KR100571060B1

KR100571060B1 - Antibody against Human Parathormone Related Peptides

Info

Publication number: KR100571060B1
Application number: KR1019997002643A
Authority: KR
Inventors: 사도코; 와카하라유지; 야부타나오히로
Original assignee: 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2006-04-14
Also published as: RU2322453C2; KR20000048691A; UA75318C2; CN1817906A; ZA978590B; CN1817906B

Abstract

인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체, 그 항체를 코딩하는 DNA, 그 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 그 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 그 항체의 제조방법, 및 그 항체의 용도.An antibody against a human parathyroid hormone-related peptide, a DNA encoding the antibody, a recombinant vector comprising the DNA, a transformant transformed by the recombinant vector, a method for producing the antibody, and a use of the antibody.

Description

인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체{Antibody against Human Parathormone Related Peptides}Antibody against Human Parathormone Related Peptides

본 발명은 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 마우스 단일클론 항체의 가변영역(V영역)과 인간항체의 정상영역(C영역)으로 이루어진 인간/마우스 키메라 항체, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 마우스 단일클론 항체의 L쇄(light chain) V영역 및 H쇄(heavy chain) V영역의 상보성 결정영역이 인간항체에 이식된 인간형화(humanized) 항체, 각 해당 항체의 L쇄 및 H쇄, 그리고 각 해당 항체의 L쇄 또는 H쇄을 구성하는 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.The present invention provides a human / mouse chimeric antibody consisting of a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody to a parathyroid hormone-related peptide and a normal region (C region) of a human antibody, and a L of a mouse monoclonal antibody to a parathyroid hormone-related peptide. Humanized antibodies in which the complementarity determining regions of the light chain V region and the heavy chain V region are implanted in a human antibody, the L chain and the H chain of each corresponding antibody, and the L chain of each corresponding antibody Or it relates to a polypeptide comprising a V region constituting the H chain.

또한, 본 발명은 상기의 항체, 특히 그 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA, 및 V영역이 포함하는 L쇄 또는 H쇄을 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 각 해당 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 해당 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다.The present invention also relates to a DNA comprising the nucleotide sequence encoding the antibody, particularly the V region, and a DNA encoding the L chain or the H chain included in the V region. The present invention also relates to a recombinant vector comprising each corresponding DNA and a host transformed with the vector.

또한, 본 발명은 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 키메라 항체 및 인간형화된 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 의약 조성물과 고칼슘혈증 억제제 및 저인혈증 개선제에 관한 것이다.The present invention also relates to methods for preparing chimeric and humanized antibodies against parathyroid hormone related peptides. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody against a parathyroid hormone-related peptide as an active ingredient, a hypercalcemia inhibitor and a hypophosphatemic improver.

악성종양에 수반되는 고칼슘혈증은 전 악성종양 환자의 5∼20%에 나타나는 중증의 합병증상으로, 방치하면 반드시 죽음에 이르기 때문에 악성종양의 말기적 증상으로 여겨지고 있다. 고칼슘혈증의 억제는 환자의 치료와 예방 후, 그리고 QOL(Quality of life)에 크게 영향을 미치기 때문에 임상적으로 중요한 역할을 한다.Hypercalcemia associated with malignant tumors is a serious complication of 5-20% of all malignant tumors. If left unchecked, it is considered a terminal symptom of malignant tumors. Inhibition of hypercalcemia plays a clinically important role because it greatly affects the treatment and prevention of patients and the quality of life (QOL).

일반적으로 악성종양 환자에 있어 고칼슘혈증은, 종양 생성성의 체액성 골흡수 인자에 의한 HHM(Humoral hypercalcemia of malignancy)이나, 뼈에 전이 또는 침윤된 종양의 국소적인 작용에 의한 LOH(Local Osteolytic hypercalcemia)등과는 크게 구별되어 진다.In general, hypercalcemia in patients with malignant tumors may be associated with a tumor-induced humoral hypercalcemia of malignancy (HHM), or local osteolytic hypercalcemia (LOH) due to the local action of tumors that metastasize to or invade bone. Is largely distinguished.

HHM에서는 골흡수나 골파열의 항진(亢進)으로 칼슘의 추출이 증가하고 신장에서 칼슘의 배설이 저하되어 고칼슘혈증을 일으킨다고 여겨지고 있다(화전성기(和田誠基) 및 영정직일(永田直一), 내과 69, 644-648)).HHM is believed to increase calcium extraction due to bone resorption and hyperplasia of bone rupture, and to reduce calcium excretion in the kidneys, leading to hypercalcemia. (Hansung period and Youngjung Il-Jin) ), Internal Medicine 69, 644-648).

고칼슘혈증은 혈청 칼슘치가 12mg/dl을 초과하면 그 증상이 나타나는 것으로 보이며, 그 증상으로, 초기에 식욕부진, 메스꺼움, 구토가 악성종양 환자에 있어서 비특이적인 증상으로 나타나고 있다. 고칼슘혈증이 악화되면 신원위뇨세관(腎遠位尿細管)의 장해로 수분의 농축력이 저하되기 때문에 다뇨(多尿)현상이 일으나며, 메스꺼움, 구토로 인해 수분이 충분히 섭취가 되지 않기 때문에 탈수를 동반한다.Hypercalcemia seems to be symptomatic when the serum calcium level exceeds 12 mg / dl. The symptoms are initially characterized by anorexia, nausea and vomiting as non-specific symptoms in malignant patients. If hypercalcemia worsens, the urinary tract of the proximal tubule (腎遠位尿細管) decreases the concentration of water, which leads to polyuria, which is caused by nausea and vomiting. To accompany.

악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 중에서 HHM을 일으키는 액성인자로서, PTH(부갑성선 호르몬: Parathyroid Hormone)형태의 물질인 부갑상선 호르몬 관련 펩티드(Parathyroid Hormone related Peptide, 이하 'PTHrP'라 칭한다)가 Moseley, J. M.에 의해 발견되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84, 5048-5052).Among the hypercalcemia associated with malignant tumors, parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), a substance in the form of PTH (parathyroid hormone), is referred to Moseley and JM. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84, 5048-5052).

