KR100603899B1

KR100603899B1 - 인간 ｍｃｐ-1에 대한 항체

Info

Publication number: KR100603899B1
Application number: KR1020027017405A
Authority: KR
Inventors: 하이에스탠드페터; 호프스테테르한스; 페이네트레버글린; 우르페르로만; 디파도바프랑코이.
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-07-25
Also published as: CN100486996C; MXPA03000201A; PL359854A1; HUP0301477A2; GB0016138D0; EP1299421A2; CA2412775A1; PL207133B1; RU2314316C2; EP1299421B1; ECSP024402A; IL153721A0; ZA200300199B; HUP0301477A3; NO20026063D0; CN1443199A; NO20026063L; AU2001283903B2; BR0112086A; JP2007054079A

Abstract

MCP-1 또는 에오탁신-매개된 질환이나 장애를 치료하기 위한, 정의된 바와 같은 서열의 고가변성 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변성 영역(V_H)을 포함하는 MCP-1 결합 분자가 제공된다.

Description

인간 ＭＣＰ-1에 대한 항체{Antibodies to human MCP-1}

본 발명은 인간 단핵구 화학주성단백질-1(monocyte chemoattractant protein-1: MCP-1)의 항체 및 단핵구 및 T-세포의 이동 및 활성화에 관련된 질환 및 장애, 예컨대, 염증성 질환의 치료를 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

일본특허공개공보 제05276986호(Sumitomo Electric Co.)는 MCP-1을 측정하고 마크로파지의 침투에 관련된 질환을 치료 및 진단하는데 유용한 인간 MCP-1에 대한 설치류의 모노클로날 항체의 제조에 대해 개시하였다. 일본특허공개공보 제09067399호(Mitsui Toatsu)는 염증의 치료에 유용한, EBV가 형질전환된 인간 말초 혈관 세포로부터 인간 MCP-1에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조를 기술하였다. 일본특허공개공보 제11060502호(Teijin)는 MCP-1 저해제, 특히 뇌경색의 치료를 위한 인간 MCP-1 항체의 용도를 기술하였다.

본 발명자들은 이제 단핵구 및 T-세포의 이동 및 활성화에 관련된 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한 인간 MCP-1에 대한 개선된 항체를 제조하였다.

따라서, 본 발명은 고가변(hypervariable) 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역(V_H)을 포함하는 항체 결합 부위를 포함하는 MCP-1 결합 분자 및 이의 직접적인 균등물을 제공하며, 상기 CDR1 은 His-Tyr-Trp-Met-Ser의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu의 아미노산 서열을 갖는다.

따라서 본 발명은 고가변 부위 CDR1', CDR2' 및 CDR3'의 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체 결합 부위를 포함하는 MCP-1 결합 분자 및 이의 직접적인 균등물을 또한 제공하며, 상기 CDR1'는 Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'는 Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 제1 면은 상기한 중쇄 가변 영역(V_H)을 포함하는 단리된 면역글로불린 중쇄를 포함하는 단일 영역 MCP-1 결합 분자를 제공한다.

본 발명의 제2 면은 중쇄 가변 영역(V_H) 및 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 MCP-1 결합 분자 및 이의 직접적인 균등물을 제공하며, 상기 MCP-1 결합 분자는,

a) 고가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(V_H)(여기서, 상기 CDR1은 His-Tyr-Trp-Met-Ser의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu의 아미노산 서열을 갖는다); 및

b) 고가변 부위 CDR1', CDR2' 및 CDR3'의 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(V_L)(여기서, 상기 CDR1'는 Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'는 Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다.

다르게 지시되지 않는 한, 모든 폴리펩타이드 쇄은 N-말단에서 출발하여 C-말단에서 끝나는 아미노산 서열로서 본 명세서에서 기술된다.

항체 결합 부위가 V_H 및 V_L 영역 양자를 가지고 있다면, 이들은 같은 폴리펩타이드 분자상에 위치할 수 있거나, 바람직하게는 각각의 영역은 다른 쇄에 위치할 수 있고, V_H 영역은 면역글로불린 중쇄 또는 단편의 부위이고, V_L은 면역글로불린 경쇄 또는 단편의 부위일 수 있다.

"MCP-1 결합 분자"는 단독 또는 다른 분자와 관련하여 MCP-1 항원에 결합할 수 있는 모든 분자를 의미한다. 결합 작용은 예컨대, 바람직하게는 같은 이소타입의, 비관련된 특이성의 항체를 사용한 음성 대조 시험을 참조하여, 그의 수용체에의 MCP-1 결합의 저해를 측정하기 위한 바이오어세이, 즉, 케모카인 수용체(CCR)-2, 예를 들어 CCR2B 또는 모든 종류의 결합 어세이를 포함하는 표준 방법(정성적 어세이)에 의해 나타날 수 있다. 이롭게는 본 발명의 MCP-1 결합 분자의 MCP-1에 대한 결합은 예컨대, BIAcore 어세이에 의해 나타낼 수 있다.

항체 결합 분자의 예는 B-세포 또는 하이브리도마 및 키메릭, CDR-그래프트 된 또는 인간 항체 또는 그의 모든 단편, 예, F (ab')₂ 및 Fab 단편 뿐만 아니라 단일 쇄 또는 단일 영역 항체에 의해 생산되는 항체를 포함한다.

단일 쇄 항체는 10 내지 30 아미노산, 바람직하게는 15 내지 25 아미노산으로 일반적으로 구성된 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 결합된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. 따라서 이와 같은 구조는 중쇄 및 경쇄의 불변 부위를 포함하지 않고, 작은 펩타이드 스페이서는 전체의 불변 부위보다 항원성이 더 적어야 한다고 믿어진다. "키메릭 항체"는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간(예, 설치류) 기원 또는 다른 인간 항체에서 유래한, 인간 기원인 반면, 중쇄 및 경쇄의 불변 부위는 또는 양자가 인간 기원인 항체를 의미한다. "CDR-그래프트된 항체"는 모든 또는 실질적으로 모든 면역글로불린의 다른 부위, 예컨대, 불변 부위 및 가변 부위의 높이 보존된 부위, 즉, 골격(framework) 부위는 수용체 항원, 예컨대, 인간 기원의 항체로부터 유래된 반면, 고가변 부위(CDR)는 공여체 항체, 예컨대, 비인간(예, 설치류) 항체 또는 다른 인간 항체로부터 유래된 항체를 의미한다. CDR-그래프트된 항체는 그러나 골격 부위, 예컨대 고가변 부위에 인접한 골격 부위의 부분에서 공여체 서열의 수 개의 아미노산을 포함할 수 있다. "인간 항체"는 예컨대, 일반적인 용어로 EP 0546073 B1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0438474 B1 및 EP0 463151 B1에 기술되어 있는 것과 같이, 중쇄 및 경쇄 양자의 불변 및 가변 부위가 모두 인간 기원 또는 반드시 같은 항체로부터는 아닌, 실직적으로 인간 기원의 서열과 동일한 항체 를 의미하고, 설치류 면역글로불린 가변 및 불변 부위 유전자가 인간의 대응물에 의해 치환된 마우스에 의해 생산된 항체를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 MCP-1 결합 분자는 인간 항체 특히, 이하 실시예에 기술된 AAV293, AAV294 및 ABN912항체이다(AAV293 항체는 인간 IgG3/κ 항체이고, ABN912는 인간 IgG4/κ 항체이나, 다른 대상물에 있어 본질적으로 동일하다. AAV294 항체는 실시예에서 이하 기술하는 FR1, V_H의 CDR2 및 FR3 및 V_L의 CDR1' 및 FR3'에서 단일 아미노산이 변화한 것을 제외하고 AAV293의 영역과 동일한 가변 영역을 갖는 인간 IgG1/κ 항체이다).

따라서 바람직한 키메릭 항체에서, 중쇄 및 경쇄의 양자의 가변 영역은 인간 기원, 예컨대, 서열번호 1 및 서열번호 2에서 나타낸 ABN912 항체의 영역이다. 불변 부위 영역은 바람직하게는 적절한 인간의 불변 부위 영역을 또한 포함하고, 예컨대, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. A. 등, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health에서 기술된다.

비록 인간기원이 것이 바람직하지만, 고가변 부위는 모든 종류의 골격 부위와 연관된다. 적절한 골격 부위는 상기 Kabat E. A. 등에 기술된다. 바람직한 중쇄 골격은 인간 중쇄 골격, 예컨대, 서열번호 1에서 나타낸 ABN912 항체의 골격이다. 이것은 FR1, FR2, FR3 및 FR4 부위의 서열로 구성된다. 같은 방법에서, 서열번호 2는 FR1', FR2', FR3' 및 FR4' 부위의 서열로 구성된 바람직한 ABN912 경쇄 골격을 나타낸다. 다른 골격 부위, 바람직하게는 인간 골격 부위는 예컨대, 상기 Kabat 등이 기술한 것과 같이 서열번호 1 및 서열번호 2에서 나타나는 것을 사용할 수 있다. 골격 부위, 특히 고가변 부위에 인접한 골격 부위에서의 수개의 아미노산 잔기는 예컨대, 결합 특성에 영향을 주기 위해, 상응하는 규정된 골격 부위의 것과 다를 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 1번 위치의 아미노산으로 시작되고 122 위치의 아미노산으로 끝나는 서열번호 1에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제1 영역 또는 상기한 제1 영역과 1번 위치의 아미노산으로 시작되고 109번 위치의 아미노산으로 끝나는 서열번호 2에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 결합 부위를 포함하는 MCP-1 결합 분자를 제공한다.

