KR100574527B1 - 면역활성이 높고 항암효과 및 유해 미생물 증식 억제활성이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 사케이 Probio-44 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역활성이 높고 항암효과 및 유해 미생물 증식 억제 활성이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 사케이 Probio-44에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44는 암세포억제 효과 및 면역활성이 높을 뿐만 아니라, 유해한 여러 종의 병원성 미생물의 생육을 효과적으로 억제하고 내산성, 내담즙산 및 기타 유용한 기능을 가지고 있으므로, 기존 항생제의 대체용으로 인체 또는 가축에게 투여하거나, 의약품, 정장제, 건강보조식품 등으로 사용하여 장내 미생물 균총의 안정화를 이루며 설사 등 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방하고 암 예방효과를 얻을 수 있다.
프로바이오틱스, 생균활성제, 락토바실러스 사케이 Probio-44, 내산성, 내담즙산성, 항암효과, 면역활성, 미생물, 생육억제

Description

면역활성이 높고 항암효과 및 유해 미생물 증식 억제 활성이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 사케이 Probio-44{Acid tolerant probiotic Lactobacillus sakei Probio-44 that can suppress the growth of pathogenic microorganisms and suppressed tumour growth and promoted the production of several different cytokines of immune responses}
도 1은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 내산성 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 내담즙성 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 B임파구 증식효과(L. sakei Probio-44-treated groups were significantly different from control group(* p<0.001) with the exception of LBS. LCP: L. sakei Probio-44 of cell pellet; LBS, L. sakei Probio-44 of cultivation the bacterial supernatants, LSC: L. sakei Probio-44 of cytoplasm LPG, L. sakei Probio-44 of peptidoglycan.)를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 T임파구 증식 효과(L. sakei Probio-44-treated groups were significantly different from control group at LCP and LPG of L. sakei Probio-44(* p<0.001).LCP: L. sakei Probio-44 of cell pellet, LBS: L. sakei Probio-44 of cultivation the bacterial supernatants, LSC: L. sakei Probio-44 of cytoplasm, LPG: L. sakei Probio-44 of peptidoglycan)를 나타내는 그림이다.
도 5는 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 NK cell 항암작용 측정(L. sakei Probio-44 treated groups were significantly different from control group (*p<0.05 , **p<0.01). LCP: L. sakei Probio-44 Of cell pellet, LBS: L. sakei Proio-44 of cultivation the bacterial supernatants, LSC: L. sakei Probio-44 of cytoplasm, LPG:L. sakei Probio-44 of peptidoglycan.) 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 TNF-??의 생성도를 측정한 결과를 나타내는 그림이다(L. sakei Probio-44 treated groups were significantly different from control group (* p<0.01, **p<0.001). LCP: L. sakei Probio-44 of cell pellet, LBS: L. sakei Probio-44 of cultivation the bacterial supernatants, LSC: L. sakei Probio-44 of cytoplasm, LPG: L. sakei Probio-44 of peptidoglycan).
도 7은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-4(Lactobacillus sakei Probio-44)의 Hydrogen peroxide(H2O2)의 생성도 측정(L. sakei Probio-44 treated groups were significantly different from control group(* p<0.001). LCP: L. sakei Probio-44 of cell pellet, LBS: L. sakei Probio-44 of cultivation the bacterial supernatants, LSC: L. sakei Probio-44 of cytoplasm, LPG: L. sakei Probio-44 of peptidoglycan) 결과를 나타내는 그림이다.
도 8은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 S. typhimurium ATCC 14028에 대한 억제 활성을 나타내는 그림이다.
도 9는 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)의 전자현미경 사진을 나타낸다.