그후, PTHrP를 코딩하는 유전자가 단리되고(Suva, L. J. et al., Science, (1987) 237, 893), 이것의 해석으로 인간 PTHrP는 유전자의 선택적 스프라이싱에 근거하여 139, 141 및 173개의 아미노산으로 이루어진 3중 가닥으로 존재하는 사실을 알았고, 전 구조를 가지는 PTHrP(1-139)의 제한분해로 혈중(血中)에서 다양한 절편(fragment)들이 존재한다는 사실이 확실해 졌다(Bana, H, Clinical Calcium (1995) 5, 229-233). PTHrP는 N말단측의 제 1위치에서 제 13위치까지의 아미노산 13개 중 8개가 PTH와 동일하고, 제 14위치에서 제 32위치의 아미노산에 있어서도 PTH와 유사한 입체구조를 가지는 것으로 추정되므로, 적어도 N말단에 있어서는 PTH와 공통의 PTH/PTHrP 수용체에 결합한다(Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026, Abou-Samra, A-B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 2732-2736).Then, the gene encoding PTHrP is isolated (Suva, LJ et al., Science, (1987) 237, 893), and in its interpretation human PTHrP is 139, 141 and 173 amino acids based on selective splicing of the gene. It was found that it exists as a triple strand consisting of, and the restriction of PTHrP (1-139) having a full structure confirmed the existence of various fragments in the blood (Bana, H, Clinical). Calcium (1995) 5, 229-233). Since PTHrP is estimated to have 8 of 13 amino acids from the first to the 13th positions on the N-terminal side to the same as PTH, and the amino acids at the 14th to 32nd positions have a stereoscopic structure similar to that of PTH, at least N At the end, it binds to the PTH / PTHrP receptor common to PTH (Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026, Abou-Samra, AB. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89, 2732-2736).

PTHrP는 다양한 종양조직으로부터 생성되는 것이 보고되어 있는데, 종양뿐만 아니라 피부, 중추신경, 자궁, 태반, 수유중의 유선, 갑상선, 부갑상선, 부신, 간, 신장, 방광을 비롯해, 태아로부터 성인에 이르기까지 여러가지 정상 조직에 의해서도 생성된다는 사실이 밝혀졌다(Burtis, W. J. Clen. Chem. (1992) 38, 2171-2183, Stewart, A. F. & Broadus, A. E. J. Clin. Endoclinol (1991) 71, 1410-1414). 또한 PTHrP는 태아기에서 신생아기에 걸쳐 모체로부터 높게 유지되는 칼슘의 대사조절에 중요한 역할을 한다고 여겨지고 있다.PTHrP is reported to be produced from a variety of tumor tissues, including tumors, skin, central nervous system, uterus, placenta, lactating mammary glands, thyroid gland, parathyroid gland, adrenal gland, liver, kidney, bladder, fetuses and adults. It has also been found to be produced by normal tissue (Burtis, WJ Clen. Chem. (1992) 38, 2171-2183, Stewart, AF & Broadus, AEJ Clin. Endoclinol (1991) 71, 1410-1414). It is also believed that PTHrP plays an important role in regulating metabolism of calcium, which is maintained high from the mother during fetal and neonatal periods.

PTH/PTHrP 수용체는 주로 뼈와 신장에 존재하고(자야장평(滋野長平), Clinical Calcium (1995) 5, 355-359), PTHrP가 수용체에 결합하면 복수의 세포내 신호전달계가 활성화되는 것이 알려져 있다. 그중 한가지는 아데닐 사이클라제(adenyl cyclase)이며, 다른 하나는 포스포리파제 C(phospholipase C)이다. 아데닐사이클라제가 활성화되면 세포내 cAMP농도가 상승하고 단백질 키나제 A(protein kinase A)가 활성화된다. 또한 포스포리파제 C는 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스포네이트를 분해하여 이노시톨 1, 4, 5-트리포스포네이트와 디아실 글리세롤을 생성시킨다. 이들의 신호 전달계에는 G단백질이 관여한다(Coleman, D. T. et al., Biochemical mechanism of parathyroid hormone action. In: "The parathyroids" (Bilezikian, J. P. et al.), Raven press, New York, (1994) page 239).PTH / PTHrP receptors are mainly present in bones and kidneys (jayajangpyeong, Clinical Calcium (1995) 5, 355-359), and it is known that multiple intracellular signaling systems are activated when PTHrP binds to receptors. . One is adenyl cyclase and the other is phospholipase C. When adenyl cyclase is activated, intracellular cAMP concentration is increased and protein kinase A is activated. Phospholipase C also degrades phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphonates to produce inositol 1, 4, 5-triphosphonates and diacyl glycerol. G signaling is involved in their signaling system (Coleman, DT et al., Biochemical mechanism of parathyroid hormone action.In: "The parathyroids" (Bilezikian, JP et al.), Raven press, New York, (1994) page 239).

PTHrP는 이들의 신호전달을 통해서 HHM에서 관찰되는 고칼슘혈증, 저인혈증. 신장인(腎燐) 재흡수기능의 저하, 신성(腎性) cDNA 배설 증가 등을 일으킨다.PTHrP is a hypercalcemia and hypophosphatemia observed in HHM through their signaling. Renal phosphorus reabsorption function decreases, and it causes an increase in the excretion of neural cDNA.

