KR100598288B1

KR100598288B1 - Ｄｎａ의 자기조직화에 의한 ｄｎａ 나노케이지 및 그제조방법, 그리고, 그것을 이용한 ｄｎａ 나노튜브 및분자캐리어

Info

Publication number: KR100598288B1
Application number: KR1020047013989A
Authority: KR
Inventors: 마츠우라카즈노리; 키미즈카노부오; 야마시타타로
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 규슈다이가쿠
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-03-06
Publication date: 2006-07-07
Also published as: KR20040099304A; CA2478491A1; EP1479766A4; JP4061401B2; WO2003074693A1; US20080177053A1; US20050112578A1; EP1479766A1; CN1692157A; JP2003259869A; AU2003213407A1

Abstract

본 발명은, 3종의 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이제이션에 의해 2차원적으로 집합시켜, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향으로 분기되어 있는 2중쇄 DNA를 형성하는 공정과, 얻어진 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를, 자기상보말단을 모두 소비하도록 3차원적으로 자기조직화하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의한 DNA 나노케이지는, DNA로부터 1단계의 과정에 의해서 간편하게 작성할 수 있고, 내부공간에 나노입자를 내포할 수 있으므로, DNA를 이용한 기능성 재료의 개발에 상당한 효과를 지닌다.

Description

ＤＮＡ의 자기조직화에 의한 ＤＮＡ 나노케이지 및 그 제조방법, 그리고, 그것을 이용한 ＤＮＡ 나노튜브 및 분자캐리어{DNA NANOCAGE BY SELF-ORGANIZATION OF DNA AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DNA NANOTUBE AND MOLECULE CARRIER USING THE SAME}

본 발명은, 서열설계되어 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA의 자기조직화(self-organization)에 의한 신규한 분자집합체인 DNA 나노케이지 및 그 제조방법, 그리고, 그것을 이용한 DNA 나노튜브 및 분자캐리어에 관한 것이다.

근년, 나노테크놀로지 분야에 있어서, DNA의 자기 조직화를 이용한 몰리큘러 머신(molecular machine)의 개발이 활발하게 행해지고 있다.

DNA의 정보는, 뉴클레오티드의 1차 서열에 그 염기단위인 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)에 의해서 코딩되어 있다. DNA의 1본쇄는 하이브리다이제이션에 의해 그들의 상보쇄를 인식해서 결합하여 2본쇄 핵산을 형성한다. 이것은, A가 T를 인식하고, G가 C를 인식하도록 핵산 고유의 염기쌍의 형성성에 의해서 일어날 수 있다. 얻어진 서열은 정확하고 상보적인 서열에만 하이브리다이제이션하므로, 원자·분자레벨에서 높은 염기서열 특이성을 지닌다. 이와 같이, DNA는, 그 기능성 뿐만 아니라, 구조형태도 매우 흥미깊고, "인간게놈계획" 등의 생명정보화학에 있어서 연구가 진행되고 있다.

N. C. Seeman 등은, 10종류의 올리고뉴클레오티드를 이용해서, 조직화, 연결, 정제, 재구축 및 연결의 5단계 반응에 의해, DNA로 이루어진 입방체(DNA 큐브(cube))를 합성하였다(J. Chen, N. C. Seeman, Nature, 350, 631-633(1991), N.C. Seeman, Acc. Chem. Res., 30, 357-363(1997)).

그러나, Seeman 등에 의한 DNA 큐브의 합성방법은, 복잡하고 빈번한 조작을 필요로 하여, 고비용을 초래한다고 하는 문제점이 있다. 또, DNA 큐브는 한 변이 약 10nm정도의 크기를 지닌 입방체이므로, 내부에 단백질 등의 나노입자를 내포하기 곤란하고, 또, 나노입자의 전송담체로서 이용하는 것이 곤란하다고 하는 문제점이 있다.

