KR100620488B1

KR100620488B1 - 신규한 히스톤 디아세틸라아제 억제제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100620488B1
Application number: KR1020040063962A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 김동훈; 이지용
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2006-09-08
Also published as: KR20060015117A

Abstract

본 발명은 히스톤-디아세틸라아제 (HDAC) 억제 활성을 갖는 신규한 화합물인 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 상기 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 공지된 화합물인 SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) 보다 우수한 생체 흡수성을 가지므로 SAHA 보다 우수한 약물동력학적 특성을 가지며, 우수한 HDAC 활성 억제 및 향상된 종양 생성 억제 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 제조방법은 간단하면서도 탁월한 효율로 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제조할 수 있다.

히스톤 디아세틸라아제, N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드, 종양

Description

신규한 히스톤 디아세틸라아제 억제제 및 이의 제조방법{Novel Histone Deacetylase Inhibitor and Method for Preparing Thereof}

도 1은 본 발명의 신규한 HDAC 억제제의 치환기 디자인 과정을 보여주는 모식도;

도 2는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제의 화학적 합성방법을 나타내는 모식도;

도 3a는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제에 의한 H3 및 튜블린의 과아세틸화를 보여주는 웨스턴 블럿 분석 사진 (대조군으로서 튜블린을 쿠마쉬 블루로 염색하였다);

도 3b는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제에 의한 p21 리포터 유전자 활성을 정량적으로 나타내는 그래프;

도 4는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제에 의한 세포 사이클 억제 효과를 나타내는 FACS 분석 그래프;

도 5는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제의 HT1080의 침입 억제 효과를 나타내는 그래프: (패널 A-C) 침입 세포의 광학 현미경 확인 - A: 혈청 없음, B: 10 μM 2d, C: 10 μM 2b; (패널 D) HT1080 세포 침입의 정량적 분석 그래프;

도 6a는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제의 인 비보에서의 활성을 나타내는 그래프: 암 환자의 혈청에서 VEGF 생성 억제 효과,

도 6b는 본 발명의 신규한 HDAC 억제제의 인 비보에서의 활성을 나타내는 그래프: 인간 위암 세포를 갖는 동물 모델에서의 효과.

본 발명은 신규한 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 상기 화합물의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 히스톤 디아세틸라아제 억제 활성을 통하여 항암 활성을 갖는 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

아세틸라아제 및 디아세틸라아제에 의하여 조절되는 히스톤의 아세틸화는 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. 아세틸화된 히스톤이 전사 활성 부위 (transcriptionally active region)에서 관찰되는 반면, 전사적으로 비활성인 유전자들은 히스톤의 저아세틸화 (hypoacetylation)와 관련이 있는 것으로 관찰되었다 (Davie, 1998). 히스톤의 부적절한 아세틸화 상태는 비정상적인 과성장 및 변형된 세포 사멸 양상의 원인이 되며 결과적으로 종양 형질 전환이 일어나는 것으로 보고되고 있다 (Mark et al., 1978).

히스톤-변형 효소에 대한 최근의 연구에 의하면, 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)는 종양화에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 인간으로부터 발견되고 11 개의 멤버가 클론된 HDAC는 몇 몇 종양세포에서 과발현되며 (Dhordain et al., 1998; Pandolfi et al. 2001), 상기 세포의 HDAC-과발현 상태에서는 종양 억제인자, 예를 들면, p53, p21 및 겔솔린(gelsolin)의 발현이 억제되나 (Hoshikawa et al., 1993; Van Lint C et al., 1996; Saito et al., 1999), 종양 활성인자 (tumor activators), 예를 들면, 저산소증-유도 인자-1 (hypoxia-induced factor-1: HIF-1), 혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF)는 상향-조절된다 (Kim et al, 2001). 흥미롭게도, 특히 HDAC 6에 의하여 조절되는 튜블린 아세틸화의 감소가 알츠하이머와 같은 신경퇴행성 질환을 갖는 환자에게서 관찰되었다 (Hempen et al., 1996; Saragoni et al., 2000).

따라서, HDAC 활성 억제는 암 및 기타 다른 질병의 치료에 적용할 수 있을 것으로 인식되어 지고 있다. 실제로, 특정한 억제제에 의한 HDAC 억제는 분자 및 세포 수준에서 단백질의 아세틸화, 특정 유전자의 발현 및 세포의 형태, 증식 및 이동 등에 변화를 초래한다 (Tsuji et al., 1976). 지난 10년 동안, 공지된 HDAC 억제제들의 구조에 기초하여 자연계에서 또는 화학적 합성으로 얻어진 수많은 HDAC 억제자가 아세틸화 및 디아세틸화의 연구에 유용한 도구로 사용될 수 있다는 것이 보고되어 졌다. 잘 알려진 HDAC 억제제 중 트리코스타틴 A (trichostatin A: TSA), HC 독소, 아피시딘 (apicidin) 및 최근의 FK228 등은 곰팡이로부터 분리되었으며 (Yoshida et al., 1990; Shute et al., 1987; Han et al., 2000; Ueda et al., 1994), 한편 소듐 부틸레이트, 수베로일라닐리드 하이드록삼 산 (suberoylanilide hydroxamic acid: SAHA) 및 MS 27-275를 포함한 벤즈아미드 유도체가 합성되었다 (Kruh et al., 1982; Richon et al., 1998; Suzuki et al., 1999; Saito et al., 1999). 이 중에서 FK228, SAHA 및 벤즈아미드 유도체 (MS 27-275) 등이 임상시험 중에 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 HDAC 억제제인 SAHA의 구조에 기초하여 신규한 HDAC 억제제를 합성하고자 예의 연구 노력한 결과, 효율적으로 합성방법으로 제조된 본 발명의 신규한 나프틸티오헵타노미드 유도체가 HDAC의 활성 억제와 연관된 생물학적 현상, 즉, 단백질의 과아세틸화, 타깃 유전자의 상향-조절, 종양 세포 칩임 억제 및 종양 성장 억제에서 그 활성이 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 HDAC 활성 억제 화합물인 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 포함하는 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성 억제제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신규한 화합물인 하기 화학식 1의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제공한다.

