KR100574563B1

KR100574563B1 - 애기장대 유래 식물체 고효율 발현 프로모터 및 이를함유하는 식물체 고효율 발현 벡터

Info

Publication number: KR100574563B1
Application number: KR1020030070596A
Authority: KR
Inventors: 서미정; 김미정; 배정명; 박영인
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2006-04-27
Also published as: KR20050035314A

Abstract

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 마이크로좀 올레산 불포화제 (microsomal oleic acid desaturase) 유전자에서 유래된 식물체 고효율 발현 프로모터 및 인트론 (intron)과 이들을 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터 그리고 이 발현벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 기존에 널리 사용되어지고 있는 꽃양배추 모자익 바이러스 유래의 CaMV 35S promoter에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 발현을 꽃과 종자 조직에서는 약 10배 이상, 뿌리와 줄기에서는 약 3배 이상 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 유용물질을 대량 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

애기장대 유래 식물체 고효율 발현 프로모터 및 이를 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터{Plant high-efficiency expression promoter derived from Arabidopsis thaliana and plant high-efficiency expression vector comprising the same}

도 1은 본 발명의 애기장대 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 유래의 프로모터 및 그 유전자에 존재하는 인트론의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2a는 β-glucuronidase (이하 'GUS'라 약칭함) 리포터 유전자를 함유하는 binary vector, pBI101 (Cat.# 6017-1, Clontech, 미국)을 나타내는 모식도이다.

도 2b는 본 발명의 애기장대 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 유래의 프로모터와 그 유전자 안에 존재하는 인트론을 포함하는 binary vector (이하, 'pAtW6-P2.4'로 약칭함)를 나타내는 모식도이다.

도 3은 6종류의 binary 벡터들을 제한효소 HindIII 와 BamHI를 이용하여 절단한 다음, 0.7% agarose 젤에서 전기영동한 것을 나타낸 것이다.

도 4는 도 3의 6종류의 binary 벡터와 pBI121 (Cat#: 6018-1, Clontech, 미국) binary vector를 함유한 Agrobacteria 에 의해 형질전환된 애기장대들이다.

도 5는 pAtW6-P2.4와 pBI121으로 형질전환된 애기장대 식물체의 전 조직- 뿌리, 줄기, 잎, 꽃대에 달린 잎 (cauline), 꽃, 발달 종자 그리고 꼬투리들을 이용 하여 GUS 활성을 조직 화학적 방법으로 염색한 것이다.

도 6는 획득된 7종류의 형질전환 애기장대에서 식물체의 전 조직- 뿌리, 줄기, 잎, 꽃대에 달린 잎 (cauline), 꽃, 발달 종자, 그리고 꼬투리들을 이용하여 GUS 효소의 활성을 조사한 것이다.

식물체내의 지방산들은 세포막과 종자 내 저장 오일을 이루는 중요한 구성 성분이다. 특히, 마이크로좀 올레산 불포화제 (microsomal oleic acid desaturase)는 세포 내 소포체 (endoplasmic reticulum) 막에 존재하여 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine)의 sn-1 과 sn-2 위치에 존재하는 일중 불포화지방산, oleic acid를 이중 불포화 지방산, linoleic acid로 전환되는 반응을 촉매하는 효소이다.

애기장대, 페츄니아, 그리고 면화에서 마이크로좀 올레산 불포화제 게놈 유전자가 보고되었으며, 애기장대 게놈 상에는 이 유전자가 1개, 그 외의 다른 식물체에는 2개 이상의 유전자가 존재하는 것으로 알려져 있다 (Okuley et al., 1994; Verwoert et al., 2000; Pirtie et al., 2001). 특히, 애기장대의 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현하며, 식물체의 세포막과 종자 내 저장 오일을 구성하는 linoleic acid 합성에 관여한다.

현재까지 상기에서 기술한 3종류의 식물체로부터 마이크로좀 올레산 불포화제 게놈 유전자가 보고되었으나, 그의 프로모터 및 그의 게놈 유전자에 존재하는 인트론에 대한 연구는 전 세계적으로 전혀 이루어지지 않았다.

