KR100601391B1 - Method for stabilization of liposome powders - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리포솜 분말의 안정화 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤을 특정비로 혼합하여 리포솜을 형성시킨 후, 동결건조 전 1 ∼ 30 분 사이에 당류를 일정량 첨가하여 재분산하면, 최소 1개월 이상 기간동안 4 ∼ 37 ℃에서 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기변화가 거의 없이 리포솜을 장기간 보관할 수 있을 정도로 안정성 향상된 리포솜 분말의 안정화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for stabilizing liposome powder, and more particularly, at least one lipid selected from phosphatidylethanolamine (PE) and phosphocholine (PC), La-phosphatidylcholine (HSPC), and cholesterol are mixed at a specific ratio. After forming a liposome, and redispersing by adding a certain amount of sugar between 1 to 30 minutes before lyophilization, the liposome is little change in size before and after lyophilization at 4 ~ 37 ℃ for at least one month or more The present invention relates to a method for stabilizing liposome powder with improved stability so that it can be stored for a long time.
포스파티딜에탄올아민계(PE), 포스포콜린계(PC), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤, 당류, 리포솜, 안정화Phosphatidylethanolamine (PE), phosphocholine (PC), L-a-phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, sugars, liposomes, stabilization
Description
도 1은 본 발명의 실시예 1 ∼ 3 및 비교예 1과 비교예 2는 당의 첨가유무 및 첨가 시기에 따른 동결건조 전과 후의 리포솜 입자 크기 변화를 나타낸 그래프이다.1 and 3 and Comparative Examples 1 and 2 of the present invention is a graph showing the change in the size of liposome particles before and after lyophilization according to the presence and absence of sugar addition time.
도 2는 본 발명의 실시예 1 ∼ 3의 당의 종류와 농도변화에 따른 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기 변화를 나타낸 그래프이다.2 is a graph showing the size change of liposome particles before and after lyophilization according to the type and concentration of sugars of Examples 1 to 3 of the present invention.
도 3은 본 발명의 실시예 1 ∼ 3의 당의 종류, 당의 농도 및 시간에 따른 37 ℃에서 동결건조 전 리포솜 입자의 크기 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the size change of liposome particles before lyophilization at 37 ℃ with the kind of sugar, the concentration of sugar and time of Examples 1 to 3 of the present invention.
도 4는 본 발명의 실시예 1 ∼ 3의 당의 종류, 당의 농도 및 시간에 따른 37 ℃에서 동결건조 후 리포솜 입자의 크기 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the change in size of liposome particles after freeze-drying at 37 ℃ with the kind of sugar, the concentration of sugar and time of Examples 1 to 3 of the present invention.
본 발명은 리포솜 분말의 안정화 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤을 특정비로 혼합하여 리포솜을 형성시킨 후, 동결건조 전 1 ∼ 30 분 사이에 당류를 일정량 첨가하여 재분산하면, 최소 1개월 이상 기간동안 4 ∼ 37 ℃에서 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기변화가 거의 없이 리포솜을 장기간 보관할 수 있을 정도로 안정성 향상된 리포솜 분말의 안정화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for stabilizing liposome powder, and more particularly, at least one lipid selected from phosphatidylethanolamine (PE) and phosphocholine (PC), La-phosphatidylcholine (HSPC), and cholesterol are mixed at a specific ratio. After forming a liposome, and redispersing by adding a certain amount of sugar between 1 to 30 minutes before lyophilization, the liposome is little change in size before and after lyophilization at 4 ~ 37 ℃ for at least one month or more The present invention relates to a method for stabilizing liposome powder with improved stability so that it can be stored for a long time.
리포솜은 제조가 쉽고 생체막과 상용성이 있으며 생분해성이 매우 우수한 물질로, 리포솜에 약물을 봉입함으로서 약물의 독성을 줄일 수 있고 치료 효과를 향상시킬 수 있는 약물 수송체로 널리 알려져 있다.Liposomes are materials that are easy to manufacture, compatible with biological membranes, and are highly biodegradable, and are widely known as drug transporters that can reduce drug toxicity and improve therapeutic effects by encapsulating drugs in liposomes.
그러나 일반적으로 리포솜은 열역학적으로 안정하지 못하기에 현탁액으로 조제해서 보관했을 경우, 보통 리포솜 입자 사이의 응집이나 융합의 발생으로 안정하지 못하다. 많은 연구자들에 의하여 리포솜의 임상에의 응용 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고 리포솜 분말시 안정성 문제에 대해서는 많은 해결책이 제시되고 있지 못하는 실정이다.In general, however, liposomes are not thermodynamically stable, and when stored in suspension, they are usually unstable due to aggregation or fusion between liposome particles. Although many researchers have been researching the application of liposomes to the clinic, many solutions have not been proposed for the stability problem of liposome powder.
