무 잎 추출물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 6 내지 30㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 대나무 잎 추출물의 제조

대나무 잎 2kg을 3ℓ의 80%(v/v) 아세톤에 침지하고, 상온에서 2개월 동안 방치한 다음, 여과하여 대나무 잎을 제거하고, 액상성분을 수득한 다음, 회전증발기(rotary evaporator)를 이용하여 완전히 건조시켜서 고형분을 수득하였다. 이어, 전기 고형분을 1ℓ의 물(pH 4.0)에 용해시키고 여과하여, 액상성분을 수득한 다음, 여과된 고형분을 다시 1ℓ의 물(pH 8.0)에 용해시키고 여과하여, 액상성분을 수득하였다. 전기 두 액상성분을 혼합하고, pH 8.0으로 적정한 다음, 활성탄 100g을 가하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하여, 액상성분을 제거하였다. 전기 여과된 활성탄에 0.5ℓ의 80%(v/v) 아세톤을 가하고, 상온에서 1시간 동안 교반한 다음, 여과하여, 액상성분을 수득하였다. 전기 수득한 액상성분을 회전증발기를 이용하여 건조시켜서 10g의 고형분을 수득하였으며, 이를 대나무 잎 추출물로 사용하였다.

실시예 2: 대나무 잎 추출물이 HL-60 세포의 분화에 미치는 영향

전골수구는 정상적으로 분화되어, 단식구세포, 대식구세포, 과립구세포 등으로 분화되는데, 전기 전골수구가 분화되지 못하면, 백혈병을 유발시킬 수 있다고 알려져 있으며, 사람의 전골수구성 백혈병(promyelocytic leukemia) 세포주 HL-60은 자체적으로는 분화되지 못하고, 1,25-디하이드록시 비타민 D₃(1,25-(OH)₂D₃ ) 또는 레티노인산(ATRA)이 처리될 경우에 분화되는 것으로 알려져 있다. 이에, 전기 HL-60 세포에 대나무 잎 추출물를 단독으로 처리하거나, 대나무 잎 추출물과 1,25-(OH)₂D₃을 혼합처리하거나 또는 대나무 잎 추출물과 ATRA를 혼합처리한 다음, 분화된 HL-60 세포의 비율을 니트로블루 테트라졸리움 환원분석법(nitroblue tetrazolium reduction assay, NBT assay)을 이용하여 측정하고, 분화된 세포의 표면에서 발현되는 세포표면 항원의 발현여부를 세포형광분석법을 이용하여 확인하였다.

실시예 2-1: NBT 분석법을 이용한 분화된 HL-60 세포의 비율측정

HL-60세포의 분화정도는 공지된 바와 같이, 니트로블루 테트라졸리움 환원분석법으로 수행되었다(참조: Collins et al., J. Exp. Ned., 149:969-974, 1979): 즉, HL-60 세포주를 10%(v/v) 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640배지(Gibco BRL, USA)에서 배양하고, 전기 배지에 각각 0, 50, 100, 200 또는 400㎍/㎖의 농도로 전기 실시예 1에서 제조한 대나무 잎 추출물을 첨가하였으며, 각 농도의 대나무 잎 추출물이 첨가된 배지에 5nM 1,25-(OH)₂D₃ 또는 50nM ATRA를 각각 첨가한 다음, 37℃에서, 72시간동안 배양하였다. 이어, 각 배양물을 원심분리하여 수득한 각각의 세포(2 ×10⁵)를 0.2%(w/v) 니트로블루 테트라졸리움과 1ng/ml의 플라스미노겐 활성화인자가 용해된 PBS에 현탁시키고, 암조건하에 37℃에서 0.5시간동안 반응시킨 다음, 발생된 청흑반점의 생성빈도를 확인하여, 분화된 세포의 비율을 결정하였다(참조: 도 1). 도 1은 대나무 잎 추출물의 첨가와 세포의 분화와의 상관관계를 나타낸 그래프로서, (□)은 대나무 잎 추출물만을 처리한 세포를 나타내고, (▨)는 대나무 잎 추출물과 1,25-(OH)₂D₃을 함께 처리한 세포를 나타내며, (■)는 대나무 잎 추출물과 ATRA를 함께 처리한 세포를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 대나무 잎 추출물만을 단독으로 처리할 경우에는 HL-60 세포가 거의 분화되지 않았으나, 1,25-(OH)₂D₃ 또는 ATRA과 혼합하여 처리할 경우에는 분화된 HL-60 세포의 비율을 급격히 향상시킬 수 있고, 분화된 세포의 비율은 대나무 추출물의 처리양에 비례하여 증가함을 알 수 있었다.