본 발명은 면역활성이 높고 항암효과 및 유해 미생물 증식 억제 활성이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 사케이 Probio-44에 관한 것으로, 보다 상세하게는 김치에서 분리된 신규 미생물로서 내산성, 내담즙산성, 항생제 저항성을 지니면서 동시에 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있고 면역활성 및 항암효과가 우수한 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44), 상기 미생물을 함유하는 약학적 또는 식품학적 조성물, 상기 미생물을 이용한 장내 유해미생물의 생육 억제 및 면역증강을 통한 암세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
인체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다. 이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상구균 등의 미생물들이 또한 포함된다. 인체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염 등 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물의 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장으로 이어져 숙주동물의 건강상태를 악화시키거나 설사에서부터 심할 경우 죽음으로까지 진행될 수 있다. 이러한 일이 발생하였을 경우 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되나 이러한 항생제는 체외로 완전히 배설되지 않고 숙주 내에 잔존하게 되며 지속적인 투여시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 되는 상황이 발생하게 된다. 또한 현재는 항생제 오남용으로 인한 부작용이 문제시되고 있다. 이에 대한 대안으로 현재 유산균 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다. 프로바이오틱스는 인체 또는 기타 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 주로 유산균들이 많이 이용되고 있다. 이러한 유산균 프로바이오틱스는 항생제 오남용으로 인해발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 사전에 억제할 수 있다. 또한 면역 활성이 뛰어나 암 예방에 효과적인이며 항암효과도 있는 것으로 나타났다.
그리고 오늘날의 유산균제제 건강보조식품은 앞에서 기술했던 유해 미생물 억제효과 이외에도 항암효과, 우수한 장내 정착능, 혈중 콜레스테롤 감소작용, 면역활성 증강작용 등의 기능을 필요로 한다. 유산균의 항암효과는 발암물질의 생성 을 유도하는 암세포의 억제, 발암물질 및 발암성 물질이 되는 화학물질의 저해 등을 들 수 있다. 이러한 유산균을 지속적으로 섭취할 경우 결장 내의 유용 유산균 수를 증가시켜 세포 수준에서 항암 효과를 내는 물질을 생성함으로써 암세포의 증식을 억제한다.
본 발명자들은 기존의 발표된 유산균제제 보다 유해 미생물들을 더욱 효과적으로 억제할 수 있고 내산성, 내담즙산성을 지니며 추가적으로 암세포의 증식을 억제하고 면역 활성이 우수한 신규 유산균제제의 탐색을 시도한 결과, 김치로부터 분리한 한 균주가 기존의 식음 유산균제제 보다 유해 미생물에 대한 억제활성과 내 산성, 내담즙산성 능력이 뛰어날 뿐 아니라, 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 면역 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 암 세포 및 유해 미생물에 대한 생육억제 능력 실험과 면역 활성실험, 내산성, 내담즙산성 실험 및 미생물 동정 실험을 한 결과, 이 균주가 암 세포 및 유해 미생물을 효과적으로 억제, 내산성, 내담즙산성이 우수하며 면역 활성이 뛰어난 균주로 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)균주라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 및 동물에는 해가 없고, 내 산성 및 내 담즙성이 뛰어난 신규 프로바이오틱 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기존 항생제의 대체용으로 인체에게 투여하거나 의약 품용으로 사용되는 정장제, 유산균제제, 건강보조식품, 유제품 종균제, 김치를 포함하는 발효식품 종균제 등으로 이용하여 암 세포 및 장내 유해한 미생물을 억제하고 면역활성이 높고, 내산성과 내담즙성이 우수한 생균활성제 함유 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44를 이용하여 동물에서 장내 유해 병원성미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명 락토바실러스 사케이 Probio-44를 이용하여 동물에서 면역 활성 증강을 통해 결장 암세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 목적들 및 잇점들은 하기 구성을 통해 보다 명백히 이해될 것이다.
본 발명의 상기 목적은 암 세포 증식 및 유해 미생물을 억제하며 면역활성이 우수하며 내산성, 내담즙산성을 가지는 신규 미생물 락토바실러스 사케이 Probio-44 (Lactobacillus sakei Probio-44), 상기 프로바이오틱 미생물을 포함하여 암세포 및 장내 서식 유해 미생물의 생육을 억제할 수 있는 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제 등의 식품학적 또는 약리학적 조성물을 제공함으로써 달성되었다.
본 발명 신규 미생물인 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44)은 김치에서 분리한 프로바이오틱 세균으로 기존의 식음료 유산균제제 보다 유해 미생물 억제활성과 내산성, 내담즙산성 능력이 뛰어날 뿐 아니라, 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 면역 활성 또한 우수한 것으로 확인되었다. 그러므로, 본 발명 프로바이오틱 미생물 및 이를 함유한 생균활성제는 장내유해세균들의 생장 억제 및 면역활성 증강 목적으로 식품학적 또는 약리학적 조성물, 즉 상기 미생물을 함유하는 의약품, 유산균제제 및 건강보조식품 등에 사용할 수 있다.