리포솜 입자의 안정성을 향상시키기 위한 해결책으로 리포솜에 폴리머를 코팅하거나[미국특허 제 3,952,004호와 미국특허 제 3,927,197호, M. Mercadal, J.C. Domingo, J. Petriz, J. Garcia, M.A. Madariaga., Biochem. Biophys. Acta 1418, 232 (1999)], 당류를 첨가하여 안정성을 향상시킨 방법들이 알려져 있다[Helmut Hauser, George Straussl., Biochem. Biophys. Acta 897, 331 (1987), 미국특허 제 4,963,362호, 미국특허 제 5,755,788호, 미국특허 제 4,537,883호]. 1996년 일본에서는 리포솜에 고농도의 염화 나트륨과 같은 전해질이나 유당, 글루코스 등의 당류를 첨가하고 또한 이온 농도를 약 20 mM 이하로 하여 리포솜의 수분산액을 분무 건조하는 리포솜 제제에 관해 발표된 적이 있다[일본특허 제 2,550,352호]. As a solution to improve the stability of liposome particles, liposomes can be coated with polymers [US Pat. No. 3,952,004 and US Pat. No. 3,927,197, M. Mercadal, J.C. Domingo, J. Petriz, J. Garcia, M.A. Madariaga., Biochem. Biophys. Acta 1418, 232 (1999)], methods for improving the stability by adding sugars are known [Helmut Hauser, George Straussl., Biochem. Biophys. Acta 897, 331 (1987), US Pat. No. 4,963,362, US Pat. No. 5,755,788, US Pat. No. 4,537,883]. In 1996, a Japanese liposome formulation was disclosed in which a liposome was added to an electrolyte such as sodium chloride, sugars such as lactose and glucose, and spray-dried an aqueous dispersion of liposomes with an ion concentration of about 20 mM or less. Japanese Patent No. 2,550,352].
또한, 미국특허 제 6,171,614 B1호와 미국특허 제 5,354,853호에는 리포솜의 자기 조립 체계를 바탕으로 기존의 인지질과 펩타이드가 결합된 인지질에 사카라이드나 펩타이드를 합성하여 구조 및 그들 사이의 결합력을 비교하여 안정성을 향상시키는 방법이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,755,788호에는 리포솜 표면에 사카라이드를 첨가하여 신체에 인공기관이나 이식 수술을 할 경우, 이식에 따른 부작용을 최소화하고 치료 효과를 극대화하여 장기간의 안정성을 향상시키는 방법에 대해 기술하고 있다.In addition, US Pat. No. 6,171,614 B1 and US Pat. No. 5,354,853 synthesize saccharides or peptides to phospholipids to which phospholipids and peptides are combined based on the self-assembly of liposomes, and compare the structure and the binding force therebetween for stability. Methods of improving are described. U. S. Patent No. 5,755, 788 describes a method of improving long-term stability by adding saccharides to the liposome surface and minimizing the side effects of transplantation and maximizing the therapeutic effect when artificial organs or transplantation are performed on the body.
반면, 미국특허 제 5,759,572호에는 낮은 독성과 낮은 항원성을 가지는 세포질의 면역성을 바탕으로 하여 기존에 보고된 바 있는 올리고당의 일종으로 강한 독성 때문에 분말화하는데 어려움이 있는 만난[Mikami, K., Summary of 15th Carbohydrate Symposium, 43, 7/29/93, 30 days, Sendai] 시리즈를 항원 세포에 결합하여 리포솜 내부에 항원을 재구성하여 면역원의 효과를 극대화하는 방법에 관한 기술을 개시하고 있다.On the other hand, U.S. Patent No. 5,759,572 is a type of oligosaccharide that has been previously reported on the basis of cytoplasmic immunity with low toxicity and low antigenicity. [Mikami, K., Summary of 15th Carbohydrate Symposium, 43, 7/29/93, 30 days, Sendai] discloses a technique for maximizing the effects of immunogens by binding to antigen cells to reconstitute antigens in liposomes.
한편, 상기 종래 기술들에 의하여 당류를 첨가하여 리포솜 제조시의 안정성과 리포솜 분말시의 안정성을 향상시키는 방법에 대해 외부 환경 변수에 대한 구체적인 내용이 제시되어 있지 않기에 이러한 부분에 대한 해결책을 제시할 필요가 있다.On the other hand, the method for improving the stability in liposome preparation and the stability in liposome powder by adding a saccharide by the conventional techniques are not presented because the specific details about the external environmental parameters will be proposed a solution to this part There is a need.
