KR100586567B1 - How to Determine LBP in Body Fluids - Google Patents

Abstract

본 발명은 피검자에게서 수득한 혈장을 면역검정함을 포함하는, 피검자의 혈액을 함유한 체액내의 세포외 LBP 의 존재를 정량하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of quantifying the presence of extracellular LBP in a body fluid containing blood of a subject, comprising immunoassay of the plasma obtained from the subject.

Description

체액내 LBP 의 정량 방법Determination of LBP in Body Fluids

본 발명은 혈액 시료를 포함한 체액 시료내에서 리포다당체 결합 단백질(이하 LBP 라 함)의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 내독소에 대한 피실험자의 노출을 결정하기 위한 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for determining the presence of lipopolysaccharide binding protein (hereinafter referred to as LBP) in a bodily fluid sample including a blood sample. The invention also relates to a kit for determining exposure of a subject to endotoxin.

리포다당체(이하 LPS 라 함)는 그람-음성 박테리아 외막의 공통 성분이며 그람-음성 박테리아 감염 및 내독소혈증과 관련된 많은 병적 작용의 원인이다. 박테리아 감염과 패혈증 사이에 연관이 있으므로, 내독소의 혈청/혈장 수준과 질병을 서로 관련시키고자 시도하였다. 일반적으로, 내독소 수준은 리물루스(Limulus) 아메바양세포 용해질(이하 LAL 이라 함) 검정을 이용하여 측정하며, 여기서 내독소는 물리적으로, 혼탁도 측정으로, 또는 분광광도법으로 측정할 수 있는 응고 캐스케이드(cascade)를 개시한다. 그러나, 이와 같은 시도에도 불구하고, 내독소 수준과 패혈증의 위중성(severity) 사이에 믿을만한 상호관계나 성과는 확인되지 않았다. 이는 대부분 다음과 같은 사실 때문일 것이다 ; (i) 패혈증 환자의 내독소 수준은 매우 낮고(> 10 pg/L), (ii) 몇몇 혈청 단백질이 단백질 가수분해 LAL 캐스케이드를 간섭하고 (iii) 혈액과 접촉시켰을 때, 내독소는 고-밀도 지방단백질(이하 HDL 이라 함)과 저-밀도 지방단백질(이하 LDL 이라 함)을 포함하는 다양한 혈액 성분과의 상호작용으로 “해독”될 수 있으며 (iv) 다른 그람-음성 유기체의 내독소가 LAL 캐스케이드를 개시시키는 능력을 변화시킨다. 따라서 환자 시료내 내독소의 절대수준은 생체내에 존재하는 생물 활성 내독소의 실농도와 일치하지 않는다.Lipopolysaccharide (hereinafter referred to as LPS) is a common component of the Gram-negative bacterial outer membrane and is responsible for many pathological actions associated with Gram-negative bacterial infections and endotoxinemia. Since there is a link between bacterial infection and sepsis, an attempt was made to correlate disease with serum / plasma levels of endotoxins. In general, endotoxin levels are determined using the Limulus amoeba cell lysate (hereinafter referred to as LAL) assay, where endotoxins are clotting that can be measured physically, turbidity measurement, or spectrophotometrically. Initiate a cascade. However, despite these attempts, no reliable correlations or outcomes have been identified between endotoxin levels and the severity of sepsis. This is mostly due to the fact that: Endotoxin levels are high-density when (i) endotoxin levels in sepsis patients are very low (> 10 pg / L), and (ii) some serum proteins interfere with the proteolytic LAL cascade and (iii) contact with blood. Interaction with various blood components, including lipoproteins (hereinafter referred to as HDL) and low-density lipoproteins (hereinafter referred to as LDL), and (iv) endotoxins from other Gram-negative organisms Change the ability to initiate a cascade. Therefore, the absolute level of endotoxin in patient sample does not match the actual concentration of biologically active endotoxin in vivo.

인체 및 다른 동물에서 LPS 와 고 친화력으로 결합하는 2 개의 관련 단백질이 확인되었다. 이들 두 단백질, 리포다당체 결합 단백질(LBP)과 살균/투과성 증가 단백질(이하 BPI 라 함)은 대략 동일한 분자량을 가지고 45 % 의 아미노산 상동성을 공유하나, 뚜렷한 생리학적 차이를 나타낸다. LBP 는 간에서 합성된 60 kD 당단백질인 반면에 BPI 는 호중구의 아주르친화성 과립에서 발견된다. LBP 는 정상 인체의 혈청에서 5 - 10 ㎍/mL 의 수준으로 발견되나 패혈증 환자에게서는 50 - 100 ㎍/mL 의 수준에 도달할 수 있다. Schumann 등의 Science, 249 : 1429 (1990) 문헌에는 인체 및 토끼 LBP 둘 다의 아미노산 서열 및 암호화 cDNA 에 관하여 기술되어 있다. BPI 와 같이, LBP 는 지질 A 에 대한 결합부위를 가지며 조형(R-) 및 평활형(S-) 박테리아의 LPS 와 결합한다. BPI 와 다르게, LBP 는 중요한 살균 활성도를 지니지 않는다. BPI 는 LBP 와 LPS 및 단구와 대식세포 상의 CD14 와의 상호작용의 결과로 나타나는 TNF 의 생성을 매개하고 저해하는 것으로 관찰되었다. Marra 등의 J. Immunol. 148 : 532 (1992), Weiss 등의 J. Clin. Invest. 90 : 1122 (1992) 문헌을 참조하시오. 대조적으로, LBP 는 LPS-유도 TNF 생성을 증가시킨다고 관찰되었다. Wright 등의 Science, 249 : 1131 (1990) 문헌을 참조하시오. 따라서, BPI 와는 대조적으로 LBP 는 면역자극 분자로 인지되었다. 예를들어, LBP-β 라고 명명한 LBP 의 변이형에 관해 기술한 Seilhamer 의 PCT 국제 출원 제 WO 93/06228 호를 참조하시오. 또한 다른 문헌들 중에서 본 발명에 흥미있는 문헌은 항-패혈증 치료제로서 항-LBP 항체에 관하여 기술한, Ulevitch 의 PCT 국제 출원 제 WO 91/01639 호 및 LBP 와 관련되고, LBP 에 대해 상동성을 가지는 폴리펩티드와 면역반응하는 항체에 관하여 기술한 미국 특허 번호 제 5,245,013 호이다.Two related proteins have been identified that bind with LPS with high affinity in humans and other animals. These two proteins, lipopolysaccharide binding protein (LBP) and bactericidal / permeable increasing protein (hereinafter referred to as BPI), have approximately the same molecular weight and share 45% amino acid homology, but show distinct physiological differences. LBP is a 60 kD glycoprotein synthesized in the liver, while BPI is found in neutrophils of azurogenic granules. LBP is found at levels of 5-10 μg / mL in serum of normal humans but can reach levels of 50-100 μg / mL in patients with sepsis. Schumann et al., Science, 249: 1429 (1990), describe amino acid sequences and coding cDNAs of both human and rabbit LBPs. Like BPI, LBP has a binding site for lipid A and binds to LPS of prototyping (R-) and smoothing (S-) bacteria. Unlike BPI, LBP does not have significant bactericidal activity. BPI was observed to mediate and inhibit the production of TNF resulting from the interaction of LBP with LPS and CD14 on monocytes and macrophages. Marra et al. J. Immunol. 148: 532 (1992), Weiss et al. J. Clin. Invest. 90: 1122 (1992). In contrast, LBP was observed to increase LPS-induced TNF production. See Wright, Science, 249: 1131 (1990). Thus, in contrast to BPI, LBP was recognized as an immunostimulatory molecule. See, eg, Seilhamer's PCT International Application No. WO 93/06228, which describes a variant of LBP named LBP-β. In addition, among other documents, the documents of interest to the present invention are related to Ulevitch's PCT International Application No. WO 91/01639 and LBP, which describe the anti-LBP antibody as an anti-septic agent, and have homology to LBP. US Pat. No. 5,245,013, which describes antibodies that immunoreact with polypeptides.

본 기술 분야에서는 LBP를 "급성기 단백질(acute phase protein)" 로서 특징 지우며, 이는 감염 및 비감염 조직의 파괴과정에 반응하여 농도가 증가하는 많은 혈장 단백질(C-반응성 단백질, 피브리노겐 및 혈청 아밀로이드 A) 중의 하나이다. 상기와 같이, LBP 수준이 류마티스성관절염과 홍반성루푸스와 같은 많은 자가면역 질병을 앓고 있는 환자의 시료에서 상승됨이 예상된다.In the art, LBP is characterized as an “acute phase protein”, which is found in many plasma proteins (C-reactive protein, fibrinogen and serum amyloid A) that increase in concentration in response to the destruction of infected and uninfected tissues. One. As described above, it is expected that LBP levels are elevated in samples of patients suffering from many autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and lupus erythematosus.