본 발명의 화합물은 HDAC 억제제인 SAHA의 구조에 기초하여 바이오이소스테릭 치환 기술 (bioisosteric replacement technique : Patani GA 및 LaVoie EJ, 1996)을 이용하여 합성하였다. SAHA의 특정 작용기를 대체할 특정 작용기의 선택은 흡수 예측 프로그램 (absorption prediction)에 의하여 얻어진 데이터에 의하여 이루어졌다.

인 실리코 흡수 예측 (in silico adsorption prediction)은 최근에 약물 개발 도구로서 소개되었다 (van de Waterbeemd H and Gifford E., 2003). 인 실리코 흡수 예측은 인공 신경망 (artificial neuronal networks) 이론에 기초하는 ADME 예측 프로그램 (http://preadme.bmdrc.org)을 이용하여 실시된다. 요컨대, 매우 투과적이고 잘 흡수되는 분자는 Caco-2 세포에 대하여 7 (x 10⁶cm/sec) 보다 큰 수치를 갖고 MDCK 세포에 대해서는 50 (x 10⁶cm/sec)보다 큰 수치를 갖는다.

흡수능이 개선된 HDAC 억제제는 암뿐만 아니라 알츠하이머 질병 (Alzheimer's disease)의 유력한 치료제가 될 것으로 기대되며, 이는 알츠하이머 환자의 뇌에서의 혈관신생이 알츠하이머 질병의 발병 병인으로 생각되므로 (Vagnucci A.H. Jr and Li W. W. 2003), 뇌-혈 장벽 (brain-blood-barrier: BBB)을 효율적으로 투과할 수 있는 HDAC 억제제는 결과적으로는 알츠하이머 질병에도 효능을 발휘할 수 있는 것으로 판단되기 때문이다.

본 발명에 따르면, 흡수 특성을 증가시키기 위하여 SAHA의 아미드 연결 그룹을 이종원소, 예를 들어, 황 (2b), 산소 (2e) 또는 질소 (2f)로 치환하였다. 황으로 치환된 유도체의 경우에 SAHA의 벤젠기보다 더 소수성인 캡 구조를 갖도록 하기 위하여 나프탈렌 유사체 (2d)를 도입하였다 (도 1).

본 발명에 따르면, 본 발명의 이종원소 연결을 갖는 하이드록삼산계 화합물은 상업적으로나 합성을 통하여 입수 가능한 화합물로부터 두 합성 단계를 거쳐 고효율로서 제조할 수 있다: (1) 방향족 티올, 아닐린 및 페놀의 알킬화는 브로모알 카노산 에틸 에스테르 또는 메틸 에스테르와 함께 염기성 조건 (바람직하게는 K₂CO₃ 사용) 에서 실시되며, (2) 에스테르기를 하이드록삼산기로 전환하는 것은 염기성 조건 (바람직하게는 KOH 사용) 하에서 NH₂OH·HCl와 함께 에스테르 화합물을 처리하는 것에 의하여 달성된다 (도 2)

본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드는 탁월한 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성 억제 효과가 있으며, 탁월할 종양 생장 억제 효과를 나타낸다.

본 발명자들은 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드의 HDAC 활성 억제 효과를 인 비트로 및 인 비보에서 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드는 인 비트로 효소 활성 분석에서 IC₅₀ 0.1 μM에서 HDAC 활성 억제효과를 나타내었으며, HDAC 활성 억제와 관련된 히스톤 및 튜블린의 과아세틸화, p21과 같은 종양 억제인자의 발현 유도, 종양 세포 침입 억제 효과를 10 μM의 농도에서 나타내었다. 더욱이, 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드는 SAHA와 유사한 VEGF 생성 억제 효과를 나타내었으며, 특히, 인간 위암 세포를 갖는 제노그래프트 마우스의 종양 생장 억제에 있어서는 SAHA 보다 뛰어난 효과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 화합물은 상술한 바와 같이 흡수 예측 프로그램을 통해 생체에서 보다 잘 흡수될 수 있는 화학 구조를 가지며, 특히, SAHA 보다 매우 우수한 흡수성을 가지는 것으로 판단된다 (표 1). 따라서, 본 발명의 화합물은 보다 개 선된 흡수성을 바탕으로 SAHA 보다 우수한 약물동력학적 특성을 갖는다.