특히, 리포솜 분말을 상품화 할 경우 외부 환경의 변수에 대한 물리적·화학 적 안정성의 문제에 직면하여 기존의 발명에서 언급되지 않은 보관 온도, 재분산시 안정성을 최대화 할 수 있는 당류와 리포솜의 각각의 종류, 농도 및 최적 혼합 농도 등의 변수에서 장기간의 안정성을 조절할 수 있는 리포솜 분말의 제조 방법 개발이 더욱 시급하다. In particular, when commercializing liposome powder, the physical and chemical stability of the external environment is not confronted with the storage temperature, which is not mentioned in the existing invention, and the types of sugars and liposomes that can maximize the stability during redispersion. It is more urgent to develop a method for preparing liposome powder that can control long-term stability at such variables as concentration, optimal mixing concentration, and the like.
이에 본 발명자들은 외부 환경의 변수에 대한 물리·화학적 안정성의 문제를 해결하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 생체적합성이 우수한 리포솜에 당류를 첨가하여 리포솜 입자의 안정성을 향상시키기 위한 방법으로, 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤을 혼합하여 리포솜을 형성시킨 후, 동결건조 전 1 ∼ 30 분 사이에 당류를 일정량 첨가하여 재분산하면, 최소 1개월 이상 4 ∼ 37 ℃에서 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기변화가 거의 변화가 없다는 것을 알게 되었다.Therefore, the present inventors have tried to solve the problem of physical and chemical stability to the variables of the external environment. As a result, as a method for improving the stability of liposome particles by adding sugars to liposomes having excellent biocompatibility, at least one lipid selected from phosphatidylethanolamine (PE) and phosphocholine (PC), La-phosphatidylcholine ( HSPC) and cholesterol are mixed to form liposomes, and a certain amount of sugar is added and redispersed for 1 to 30 minutes before lyophilization, and the size change of liposome particles before and after lyophilization at 4 to 37 ° C. for at least 1 month. I found little change.
따라서, 본 발명은 리포솜 형성 후 당류를 첨가하여 재분산하여 외부 환경 의 특정 변수에 따른 리포솜 입자의 크기가 변화가 없는 리포솜 입자의 안정화 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for stabilizing liposome particles in which the size of liposome particles does not change according to a specific variable of the external environment by adding redispersed sugars after liposome formation.
본 발명은 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤을 3 ∼ 5 : 1 ∼ 3 : 1의 중량비로 혼합하여 0.1 ∼ 10 mM(w/v) 농도로 수화한 후, 동결-해동(freeze-thaw)하여 리포솜 입자를 제조하는 단계와,The present invention mixes one or more lipids selected from phosphatidylethanolamine (PE) and phosphocholine (PC), La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol in a weight ratio of 3 to 5: 1 to 3: 1 to 0.1 to Hydrating at a concentration of 10 mM (w / v), and then freeze-thaw to prepare liposome particles;
상기 제조된 리포솜 입자에, 1 분 ∼ 30 분 후에 당류를 0.01 ∼ 80 mM(w/v) 농도로 첨가하고, 동결-건조하여 리포솜 입자를 안정화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 리포솜 입자의 안정화 방법에 그 특징이 있다.To the liposome particles prepared above, a method for stabilizing liposome particles comprising a step of adding a saccharide at a concentration of 0.01 to 80 mM (w / v) after 1 to 30 minutes, and freeze-drying to stabilize the liposome particles. There is a characteristic.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.
현재 사용중인 리포솜 입자는 상품화로서의 가치를 높이기 위해 당류를 첨가하여 제조하고 있으나, 그 첨가의 최적 조건 또는 안정성이 유지되는 보관 조건에 대한 구체화되어 있지 않아 문제가 발생하고 있다. 반면에, 본 발명은 열역학적으로 불안정한 구조를 지니는 리포솜을 장기간 보관하는 방법으로 분말화라는 과정에서 재분산시 발생하는 리포솜 입자간의 응집과 융합을 방지하여 장기간ㆍ지속적인 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 입자크기를 측정하여 지지체로 작용하는 당의 첨가, 당의 종류, 첨가 시기, 농도 및 보관온도를 최적화하여 특정의 외부 조건하에서 최장 시간 안정화 할 수 있는 리포솜 입자의 안정화 방법에 관한 것이다.The liposome particles currently in use are prepared by adding saccharides in order to increase their value as commercialization, but there is a problem because they are not specified for the optimal conditions or storage conditions for maintaining the stability. On the other hand, the present invention relates to a method for long-term storage of liposomes having a thermodynamically unstable structure to prevent long-term and continuous stability by preventing agglomeration and fusion between liposome particles generated during redispersion during powdering. The present invention relates to a method for stabilizing liposome particles, which can be stabilized for a long time under specific external conditions by optimizing the addition of sugar, the type of sugar, the timing of the addition, the concentration, and the storage temperature by measuring the particle size.