한편, 이와 같은 전송 담체로서 이용되는 분자캐리어, 특히 표식성이 있어 온도나 DNA 분자인식에 응답해서 약물을 방출하는 약물전달체계(drug delivery system)에 있어서의 약물 캐리어에 대해서는, 주로 지질 분자로 이루어진 리포솜(liposome)이 광범위하게 이용되어 왔다.

그러나, 리포솜을 조제할 때에는, 초음파 조사 등의 에너지의 작용이 필요하고 하는 문제점이 있다.

본 발명자들은, 올리고뉴클레오티드와 갈락토오스로 이루어진 콘쥬게이트를 절반 어긋나게 한 상보쇄와 2중쇄 형성을 통해 자기조직화에 의해 1차원 DNA집합체를 따른 당클러스터(sugar clusters)를 구축하는 기술을 확립하였다(일본 공개특허 제 2001-247596호 공보, K. Matsuura, M. Hibino, Y. Yamada and K. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc., 123, 357-358(2001)).

이와 같이, DNA 분자에 고유한 특성(즉, 염기쌍 형성에 의한 분자인식성과, 하이브리다이제이션에 의한 자기 조직성)을 지녀, 자기조직화에 의해 1단계로, 거의 에너지를 필요로 함이 없이 구축할 수 있는 동시에, 그 내부공간에 나노입자를 내포시킬 수 있는 DNA 나노케이지의 개발에 대한 요구가 높아지게 되었다.

따라서, 본 발명은, 단지 3종류의 올리고뉴클레오티드를 혼합하는 것만으로, 에너지를 필요로 함이 없이 작성할 수 있는 DNA로 이루어진 나노케이지를 제공하는 것, 1단계의 조작으로 간편하고 경제적으로 DNA 나노케이지를 구축할 수 있는 DNA 나노케이지의 제조방법을 제공하는 것, 그리고, DNA 나노케이지를 1차원 방향으로 연결한 DNA 나노튜브 및 내부공간에 가역적으로 금속 나노입자나 단백질 등의 나노입자를 다수 내포하는 것이 가능한 분자캐리어를 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 1차원 DNA를 자기 조직화에 의해 집합시킨다고 하는 발상을 2차원 및 3차원개념으로 확장함으로써, 구형상의 DNA 나노케이지를 얻고, 그 내부공간에 가역적으로 금속 나노입자나 단백질 등을 내포시킬 수 있는 것을 발견하고, 이러한 지견에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하의 [1] 내지 [6]항에 기재된 사항에 의해 특정된다:

[1] 서열설계된 3종의 올리고뉴클레오티드로 각각 이루어져 3방향으로 분기 되어 있는 2중쇄 DNA의 자기조직화에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지.

[2] 상기 나노케이지가 구형상으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 [1]항에 기재한 DNA 나노케이지.

[3] 3종의 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이제이션에 의해 2차원적으로 집합시켜, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를 형성하는 공정과, 얻어진 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를, 3차원적으로 자기상보말단을 모두 소비하도록 자기조직화하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지의 제조방법.

[4] 상기 3종의 올리고뉴클레오티드를 0 내지 10℃에서 혼합해서 하이브리다이제이션을 행하는 것을 특징으로 하는 상기 [3]항에 기재한 DNA 나노케이지의 제조방법.

[5] 상기 [1] 또는 [2]항에 의한 DNA 나노케이지를 1차원방향으로 연결해서 융합한 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지튜브.

[6] 상기 [1] 또는 [2]항에 의한 DNA 나노케이지에 금속 나노입자 또는 단백질을 내포시킨 것을 특징으로 하는 분자캐리어.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 DNA 나노케이지는, 도 1에 표시한 바와 같이, 3종의 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이제이션에 의해 2차원적으로 집합시켜, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향 분기된 2중쇄 DNA를 형성하고, 이 3방향 분기된 2중쇄 DNA를, 3차원적으로 자기상보말단을 모두 소비하도록 자기조직화함으로써 제조하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 DNA 나노케이지는, 하이브리다이제이션에 의해 집합화시킴으로써, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향 분기된 2중쇄 DNA를 얻고, 이들이 더욱 말단을 모두 소비하도록 집합화해서 나노케이지를 구축하도록 설계되어 있다.