본 발명의 화합물은 생물학적 특징으로서 HDAC 활성 억제 및 종양 생성 억제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 화합물은 HDAC 활성에 관련되는 다양한 질병 또는 질환의 치료 또는 예방의 용도를 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 포함하는 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성 억제제를 제공한다.

화학식 1

본 발명의 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성 억제제에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상술한 본 발명의 화합물에 대한 내용과 동일하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드을 유효성분으로 포함하는 HDAC 억제제는 상기 화합물이 갖는 우수한 HDAC 활성 억제 효능 및 탁월한 흡수능으로 인하여, 강력한 HDAC 억제 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a)약제학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드:

화학식 1

; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상술한 본 발명의 화합물에 대한 내용과 동일하기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 HDAC 활성을 효과적으로 억제하며 특히, 혈관형성 (angiogenesis)에 관여하는 VEGF의 생성을 억제하고, 종양 생장을 억제하는 효능을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 및 용매화물로서 HDAC의 억제활성을 나타내는 화합물은 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업계의 기술수준을 고려하여 당업자에 명확하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 약제학적으로 허용되는 염은 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산 및 황산 등으로 제조된 무기산염, 아세트산, 포름산, 숙신산, 타타르산, 시트르산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 및 말레인산 등으로 제조된 유기산염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나트탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염, 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염 및 트리메틸아민, 트리에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드는 상업적으로 또는 합성을 통하여 입수할 수 있는 화합물로부터 두 단계의 합성과정을 거쳐 제조되며, 제조효율이 매우 탁월하다.

본 발명의 하기 특정 실시예를 참조하여 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸 티오)헵타노미드 합성방법을 설명하면 다음과 같다: (1) 2-나프탈렌티올을 용매에 용해한 후 K₂CO₃ 및 7-브로모헵타노산 에틸 에스테르를 실온에서 첨가하고 일정온도로 가열하여 반응시킨다; (2) 상기 (1)에서 제조된 에틸-7-(2-나프틸티오)헵타노에이트를 용매에 용해하고 염기성 조건 하에서 NH₂OH·HCl를 0℃에서 첨가하여 일정온도에서 일정시간 반응시킨 후 HCl로 중화하고 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 수득한다 (도 2).

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (1)에서 바람직한 용매는 DMF,NMP,아세톤,CH₂Cl₂,THF 또는 DMSO이며, 가장 바람직하게는 DMSO이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (1)에서 염기성 조건을 위하여 예를 들어, K₂CO_3, 탄산나트륨, 소듐에톡시드 및 소듐메톡시드 등의 무기염기 또는 디에틸아민, 트리에틸아민, 디에탄올아민 등의 유기염기 등 다양한 무기 혹은 유기염기를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 K₂CO₃를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (1)에서 반응온도는 바람직하게는 25-45℃이며, 보다 바람직하게는 30-40℃ 이며, 가장 바람직하게는 35℃이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (1)에서 반응시간은 바람직하게는 3-9 시간, 보다 바람직하게는 4-8 시간이며, 가장 바람직하게는 6시간이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (2)에서 바람직한 용매는 메탄올 혹은 에탄올이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계(2)에서 반응온도는 실온이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (2)에서 반응시간은 바람직하게는 6-30 시간, 보다 바람직하게는 12-24 시간이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (2)에서 염기성 조건을 위하여, 예를 들어, KOH, NaOH 및 CaOH 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 KOH를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 상기 합성 (2)에서 중화제로는 바람직하게는 HCl을 사용하나, 이에 한정하는 것은 아니며 일반적으로 사용되는 질산, 황산 등의 무기산 또는 빙초산 등의 유기산도 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 제조방법에 사용되는 용매, 반응 온도 및 반응 시간은 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드가 생성되는 범위 내에서 제한 없이 다양하게 설정할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 제조방법 단계 (1) 및 단계 (2)에서 제조된 화합물의 순수분리는 당업계에서 화합물의 순수분리에 통상적으로 사용되는 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게 화합물의 용해도 차이를 이용하는 방법 또는 크로마토그래피를 사용한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 시료 및 기기

사용되는 모든 용매는 사용 전에 완전하게 건조되었다. 시료는 특별히 언급되지 않는 한 추가적으로 정제하여 사용하지는 않았다. 약품은 Aldrich 또는 TCI 사에서 구입하였다. 녹는점은 Mel-Temp Ⅱ 기기를 사용하여 측정되었으며, 보정되지는 않았다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 CDCl₃ 또는 DMSO-d ₆ 용매에서 300 및 75 MHz에서 Varian 300을 사용하여 얻었다. 케미컬 쉬프트 d (chemical shift d) 는 외부 표준인 TMS에 대한 ppm으로 표시되어 있고, 커플링 상수 J 값은 Hz로 나타난다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (flash column chromatography)는 Merck 실리카겔로 실시하였다.