본 발명에서 흥미있는 것은 피검자의 BPI 활성도 검정과 관련된 설명이다. von der Mohien 등의 Abstract, 13th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brussels (1993. 3)에는 그람-음성 패혈증 환자 및 건강한 피검자의 BPI 혈청 수준에 대한 검정 결과를 기술하고 있다. 이 초록은 BPI 가 건강한 피검자의 혈청에서는 검정 조건 하에서 검출될 수 없는 반면에 순환 BPI 는 모든 패혈증 환자에게서 검출되었음을 기술하였다. 또한 흥미있는 것은 본원에서 참고문헌으로 인용한 1993년 9월 22일자로 제출된 출원 번호 제 08/125,677 호의 일부 계속 출원인 1993년 12월 29일자로 제출된, 공동소유의 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/175,276 호의 명세서이다. 이들 특허 출원은 혈액 혈장 시료내 BPI 수준이 패혈증의 존재나 부재와 상호관련되는 반면에 혈액 혈청 시료내 BPI 수준은 그러하지 않음을 기술하고 있다. 이 특허 출원은 혈청에 존재하는 BPI 수준이 순환 혈액내 BPI 의 내인성 세포외 수준을 나타내지 못하는 반면에 혈장내 BPI 수준은 그러함을 가르친다.Of interest to the present invention are the descriptions relating to the BPI activity assay of the subject. Abstract, 13th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brussels (1993. 3) by von der Mohien et al. describe the results of assays for BPI serum levels in Gram-negative sepsis patients and healthy subjects. This abstract described that circulating BPI was detected in all sepsis patients, while BPI could not be detected under assay conditions in the sera of healthy subjects. Also of interest is the co-owned co-pending US patent application number filed on December 29, 1993, filed on December 29, 1993, which is part of Applicant No. 08 / 125,677, filed on September 22, 1993, incorporated herein by reference. In the specification of 08 / 175,276. These patent applications state that BPI levels in blood plasma samples correlate with the presence or absence of sepsis, while BPI levels in blood serum samples do not. This patent application teaches that BPI levels present in serum do not represent endogenous extracellular levels of BPI in circulating blood, while plasma BPI levels do.

또한 본 발명에 흥미있는 것은 인체 LBP 에 대한 모노클로날 항체의 생성에 관하여 보고한, Leturcq 등의 Keystone Tahoe Endotoxin Conference, March, 1 - 7, 1992 (Abstract) 문헌의 설명이다. LBP 의 존재에 대한 정상 인체 혈청 시료의 선별도 보고되어 있다. 정상 혈청 시료에 대한 LBP 수준은 평균값이 7 ㎍/mL 인, 1 ㎍/mL 내지 24 ㎍/mL 범위인 것으로 보고되었다. 더 흥미있는 것은 패혈증 및 건강한 개인의 혈청내 LBP 및 가용성 CD14 수준에 대한 데이터를 제시한, Richard Ulevitch at the American Society for Microbiology General Meeting in Atlanta, Georgia May 16 - 21 (1993) 문헌의 설명이다. 건강한 어른의 혈청내 가용성 CD14 및 LBP 의 평균농도는 각각 1 ㎍/mL 와 7 ㎍/mL 였다. 패혈증 환자의 혈청내 가용성 CD14 및 LBP 의 평균 농도는 각각 2 ㎍/mL 와 55 ㎍/mL 임이 보고되었다.Also of interest to the present invention is the description of the Keystone Tahoe Endotoxin Conference, March, 1-7, 1992 (Abstract), et al., Reported on the production of monoclonal antibodies against human LBP. Screening of normal human serum samples for the presence of LBP is also reported. LBP levels for normal serum samples were reported to range from 1 μg / mL to 24 μg / mL with mean values of 7 μg / mL. More interesting is the description in the Richard Ulevitch at the American Society for Microbiology General Meeting in Atlanta, Georgia May 16-21 (1993), which presents data on serum LBP and soluble CD14 levels in sepsis and healthy individuals. The mean concentrations of soluble CD14 and LBP in serum of healthy adults were 1 μg / mL and 7 μg / mL, respectively. The mean concentrations of soluble CD14 and LBP in serum of sepsis patients were reported to be 2 μg / mL and 55 μg / mL, respectively.

Geller 등의 Arch. Surg., 128 : 22 - 28 (1993) 문헌은 급성기 반응을 유도하는 공지된 3 가지 모델에서 LBP mRNA 의 유도를 연구한 실험을 기술하고 있다 : (1) LPS 주사 ; (2) 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 주사 ; 및 (3)터펜타인 주사. 이 문헌은 LBP mRNA 가 간의 염증 중에 유도됨을 보고하면서 LBP 가 내독소에 대한 생체내 반응을 조절하는데 중요한 급성기 단백질임을 시사한다.Arch, Geller et al. Surg., 128: 22-28 (1993), describes an experiment studying the induction of LBP mRNA in three known models of inducing acute phase responses: (1) LPS injection; (2) Corynebacterium parvum injection; And (3) terpentine injection. This document reports that LBP mRNA is induced during liver inflammation, suggesting that LBP is an important acute phase protein in regulating in vivo responses to endotoxins.

Gallay 등의 Infect. Immun., 61 : 378 - 383 (1993) 문헌은 LBP 합성에서 유도된 질산은으로 주사한 마우스에서의 급성기 반응, 및 LBP 수준이 급성기 반응 후에 정상 수준보다 약 10 배 증가함을 기술하고 있다.Infect by Gallay et al. Immun., 61: 378-383 (1993), describe acute phase responses in mice injected with silver nitrate induced in LBP synthesis, and LBP levels about 10-fold higher than normal levels after acute phase responses.

내독소에 대한 피검자의 노출을 결정하고, 다른 급성기 생리학적 반응으로 부터 내독소에 대한 노출 효과를 구별하는 방법이 본 기술분야에서 요구된다. 또한 피검자에게서 그람-음성 패혈증의 존재나 위중성을 진단하고, 패혈증에 걸린 피검자의 예후를 예측하는 방법도 요구된다.There is a need in the art for methods of determining subject exposure to endotoxins and distinguishing the effects of exposure to endotoxins from other acute physiological responses. There is also a need for a method for diagnosing the presence or neutrality of Gram-negative sepsis in a subject and predicting the prognosis of the subject with sepsis.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 LBP 를 검정함으로써 내독소에 대한 피검자의 노출을 결정하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 LBP 를 검정함으로써 인체내 급성기 반응에서 그람-음성 박테리아 내독소에 대한 노출을 선별하는 방법을 제공한다. 특히 이 방법은 피검자의 체액 시료내 LBP 의 농도를 결정하고 LBP 의 농도와 내독소에 대한 노출을 지시하는 표준을 상호관련시키는 단계를 포함한다. 상기 표준은 외과수술을 받기 전과 같은 예비처리시 피검자의 LBP 수준에 의해 결정된 규정 피검자에 대한 자각적 표준을 포함할 수 있다. 상기 외과수술로 인한 내독소에 대한 노출은 외과수술 전에 피검자에 대하여 확정된 표준과 외과수술 후 LBP 수준을 비교함으로써 결정할 수 있다. LBP 의 예비처리 표준 수준에 대한 접근이 규정 개인에게 유용하지 않을 경우, 집단이나 부분 모집단 평균을 기초로한 목적 표준을 비교용으로 적용할 수 있다. 그와 같은 하나의 표준은 본원에서 다양한 질병 상태에 있는 피검자에 대한 LBP 값을 결정한 바와 같이, 인체 혈장 또는 혈청 내의 약 15 ㎍/mL 보다 더 큰 농도일 수 있다. 상기 표준 초과의 LBP 수준을 나타내는 피검자는 추정적으로 내독소에 노출되어 있는 것으로 진단할 수 있는 반면에 상기 표준 미만의 수준을 갖는 피검자는 그러하지 않다. 요구되는 검정 방법의 민감성과 선택성 및 규정 피검자의 부분 모집단에 따라 선택적 표준을 확정할 수 있다. 예를들어, 여러 부분 모집단의 상이한 연령, 성별, 인종 및 기초 건강상태에 대한 상이한 수준에서 표준을 확정할 수 있다. 더욱이, 표준수준은 검정하는 특정 체액의 동일성에 따라 상이할 것임을 이해해야 한다.The present invention provides a method for determining a subject's exposure to endotoxin by assaying LBP. The present invention also provides a method of screening exposure to Gram-negative bacterial endotoxin in acute phase response in humans by assaying LBP. In particular, the method includes determining the concentration of LBP in the subject's bodily fluid sample and correlating the standard indicating the concentration of LBP with exposure to endotoxin. The standard may include subjective standards for a defined subject determined by the subject's LBP level at pretreatment, such as prior to surgery. Exposure to endotoxin due to the surgery can be determined by comparing the established standard for the subject prior to surgery with the LBP level after surgery. If access to the LBP's level of pretreatment standards is not useful for the regulatory individual, the objective standard based on group or subpopulation means may be applied for comparison. One such standard may be a concentration greater than about 15 μg / mL in human plasma or serum, as determined herein for LBP values for subjects in various disease states. Subjects with LBP levels above the standard may be diagnosed as being presumably exposed to endotoxin, whereas subjects with levels below the standard are not. Depending on the sensitivity and selectivity of the test method required and the subpopulation of the regulatory subject, an optional standard can be established. For example, standards can be established at different levels for different ages, genders, races, and basic health conditions of different subpopulations. Moreover, it should be understood that standard levels will vary depending on the identity of the specific body fluids being tested.