모든 인간에서 천연적으로 발견되는 단백질에 대해 일어나는 모노클로날 항체는 일반적으로 비인간 시스템, 예컨대 마우스에서 개발된다. 이것의 직접적인 결과로, 인간에게 투여시 하이브리도마에 의해 생산되는 이종개체 항체는 이종개체의 면역글로불린의 불변 부위에 의해 주로 매개되는 원치않는 면역 반응을 일으킨다. 이것은 장기간을 투여할 수 없는 상기 항체의 사용에 명백한 제한을 가져온다. 따라서 인간에 투여될 때 실질적인 동종이계의 반응을 일으키지 않는 단일 쇄, 단일 영역, 키메릭, CDR-그래프트된, 또는 특히 인간 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기의 관점에서, 본 발명의 보다 바람직한 MCP-1 결합 분자는 적어도,

a) (ⅰ) 고가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 가변 영역 및 (ⅱ) 인간 중쇄의 불변 부위 또는 그의 단편(여기서, 상기 CDR1은 His-Tyr-Trp-Met-Ser의 아미노산 서열을 갖고, CDR2는 Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly의 아미노산 서열을 갖고, CDR3은 Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편; 및

b) (ⅰ) CDR3' 고가변 부위 및 임의의 CDR1', CDR2' 고가변 부위를 포함하는 가변 영역 및 (ⅱ) 인간 경쇄의 불편 부위 또는 그의 단편(여기서, 상기 CDR1'는 Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'는 Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'는 Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편을 포함하는 인간 항 MCP-1 항체 및 그의 직접적인 균등물에서 선택된다.

또한 본 발명의 MCP-1 결합 분자는,

a) 서열번호 1에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 고가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 영역,

b) 서열번호 2에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 고가변 부위 CDR1', CDR2' 및 CDR3' 서열을 포함하는 제2 영역 및

c) 제1 영역의 N-말단 및 제2 영역의 C-말단 또는 제1 영역의 C-말단 및 제2 영역의 N-말단에 결합된 펩타이드 링커

를 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 단일 쇄 결합 분자 및 그의 직접적인 균등물에서 선택될 수 있다.

주지된 바와 같이, 하나, 수개의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환과 같은 아미노산 서열의 작은 변화는 실직적으로 동일한 성질을 갖는 원래 단백질의 알릴(allelic) 형태에 이르게 할 수 있다.

이와 같이, 용어 "그의 직접적인 균등물"은,

(ⅰ) 고가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 1에 나타낸 고가변 부위와 전체로서 적어도 80% 상동성, 바람직하게는 적어도 90% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 상동성을 갖고;

(ⅱ) 서열번호 1에서 나타낸 것과 동일한 고가변 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3를 갖는 반면 분자 X의 것과 동일한 골격 부위를 갖는 참조 분자와 실질적으로 같은 정도로 그의 수용체에 대한 MCP-1의 결합을 저해할 수 있는,

모든 단일 영역 MCP-1 결합 분자(분자 X) 또는,

(ⅰ) 고가변 부위 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 및 CDR3'은 서열번호 1 및 2에 나타낸 고가변 부위와 전체로서 적어도 80% 상동성, 바람직하게는 적어도 90% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 상동성을 갖고;

(ⅱ) 서열번호 1 및 2에서 나타낸 것과 동일한 고가변 부위 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 갖는 반면, 분자 X'의 것과 동일한 골격 부위 및 불변 부위를 갖는 참조 분자와 실질적으로 같은 정도로 그의 수용체에 대한 MCP-1의 결합을 저해할 수 있는,

결합 부위 당 적어도 2개의 영역을 갖는 모든 MCP-1 결합 분자(분자 X')를 의미한다.

본 명세서에서, 서열이 이상적으로는 일직선으로 배열하였을 때, 아미노산 서열상의 공백이나 삽입을 동일하지 않은 잔기로 계수할 때와 유사한 입장에서 아미노산 서열이 적어도 80%의 동일한 아미노산 잔기를 갖는다면, 아미노산은 서로 적어도 80%의 상동성을 갖는다.

MCP-1의 그의 수용체에 대한 결합 저해는 본 명세서에 하기에 기술된 어세이를 포함하는 다양한 어세이에서 편리하게 측정될 수 있다. 용어 "같은 정도(to the same extent)"는 참조 및 균등한 분자가 상기에서 언급한 어세이의 하나에서 통계적 기준에서 실질적으로 동일한 MCP-1 결합 저해 곡선을 나타내는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 MCP-1 결합 분자는 상기와 같이 어세이할 때, 상응하는 참조 분자의 IC₅₀의 +/-×5 내의, 바람직하게는 실질적으로 같은, 그의 수용체(CCR2B)의 MCP-1 결합 저해에 대한 IC₅₀을 일반적으로 갖는다.

예컨대, 사용된 어세이는 예컨대, 하기 실시예에 기술되는 SPA 기술을 사용하여 막에 결합된 MCP-1 수용체(CCR2B) 및 본 발명의 MCP-1 결합 분자에 의한 MCP-1 결합의 경쟁적 저해의 어세이일 수 있다.

보다 바람직하게는, 인간 MCP-1 항체는 적어도,

a) 1번 위치의 아미노산으로 시작되고 122번 위치의 아미노산으로 끝나는 서열번호 1에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 영역과 인 간 중쇄의 불변 부위를 포함하는 하나의 중쇄; 및

b) 1번 위치의 아미노산으로 시작되고 109번 위치의 아미노산으로 끝나는 서열번호 2에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 영역과 인간 경쇄의 불변 부위를 포함하는 하나의 경쇄를 포함한다.

인간 중쇄의 불변 부위는 γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, μ, α₁, α₂, δ 또는 ε형태, 바람직하게는 γ형태, 보다 바람직하게는 γ₄ 형태일 수 있고, 인간 경쇄의 불변 부위는 κ 또는 λ형태(λ₁, λ₂ 및 λ₃ 하부형태를 포함), 바람직하게는 κ형태일 수 있다. 모든 불변 부위의 아미노산 서열은 상기 Kabat 등에 나타난다.

본 발명의 MCP-1 결합 분자는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 이 점에서, 결합 분자를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 제작되고, 적절한 제어 서열하에 놓여지고, 발현을 위해 적절한 숙주 유기체내로 도입되어야만 한다.

따라서, 매우 일반적인 방법으로,

(ⅰ) 본 발명의 단일 영역 MCP-1 결합 분자, 본 발명의 단일 쇄 MCP-1 결합 분자, 그의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편 또는 본 발명의 MCP-1 결합 분자를 코딩하는 DNA 분자 및

(ⅱ) 재조합 방법에 의해 본 발명의 MCP-1 결합 분자의 생산을 위한 본 발명의 DNA 분자의 용도를 제공한다.

선행기술의 현재 상태는 당업자라면 본 명세서에 제공된 정보, 즉, 가변 부위의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 DNA 서열로 주어진 본 발명의 DNA 분자를 합 성할 수 있다. 가변 영역 유전자를 제작하는 방법은 예컨대, EPA 239 400에 기술되어 있고, 하기와 같이 간단히 요약될 수 있다: 어떠한 특이성의 MAb의 가변 영역을 코딩하는 유전자를 클로닝한다. 골격 및 고가변 부위를 코딩하는 DNA 단편을 결정하고, 골격 부위를 코딩하는 DNA 단편을 접합점에서 적절한 제한위치에 같이 융합하기 위해 고가변 부위를 코딩하는 DNA 단편을 제거한다. 제한위치는 표준 방법에 의한 DNA 분자의 돌연변이에 의해 적절한 위치에 생성할 수 있다. 이중 나선의 합성 CDR 카세트는 서열번호 1 또는 2에서 주어진 서열에 따라 DNA 합성에 의해 제조한다. 상기 카세트는 점착성 말단을 제공하므로 골격의 접합점을 연결할 수 있다.

또한 본 발명의 MCP-1 결합 분자를 코딩하는 DNA 작제물을 얻기 위해 하이브리도마 세포주를 제조하는 것으로부터 mRNA에 접근하는 것이 반드시 필요한 것은 아니다. 이와 같이, PCT 출원 WO 90/07861호는 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 관한 기술된 정보만으로 재조합 DNA 기술에 의한 항체의 생산을 상세히 교시하고 있다. 상기 방법은 다수의 올리고뉴클레오타이드의 합성, PCR 방법에 의한 증폭 및 원하는 DNA 서열을 얻기 위한 스플라이싱을 포함한다.

적절한 프로모터 또는 중쇄 및 경쇄 불변 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 통상 시판된다. 이와 같이 본 발명의 DNA 분자만을 제조하면, 적절한 발현 벡터내로 편리하게 도입할 수 있다. 단일 쇄 항체를 코딩하는 DNA 분자는 표준 방법, 예컨대, WO 88/1649호에서 기술하는 방법에 의해 또한 제조할 수 있다.

이상의 관점에서, 하이브리도마 또는 세포주 기탁은 명세서의 충분한 기술의 기준을 충족하므로 필요가 없다.

특정 구체예에서, 본 발명은 MCP-1 결합 분자의 생산을 위한 하기에서 기술한 것과 같은 제1 및 제2 DNA 작제물을 포함한다:

제1 DNA 작제물은 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하며,

a) 골격 및 고가변 부위를 포함하는 가변 영역을 코딩하는 제1 부분(여기서, 고가변 부위는 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열이고, 이것의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타나며; 상기 제1 부분은 가변 영역의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈에서 시작하고, 가변 영역의 최종 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝난다); 및

b) 중쇄의 불변 부위의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈에서 시작하고, 그의 불변 부위 또는 단편의 최종 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나고, 종료 코돈이 이어지는 중쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분을 포함한다.

바람직하게는, 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 코딩하는 상기 제1 부분은 1번 위치의 아미노산에서 시작하고, 122번 위치의 아미노산에서 종료하는 서열번호 1에서 나타난 아미노산 서열과 실질적으로 동일하다. 보다 바람직하게는 제1 부분은 1번 위치의 뉴클레오타이드에서 시작하고, 366번 위치의 뉴클레오티드에서 종료하는 서열번호 1에서 나타난 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또한 바람직하게는, 제2 부분은 인간 중쇄의 불변 부위, 보다 바람직하게는 인간 γ4 쇄의 불변 부위를 코딩한다. 상기 제2 부분은 게놈성 기원(인트론을 포함) 또는 cDNA 단편(인트론 없음)일 수 있다.