본 발명 신규 프로바이오틱 미생물인 락토바실러스 사케이 Probio-44은 장세포에 흡착할 수 있을 뿐만 아니라, 다음과 같은 프로바이오틱 특성을 보유한다.
- 장내 유해미생물의 생장 억제능
- 항암 활성 및 면역 활성 증강능
- 호기적, 혐기적 조건 및 다양한 pH에서의 생장능; 이러한 성질은 위장관내에서 변화되는 다양한 생리적 및 병리적 조건에 잘 적응할 수 있는 능력을 부여한다.
- 위산 및 담즙산 내성
- 동결건조에서의 생균활성 보유능
또한, 본 발명 신규 미생물은 공지의 다른 예방 또는 치료방법과 같이 항생제 내성이나 생물 독성 등의 부작용이 없는 것이 특징이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱(probiotic)' 은 ' 사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물' 의 의미로 이해된다. 프로바이오틱 미생물은 프로바이오틱 활성을 갖는 살아 있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
구체적으로, 김치로부터 분리한 본 발명 Probio-44 균주의 형태 및 생리· 생화학적 특성을 조사한 결과는 다음과 같다 : Probio-44는 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 간균이다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30∼37℃이 바람직하다. 가스와 인돌을 생성하지 않으며 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않는다.
또한, 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-44은 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속하는 균주로서 99.6 %의 16S rDNA 상동성으로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 표준균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-44를 락토마실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 균주로 동정하고, 상기 락토바실러스 사케이 Probio-44를 생명공학연구원 유전자은행에 2003년 2월 19일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10427BP). Probio-44의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 본 발명의 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 영하 -80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 유해 미생물 억제 활성을 가지는 내산성, 내담즙산성 미생물을 탐색하는 과정은 하기와 같이 수행할 수 있다. 즉, 김치 국물을 희석하여 BCP 고체 배지(일본 영연화학사 제품)에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 현미경으로 관찰한 후 구, 간균형 미생물 320개를 선발하여 MRS배지(Difco)에 옮겨 배양한 뒤, 영하 80℃에 보존하였다.
본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 장내 유해 미생물의 생육 억제 방법을 제공한다. 상기 방법에서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei ) Probio-44가 유해 미생물을 억제하기 위한 최적온도 조건으로는 30~37℃가 바람직하다. 분리된 구, 간균형 320개 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)과 항생제 평가시 사용되는 미생물 14종을 대상으로 하였다. 이러한 미생물 15 종은 다음과 같다: Helicobacter pylory ATCC 43504, S. aureus ATCC 25923, V. parahamolyticus ATCC1 7802, E. coli ATCC 25922, S. typhimurium ATCC 14028, E. coli 0157:H7 ATCC 43888, B. cereus KCCM 40133, E. coli B 44, B. subtilis ATCC 6633, L. monocytogenes KCTC 1014, E. erogenes ATCC 13048, S. enteritidis ATCC 13076, E. coli 0157: H7 933, L. monocytogenes ATCC 19111, C. sputorum. 상기 유해 미생물들에 대해 생육 억제환을 측정하여 대조군과 비교한 후 유해미생물의 억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-44로 명명하였다. 구체적으로, 본 발명의 균주 본 발명의 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) Probio-44가 유해미생물의 생장을 억제하는 억제환의 지름(단위는 mm)은 Helicobacter pylory ACTCC 43504 는 5로 나타났고 S, aureus ATCC 25923는 1, V. parahamolyticus ATCC1 7802는 1, E. coli ATCC 25922는 2, S. typhimurium ATCC 14028는 3, E. coli 0157:H7 ATCC 43888는 2, B. cereus KCCM 40133는 1, E. coli B 44는 2, S. enteritidis ATCC 13076는1, E. coli 0157: H7 933은 1로 나타났다.