또한 본 발명은 피검자의 체액 시료내 LBP 의 농도를 결정하고 LBP 의 농도와 패혈증의 존재나 위중성을 지시하는 표준을 상호관련시키는 단계를 포함하는, 피검자에게서 패혈증의 존재나 위중성을 진단하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 피검자의 체액 시료내 LBP 의 농도를 결정하고 LBP 의 농도와 패혈증에 걸린 피검자의 예후를 지시하는 표준을 상호관련시키는 단계를 포함하는, 패혈증에 걸린 피검자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of diagnosing the presence or neutrality of sepsis in a subject, comprising determining a concentration of LBP in a subject's bodily fluid sample and correlating the concentration of LBP with a standard indicating the presence or neutrality of sepsis. To provide. The present invention also provides a method for predicting the prognosis of a subject with sepsis, comprising determining the concentration of LBP in a bodily fluid sample of a subject and correlating the concentration of LBP with a standard indicating a prognosis of the subject with sepsis. do.

또한 본 발명은 친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체, 바이오틴 표지된 토끼의 항-LBP 항체 및 샌드위치 면역검정 시약 등을 포함하는, 내독소에 대한 피검자의 노출을 결정하기 위한 키트를 제공한다.The invention also provides a kit for determining subject exposure to endotoxins comprising affinity purified rabbit anti-rLBP antibodies, biotin labeled rabbit anti-LBP antibodies, sandwich immunoassay reagents, and the like.

제 1 도는 LBP 샌드위치 검정에서 rLBP, rLBP₂₅, rBPI 및 rBPI₂₃ 에 대한 선량-반응 측선을 도시한 것이다 ;1 shows dose-response sidelines for rLBP, rLBP ₂₅ , rBPI and rBPI ₂₃ in the LBP sandwich assay;

제 2 도는 건강한 인체 피검자 및 여러 질병상태에 있는 인체 피검자의 혈장내 LBP 수준(평균 ±표준오차)을 도시한 것이다 ;FIG. 2 shows plasma LBP levels (mean ± standard error) in healthy human subjects and human subjects in various disease states;

제 3 도는 LPS 로 처리한 건강한 피검자의 LBP 수준(평균 ± 평균오차)을 도시한 것이다 ;3 shows LBP levels (mean ± mean error) of healthy subjects treated with LPS;

제 4 도는 고수준 또는 저수준의 혈장 LBP를 갖는 것으로 분류된 그람-음성 패혈증이 의심되는 환자의 비교 생존율을 도시한 것이다 ;4 shows the comparative survival of patients suspected of Gram-negative sepsis classified as having high or low plasma LBP;

제 5a - 5c 도는 건강한 피검자, 류마티스성관절염 및 패혈증 피검자의 LBP, C-반응성 단백질(CRP) 및 피브리노겐 수준(평균 ±표준오차)을 도시한 것이다.5A-5C show LBP, C-reactive protein (CRP) and fibrinogen levels (mean ± standard error) of healthy, rheumatoid arthritis and sepsis subjects.

본 발명은 혈액을 포함하는 체액내 LBP 의 존재를 정량하는 방법에 관한 것이다. 치료학적으로 투여된 LBP 의 존재 및 양을 결정하기 위해 검정법을 이용할 수 있으며, 이는 내독소에 대한 피검자의 노출 전조로서 순환 혈액내 내인성 LBP 의 존재를 정량하는데 특히 유용하다. 더욱이, LBP 의 존재를 정량하는 것은 그람-음성 패혈증 환자를 평가하는 진단 및 예후 방법에 유용할 것이라고 예상된다.The present invention relates to a method of quantifying the presence of LBP in a body fluid comprising blood. Assays can be used to determine the presence and amount of therapeutically administered LBP, which is particularly useful for quantifying the presence of endogenous LBP in circulating blood as a precursor to exposure of endotoxins. Moreover, it is anticipated that quantifying the presence of LBP will be useful for diagnostic and prognostic methods of evaluating Gram-negative sepsis patients.

본 발명은 고 검정 민감성, 고 특이성 및 우수한 재현성을 나타내는 인체 LBP 에 대한 샌드위치 ELISA 검정을 제공한다. 본원에서 사용한 바와 같이 검정법에 의해 정량된 "LBP" 는 천연 LBP, 재조합 LBP, LBP 단편과 유사체 뿐만 아니라 그 밖의 LBP 단백질 및 단백질 산물을 포함한다.The present invention provides a sandwich ELISA assay for human LBP showing high assay sensitivity, high specificity and good reproducibility. As used herein, “LBP” quantified by assays includes native LBP, recombinant LBP, LBP fragments and analogs, as well as other LBP proteins and protein products.

재조합 LBP 의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 본원의 서열번호 : 1 및 2 에 나타난 바와 같이, 1993년 6월 17일자로 제출된 공동소유의 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/029,510 호에 제시되어 있다. 재조합 LBP 아미노-말단 단편은 서열번호 : 3 및 4 에 제시된 LBP 아미노-말단의 첫째 197 아미노산의 아미노산 서열에 의해 특정화되며, 이의 생성에 관하여는 본원에서 참고문헌으로 인용한 1993년 6월 12일자로 제출된 공동소유의 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/079,510 호에 기술되어 있다. 상기 LBP 단백질 산물은 면역학적 검정 및 생물검정을 포함하는 검정법을 이용하여 서브나노그람/mL 범위에서 용이하게 정량될 수 있다. LBP 를 정량할 수 있는 면역학적 검정은 효소 결합 면역흡착(ELISA) 샌드위치 검정에 의해 바람직하게 수행되나 경쟁적 검정 및 다른 표지형을 이용하는 면역학적 검정을 이용할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 검정법은 모노클로날 항체 및 친화-정제된 토끼 폴리클로날 항체를 포함하는 항-LBP 항체를 이용한다. 토끼 폴리클로날 항-LBP 항체는 면역원으로서 LBP를 사용하는 종래 방법에 따라 제조될 수 있다. LBP 에 대한 검정법에 비-면역학적 방법을 사용할 수도 있다. 한 예로서, Ulevitch 등의 미국 특허 출원 번호 제 5,245,013 호에는 LPS 에 LBP 를 결합시키고 원심분리 밀도 기울기법으로 이 복합체를 분리하는 단계로 구성되는 검정 방법이 기술되어 있다. 또 다른 예로서, Geller 등의 Arch. Surg. 128 : 22 - 28 (1993) 문헌에는 IL-6 및 TNF 상향조절(upregulation)을 측정하는 LBP 생물활성도 검정법이 기술되어 있다.Amino acid and nucleotide sequences of recombinant LBPs are shown in co-owned co-pending US patent application Ser. No. 08 / 029,510, filed June 17, 1993, as shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 herein. Recombinant LBP amino-terminal fragments are characterized by the amino acid sequence of the first 197 amino acids of the LBP amino-terminal set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4, the production of which is dated June 12, 1993, incorporated herein by reference. Co-pending co-pending US patent application Ser. No. 08 / 079,510 filed. The LBP protein product can be readily quantified in the subnanogram / mL range using assays including immunological assays and bioassays. Immunological assays capable of quantifying LBP are preferably performed by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) sandwich assays, but competitive assays and immunological assays using other labeled forms may also be used. Preferred assays of the invention utilize anti-LBP antibodies comprising monoclonal antibodies and affinity-purified rabbit polyclonal antibodies. Rabbit polyclonal anti-LBP antibodies can be prepared according to conventional methods using LBP as an immunogen. Non-immunological methods can also be used for assays for LBP. As an example, Ulevitch et al. US Patent Application No. 5,245,013 describes an assay method consisting of binding LBP to LPS and separating this complex by centrifugal density gradient. As another example, Arch. Surg. 128: 22-28 (1993) describe LBP bioactivity assays measuring IL-6 and TNF upregulation.

LBP 의 존재를 검정할 수 있는 체액은 혈청과 혈장을 가지는 전혈을 포함하는 것이 바람직하다. LBP 는 혈청 단백질이기 때문에 분비가 가능하고 요내의 LBP 수준을 분석함으로써 진단 및 예후적으로 유용할 것이라 예상된다. 또한 본 발명의 LBP 면역검정법은 폐 세정액, 유리체액, 극간액, 뇌척수액, 타액 및 활액을 포함하나, 이에 국한되지 않는 다른 체액내 LBP 의 농도를 결정하는데 사용할 수 있다.Body fluids capable of assaying the presence of LBP preferably include whole blood with serum and plasma. Since LBP is a serum protein, it can be secreted and expected to be diagnostically and prognostically useful by analyzing LBP levels in the urine. In addition, the LBP immunoassay of the present invention can be used to determine the concentration of LBP in other body fluids, including but not limited to lung lavage, vitreous fluid, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, saliva and synovial fluid.