제2 DNA 작제물은 경쇄 또는 또는 그의 단편을 코딩하며,

a) 양자 택일로 골격 및 고가변 부위를 포함하는 가변 영역을 코딩하는 제1 부분(여기서, 고가변 부위는 CDR1', CDR2' 및 CDR3'의 서열이고, 이것의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타나며; 상기 제1 부분은 가변 영역의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈에서 시작하고, 가변 영역의 최종 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝난다); 및

b) 경쇄의 불변 부위의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈에서 시작하고, 그의 불변 부위 또는 단편의 최종 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나고, 종료 코돈이 이어지는 경쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분을 포함한다.

바람직하게는, 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 코딩하는 상기 제1 부분은 1번 위치의 아미노산에서 시작하고, 109번 위치의 아미노산에서 종료하는 서열번호 2에서 나타난 아미노산 서열과 실질적으로 동일하다. 보다 바람직하게는 제1 부분은 1번 위치의 뉴클레오티드에서 시작하고, 327번 위치의 뉴클레오티드에서 종료하는 서열번호 2에서 나타난 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한 바람직하게는, 제2 부분은 인간 경쇄의 불변 부위, 보다 바람직하게는 인간 κ 쇄의 불변 부위를 코딩한다.

본 발명은 또한 하나 이상, 전형적으로는 약간의, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2' 또는 CDR3'의 잔기가 서열번호 1 및 서열번호 2에서 나타난 잔기로 예컨대 돌연변이, 예를 들어 상응하는 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이에 의해 변형된 MCP-1 결합 분자를 포함한다. 본 발명은 이와 같이 변형된 MCP-1 결합 분자를 코 딩하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상, 전형적으로는 약간의, 골격 부위의 잔기가 서열번호 1 및 서열번호 2에서 나타난 잔기로 변형된 결합 분자를 포함한다.

제1 및 제2 DNA 작제물에서, 제1 및 제2 부분은 인트론에 의해 분리될 수 있고, 인핸서가 제1 및 제2 부분사이의 인트론내에 편리하게 위치할 수 있다. 전사되지만 번역되지 않는 상기와 같은 인핸서의 존재는 전사의 효율을 도울 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 DNA 작제물은 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 유전자의 인핸서를 포함한다.

각각의 DNA 작제물은 적당한 발현 제어 서열의 조절하에, 특히 적당한 프로모터의 조절하에 위치한다. DNA 작제물이 발현을 위해 도입될 수 있는 숙주 개체에 적응될 수 있는 한 어떠한 종류의 프로모터도 사용할 수 있다. 그러나, 만약 발현을 포유세포에서 일어나도록 하는 경우, 면역글로불린 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

원하는 항체를 세포 배양물이나 형질전환 동물에서 제조할 수 있다. 바람직한 형질전환 동물은 적당한 제어 서열하에 위치한 제1 및 제2 DNA 작제물을 난자로 마이크로인젝션하여 그렇게 제조된 난자를 적당한 가임신 암컷에게 도입하고 원하는 항체를 발현하는 자손을 선별하는 것을 포함하는 표준방법에 따라 수득할 수 있다.

항체 쇄를 세포 배양물에서 제조할 때, DNA 작제물은 먼저 단일의 발현 벡터 또는 두 개의 분리되었지만 양립가능한 발현 벡터로 삽입되어야만 하며, 후자의 가 능성이 바람직하다.

따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 상기 DNA 작제물을 포함하는 원핵 또는 진핵 세포주에서 복제할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

그 후 DNA 작제물을 함유하는 각각의 발현 벡터를 적당한 숙주 개체로 도입한다. DNA 작제물을 두 개의 발현 벡터로 별도로 삽입하는 경우, 그들을 별도로, 즉 세포당 한 타입의 벡터로 도입하거나, 공동-도입할 수 있으며, 후자의 가능성이 바람직하다. 적당한 숙주 개체는 세균, 효모 또는 포유세포주일 수 있으며, 후자가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 포유세포주는 림프 기원이며, 예를 들어 편리하게는 내생성 항체 중쇄 또는 경쇄를 발현하지 않는 마이엘로마, 하이브리도마 또는 보통의 불멸화된 B-세포, 예를 들어 SP2/0 세포주이다.

포유세포에서의 발현을 위하여 MCP-1 결합 분자 코딩 서열을 숙주세포 DNA로 MCP-1 결합 분자의 높은 수준의 발현을 허용하거나 선호하는 위치내로 도입하는 것이 바람직하다. MCP-1 결합 분자 코딩 서열이 그러한 선호하는 위치로 도입된 세포를 그들이 발현하는 MCP-1 결합 분자의 수준에 기초하여 동정하고 선별할 수 있다. 어떠한 적당한 선별마커도 MCP-1 결합 분자 코딩 서열을 함유하는 숙주 세포를 제조하기 위해 사용할 수 있으며; 예를 들어 dhfr 유전자/메토트렉세이트 또는 균등한 선별 시스템을 사용할 수 있다. 본 발명의 MCP-1 결합 분자의 발현 시스템은 EP 0256055B, EP 0323997B 및 유럽특허출원 89303964.4에 기재된 것들과 같은 GS-기초 증폭/선별 시스템을 포함한다.

본 발명의 추가 측면에서 (ⅰ) 상기한 바와 같은 발현벡터로 형질전환된 개 체를 배양하고 (ⅱ) 배양물로부터 MCP-1 결합 분자를 회수하는 것을 포함하는 MCP-1 결합 분자의 제조방법이 제공된다.

가장 바람직하게는 본 발명의 MCP-1 결합 분자는 인간 항체, 예를 들어 AAV293, AAV294 또는 ABN912 항체이며, 상응하는 하이브리도마 세포주의 배양에 의하거나, 바람직하게는 항체 이소타입 또는 다른 항체 기능 또는 성질을 변형하도록 변형된 DNA를 포함하여, 인간 항체를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 세포주로부터 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면 AAV294 및 더욱 특히 AAV293 및 ABN912 항체가 재조합 인간 에오탁신-1과 교차반응하는 것이 밝혀졌다. 이와 같이 이들 항체는 우수하게도 에오탁신-1 및 MCP-1과 상호작용하고, MCP-1의 그의 수용체에 대한 결합을 저해할 뿐 아니라 에오탁신-1의 그의 수용체에 대한 결합을 저해하는데 사용될 수 있다. 에오탁신 분비는 천식과 같은 알레르기성 및 염증성 기도 질환을 포함하는 알레르기 질환 및 장애에 연루되어 있다. MCP-1 및 에오탁신, 예를 들어 인간 MCP-1 및 인간 에오탁신 모두에 대해 결합 특이성을 갖는 항체, 특히 키메라 및 CDR-그래프트된 항체 및 특히 인간 항체는 및 그러한 항체의 MCP-1 또는 에오탁신 매개된 질환의 치료를 위한 용도는 본 발명의 범위내에 포함된다.

따라서 추가 측면에서 본 발명은 에오탁신과 교차반응하는 MCP-1에 대한 항체를 포함한다.

우수하게도 본 발명의 이 측면의 항체는 MCP-1의 그의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있고 에오탁신의 그의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는 항체이다.

또다른 추가 측면에서 본 발명은

ⅰ) MCP-1- 또는 에오탁신-매개된 질환 또는 장애 치료를 위한, MCP-1 및 에오탁신의 그의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는 에오탁신과 교차반응하는 MCP-1에 대한 항체의 용도;

ⅱ) 에오탁신과 교차반응하고 MCP-1 및 에오탁신의 그들의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는 MCP-1에 대한 항체를 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 MCP-1- 또는 에오탁신-매개된 질환 또는 장애의 치료방법;

ⅲ) 에오탁신과 교차반응하고 MCP-1 및 에오탁신의 그들의 수용체에 대한 결합을 저핼 수 있는 MCP-1에 대한 항체를, 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물; 및

ⅳ) MCP-1 또는 에오탁신-매개된 질환 또는 장애 치료용 약제 제조를 위한, 에오탁신과 교차반응하고 MCP-1 및 에오탁산의 그들의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는 MCP-1에 대한 항체의 용도를 포함한다.

이들 추가 측면에서 MCP-1 항체는 바람직하게는 에오탁신-1과 교차반응하고 에오탁신-매개된 질환은 바람직하게는 에오탁신-1-매개된 질환이다.

본 설명을 위해 항체가 MCP-1 및 에오탁신의 그들의 수용체에 대한 결합을 AAV294, AAV293 또는 ABN912 항체와 같은 정도로 실질적으로 저해할 수 있으면 항체는 "MCP-1 및 에오탁신의 그들의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는" 것이며, "동일한 정도"는 상기와 같은 의미를 갖는다.

본 설명에서 구 "MCP-1 매개된 질환" 및 "에오탁신-매개된 질환"은 MCP-1 또 는 에오탁신, 특히 에오탁신-1이 질환이나 이상의 발병, 진전, 경과, 지속 또는 병리를 포함하여, 질환 또는 의학적 이상에 직간접적인 역할을 하는 모든 질환 및 의학적 이상을 포함한다.

본 설명에서 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 질환에 감염될 위험이 있거나 질환에 감염된 것으로 의심되는 환자 및 질환 또는 의학적 이상을 앓거나 그로부터 고통받는 것으로 진단된 환자의 치료를 포함하여, 예방 또는 방지적 처치 및 치료 또는 질환 완화 처치를 가리키며, 임상적 재발의 억제를 포함한다.