본 발명의 리포솜 입자의 안정화 방법을 제조 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Referring to the method for stabilizing the liposome particles of the present invention in detail step by step as follows.
본 발명은 통상의 방법으로 리포솜을 형성한 후, 특정 농도의 당류를 첨가하여 동결-건조하여 리포솜 입자를 제조한다.The present invention forms liposomes by conventional methods, and then freeze-dries by adding a certain concentration of sugars to prepare liposome particles.
먼저, 리포솜을 형성하는 단계로 지질로 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤을 혼합하여 수화한 후, 동결-해동(freeze-thaw)하여 리포솜 입자를 형성한다.First, a liposome is formed to hydrate by mixing at least one lipid selected from phosphatidylethanolamine (PE) and phosphocholine (PC), La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol as lipids, and then freeze-thaw. freeze-thaw to form liposome particles.
상기 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질, L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤은 3 ∼ 5 : 1 ∼ 3 : 1의 비(w/v)로 혼합 사용한다. 상기 콜레스테롤은 소수성 결합의 강화를 위해 사용하며, L-a-포스파티딜콜린(HSPC)은 셀 도입(cell induction)의 목적으로 사용된 것으로 리포솜의 원활한 형성을 도와주며 화장품 재료로 사용될 경우 리포솜과 상피세포간의 흡착성과 흡수성을 증가시켜준다.At least one lipid, La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol selected from the phosphatidylethanolamine-based (PE) and phosphocholine-based (PC) are mixed in a ratio of 3 to 5: 1 to 3: 1 (w / v). use. The cholesterol is used to strengthen the hydrophobic bond, La-phosphatidylcholine (HSPC) is used for the purpose of cell induction (cell induction) to help the smooth formation of liposomes and when used as a cosmetic material between the liposomes and epithelial cells Increases absorbency
상기 포스파티딜에탄올아민계(PE) 및 포스포콜린계(PC) 중에서 선택된 1종 이상의 지질의 혼합비(w/v)가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜 입자들 사이의 응집과 융합이 생기는 문제가 있고, L-a-포스파티딜콜린(HSPC)의 혼합비(w/v)가 1 미만과 3을 초과하는 경우에는 리포솜 형성이 잘 안 되는 문제가 있다. 상기 혼합된 지질의 농도는 0.1 ∼ 10 mM을 유지하는 것이 바람직하며, 농도가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 약물의 봉합률이 떨어지게 되고, 리포솜 입자간의 응집과 융합이 생기는 안정성에 문제가 있다. If the mixing ratio (w / v) of one or more lipids selected from the phosphatidylethanolamine-based (PE) and phosphocholine-based (PC) is outside the above range, there is a problem in that aggregation and fusion between liposome particles occur. If the mixing ratio (w / v) of La-phosphatidylcholine (HSPC) is less than 1 and more than 3, liposome formation is difficult. The concentration of the mixed lipids is preferably maintained at 0.1 to 10 mM, and if the concentration is out of the above range, the sealing rate of the drug decreases, and there is a problem in stability of aggregation and fusion between liposome particles.
상기 포스파티딜에탄올아민계(PE)는 디아실 그룹의 탄소수가 6 ∼ 22인 것으로 예를 들면 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세 로-3-포스파티딜에탄올아민 (DLPE), 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(POPE) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 포스포콜린계(PC)는 디아실 그룹의 탄소수가 3 ∼ 24인 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 1-팔미토일-2-글루타로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PGPC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.The phosphatidylethanolamine-based (PE) is 6 to 22 carbon atoms of the diacyl group, for example 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DPPE), 1,2-dis Theoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DSPE), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DLPE), 1,2-dimyristoyl-sn -Glycero-3-phosphatidylethanolamine (DMPE), 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE) and 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3 One or two or more selected from phosphatidylethanolamine (POPE) can be used. In addition, the phosphocholine-based (PC) is a 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-disteroyl having 3 to 24 carbon atoms of the diacyl group -sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), La-phosphatidylcholine (HSPC), 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PGPC), 1,2 -Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) and 1,2-dioleoyl-sn One or two or more selected from -glycero-3-phosphocholine (DOPC) can be used.