옥수수의 알코올 디하이드로게네이즈 (alcohol dehydrogenase) 유전자의 첫 번째 인트론 (intron)을 비롯하여 몇몇 식물 게놈 유전자들 상에 존재하는 인트론은 식물체에서 자신의 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 보고하였다 (Callis et al., 1987; Norris et al., 1993; Currie et al., 1991 and 1993). 그러나, 마이크로좀 올레산 불포화제 게놈 유전자내에 존재하는 인트론에 의한 자신의 유전자 발현 조절에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않았다.

최근에 유전 공학 기술을 이용하여 식물의 형질을 개량하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 과정에서 외래의 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터가 요구된다. 이를 위해 식물체의 전 조직에서 발현이 유도되는 꽃양배추 모자익 바이러스 (cauliflower mosaic virus; CaMV35S) 유래의 프로모터가 널리 사용되어지고 있다. 그러나, 이러한 CaMV35S 프로모터가 사용되었을 때, 식물체의 잎과 세포분열이 활발한 조직을 제외한 식물의 다른 조직에서 외래유전자의 발현양이 적은 것이 단점이다. 그러므로 형질전환 식물체에서 외래 도입 유전자를 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터가 강력 히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 애기장대로부터 유래된 마이크로좀 올레산 불포화제가 식물체의 전 조직에서 발현되는 것에 착안하여 그의 프로모터 및 인트론을 클로닝한 후, 프로모터 및 인트론을 binary vector에 삽입하여 모델 식물체인 애기장대에 도입한 결과, 애기장대 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터 및 그의 유전자에 존재하는 인트론 (intron)은 기존에 널리 사용되어지고 있는 꽃양배추 모자익 바이러스 유래의 CaMV 35S 프로모터에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 발현을 꽃과 종자 조직에서는 약 10배 이상, 뿌리와 줄기에서는 약 3배 이상 증가시킬 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 애기장대의 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자에서 유래된 식물체 고효율 발현 프로모터 및/또는 발현 증강용 인트론을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 위의 고효율 발현 프로모터 및/또는 발현 증강용 인트론를 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터 및 이 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체에서 유용 물질을 대량 생산하고자 하는 경우, 위의 고효율 발현 프로모터 및/또는 발현 증강용 인트론을 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 고효율로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 1 내지 959 (-959 내지 -1) 부위의 염기서열을 포함하는 식물체의 고효율 발현 프로모터를 제공한다. 괄호안은 전사 개시 부위로부터 upstream 방향으로 마이너스로 번호를 매긴 것이다.

상기 본 발명의 고효율 발현 프로모터는 기존에 널리 사용되어지고 있는 꽃양배추 모자익 바이러스 유래의 CaMV 35S 프로모터에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 발현을 크게 증가시킬 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 전사 개시 부위로부터 +144 내지 +1274 부위의 염기서열을 포함하는 식물체의 발현 증강용(enhancing) 인트론을 제공한다.

상기 본 발명의 발현 증강용 인트론은 식물체에서 도입된 유전자의 전사개시를 돕거나 전사된 mRNA의 안정성(stability)을 높임으로써 목적 유전자의 발현을 현저히 증가시킬 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물체의 고효율 발현 프로모터 및/또는 발현 증강용 인트론을 함유하는 식물체의 고효율 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 식물체 고효율 발현 벡터는 상기 본 발명의 프로모터만을 함유하거나 본 발명의 인트론에 CaMV 35S 프로모터와 같은 일반 식물체 발현 프로모터를 조합하여 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 본 발명의 프로모터와 인트론을 모두 함유하는 것이 식물체에서 도입 유전자를 고효율로 발현시키기에 좋다.

본 발명의 식물체 고효율 발현 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 트랜젼트 발현(transient expression) 벡터일 수도 있으나, 바람직하게는 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 바이너리(binary) 벡터인 것이 좋다

본 발명에 이용될 수 있는 binary 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 BR과 BL을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pBIN20, BIBAC 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

상기 본 발명의 식물체 종자 특이적 발현 벡터에서, 본 발명의 프로모터 및/또는 인트론은 binary 벡터에 함유된 외래 유전자의 앞에 위치한다. 본 발명에서는 외래 유전자의 한 예로서 GUS 리포터 유전자가 함유된 binary 벡터(pBI101)에 본 발명의 프로모터 및 인트론을 삽입한 pAtW6-P2.4 (도 2b)을 제조하였으나, 상기 GUS 리포터 유전자를 다른 목적 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 식물체 고효율 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