한편, 본 발명 균주 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) Probio-44는 항생제 내성이 있어, 장내 유해 미생물의 생육을 억제하기 위해서 항생제와 같이 또는 기존 항생제의 대체용으로도 인체 또는 가축에게 투여할 수 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, Probio-44의 항생제에 대한 감수성 실험은 Microbiology procedures handbook vol.1(Henry D. Isenberg, ASM)과 한국특허공고 제91-4366호의 방법에 의거하여 10종의 항생제에 대해 수행하였으며, 항생제 감수성 실험 결과각각의 항생제에 대한 최소 억제농도(mg/ml)는 Ampicillin(10㎍)에 대해 10mm, Gentamycin(10㎍)에 대해 2mm, Tetracycline(30㎍)에 대해 8mm, Neomycin(30㎍)에 대해 1mm, Erythromycin(15㎍)에 대해 7mm, Lincomycin(2㎍)에 대해 2.5mm, Cephalothin(30㎍)에 대해 12mm, Carbenicillin(100㎍)에 대해 10mm, Penicillin(10IU)에 대해 12mm, Sulficoxazole(0.25mg)에 대해 1mm, Kanamycin(30㎍)에 대해 1mm로 나타나 항생제 내성이 확인되었다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명 프로바이오틱 미생물을 이용하여 면역 활성을 증강시키거나 암세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 면역 활성 실험 결과 Probio-44의 B cell과 T cell의 증식능 및 NK cell의 활성이 우수한 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 대식세포가 항암효과를 나타내는 TNF-α 활성 또한 매우 우수한 것으로 나타났다. 그리고, Probio-44는 Hydrogen peroxide(H2O2)의 활성이 역시 우수한 것으로 나타났다. 암 세포 증식 억제 실험 결과 은 다음과 같이 수행하였다.
암세포 증식 억제 실험 결과, 본 발명 Probio-44는 암세포인 Sacorma-180 ascites cancer cells, B16 melanoma cancer cells, AGS human gastric cancer cells의 cells line을 사용하여 MTT assay를 행한 In vitro실험에서 Sacorma-180 ascites cancer cells, B16 melanoma cancer cells, 및 AGS human gastric cancer cells 등의 암세포 증식을 억제하여 항암효과가 우수한 것으로 나타났다.
본 발명의 한 유익한 측면에 있어서, 본 발명은 신규의 프로바이오틱 미생물인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) Probio-44을 함유하는 식품, 의약품, 동물약품, 유산균제제 및 건강보조식품을 제공한다. 본 발명 미생물은 허용가능한 담체와 함께 독립적으로, 또는 첨가되어 사용되거나 사람 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명 미생물은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 부여함) 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 증강시키거나 보완함)에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명의 의약학적, 식품학적 또는 영양학적 조성물은 분리된 프로바이오틱세균으로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei ) Probio-44 또는 이와 함께 2종 이상의 다른 유익한 균주와 적당한 담체를 함께 포함할 수 있다.
예컨대, 본 발명 조성물에 본 발명 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들 은 사람이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 유해 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 Saccharomyces, Candida, Pichia 및 Torulopsis를 포함하는 효모(yeasts), Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium 등과 같은 곰팡이 및 Lactobacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Leuconostoc, Bacteroides, Staphylococcus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Propionibacterium, Enterococcus, Pediococcus, 그리고 Micrococcus 속 세균들이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, 및 Staphylococcus xylosus 등을 들 수 있다. 바람직하게는 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 면역활성 증강 및 항암작용이 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명 조성물에 추가로 포함하여 본 발명 조성물의 효과를 더욱 증진시킬 수도 있다. 본 발명 조성물에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡 슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) Probio-44 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
통상적인 항생제 대신에, 본 발명 신규 미생물 및 조성물은 생균활성제로 사람 또는 동물에 투여되거나 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제, 또는 건강보조식품과 함께 사람이나 동물에 투여될 수 있다. 본 발명 프로바이오닉 미생물 및 이를 포함한 조성물 형태의 생균활성제는 기존 항생제의 대체용으로 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 하고 면역활성을 증강시키는 등의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명 조성물은 또한 장내 미생물 균총을 유지하기 위해 항생제 투여 후에도 투여될 수 있다.