이와 같이 PTHrP는 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증에 밀접하게 관련되어 있다는 사실은 명확히 밝혀져 있다. 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증의 치료에는 보액(補液)을 수행하는 것 이외에 칼시도닌, 스테로이드제, 인도메다신, 무기인산염, 비스포스페이트등을 사용한다. 그러나, 이들의 약제는 연속적으로 사용하면 효과가 저하되고, 강한 부작용을 보이며, 또한 약효 발현이 늦어지므로, 보다 치료효과 가 높고 부작용이 적은 약제의 사용이 기대되고 있다.As such, it is clear that PTHrP is closely related to hypercalcemia associated with malignant tumors. In the treatment of hypercalcemia associated with malignant tumors, calcidonin, steroids, indomedasin, inorganic phosphates, bisphosphates, etc., are used in addition to performing the supplement. However, when these drugs are used continuously, their effects are lowered, they have strong side effects, and their drug expression is slowed down. Therefore, it is expected to use drugs with higher therapeutic effects and fewer side effects.

한편, 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 치료의 새로운 시도로서, Kukreja, S. C. 팀은 인간의 폐암세포 또는 후두암세포를 이식해서 고칼슘혈증을 일으킨 무흉선 마우스에 PTHrP에 대한 중화항혈청(中和抗血淸)을 투여하면 혈중 칼슘의 농도 및 요(尿) cAMP의 양이 감소한다는 것이 보고되어 있다(J. Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802). Sato, K.(佐藤幹二)팀은 PTHrP를 생성하는 인간 종양을 이식한 누드마우스에 PTHrP(1-34)에 대한 항체를 투여했을 때, 고칼슘혈증을 감소시켜 마우스의 생존시간을 대폭 연장시킬 수 있었다고 보고하고 있다(J.bone & Mine. Res. (1993) 8, 849-860). 또한, 일본 특허공개 제 4-228028호에는 인간 PTHrP(1-34)에 대한 마우스/인간 키메라 항체가 개시되어 있다.On the other hand, as a new approach to the treatment of hypercalcemia associated with malignant tumors, Kukreja, SC and his team have developed neutralizing antiserum against PTHrP in athymic mice transplanted with human lung or laryngeal cancer cells to cause hypercalcemia. Has been reported to reduce blood calcium levels and urinary cAMP levels (J. Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802). Sato, K., and his team, when administered to PTHrP-producing human tumor-producing nude mice with PTHrP (1-34) antibodies, can significantly reduce hypercalcemia and significantly extend the survival time of mice. (J.bone & Mine.Res. (1993) 8, 849-860). Japanese Patent Laid-Open No. 4-228028 also discloses a mouse / human chimeric antibody against human PTHrP (1-34).

마우스의 단일클론 항체는 인간에 있어서 고도의 면역원성(「항원성」이라고 하는 경우도 있음)을 가지며, 이 때문에 인간에 대한 마우스 단일클론 항체의 의학적 치료 방법으로서의 가치는 제한되어 있다. 예를 들어, 마우스 항체를 인간에 투여하면 이물질로서 대사될수 있기 때문에, 인간에 대한 마우스 항체의 반감기는 비교적 짧아서 기대되는 효과를 충분히 발휘할 수 없다. 더욱이, 투여한 마우스 항체에 대해 발생하는 인간 항마우스 항체(HAMA)는 혈청병 또는 다른 알레르기반응등, 환자에 있어서 부적합하고, 위험한 면역반응을 야기한다. 따라서, 마우스 단일클론 항체를 인간에게 반복해서 투여할 수는 없다.Mouse monoclonal antibodies have a high degree of immunogenicity (sometimes referred to as "antigenicity") in humans, and as a result, their value as a medical treatment method of mouse monoclonal antibodies to humans is limited. For example, when a mouse antibody is administered to a human, it can be metabolized as a foreign substance, and thus the half-life of the mouse antibody to a human is relatively short, so that the expected effect cannot be sufficiently exhibited. Moreover, human anti-mouse antibodies (HAMA) that occur against administered mouse antibodies are inadequate in patients, such as serum diseases or other allergic reactions, and cause dangerous immune responses. Thus, mouse monoclonal antibodies cannot be repeatedly administered to humans.

이와 같은 문제를 해결하기 위해 인간외 유래의 항체, 예를 들어 마우스 유래의 단일클론 항체의 면역원성을 저하시키는 방법이 개발되었다. 그 중 하나는, 항체의 가변영역(V영역)은 본래의 마우스 단일클론 항체에 유래하고, 정상영역(C영역)은 적당한 인간 항체에 유래하는 키메라 항체를 제작하는 방법이다.In order to solve such a problem, a method for lowering the immunogenicity of an antibody derived from a human being, for example, a monoclonal antibody derived from a mouse, has been developed. One of them is a method for producing a chimeric antibody derived from an original mouse monoclonal antibody and a constant region (C region) derived from a suitable human antibody.

수득한 키메라 항체는 본래 마우스 항체의 가변영역을 완전한 형태로 함유하므로 본래의 마우스 항체와 동일한 특이성을 가지고, 항원에 결합할 것을 기대할 수 있다. 또한, 키메라 항체에는 인간이외에서 유래하는 아미노산 서열의 비율이 실질적으로 감소하고 있고, 이로 인해 본래의 마우스 항체에 비해 낮은 면역원성을 보일 것으로 예상된다. 키메라 항체는 본래의 마우스 단일클론 항체와 동일하게 항원에 결합하고, 또한 면역원성이 저하되지만, 역시 마우스 가변영역에 대한 면역반응이 일어날 가능성이 있다(LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4220-4224).Since the obtained chimeric antibody originally contains the variable region of the mouse antibody in a complete form, it can be expected to bind to the antigen with the same specificity as that of the original mouse antibody. In addition, the ratio of amino acid sequences derived from non-human to the chimeric antibody is substantially reduced, which is expected to show lower immunogenicity than the original mouse antibody. Chimeric antibodies bind antigens in the same way as the original mouse monoclonal antibodies and also reduce immunogenicity, but there is also the possibility that an immune response to mouse variable regions occurs (LoBuglio, AF et al., Proc. Natl. Acad). Sci. USA (1989) 86, 4220-4224).