상기 식물체 고효율 발현 벡터가 binary 벡터인 경우에는 예컨대, floral dip 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal) 에 따라 식물체를 형질전환시키고, transient expression vector인 경우에는 예컨대, particle bombardment 방법 (Lacorte et al., 1997, Plant Cell Reports) 에 의거하여 식물체를 형질전환 시킬 수 있다. 본 발명의 식물체 종자 특이적 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환 시킬 수 있으나, 본 발명에서는 그 예로서 Arabidopsis의 형질전환만을 실시하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 식물체 고효율 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 고효율로 발현시키는 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 식물체에서 대량 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 식물체 고효율 발현 벡터에서 상기 프로모터 및/또는 인트론의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터 및 그의 유전자에 존재하는 인트론 (intron)에 관한 것으로써 이는 기존에 널리 사용되어지고 있는 꽃양배추 모자익 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자의 발현을 꽃과 종자 조직에서는 약 10배 이상, 뿌리와 줄기에서는 약 3배 이상 증가시킬 수 있다. 그러므로 본 발명은 유용물질을 대량 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

(실시예 1) 애기장대 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터 및 그의 유전자에 존재하는 인트론 확보 및 염기서열 분석

애기장대의 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자(FAD2)의 프로모터 및 그의 유전자에 존재하는 인트론을 확보하기 위하여 애기장대 게놈 염기서열 (http://mips.gsf.de/proj/thal/index.html, At3g12120, GenBank Accession No: NM_112047) 에 근거해서 forward primer(AraW6F1: 5'-CCG AAG CTT GGT GTG TCG TCG TTA TAC GCG GTA AA-3')와 reverse primer(AraW6R4: 5'-CGA GGA TCC CTG CAG AAA ACC AAA AGC AAA AG-3')를 제작하였고, 애기장대의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출한 다음, 중합효소 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하 'PCR'로 약칭함)을 수행하여 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터 및 그의 유전자에 존재하는 인트론을 분리하였다. 분리된 약 2.4 kb DNA 절편을 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝한 후, ABI Bigdye cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 염기서열을 분석하였다 (도 1). 분석된 염기서열을 기존의 애기장대 게놈 데이터 베이스 (http://mips.gsf.de/proj/thal/index.html, At3g12120, GenBank Accession No: NM_112047)와 비교해 본 결과 정확히 같은 클론임을 확인하였다. 이탤릭체로 된 염기서열은 이 유전자의 5' untranslated region 내에 존재하는 인트론 부위를 나타낸 것이다. 또한, 단백질 합성 개시 코돈 'ATG'는 굵은 글씨체로, 전사개시(transcription initiation)부위인 염기(붉은 색) "A"를 '+1'로 표시하였다.

서열번호 1은 도1에서 전사개시부위의 상류(Upstream)를 나타낸 것이고, 서열번호 2는 도1에서 전사개시부위로부터의 하류(Downstream)을 나타낸 것이다.

(실시예 2) 애기장대 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 전사개시 부위 확인

애기장대의 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 (At-FAD2)의 프로모터 부위의 활성을 조사하기 위해서는 이 유전자의 정확한 전사개시 부위가 확인되어야 하므로 cRACE (circular first-strand cDNA-mediated rapid amplication of c DNA ends) 방법 (Nucleic Acid Research 23: 3796-3797, 1995)에 의거하여 At-FAD2 유전자의 전사개시 부위를 확인하는 연구가 수행되었다. 애기장대의 꽃으로부터 전체 RNA를 분리한 후, 역전사 효소 (reverse transcriptase, Super Script^TMII RT, G_IBCO BRL)를 이용하여 cDNA pool을 만든 후, 이것을 주형으로 유전자 특이적 primers (AraW6R2; 5'-CAG CGT TTG AAA CAA TGC GGC GGG-3' 와 AraW6R3; 5'-CGG CAT TCT TCC ACC TGC ACC CAT G-3')와 cDNA library의 Adaptor primers (AP1; 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' 와 AP2; 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3')를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 번역 개시 코돈 (translation initiation codon, ATG)으로부터 147 base 앞에 존재하는 염기서열 "A"가 전사 개시 (transcription initiation)부위로 확인되었다. 이를 도 1에서 '+1'로 표시하였다.