특히, 항생제 내성뿐만 아니라 유해 장내미생물 생육 억제능 및 항암활성을 갖는 본 발명 신규 미생물은 특히, 다른 치료법이 비효과적이거나 임상적으로 부작용이 있는 장내 유해미생물 감염의 감염에 의해 유발된 대부분의 증상 완화나 치료에 매우 유용하다. 그리하여, 본 발명은 신규 미생물 또는 이를 유효량 함유한 조성물을 사용하여 장내 유해 미생물의 감염이나 장내 질환의 발생을 저지하거나 장내 유해 미생물 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 발명의 권리범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내산, 내담즙산 성질
내산성은 MRS broth에 1N HCl로 pH를 1과 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5.5, 6, 7로 조정 하고 Probio-44를 1% 접종 후 37℃배양기에서 2시간동안 정치배양한 후 십진희석하여 MRS agar로 37℃에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였으며, 내담즙성 실험은 MRS broth에 Bacto oxgall(Difco)을 0%와 0.25, 0.3, 0.5, 0.7, 1%로 첨가후 Probio-44를 1%접종 후 37℃배양기에서 2시간동안 정치배양한 후 십진희석하여 MRS agar로 37℃에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) Probio-44는 내산성과 내담즙성이 우수한 것으로 나타났다(도 1, 2)
실시예 2 분리된 미생물의 in vitro상에서 암 세포 증식 억제 실험
Probio-44를, MRS 액체배지 (Difco)에 37℃에서 24시간 배양한 후 균체(LCP)와 배양상등액(LBS), peptidoglycan(LCP), cytoplasm(LSC)으로 분류하였다. In vitro실험으로는 Sacorma-180 ascites cancer cells 과 B16 melanoma cancer cells, AGS human gastric cancer cells의 cells line을 사용하여 MTT assay를 하였다. Sacorma-180 ascites cancer cells 과 B16 melanoma cancer cells, AGS human gastric cancer cells의 cells line은 10% heat-inactivated fetal bovien serum을 함유한 RPMI 1640(100 U/ml penicillin, 100g/ml streptomycin(Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.)배지로 5% CO2 세포배양기에서 배양하면서 세포증식을 관찰하였다. 배양 후 96공 (96-well) 세포배양 plate에 Sacorma-180 ascites cancer cells 과 B16 melanoma cancer cells, AGS human gastric cancer cells을 1X105이 되도록 희석하여 180㎕씩 96 well plate에 분주후 유산균 시료를 20㎕씩 첨가하여 48시간 배양후 세포배양 Plate에 MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue)시약을 25㎛ 정도 접종한 후, 5% CO2를 포함하는 37℃ 세포배양기내에서 4시간 배양한다(MTT 분석은 접종 후 노란빛을 띄지만, 살아있는 세포 속에 들어가면 미토콘드리아의 탈수소 효소에 의해 보라색을 띄운다). 4시간 후 DMSO를 150㎕씩 분주후 MTT용액과 반응하여 생긴 푸른색의 fomazan 결정을 완전히 녹인 후 30분 안에 ELISA를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 시험으로 Sacorma-180 ascites cancer cells 과 B16 melanoma cancer cells, AGS human gastric cancer cells를 억제하는 것으로 나타났다(표1).
Figure 112003503540004-pat00001
실시예 3 분리된 미생물의 in vivo상에서 암 세포 증식 억제 효과
In vivo 실험은 ICR mouse를 각 군당 7마리씩하여 1X107 Sacorma-180 ascites cancer cells 1ml씩을 ICR mouse의 복강에 주사하여 암을 유발시켰으며, 암세포 주입 24시간 후부터 유산균 4개의 시료(균체:50mg/day, 배양상등액: 100㎕/day, peptidoglycan;50mg/day, cytoplasm;100㎕/day)를 ICR mouse에게 20일간 복강주사한후 40일까지의 생존여부를 관찰하였다. 락토바실러스 사케이 Probio-44는 항암효과가 우수한 것으로 나타났다(표2).