AAV293 및 ABN912 항체는 항-MCP-1 항체, 예를 들어 항 인간 MCP-1 항체에 대해 이전에 보고된 친화도 보다 더 높은 MCP-1에 대한 결합 친화도를 갖는다. 따라서 ABN912는 MCP-1 결합에 대해 약 50 pM 미만, 예를 들어 약 43 pM의 해리 평형 상수 K_D를 갖는다. 이러한 높은 결합 친화도는 ABN912가 특히 치료적 적용에 적당하게 한다.

따라서 또다른 추가 측면에서 본 발명은 약 50 pM 이하의 MCP-1에 대한 결합에 대한 K_D를 갖는 MCP-1에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 이 측면은 에오탁신과 교차반응하는 MCP-1에 대한 항체에 대해 상기한 바와 같이, 그렇게 높은 친화성 항체에 대한 용도, 방법 및 조성물을 포함한다.

더욱이 본 발명에 따르면 ABN912 항체가 MCP-1의 24번 위치에 있는 아르기닌 잔기를 포함하는 MCP-1의 항원성 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 우수하게도 ABN912 항체는 MCP-1의 그의 수용체(CCR2B)와의 결합을 직접적으로 방 해할 수 있고; Arg24는 MCP-1의 CCR2B에 대한 결합을 위해 MCP-1의 중요한 잔기이다. 또한 ABN912 결합 위치는 MCP-1의 Arg18 및 Lys49 잔기를 포함한다.

따라서 또다른 추가 측면에서 본 발명은 MCP-1의 24번 위치에 있는 아르기닌 잔기를 포함하는 MCP-1의 항원성 에피토프에 결합하는 MCP-1의 항체를 포함한다. 바람직하게는 항원성 에피토프는 또한 MCP-1의 18번 위치의 아르기닌 잔기 및 49번 위치의 라이신 잔기를 포함한다. 유사하게 본 발명의 이 측면은 에오탁신과 교차반응하는 MCP-1에 대한 항체에 대해 상기한 바와 같은 용도, 방법 및 조성물을 포함한다.

상기 정의된 MCP-1 결합 분자, 특히 본 발명의 제1 및 제2 측면에 따른 MCP-1 결합 분자; 에오탁신과 교차반응하는 MCP-1에 대한 항체, 특히 MCP-1 및 에오탁신의 그들의 수용체에 대한 결합을 저해할 수 있는 항체; 약 50 pM 이하의 MCP-1 결합 KD를 갖는 MCP-1에 대한 항체; MCP-1의 24번 위치에서 아르기닌 잔기를 포함하는 MCP-1의 항원성 에피토프에 결합하는 MCP-1의 항체는 이하 "본 발명의 항체"라 언급한다.

바람직하게는 본 발명의 항체는 본 발명의 제1 및 제2 측면에 따른 MCP-1 결합 분자이다. 우수하게도 본 발명의 항체는 인간 항체, 가장 바람직하게는 ABN912 항체 또는 그의 직접적 균등물이다.

본 발명의 항체는 MCP-1의 그의 표적 세포에 대한 영향을 저해하고 따라서 MCP-1 매개된 질환 및 장애의 치료를 위해 사용된다. 본 발명의 항체의 이들 및 기타 약리학적 활성은 예를 들어 하기하는 바와 같은 표준 시험 방법에서 증명될 수 있다:

1. CCR2B 발현 세포에 대한 MCP-1 결합의 저해

MCP-1의 신호도입 및 이펙터 기능을 위한 예비조건은 그의 수용체 CCR2B와의 상호작용이다. 섬광 접근 어세이(SPA) 기술을 본 발명의 항체가 이 수용체를 발현하는 세포막에 대한 MCP-1 결합을 저해하는 것을 증명하기 위하여 사용한다.

CCR2B 발현 CHO 세포의 막을 농도 범위(예를 들어 10^-14 M 내지 10^-8 M)의 표적 항체와 함께 배양하고 (125-I)-MCP-1의 잔존 결합을 밀 싹 아글루티닌 비드를 이용하여 SPA에 의해 측정한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이 어세이에서 시험할 때 약 0.1 내지 약 10 nM 범위, 특히 약 0.5 nM(예를 들어 461±206 pM)의 IC₅₀을 갖는다.

2. MCP-1 매개된 신호도입의 저해

본 발명의 항체가 MCP-1에 의해 유발되는 생리학적 영향을 저해하는 잠재력을 MCP-1 유도된 세포내 Ca²⁺ 이동을 항체 존재 및 부재하에 측정함으로써 결정한다.

칼슘 반응의 측정을 안정하게 형질감염된 CCR2B 발현 CHO 세포주 및 THP-1 세포로 형광 염료 및 실시예에서 이후 기재하는 바와 같은 FACS 분석을 이용하여 수행한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이 어세이에서 시험할 때 약 0.05 내지 약 10 nM 범위, 특히 약 0.05 nM(예를 들어 390±20 pM)의 IC₅₀을 갖는다.

본 발명의 항체는 우수하게도 에오탁신, 특히 에오탁신-1과 교차반응하고 따라서 우수하게도 에오탁신의 그의 표적세포에 대한 영향을 저해할 수 있으며 따라서 추가로 에오탁신 매개된 질환 및 장애 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체의 교차반응성은 BIAcore?(Karlsson et al. J. Immunol. Meth. 1991; 145: 229-240)와 같은 광학적 바이오센서 기술을 이용하여 결정될 수 있다.

상기 어세이에서 지적된 바와 같이 본 발명의 항체는 MCP-1의 영향을 강력하게 차단하며 바람직하게는 에오탁신과 교차반응한다. 따라서 본 발명의 항체는 하기와 같은 약제학적 유용성을 갖는다:

본 발명의 항체는 MCP-1 또는 에오탁신 매개된 질환 또는 의학적 이상의 예방 및 치료에 유용하다. MCP-1은 백혈구 통행, 특히 단핵구의 염증 부위로의 이동에서 중요한 역할을 하며 따라서 본 발명의 항체는 단핵구 이동을 저해하는데, 예를 들어 염증성 이상, 알레르기 및 알레르기성 이상, 자가면역 질환, 이식편 거부, 백혈구 침윤을 수반하는 암, 협착증 또는 재협착증, 동맥경화증, 류마티스성 관절염 및 골관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체로 치료될 수 있는 질환 또는 이상은

천식, 알레르기성 비염, COPD, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 간질성 폐 질환(ILD)(예를 들어 특발성 폐 섬유증, RA, SLE 등과 같은 자가면역 질환과 관련된 ILD); 아나필락시스 또는 과민성 반응, 약물 알레르기(예를 들어, 페니실린 또는 세팔로스포린에 대한) 및 곤충 침 알레르기; 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장질환; 척추관절염, 경피증; 건선 및 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르 기성 접촉 피부염, 담마진과 같은 염증성 피부질환; 혈관염;

자가면역 질환, 특히 관절염(예를 들어 류마티스성 관절염, 만성 관절염, 건선성 관절염 및 변형성 관절염) 및 염증성 이상 및 골 손실, 염증성 동통, 과민성(기도 과민성 및 피부 과민성 모두 포함) 및 알레르기를 수반하는 류마티스성 질환을 포함하는, 류마티스성 질환과 같은 염증성 성분을 포함하는 병인을 갖는 자가면역 질환을 포함한다.

본 발명의 항체가 사용될 수 있는 특정 자가면역 질환은 자가면역 혈액 질환(예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수한 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증을 포함), 전신성 홍반성 낭창, 다발성 연골염, 경피증, 베게너 육아종, 피부근염, 만성 활동성 간염, 근무력증, 건선, 스티븐-죤슨 증후군, 특발성 스프루우, 자가면역 염증성 장질환(예를 들어 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 대장 증상을 포함), 자가면역 갑상선염, 베셋병, 내분비성 안과질환, 그레이브스 질환, 유육종증, 다발성 경화증, 원발성 담도성 간경변, 연소성 당뇨병(진성 당뇨병 타입 Ⅰ), 포도막염(전방 또는 후방), 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 및 사구체신염(예를 들어 특발성 신증후군 또는 최소 변화 신장질환을 포함하는 신증후군을 갖거나 갖지 않는);

알로그래프트 거부 또는 제노그래프트 거부를 포함하는 이식편 거부(예를 들어 심장, 폐, 결합된 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 안구 이식편) 또는 이식편-대-숙주 질환 및 기관 이식 연관된 동맥경화증;

죽상동맥경화증;

피부 또는 기관의 백혈구 침윤이 있는 암;

혈관 개입 및 신내막 증식증으로 인한 협착증 또는 재협착증을 포함하는, 혈관 특히 동맥, 예를 들어 관상동맥의 협착증 또는 재협착증;

및 재관류 손상, 용균성 질환, 사이토카인 유도된 독성(예를 들어 폐혈성 또는 내독성 쇼크), 다발성 근염, 피부근염, 및 유육아종을 포함하는 육아종 질환을 포함하는 염증성 반응이 관여하는 다른 질환 또는 이상을 포함한다.

본 발명의 항체는 골관절염, 골다공증 및 기타 염증성 관절질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 및 연령-관련된 골 손실을 포함하는 일반적인 골 손실 및 특히 치주 질환을 포함하는 골 및 연골 대사 질환을 치료하는데 특히 유용하다.