(실시예 3) 식물체의 전 조직에서 발현하는 애기장대 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 프로모터의 활성 단편 및 그의 게놈 유전자에 존재하는 intron을 이용한 binary 벡터 제조

At-FAD2 유전자 프로모터의 활성, 프로모터 활성 단편 분석 및 그의 유전자 안에 존재하는 intron이 형질전환 식물체에서 외래 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 도 1의 염기서열에 근거하여 유전자 특이 primers (표 1)를 제조한 다음, 원래의 크기 및 5' 말단부터 일부분이 제거된 프로모터 부위를 PCR로 확보하였다. 확보된 PCR 생성물은 HindIII 와 BamHI 제한 효소 부위를 이용하여 β-glucuronidase (이하 'GUS'라 약칭함) 유전자를 함유하는 binary vector, pBI101 (Cat.# 6017-1, Clontech, 미국)(도 2a)에 삽입하여 pAtW6-P2.4라는 binary vector를 제조하였다(도 2b). 여기서 GUS는 β-glucuronidase를 코딩하는 리포터 유전자이고, NPTII는 Neomycin Phosphotransferase II를 코딩하는 kanamycin 저항성 마커 유전자이고, Nos-pro와 Nos-ter는 NPTII의 식물체 발현 프로모터와 터미네이터이다. 그리고 GUS 리포터 유전자는 삽입된 프로모터와 Nos (Nopaline synthase) 터미네이터 (Nos-ter)에 의해 식물체에서 발현된다.

제조된 각각의 binary vector를 대장균(DH5α)에 도입한 다음, alkaline lysis 방법 (Sambrook et al., 2001)에 의거하여 플라스미드를 추출하여 제한효소 HindIII 와 BamHI를 이용하여 절단한 다음 0.7% agarose 젤에서 전기영동 하였다 (도면 3). 여기서, pAtW6-P2.4는 유전자 특이적 primers, AraW6F1 과 AraW6R4에 의해 증폭된 기존의 프로모터 부위와 그의 유전자 안에 존재하는 intron을 함유하는 binary 벡터이고, pAtW6-PF1는 유전자 특이적 primers, AraW6F1 과 AraW6R1에 의해 증폭된 프로모터 부위를 함유한 binary 벡터이고, pAtW6-PF2는 유전자 특이적 primers, AraW6F2 와 AraW6R1에 의해 증폭된 프로모터 부위를 함유한 binary 벡터이고, pAtW6-PF3는 유전자 특이적 primers, AraW6F3 과 AraW6R1에 의해 증폭된 프 로모터 부위를 함유한 binary 벡터이고, pAtW6-PF4는 유전자 특이적 primers, AraW6F4 와 AraW6R1에 의해 증폭된 프로모터 부위를 함유한 binary 벡터이고, pAtW6-PF5는 유전자 특이적 primers, AraW6F5 와 AraW6R1에 의해 증폭된 프로모터 부위를 함유한 binary 벡터이다.

아래 표 1은 PCR 반응에서 사용된 유전자 특이적 primer들의 염기서열을 나타낸다.

(실시예 4) 제조된 binary 벡터를 이용해서 애기장대 식물체의 형질전환

상기와 같이 제조된 6종류의 binary 벡터들 (pAtW6-P2.4, pAtW6-F1, pAtW6-F2, pAtW6-F3, pAtW6-F4, pAtW6-F5)과 pBI121 binary 벡터 (Cat.# 6018-1, Clontech, 미국)를 Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Suh et al., 2002, Planta) 내로의 도입은 Freeze-thaw 방법 (An, G. 1987, Methods in Enzymology)에 근거하여 수행하였다. Agrobacteria tumefaciens C58C1균주를 O.D.=0.5가 되도록 YEP 배지에서 현탁 배양한 후, 20 mM CaCl₂ 용액에 현탁한 다음, 7종류의 binary 벡터와 각각 혼합하여 액체질소에 1분간 방치한 후, 37 ^oC에서 2분간 배양함으로써 Agrobacterium tumefaciens C58C1내로 도입하였다. 각각의 형질전환된 Agrobacteria는 2일 동안 28 ^oC에서 진탕 배양한 후, floral dip 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal)에 근거하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana cv. columbia)의 개화직전 암술머리에 접종함으로써 애기장대를 형질전환 시켰다.