실시예 2-2: 세포형광분석법을 이용한 세포표면 항원의 발현여부 확인

공지된 방법을 이용하여, 분화된 HL-60 세포의 세포 표면항원인 CD11b의 발현정도를 세포형광분석법을 이용하여 분석하였다(참조: Kim NJ et al., Kor. J. Pharmacogn., 26:368-376, 1995).

즉, HL-60 세포주를 10%(v/v) 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640배지(Gibco BRL, USA)에서 배양하고, 전기 배지에 400㎍/㎖ 대나무 잎 추출물, 5nM 1,25-(OH)₂D₃, 50nM ATRA, 400㎍/㎖ 대나무 잎 추출물 + 5nM 1,25-(OH)₂D₃ 및 400㎍/㎖ 대나무 잎 추출물 + 50nM ATRA를 각각 첨가하고, 37℃에서, 72시간동안 배양하였다. 이어, 각각의 배양물로부터 단일세포 현탁액을 수득하고, PBS로 세척한 다음, 형광 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 표지된 항-인간 CD14 단클론항체 또는 항-인간 CD11b 단클론항체(Becton Dickinson, USA)를 가하고, 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어, 세포를 PBS로 세척하고, 1%(v/v) 포르말린이 함유된 PBS를 사용하여 고정시킨 다음, 세포수 및 각 세포에서 발색되는 형광의 정도를 사이토플로로그래프(Epic V Flow Cytofluorograph, Coulter Electronics, USA; excitation 486-575nm:emission 568-690nm)와 다중 변수 데이터 처리시스템(multi-parameter data acquisition and display system. MDADS)을 사용하여 정량적으로 측정하였다. 이때, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 HL-60 세포주를 사용하였다(참조: 도 2a 내지 도 2f). 도 2a 내지 도 2f는 대나무 잎 추출물의 첨가여부에 따른 분화된 세포의 표면에서 발현되는 CD11b의 발현정도를 비교한 그래프로서, 도 2a는 아무것도 첨가하지 않은 대조군, 도 2b는 대나무 잎 추출물만을 첨가한 실험군, 도 2c는 1,25-(OH)₂D₃만을 첨가한 실험군, 도 2d는 대나무 잎 추출물과 1,25-(OH)₂D ₃을 동시에 첨가한 실험군, 도 2e는 ATRA만을 첨가한 실험군 및 도 2f는 대나무 잎 추출물과 ATRA을 동시에 첨가한 실험군을 각각 나타내며, (■)의 부위는 각 실험군을 처리하기 이전의 상태를 나타내고, (□)의 부위는 각 실험군을 처리한 이후의 상태를 나타낸다. 도 2a 내지 도 2f에서 보듯이, 1,25-(OH)₂D₃ 또는 ATRA 만을 첨가한 경우보다, 대나무 잎 추출물을 동시에 첨가한 경우에, CD11b의 발현정도가 현저하게 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 2-3: 전골수구성 백혈병 질환동물에 대한 대나무 잎 추출물의 효과확인

전기 실시예 2-1 및 2-2에서, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 미분화된 골수세포의 분화를 촉진시키는 역할을 수행함을 알 수 있었다. 이에, 생체내에서도 대나무 잎 추출물이 유사한 효과를 나타낼 수 있는지의 여부를 전골수구성 백혈병 질환동물을 사용하여 확인하였다.

전기 실시예 1에서 제조한 대나무 잎 추출물을 생리식염수에 용해시킨 후, 120마리의 3주령의 웅성 전골수구성 백혈병 질환모델 마우스(AKR/N Slc, 중앙실험동물(주), 대한민국)에 20㎍/체중(g)/시간(일)의 용량으로 2㎍/체중(g)/시간(일) ATRA와 함께 7일 동안 복강주사한 다음, 7일마다 20마리의 골수를 수집하여, 35일(5주)동안 골수를 수집하였다. 일부 마우스는 대조군으로 2㎍/체중(g)/시간(일) ATRA만 투여하였다. 현미경하에서 전기 수집한 골수 내의 전골수구 세포의 수를 계수하여, 골수 1㎕당 전골수구 세포의 수로 환산하여, 시간의 경과에 따른 전골수구 세포의 증감을 비교하였다(참조: 표 1). 이때, 양성 대조군으로는 대나무 잎 추출물이 용해되지 않은 생리식염수를 복강주사한 질환모델 마우스를 사용하고, 음성 대조군으로는 대나무 잎 추출물이 용해되지 않은 생리식염수를 복강주사한 정상적인 마우스를 사용하였다.