따라서, 이와 같은 서열설계조건을 만족하는 한, DNA서열은 임의이다. 일례로서, 도 2에 DNA 나노케이지를 제작하는 올리고뉴클레오티드의 서열을 표시한다. 각 3'-말단에 자기상보 1본쇄 DNA를 지닌 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를 형성하도록 설계한 3종의 올리고뉴클레오티드쇄를 합성한다. 즉, 예를 들면, 주로 구아닌과 시토신의 상보쌍으로부터, 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA인 트리고날 스포크형 복합체(trigonal spoke type complex)를 형성시키고, 더욱 아데닌과 티민에 의한 페이스트(paste)부위에서 DNA의 고차원 구조의 형성을 가능하게 하는 바와 같은 염기서열을 설계한다.

본 발명에 있어서, 자기상보말단이란, 5'-말단쪽으로부터 읽을 경우의 서열과 3'-말단쪽으로부터 읽을 경우의 서열이 상보적인(A에 대해서 T, G에 대해서 C를 상보적이라고 말함) DNA서열을 지닌 1본쇄 DNA말단을 말한다. 이와 같은 서열은, 그 자체에 의해서 2중쇄 DNA를 형성하는 것이 가능하다. 예를 들면, 5'-GCTTCGATCGAAGC-3'는 자기상보성 서열이다.

본 명세서에 있어서, 올리고뉴클레오티드란, 데옥시리보스와 핵산염기로 이루어진 뉴클레오시드가, 각각 올리고머로로부터 인산디에스테르결합을 통해 연결된 (수개의 뉴클레오시드로부터 수십개의 뉴클레오시드로) 화합물을 말하며, 2중쇄(혹은 2본쇄) DNA란, 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이제이션에 의해서 2중 나선을 형성한 복합체를 말한다.

본 발명에 있어서의 3종의 올리고뉴클레오티드쇄의 합성방법은 제한없으나, 일반적으로 포스포로아미다이트법을 이용한 자동합성기 등에서 합성된다.

본 발명에 있어서의 DNA 나노케이지의 제조방법에 있어서는, 2중쇄 DNA가 해리하는 온도(융해온도)보다도 낮은 온도에서 행하는 것이 바람직하다. 융해온도는, 올리고뉴클레오티드의 서열에 의존한다. 예를 들면, 도 2에 표시한 길이 및 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드의 경우에는, 약 35℃에서 2중쇄가 해리하여 1본쇄로 된다.

본 발명에 있어서의 3종의 올리고뉴클레오티드를 온도 0 내지 10℃에서 혼합하여, 하이브리다이제이션하는 것이 바람직하다. 여기서, 온도가 이 범위밖으로 되면, 3방향 분기된 2중쇄 DNA는 형성되나, 자기상보말단이 조직화해서 케이지로 되지 않는 경향이 보여진다.

본 발명에 있어서의 3종의 올리고뉴클레오티드의 길이는, 10량체(10-mer) 내지 100량체 정도가 바람직하다. 여기서, 길이가 10량체보다도 짧아지면, 융해온도가 저하하므로, DNA쇄의 하이브리다이제이션이 일어나기 어려워, 케이지가 형성되지 않는다고 하는 경향이 있다. 길이가 100량체보다도 길어지면, 명확한 구조체가 관찰되기 어렵다고 하는 경향이 있다. 또, 3종의 올리고뉴클레오티드의 길이는, 동일해도, 각각 달라도 된다. 길이가 동일하면 대칭성이 높은 집합체가 얻 어지므로, 구형상의 케이지를 얻기에는 바람직하다. 다른 길이를 이용함으로써, 예를 들면, 계란형상의 비대칭 구조체를 구축하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 3종의 올리고뉴클레오티드의 전체 농도는, 1μM이상이 바람직하다. 여기서, 1μM보다도 낮아지면, DNA끼리의 수소결합이 충분하게 일어날 기회가 없어지므로, 하이브리다이제이션이 일어나지 않아, 집합체 형성이 관찰되지 않고, DNA 나노케이지가 관찰되지 않는다고 하는 경향이 있다.