(실시예 5) 형질전환된 애기장대의 조직 화학적 염색 및 효소학적 분석

상기에서 제조된 7종류의 애기장대 형질전환체로부터 종자를 수확한 다음, kanamycin (30 mg/L)을 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 형질전환 식물체를 선별하였다. 선별된 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법 및 효소학적 방법을 이용하여 조사하였다. 각 형질전환 식물체의 전 조직을 염색하기 위하여, 식물체의 각 조직은 1mM X-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담구어 37 ℃에서 12 시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 100% 에탄올을 부가함으로써 조직에 존재하는 클로로필을 제거했다. 그 결과, 도 5에서 보는 것처럼 pAtW6-P2.4로 형질전환된 애기장대 (AtW6P2.4)의 전 조직- 뿌리, 줄기, 잎, 꽃대에 달린 잎 (cauline), 꽃, 발달 종자 그리고 꼬투리에서 GUS의 활성이 확인되었다. 도 5에서, Control은 형질전환되지 않은 애기장대이고, CaMV35S는 pBI121 binary 벡터에 의해 형질전환된 애기장대이고, AtWP2.4는 pAtW6-P2.4에 의해 형질전환된 애기장대이다. 종자1은 개화 후 5 - 7일, 종자2는 개화 후 10 - 15일, 그리고 종자3은 개화 후 23 -25일에 수확된 발달종자이다.