대나무 잎 추출물이 투여된 동물에서, 시간의 경과에 따른 전골수구 세포의 변화(단위: 세포수/골수 1㎕)

경과시간(일)	양성 대조군	음성 대조군	ATRA 투여군	ATRA와 대나무 잎 추출물 투여군
0	20	11	20	20
7	42	12	30	28
14	58	13	45	24
21	79	11	55	21
28	95	12	62	17
35	-*	11	80	17

*: 마우스 사망으로 인하여 전골수구 세포의 계수 불가

상기 표 1에서 보듯이, 대나무 잎 추출물이 병행 투여된 마우스에서는 시간의 경과에 따라, 전골수구 세포의 수가 감소하여 일정 수준으로 유지함을 알 수 있었다. 전골수구성 백혈병 마우스(양성 대조군)는 시간이 경과함에 따라, 전골수구 세포가 증가하고, 30일이 경과한 시점에서 20마리가 모두 사망하여, 더 이상 전골수구 세포를 계수할 수 없었다는 점과, 정상 마우스(음성 대조군)는 일정 수준의 전골수구 세포수를 유지하였다는 점을 감안한다면, 대나무 잎 추출물이 전골수구의 비분화로 인하여 발생되는 전골수구 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다.

전기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과를 종합하면, 대나무 잎 추출물은 생체외 또는 생체내에서도 비분화된 전골수구 세포의 수를 감소시킬 수 있으며, 이는 대나무 잎 추출물이 비분화된 전골수구세포의 분화를 촉진시키기 때문임을 확인할 수 있었는 바, 본 발명의 대나무 잎 추출물이 비분화된 전골수구에 의하여 유발되는 전골수구성 백혈병의 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 대나무 잎 추출물이 IL-12의 생산에 미치는 영향

대식구세포는 일정수준의 IL-12를 생산하지만, LPS(lipopolysaccharide)를 첨가할 경우에는 IL-12를 과도하게 생산함이 알려져 있는 바, 이러한 IL-12의 과량생산에 대나무 잎 추출물이 어떠한 영향을 미치는지, 발현된 IL-12의 단백질 수준과 mRNA 수준에서 확인하였다.

실시예 3-1: 대나무 잎 추출물의 처리에 따른 IL-12 단백질 발현량의 변화측정

RAW26437 세포를 10%(v/v) 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640배지(Gibco BRL, USA)에서 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 24시간 동안 배양한 다음, 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군, 5㎍/㎖ LPS만을 처리한 양성 대조군, 5㎍/㎖ LPS와 1㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군 1, 5㎍/㎖ LPS와 10㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군 2, 5㎍/㎖ LPS와 50㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군 3, 5㎍/㎖ LPS와 100㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군 4 및 5㎍/㎖ LPS와 200㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군 5를 각각 준비하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 각 세포내에서 발현되는 IL-12의 양을 정량하였다. 이때, IL-12의 양은 공지된 바와 같이, IL-12 p40에 대하여 특이적인 단클론항체를 사용한 ELISA 방법에 의하여 측정하였다(참조: Kang BY et al., Biochem. Pharmacol., 63:1901-1910, 2002)(참조: 도 3). 도 3은 대나무 잎 추출물의 첨가량에 따른, IL-12의 발현량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, LPS만을 처리한 경우(양성 대조군)에는 약 3.5ng/ml의 수준까지 IL-12가 발현되었으나, 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 경우, IL-12의 발현량이 감소되었으며, 50㎍/㎖ 이상의 양으로 대나무 잎 추출물을 처리한 경우에는 더이상 IL-12의 발현량이 감소되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 대나무 잎 추출물의 처리에 따른 IL-12 mRNA 발현량의 변화측정

RAW26437 세포를 10%(v/v) 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640배지(Gibco BRL, USA)에서 37℃, 5%(v/v) CO₂의 조건하에 24시간 동안 배양한 다음, 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군, 5㎍/㎖ LPS만을 처리한 양성 대조군 및 5㎍/㎖ LPS와 200㎍/㎖ 대나무 잎 추출물을 동시에 처리한 실험군을 각각 준비하고, 다시 24시간 동안 배양하였다.