2. HDAC 활성 억제제의 합성

단계 1: 에스테르 화합물 합성 (화합물 1a-1f)

반응시키고자 하는 방향족 화합물 (2 mmol)의 DMF (5 ㎖) 용액을 교반하면서 K₂CO₃ (2.1 mmol) 및 브로모알카노산 에틸에스테르 (1a 및 1c의 경우에는 메틸 에스테르) (2.1 mmol)를 실온에서 첨가하고 35℃로 가열하였다 (1f의 경우에는 60℃). 6시간 후에, 염수 (brine)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 수성 용액을 EtOAc (6 ㎖ x 3)로 추출하였다. 수집한 유기용매층을 염수로 씻어준 후, MgSO₄로 건조시키고, 감압 농축하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hexane : EtOAc = 20 : 1)로 정제하여 표제 화합물을 얻었다 (도 2).

1a, 메틸-6-(페닐티오)헥사노에이트 (Methyl-6-(phenylthio)hexanoate): 수율 98%; ¹H NMR (CDCl₃) δ 7.37-7.28 (m, 4H), 7.23-7.10 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 2.95 (t, J = 7.2, 2H), 2.34 (dd, J = 7.8, 6.9, 2H), 1.72-1.63 (m, 4H), 1.54-1.46 (m, 2H); ESI/MS m/z 261.1[238.10+Na] ⁺

1b, 에틸-7-(페닐티오)헵타노에이트 (Ethyl-7-(phenylthio)heptanoate): 수율 97%; ¹H NMR (CDCl₃); δ 7.37-7.28 (m, 4H), 7.22-7.17 (m, 1H), 4.15 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.32 (dd, J = 7.8, 7.2, 2H), 1.71-1.62 (m, 4H), 1.53-1.43 (m, 2H), 1.41-1.32 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H); ESI/MS m/z 289.1 [266.13+Na] ⁺

1c, 메틸-8-(페닐티오)옥타노에이트 (Methyl-8-(phenylthio)octanoate): 수율 94%; ¹H NMR (CDCl₃); δ 7.33-7.17 (m, 5H), 3.70 (s, 3H), 2.94 (t, J = 7.2, 2H), 2.34 (dd, J = 7.8, 6.9, 2H), 1.62-1.37 (m, 6H), 1.35-1.17 (m, 4H); ESI/MS m/z 289.1 [266.13+Na] ⁺

1d, 에틸-7-(2-나프틸티오)헵타노에이트 (Ethyl-7-(2-naphthylthio)heptanoate): 수율 96%; ¹H NMR (CDCl₃); δ 7.82-7.75 (m, 5H), 7.52-7.42 (m, 4H), 4.15 (t, J = 7.2, 2H), 3.05 (t, J = 7.2, 2H), 2.32 (t, J = 7.2, 2H), 1.78-1.60 (m, 4H), 1.56-1.46 (m, 2H), 1.42-1.35 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.2, 3H); ESI/MS m/z 339.2 [316.15+Na] ⁺

1e, 에틸-7-페녹시헵타노에이트 (Ethyl-7-phenoxyheptanoate): 수율 91%; ¹H NMR (CDCl₃); δ 7.34-7.28 (m, 2H), 6.99-6.91 (m, 3H), 4.16 (q, J = 7.2 Hz, 2H ), 3.99 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.37-2.31 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.72-1.63 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 4H), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H); ESI/MS m/z 251.1 [250.16+H] ⁺

1f, 에틸-7-(페닐아미노)헵타노에이트 (Ethyl-7-(phenylamino)heptanoate): 수율 86%; ¹H NMR (CDCl₃) δ 7.30 (s, 1H), 7.21 (dd, J = 7.5, 7.2, 2H), 6.74 (dd, J = 7.5, 7.2, 1H), 6.66 (d, J = 7.8, 2H), 4.16 (q, J = 7.2, 2H), 3.14 (t, J = 6.9, 2H), 2.34 (dd, J = 7.8, 6.9, 2H), 1.70-1.62 (m, 4H), 1.48-1.34 (m, 4H), 1.29 (t, J = 7.2, 3H); ESI/MS m/z 250.2 (249.17+H) ⁺

단계 2: NH ₂ OH·HCl을 사용한 에스테르의 아미드화 (화합물 2a-2f)

상기 단계 1에서 제조된 에스테르 화합물 (1 mmol)의 MeOH (6 ㎖) 용액을 교반하면서 NH₂OH·HCl (4 mmol) 및 미세분말화된 무수 KOH (6 mmol)을 연속적으로 0℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하고 1N HCl로 중화하였다. 감압하여 MeOH을 제거하고 결과적으로 얻은 수성 용액을 EtOAc (5 ㎖ x 3)로 추출하였다. 수집한 유기용매층을 염수로 씻고, MgSO₄로 건조한 후, 감압농축하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CHCl₃ : MeOH = 10 : 1)로 순수 분리하여 표제 화합물을 얻었다 (도 2).

2a, N -히드록시-6-(페닐티오)헥사노미드 ( N -hydroxy-6-(phenylthio)hexanomide): 수율 88%; mp 140-141℃; ¹H NMR (CDCl₃+CD₃OD) δ 7.37-7.15 (m, 5H), 2.91 (t, J = 6.9, 2H), 2.08 (t, J = 7.5, 2H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.45-1.40 (m, 2H); ESI/MS m/z 238.1 [239.10-H] ^- ; Anal. Calcd for C₁₂H₁₇NO ₂S: C, 60.22; H, 7.16; N, 5.85. Found: C, 60.20; H, 7.12; N, 5.82.