이때, 수화는 약물수용액에 의해 지질막이 완전히 분산될 때까지 수행하며, 동결-해동(freeze-thaw)시 동결온도는 -30 ∼ -10 ℃이고, 해동온도는 40 ∼ 60 ℃에서 5회 이상 반복 실시한 후, 초음파를 수행한다. 단막의 리포솜을 얻기 위해서는 가압 압출기를 사용하여 기공의 크기가 30 ∼ 200 ㎚인 폴리카보네이트 막 을 통과시켜 제조한다. 리포솜 내부에 함유되지 않은 약물은 약 4 ∼ 5 ℃에서 2주 이상 막투석을 실시하여 분리한다.At this time, the hydration is carried out until the lipid membrane is completely dispersed by the drug aqueous solution, the freezing temperature during freeze-thaw is -30 ~ -10 ℃, thawing temperature is repeated at least 5 times at 40 ~ 60 ℃ After conducting, ultrasound is performed. In order to obtain a liposome of a single membrane, it is prepared by passing a polycarbonate membrane having a pore size of 30 to 200 nm using a pressure extruder. Drugs not contained in the liposomes are separated by membrane dialysis at about 4-5 ° C. for at least two weeks.
다음으로, 상기 공정으로 형성된 리포솜 입자에 1 분 ∼ 30 분 사이에 당류를 0.01 ∼ 80 mM(w/v) 농도로 첨가하고, 동결-건조하여 리포솜 입자를 안정화시킨다.Next, saccharides are added to the liposome particles formed in the above process at a concentration of 0.01 to 80 mM (w / v) for 1 to 30 minutes, and freeze-dried to stabilize the liposome particles.
상기 당은 단당류, 이당류 및 다당류로 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들 면 만니톨, 포도당, 만노스 및 과당의 단당류, 말토스, 수크로오스 및 트레할로스의 이당류, 소르비톨, 덱스트린 및 글루코사민 등의 다당류를 사용할 수 있다. 상기 당류를 3차 증류수에 녹인 후, 당의 농도를 0.01 ∼ 80 mM로 제조하여 사용한다. 상기 당의 농도가 0.01 mM 미만이면 동결-건조 공정 동안에 리포솜의 안정성에 영향을 미치지 못하게 되어 리포솜 입자간의 응집과 융합이 생기게 되고, 80 mM를 초과하는 경우에는 인지질에 비해 상당량 들어가기에 점도가 증가되어 약한 겔의 형태가 되는 문제가 발생한다. 이때, 동결-건조 공정시 -80 ∼ -70 ℃에서 동결한 후, -50 ∼ -40 ℃에서 건조한다. The sugar is not particularly limited to monosaccharides, disaccharides and polysaccharides, but for example, monosaccharides of mannitol, glucose, mannose and fructose, polysaccharides such as disaccharides of maltose, sucrose and trehalose, sorbitol, dextrin and glucosamine can be used. After dissolving the saccharide in tertiary distilled water, the sugar concentration is prepared from 0.01 to 80 mM and used. If the sugar concentration is less than 0.01 mM, it does not affect the stability of liposomes during the freeze-drying process, resulting in coagulation and fusion between liposome particles. The problem of gel formation arises. At this time, in the freeze-drying step, after freezing at -80 ~ -70 ℃, it is dried at -50 ~ -40 ℃.
상기와 같이, 본 발명에 따라 제조된 리포솜 입자는 리포솜이 형성된 후, 1 ∼ 30 min 후에 당류를 첨가하고 동결건조 하여 재분산하면, 최소 1개월 이상 4 ∼ 37 ℃에서 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기변화를 측정한 결과, 재분산시 당은 리포솜 형태 유지의 지지체의 역할을 수행하고 당이 첨가되므로서 당의 빠른 분산력으로 특정의 보관온도와 첨가되는 특정의 당, 농도 및 리포솜과의 농도 혼합비를 조절하므로서 리포솜을 장기간 보관할 수 있고 이에 따른 안정성의 향상을 기대할 수 있다. As described above, the liposome particles prepared according to the present invention are liposomes formed after 1 ~ 30 min after the addition of sugars and lyophilized and redispersed, the liposome particles before and after lyophilization at 4 ~ 37 ℃ for at least 1 month As a result of measuring the change in size, the sugar acts as a support for liposome shape maintenance and the sugar is added, and as a result of the rapid dispersing of sugar, the sugar has a specific storage temperature and a specific sugar, concentration and mixing ratio with liposome. By adjusting, liposomes can be stored for a long time and improved stability can be expected.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on the following Example, this invention is not limited to an Example.