마우스 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 제 2의 방법은, 한층 복잡하지만, 마우스 항체의 잠재적인 면역원성을 더욱 대폭적으로 감소시킬 수 있을 것이다. 이 방법에 있어서는, 마우스 항체의 가변영역으로부터 상보성결정영역 (complementary determining resion; CDR)만을 인간의 가변영역에 이식하고, 「재구성」(reshaped)된 인간 가변영역을 제작한다. 단, 필요에 의해서는 재구성 인간 가변영역의 CDR 구조를 본래 마우스 항체의 구조에 더욱 근접시키기 위해 CDR을 지지하고 있는 프레임워크영역(FR)의 일부 아미노산 서열을 마우스 항체의 가변영역으로부터 인간의 가변영역에 이식하는 경우가 있다.The second method for reducing the immunogenicity of a mouse antibody is more complicated, but may further reduce the potential immunogenicity of a mouse antibody. In this method, only a complementary determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody is transplanted into a human variable region, and a "reshaped" human variable region is produced. However, if necessary, in order to bring the CDR structure of the reconstructed human variable region closer to that of the original mouse antibody, some amino acid sequences of the framework region (FR) supporting the CDRs may be converted from the variable region of the mouse antibody to the human variable region. It may be transplanted to.

다음으로, 이들의 인간형화된 재구성 인간 가변영역을 인간 정상영역에 결합시킨다. 최종적으로 재구성된 인간형화된 항체의 인간이외의 아마노산 서열에서 유래하는 부분은 CDR 및 극히 일부인 FR뿐이다. CDR은 초가변 아미노산 서열에 의해 구성되어 있으므로, 종(種)특이성 서열을 나타내지 않는다. 이 때문에, 마우스 CDR을 가지는 인간형화된 항체는 이미 인간 CDR을 함유하는 천연의 인간 항체에 비해 강한 면역원성을 가지지 못할 것임에 틀림없다.Next, these humanized reconstituted human variable regions are joined to human normal regions. The only parts derived from the non-human amanoic acid sequences of the finally reconstituted humanized antibody are the CDRs and very few FRs. The CDRs are composed of hypervariable amino acid sequences and therefore do not exhibit species specific sequences. For this reason, humanized antibodies with mouse CDRs must not have strong immunogenicity as compared to native human antibodies already containing human CDRs.

또한, 인간형화된 항체에 대해서는 Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Ketteborough, C. A. et al., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Gorman, S. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P. R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M. S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; 그리고 Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993 등의 문헌을 참고할 것.In addition, for humanized antibodies, see Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Ketteborough, C. A. et al., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Gorman, S. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P. R. et al., Bio / Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M. S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; And Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993 et al.

전기한 바와 같이, 인간형화된 항체는 치료방법의 목적으로는 유용할 것으로 예상되지만, PTHrP에 대한 인간형화된 항체는 알려져 있지 않으며, 상기의 문헌에서는 이에 대한 아무런 시사도 되어 있지 않다. 또한, 인간형화된 항체의 제조 방법에 있어서는 임의의 항체에 보편적으로 적용하여 얻을 수 있는 획일적인 방법이 존재하지 않기 때문에, 특정한 항원에 대해 충분한 결합활성과 중화활성을 나타내는 인간형화된 항체의 제작을 위해서는 여러 가지 궁리가 필요할 것이다(예를 들어, Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856을 참고할 것).As mentioned above, while humanized antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, no humanized antibodies to PTHrP are known and there is no suggestion in this document. In addition, since there is no uniform method that can be universally applied to any antibody in the production method of humanized antibodies, the production of humanized antibodies that exhibit sufficient binding and neutralizing activity with respect to specific antigens is proposed. This may require a number of devises (see, eg, Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

[발명의 개시][Initiation of invention]

본 발명은 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 가변영역(V영역)과 인간항체의 정상영역(C영역)으로 이루어진 인간/마우스 키메라 항체, PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역의 상보성 결정영역이 인간 항체에 이식된 인간형화된(humanized) 항체, 각 해당 항체의 L쇄 및 H쇄, 그리고 각 해당 항체의 L쇄 또는 H쇄을 구성하는 V영역이 포함된 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention provides a human / mouse chimeric antibody consisting of a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody against PTHrP and a normal region (C region) of a human antibody, and an L chain V region and an H chain of a mouse monoclonal antibody against PTHrP. Provided is a polypeptide comprising a humanized antibody in which the complementarity determining region of the V region is implanted in a human antibody, the L chain and the H chain of each corresponding antibody, and the V region constituting the L or H chain of each corresponding antibody. It aims to do it.

또한, 본 발명은 상기의 항체, 특히 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA, 그리고 V영역을 포함하는 폴리펩티드를 가지고 있는 L쇄 또는 H쇄를 코딩하는 DNA를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한, 각 해당 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 해당 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 PTHrP에 대한 키메라 항체 및 인간형 항체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 중화활성이 높은 PTHrP에 대한 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 PTHrP에 대한 항체 또는 인간형 항체를 유효성분으로 포함하는 의약조성물과 고칼슘혈증 억제제, 저인혈증 개선제 및 알칼리증 개선제를 제공하는 것을 목적으로 한다. It is also an object of the present invention to provide a DNA encoding an L chain or an H chain having the above-described antibody, in particular, a DNA comprising a nucleotide sequence encoding a V region, and a polypeptide comprising a V region. It is also an object of the present invention to provide a recombinant vector comprising each corresponding DNA and a host transformed with the vector. An object of the present invention is to provide a method for producing a chimeric antibody and a humanized antibody against PTHrP. An object of the present invention is to provide an antibody against PTHrP having high neutralizing activity. An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising an antibody or human-type antibody against PTHrP as an active ingredient, a hypercalcemia inhibitor, a hypophosphatemic improver, and an alkalosis improver.

본 발명자들은 상기과제를 밝히기 위해 예의 연구를 수행한 결과, PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체로서 인간에 있어서의 면역활성이 저하된 항체를 얻는 데 성공하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.As a result of earnestly researching the above-mentioned problems, the present inventors have succeeded in obtaining an antibody with reduced immune activity in humans as a mouse monoclonal antibody against PTHrP, and have completed the present invention.