또한 GUS의 활성을 정량적으로 조사하기 위하여, Jefferson et. al. (EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)의 방법에 의거하여 형질전환 식물체의 각 조직을 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium lauroylsarcosine, 그리고 10 mM β-mercaptoethanol을 함유하는 용액에서 마쇄한 다음, 12,000 X g에서 원심분리하여 상등액을 취했다. 획득된 상등액은 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide와 섞어 37 ℃에서 반응시킨 다음, 0.2 M Na₂CO₃를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 fluorometer를 이용하여 365 nm 와 455 nm 파장에서 값을 측정한 다음, 측정된 값은 MUG 표준용액을 이용하여 만든 표준곡선과 비교함으로써 GUS 활성을 계산하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서, 보여지는 GUS 활성도는 각 construct별로 얻어진 10개 형질전환체 (T₁ 식물체)를 분석하여 얻어진 값이다. 그 결과, 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터는 식물체에서 줄기, 꽃 그리고 발달 종자에서 가장 강한 GUS의 발현 양상을 나타내었으며, 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 인트론을 함유하고 있는 전장의 프로모터는 CaMV35S 프로모터에 비해 GUS의 발현양이 식물체의 잎과 꽃대에 달린 잎 (cauline) 조직에서는 비슷하지만, 꽃과 종자 조직에서는 약 10배 이상, 뿌리와 줄기에서는 약 3배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 안에 존재하는 인트론은 자신의 프로모터와 함께 사용되었을 때 식물체의 전 조직에서 적어도 2배 이상의 GUS 활성을 증가시킬 수 있고, 특히 개화 후 5 - 7일의 발달 종자에서는 약 10배 이상의 GUS 발현이 증가됨을 확인하였다. 그리고 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 프로모터의 일부를 점차적으로 제거하였을 때, 식물체의 전 조직에서 GUS 활성이 감소됨을 확인하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 애기장대의 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 (At-FAD2)에서 유래된 프로모터와 그의 유전자에 존재하는 인트론을 이용하여 외래 유전자를 식물체에서 발현시킨 결과, 기존에 널리 사용되어지고 있는 CaMV35S 프로모터 보다 잎과 꽃대에 달린 잎을 제외한 식물체의 전 조직에서 적어도 3배에서 10배 이상 도입된 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 신규 프로모터임을 확인하였다. 또한, 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자 (At-FAD2)에 존재하는 인트론은 자신의 프로모터와 함께 사용되었을 경우, 식물체 전 조직에서 외래 유전자의 발현을 약 3배이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> KOREA CHUNGANG EDUCATIONAL FOUNDATION <120> Plant high-efficiency expression promoter derived from Arabidopsis thaliana and plant high-efficiency expression vector comprising the same <130> PN051409 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 959 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> promoter <222> (1)..(959) <400> 1 ggtgtgtcgt cgttatacgc ggtaaataga tagatagaaa aatagaagtc caatgcaaga 60 gacttaactt aatcatccca attaattgat tgcattaact tgtacttgta ttttccgtcc 120 gccacctaat ttgattaata atataataaa gattacaatt gaaaacataa acaagagaaa 180 atccgcacga atctaccaaa gtgcatcacg tttgggtatc catacacgtg accaccagtc 240 caccacaaca caatgtctgt agatatttta atgtttcaca tgatagaaga agccaaacgt 300 aagaactctc ttttccactt ttagcccttt ccccgcctac cactgcttac gacttgtgta 360 agtggcaaac tagtaataat agagacgaaa cttaaatata aaaaagttga atccaaccaa 420 gttggtgtta atcaaatggt taagttataa tggtgaaaga tttgccatgt gtattgtatt 480 aagagttaag accaaggttt ggttcccatc acttacgatt ctttcttttc atatgattct 540 aaagttagtt attataaaca tcttaattta ctacacaata ttcggtaatt tctacatatt 600 ttagagatta gtttgagttt caatccatac tttactagtg attataaatt aatatacgta 660 cttttcgact ataaagtgaa actaagtaaa ttagaacgtg atattaaaaa gttaatgttc 720 actgttatat ttttttcaca agtaaaaaat gggttatttg cggtaaataa aaataccaga 780 tattttgaat tgattaaaaa ggttgaaata agagaggagg ggaaagaaaa gaaggtgggg 840 gcccagtatg aaagggaaag gtgtcatcaa atcatctctc tctctctctc tctaccttcg 900 acccacgggc cgtgtccatt taaagccctg tctcttgcca ttccccatct gaccaccag 959 <210> 2 <211> 2577 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> intron <222> (144)..(1274) <400> 2 aagaagagcc acacactcac aaattaaaaa gagagagaga gagagagaga cagagagaga 60 gagagattct gcggaggagc ttcttcttcg tagggtgttc atcgttatta acgttatcgc 120 ccctacgtca gctccatctc caggtccgtc gcttctcttc catttcttct cattttcgat 180 tttgattctt atttctttcc agtagctcct gctctgtgaa tttctccgct cacgatagat 240 ctgcttatac tccttacatt caaccttaga tctggtctcg attctctgtt tctctgtttt 300 tttcttttgg tcgagaatct gatgtttgtt tatgttctgt caccattaat aataatgaac 360 tctctcattc atacaatgat tagtttctct cgtctacaaa acgatatgtt gcattttcac 420 ttttcttctt tttttctaag atgatttgct ttgaccaatt tgtttagatc tttattttat 480 tttattttct ggtgggttgg tggaaattga