본 발명에 관한 DNA 나노케이지의 제조방법에 있어서, 3종의 올리고뉴클레오티드 수용액의 염강도는, 0.25M 내지 1.0M이 바람직하다. 여기서, 0.25M보다도 낮아지면, 정전반발때문에 2중쇄 형성이 일어나기 어려워, DNA 나노케이지가 관찰되기 어렵다고 하는 경향이 있고, 1.0M보다도 높아짐에 따라, DNA 나노케이지끼리 접착한다고 하는 경향이 있다. 따라서, 독립의 나노케이지를 관찰하기 위해서는, 약 0.5M정도의 염강도가 적합하다.

본 발명에 관한 DNA 나노케이지의 제조방법에 있어서, 이용되는 염은 특히 한정되는 것은 아니다. 1가의 금속염이 이용되면, 특히 염의 종류에는 관계없이 나노케이지가 제조가능하며, 이들 중에서도, NaCl이 바람직하게 이용된다.

본 발명에 있어서의 3방향분기된 2중쇄 DNA(도 3 참조)가 더욱 3차원적으로 자기상보말단을 모두 소비하도록 자기조직화함으로써, DNA 나노케이지를 얻는 것이 가능하다. 이 DNA 나노케이지 모델을 도 4에 표시한다. 그들의 크기나 형상은, DNA서열, DNA의 길이, DNA의 농도, 염강도 등에 따라 적절하게 조정가능하다.

본 발명에 있어서 DNA 분자집합체의 자기조직화는, 수용액중에서 행하는 것 이 바람직하나, 기-액 계면에서 자기조직화를 행하는 것도 가능하다.

본 발명에 관한 DNA 나노케이지는, DNA만으로 구성되고, 내부가 중공인 케이지형상 집합체이다. 그 형상은, 다면체 구조, 예를 들면, 구형상, 계란형상 등을 들 수 있으나, 이들 형상으로 한정되는 것은 아니고, 조건을 변경함으로써 다양한 형태로 변화한다. 특히 케이지 내부에 나노입자를 내포하기 쉽게 하기 위해서, 구형상이 적합하다. 또, 올리고뉴클레오티드의 농도를 변화시킴으로써, 튜브형상 집합체인 DNA 나노튜브를 형성하는 것도 가능하다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 농도를 2μM, 염강도를 1M로 하면, 50nm정도의 구형상 집합체가 더욱 조직화해서 네트워크구조를 형성하고, 올리고뉴클레오티드 농도를 5μM, 염강도를 0.5M로 하면, 50 내지 200nm정도의 크기의 구형상 집합체가 형성된다. 또, 올리고뉴클레오티드 농도를 50μM이상, 염강도를 0.5M로 하면, 직경 20nm정도, 길이 1㎛를 지닌 DNA 나노케이지가 형성된다.

본 발명에 있어서 구형상으로 형성된 DNA 나노케이지의 직경은 20 내지 200nm가 바람직하다. 직경은, DNA 나노케이지를 이용하는 목적에 따라서 적절하게 변경하는 것이 가능하다. 예를 들면, 나노케이지가 단백질을 2개 혹은 3개 내포할 경우에는, 직경이 작은 케이지가 바람직하고, 바이러스와 같은 큰 것을 내포할 경우에는, 직경이 큰 케이지가 바람직하다.

본 발명에 관한 DNA 나노튜브는, DNA 나노케이지가 1차원방향으로 연결되어 융합된 구조를 지닌다. 즉, DNA 나노튜브가 융해해서 보다 큰 분자집합체인 DNA 나노튜브로 성장하는 것으로 여겨진다. 또, 연결된 DNA 나노케이지의 수는 특히 한정되지 않는다.