상기 적응증을 위하여, 적당한 용량은 물론 사용하는 본 발명의 특정 항체, 숙주, 투여방식 및 치료되는 증상의 성질 및 중증도에 따라 변화한다. 그러나, 예방적 사용시, 일반적으로 체중 킬로그램당 약 0.05 ㎎ 내지 약 10 ㎎, 더욱 통상적으로 체중 킬로그램당 약 0.1 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 용량으로 만족스런 결과를 얻을 수 있는 것으로 나타난다. 예방적 사용의 투여 빈도는 보통 1주에 약 1회 내지 3개월에 약 1회, 더 보통 약 2주에 1회 내지 10주에 1회, 예를 들어 4 또는 8주에 1회 범위에 있다. 본 발명의 항체는 편리하게는 비경구로, 정맥내로, 예를 들어 주전(antecubital) 또는 기타 말초 혈관으로, 근육내로, 또는 피하로 투여된다. 예를 들어, 예방적 처치는 전형적으로 본 발명의 항체를 한달에 한번 내지 2 내지 3달에 한번 또는 그 보다 덜 자주 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 방식으로 제조될 수 있다. 본 발명 에 따른 조성물은 바람직하게는 동결건조 형태로 제조된다. 즉시 투여를 위해 적당한 수성 담체, 예를 들어 주사용 멸균수 또는 멸균 완충 생리식염수에 용해된다. 볼루스 주사로서 보다 주입에 의한 투여를 위해 더 큰 용량의 용액을 제조하는 것이 바람직하다고 여겨지는 경우, 제형화시 인간 혈청 알부민이나 환자 자신의 헤파린 처리된 혈액을 염수로 도입하는 것이 바람직하다. 과량의 그러한 생리학적 불활성 단백질의 존재는 주입 용액과 함께 사용되는 용기와 튜빙의 벽으로의 흡착에 의한 항체의 손실을 방지한다. 알부민을 사용하는 경우, 적당한 농도는 염수 용액의 0.5 내지 4.5중량%이다.

본 발명은 하기 실시예에서 수반 다이어그램을 참조로 하여 설명 목적으로만 추가로 기재된다:

도 1

A - 처리 및 무처리 붉은털 원숭이로부터의 다양한 펀치 생검에 대한 호산구과산화효소(EPO) 활성을 보여주는 그래프;

B - 생검에 대한 골수과산화효소(MPO) 활성을 보여주는 유사한 그래프;

도 2 - ABN912 및 CGP44290(대조 항체) 처리전후의 붉은털 원숭이로부터의 조직 샘플에 대한 호산구 염색을 보여주는 사진;

도 3 - 다양한 처리 섭생에 대한 인간 피부 이식편에서 Th 세포 이동(%)을 보여주는 그래프; 및

도 4 - MCP-1에 대한 결합에 대한 ABN912 돌연변이의 상대적 결합 친화도를 보여주는 그래프.

쥐 면역글로불린 레파토리 대신에 인간 IgG/κ 레파토리를 발현하도록 조작된 형질전환 마우스(Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851)를 사용하여 인간 MCP-1에 대한 항체를 생성시킨다. 이들 마우스로부터의 B 세포를 표준 하이브리도마 기술에 의해 불멸화하고 인간 IgG3/κ 항체 AAV293을 분비하는 쥐 하이브리도마 세포를 얻는다.

실시예 1 : 마우스의 면역화 및 하이브리도마 세포주의 생성

면역화

4개의 메다렉스 마우스(마우스 번호 16194-16197, 메다렉스 인크. 애난데일, NJ, USA)를 재조합 인간 MCP-1(R&D 시스템즈, 미니아폴리스, MN, USA)을 0 및 14 일(i.p.) 및 26 일(i.v.)에 완전 프로인트 애쥬번트중에 마우스당 100 ㎍ 단백질로 면역화한다. 41 일에 아무 마우스도 검출가능한 혈청 항체를 나타내지 않는다. 마우스를 rhMCP-1으로 49 및 65 일에 불완전 프로인트 애쥬번트중에 s.c.로 마우스당 100 ㎍ 단백질로 추가 면역화한다. 106 일에 어세이할 때, 실질적인 항-MCP-1 항체 역가가 한 마리의 마우스(마우스 No. 16194)에서 검출된다. 이 마우스를 융합후 7 회 더 추가접종한다: 106(i.p.), 119(s.c.) 및 135(i.p.) 일에 염수중 마우스당 100 ㎍ 단백질 및 융합전 -4(×2-i.v. 및 i.p.) 및 -3 및 -2(둘 다 i.p.) 일에 염수중에 마우스당 25 ㎍ 단백질.

융합 및 하이브리도마 선별

융합 당일에 마우스 16194를 CO₂ 흡입에 의해 죽이고 총 지라 세포(4.8×10⁷)를 마우스 골수 세포주, PAI-O 세포(5×10⁷)를 갖는 PEG4000을 이용하여 통상의 방법에 의해 융합한다. 융합 세포를 RPMI1640, 10% 열 불활성화된 송아지 태아 혈청, 5×10^-5 M β-머캅토에탄올, 50 ㎍/㎖ 겐타마이신 함유 HAT에서 마우스 복강 세포(Balb/c 마우스)의 피더 층을 함유하는 720 웰에 플레이트한다(1 ㎖/웰). 배양 배지를 4 일마다 교환하고 14 일후 HAT 배지를 아미노프테린이 생략된 HT 배지로 교환한다. 플레이트된 최초 720 웰중, 461 웰(64%)이 하이브리도마 증식에 대해 양성이다. 상등액을 모으고 ELISA에서 MCP-1 반응성 모노클로날 항체에 대해 스크리닝한다. IgG 서브클래스의 7 개의 모노클로날 항체가 확인된다. 클로닝을 4×96 웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 웰당 0.5 세포/100 ㎕를 플레이팅하여 수행한다. 클론을 8 일후 현미경으로 확인하고, 100 ㎕의 증식 배지를 첨가하고 다음 날 상등액을 ELISA로 시험한다. 가장 반응성이 큰 하이브리도마, 클론 149를 추가 클로닝 및 특성분석을 위해 선별한다. 하이브리도마 서브클론 149-12를 IgG3/κ 모노클로날 항체 산물, AAV293의 rhMCP-1 의존성 칼슘 대사 어세이에서의 저해 활성에 기초하여 선별한다.

중쇄 및 경쇄의 순도 및 부분 아미노산 서열

아미노산 서열분석

정제된 항체 AAV293의 경쇄 및 중쇄를 SDS-PAGE에 의해 분리하고 아미노-말단 아미노산을 에드만 분해에 의해 결정한다. 중쇄 및 경쇄 가변성 영역을 코딩하 는 cDNA 서열은 클론된 하이브리도마 세포로부터의 mRNA로부터 수득된 cDNA의 PCR 증폭에 의해 수득하고 전체 서열분석한다. 중쇄 및 경쇄 가변성 영역의 아미노-말단 아미노산 서열 및 상응하는 DNA 서열을 하기 서열번호 1 및 2에 나타내었고, CDRs를 굵은 글씨로 나타내었다.

서열번호 1

서열번호 2

추가의 항-MCP-1 모노클로날 항체, IgG1/κ 모노클로날 항체 산물, AAV294를 상기한 바와 같이 수득한다. 이 항체는 AAV293 항체에 비해 약 3-배 낮은 친화도로 MCP-1과 결합하고, V_HAAV294가 24번 위치에 Ala 대신 Val, 60번 위치에 Tyr 대신 Phe을, 74번 위치에 Asn 대신 Ser을 갖고, V_LAAV294가 30번 위치에 Ser 대신 Tyr을 69번 위치에 Pro 대신 Thr을 갖는 점을 제외하고는, AAV293 항체와 동일한 V_H 및 V_L 아미노산 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.

중쇄 및 경쇄를 위한 발현 벡터 제작

클로닝된 VL 및 VH 코딩 서열을 PCR로 증폭시키고 적절한 제한 위치를 통해 면역글로불린 프로모터, RFT2 항체로부터의 리더 서열(Heinrich et al.(1989) J. Immunol. 143, 3589-97), J-단편의 일부 및 스플라이스 공여체 위치를 제공하는 카세트 벡터로 삽입하였다. 전체 V_L 부위, 프로모터 및 분비를 위한 리더 서열을 함유하는 경쇄 카세트를 인간 Cκ 유전자, 면역글로불린 중쇄 인핸서, 및 메토트렉세이트(MTX)에 의한 선별을 위한 변형된 쥐 dhfr cDNA를 함유하는 발현 벡터로 도입하였다.

중쇄 카세트를 따라서 인간 IgG4 유전자, 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 선별을 위한 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 발현 벡터로 도입하였다.

중쇄 및 경쇄는 모두 고수준 발현을 위한 단서가 되는 것으로 교시된 재배열된 면역글로불린 유전자의 게놈 형상과 유사한 발현 벡터에서의 형상을 갖는다.

항체 생산을 위해 상기 벡터를 적절한 숙주세포주, 예를 들어 SP2/0 세포주로 공동-형질감염시킨다. 벡터 서열을 함유한 세포를 메토트렉세이트 선별에 의해 선별하고, 선별된 세포주를 배양하여 ABN912 항체(인간 IgG4/κ 항-인간 MCP-1 항체)를 발현시킨다.

NVP-ABN912의 중쇄 및 경쇄 유전자를 각각 운반하는 발현 벡터를 선형화하고 SP2/0 세포를 전기천공에 의해 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 송아지 태아 혈청(FCS)을 함유하는 비-선택적 RPMI 배지에서 20 시간동안 증식시키고 G418 선별을 1.4 ㎎/㎖에서 48-72 시간동안 적용하였다. 형질감염된 풀을 통상 사용하는 첨가제(피루베이트, 글루타민, 인간 혈청 알부민, 트랜스페린, 인슐린)를 함유하는 FCS-결핍 RPMI 배지에 적응시켰다. 고생산 클론을 200 nM 및 1 μM의 메토트렉세이트로 2단계 증폭후 분리하였다. 클론과 서브클론의 생산 안정성을 부가적인 스피너 실험을 갖는, 4-5개월의 연속 배양기간에 걸쳐 T175 배양물에서 측정하였다. 고생산 클론에 대하여 실험실-규모에서 생물반응기 배양으로 스케일-업을 수행하였다. ABN912 생산에 유용한 몇몇 고생산 세포주를 수득하였다. 증식 배양물에서 수득된 축적된 산물의 최대량은 504 ㎎/ℓ였다.