즉, 본 발명은 인간 항체의 L쇄 C영역 및 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 L쇄 V영역을 포함한 키메라 L쇄에 관한 것이다. L쇄 V영역으로서는 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열이 포함된 것을 들 수 있고, L쇄 C영역으로서는 Cλ영역을 예로 들 수 있다. That is, the present invention relates to a chimeric L chain comprising the L chain C region of a human antibody and the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against PTHrP. The L chain V region includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, and the L chain C region includes a Cλ region.

또한, 본 발명은 인간 항체의 H쇄 C영역 및 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 H쇄 V영역을 포함한 키메라 H쇄에 관한 것이다. H쇄 V영역으로서는 서열번호 46로 표시되는 아미노산 서열이 포함된 것을 들 수 있고, H쇄 C영역으로서는 Cγ1영역을 예로 들 수 있다. The invention also relates to a chimeric H chain comprising the H chain C region of a human antibody and the H chain V region of a mouse monoclonal antibody against PTHrP. The H chain V region includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, and the H chain C region includes a Cγ1 region.

또한, 본 발명은 상기의 키메라 L쇄 및 키메라 H쇄을 포함하는 PTHrP에 대한 키메라 단일클론 항체에 관한 것이다.The present invention also relates to a chimeric monoclonal antibody against PTHrP comprising the chimeric L chain and chimeric H chain.

또한, 본 발명은 인간항체의 L쇄 V영역의 프레임워크 영역 1∼4 및 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 L쇄 V영역의 상보성 결정영역 1∼3을 가지는 인간형 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상보성 결정영역 1∼3은 각각 서열번호 59∼61로 표시되는 아마노산 서열을 포함하도록 하였다. 프레임워크 영역 1∼3으로서는 각각 인간항체 HSU03868의 프레임워크 영역 1∼3 유래의 것을, 한편, 프레임워크 영역 4로서는 인간항체 S25755의 프레임워크 영역 4 유래의 것을 사용하였다. 혹은, 프레임워크 영역 1∼3으로서는 각각 인간항체 HSU03868의 프레임워크 영역 1∼3 과 실질적으로 동일한 것을, 프레임워크 영역 4로서는 인간항체 S25755의 프레임워크 영역 4와 실질적으로 동일한 것을 사용하였다.The present invention also includes the L chain V region of a human antibody having framework regions 1 to 4 of the L chain V region of a human antibody and complementarity determining regions 1 to 3 of the L chain V region of a mouse monoclonal antibody directed against PTHrP. It relates to a polypeptide. Complementarity determining regions 1 to 3 were intended to include the amanoic acid sequences represented by SEQ ID NOs: 59 to 61, respectively. As the framework regions 1 to 3, those derived from the framework regions 1 to 3 of the human antibody HSU03868 were used, respectively, and as the framework region 4, those derived from the framework region 4 of the human antibody S25755 were used. Alternatively, the framework regions 1 to 3 are substantially the same as the framework regions 1 to 3 of the human antibody HSU03868, and the framework region 4 is substantially the same as the framework region 4 of the human antibody S25755.

여기서, 「실질적으로 동일」이라는 것은 인간형 항체에 사용되는 인간항체 의 프레임워크 영역에 있어서, 인간형 항체가 마우스 단일클론 항체와 동일한 활성을 가질 수 있도록 하기 위해서는, 마우스 단일클론 항체의 상보성 결정영역 형성에 필요한 아미노산의 결실, 치환, 첨가 등이 일어나도 좋다는 것을 의미한다. Here, "substantially the same" means that in the framework region of the human antibody used for the human antibody, in order to enable the human antibody to have the same activity as the mouse monoclonal antibody, it is necessary to form the complementarity determining region of the mouse monoclonal antibody. It means that deletion, substitution, addition, etc. of a required amino acid may occur.

또한, 본 발명은 프레임워크 영역 중의 카밧(Kabat)의 규정(Kabat, E. A. et al., Us Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991)에 의한, 제 36번째의 아미노산이 티로신이며, 제 49번째의 아미노산이 아스파라긴산인 인간형화된 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. In addition, according to the present invention, the thirty-sixth amino acid is tyrosine, which is defined by Kabat (Kabat, EA et al., Us Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991). A polypeptide comprising the L chain V region of a humanized antibody wherein the 49th amino acid is aspartic acid.

또한, 본 발명은 서열번호 48∼51로 표시되는 것 중의 어느 한 아미노산 서열을 포함하는 인간형화된 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. The present invention also relates to a polypeptide comprising the L chain V region of a humanized antibody comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 48 to 51.

또한, 본 발명은, 프레임워크 영역 중의 카밧의 규정에 의거한, 제 45번째의 아미노산이 라이신이며 제 87번째의 아미노산이 이소로이신(isoleucine)인 인간형 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리 펩티드이다. The present invention is also a polypeptide comprising the L chain V region of a humanoid antibody wherein the 45th amino acid is lysine and the 87th amino acid is isoleucine according to the Kabat definition in the framework region. .

또한, 본 발명은 서열번호 52∼55로 표시되는 것 중에서 어느 한 아미노산 서열을 포함하는 인간형화된 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. The present invention also relates to a polypeptide comprising the L chain V region of a humanized antibody comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 52-55.