이 DNA 나노튜브의 모델을 도 5에 표시한다.

본 발명에 관한 DNA 나노튜브의 크기는, 특히 한정되지 않지만, 직경 1 내지 50nm정도, 길이 100nm 내지 10㎛가 바람직하다. 직경 및 길이가 이들 범위로부터 벗어나면, DNA 나노튜브가 나노오더영역으로부터 일탈하여, 튜브형상이라고 말하기 곤란하다.

본 발명에 관한 DNA 나노케이지 혹은 DNA 나노튜브는, 나노케이지의 내부공간에 금, 은, 백금, 팔라듐 등의 금속 나노입자, 황화 카드뮴, 셀렌화 카드뮴, 황화 아연 등의 반도체 나노입자, 산화티탄 등의 광촉매 나노입자, 산화철 등의 자성 나노입자, 실리카 입자, 헤테로폴리산, 플라스틱 미립자, 바이러스, 단백질, 펩티드, 다당, 기타의 DNA 등의 나노입자를 복수개 내포해서, 분자캐리어로서 이용할 수 있고, 온도 등의 환경변화에 응답해서, 내포물을 방출하는 것이 가능하다.

구체적으로는, 카티온성 및 아니온성의 금 나노입자나, 단백질 페리틴이 이 DNA 나노케이지, 즉 DNA로 이루어진 케이지에 복수개 내포될 수 있다. 이들 DNA집합체는 온도나 이온강도에 의해 해리 및 재구축이 제어될 수 있으므로, 단백질 의약을 내포한 DNA집합체를 이용해서 열에 응답한 약물방출시스템을 구축할 수 있는 것으로 여겨진다. 또, DNA집합체를 구성하고 있는 1개의 DNA쇄의 완전상보쇄의 존재에 의해서도, DNA집합체를 해리시키는 것이 가능하므로, 어느 특정 유전자서열에 응답한 약물방출시스템을 구축하는 것도 가능하다. 또한, 올리고뉴클레오티드에 당쇄 등을 부가시켜 세포특이성을 부여함으로써, 신규의 약물전달체계로서도 유용하다.

한편, 금속 나노입자는, 양자사이즈효과에 의해 벌크금속과는 다른 광학적·전기적·자기적 성질을 나타내는 것이 알려져 있다.

본 발명에 의한 DNA 나노케이지 혹은 DNA 나노튜브는, 금속 나노입자의 집합상태를 제어해서 해당 금속 나노입자를 복수개 내포할 수 있다. 나노입자가 집합함으로써, 단독의 나노입자와는 다른 물성이 발현된다. 예를 들면, 금 나노입자의 플라스몬 흡수는, 집합체의 형성시 장파장쪽으로 시프트하는 것이 명백하다. 단백질 내포 DNA집합체의 경우와 마찬가지로, 이 금 나노입자를 내포한 DNA집합체는, 온도나 특이적 분자인식에 의해서 해리 및 재구축이 제어될 수 있으므로, 온도나 특이적 분자인식에 의해서 광학적 특성을 변화시키는 디바이스를 구축할 수 있다. 또, 이들 DNA집합체의 존재하에 나노입자의 작성을 행하면, 특이한 사이즈 및 형상의 나노입자를 작성할 수 있다. 이들 수법은, 반도체 및 자성 입자에도 적용가능하다.

본 발명에 있어서, DNA 나노케이지내 혹은 DNA 나노튜브내에 내포할 수 있는 나노입자의 크기는, 2nm 내지 200nm가 바람직하다. 여기서, 2nm보다 작아짐에 따라, DNA 나노케이지의 격자의 공간으로부터 나노입자가 누설할 염려가 있고, 200nm보다 크게 되면, 지나치게 커서, 나노입자가 DNA 나노케이지에 내포되기 어렵다고 하는 염려가 있다.