LBP 는 "급성기 단백질" 로서 특정화되므로 LBP 수준이 자가면역 질병에 걸린 피검자에게서 상승될 것이라 예상된다. 본 발명의 한 양상으로서, LBP 수준은 일반적으로 급성림프아구성백혈병(ALL), 급성대숙주성이식편병(aGvHD), 만성림프구성백혈병(CLL), 피부 T-세포림프종(CTCL), 1 형 당뇨병, 재생불량성빈형(AA), 크론병, 건선, 류마티스성관절염(RA), 공피증 및 전신홍반성루푸스(SLE)에 걸린 피검자에게서 정상 이상으로 상승되지 않는다고 밝혀졌다.Since LBP is characterized as an "acute protein", it is expected that LBP levels will be elevated in subjects with autoimmune disease. As an aspect of the present invention, LBP levels are generally defined as acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute premature host graft disease (aGvHD), chronic lymphocytic leukemia (CLL), cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), type 1 It has not been found to be elevated above normal in subjects with diabetes mellitus, aplastic anemia (AA), Crohn's disease, psoriasis, rheumatoid arthritis (RA), scleroderma and systemic lupus erythematosus (SLE).

그람-양성 패혈증에 걸린 것으로 최종 확인된 피검자를 제외하고 그람-음성 패혈증에 걸린 것으로 시험적으로 확인된 특정 피검자 역시 LBP 수준이 상승하였다. 박테리아 및/또는 내독소가 장에서 혈류내로 전이되는 것은 임의의 감염에서 발생할 수 있음을 주목해야 한다. 따라서, 그람-양성 박테리아나 진균류에 기인한 감염은 혈액내에 내독소나 그람-음성 박테리아의 존재를 초래할 수 있으므로, LBP 의 수준을 상승시킬 수도 있다.Except for those who were finally identified as having Gram-positive sepsis, certain subjects who were experimentally identified as Gram-negative sepsis also had elevated LBP levels. It should be noted that the transfer of bacteria and / or endotoxins into the bloodstream in the intestine can occur in any infection. Thus, infections caused by Gram-positive bacteria or fungi can lead to the presence of endotoxins or Gram-negative bacteria in the blood, thus raising the level of LBP.

본 발명은 LBP 의 혈청 및 혈장 수준이 생물학적 활성 LPS 에 대한 피검자의 노출과 직접 상호관련된다는 관찰을 일부 기초로 한다. 더욱이, LBP 수준은 그람-음성 패혈증이 의심되는 환자의 생존과 상호관련되는 것으로 여겨진다. 예를들어, 27.3 ㎍/mL(그람-음성 패혈증에 걸린 58 명의 피검자에 대한 중앙값) 이하의 순환 LBP 수준을 지닌 피검자는 중앙값 이상의 LBP 수준을 지닌 피검자보다 14 일 더 많이 생존하는 경향이 있다. 또한, 예를들어, 혈장 LBP 한계치 수준을 46 ㎍/mL 로 맞추었을 때, 46 ㎍/mL 보다 적은 예비처리 LBP 현장 수준을 갖는 피검자는 46 ㎍/mL 보다 큰 예비처리 혈장 LBP 수준을 갖는 피검자에게서 보다 27 일 기간 이상으로 상당히 더 큰 생존률(p = 0.004)을 가졌다.The present invention is based in part on the observation that serum and plasma levels of LBP correlate directly with the subject's exposure to biologically active LPS. Moreover, LBP levels are believed to correlate with survival of patients suspected of Gram-negative sepsis. For example, subjects with circulating LBP levels below 27.3 μg / mL (median for 58 subjects with Gram-negative sepsis) tend to survive 14 days longer than subjects with LBP levels above the median. Also, for example, subjects with pretreatment LBP site levels of less than 46 μg / mL, when subjecting the plasma LBP threshold level to 46 μg / mL, were tested in subjects with pretreatment plasma LBP levels greater than 46 μg / mL. Had a significantly greater survival (p = 0.004) over the 27-day period.

또한 본 발명은 LBP 의 상승된 수준이 더 많은 양의 내독소에 대한 노출로 인한 것이며, 그것으로 보다 큰 감염 및/또는 내독소혈증의 위중성을 진단할 수 있음이 예측된다. LBP 의 상승된 수준은 또한 그람-음성 박테리아에 대해 규제된 항생제, 또는 모노클로날 항체 E5 를 포함하는 항-내독소 항체나 BPI 와 같이 내독소에 직접 표적된 다른 치료제를 사용하는 적합성 여부를 지시하는데 사용될 수도 있다.The present invention also predicts that elevated levels of LBP are due to exposure to higher amounts of endotoxins, whereby it is possible to diagnose the gastric severity of larger infections and / or endotoxins. Elevated levels of LBP also indicate the suitability of using regulated antibiotics for Gram-negative bacteria or anti-endotoxin antibodies comprising monoclonal antibody E5 or other therapeutic agents targeted directly to endotoxins such as BPI. It can also be used to

본 발명의 다른 양상 및 잇점은 다음의 실시예를 고려하여 이해될 것이다. 실시예 1 은 친화 정제된 토끼의 항-BPI 항체의 제조에 관한 것이고 ; 실시예 2 는 상기 항체의 바이오틴 표지에 관한 것이고 ; 실시예 3 은 상기 항체를 사용하는 ELISA 과정에 관한 것이다. 실시예 4 는 rLBP, rLBP₂₅, rBPI 및 rBPI₂₃ 의 비교 면역반응성에 관한 것이다. 실시예 5 는 풀로 만든 인체 혈장내로 스파이크된 rLBP 의 측정에 관한 것이고 ; 실시예 6 은 인체 혈장 및 혈청내 LBP 수준의 비교에 관한 것이다. 실시예 7 은 인체 혈장의 패혈증 및 다른 질병상태와 내인성 LBP 면역반응성과의 임상적 상호관계에 관한 것이고 ; 실시예 8 은 건강한 피검자의 내인성 LBP 수준에 대한 LPS 투여 효과에 관한 것이다. 실시예 9 는 그람-음성 패혈증이 의심되는 환자의 혈장 LBP 수준과 생존 사이의 임상적 상호관계에 관한 것이고 ; 실시예 10 은 건강한 피검자, 류마티스성관절염 및 패혈증 환자에 있어서 급성기 단백질의 임상적 상호관계에 관한 것이다.Other aspects and advantages of the invention will be understood in light of the following examples. Example 1 relates to the preparation of anti-BPI antibodies of affinity purified rabbits; Example 2 relates to biotin labeling of said antibody; Example 3 relates to an ELISA procedure using the antibody. Example 4 relates to the comparative immunoreactivity of rLBP, rLBP ₂₅ , rBPI and rBPI ₂₃ . Example 5 relates to the measurement of rLBP spiked into human plasma made of grass; Example 6 relates to a comparison of LBP levels in human plasma and serum. Example 7 relates to the clinical interrelationship of endogenous LBP immunoreactivity with sepsis and other disease states of human plasma; Example 8 relates to the effect of LPS administration on endogenous LBP levels in healthy subjects. Example 9 relates to a clinical correlation between plasma LBP levels and survival in patients suspected of Gram-negative sepsis; Example 10 relates to the clinical correlation of acute phase proteins in healthy subjects, rheumatoid arthritis and sepsis patients.

실시예 1Example 1

친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체의 제조Preparation of affinity-purified rabbit anti-rLBP antibodies

이 실시예에 따라 친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체를 제조하였다. 특히, 본원에서 참고문헌으로 인용한 1993년 6월 17일자로 제출된 공동소유의 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/079,510 호에 의해 생성된 rLBP(20 mg)를 0.5 NaCl 을 함유하는 0.2 M 중탄산염, pH 8.6 내의 10 mL 시안 브롬-활성화 세파로스 4B(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)에 결합시켰다. rLBP 의 약 94 % 가 수지와 결합되었다. 1993년 6월 17일자로 제출한 미국 특허 출원 번호 제 08/079,510 호의 방법에 따라 생성된 rLBP₂₅ 로 초기 면역시킨 다음 rLBP 로 면역시킨, 2 마리 토끼의 풀로 만든 항혈청(125 mL)을 동부피의 인산염 완충 식염수, pH 7.2 (PBS) 로 희석하였다. 희석된 항혈청의 일부(50 mL)를 10 mL rLBP-세파로스 컬럼에 통과시키고 ; 그런 다음 이 컬럼을 PBS 로 세척하고 결합된 항체를 0.1 M 글리신, pH 2.5 로 용리시켰다. 수집된 분획을 즉시 1 M 인산염 완충액, pH 8.0 으로 중화시켰다. Harlow 등의 Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, New York, p.312 (1988) 문헌의 방법에 따라 280 nm 에서 흡광도를 측정함으로써 피크 분획을 확인하였다. 연달아 및 번의 컬럼 순환 후에 친화 정제된 토끼의 항-LBP 항체를 PBS-아지드, pH 7.2 에 대하여 투석하였다.Anti-rLBP antibodies of affinity purified rabbits were prepared according to this example. In particular, rLBP (20 mg) generated by co-owned co-pending US patent application Ser. No. 08 / 079,510, filed June 17, 1993, incorporated herein by reference, contains 0.2 M containing 0.5 NaCl. Bicarbonate, 10 mL cyan bromine-activated Sepharose 4B in pH 8.6 (purchased from Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). About 94% of rLBP was combined with the resin. Antiserum (125 mL) made from grass of two rabbits, initially immunized with rLBP ₂₅ generated according to the method of U.S. Patent Application No. 08 / 079,510, filed June 17, 1993, and then immunized with rLBP, phosphate in eastern blood Diluted with buffered saline, pH 7.2 (PBS). A portion of diluted antiserum (50 mL) was passed through a 10 mL rLBP-Sepharose column; This column was then washed with PBS and the bound antibody eluted with 0.1 M glycine, pH 2.5. Collected fractions were immediately neutralized with 1 M phosphate buffer, pH 8.0. Peak fractions were identified by measuring absorbance at 280 nm according to the method of Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, New York, p.312 (1988). The anti-LBP antibodies of affinity purified rabbits were successively dialyzed against PBS-azide, pH 7.2 after successive column cycles.