2b, N -히드록시-7-(페닐티오)헵타노미드 ( N -hydroxy-7-(phenylthio)heptanomide): 수율 93%; mp 90-91℃; ¹H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 10.34 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.33-7.17 (m, 5H), 2.96 (t, J = 7.2, 2H), 1.94 (t, J = 7.2, 2H), 1.61-1.52 (m, 2H), 1.50-1.43 (m, 2H), 1.42-1.34 (m, 2H), 1.29-1.24 (m, 2H); ESI/MS m/z 276.1 [253.11+Na] ⁺ ; Anal. Calcd for C₁₃H₁₉NO₂S: C, 61.63; H, 7.56; N, 5.53. Found: C, 61.59; H, 7.52; N, 5.52.

2c, N -히드록시-8-(페닐티오)옥타노미드 ( N -hydroxy-8-(phenylthio)octanomide): 수율 84%; mp 102℃; ¹H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 10.33 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.33-7.17 (m, 5H), 2.96 (t, J = 7.2, 2H), 1.94 (t, J = 7.2, 2H), 1.60-1.36 (m, 6H), 1.30-1.16 (m, 4H); ESI/MS m/z 266.1 [267.13-H] ^- ; Anal. Calcd for C₁₄H ₂₁NO₂S: C, 62.89; H, 7.92; N, 5.24. Found: C, 62.84; H, 7.97; N, 5.18.

2d, N -히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드 ( N -hydroxy-7-(2-naphthylthio )heptanomide): 수율 88%; mp 122-123℃; ¹H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 10.31 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.87-7.80 (m, 4H), 7.50-7.41 (m, 3H), 3.06 (t, J = 7.2, 2H), 1.93 (t, J = 7.2, 2H), 1.66-1.56 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 4H), 1.30-1.23 (m, 2H); ESI/MS m/z 326.1 [303.13+Na] ⁺ ; Anal. Calcd for C₁₇H₂₁NO ₂S: C, 67.29; H, 6.98; N, 4.62. Found: C, 67.24; H, 6.96; N, 4.62.

2e, N -히드록시-7-페녹시헵타노미드 ( N -hydroxy-7-phenoxyheptanomide): 수율 81%; mp 71-72℃; ¹H NMR (CDCl₃) δ 10.35 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 7.31-7.26 (m, 2H), 6.94-6.90 (m, 3H), 3.95 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.96 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81-1.66 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 2H), 1.44-1.37 (m, 2H), 1.32-1.26 (m, 2H); ESI/MS m/z 238.1 [237.14+H] ⁺ ; Anal. Calcd for C₁₃H₁₉NO₃: C, 65.80; H, 8.07; N, 5.90. Found: C, 66.87; H, 8.11; N, 5.90.

2f, N -히드록시-7-(페닐아미노)헵타노미드 ( N -hydroxy-7- (phenylamino)heptanomide): 수율 65%; ¹H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 10.36 (s, 1H), 8.69 (bs, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.14-7.05 (m, 2H), 6.63-6.50 (m, 3H), 2.98 (t, J = 6.9, 2H), 1.97 (t, J = 7.5, 2H), 1.58-1.50 (m, 4H), 1.38-1.24 (m, 4H); ESI/MS m/z 237.1 [236.15+H] ⁺ ; Anal. Calcd for C₁₃H₂₀N₂O ₂: C, 66.07; H, 8.53; N, 11.85. Found: C, 66.09; H, 8.52; N, 11.87.

3. 합성된 화합물의 활성 실험방법

인 비트로 효소 분석

HDAC의 공급원이 되는 핵 분획을 배양세포 (HeLa, 한국세포주은행)로부터 수집하였다. 핵 분획을 0.5% TritonX-100을 포함하는 인산염 완충액 (pH 8.0)으로 용해하고 원심분리하였다. 제조된 핵 용해물 10 ㎍을 사용하여 제조자의 지침 (Biomol 사의 AK-500 kit)에 따라 96-웰 플레이트에서 반응을 실시하였다. 반응 종결 후에 HDAC 활성을 FL600 Microplate Reader (Bio-Tek Instrument, Inc., Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다.

세포 증식 분석

인간 섬유육종 세포 (HT1080)를 37℃, 5% CO₂ 습윤 조건하에서 10% (v/v) 열-불활성화된 우태아혈청 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 유지하였다. 화합물의 저장용액 (stock solution)은 사용 전에 바로 제조되었다. 모든 화학 약품은 DMSO에 용해하였다.

세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 상술한 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 다양한 농도의 실험 화합물을 세포에 48시간 동안 처리하였다. MTT 분석법으로 세포 성장을 측정하였고, 100배 배율의 광학 현미경을 사용하여 형태를 관찰하였다.