aaaaaaaaaa aacagcataa attgttattt 540 gttaatgtat tcattttttg gctatttgtt ctgggtaaaa atctgcttct actattgaat 600 ctttcctgga ttttttactc ctattgggtt tttatagtaa aaatacataa taaaaggaaa 660 acaaaagttt tatagattct cttaaacccc ttacgataaa agttggaatc aaaataattc 720 aggatcagat gctctttgat tgattcagat gcgattacag ttgcatggca aattttctag 780 atccgtcgtc acattttatt ttctgtttaa atatctaaat ctgatatatg atgtcgacaa 840 attctggtgg cttatacatc acttcaactg ttttcttttg gctttgtttg tcaacttggt 900 tttcaatacg atttgtgatt tcgatcgctg aatttttaat acaagcaaac tgatgttaac 960 cacaagcaag agatgtgacc tgccttatta acatcgtatt acttactact agtcgtattc 1020 tcaacgcaat cgtttttgta tttctcacat tatgccgctt ctctactctt tattcctttt 1080 ggtccacgca ttttctattt gtggcaatcc ctttcacaac ctgatttccc actttggatc 1140 atttgtctga agactctctt gaatcgttac cacttgtttc ttgtgcatgc tctgtttttt 1200 agaattaatg ataaaactat tccatagtct tgagttttca gcttgttgat tcttttgctt 1260 ttggttttct gcagaaacat gggtgcaggt ggaagaatgc cggttcctac ttcttccaag 1320 aaatcggaaa ccgacaccac aaagcgtgtg ccgtgcgaga aaccgccttt ctcggtggga 1380 gatctgaaga aagcaatccc gccgcattgt ttcaaacgct caatccctcg ctctttctcc 1440 taccttatca gtgacatcat tatagcctca tgcttctact acgtcgccac caattacttc 1500 tctctcctcc ctcagcctct ctcttacttg gcttggccac tctattgggc ctgtcaaggc 1560 tgtgtcctaa ctggtatctg ggtcatagcc cacgaatgcg gtcaccacgc attcagcgac 1620 taccaatggc tggatgacac agttggtctt atcttccatt ccttcctcct cgtcccttac 1680 ttctcctgga agtatagtca tcgccgtcac cattccaaca ctggatccct cgaaagagat 1740 gaagtatttg tcccaaagca gaaatcagca atcaagtggt acgggaaata cctcaacaac 1800 cctcttggac gcatcatgat gttaaccgtc cagtttgtcc tcgggtggcc cttgtactta 1860 gcctttaacg tctctggcag accgtatgac gggttcgctt gccatttctt ccccaacgct 1920 cccatctaca atgaccgaga acgcctccag atatacctct ctgatgcggg tattctagcc 1980 gtctgttttg gtctttaccg ttacgctgct gcacaaggga tggcctcgat gatctgcctc 2040 tacggagtac cgcttctgat agtgaatgcg ttcctcgtct tgatcactta cttgcagcac 2100 actcatccct cgttgcctca ctacgattca tcagagtggg actggctcag gggagctttg 2160 gctaccgtag acagagacta cggaatcttg aacaaggtgt tccacaacat tacagacaca 2220 cacgtggctc atcacctgtt ctcgacaatg ccgcattata acgcaatgga agctacaaag 2280 gcgataaagc caattctggg agactattac cagttcgatg gaacaccgtg gtatgtagcg 2340 atgtataggg aggcaaagga gtgtatctat gtagaaccgg acagggaagg tgacaagaaa 2400 ggtgtgtact ggtacaacaa taagttatga ggatgatggt gaagaaattg tcgacctttc 2460 tcttgtctgt ttgtcttttg ttaaagaagc tatgcttcgt tttaataatc ttattgtcca 2520 ttttgttgtg ttatgacatt ttggctgctc attatgttat gtgggaagtt agtgttc 2577 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer AraW6F1 <400> 3 ccgaagcttg gtgtgtcgtc gttatacgcg gtaaa 35 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer AraW6F2 <400> 4 ccgaagcttc caccagtcca ccacaacac 29 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer AraW6F3 <400> 5 ccgaagcttg gtgaaagatt tgccatgtgt attg 34 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer AraW6F4 <400> 6 ccgaagcttg aacgtgatat taaaaagtta atgttcactg 40 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer AraW6F5 <400> 7 ccgaagcttc tctctacctt cgacccacgg 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer AraW6R1 <400> 8 caaggatccg gagatggagc tgacgtaggg gcg 33 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer AraW6R4 <400> 9 cgaggatccc tgcagaaaac caaaagcaaa ag 32

Claims

서열번호 1의 1 내지 959 (-959 내지 -1) 부위의 염기서열을 포함하는 식물체의 고효율 발현 프로모터.
서열번호 2의 전사 개시 부위로부터 +144 내지 +1274 부위의 염기서열을 포함하는 식물체의 발현 증강용(enhancing) 인트론.
제 1항의 고효율 발현 프로모터 및 제 2항의 발현 증강용 인트론을 함유하는 식물체의 고효율 발현 벡터.
제 3항에 있어서, 상기 프로모터가 바이너리(binary) 벡터에 삽입된 것을 특징으로 하는 식물체의 고효율 발현 벡터.
제 4항에 있어서, 도 2b에 도시된 pAtW6-P2.4인 것을 특징으로 하는 식물체의 고효율 발현 벡터.
제 3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 고효율 발현 벡터를 함유하고 있는 대장균(E.coli) 또는 아그로박테리움 튜머퍼시언스 (Agrobacterium tumefaciens C58C1)
제 3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 고효율 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
제 3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 종자 특이적 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키는 방법.