실시예 2Example 2

바이오틴 표지된 토끼의 항-rLBP 항체의 제조Preparation of Anti-rLBP Antibodies in Biotin Labeled Rabbits

이 실시예에서는 실시예 1 의 방법에 따라 생성된 친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체 20 mg 을 11 mL 의 0.1 M 중탄산나트륨, pH 8.3 내의 2 mg 바이오틴아미도카프론산염 N-히드록시숙신이미드 에스테르(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)와 함께 실온에서 2 시간 동안 항온시켰다. 비결합된 바이오틴을 제거하고, 0.1 % 아지드 나트륨을 함유하는 PBS 로 평형화시킨 PD-10 컬럼(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오텍 인코포레이티드에서 구입)상에서 반응 혼합물을 분획화 함으로써 알칼리성 완충액을 교환하였다.In this example, 20 mg of the affinity purified rabbit anti-rLBP antibody produced according to the method of Example 1 was added to 2 mL biotinamidocapronate N-hydroxysuccinimide in 11 mL of 0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.3. Incubated for 2 hours at room temperature with ester (purchased from Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Alkaline buffer by removing unbound biotin and fractionating the reaction mixture on a PD-10 column (purchased from Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) equilibrated with PBS containing 0.1% azide sodium Exchanged.

실시예 3Example 3

ELISA 과정ELISA course

친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체(PBS 내의 2 ㎍/mL) 50 μL 를 이뮬론 2 (Immulon 2)(버지니아 챈틸리에 소재하는 다이너테크 라보라토리스 인코포레이티드에서 구입)마이크로플레이트의 웰 내에서 2 - 8 ℃ 로 밤새(또는 택일적으로, 37 ℃에서 1 시간) 항온하였다. 항체 용액을 제거하고 PBS 에 함유되어 있는 1 % 무-지방 우유 200 μL (차단제)를 모든 웰에 가하였다. 평판을 실온에서 1 시간 동안 차단시킨 후, 300 μL 의 세척 완충액(PBS/0.05 % 트윈-20)으로 웰을 3 회 세척하였다.50 μL of affinity-purified rabbit anti-rLBP antibody (2 μg / mL in PBS) was immunized with Imulon 2 (purchased from Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) Incubated overnight at 2-8 ° C. (or alternatively, 1 hour at 37 ° C.). The antibody solution was removed and 200 μL of 1% fat-free milk (blocker) contained in PBS was added to all wells. After the plate was blocked for 1 hour at room temperature, the wells were washed three times with 300 μL of wash buffer (PBS / 0.05% Tween-20).

표준, 시료 및 대조를 개별적인 96-웰 평판 내에서 1 % 소 혈청 알부민, 0.05 % 트윈 20 (PBS-BSA/트윈) 및 10 유닛/mL 의 헤파린 나트륨(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)을 함유하는 PBS 로 3 회 중복하여 희석하였다. rLBP 또는 rLBP₂₅ 표준용액을 100에서 0.012 ng/mL 까지 2 배 계열희석하여 제조하였다. 표준, 시료 및 대조(50 μL)의 각 복제물 및 희석물을 차단된 마이크로플레이트로 옮기고 37 ℃ 에서 1 시간 동안 항온하였다. 제 1 차 항온 후에 웰을 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 바이오틴-표지된 토끼의 항-LBP 항체를 PBS-BSA/트윈으로 1/2000 희석하고 50 μL 를 모든 웰에 가하였다. 그런 다음 평판을 37 ℃ 에서 1 시간 동안 항온하였다. 이어서, 모든 웰을 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 알칼리성 포스파타제-표지된 스트렙타비딘(캘리포니아 샌프란시스코에 소재하는 자임드 라보라토리스 인코포레이티드에서 구입)을 PBS-BSA/트윈으로 1/2000 희석하고 50 μL 를 모든 웰에 가하였다. 37 ℃에서 15 분간 항온한 후, 모든 웰을 세척 완충액으로 3 회, 탈염수로 3 회 세척하고 발색성 기질 p-니트로페닐인산염(10 % 디에탄올아민 완충액 내의 1 mg/mL)을 모든 웰에 50 μL 의 부피로 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 발색현상을 진행시킨 후 반응이 정지되도록 50 μL 의 1 N NaOH 를 가하였다. 브이맥스 플레이트 리더(Vmax Plate Reader)(캘리포니아 멘로 파크에 소재하는 몰레큘라 디바이시즈 코포레이션에서 구입)를 사용하여 모든 웰에 대하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.Standards, samples and controls were prepared in 1% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 (PBS-BSA / Twin) and 10 units / mL of heparin sodium (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in individual 96-well plates. Diluted three times with PBS containing). rLBP or rLBP ₂₅ standard solutions were prepared by dilution series from 100 to 0.012 ng / mL. Each replicate and dilution of the standard, sample and control (50 μL) was transferred to a blocked microplate and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After the first incubation the wells were washed three times with wash buffer. Biotin-labeled rabbit anti-LBP antibodies were diluted 1/2000 with PBS-BSA / Tween and 50 μL was added to all wells. The plate was then incubated at 37 ° C. for 1 hour. All wells were then washed three times with wash buffer. Alkaline phosphatase-labeled streptavidin (purchased from Zymede Laboratoris Inc., San Francisco, Calif.) Was diluted 1/2000 with PBS-BSA / Tween and 50 μL was added to all wells. After 15 minutes incubation at 37 ° C., all wells were washed three times with wash buffer and three times with demineralized water and 50 μL of the chromogenic substrate p-nitrophenylphosphate (1 mg / mL in 10% diethanolamine buffer) was added to all wells. Added in volume. After developing the color development for 1 hour at room temperature, 50 μL of 1 N NaOH was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 405 nm for all wells using a Vmax Plate Reader (purchased from Molecular Devices Corporation, Menlo Park, Calif.).

모든 시료 및 표준(3 회 중복)에 대한 405 nm 에서의 평균 흡광도(A₄₀₅)는 제 1 차 항온단계에서 시료 희석 완충액(LBP 는 없음)만으로 주어진 웰의 평균 A₄₀₅ 를 공제함으로써 배경에 대해 보정하였다. 그런 다음 표준곡선을 ng/mL 의 rLBP 또는 rLBP₂₅ 에 대한 A₄₀₅ 로서 도시하였다. 선형 범위를 선택하여, 선형회귀분석을 수행하고 표준곡선에 기입함으로써 시료와 대조의 농도를 결정하였다.Average absorbance at 405 nm (A ₄₀₅ ) for all samples and standards (3 duplicates) is corrected for background by subtracting the average A ₄₀₅ of a given well with sample dilution buffer (no LBP) in the first incubation step. It was. The standard curve is then shown as A ₄₀₅ for ng / mL of rLBP or rLBP ₂₅ . By selecting the linear range, linear regression analysis was performed and the concentration of the sample and control was determined by writing on the standard curve.

상기에 기재되어 있는 ELISA 과정에 사용한 항체 및 시약들을 구성요소로 포함하는, 내독소에 대한 피검자의 노출을 결정하기 위한 키트를 제조할 수 있다. 제조된 키트는 다음을 포함할 수 있다 : (1) 친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체를 피복시키고 1 % 무-지방 우유로 차단시킨 마이크로플레이트 ; (2) 소 혈청 알부민, 트윈 20(PBS-BSA/트윈) 및 헤파린 나트륨을 함유하는 희석 완충용액 PBS ; (3) rLBP 또는 rLBP₂₅ 표준용액, 시료 및 대조군의 복제물 및 희석물 ; (4) PBS-BSA/트윈으로 희석시킨 바이오틴 표지된 토끼의 항-LBP 항체 ; (5) PBS-BSA/트윈으로 희석시킨 알칼리성 포스파타제-표지된 스트렙타비딘 ; (6) 10 % 디에탄올아민 완충용액에 용해시킨 발색성 기질 p-니트로페닐인산염 ; (7) NaOH ; 및 (8) 세척 완충용액 및 탈염수.Kits for determining subject exposure to endotoxins can be prepared, which comprise the antibodies and reagents used in the ELISA procedure described above as components. The kits prepared may include: (1) microplates coated with an anti-rLBP antibody of affinity purified rabbit and blocked with 1% fat-free milk; (2) dilution buffer PBS containing bovine serum albumin, Tween 20 (PBS-BSA / Twin) and heparin sodium; (3) clones and dilutions of rLBP or rLBP ₂₅ standard solutions, samples and controls; (4) biotin-labeled rabbit anti-LBP antibodies diluted with PBS-BSA / Twin; (5) alkaline phosphatase-labeled streptavidin diluted with PBS-BSA / Twin; (6) color developing substrate p-nitrophenyl phosphate dissolved in 10% diethanolamine buffer solution; (7) NaOH; And (8) wash buffer and demineralized water.