Figure 112003503540004-pat00002
실시예 4 분리된 미생물의 임파구 증식능의 측정
임파구 증식능의 측정은 비장세포를 96 well plate에 5X105 cell/well의 농 도로 넣고 세포증식을 위한 mitogen으로 10㎍/㎖ LPS 와 2.5㎍/㎖ ConA를 첨가하여 각각 Bcell과 Tcell의 증식능력을 알아보았다. 전체 배양부피는 200㎕로 맞추어서 5% CO2배양기에서 48시간 배양후 세포증식을 알아보기 위하여 MTT(2㎍/㎖) 25㎕를 가하고 4시간동안 다시 배양하였다. 생성된 formazan을 DMSO 150㎕로 녹인 후 ELIAS reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정함으로서 임파구증식을 측정하였다. 비장세포를 96well plate에 well당 5X105 cell 개씩 넣고 Probio-44를 농도별로 첨가한 다음 mitogen이 있거나 없는 상태에서 48시간 배양한 후 위와 동일한 방법으로 측정하였다. 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) Probio-44는 B임파구와 T임파구 증식능이 우수한 것으로 나타났다(도 3, 4).
실시예 5 분리된 NK cell 의 항암작용 측정
NK cell 항암작용 측정 실험은 NK cell에 예민한 YAC-1 cell에 대한 cytotoxicity를 측정하였다. 비장세포를 96well plate에 5X105 cell/well의 농도로 넣은 후 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) Probio-44를 분주하고, YAC-1cell을 target cell로 하여 25:1의 비율로 넣고 20시간동안 배양하였다. 세포증식을 알아보기 위하여 MTT(2㎍/㎖)25㎕를 가하고 5시간동안 더 배양하고 생성된 formazan을 DMSO 150㎕로 녹이고 ELISA reader로 540nm에서 측정하였다(도 5).
실시예 6 분리된 미생물의 TNF-α 의 생성도 측정
대식세포가 항암 효과를 나타내는 또 다른 기전의 하나인 TNF-α 의 활성은 TNF-α 에 민감한 L929 fibroblast 세포를 이용하여 Flick and Gifford(1984)의 방 법에 따라 배양상등액의 세포독성을 측정함으로써 알 수 있었다. L929 세포(4X105 cell/㎖) 100㎕를 바닥이 편편한 96well plate에 밤새 배양하여 monorlayer를 만든 세포 50㎕와 ICR mouse의 대식세포에 LPS 또는 LPS+ γ -IFN 으로 활성화시킨 배양상등액 100㎕와 2㎍/㎖ actinomycin D 50㎕를 가하여 전체양을 200㎕로 한후 18시간 동안 배양한 다음 MTT(2㎍/㎖)를 25㎕넣고 4시간 더 배양하였다. 생성된 formazone을 DMSO로 녹인 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 L929세포의 증식저해율을 측정하였다. 결과는 L929세포만의 흡광도와 각 각의 시험군의 흡광도를 비교하여 L929세포가 분해된 정도를 나타내었다. Actinomycin D는 TNF-α 에 대한 L929세포의 감수성을 증가켰다. 분리한 대식세포에 Probio-44를 100, 10.1.0.1㎍/㎖를 가하고 10㎍/㎖의 LPS가 있거나 없는 상태에서 20시간 처리한 후 20시간 더 배양시킨 후 MTT assay를 하였다(도 6)
실시예 7 분리된 미생물의 Hydrogen peroxide 측정
Hydrogen peroxide(H2O2)의 분비는 지시약인 phenol red의 색이 horse-radish peroxidase 의 촉매 하에 산화되어 변하는 정도로 측정할 수 있는데 이는 Nathan and Root, (1977)가 언급한 방법을 변형하여 사용하였다. 분리한 대식세포에 Probio-44를 100. 10. 1. 0.1 ㎍/㎖ 농도로 가하고 10㎕/㎖의 LPS가 있거나 없는 상태에서 20시간 처리한 후 위와 동일한 방법으로 측정하였다. Probio-44가 Hydrogen peroxide(H2O2)가 유의성 있게 증가하였다(도 7).
실시예 8 분리된 미생물의 유해 미생물 생장 억제 효과
분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)과 항생제 평가시 사용되는 미생물 15종을 대상으로 하였다. 이러한 미생물 15 종은 다음과 같다: Helicobacter pylory ATCC 43504, S. aureus ATCC 25923, V. parahamolyticus ATCC1 7802, E. coli ATCC 25922, S. typhimurium ATCC 14028, E. coli 0157:H7 ATCC 43888, B. cereus KCCM 40133, E. coli B 44, B. subtilis ATCC 6633, L. monocytogenes KCTC 1014, E. erogenes ATCC 13048, S. enteritidis ATCC 13076, E. coli 0157: H7 933, L. monocytogenes ATCC 19111, C. sputorum.