단백질의 과아세틸화

HT1080 세포를 100 ㎜ 디쉬에서 상술한 조건에 따라 배양하고, 8시간 동안 다양한 농도에서 실험 화합물을 처리하였다. 배양 후, 세포를 세척하고 원심분리로 수집하였다. 핵에서 히스톤을 분리하고 분리된 히스톤을 15% SDS-PAGE에서 전기영동하고 PVDF 막으로 이동시켰다. 아세틸화된 히스톤 및 튜뷸린에 대한 항원과 함께 상기 막을 배양하고 순차적으로 항-토끼 또는 마우스 항원과 배양하였다. 화학 발광 키트를 사용하여 아세틸화된 단백질의 수준을 검출하였다.

p21 리포터 유전자의 유도

루시퍼라아제 분석을 위하여, 인간 야생형 p21 프로모터-루시퍼라아제 융합 플라스미드를 포함하는 Mv1Lu 세포 (한국세포주은행)를 6-웰 플레이트에 접종하고 다양한 농도의 실험 화합물을 20 시간 처리하였다. 배양 후, 세포를 세척하고 원심분리하여 수집하였다. 수확한 세포를 0.5% TritonX 100를 포함하는 인산염 완충 액 (pH 8.0)에 용해하고 원심분리로 용해물을 얻었다. 루시퍼라아제 활성은 FL600 Microplate Reader (Bio-Tek Instrument, Inc., Winooski, VT)를 사용하여 검출하였으며, 상등액의 일부는 단백질의 농도 측정을 위하여 사용하였다.

유세포 분석기 (Flow Cytometry)를 이용한 세포 사이클 분석

HT1080 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 (10⁵ cells/well) 24 시간 배양하였다. 혈청이 없는 DMEM에서 24 시간 배양하였다. 동기화 (synchronization) 후에 상기 세포에 실험 화합물을 처리하거나 처리하지 않고 10% 혈청의 존재 하에서 24 시간 배양하였다. 그 다음, 세포를 트립신처리 하여 수확하고, 에탄올 존재 하에서 고정하고 투과화하였다. 세포를 원심분리하고 인산염 완충 염수 (PBS, pH 7.4)에 재현탁하였다. 배경 염색을 줄이기 위하여 RNase (80 ㎍/㎖)를 첨가하고 프로피디움 아이오다이드 (propidium iodide) (50 ㎍/㎖)를 사용하여 특정 DNA 염색을 실시하였다. DNA 히스토그램은 Beckton-Dickenson FACS Vantage flow cytometer system (Beckton-Dickenson, San Jose, CA)으로 결정되었으며, 세포 사이클 분포는 Cell Quest software version 3.2 (Beckton-Dickenson)를 사용하여 분석되었다.

인 비트로 침입 분석

내피 세포의 침입도를 인 비트로에서 8.0-m-세공-폴리카르보네이트 필터를 갖는 트랜스웰 챔버 시스템에서 실시하였다. 필터의 하부를 10 ㎕의 젤라틴 (1 mg/㎖)으로 코팅하고, 상부를 10 ㎕의 마트리젤로 코팅하였다. HT1080 (1x10⁵ 세포) 필터의 상부에 놓고 챔버를 37℃에서 18 시간 배양하였다. 세포를 메탄올로 고정하고 헤마톡실린/에오신 (hematoxylin/eosin)으로 염색하였다. 세포 침입은 필터 하부의 전체 세포 수를 100배 배율의 광학 현미경으로 측정하여 결정되었다.

제노그래프트 마우스 (xenograft mouse)를 이용한 종양 억제 활성 측정

실험동물

체중이 20 g인 6 주령의 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스를 연세대학교 의과학연구센터 동물실험부서에서 공급받아 특정병원균이 없는 (specific pathogen free (SPF) 조건에서 유지하였다. 한국 의학실험동물 보호 협회에서 승인된 방법에 의하여 실시되었다.

세포주 및 S.C 접종

복수 (ascites)로부터 수립한 YCC-3 인간 위암세포주를 연세대학교 의과대학 암전이연구센터로부터 공급받았다. 세포를 37℃, 5% CO₂ / 95% 공기 조건에서 10% 우태아혈청 (FBS, Biofluids. MD.USA), 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 페니실린 100 units (Invitrogen. CA.USA)를 포함하는 MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen. CA.USA)에서 배양하였다. 지수 성장기 (exponential growth phase) 의 세포를 0.25% 트립신-EDTA으로 회수하고 세척한 후 생리식염수 (normal saline)에 재현탁하였다. 생존능이 95% 이상인 단일 세포의 현탁액을 사용하였다. 각 마우스의 좌상 옆구리 부위에 2x10⁷ 세포 (100 ㎕ 생리식염수)를 피하주사하였다.

약물

SAHA 및 2d (10 mM, 50 ㎕)를 생리식염수로 희석하고 피하주사하였다.

처리 및 측정

주사한 부위에 직경 5 ㎜의 종양 (접종 2 주 후)을 갖는 마우스를 3 마리 씩 3 군으로 무작위로 나누었다: 대조군 (DMSO), SAHA 군 (20 mM/마우스), 2d 군 (20 mM/마우스). 약물을 격일로 21일 간 복강투여하였다. 주마다 3회 마우스 체중을 측정하고 1일 째부터 주마다 3회 칼리퍼 방법 (caliper method)으로 종양을 측정하였다. 종양부피는 하기 수학식 1에 의하여 계산되었다.

종양부피=(길이 x 넓이²)/2

추가적으로, 각 군의 생존 시간을 측정하였다.