실시예 4Example 4

rLBP, rLBP₂₅, rBPI 및 rBPI₂₃ 의 비교 면역반응성Comparative immunoreactivity of rLBP, rLBP ₂₅ , rBPI and rBPI ₂₃

이 실시예에서는 가능한 면역학적 교차-반응성을 결정하기 위해 rLBP, rLBP₂₅, rBPI 및 rBPI₂₃ 의 면역반응성을 BPI 샌드위치 ELISA 로 비교하였다. LBP BPI 사이에는 상당한 서열 상동성이 존재함[예를들어, Schumann 등의 Science, 249 : 1429 (1990) 문헌 참조]에도 불구하고, 제 1 도에 도시된 결과는 질량기준에 대하여 rBPI₂₃ 이 rLBP₂₅ 및 rLBP 의 크기보다 약 3 차수 적은 크기 신호를 산출한 반면에, rBPI 는 rLBP 및 rLBP₂₅ 의 크기 보다 약 5 차수 적은 크기 신호를 산출하였음을 보여준다. 예를들어, 100,000 ng/mL (100 ㎍/mL)의 rBPI 나 400 ng/mL 의 rBPI₂₃ 의 농도는 0.8 ng/mL 의 rLBP 나 0.4 ng/mL 의 rLBP₂₅ 에 의해 생성된 신호와 동일한 신호를 산출하였다. 이러한 결과는 BPI 와 상기 항체와의 최소 교차-반응성을 설명하며 LBP 에 대한 검정법의 특이성을 확증한다.In this example, the immunoreactivity of rLBP, rLBP ₂₅ , rBPI and rBPI ₂₃ was compared by BPI sandwich ELISA to determine possible immunological cross-reactivity. Despite the significant sequence homology between LBP BPI (see, eg, Schumann et al., Science, 249: 1429 (1990)), the results shown in FIG. 1 show that rBPI ₂₃ is rLBP relative to mass. _{It was shown that} rBPI yielded a magnitude signal that was about three orders of magnitude smaller than the magnitudes of ₂₅ and rLBP, whereas rBPI yielded a magnitude signal that was about five orders of magnitude less than the magnitudes of rLBP and rLBP ₂₅ . For example, a concentration of 100,000 ng / mL (100 μg / mL) rBPI or 400 ng / mL rBPI ₂₃ produces the same signal as that produced by 0.8 ng / mL rLBP or 0.4 ng / mL rLBP ₂₅ . Calculated. These results explain the minimal cross-reactivity of the BPI with the antibody and confirm the specificity of the assay for LBP.

실시예 5Example 5

풀로된 인체 혈장내로 스파이크된(spiked) rLBP 의 측정Determination of rLBP spiked into pooled human plasma

이 실시예에서는 상이한 농도의 rLBP 로 스파이크시킨 풀로된 인체 혈장을 조사함으로써 인체 혈액내 rLBP 의 회수율을 평가한 다음 냉동시키고 샌드위치 ELISA 로 측정하기 전에 해동하였다. 스파이크된 LBP 의 회수율은 스파이크된 인체 혈장 시료에서 측정한 LBP 의 양에서 스파이크 되지 않은 대조의 농도를 빼고, 이를 상기 시료에서 스파이크된 실제량으로 나눔으로써 규정하였다. 회수된 분획에 100 을 곱하여 그 결과를 입력 농도의 백분율로서 나타냈다. 풀로된 인체 혈장 시료 내로 스파이크된 상이한 농도의 rLBP 의 회수율은 평균 68 % 이며 그 범위는 42 ㎍/mL 에서 59 % 내지 168 ㎍/mL 에서 78 % 였다. 표 1 은 각 LBP 스파이크된 혈장 시료에 대한 회수율 데이터를 요약한 것이다.In this example, the recovery of rLBP in human blood was assessed by irradiating pooled human plasma spiked with different concentrations of rLBP and then thawed before freezing and measured by sandwich ELISA. The recovery of spiked LBP was defined by subtracting the concentration of the unspiked control from the amount of LBP measured in the spiked human plasma sample and dividing it by the actual amount spiked in the sample. The recovered fractions were multiplied by 100 and the result is expressed as a percentage of the input concentration. The recovery of different concentrations of rLBP spiked into pooled human plasma samples averaged 68% and ranged from 59% at 42 μg / mL to 78% at 168 μg / mL. Table 1 summarizes the recovery data for each LBP spiked plasma sample.

[표 1]TABLE 1

풀로된 구연산 첨가 인체 혈장내로 스파이크된 rLBP 의 회수Recovery of spiked rLBPs into human plasma with pooled citric acid

실시예 6Example 6

혈장 및 혈청 LBP 수준의 비교Comparison of Plasma and Serum LBP Levels

이 실시예에 따라서 건강한 피검자의 혈청 및 혈장내 LBP 의 농도를 실시예 3 에 의한 샌드위치 ELISA 검정을 이용하여 검정하고 비교하였다. 항응고제 부가의 결과로 나타나는 희석에 대하여 혈장 부피를 보정했을때(0.85 의 인수로 나눔) LBP 의 혈장 농도는 LBP 에 대한 혈청 농도와 본질적으로 동일하다고 밝혀졌다. 정상 인체 피검자의 혈장 농도는 혈청에 대한 3.7 ㎍/mL (표준편차 0 9 ㎍/mL)와 비교하여, 보정된 3.1 ㎍/mL (표준편차 0.9 ㎍/mL) 또는 3.7 ㎍/mL (표준편차 1.1 ㎍/mL)임이 밝혀졌다.According to this example, the concentrations of serum and plasma LBP of healthy subjects were assayed and compared using the sandwich ELISA assay according to Example 3. When plasma volume was corrected for dilution resulting from anticoagulant addition (divided by factor of 0.85), the plasma concentration of LBP was found to be essentially the same as the serum concentration for LBP. Plasma concentrations in normal human subjects were corrected by 3.1 μg / mL (standard deviation 0.9 μg / mL) or 3.7 μg / mL (standard deviation 1.1) compared to 3.7 μg / mL (standard deviation 0 9 μg / mL) for serum. Μg / mL).

실시예 7Example 7

인체 혈장내 내인성 LBP 면역반응성의 임상적 상호관계Clinical Correlation of Endogenous LBP Immune Responses in Human Plasma

이 실시예에서는 그람-음성 패혈증에 걸린 다양한 피검자 및 다양한 다른 임상 증상으로부터 수집한 인체 혈장 또는 혈청 시료에서 내인성 LBP 면역반응성을 측정하였다. 특히, 건강한 개인(30 명의 피검자) 및 그람-음성 패혈증이라고 진단받은 개인(363 명의 피검자)의 혈장 시료를 LBP 수준에 대하여 검정하였다. 급성림프아구성백혈병(ALL)(6 명의 피검자) ; 급성대숙주성이식편병(aGvHD)(8 명의 피검자) ; 만성림프구성백혈병(CLL)(9 명의 피검자) ; 피부 T-세포림프종(CTCL)(12 명의 피검자) ; 1 형 당뇨병(13 명의 피검자) ; 재생불량성빈혈(AA)(16 명의 피검자) ; 크론병(8 명의 피검자) ; 건선(13 명의 피검자) ; 류마티스성관절염(RA)(86 명의 피검자) ; 공피증(4 명의 피검자) 및 전신홍반성루푸스(SLE)(10 명의 피검자)를 지닌 개인의 혈청 시료를 LBP 수준에 대하여 검정하였다. 그 결과는 제 2 도에 나타나 있다.In this example, endogenous LBP immunoreactivity was measured in human plasma or serum samples collected from various subjects with Gram-negative sepsis and various other clinical symptoms. In particular, plasma samples from healthy individuals (30 subjects) and individuals diagnosed with Gram-negative sepsis (363 subjects) were assayed for LBP levels. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) (6 subjects); Acute host disease (aGvHD) (8 subjects); Chronic lymphocytic leukemia (CLL) (9 subjects); Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) (12 subjects); Type 1 diabetes mellitus (13 subjects); Aplastic anemia (AA) (16 subjects); Crohn's disease (8 subjects); Psoriasis (13 subjects); Rheumatoid arthritis (RA) (86 subjects); Serum samples from individuals with scleroderma (4 subjects) and systemic lupus erythematosus (SLE) (10 subjects) were assayed for LBP levels. The results are shown in FIG.

그람-음성 패혈증에 걸린 것으로 진단된 피검자 중에서는 LBP 수준이 상승된 반면에 급성림프아구성백혈병, 급성대숙주성이식편병, 만성림프구성백혈병, 피부 T-세포림프종, 1 형 당뇨병, 재생불량성빈혈, 크론병, 건선, 류마티스성관절염, 공피증 및 전신홍반성루푸스(SLE)에 걸린 피검자에게서는 LBP 수준이 정상 이상으로 상승되지 않음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 LBP 검정은 다른 급성기 증상(RA, SLE 등)을 내독소와 관련된 증상과 구별하는데 가치가 있다.Among the subjects diagnosed with Gram-negative sepsis, LBP levels were elevated, whereas acute lymphoblastic leukemia, acute premature graft disease, chronic lymphocytic leukemia, cutaneous T-cell lymphoma, type 1 diabetes, aplastic anemia In patients with Crohn's disease, psoriasis, rheumatoid arthritis, scleroderma, and systemic lupus erythematosus (SLE), LBP levels did not rise above normal. Thus, the LBP assay of the present invention is valuable in distinguishing other acute phase symptoms (RA, SLE, etc.) from symptoms associated with endotoxin.