본 발명에 있어서, DNA 나노케이지내 혹은 DNA 나노튜브내에 내포할 수 있는 나노입자의 수는, 나노입자의 크기에 따라 적절하게 변경하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서의 나노입자의 DNA 나노케이지에의 결합을 용이하게 하기 위해서, 카티온성이나 아니온성의 보호제 분자를 이용해서 나노입자를 작성하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서의 나노입자는, 그 표면전하에 의해 DNA 나노케이지 혹은 DNA 나노튜브의 부착장소가 다르다. 예를 들면, 정전하의 경우에는, DNA 나노케이지의 표면(내부 및 외부)에 부착하고 있는 것으로 여겨지나, 중성 및 음전하의 경우에는, DNA 나노케이지의 내부 수상에 존재하고 있고, DNA와는 직접 상호작용하고 있지 않은 것으로 여겨진다.

DNA 나노케이지 혹은 DNA 나노튜브에의 나노입자의 내포방법은, 특히 한정되는 것은 아니지만, 나노입자의 존재하에, DNA 나노케이지의 수용액을 일단 약 70℃로 가열하여, 나노케이지를 해리시킨 후, 10℃까지 온도를 낮춤으로써, 나노케이지가 재구축됨에 따라 나노입자가 내포된다.

도 1은 본 발명에 있어서의 DNA 나노케이지의 제조공정도

도 2는 본 발명에 있어서의 3종의 올리고뉴클레오티드의 일례를 표시한 도면

도 3은 본 발명에 있어서의 3방향 분기된 2중쇄 DNA의 일례를 표시한 도면

도 4는 본 발명에 있어서의 DNA 나노케이지의 모델을 표시한 도면

도 5는 본 발명에 있어서의 DNA 나노튜브의 모델을 표시한 도면

도 6은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 DNA나노케이지의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 7은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 DNA나노케이지의 동적 광산란에 의한 입자직경분포를 표시한 그래프

도 8은 엑소뉴클레아제 III에 의한 DNA 나노케이지의 절단반응의 경시변화를 표시한 도면

도 9는 본 발명의 실시예 2에 있어서의 DNA 나노케이지의 네트워크의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 10은 본 발명의 실시예 3에 있어서의 DNA 나노케이지의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 11은 본 발명의 실시예 4에 있어서의 DNA 나노튜브의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 12는 본 발명의 실시예 5에 있어서의 DNA 나노케이지에 내포된 카티온성 금 나노입자자의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 13은 본 발명의 실시예 6에 있어서의 DNA 나노케이지에 내포된 아니온성 금 나노입자의 투과형 전자현미경상을 표시한 사진

도 14는 본 발명의 실시예 7에 있어서의 DNA 나노케이지에 내포된 금속단백질 페리틴의 전자현미경상을 표시한 사진

이하, 실시예를 참조해서 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이들 예는 단지 실시예인 바, 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 또, 본 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위에서 변경시켜도 된다.

실시예 1

도 2에 표시한 서열의 3종의 30량체(30-mer) 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 1μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하여, 12시간 숙성시켰다.

이 용액을 10℃에서 TEM 그리드(grid)에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라닐로 염색해서 투과형 전자현미경 관찰을 행하였다. 그 결과를 도 6에 표시한다.

도 6에 있어서, 직경 20 내지 70nm정도의 구형 집합체가 관찰되었다.

또, 동적 광산란(DLS)측정에 의해서, 도 7에 표시한 바와 같이, 직경 20 내지 70nm의 집합체가 구축되어 있는 것이 확인되었다. 해당 도면에 있어서, 20 내지 70㎜이외에도 700nm부근에 피크가 있으나, 이것은 케이지끼리 회합해서 외견상 피크가 나타나고 있는 것으로 여겨진다.

이들 실험 결과로부터, 도 6에서 관찰된 DNA의 구형상 집합체는, 3종의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이제이션하여, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향 분기된 2중쇄 DNA를 형성한 후, 자기상보말단을 모두 소비하도록 상기 2중쇄 DNA를 집합화함으로써 구축되어 있는 것으로 여겨진다.