실시예 2 : 생화학적 및 생물학적 데이터

인간 모노클로날 항체 ABN912는 인간 MCP-1에 결합하고 시험관내에서 그의 기능을 중화시킨다. 모노클로날 항체를 두 독립적인 생화학적 방법, Biacore 분석 및 섬광 근접 어세이(SPA) 분석에 의해 재조합 인간 MCP-1에 대한 그의 결합에 대해 추가로 특성을 규명한다. 다른 CC-케모카인 또는 비인간 MCP-1에 대한 ABN912 항체의 특이성을 BIAcore에 의해 측정하고 ABN912에 의해 CCR2B를 발현하는 세포에 대한 MCP-1의 결합 저해를 SPA에 의해 입증한다. 재조합 및 천연 생산 MCP-1에 대한 ABN912의 생물학적 활성은 CCR2B를 발현하는 세포에서 Ca²⁺ 이동화 어세이에서 입증된다. 그의 천연 표적 세포, 인간 말초혈액 단핵구(hPBMC)에 대한 ABN912의 활성은 MCP-1 유도된 화학주성 어세이에 의해 증명된다.

2.1 BIAcore 분석

고정화된 ABN912에 대한 재조합 인간 MCP-1의 결합의 결합 및 해리 속도 상 수를 BIAcore 분석에 의해 결정하고 K_D 값을 도출한다. ABN912를 센서칩 표면에 고정시키고 재조합 MCP-1의 결합을 표면 플라스몬 공명(BIACORE 2000 인스트루먼트 핸드북, 1999. 3.(버전 AC); http: www.biacore.com)에 의해 측정한다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.

ABN912는 매우 높은 친화도로 재조합 인간 MCP-1과 결합한다.

2.2 케모카인 선택성 및 종 특이성 프로파일

ABN912와 MCP-1의 상호작용의 특이성을 결정하기 위하여, 많은 비인간 MCP-1 및 CC-케모카인을 그들이 ABN912와 상호작용하는 능력에 대해 BIAcore에 의해 측정한다.

2.2.1 비-영장류 MCP-1과의 상호작용

실험실에서 통상적으로 사용되는 종으로부터의 일련의 MCP-1을 ABN912 항체에 대한 결합에 대해 측정한다. 5 nM 케모카인 용액을 ABN912로 미리 로딩되어 있는 BIAcore 플로우셀로 주사하여 측정을 수행한다. 8 분후 결합된 케모카인 양을 조사된 각각의 케모카인에 대해 측정한다. 얻어진 결과를 재조합 인간 MCP-1(100%)와 비교한 각각의 케모카인의 퍼센트 결합으로서 하기 표에 나타내었다.

ABN912는 인간 MCP-1에 특이적이며 시험된 어떤 다른 종의 MCP-1과도 교차반응하지 않는다.

2.2.2 재조합 케모카인과의 상호작용

ABN912의 다른 CC-케모카인과의 교차반응성을 결정하기 위하여, 항체에 대한 그들의 결합 능력을 상기한 과정에 의해 측정한다. 재조합 인간 MCP-1과 비교한 각각의 케모카인의 퍼센트 결합을 하기 표에 나타내었다.

ABN912는 인간 MCP-1에 특이적이며 MCP-2, MCP-3, MCP-4, LEC, RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β와 교차반응하지 않지만, 인간 에오탁신, 즉 인간 에오탁신-1과는 유의하게 교차반응한다. AAV294 또한 에오탁신과 유의하게 교차반응하는 것으로 확인된다.

2.3 CCR2B 발현 세포에 대한 MCP-1 결합 저해

SPA(섬광 근접 어세이) 기술을 이용하여 ABN912 항체가 MCP-1이 CCR2B 수용체를 발현하는 세포막에 결합하는 것을 방지하는 것을 보여준다. CCR2B 발현 CHO 세포(CHO#84-하기 참조)의 막을 농도 범위의 ABN912(10^-14 M 내지 10^-8 M)로 인큐베이션하고 방사성(125-I)-MCP-1의 잔여 결합을 밀 싹 아글루티닌 비드를 사용하여 SPA에 의해 측정한다. 3개의 독립된 실험으로부터 얻은 평균 IC₅₀[M]은 (461±206)×10^-12이다. ABN912는 MCP-1이 CCR2B 수용체를 발현하는 세포막에 결합하는 것을 방지한다.

2.4 MCP-1 매개된 신호도입의 저해

MCP-1 유도된 신호도입의 초기 현상은 형광 염료를 사용하여 측정할 수 있는 세포내 Ca²⁺의 이동이다.

칼슘 반응의 측정을 케모카인 수용체 CCR2B를 발현하도록 안정하게 형질감염된 CHO 세포주인 세포주 CHO#84를 이용하여 수행한다. CHO#84 세포를 10% 투석된 FCS, 200 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 및 선별 시약으로서 80 nM 메토트렉세이트를 함유하는 무-리보뉴클레아제 및 데옥시리보뉴클레아제, 및 글루타맥스-1 함유 MEM 알파 배지에서 배양한다. 세포 배양물이 컨플루언스전에 탁해졌을 때, 세포를 PBS로 세척하고 트립신-EDTA로 단시간(최대 1 분) 인큐베이션하여 탈리시킨다.

CHO#84 세포를 RPMI에서 250 g로 7 분간 원심분리하여 세척하고 0.04% 플루론산, 1.0 μM 퓨라 레트 및 0.3 μM 플루오-3 함유 Hepes 완충액 0.5% BSA에서 3.5×10⁶ 세포/㎖로 재현탁한다. 세포를 이들 형광 칼슘 프로브로 1 시간동안 실온의 암소에서 때때로(6-8 회) 부드럽게 교반하면서 로딩한다. 그 후 세포를 원심분리에 의해 Hepes 완충액 0.5% BSA에서 2회 수획하고, 침전물을 Hepes 완충액 0.5% BSA에 1.5 내지 2×10⁶ 세포로 재현탁한다. 세포는 이제 자극과 칼슘 측정을 위한 준비가 되었으며 사용시까지 실온의 암소에서 저장한다.

항체와 케모카인(MCP-1, R&D 시스템즈, 미니아폴리스, MN, USA)을 20배 농도 용액으로 제조하고 세포에 첨가하기 전에 실온에서 5-8 분동안 혼합한다. 녹색 및 적색 형광을 플로우 사이토미터(FACS, 벡톤 딕킨슨)로 시간에 대하여 측정한다. 각각의 세포 샘플에 대하여, 기저 값을 얻기 위하여 먼저 형광 Ca-프로브로 예비로딩된 세포의 형광을 15 초동안 기록한다. 데이터 획득을 간단하게 방해하여 작은 부피의 자극원(항체가 있거나 없는 케모카인의 10배 농축물)을 첨가하여 세포를 자극하고 형광 측정을 회복한다. 총 형광 측정은 51 초간 지속된다.

사용된 Ca²⁺ 지시제는 칼슘과 결합시 형광 강도에서 상호 쉬프트를 나타낸다: 플루오-3 형광은 증가하는 반면, 퓨라 적색 형광은 감소한다. 각각의 실험에 대해, 적색 및 녹색 형광을 기록하고 녹색과 적색 형광의 비율을 계산하고 시간 대비 플랏팅한다. "기저 비율"과 "자극 비율"을 각각 자극 직전에 얻은 비율의 평균값과 자극후 얻은 최대 비율의 평균값으로 정의된다. 반응의 강도를 "자극 비율"÷"기저 비율"로 주어지는 자극 지수(S.I.)에 의해 정량화한다. 항체 존재하에 얻은 자극 지수를 용매 단독 존재하에 얻은 S.I.의 퍼센트로서 표현한다.

용매 S1에 용해된 항체 A1의 저해(%)는 하기 식에 의해 주어진다:

100-[(S.I._A1×100)/S.I._s1]

ABN912에 의한 저해를 전구체 항체, AAV293 및 관련성이 없는 상업적으로 입수가능한 항-MCP-1 쥐 항체(R&D 시스템즈)의 것과 비교한다. 또한 AAV293을 생성시키기 위해 사용된 면역원은 E. coli로부터의 글리코실화되지 않은 재조합 인간 MCP-1이었으므로, TNFα-자극 HUVECs(인간 제대정맥 내피 세포)으로부터의 MCP-1 상등액을 또한 CHO#84 세포를 자극하는데 사용하고 ABN912의 Ca²⁺ 대사에 대한 길항 효과를 상기한 바와 같이 측정한다. 얻어진 결과를 하기 표에 나타내었다.

ABN912는 CHO#84 세포에서 E. coli 유래되고 HUVEC 유래된 MCP-1 모두에 대해 유사한 강도로 MCP-1 유도된 Ca²⁺ 대사를 저해한다.

2.5 MCP-1 유도된 화학주성의 저해

MCP-1의 hPBMC(인간 말초혈액 단핵구 세포)에 대한 화학주성 효과를 저해하는 ABN912의 능력을 보이덴 챔버 기초 화학주성 어세이에서 측정한다. HPBMC를 Lymphoprep™으로 제조하고 ㎖당 2×10⁶ 단핵구를 인풋으로 사용한다. ABN912 또는 관련성이 없는 항체(음성 대조)를 챔버의 하부 및 상부 구획에 지시된 몰비로 가한다. 화학주성을 5.7 nM 재조합 인간 MCP-1 또는 1 nM fMIFL(음성 대조)로 하부 챔버에서 유도한다. 세포를 실온에서 90 분동안 상부 챔부로부터 하부 챔버로 이동하도록 허용한다. 이동한 세포의 수를 염색과 계수에 의해 결정한다. ABN912가 hPBMCs의 MCP-1 유도된 화학주성을 용량 의존적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다. MCP-1 유도된 화학주성에 대한 ABN912의 영향은 특이적이다; 비관련된 항체는 영향을 미치지 않으며 ABN912는 fMIFL 유도된 화학주성에는 영향을 미치지 않는다.