실시예 8Example 8

건강한 피검자내 내인성 LBP 수준에 대한 LPS 투여 효과Effect of LPS Administration on Endogenous LBP Levels in Healthy Subjects

이 실시예에서는 건강한 인체 피검자내 내인성 LBP 면역반응성에 대한 LPS 효과를 결정하였다. 특히, 4 ng/kg 의 LPS 를 정맥내 투여한 후 여러 시점(16 명의 피검자)에서의 LBP 혈장 수준 또는 LPS 를 주입하지 않은 대조 피검자(2 명)에서의 변화에 대하여 LBP 샌드위치 검정을 이용하여 건강한 피검자를 모니터 하였다. 제 3 도에 도시된 결과는 시간에 따른 혈장 LBP 농도의 평균 변화를 나타낸다. LPS 로 처리한 피검자의 경우 LBP 수준은 LPS 투여 후 약 6 시간에서 상승하기 시작했다. 피크 LBP 혈장 수준은 대부분의 피검자에게서 LPS 투여 후 10 - 12 시간에서 관찰되었다. 기본량에서 피크 LBP 수준까지 평균 증가치는 약 3 배였다. 이 시점 이상에서 대조 피검자의 평균 LBP 수준은 정상 범위 이내로 유지되었다(약 5 ㎍/mL).In this example, the effect of LPS on endogenous LBP immunoreactivity in healthy human subjects was determined. In particular, the LBP sandwich assay was used to assess changes in LBP plasma levels at different time points (16 subjects) after intravenous administration of 4 ng / kg LPS or in control subjects (2) without LPS injection. The subject was monitored. The results shown in FIG. 3 represent the average change in plasma LBP concentration over time. For LPS-treated subjects, LBP levels began to rise about 6 hours after LPS administration. Peak LBP plasma levels were observed 10-12 hours after LPS administration in most subjects. The average increase from baseline to peak LBP level was about three times. Above this point, the mean LBP level of the control subjects remained within the normal range (about 5 μg / mL).

부가적인 분석은 체액내 LBP 수준과 내독소에 대한 노출 증후의 상호관계를 설명할 것이며 LBP 수준이 내독소에 대한 노출의 결과로 나타나는 질병상태를 진단하고 예후할 것으로 예상된다.Additional analyzes will explain the correlation between humoral LBP levels and endotoxin exposure symptoms and are expected to diagnose and prognose disease conditions that result from exposure to endotoxins.

부가적인 분석은 DIC 와 ARDS 를 포함하는 패혈증과 관련된 증상을 포함하는 박테리아 감염, 내독소혈증 및 패혈증의 증후와 LBP 수준과의 상호관계를 설명할 것으로 예상된다.Additional analyzes are expected to explain the correlation between LBP levels and symptoms of bacterial infections, endotoxins and sepsis, including symptoms related to sepsis, including DIC and ARDS.

실시예 9Example 9

그람-음성 패혈증이 의심되는 환자의 혈장 LBP 수준과 Plasma LBP levels in patients suspected of Gram-negative sepsis and

생존 사이의 임상적 상호관계Clinical Correlation Between Survival

그람-음성 패혈증이 의심되는 환자의 혈장 LBP 수준과 생존 사이의 상호관계를 실시예 7 에 기술된 패혈증 피검자로 부터 수득한 데이터를 이용하여 비교하였다. 이 경우에 표준 LBP 농도는 46 ㎍/mL 로 맞추고, 예비처리 시료에서 측정한 바와같이 높거나(> 46 ㎍/mL) 낮은(< 46 ㎍/mL) LBP 혈장 수준을 갖는 것으로서 그람-음성 패혈증이 의심되는 환자를 분류하였다. 제 4 도에 도시한 데이터에서 보여지는 바와 같이 낮은 예비처리 혈장 LBP 수준을 갖는 피검자는 높은 예비처리 혈장 LBP 수준을 갖는 피검자 보다 27 일 기간 이상 상당히 더 큰 생존율(p = 0.004)을 갖는다. 이들 데이터는 LBP 수준을 검정하고 이를 패혈증에 걸린 피검자의 예후를 예측하기 위한 표준 LBP 값과 비교하는데 유용하다.The correlation between plasma LBP levels and survival in patients suspected of Gram-negative sepsis was compared using data obtained from sepsis subjects described in Example 7. In this case the standard LBP concentration was set to 46 μg / mL and Gram-negative sepsis was found to have high (> 46 μg / mL) or low (<46 μg / mL) LBP plasma levels as measured in the pretreated samples. Suspicious patients were classified. As shown in the data shown in FIG. 4, subjects with low pretreatment plasma LBP levels have significantly greater survival (p = 0.004) over a 27-day period than those with high pretreatment plasma LBP levels. These data are useful for assaying LBP levels and comparing them to standard LBP values for predicting the prognosis of sepsis subjects.

실시예 10Example 10

건강한 피검자, 류마티스성관절염 및 패혈증 환자에 있어서 In healthy subjects, patients with rheumatoid arthritis and sepsis

급성기 단백질의 임상적 상호관계Clinical Correlation of Acute Phase Proteins

LBP, C-반응성 단백질(CRP) 및 피브리노겐의 혈장 수준을 제 5a (LBP 수준), 5b (CRP 수준) 및 5c (피브리노겐 수준)도에 나타낸 결과를 갖는, 건강한 피검자, 류마티스성관절염 및 패혈증 환자의 소 그룹에서 측정하였다. 이 결과는 건강한 피검자에 비하여, 평균 피브리노겐 수준이 류마티스성관절염 및 패혈증 피검자 둘 다에 대하여 약 2.5 배 상승되었음을 나타낸다. 건강한 피검자에 비하여, 평균 CRP 수준은 류마티스성관절염 피검자에게서 약 40 배 및 패혈증 피검자에게서 200 배 상승되었음이 밝혀졌다. 대조적으로, 실시예 7 의 결과와 일치하여 평균 LBP 수준이 류마티스성관절염 피검자에게서 단지 약간 증가된 반면에(2 배 이하) 패혈증 피검자에 대한 평균 LBP 수준은 6 배 이상 까지 증가 되었다.Of healthy subjects, rheumatoid arthritis and sepsis patients with results showing plasma levels of LBP, C-reactive protein (CRP) and fibrinogen in degrees 5a (LBP level), 5b (CRP level) and 5c (fibrinogen level). Measured in small groups. This result indicates that the average fibrinogen level was increased about 2.5-fold for both rheumatoid arthritis and sepsis subjects compared to healthy subjects. Compared to healthy subjects, it was found that mean CRP levels were elevated about 40-fold in rheumatoid arthritis subjects and 200-fold in sepsis subjects. In contrast, in line with the results of Example 7, mean LBP levels were only slightly increased (up to 2 times) in rheumatoid arthritis subjects, whereas mean LBP levels for sepsis subjects increased up to 6 times or more.

현재의 바람직한 실시형태인 상기 상세한 설명을 고려하여 본 발명의 실행에 있어서 다수의 수정 및 변형이 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 가능할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구의 범위로만 제한된다.It is anticipated that many modifications and variations will be possible to those skilled in the art in the practice of the present invention in light of the above detailed description of the presently preferred embodiments. Accordingly, the scope of the invention is limited only by the scope of the appended claims.

[서열목록][Sequence list]

(1) 일반적인 정보 :(1) General Information:

(i) 출원인 : 조마 코포레이션(i) Applicant: Dressage Corporation

(ii) 발명의 명칭 : 체액내 LBP 의 정량 방법(ii) Title of the Invention: Method for Quantifying LBP in Body Fluids

(iii) 서열의 수 : 4(iii) number of sequences: 4

(iv) 통신 주소 :(iv) communication address:

(A) 수신인 ; 마샬, 오 '툴레, 저스타인, 머레이 및 보룬(A) recipient; Marshall, O'Thule, Juststein, Murray and Borun

(B) 가 : 사우스 웨커 드라이브 233 시어스 타워 6300(B) A: South Wacker Drive 233 Sears Tower 6300

(C) 시 : 시카고(C) City: Chicago

(D) 주 : 일리노이(D) State: Illinois

(E) 국명 : 미국(E) Country name: United States

(F) 우편 번호 : 60606 - 6402(F) Zip Code: 60606-6402

(V) 컴퓨터 입력 형태 :(V) computer input form:

(A) 매개형 : 플로피 디스크(A) media type: floppy disk

(B) 컴퓨터 : 범용 IBM PC(B) Computer: General Purpose IBM PC

(C) 운영 시스템 : PC-DOS/MS-DOS(C) operating system: PC-DOS / MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 패탄트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25(D) Software: Fantastic release # 1.0, version # 1.25

(vi) 현재의 출원 자료 :(vi) Current application data:

(A) 출원번호 :(A) Application number:

(B) 출 원 일 :(B) Date of application:

(C) 분 류 :(C) Classification:

(viii) 대리인 정보 :(viii) Agent Information:

(A) 성명 : 샤프, 제프리 에스.(A) Statement: Sharp, Jeffrey S.