다음에, DNA를 말단으로부터 절단하는 뉴클레아제에 의한 절단활성을 조사하여, DNA구형상 집합체의 구조를 확인하였다.

즉, 상기에서 얻어진 DNA 구형상 집합체를 리가제에 의해 연결해서, 멍빈 뉴클레아제(Mung Bean Nuclease)에 의해 여분의 1본쇄 DNA를 제거한 후, 3'-말단으로 부터 2본쇄를 특이적으로 절단하는 엑소뉴클레아제(Exonuclease) III에 의해 절단활성을 조사하였다. 그 결과를 표 8에 표시한다.

도 8로부터 명백한 바와 같이, 말단을 지닌 2본쇄 DNA가 절단되는 조건(660mM Tris-HCl 완충액, 6.6mM MgCl₂, pH 8, 엔자임 70유닛(enzyme 70 unit), 37℃)하에 있어서, 라이게이션한 DNA집합체는 모두 절단되어 있었다. 따라서, 본 실시예에서 얻어진 DNA 구형상 집합체는, 나노케이지형상인 것이 증명되었다.

실시예 2

실시예 1과 마찬가지 서열의 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 2μM로 되도록 1M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

이 용액을, 10℃에서 TEM 그리드에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라닐로 염색해서 투과형 전자현미경관찰을 행하였다. 그 결과를 도 9에 표시한다.

도 9로부터, 직경 30 내지 50nm정도의 구형상 집합체가 더욱 조직화해서 네트워크 구조를 형성하고 있는 것을 알 수 있다.

실시예 3

실시예 1과 마찬가지 서열의 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 5μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

이 용액을, 10℃에서 TEM 그리드에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라 닐로 염색해서 투과형 전자현미경관찰을 행하였다. 그 결과를 도 10에 표시한다.

도 10에 있어서, 직경 50 내지 200nm정도의 구형상 집합체가 더욱 조직화해서 네트워크구조를 형성하고 있는 것을 알 수 있다.

실시예 4

실시예 1과 마찬가지 서열의 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 50μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

이 용액을, 10℃에서 TEM 그리드에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라닐로 염색해서 투과형 전자현미경관찰을 행하였다. 그 결과를 도 11에 표시한다.

도 11에 있어서, 직경 20nm정도, 길이 1㎛인 DNA 나노튜브가 형성되는 것을 알 수 있다.

비교예 1

실시예 1과 마찬가지 서열의 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 1μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 30℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

이 용액을, 30℃에서 TEM 그리드에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라닐로 염색해서 투과형 전자현미경관찰을 행하였다.

그 결과, 3종의 올리고뉴클레오티드를 혼합하는 온도가 30℃였으므로, 자기 상보말단부분의 DNA 2중쇄가 해리되어, 구형상 집합체는 관찰되지 않았다.

비교예 2

실시예 1과 마찬가지 서열의 올리고뉴클레오티드중 2종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 1μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

이 용액을, 10℃에서 TEM 그리드에 적하하고, 얻어진 시료를 아세트산 우라닐로 염색해서 투과형 전자현미경관찰을 행하였다.

그 결과, 실시예 1과 같은 구형상 집합체는 관찰되지 않았다.

비교예 3

자기상보말단을 지니지 않은 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드를, 전체 올리고뉴클레오티드 농도 = 1μM로 되도록 0.5M NaCl수용액중에 10℃에서 혼합하고, 12시간 숙성하였다.

실시예 5

4급 암모늄염으로 보호된 카티온성 금 나노입자(평균입자직경 2.2nm) 1.4mM의 존재하에, 실시예 1과 마찬가지 서열의 3종의 30량체 올리고뉴클레오티드 1μM을, 0.5mM NaCl수용액중에 10℃에서 조직화해서, 분자캐리어를 작성하였다.

그 후, 염색하지 않고 TEM관찰을 행하였다. 그 결과를 도 12에 표시한다.