이러한 유해 미생물은 MRS 액체배지에서 18시간 배양한 후 배양액 0.1ml을 취하여 MRS 고체배지에 도말 하였다. 그런 후 MRS 액체배지에서 18시간 배양된 각각의 분리 미생물 배양액 40ul를 지름 8 mm의 페이퍼디스크에 접종한 후 유해미생물이 도말된 고체배지에 올려놓은 후 배양하였다. 일정 시간의 배양 후 나타나는 억제환을 측정하여 대조군과 비교한 후 유해미생물의 억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-44로 명명하였다. Probio-44의 유해 미생물에 대한 억제 활성은 다음 표 3과 같다. 표3에서 보는 바와 같이 Probio-44는 사용된 유해미생물 15종에 대해서 대부분 유사한 억제 활성을 지니는 매우 유용한 미생물인 것으로 확 인되었다(표3).
Figure 112003503540004-pat00003
실시예 9 Probio-44 항생제에 대한 감수성
Probio-44 항생제에 대한 감수성 실험은 Microbiology Procedures handbook vol.1(Henry D, Isenberg, ASM)과 한국특허공고 91-4366호의 방법에 의거하여 10종의 항생제에 대해 수행하였으며, 사용된 항생제 종류는 Ampicillin 10㎍, Gentamycin 10㎍, Tetracycline 30㎍, Neomycin 30㎍, Erythromycin 15㎍, Lincomycin 2㎍, Cephalothin 30㎍, Carbenicillin 100㎍, Penicillin 10IU, Sulficoxazole 0.25mg, Kanamycin 30㎍, Streptomycin 10㎍(sensi- disc antimicrobial susceptibility test discs(BBL)을 사용하였다. 준비한 항생제 페이퍼디스크를 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 나타나는 억제환의 직경을 측정하였다(표 4).
Figure 112003503540004-pat00004
실시예 10 분리한 미생물 Probio-44의 동정
실시예 1에서 분리된 Probio-44 균주를 MRS 배지 (Difco사 제품)에서 37℃조건으로 배양하였다. Probio-44 균주를 동정하기 위하여, Probio-44의 형태 및 생리학적 특성은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 904, 1997)의 방법과 API 32A 및 CHL 키트 (바이오메리오사 제품)를 사용하여 결정하였다(표 5, 도 9). 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다. Probio-40의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통 분류학적 분석에서 Probio-44는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 균주로서 99.6%의 16S rDNA 상동성으로 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei)의 표준균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
Figure 112003503540004-pat00005
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속의 새로운 미생물인 락토바실러스 사케이 Probio-44는 면역활성이 우수하며, 암 세포 증식 및 병원성 세균을 억제하는 유산균 프로바이오틱스로 인체 내 및 장내에서 유해한 성질을 나 타내는 암세포 및 여러 종류의 병원성 미생물을 효과적으로 억제하고 내산성, 내담즙산 기능을 가지고 있어 기존 항생제의 대체용으로 인체에 투여시 장내미생물 균 총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있으며 건강상태를 양호하게 하고 장내 암 세포 증식 억제 및 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.
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Claims (7)

  1. 내산성 및 내담즙산성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강과 항암 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 Probio-44(Lactobacillus sakei Probio-44 KCTC 10427BP).
  2. 허용 가능한 담체 및 유효량의 상기 제1항의 락토바실러스 사케이 Probio-44을 포함하고 프로바이오틱 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 구강 섭취시 장내 유해세균의 증식을 억제하거나 면역활성 증강을 통해 결장 암세포 증식을 억제하는데 유용한 조성물.
  5. 상기 제1항의 락토바실러스 사케이 Probio-44를 유효량으로 포함하는 동물사료첨가제.
  6. 상기 제1항의 락토바실러스 사케이 Probio-44를 이용하여 인간을 제외한 동물에서 장내 유해 병원미생물의 생육을 억제하거나 상기미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 상기 제1항의 락보바실러스 사케이 Probio-44를 이용하여 인간을 제외한 동물에서 면역활성 증강을 통해 결장 암세포 증식을 억제하는 방법.
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