또한, 본 발명은 인간항체의 H쇄 V영역의 프레임워크 영역 1∼4 및 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 H쇄 V영역의 상보성 결정영역 1∼3을 포함하는, 인간형화된 항체의 H쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상보성 결정영역 1∼3은 각각 서열번호 62∼64로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 예로 들 수 있다. 프레임워크 영역 1∼4로서는 인간 하위군 Ⅲ(Human Subgroup Ⅲ (HSG Ⅲ), Kabat, E. A. et al., Us Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) 에 속하는 인간항체 프레임워크 영역 1∼4 유래의 것을, 좀더 상세히 말하면 각각 인간항체 S31679의 프레임워크 영역 1∼4 유래의 것을 예로 들수 있고, 혹은 인간항체 S31679의 프레임워크 영역 1∼4와 실질적으로 동일 한 것을 예로 들 수 있다.In addition, the present invention provides an H chain of a humanized antibody comprising framework regions 1 to 4 of the H chain V region of a human antibody and complementarity determining regions 1 to 3 of the H chain V region of a mouse monoclonal antibody directed against PTHrP. It relates to a polypeptide comprising a V region. Examples of the complementarity determining regions 1 to 3 each include an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 62 to 64. As framework regions 1 to 4, human antibody framework region 1 belonging to the Human Subgroup III (HSG III), Kabat, EA et al., Us Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) In more detail, the thing derived from the framework regions 1-4 of human antibody S31679 can be mentioned, respectively, or the thing substantially the same as the framework regions 1-4 of human antibody S31679 can be mentioned.

또한, 본 발명은 서열번호 56로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 인간형 항체의 H쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. The present invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 and comprising the H chain V region of a humanized antibody.

또한, 본 발명은 상기의 인간형 항체의 L쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드 및 인간 항체의 L쇄 C영역을 포함하는 폴리펩티드를 함유하는, 인간형화된 항체의 L쇄에 관한 것이다. 여기서, C영역으로서는 Cγ영역, 프레임워크 영역 1∼3으로서는 각각 인간항체 HSU03868의 프레임워크 영역 1∼3과 실질적으로 동일한 것을, 그리고 상보적 결정영역 1∼3의 아미노산 서열로서는 각각 서열번호 59∼61로 표시되는 것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to the L chain of a humanized antibody, comprising a polypeptide comprising the L chain V region of the humanized antibody and a polypeptide comprising the L chain C region of a human antibody. Herein, as the C region, the Cγ region, the framework regions 1 to 3 are substantially the same as the framework regions 1 to 3 of the human antibody HSU03868, and the amino acid sequences of the complementary determining regions 1 to 3 are SEQ ID NOs: 59 to 61, respectively. For example, it is represented by.

또한, 본 발명은 전기 인간형화된 항체의 H쇄 C영역을 포함하는 폴리펩티드 및 H쇄 V영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 인간 PTHrP 에 관한 인간형화된 항체의 H쇄에 관한 것이다. C영역으로서는 Cγ1영역을, 프레임워크 영역 1∼4로서는 각각 인간항체 HSGⅢ에 속하는 인간항체 유래의 프레임워크 영역 1∼4 유래의 것을, 상보적 결정영역 1∼3으로서는 각각 서열번호 62∼64로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to an H chain of a humanized antibody directed against human PTHrP, comprising a polypeptide comprising an H chain C region and a polypeptide comprising an H chain V region of an electrohumanized antibody. The C region is represented by the Cγ1 region, the framework regions 1 to 4 are derived from the framework regions 1 to 4 derived from the human antibody belonging to the human antibody HSGIII, and the complementary determining regions 1 to 3 are represented by SEQ ID NOs: 62 to 64, respectively. Examples include the amino acid sequence to be.

또한, 본 발명은 항원성이 약하고, 중화활성이 높은 항PTHrP 에 관한 것이다. 각 해당 PTHrP 항체는 인간의 질환의 치료에 기여할 수 있는 인간 항체, 인간형화된 항체, 키메라 항체, 프라이마다이즈드 항체 등을 포함한다. 또한, 각 해당 항체는 낮은 해리정수를 가진다. 더욱이 본 발명의 항체는 해리정수가 작기때문에, 중화활성이 높고, 인간의 질병 치료에 이용될 수 있을 것이다.In addition, the present invention relates to anti-PTHrP which is weak in antigenicity and high in neutralizing activity. Each corresponding PTHrP antibody includes human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, primed antibodies, and the like, which may contribute to the treatment of human diseases. In addition, each of these antibodies has a low dissociation constant. Moreover, since the dissociation constant is small, the antibody of the present invention has high neutralizing activity and can be used for treating human diseases.

또한, 본 발명의 항체는 1.86×10^-7 [M] 이하의 해리정수, 1.22×10^-1 [1/Sec]이하의 해리속도정수, 그리고 6.55×10⁴ [1/M.Sec]이상의 결합해리정수를 가진다. 또한, 이들 정수는 방사선 동위원소(RI)로 표식된 리간드를 이용한 스켓차아드 도표(Scatchard plot)의 해석이나, 표면 플라스마 공명센서 등으로 측정할 수 있다.In addition, the antibody of the present invention has a dissociation constant of 1.86 × 10 ⁻⁷ [M] or less, a dissociation rate constant of 1.22 × 10 ⁻¹ [1 / Sec] or less, and binding of 6.55 × 10 ⁴ [1 / M.Sec] or more It has a dissociation constant. In addition, these constants can be measured by the analysis of the Scatchard plot using the ligand labeled with a radioisotope (RI), a surface plasma resonance sensor, etc.

또한, 본 발명은 인간 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 L쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA, 또는 H쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA에 관한 것이다. L쇄 V영역및 H쇄 V영역으로서는 각각 서열번호 45, 46으로 표시되는 아미노산 서열이 포함된 것을 들 수 있으며, L쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA로서는 예를 들어 서열번호 65로 표시되는 것을 예로 들 수 있으며, H쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA로서는 서열번호 57로 표시되는 것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to a DNA having a nucleotide sequence encoding the L chain V region of a mouse monoclonal antibody directed against human PTHrP, or a DNA having a nucleotide sequence encoding the H chain V region. Examples of the L-chain V region and the H-chain V region include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 45 and 46. DNAs having a nucleotide sequence encoding the L chain V region are represented by SEQ ID NO: 65, for example. Examples of the DNA include the nucleotide sequence encoding the H-chain V region.