4. 실험 결과

인 비트로 효소 활성 분석 결과

우선, SAHA에 비하여 크게 증가된 흡수 예측 값을 갖는 SAHA 유도체 (화합물 2a-2f)의 HDAC 억제 활성을 인 비트로 HDAC 효소 분석법을 사용하여 측정하였다. 실험된 화합물의 IC₅₀ 수치는 하기 표 1에 나타나 있다. 실험된 유도체 중, 2b 및 2d가 효소 분석법에서 IC₅₀ 수치 0.1 μM로 가장 유력한 활성을 나타내었다. 그러나, 연결 부위에서 황 대신 질소 또는 산소가 사용되고 다른 알킬 사슬 (C₆ 또는 C₈)을 갖는 유도체는 2b 또는 2d보다 낮은 활성을 나타내었다.

세포 증식 분석 결과

인 비보에서 SAHA 유도체 (화합물 2a-2f)의 활성을 확인하기 위하여, 인간 섬유육종 세포 (HT1080)에 상기 유도체들을 처리하였다. 2b 또는 2d를 처리한 결과 투여량에 비례하여 세포의 형태가 변하고 성장이 억제되었다.

SAHA가 처리된 세포와 유사하게 2b 또는 2d가 처리된 세포는 대조군 세포 보다 더 길어진 형태를 나타내었으며, 2b 및 2d의 IC₅₀ 수치는 각각 10 및 7.5 μM 이었다 (표 1).

상기 결과는 연결기로는 황 원자가 가장 우수한 작용기라는 것을 보여준다. 또한, 세포계에서 모노옥시게나아제류에 의한 황 원자의 산화로부터 생성된 설폰 또는 설폭사이드는 또 다른 약물동력학적 특성을 제공하거나 또는 HDAC에 대하여 보다 나은 억제력을 제공할 수 있다고 판단된다. 상기와 같은 이유로 2b 및 2d를 후보물질로 선정하고 추가적인 실험을 실시하였다.

화합물	흡수 예측		IC₅₀ 값 (μM)
화합물	Caco-2 (x10⁶㎝/sec)	MDCK (x10⁶㎝/sec)	HDAC 활성	세포 증식
SAHA	1.278	4.38	0.05	3
2a	11.755	710	0.15	20
2b	14.42	714	0.1	10
2c	26.97	715	0.15	12
2d	16.67	315	0.1	7.5
2e	9.42	511	0.15	13
2f	19.26	603	0.15	16

2b 및 2d의 HDAC 억제제로서의 인 비보 검증

단백질의 과아세틸화 결과

특정 억제제에 의한 HDAC의 활성 억제는 약물-처리된 세포에서 히스톤의 과아세틸화를 유도한다는 것이 보고되어 있으며, 흥미롭게도 HDAC6는 튜블린의 아세틸화 상태 조절을 통하여 동적 마이크로튜블의 안정성에 관여하는 것으로 보고되고 있다 (Haggarty et al. 2003; Zhang et al. 2002; Matsuyama et al. 2002).

선택된 화합물 (2b 및 2d)이 인 비보에서 HDAC 활성을 억제하는 지 여부를 확인하기 위하여, 약물-처리된 세포에서 히스톤 및 튜블린의 과아세틸화 유도여부를 웨스턴 블럿 분석을 통하여 검사하였으며, 아세틸화된 H3 및 아세틸화된 튜블린을 검출할 수 있는 항체를 사용하였다. 도 3A에서 나타나는 바와 같이, 2b 및 2d는 약물이 처리되지 않은 대조군에 비하여 고-아세틸화된 H3 및 튜블린의 축적을 유도하였다. 대조군으로서 처리된 SAHA에 의한 히스톤 및 튜블린의 과아세틸화 양상과는 다르게, 본 발명의 유도체에 의한 과아세틸화 양상은 초기에 피크를 이루었다.

p21 리포터 유전자의 유도 결과

인 비보에서 2b 및 2d의 활성을 HDAC 타깃 유전자의 발현 변화를 검출하여 확인하였다.

히스톤의 과아세틸화는 p21^WAF1와 같은 종양 억제인자를 유도하는 것이 잘 알려져 있다. 사이클린-CDK의 억제제인 p21^WAF1은 다양한 종양 세포에서 HDAC 억제제-유도된 G1 세포 사이클 저지에 필수적으로 요구된다 (Han et al., 2000; Archer et al., 1998; Siavoshian et al., 1997). 잘 알려진 HDAC 억제제, 예컨대, TSA, SAHA 및 FK228은 전사적으로 p21^WAF1를 유도하는 것으로 보고되어 있다.

약물 처리에 의한 p21^WAF1의 단백질 수준 변화를 검사하기 위하여, 리포터 유전자 분석법을 통하여 p21^WAF1의 증가를 관찰하였다. p21^WAF1 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자로 안정하게 형질감염된 Mv1Lu 세포를 SAHA 유도체로 처리하였다. 세포에서 p21^WAF1 발현을 유도할 수 있는 2b 및 2d의 활성은 대체로 히스톤 아세틸화와 상관관계를 가졌다 (도 3a 및 3b). 이러한 결과는 2b 및 2d는 인 비보에서 특이적 HDAC 억제제임을 나타내는 것이다.