2.6 붉은털 원숭이에서 백혈구 유출의 저해

이 기계적 모델을 사용하여 백혈구의 붉은털 원숭이 피부로의 MCP-1 유도된 백혈구 유출이 i.v. 볼루스 주사로 주어졌을 때 NVP-ABN912에 의해 저해될 수 있는지 여부를 시험하였다.

백혈구 수를 촉진하고 내피세포가 최적의 백혈구 모집을 할 수 있도록 수컷 성체 붉은털 원숭이를 30 ㎍/㎏ IL-3로 13 일간 주사하였다(하루에 2회, i.v.). 13 일에 원숭이를 마취시키고 MCP-1(10 ㎍)을 유방과 복부의 우측에 피부내로 삼중으로 주사하였다. 4 시간후, 원숭이를 다시 마취시키고 MCP-1 주사 위치로부터의 펀치 생검을 채취하였다. 그 후 NVP-ABN912 또는 인간 암배항원에 대한 이소타입 매치된 인간화 음성 대조 항체(CGP44290)를 i.v. 볼루스 주사로서 5 ㎎/㎏ 용량에 도달하도록 투여하였다. 마지막으로, MCP-1(10 ㎍)을 유방과 복부의 좌측에 피부내로 삼중으로 주사하였다. 이들 주사 위치를 이전의 주사 시리즈에 대해 대칭적으로 위치시켰다. 4 시간후, 원숭이를 마취시키고 MCP-1 주사 위치로부터의 펀치 생검을 채취하였다. 그 후 모든 펀치 생검을 절반으로 잘라 절반을 효소 분석을 위해 액체 질소에서 동결시켰다. 나머지 절반을 이후의 조직학을 위해 포르말린에 보존하였다. 호산구와 호중구의 효소 어세이는 각각 호산구과산화효소(EPO) 활성과 골수과산화효소(MPO) 활성이었다. PBS 주사와 세포 침윤을 자극하는 주사를 하지 않은 대조들을 각각의 원숭이에 대해 병행하여 수행하였다. 유의한 항체 매개 된 효과가 대조에서는 관찰되지 않았다.

각각 NVP-ABN912 및 CGP44290(IgG4, 이소타입 매치된 음성 대조)으로의 처리 전후 MCP-1 주사 위치에서의 효소 활성을 평균±SD로 나타내었다. 다중 주사 위치(3)을 각각의 조건에 대한 모든 원숭이에 대해 사용하였다. 두 개의 독립적으로 진행된 실험의 결합된 데이터를 도 1에 나타내었다. A-호산구 유출 및 도 1B 호중구 유출.

항체 처리전(MCP-1 무처리, 100%)과 후 정상화된 EPO(A) 또는 MPO(B) 활성을 평균±SD로 나타내었다.

백혈구 유출을 10 ㎍ MCP-1에 의해 붉은털 원숭이에서 유도할 때, 항체 처리전 백혈구 유출과 비교하여 NVP-ABN912 존재하에 85.5% 호산구 및 81.4% 호중구 유출의 저해가 관찰되었다. 양 세포 타입에 대해 단지 약 20%의 저해만이 CGP44290을 적용하였을 때 측정되었다. PBS 주사 단독이 10 ㎍ MCP-1으로 나타난 반응의 13.0%(호산구) 및 22.7%(호중구)의 모집을 나타낸 것을 고려하면, NVP-ABN912 투여가 백혈구 유출량을 PBS 자극으로 관찰된 백그라운드 수준으로 감소시켰다. NVP-ABN912와 대조 항체 사이에 관찰된 차이는 통계학적으로 매우 유의하며(p<0.01) 효과의 정도를 고려하면, 생물학적 연관성도 있는 것으로 보인다. 호산구 유출의 대표적 조직학을 도 2에 나타내었다.

MCP-1 유도된 호산구 유출 실험으로부터의 펀치 생검의 조직학을 4 마리 원숭이(2279, 2280, 2281 및 2282)에 대해 나타내었다.

각각 원숭이 2279, 2280, 2281 및 2282의 항체로의 처리전 (A), (B), (E), (F) 호산구 염색.

각각 원숭이 2279, 2280, 2281 및 2282의 항체로의 처리전 (C), (D), (G), (H) 호산구 염색.

원숭이 2279와 2280을 이소타입 매치된 대조 항체 CGP44290(5 ㎎/㎏)으로 처리하고 원숭이 2281 및 2282를 NVP-ABN912(5 ㎎/㎏)로 처리하였다. 호산구는 적색으로 염색되고(흑색과 백색에서 어두운 점으로 나타남) 패널 (G)와 (H)의 화살표는 두 마리의 NVP-ABN912 처리된 원숭이에 존재하는 소수의 호산구를 부각시킨다.

호산구 유출의 거의 완전한 저해가 NVP-ABN912 처리된 원숭이에서 관찰된 반면, 처리 전후간에 어떠한 차이도 CGP44290으로 관찰되지 않았다.

2.7 SCID-hu 마우스에서 T 세포 침윤의 저해

이 기계적 모델을 사용하여 SCID-hu 마우스의 피부로의 Th 세포의 MCP-1 유도된 침윤이 NVP-ABN912의 i.p. 주사에 의해 저해될 수 있는지 여부를 시험하였다.

SCID 마우스에 두 작은 조각의 인간 성체 피부를 이식하였다(SCID-hu 피부). 이식편의 질을 이식후 5-6 주동안 모니터링한 후, 성공적으로 이식된 마우스(일반적으로 >85%)를 생체내 이동 실험을 위해 선별하였다. 케모카인-유도된 이동을 위해, PBMC를 버피 코트 샘플로부터의 표준 밀도 구배 분리에 의해 분리하고 두 조각의 인간 피부(등 위쪽의 좌우측에)를 이미 이식한(5-8 주) SCID-hu 피부 마우스로 선택 도입하였다(i.p. 1×10⁸ 세포/마우스, 500 ㎕ 부피). 세포 도입을 0 일에 완료하였다. MCP-1(R&D 시스템즈, 미니아폴리스, MN)과 PBS를 실험 1, 2, 4 및 6 일 에 인간 이식편으로 피배로 투여하였다. 대조 마우스(CGP44290 처리)에게 500 ng의 MCP-1을 우측 피부 이식편에, 동일 부피(30-㎕)의 PBS를 좌측 이식편에 주사하였다. NVP-ABN912로 처리된 마우스에게 좌우 양측 피부 이식편에 500 ng의 MCP-1을 주사하였다. NVP-ABN912와 이소타입 대조 CGP44290을 0 일(세포 도입 5 시간전) 및 실험 2 및 5 일에 i.p.로 투여하였다(100 ㎍/마우스, 4 ㎎/㎏, 500 ㎕ 부피). 8 일에 모든 마우스를 희생시키고 인간 피부 이식편을 추가 분석을 위해 수획하였다. 각각의 인간 피부 이식편의 단일 세포 현탁액을 DAKO Medimachine?을 이용하여 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 이들 세포 현탁액을 FITC와 PE에 컨쥬게이트된 인간 항-CD3 및 항-CD4 mAb로 염색하고 FACSCalibur 플로우 사이토미터(벡톤 딕킨슨, 산 호세, CA)에서 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상응하는 CPG44290 처리군(3 마리, n=3)에서 확인된 3.73±1.03%와 비교하여 주입된 인간 Th 세포의 0.73±0.15%가 ABN912 처리군( 5 마리, n=10)에서 피부 이식편을 침윤하였다. 세포 이동이 PBS에 의해 유도된 마우스에서, 0.34±0.17%의 Th 세포가 인간 피부 이식편을 침윤하였다(3 마리, n=3).

통계학적 분석을 변동의 일측 분석에 이어 던넷 다중 비교 시험으로 수행하였다. 각각 ABN912 대 CGP44290 처리된 동물에서 Th 세포 침윤의 감소는 매우 유의적이었다(p<0.01, **).

2.8 인간 MCP-1상의 ABN912 결합 에피토프의 특성분석 및 작용 양식

NVP-ABN912의 Fab 단편을 갖는 MCP-1의 복합체의 3차원적 구조를 X-레이 크리스탈로그래피에 의해 결정하였다.

NVP-ABN912의 Fab 단편을 전제 항체로부터의 단백질분해효소 절단에 의해 생산하고 단백질 A 크로마토그래피 후 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Fab와 재조합 인간 MCP-1 사이의 복합체를 단백질 G 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하고, 한외여과에 의해 50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl중 26 ㎎/㎖로 농축하였다. 결정을 실온에서 20%(w/v) PEG, 10%(v/v) 이소프로판올, 0.1 M Na Hepes pH 7.5의 달려있는 방울에서 증기 확산 기술에 의해 성장시켰다. 그들은 단위 세포 크기 a=63.90 Å, b=86.08 Å, c=321.64 Å이고 비대칭 단위당 3 개의 복합체를 갖는 스페이스 그룹 P2_l2_l2_l이다. 데이터 수집전에, 하나의 결정을 17%(w/v) PEG 4,000, 8.5%(v/v) 이소프로판올, 15% 글리세롤, 85 mM Na Hepes pH 7.5에 약 3 분동안 담궜다. 그 후 결정을 나일론 크리오루프에 집적하고 120 K의 질소 기류에서 직접 동결시켰다. 회절 데이터를 MAR 345 이미지 플레이트 시스템으로 유러피언 신크로톤 래디에이션 파실리티(λ=0.90 Å)의 SNBL 빔라인에서 측정하였다. 68,948의 독특한 반사에 상응하는(Rsym=0.050) 총 242,617 관찰이 20.0과 2.33 Å 해상도사이에서 수집되었다(89.3% 완전성). 구조를 분자 대체에 의해 출발 모델로서 3D6 모노클로날 항체(RCSB 진입 1DFB; He et al., 1992) 및 인간 MCP-1(RCSB 진입 1 DOL; Lubkowski et al., 1997)의 Fab 단편의 X-레이 구조를 사용하여 결정하였다. 구조를 비틀림 각 다이나믹스 및 프로그램 CNX를 이용한 에너지 최소화에 의해 20 내지 2.33 Å의 모든 반사에 대해 0.224의 최종 R-인자(Rfree=0.261)로 정제하였다. 최종 모델은 ABN912의 L1 내지 L214와 H1 내 지 H222와 인간 MCP-1의 잔기 10 내지 71을 포함한다. 그것은 결합 길이에서 0.006 Å 및 결합각에서 1.36°의 rms 편차를 갖는 양호한 기하학을 갖는다.