실시예 1Example 1
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) : L-a-포스파티딜콜린 (HSPC) : 콜레스테롤(CHOL)을 3 : 2 : 1의 조성비(w/v)로 혼합하여 10 mM의 인지질을 제조하였다. 상기 인지질 68.5 mg을 정밀히 달아 클로로포름 5 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 사용하여 상전이온도 41 ℃ 이상을 유지하면서 감압 증류하여 둥근 플라스크벽에 얇은 지질막을 만들고, 진공 중에서 24h 건조시켜 둥근 플라스크내에 잔류하는 클로로포름을 완전히 제거하였다. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC): La-phosphatidylcholine (HSPC): Cholesterol (CHOL) in a mixture of 3: 2: 1 (w / v) 10 mM phospholipid was prepared. 68.5 mg of the phospholipid was precisely weighed, dissolved in 5 ml of chloroform, and distilled under reduced pressure while maintaining a phase transition temperature of 41 ° C. using a rotary evaporator to form a thin lipid membrane on the round flask wall, and dried in a vacuum for 24 hours to remain in the round flask. Chloroform was removed completely.
다음으로 10 mM 약물성분인 칼세인 수용액 10 ml 첨가하여 지질막이 완전히 분산될 때까지 수화시킨 다음, 2분 간격으로 10분간 교반하여 다막 리포솜을 제조하였다. 수화를 마친 후, 동결-해동(freeze-thaw) 과정을 각각 -16 ℃와 55 ℃에서 7번 반복하여 실시하였고, 이 용액을 초음파 발생기의 팁 부분이 1/2정도 잠기게 고정한 다음 4 ℃ 이하를 유지하면서 5분간 초음파 처리를 실시하였다. Next, 10 ml of an aqueous solution of calcein, which is a 10 mM drug component, was added thereto, hydrated until the lipid membrane was completely dispersed, and then stirred for 10 minutes at 2 minute intervals to prepare a multi-film liposome. After hydration, the freeze-thaw process was repeated 7 times at -16 ° C and 55 ° C, respectively, and the solution was fixed so that the tip of the ultrasonic generator was half-immersed and then the temperature was below 4 ° C. Ultrasonic treatment was performed for 5 minutes while maintaining.
다음으로, 가압 압출기를 사용하여 100 nm 폴리카보네이트 막을 통과시켜 단막 리포솜 입자를 얻었고, 리포솜 내부에 함유되지 않은 약물은 4 ℃에서 2주 동안 막 투석을 실시하여 분리하여 control 리포솜을 얻었다.Next, single membrane liposome particles were obtained by passing a 100 nm polycarbonate membrane using a pressure extruder, and drugs not contained in the liposomes were separated by performing membrane dialysis for 2 weeks at 4 ° C. to obtain control liposomes.
상기에서 얻어진 control 리포솜에 당류인 말토스를 0.01 ∼ 80 mM 범위내에서 변화시키면서 심층동결기(deepfreezer)에서 -77 ℃의 온도에서 12h동안 동결 후, 동결-건조기(freeze-dryer)에서 -45 ℃의 온도에서 24 h동안 건조하였다. 이때, 당은 4 ℃의 냉장고에서 3차 증류수에 용해시켜 0.01 ∼ 80 mM 농도의 용액으로 제조하여 사용하였다. The control liposome obtained above was frozen for 12 h at a temperature of -77 ° C. in a deepfreezer while changing maltose, a saccharide, in the range of 0.01 to 80 mM, and then -45 ° C. in a freeze-dryer. Dried at a temperature of 24 h. At this time, the sugar was dissolved in tertiary distilled water in a refrigerator at 4 ℃ to prepare a solution of 0.01 ~ 80 mM concentration was used.
실시예 2 Example 2
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 당류인 말토스 대신에 수크로오스를 0.01 ∼ 80 mM 농도 범위내에서 변화시키면서 반응을 수행하여 수크로오스가 첨가된 리포솜을 얻었다.In the same manner as in Example 1, the reaction was carried out while varying the sucrose in the concentration range of 0.01 ~ 80 mM instead of maltose as a saccharide to obtain a liposome to which sucrose was added.
실시예 3Example 3
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 당류인 말토스 대신에 글루코사민과 만니톨을 각각 0.01 ∼ 80 mM 농도로 사용하여 반응을 수행하여 글루코사민과 만니톨이 첨가된 리포솜을 얻었다.In the same manner as in Example 1, glucosamine and mannitol were used in the concentration of 0.01 to 80 mM, respectively, in place of the saccharide maltose, thereby obtaining liposomes to which glucosamine and mannitol were added.