세포 사이클 분석 결과

페닐부틸레이트, 트리코스탄닌 A 및 SAHA와 같은 HDAC 억제제에 의하여, 세포 사이클 키나아제 억제제인 p21^WAF1의 발현이 형질전환 세포에서 유도된다 (Richon et al. 1996; Xiao et al. 1999; Han et al. 2000). 상기 약제에 의한 p21^WAF1의 발현 증가는 형질전환 세포에서 세포의 성장 저지에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 알려져 있으므로, 세포 사이클에 대한 2b 및 2d의 효과를 세포 FACS 분석을 통하여 실험하였다.

그 결과, 2b 및 2d는 G₀-G₁기에서 HT1080 세포의 세포 사이클의 진행을 SAHA와 동일한 양상으로 억제하였으며, 이는 HT1080 세포에서 p21^WAF1 발현의 증가와 연관이 있다 (도 4).

종양 세포 침입 억제

저산소증 (hypoxia)과 같은 특정 조건에서 과발현된 HDAC는 정상 조건에 비하여 히스톤의 아세틸화 수준 변화를 통하여 혈관 형성을 유도하는 것으로 보고되었다 (Kim et al. 2001). 종양 세포 침입은 종양세포의 이동 및 확산에 있어 중요한 단계이므로 이 단계의 억제는 항-혈관신생제의 중요한 특성으로서 고려되고 있다 (Kwon et al. 2002). 2d가 HDAC 활성을 조절하여 종양 세포 침입을 억제할 수 있는 지를 확인하기 위하여, Kwon 등이 개시한 방법에 따라 인 비트로 침입 분석을 실시하였다.

그 결과, HT1080는 효과적으로 필터를 통하여 침입하였으나, 2d는 10 μM 농도에서 HT1080 세포의 침입을 억제하였으며, 2b 또한 10 μM 농도에서 HT1080 세포의 침입을 억제하였다 (도 5). 도 5의 패널 D에는 종양 세포 침입 분석의 정량적 데이터가 기재되어 있다. 이 데이터는 SAHA 유도체인 2d가 종양 세포의 혈관신생 특성을 인 비트로에서 강력하게 억제하는 것을 보여준다.

인 비보 에서의 종양 억제활성 평가

MS-27-275 및 히드록삼산계 HPCs 등 수 개의 HDAC 억제제가 인 비보에서 종양 성장에 대한 억제 활성을 보여주었다 (Saito et al. 1999; Butler et al. 2000). 그 중에서, SAHA는 동물 모델에서 종양의 부피 및 발생빈도를 부작용 없이 현저하게 감소시켰다 (Butler et al. 2000; Cohen et al. 1999). 이로부터 2b 및 2d가 인 비보에서 종양 억제 활성을 갖는지 여부를 실험하였다.

우선, 암 환자로부터 수득한 혈청에 SAHA 또는 2b 및 2d를 다양한 농도로 처리하여 VEGF의 상대적 생성율을 측정함으로써 SAHA 또는 2b 및 2d의 VEGF 생성 저해 정도를 측정하였다. VEGF는 내피 세포의 증식을 증진시켜 혈관신생을 자극하며, HDAC 활성에 의하여 그 발현 정도를 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Kim et al. 2001).

도 6a에 나타나 있는 것처럼, 2d는 혈청으로부터의 VEGF 생성을 SAHA와 동일 한 정도로 억제하는 반면, 2b 는 그러하지 못했다.

또한, 인간 위암조직이 이식된 제노그래프트 마우스 (xenograft mouse)를 이용하여 2d 및 SAHA의 종양 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 2d는 대조군에 비하여 제노그래프트 마우스에서 종양의 부피를 현저하게 감소시켰으며, 이러한 2d의 종양세포 억제효과는 SAHA의 그것보다 높은 것으로 나타났다 (도 6b).

이 같은 결과는 인 비보에서 2d가 SAHA 보다 향상된 체내 흡수율을 통해서 강력한 종양억제 효과를 나타내었음을 알 수 있으며, 위의 결과들을 종합할 때, 2d가 HDAC 억제 효과를 갖는 새로운 항암제로서 개발될 수 있다는 것을 보여준다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 억제 활성을 갖는 신규한 화합물인 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 및 상기 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 공지된 화합물인 SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) 보다 우수한 생체 흡수성을 가지므로 SAHA 보다 우수한 약물동력학적 특성을 가지며, 우수한 HDAC 활성 억제 및 향상된 종양 생성 억제 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드 제조방법은 간단하면서도 탁월한 효율로 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드를 제조할 수 있다.

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Claims

하기 화학식 1로 표시되는 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드:

화학식 1
삭제
(a) 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성 억제제로서, 약제학적 유효량의 상기 제 1 항의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
다음의 단계를 포함하는 상기 제 1 항의 N-히드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노미드의 제조 방법:

(a) 2-나프탈렌티올을 염기성 조건 하에서 7-브로모헵타노산 에틸에스테르와 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 에틸-7-(2-나프틸티오)헵타노에이트를 염기성 조건 하에서 NH₂OH·HCl와 반응시키는 단계.