NVP-ABN912 Fab/인간 MCP-1 복합체는 많은 소수성 및 극성 상호작용 및 몇몇 핵심 정전기적 상호작용이 관여하는 큰 결합 면(1,590 Å²의 결합된 묻힌 표면)을 나타낸다. 항원에 대한 주요 접촉은 항원-결합 위치의 중심에 걸쳐 폴드하는 NVP-ABN912의 긴 H-CDR3 루프에 의해 매개되고 복합체에 대부분 묻힌다. 인간 MCP-1상의 결합 에피토프는 아미노산 잔기 Asn 14, Thr 16, Asn 17, Arg 18, Lys 19, Ile 20, Ser 21, Gln 23, Arg 24, Lys 49, Glu 50, Ile 51 및 Cys 52를 포함한다. Arg 18, Arg 24 및 Lys 49가 항체 잔기 Glu L55, Asp H99 및 Glu H101과의 정전기적 상호작용과 Tyr L94, Trp H33, Asn H50, Gln H53, Asp H99 및 Tyr H108과의 H-결합된 상호작용에 관여한다. 또한, MCP-1 Arg 18 및 Arg 24의 구아니디늄 잔기는 각각 Trp H33 및 Tyr H32의 방향족 환에 대해 π-스택된다. NVP-ABN912와 항원의 Tyr 13, Gln 17, Ser 21, Lys 19, Arg 24 및 Glu 50간의 부가적인 상호작용은 단백질 면에 묻힌 8개의 물 분자에 의해 매개된다. MCP-1의 Tyr 13과 Arg 24가 CCR2B 케모카인 수용체에 대한 결합에 관여하므로(Hemmerich et al., 1999, Biochemistry, 38: 13012-13025), NVP-ABN912가 직접 길항제 결합을 위해 수용체와 결쟁하는 것으로 보인다.

2.9 부위-특이적 돌연변이에 의한 MCP-1상의 ABN912 에피토프의 맵핑

NVP-ABN912에 의한 인식을 위해 MCP-1상의 기능적으로 중요한 잔기를 결정하 기 위하여, 알라닌-스캐닝 돌연변이생성 연구를 수행하였다(Cunningham, B. C. and Wells, J. A.(1989) Science 244, 1081-1085). 먼저, MCP-1의 3차원 구조(Handel, T. M. and Domaille, P. J.(1996) Biochemistry 35, 6569-6584; Lubkowski, J., Bujacz, G., Boque, L., Domaille, P.J., Handel, T. M. and Wlodawer, A.(1997) Nature Struct. Biol. 4, 64-69)를 육안으로 조사하여 소프트웨어 WebLab 뷰어를 사용하여 표면 노출된 잔기를 확인하였다. ABN912와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 총 39 개의 잔기를 퀵쇄지 부위-특이적 돌연변이 키트(Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J. and Wright, D. A.(1996) Strategies 9(3), 3-4)를 이용하여 개별적으로 알리닌이나 라이신(D3K, A48K)으로 돌연변이시켰다. 생성된 돌연변이 유전자를 HEK.EBNA 세포에서 세포를 2 마이크로그램의 MCP-1 돌연변이 서열을 운반하는 발현 플라스미드와 진포터 형질감염 시약(Gene Therapy Systems)으로 형질감염시켜 발현시켰다. 형질감염후, 세포를 3 일동안 37 ℃에서 인큐베이션하고 상등액을 모으고 5' 동안 원심분리한 후 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 돌연변이 MCP-1 농도를 프로틴 어세이(바이오래드)를 이용하여 정제 MCP-1을 표준으로 하여 결정하였다. 전형적으로 40 ㎍의 정제 인간 MCP-1 또는 MCP-1 돌연변이를 3 ㎖의 배양물로부터 수득하였다.

MCP-1과 돌연변이 MCP-1의 NVP-ABN912에 대한 친화도를 BIAcore 인스트루먼트(BIAcore)를 갖는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. 먼저, 인스트루먼트의 센서칩 표면을 활성화시키고 30 ㎍/㎖ 항-Fcγ 용액을 주사하여 칩에 공유결합시켰다. NVP-ABN912 항체를 5 ㎍/㎖ 용액을 주사함으로써 항-Fcγ 변형된 표면상 에 축적시켰다. 희석된 MCP-1 또는 MCP-1 돌연변이를 제조하여 최종농도 0.75 내지 4 nM을 만들고 주사하여 센서칩 표면상에 고정된 NVP-ABN912에 결합시켰다. 결합과 해리를 표면 플라스몬 공명 신호를 기록하는 동안 5 분간 수행하였다. 그 후 적정 시리즈를 BIA평가 3.0 소프트웨어(인스트루먼트 인스톨레이션의 소프트웨어 파트; 핸드북 Cat. No. BR-1002-29; edition 7-97)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 NVP-ABN912에 대한 MCP-1 및 MCP-1 돌연변이의 결합을 보여주는 도 4에 나타내었다.

상기한 바와 같이 확인된, NVP-ABN912 인식을 위한 MCP-1상의 주요 결정기는 잔기 T16, R18, R24 및 K49이다. K49의 알라닌으로의 돌연변이가 133배의 친화도 감소를 일으킨 반면, T16, R18 및 R24의 알라닌으로의 돌연변이는 NVP-ABN912에 대한 결합을 완전히 막았다.

<110> Novartis AG Novartis-Erfindungen Verwaltunggesellschaft m-b-H. Hiestand Peter Hofstetter Hans Payne Trevor Glyn Urfer Roman <120> ANTIBODIES TO HUMAN MCP-1 <130> 31491 <140> PCT/EP 01/07468 <141> 2001-06-29 <150> GB0016138.0 <151> 2000-06-30 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> MUS MUSCARIS <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <223> CDR1 from 91 to 105; CDR2 from 148 to 198; CDR3 from 295 to 333 <400> 1 gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agt cac tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg ctg 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gcc aac ata gag caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg gac tct gtg 192 Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aat tca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat ttc tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg agg gat ctt gaa ggt cta cat ggg gat ggg tac ttc gat ctc tgg 336 Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 ggc cgt ggc acc ctg gtc acc gtc tct tca 366 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> MUS MUSCARIS <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <223> CDR1' from 70 to 102; CDR2' from 148 to 168; CDR3' from 265 to 285 <400> 3 gcc atc cag ttg aca cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc atc ctc atc tgc cgg gca agt cag ggc gtt agc agt gct 96 Asp Arg Val Ile Leu Ile Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg cca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat ttc tgt caa cag ttt aat agt tac cct ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa cga act 327 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <400> 4 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Leu Ile Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> Vh CDR1 <400> 5 His Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Vh CDR2 <400> 6 Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Vh CDR3 <400> 7 Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Vl CDR1' <400> 8 Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Vl CDR2' <400> 9 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> MUS MUSCARIS <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Vl CDR3' <400> 10 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro 1 5

Claims

서열중에 고가변성 부위인, 아미노산 서열 His-Tyr-Trp-Met-Ser를 갖는 CDR1, 아미노산 서열 Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly을 갖는 CDR2, 및 아미노산 서열 Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu을 갖는 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변성 영역(V_H)을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 인간 단핵구 화학주성단백질(MCP)-1 항체;

또는

(ⅰ) 고가변성 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3가 서열번호 1에 나타낸 고가변성 부위와 전체로서 적어도 95% 상동성을 갖고;

(ⅱ) 참조 분자와 실질적으로 같은 정도로 그의 수용체에 대한 MCP-1의 결합을 저해할 수 있는 분자 X로서, 상기 참조 분자는 서열번호 1에서 나타낸 것과 동일한 고가변성 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3를 갖는 반면 분자 X의 것과 동일한 골격 부위 및 불변 부위를 갖는 것인, 인간 MCP-1 항체(분자 X).
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a) 서열중에 고가변성 부위인, 아미노산 서열 His-Tyr-Trp-Met-Ser를 갖는 CDR1, 아미노산 서열 Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly을 갖는 CDR2, 및 아미노산 서열 Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu을 갖는 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변성 영역(V_H) 및

b) 서열중에 고가변성 부위인, 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala을 갖는 CDR1', 아미노산 서열 Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser을 갖는 CDR2', 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro을 갖는 CDR3'를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변성 영역(V_L):

을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는, 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 양 가변성 영역을 포함하는 인간 MCP-1 항체;

또는

(ⅰ) 고가변성 부위 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 및 CDR3'가 서열번호 1 및 2에 나타낸 고가변성 부위와 전체로서 적어도 95% 상동성을 갖고;

(ⅱ) 참조 분자와 실질적으로 같은 정도로 그의 수용체에 대한 MCP-1의 결합을 저해할 수 있는 분자 X'로서, 상기 참조 분자는 서열번호 1 및 2에서 나타낸 것과 동일한 고가변성 부위 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 갖는 반면 분자 X'의 것과 동일한 골격 부위 및 불변 부위를 갖는 것인, 인간 MCP-1 항체(분자 X').
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