비교예 1Comparative Example 1
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 당을 첨가하지 않고 반응을 수행하여 control 리포솜을 얻었다.In the same manner as in Example 1, the reaction was performed without adding sugar to obtain a control liposome.
비교예 2Comparative Example 2
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 당류인 말토스, 수크로오스, 글루코사민 및 만니톨을 약물성분인 칼세인 수용액과 함께 첨가하여 수화시키는 방법으로 반응을 수행하여 당을 함유하는 리포솜을 얻었다.The same procedure as in Example 1 was carried out, but the reaction was carried out by adding saccharides such as maltose, sucrose, glucosamine and mannitol together with an aqueous solution of calcein as a drug component to hydrate to obtain a liposome containing sugar.
실험예 1Experimental Example 1
상기 실시예 1 ∼ 3 및 비교예 1 ∼ 2에서 제조된 리포솜 입자의 안정성을 관찰하기 위하여 동결건조 전과 후의 리포솜 입자의 크기를 25 ℃에서 광산란 장치를 사용하여 조사하였으며, 그 결과를 다음 도 1에 나타내었다. In order to observe the stability of the liposome particles prepared in Examples 1-3 and Comparative Examples 1-2, the size of liposome particles before and after lyophilization was investigated using a light scattering apparatus at 25 ° C., and the results are shown in FIG. Indicated.
도 1에 나타난 바와 같이, 리포솜 형성 후 당을 첨가한 실시예 1 ∼ 3과 당을 첨가하지 않은 비교예 1 및 지질막을 수화하는 과정에서 당을 첨가한 비교예 2의 동결건조 전과 후의 입자의 크기를 관찰한 결과, 비교예 1, 2에 비해 리포솜 형성 후 당을 첨가한 실시예 1 ∼ 3의 경우 동결건조 전과 후의 입자크기가 거의 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 리포솜에 당을 첨가하는 시기에 따라 동결건조 전과 후에 리포솜 입자의 크기가 달라지는 것을 볼 수 있었다. As shown in Figure 1, the size of the particles before and after lyophilization of Examples 1 to 3 added sugar after liposome formation, Comparative Example 1 without added sugar and Comparative Example 2 added with sugar in the process of hydrating the lipid membrane As a result, it was confirmed that the particle size before and after lyophilization was almost unchanged in Examples 1 to 3 in which sugar was added after liposome formation as compared with Comparative Examples 1 and 2. As a result, the size of the liposome particles was changed before and after lyophilization depending on the time of adding sugar to liposomes.
실험예 2Experimental Example 2
리포솜이 형성된 후 동결건조 전 1 ∼ 30 min 사이에 당류를 첨가하여 리포솜 분말화의 안정성을 최대화 할 수 있는 조건을 찾기 위해 당의 종류와 농도를 달리하여 4 ℃에서 보관하면서 리포솜 입자의 크기 변화를 관찰하였다. After the liposome was formed and before the lyophilization, sugars were added to observe the change in the size of the liposome particles while storing at 4 ° C by varying the type and concentration of sugars in order to maximize the stability of liposome powdering by adding sugars. It was.
도 2에서 볼 수 있듯이, 말토스, 수크로오스 및 글루코사민의 경우 농도가 증가할수록 입자의 크기가 거의 변화가 없었고, 만니톨 경우 대체적으로 농도가 증가함에 따라 입자의 크기의 변화를 보인다는 것을 확인하였다. 만니톨의 경우구조상의 문제로 동결-건조 공정 후 재분산시 다른 당에 비해 낮은 재분산성을 가지고 만니톨 표면의 약한 음이온성으로 동결건조 공정 하는 과정에서 수분이 빠져나가면서 만니톨이 약한 양이온성인 리포솜 입자 표면에 흡착되어 결과적으로 입자크기의 변화가 발생하는 것이다. 그러나 이와 같은 변화는 당을 첨가하지 않은 리포솜 입자에 비하면 간과해도 될 미세한 변화이다.As can be seen in Figure 2, maltose, sucrose and glucosamine showed that the size of the particles was almost unchanged as the concentration increases, it was confirmed that the size of the particles as the concentration increases in the case of mannitol. In the case of mannitol, due to the structural problem, the surface of red liposome particles having weak redispersibility compared to other sugars during freeze-drying process and low anionicity on the surface of mannitol and ionic drying of the mannitol is weak cationic liposome particle during the freeze-drying process As a result, the particle size changes. However, such a change is a slight change that may be overlooked compared to liposome particles without adding sugar.