도 12에 있어서, 금 나노입자가 20 내지 70nm정도의 집합체를 형성하고 있는 것을 알 수 있었다. 이 DNA를 아세트산 우라닐로 염색하면, 해당 염색된 부분은, 금 나노입자가 집합하고 있는 부분과 일치하는 것을 알 수 있었다.

또, 금 나노입자의 플라스몬 흡수밴드는, 조직화를 통해 26nm정도 레드-시프트(red-shift)하였다. 이것은, 금 나노입자가 DNA 나노케이지에 내포되어 있기 때문에 일어난 것으로 여겨진다.

실시예 6

DNA 나노케이지의 내부공간에 내포되는 게스트분자로서 아니온성 금 나노입자를 이용한 이외에는, 실시예 5와 마찬가지로 해서, 분자캐리어를 작성하였다.

실시예 5와 마찬가지로 해서, TEM관찰을 행하였다. 그 결과를 도 13에 표시한다.

도 13에 있어서, 금나노입자가 2.5 내지 30nm정도의 집합체를 형성하고 있는 것을 알 수 있다. 이 DNA를 아세트산 우라닐로 염색하면, 해당 염색부분이 금 나노입자가 집합하고 있는 부분과 일치하는 것을 알 수 있다.

실시예 7

DNA 나노케이지의 내부공간에 내포되는 게스트분자로서 금속단백질인 페리틴을 이용한 이외에는, 실시예 5와 마찬가지로 해서, 분자캐리어를 작성하였다.

실시예 5와 마찬가지로 해서, TEM관찰을 행하였다. 그 결과를 도 14에 표시한다.

도 14에 있어서, 페리틴이 8 내지 25nm정도의 집합체를 형성하고 있는 것을 알 수 있다. 이 DNA를 아세트산 우라닐로 염색하면, 해당 염색부분이 페리틴이 집합하고 있는 부분과 일치하는 것을 알 수 있다.

본 발명에 관한 DNA 나노케이지는, DNA로부터 1단계의 과정에 의해서 간편하게 작성할 수 있고, 내부에 나노입자를 내포할 수 있으므로, DNA를 이용한 기능성 재료의 개발에의 효과는 상당하다. 또한, 나노영역으로부터 메소스코픽영역까지 폭넓은 영역의 테크놀로지분야로 전개할 수 있는 가능성을 지니고 있고, 차세대의 다기능성 재료로서도 이용할 수 있다. 또, DNA 나노케이지 내부에 단백질 의약을 내포시키고, 케이지 표면에 세포 표적성 분자를 결합시킴으로써, 표적성이 있고, 또 온도나 DNA 분자인식에 응답해서 단백질 의약물을 서서히 방출하는 약물전달체계의 신규캐리어로서도 이용가능하다.

또, 본 발명에 관한 DNA 나노케이지는, 혼합하는 것만으로 거의 에너지를 필요로 함이 없이 작성가능하므로, 분자캐리어로서의 이용성이 높다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열설계된 3종의 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이제이션에 의해 2차원적으로 집합시킨 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를, 자기조직화해서 형성된 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지.
제 1항에 있어서, 상기 나노케이지가 구형상으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지.
3종의 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이제이션에 의해 2차원적으로 집합시켜, 말단에 자기상보쇄를 지닌 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를 형성하는 공정과, 얻어진 3방향으로 분기된 2중쇄 DNA를 3차원적으로 자기상보말단이 모두 2중쇄를 형성하도록 자기조직화하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 3종의 올리고뉴클레오티드를 0 내지 10℃에서 혼합해서 하이브리다이제이션을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지의 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 의한 DNA 나노케이지를 1차원방향으로 연결해서 융합한 것을 특징으로 하는 DNA 나노케이지튜브.
제 1항 또는 제 2항에 의한 DNA 나노케이지에 금속 나노입자 또는 단백질을 내포시킨 것을 특징으로 하는 분자캐리어.