이어, 각 세포에서 총 mRNA를 수득하고, 이를 주형으로 하고 프라이머로서 oligo(dT)를 사용한 RT-PCT을 수행하여 각 mRNA에 대한 cDNA를 수득하였다. 이어, 수득한 cDNA를 PCR 방법으로 증폭시켜서, IL-12 p40, IL-12 p35, IL-6 및 β-액틴 의 유전자를 각각 수득하였다. 이때, 프라이머로는 다음의 것을 사용하였다:

IL-12 p40-센스: 5'-agaagctaaccatctcctggtttg-3'(서열번호 1)

IL-12 p40-안티센스: 5'-ccggagtaatttggtgcttcacac-3'(서열번호 2)

IL-12 p35-센스: 5'-cagcgttccaacagcctc-3'(서열번호 3)

IL-12 p35-안티센스: 5'-gcagagtctcgccattatg-3'(서열번호 4)

IL-6-센스: 5'-gaacaacgatgatgcactt-3'(서열번호 5)

IL-6-안티센스: 5'-gtagagaacaacataagtc-3'(서열번호 6)

β-액틴-센스: 5'-ggaatcctgtggcatccatgaaac-3'(서열번호 7)

β-액틴--안티센스: 5'-aaaacgcagctcagtaacagtccg-3'(서열번호 8)

그런 다음, 각각의 수득한 유전자를 전기영동하여 비교하였다(참조: 도 4). 도 4는 대나무 잎 추출물의 첨가여부에 따른, IL-12 p40 mRNA의 발현량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, LPS가 단독적으로 처리된 경우에는 IL-12 p40, IL-12 p35 및 IL-6 mRNA의 발현량이 급격히 증가하였으나, LPS와 대나무 잎 추출물이 동시에 처리된 경우에는 IL-12 p40 mRNA의 발현량은 LPS가 처리되지 않은 수준으로 감소되었다. 그러나, IL-12의 다른 서브유닛인 p35는 대나무 잎 추출물이 처리되어도 mRNA의 발현량이 감소되지 않았으며, LPS에 의하여 발현이 유도되는 또 다른 인터루킨인 IL-6의 경우에도 대나무 잎 추출물이 처리되어도 mRNA의 발현량이 감소되지 않음을 알 수 있었다.

이처럼, IL-12의 다른 서브유닛인 p35의 mRNA의 양이 변화되지 않는다는 것은 본 발명의 대나무 잎 추출물이 IL-12 p40의 발현에 특이적으로 작용함을 의미하고, IL-6의 mRNA의 양이 변화되지 않는다는 것은 IL-12 p40의 mRNA의 양이 감소하는 것이 세포독성으로 인한 세포기능의 저하때문이 아니라는 점을 의미하는 바, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 IL-12 p40의 발현만을 특이적으로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 3-3: IL-12 과다발현 동물에 대한 대나무 잎 추출물의 효과확인

상술한 실시예 3-1 및 3-2의 결과를 종합하면, 본 발명의 대나무 잎 추출물은 LPS의 처리에 의하여 유도된 IL-12 p40의 발현을 특이적으로 억제하며, 이는 IL-12 p40 유전자의 전사수준에서 조절됨을 알 수 있었다. 이에, 생체내에서도 대나무 잎 추출물이 유사한 효과를 나타낼 수 있는지의 여부를 LPS를 섭식시킨 마우스의 비장에서의 인터루킨-12(IL-12)의 농도를 측정함으로써 확인하였다. 즉, 마우스의 비장에 존재하는 대식구세포는 IL-12를 생산하는데, LPS를 과다하게 섭식한 마우스는 전기 대식구세포에서 IL-12가 과다하게 생산됨이 알려져 있으므로(참조: 특허공개 제 2002-14435호), 전기 IL-12를 과다생산하는 마우스에 대나무 잎 추출물을 처리하여, IL-12의 생산량이 감소하는지의 여부를 확인하였다.