실험예 3Experimental Example 3
본 발명의 외부 환경에 따른 리포솜 분말의 안정성을 보기 위하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다. In order to see the stability of the liposome powder according to the external environment of the present invention was carried out by the following method.
37 ℃의 온도에서 리포솜 분말의 안정성을 보기 위해 상기 실시예 1 ∼ 3 및 비교예 1에서 제조된 당이 리포솜 형성 후 첨가된 수용액과 당을 첨가하지 않은 control 리포솜을 각각 37 ℃로 고정한 인큐베이터(incubator)에서 30일간 보관하면서 동결건조 전과 재분산 후의 시간에 따른 리포솜 입자 크기의 변화를 각각 관찰하였다. In order to see the stability of the liposome powder at the temperature of 37 ℃ incubator (fixed to 37 ℃ each of the aqueous solution added after the formation of liposome and the control liposome without added sugar prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 The change of liposome particle size with time before lyophilization and after redispersion was observed during storage for 30 days.
본 발명의 동결건조 전과 후의 리포솜 입자의 크기 변화 측정으로, 당이 첨가된 리포솜 분말화의 상품화시 외부 환경에 의한 보관상의 물리적ㆍ화학적 안정성을 관찰하기 위해, 입자의 크기가 가장 안정한 최적의 농도인 30 mM과 60 mM로 37 ℃에서 최소 30일간 인큐베이터(incubator)에서 보관하면서 동결건조 전과 후의 당이 첨가된 리포솜 입자와 당이 첨가되지 않은 control 리포솜의 크기 변화를 관찰하였다.Measurement of the size change of liposome particles before and after lyophilization of the present invention, in order to observe the physical and chemical stability of storage by the external environment during commercialization of sugar-added liposome powdering, the particle size is the most stable concentration The changes in the size of sugar-added liposomes and sugar-free control liposomes were observed before and after lyophilization, at 30 mM and 60 mM in an incubator at 37 ° C for at least 30 days.
도 3에서 볼 수 있듯이, 동결건조 전에는 당류의 첨가 유무에 관계없이 시간의 경과에 따른 리포솜의 입자의 크기 변화가 없었다. 그러나 동결건조 후에는 시간이 당을 첨가하지 않은 입자의 경우 시간의 변화에 따른 크기변화가 뚜렷이 나타나는 경향을 보인다는 것을 알 수 있다.As can be seen in Figure 3, there was no change in the size of the particles of liposomes over time, regardless of the addition of sugars before lyophilization. However, it can be seen that after freeze-drying, the particle size does not have a tendency to change with time.
상기 첨가된 당 성분 중, 말토스와 수크로오스의 경우 크기의 변화없이 지속적인 안정성을 보이고, 글루코사민과 만니톨의 경우는 시간의 경과에 따라 입자의 크기가 서서히 증가하는 경향을 보이나 그 변화가 미세하므로 안정성에 변화가 생겼다고 볼 수 없다.Among the added sugar components, maltose and sucrose showed continuous stability without change in size, and in the case of glucosamine and mannitol, the particle size tended to increase gradually over time, but the change was minute, so the stability was improved. There is no change.
따라서, 당의 첨가 방법과 온도, 시간, 당의 종류 및 당의 농도에 따라 리포솜 입자의 안정성이 다르게 나타나며, 당이 지지체로 작용하여 리포솜 입자의 물리적ㆍ화학적 안정성을 조절할 있음을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the stability of liposome particles differs depending on the method of sugar addition, temperature, time, type of sugar, and sugar concentration, and the sugar acts as a support to control the physical and chemical stability of the liposome particles.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 열역학적으로 불안정한 구조를 지니는 리포솜의 보관에 따른 입자의 안정성에 있어 당류의 첨가 방법과 외부 환경의 변수를 다르게 함으로서 리포솜의 안정성을 향상시키고 상품화시 안정성을 조절할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 특히 0.01 ∼ 80 mM의 농도와 4 ∼ 37 ℃의 온도에서 자유자재로 리포솜분말의 안정화를 극대화하고 조절 할 수 있는 새로운 개념의 리포솜 제조 방법을 제공하는데 기여하는 바가 크다고 할 수 있다. As described above, the present invention can improve the stability of liposomes and control the stability during commercialization by varying the method of addition of saccharides and the external environment in the stability of particles according to the storage of liposomes having a thermodynamically unstable structure. In particular, the present invention contributes to providing a new method for preparing liposomes that can maximize and control the stabilization of liposome powders freely at a concentration of 0.01 to 80 mM and a temperature of 4 to 37 ° C. Can be.
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Legal Events
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