(B) 등록번호 : 제 31,879 호(B) Registration No: 31,879

(C) 참고번호 : 제 27129/31843 호(C) Reference No.: 27129/31843

(ix) 통신 정보 :(ix) Communication Information:

(A) 전화번호 : 312/474 - 6300(A) Phone number: 312/474-6300

(B) 텔레팩스 : 312/474 - 0448(B) Telefax: 312/474-0448

(C) 텔렉스 : 25 - 3856(C) Telex: 25-3856

(2) 서열 번호 : 1 에 대한 정보 :(2) Information about SEQ ID NO: 1

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 길이 : 1443 염기쌍(A) Length: 1443 base pairs

(B) 형 : 핵산(B) type: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 서열의 종류 : DNA(ii) Type of sequence: DNA

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : CDS(A) Name / symbol: CDS

(B) 존재위치 : 1..1443(B) Presence location: 1..1443

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : misc feature(A) Name / symbol: misc feature

(D) 기타정보 : "rLBP"(D) Other information: "rLBP"

(xi) 서열 : 서열번호 : 1 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1:

2) 서열번호 : 2 에 대한 정보 :2) Information about SEQ ID NO: 2

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 길이 : 481 아미노산(A) Length: 481 amino acids

(B) 형 : 아미노산(B) type: amino acid

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 서열의 종류 : 단백질(ii) Type of sequence: protein

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : misc feature(A) Name / symbol: misc feature

(D) 기타정보 : "rLBP"(D) Other information: "rLBP"

(xi) 서열 : 서열번호 : 2 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2:

2) 서열번호 : 3 에 대한 정보 :2) Information about SEQ ID NO: 3

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 길이 : 591 염기쌍(A) Length: 591 base pairs

(B) 형 : 핵산(B) type: nucleic acid

(C) 쇄의 수 : 1 본쇄(C) Number of chains: 1 chain

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 서열의 종류 : DNA(ii) Type of sequence: DNA

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : misc feature(A) Name / symbol: misc feature

(D) 기타정보 : "rLBP 25"(D) Other information: "rLBP 25"

(xi) 서열의 특징 :(xi) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : CDS(A) Name / symbol: CDS

(B) 존재위치 : 1..591(B) Location: 1..591

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : misc feature(A) Name / symbol: misc feature

(D) 기타정보 : "rLBP 25"(D) Other information: "rLBP 25"

(xi) 서열 : 서열번호 : 3 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3:

2) 서열번호 : 4 에 대한 정보 :2) Information about SEQ ID NO: 4

(i) 서열의 특성 :(i) the nature of the sequence:

(A) 길이 : 197 아미노산(A) Length: 197 amino acids

(B) 형 : 아미노산(B) type: amino acid

(D) 형태 : 직쇄상(D) Form: straight chain

(ii) 서열의 종류 : 단백질(ii) Type of sequence: protein

(ix) 서열의 특징 :(ix) Features of the sequence:

(A) 이름/기호 : misc fature(A) Name / symbol: misc fature

(B) 기타정보 : "rLBP 25"(B) Other information: "rLBP 25"

(xi) 서열 : 서열번호 : 4 :(xi) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4:

본 출원은 1994년 1월 24일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 제 08/186,811 호의 일부 계속 출원이다.This application is part of a continued application of US Patent Application No. 08 / 186,811, filed January 24, 1994.

Claims (19)

피검자의 체액 시료내 리포다당체 결합 단백질의 농도를 결정하고 이 리포다당체 결합 단백질의 농도를 내독소에 대한 피검자의 노출을 지시하는 표준과 상호관련시키는 단계를 포함하는, 내독소에 대한 인체를 제외한 피검자의 노출을 결정하는 방법.Determining the concentration of lipopolysaccharide binding protein in the body fluid sample of the subject and correlating the concentration of the lipopolysaccharide binding protein with a standard indicative of the subject's exposure to endotoxin. How to determine your exposure. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the sample is a blood sample. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 혈장 또는 혈청 시료임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the sample is a plasma or serum sample. 제 1 항에 있어서, 리포다당체 결합 단백질의 농도는 면역검정 수단에 의해 결정됨을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the concentration of lipopolysaccharide binding protein is determined by immunoassay means. 제 4 항에 있어서, 면역검정은 샌드위치 면역검정임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein the immunoassay is a sandwich immunoassay. 제 1 항에 있어서, 표준은 예비처리 기간 중에 검정된 상기 피검자에 대한 LBP 농도 보다 큰 농도임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the standard is a concentration greater than the LBP concentration for the subject assayed during the pretreatment period. 피검자의 체액 시료내 리포다당체 결합 단백질의 농도를 결정하고 이 리포다당체 결합 단백질의 농도를 패혈증의 존재나 위중성을 지시하는 표준과 상호관련시키는 단계를 포함하는, 인체를 제외한 피검자에게서 패혈증의 존재나 위중성을 진단하는 방법.Determining the concentration of lipopolysaccharide-binding protein in the body fluid sample of the subject and correlating the concentration of the lipopolysaccharide-binding protein with a standard indicative of the presence or neutrality of sepsis. How to diagnose gastritis. 제 7 항에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료임을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein said sample is a blood sample. 제 7 항에 있어서, 상기 시료는 혈장 또는 혈청 시료임을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein said sample is a plasma or serum sample. 제 7 항에 있어서, 리포다당체 결합 단백질의 농도는 면역검정 수단에 의해 결정됨을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein the concentration of lipopolysaccharide binding protein is determined by immunoassay means. 제 10 항에 있어서, 면역검정은 샌드위치 면역검정임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the immunoassay is a sandwich immunoassay. 제 7 항에 있어서, 표준은 비패혈증 기간 중에 검정된 상기 피검자에 대한 LBP 농도 보다 더 큰 농도임을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein the standard is a concentration greater than the LBP concentration for the subject assayed during the period of nonsepticemia. 피검자의 체액 시료내 리포다당체 결합 단백질의 농도를 결정하고 이 리포다당체 결합 단백질의 농도를 패혈증에 걸린 피검자의 예후를 지시하는 표준과 상호관련시키는 단계를 포함하는, 패혈증에 걸린 인체를 제외한 피검자의 예후를 예측하는 방법.Prognosis of subjects other than humans with sepsis, including determining the concentration of lipopolysaccharide binding protein in the body fluid sample of the subject and correlating the concentration of the lipopolysaccharide binding protein with a standard indicating the prognosis of the subject with sepsis. How to predict. 제 13 항에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the sample is a blood sample. 제 13 항에 있어서, 상기 시료는 혈장 또는 혈청 시료임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the sample is a plasma or serum sample. 제 13 항에 있어서, 리포다당체 결합 단백질의 농도는 면역검정 수단에 의해 결정됨을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the concentration of lipopolysaccharide binding protein is determined by immunoassay means. 제 16 항에 있어서, 면역검정을 샌드위치 면역검정임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 16, wherein the immunoassay is a sandwich immunoassay. 제 13 항에 있어서, 표준은 비패혈증 기간 중에 검정된 상기 피검자에 대한 LBP 농도 보다 더 큰 농도임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the standard is a concentration greater than the LBP concentration for the subject assayed during the nonseptic period. 다음을 포함하는, 내독소에 대한 피실험자의 노출을 결정하기 위한 키트Kits for determining subject exposure to endotoxins, including (1) 친화 정제된 토끼의 항-rLBP 항체를 피복시키고 PBS 에 함유되어 있는 1 % 무-지방 우유로 차단시킨 마이크로플레이트 ;(1) microplates coated with an affinity purified rabbit anti-rLBP antibody and blocked with 1% fat-free milk contained in PBS; (2) 1 % 소 혈청 알부민, 0.05 % 트윈 20(PBS-BSA/트윈) 및 헤파린 나트륨을 함유하는 희석 완충용액 PBS ;(2) dilution buffer PBS containing 1% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 (PBS-BSA / Tween) and heparin sodium; (3) rLBP 또는 rLBP₂₅ 표준용액, 시료 및 대조군의 복제물 및 희석물 ;(3) clones and dilutions of rLBP or rLBP ₂₅ standard solutions, samples and controls; (4) PBS-BSA/트윈으로 희석시킨 바이오틴-표지된 토끼의 항-LBP 항체;(4) biotin-labeled rabbit anti-LBP antibodies diluted with PBS-BSA / Twin; (5) PBS-BSA/트윈으로 희석시킨 알칼리성 포스파타제-표지된 스트렙타비딘 ;(5) alkaline phosphatase-labeled streptavidin diluted with PBS-BSA / Twin; (6) 발색 반응시키기 위한 10 % 디에탄올아민 완충용액에 용해시킨 발색성 기질 p-니트로페닐인산염 ;(6) color developing substrate p-nitrophenyl phosphate dissolved in 10% diethanolamine buffer solution for color reaction; (7) 발색 반응을 정지시키기 위한 1N NaOH ; 및(7) 1N NaOH for stopping the color reaction; And (8) 세척 완충용액 및 탈염수.(8) wash buffer and demineralized water.