2주령의 웅성 DBA/2 마우스 120마리에 LPS를 혼합한 사료를 실험기간 동안 섭식시켰다. 한편, 전기 실시예 1에서 제조한 대나무 잎 추출물을 생리식염수에 용해시킨 후, 전기 웅성 DBA/2 마우스에 20㎍/체중(g)/시간(일)의 용량으로 7일 동안 매일, 7일 후에는 하루 걸러서 한 번씩 복강주사한 다음, 추출물 주사시작 후 7일마다 20마리의 비장을 채취하여, 35일(5주)동안 비장을 수집하였다(참조: Kang BY et al., Br. J. Pharmacol., 128:380-384, 1999). 전기 수집한 각각의 비장을 생리식염수 10㎖에 넣고 균질화한 다음, CO₂ 배양기에서 48시간 배양한 후, 전기 상등액에 함유된 IL-12의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다(참조: Kang BY et al., Br. J. Pharmacol., 128:380-384, 1999)(참조: 표 2). 이때, 양성 대조군으로는 대나무 잎 추출물이 용해되지 않은 생리식염수를 복강주사한 LPS를 섭식한 마우스를 사용하고, 음성 대조군으로는 대나무 잎 추출물이 용해되지 않은 생리식염수를 복강주사한 LPS를 섭식하지 않은 마우스를 사용하였다.

대나무 잎 추출물이 투여된 마우스에서, 시간의 경과에 따른 IL-12 농도의 변화(단위: ng/㎖)

경과시간(일)	양성 대조군	음성 대조군	대나무 잎 추출물 투여군
0	111	23	112
7	167	25	100
14	256	31	80
21	213	28	90
28	380	29	64
35	327	27	52

상기 표 2에서 보듯이, 대나무 잎 추출물이 투여된 마우스에서는 시간의 경 과에 따라, IL-12의 농도가 감소함을 알 수 있었다. 양성 대조군의 경우에는 시간이 경과함에 따라, IL-12의 농도가 증가한다는 점과, 음성 대조군의 경우에는 일정 수준의 IL-12의 농도를 유지한다는 점을 감안한다면, 대나무 잎 추출물이 비장의 대식구에서 생산되는 IL-12의 비정상적인 과다발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.

전기 실시예 3-1 내지 3-3의 결과를 종합하면, 대나무 잎 추출물은 생체외 또는 생체내에서도 비정상적인 요인에 의하여 유도되는 IL-12의 과다발현을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었는 바, 본 발명의 대나무 잎 추출물이 IL-12의 과다발현에 의하여 유발되는 자가면역질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 대나무 잎으로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 대나무 잎 추출물, 전기 추출물의 제조방법, 전기 추출물을 유효성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제 및 자가면역 치료제를 제공한다. 본 발명의 대나무 잎 추출물은 전골수구성 백혈병의 유발을 억제시킬 수 있고, IL-12 p40 유전자의 과발현에 의한 자가면역질환의 유발을 억제시킬 수 있으므로, 다양한 면역질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

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Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 대나무 잎을 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매에 침지하고, 상온에서 1 내지 3개월 동안 방치한 다음, 여과하여 수득한 액상성분을 건조시켜 고형분을 수득하며, pH 4.0의 물에 용해시킨 다음, 여과하여 액상성분과 고형분을 각각 수득하고, 전기 고형분을 다시 pH 8.0의 물에 용해시킨 다음, 여과하여 액상성분을 수득하며, 전기 각 액상성분을 혼합하여 pH 8.0으로 적정하고, 활성탄을 가하여 교반한 다음, 여과하여 고형분을 수득하며, 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매를 가하여 교반한 다음, 여과하여 수득한 액상성분을 다시 건조시켜서 수득한 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 전골수구성 백혈병(promyelocytic leukemia) 치료제.
5. 대나무 잎을 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매에 침지하고, 상온에서 1 내지 3개월 동안 방치한 다음, 여과하여 수득한 액상성분을 건조시켜 고형분을 수득하며, pH 4.0의 물에 용해시킨 다음, 여과하여 액상성분과 고형분을 각각 수득하고, 전기 고형분을 다시 pH 8.0의 물에 용해시킨 다음, 여과하여 액상성분을 수득하며, 전기 각 액상성분을 혼합하여 pH 8.0으로 적정하고, 활성탄을 가하여 교반한 다음, 여과하여 고형분을 수득하며, 물과 아세톤이 0.3:0.7 내지 0.1:0.9(v/v)의 비율로 혼합된 용매를 가하여 교반한 다음, 여과하여 수득한 액상성분을 다시 건조시켜서 수득한 대나무 잎 추출물을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 자가면역질환 치료제.

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