또한, 본 발명은 앞서 서술한 인간형화된 항체의 L쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA, 또는 H쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA에 관한 것이다. L쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA로서는 서열번호 66∼74로 표시 되는 것 중의 어느 하나를 들 수 있고, H쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 가지는 DNA로서는 서열번호 58로 표시되는 것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to a DNA having a nucleotide sequence encoding the L chain V region of the humanized antibody described above, or a DNA having a nucleotide sequence encoding the H chain V region. The DNA having the nucleotide sequence encoding the L-chain V region can be any one of those represented by SEQ ID NOs: 66-74, and the DNA having the nucleotide sequence encoding the H-chain V region can be represented by SEQ ID NO: 58. For example.

또한, 본 발명은 서열번호 47∼55로 표시되는 것 중에서 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지는 인간형화된 항체의 L쇄 V영역의 DNA에 관한 것이다. 각 해당 DNA로서는 서열번호 66 내지74로 표시되는 것 중의 어느 하나의 염기서열을 포함하는것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to the DNA of the L chain V region of a humanized antibody having a nucleotide sequence encoding any one of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 47 to 55. Examples of the corresponding DNA include any one of nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 66 to 74.

또한, 본 발명은 서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 인간형화된 항체의 H쇄 V영역의 DNA에 관한 것이다. 각 해당 DNA로서는 서열번호 58로 표시되는 염기서열을 포함하는것을 예로 들 수 있다.The present invention also relates to the DNA of the H chain V region of a humanized antibody encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56. Examples of the corresponding DNA include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 58.

또한, 본 발명은 앞서 나열한 DNA를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant vector comprising the above-listed DNA.

또한, 본 발명은 상기의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a transformant transformed by the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기의 형질전환체를 배양하여 수득한 배양물로부터 인간의 부갑상선 관련 펩티드에 대한 키메라항체 또는 인간형 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 인간의 부갑상선 관련 펩티드에 대한 키메라항체 또는 인간형 항체의 제조방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is a chimeric antibody or human-type antibody against a human parathyroid-related peptide, characterized in that the chimeric antibody or human-type antibody against a human parathyroid-related peptide is collected from the culture obtained by culturing the transformant. It relates to a manufacturing method of.

또한, 본 발명은 전기 항체를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물과 고칼슘혈증 억제제 및 저인혈증 개선제에 관한 것이다. 고칼슘혈증은 악성종양에 기인하는 것이며, 또한, 악성종양수반성 고칼슘혈증 환자에 있어서는 자주 저인혈증이 나타난다. 따라서, 본 발명의 항체는 상기 악성종양에 대한 치료나 고칼슘혈증 혹은 저인혈증의 경감을 위해 사용할 수 있다. 또한, 악성종양으로서는, 예를 들어 췌장암, 폐암, 인두암, 후두암, 설암, 치육암, 식도암, 위암, 담관암, 유방암, 신장암, 방광암, 자궁암, 전립선암 및 악성임파종 등에서 적어도 1종류를 예로 들 수 있는데, 이들 암에 한정되는 것이 아니라, 고칼슘혈증을 초래하는 악성종양은 모두 본 발명의 고칼슘혈증 억제제 사용의 대상이 될 수 있다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the above antibody as an active ingredient, a hypercalcemia inhibitor and a hypophosphatemic improver. Hypercalcemia is due to malignant tumors, and hypoglycemia often occurs in patients with malignant tumor-associated hypercalcemia. Therefore, the antibody of the present invention can be used for the treatment of the malignant tumors or for reducing hypercalcemia or hypophosphatemia. Examples of malignant tumors include at least one of pancreatic cancer, lung cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, dental carcinoma, esophageal cancer, gastric cancer, bile duct cancer, breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, prostate cancer and malignant lymphoma. Although not limited to these cancers, all malignancies that lead to hypercalcemia may be subject to use of the hypercalcemia inhibitors of the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. 인간 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 작제1. Construction of Mouse Monoclonal Antibodies Against Human PTHrP

PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체는 항원으로 면역한 동물로부터 수득한 항체 생성 세포와 마엘로마(myeloma) 세포와의 세포융합에 의한 하이브리도마 (hybridoma)를 조제하여, 수득한 하이브리도마에서 PTHrP활성을 특이적으로 저해하는 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 조제할 수 있다.The mouse monoclonal antibody against PTHrP is prepared from hybridomas by cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells obtained from animals immunized with the antigen, and PTHrP activity in the hybridomas obtained. It can be prepared by selecting a clone that produces an antibody that specifically inhibits.

(1) 항원의 제조(1) Preparation of Antigen

동물면역에 이용하는 PTHrP로서는 재조합 DNA법 또는 화학합성에 의해 조제한 PTHrp의 아미노산 서열의 전부 혹는 일부 펩티드, 또는 고칼슘혈증을 야기하는 암세포의 배양 상등액 유래의 PTHrP 등을 예로 들 수 있다. 예를 들면, 공지된 PTHrP(Kemp, B. E. et al., Science(1987)238, 1568-1570)의 제 1내지 34번 째의 아미노산으로 구성된 펩티드(PTHrP(1-34))를 항원으로 이용할 수 있으며, 이때 인 간 PTHrP(1-34)는 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것이다. Examples of PTHrP used for animal immunization include all or part of an amino acid sequence of PTHrp prepared by recombinant DNA method or chemical synthesis, or PTHrP derived from culture supernatant of cancer cells causing hypercalcemia. For example, a peptide (PTHrP (1-34)) consisting of amino acids 1-34 of known PTHrP (Kemp, BE et al., Science (1987) 238, 1568-1570) can be used as an antigen. In this case, human PTHrP (1-34) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75.

수득한 PTHrP를 담체단백질(예를 들어, 사이로면역글로부린 (thyroimmunogloburin)에 결합시킨 후, 어쥬번트(adjuvant)를 첨가한다. 어쥬번트로서는 플로인트(Freund's)의 어쥬번트, 플로인트의 불완전 어쥬번트등을 예로 들 수 있고, 이들 중 어느 것을 혼합해도 좋다.The obtained PTHrP is bound to a carrier protein (for example, thyroimmunogloburin), and then an adjuvant is added. These can be mentioned, You may mix any of these.

(2) 면역 및 항체 생산세포의 채취(2) Collection of immune and antibody producing cells

상기와 같이 수행하여 수득한 항원을 포유동물, 예를 들어, 마우스, 렛트, 말, 원숭이, 토끼, 염소, 양 등의 포유동물에 투여한다. 면역은 공지된 방법이라면, 어떠한 방법도 이용할 수 있으나, 주로 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 등에 의해 수행한다. 또한, 면역의 간격은 특히 한정되지 않지만, 몇일에서 몇주간의 간격으로, 바람직하게는 4 내지 21일간의 간격으로 면역한다.The antigen obtained by performing as described above is administered to a mammal, for example, a mammal such as a mouse, a rat, a horse, a monkey, a rabbit, a goat, a sheep and the like. Immunization can be any method as long as it is a known method, but is mainly performed by intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, or the like. In addition, the interval of immunity is not particularly limited, but is immunized at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 4 to 21 days.

최종 면역일에서 2 내지 3일 후에 항체 생산 세포를 채집한다. 항체 생산 세포로서는 췌장세포, 임파절 세포, 말초혈 세포를 예로 들수 있으나, 일반적으로 췌장세포가 이용된다. 항원의 면역량은 1회에 마우스 1마리 당, 100㎍가 이용된다.Antibody producing cells are collected 2-3 days after the last immunization day. Examples of the antibody producing cells include pancreatic cells, lymph node cells, and peripheral blood cells. Pancreatic cells are generally used. The antigen-immunized dose is 100 µg per mouse at one time.

(3) 항원의 역가측정(3) determination of titer of antigen

면역시킨 동물의 면역반응 정도를 확인하고, 또한, 세포융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선택하기 위하여, 면역시킨 동물의 혈중 항 원 역가, 또는 항체 생산 세포의 배양 상등액 속의 항원 역가를 측정한다.In order to confirm the degree of immune response of the immunized animal and to select the desired hybridoma from the cells after the cell fusion treatment, the antigen titer in the blood supernatant of the immunized animal or the culture supernatant of the antibody-producing cell was determined. Measure

항체 검출의 방법으로서는, 공지된 기술, 예를 들어, 효소면역측정법(EIA; Enzyme Immuno Assay), 동위원소면역측정법(RIA; Radio Immuno Assay), 효소연결 면역 솔벤트 측정법(ELISA; Enzyme-Linked Immuno Sorvent Assay)등을 이용할 수 있다.As the method of antibody detection, well-known techniques, for example, enzyme immunoassay (EIA; Enzyme Immuno Assay), isotope immunoassay (RIA; Radio Immuno Assay), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA; Enzyme-Linked Immuno Sorvent) Assay) can be used.

(4) 세포융합(4) cell fusion

항체 생산 세포와 융합시킨 마엘로마(골수종) 세포로서, 마우스, 렛트, 인간 등 여러가지 동물에서 유래하고, 당업자가 일반적으로 입수 가능한 주화세포를 사용한다. 사용하는 세포주로서는, 약제 저항성을 가지고, 미융합 상태에서는 선택 배지(예를 들어, HAT배지)에서 생존할 수 없고, 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 가지는 것이 이용된다. 일반적으로, 8-아자구아닌(azaguanine) 내성주가 이용되고, 이 세포주는 하이포잔틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine)-포스포릴트랜스퍼라제(phosphoryltransferase)가 결손되어서, 하이포잔틴ㆍ아미노프테린(aminopt-As Maeloma (myeloma) cells fused with antibody-producing cells, chemotactic cells derived from various animals such as mice, rats, and humans and generally available to those skilled in the art are used. As the cell line to be used, those which have drug resistance, and which have a property of not being able to survive in a selective medium (for example, HAT medium) in an unfused state and only surviving in a fused state are used. Generally, 8-azaguanine resistant strain is used, and this cell line is deficient in hypoxanthine-guanine-phosphoryltransferase, resulting in hypoxanthine aminopterin.

erin)ㆍ티미딘(thymidine)(HAT) 배지에서 생육할 수 없는 것이다.It cannot grow on erin) thymidine (HAT) medium.

마엘로마 세포는 이미 공지된 여러가지 세포주, 예를 들어, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979)123:1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81:1-7), NS-1(Kohler, D. H. et al., Cell(1976) 8:405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276:269-270), F0(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980)148:313-323), R120(Galfre, G. et al., Nature(1979)277:131-133) 등이 적절히 사용된다.Maeloma cells are already known in various cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, DH et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), F0 (de St. Groth, SF et al., J. Immunol. Methods (1980) 148: 313-323), R120 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133), etc. Used.

항체생산세포는 췌장세포, 임파절 세포 등에서 수득된다. 즉, 전기 각종 동물로부터 췌장, 임파절 등을 적출 또는 채취하여, 이들 조직을 파쇄한다. 수득한 피쇄물을 PBS, DMEM, RPMI1640 등의 배지 또는 완충액에 현탁하고, 스텐레스 메쉬 등으로 여과한 후, 원심분리를 수행함으로써 목적으로 하는 항체생산세포를 조제한다.Antibody producing cells are obtained from pancreatic cells, lymph node cells and the like. In other words, pancreas, lymph nodes, and the like are extracted or collected from various kinds of animals, and these tissues are crushed. The obtained lysate is suspended in a medium or buffer solution such as PBS, DMEM, RPMI1640, filtered through a stainless mesh, or the like, followed by centrifugation to prepare desired antibody-producing cells.

다음으로, 상기 마엘로마 세포와 항체생산세포를 세포융합시킨다.Next, the maeloma cells and the antibody producing cells are cell fused.

세포융합은 MEM, DMEM, RPME-1640 배지 등의 동물세포 배양용 배지속에 마엘로마 세포와 항체생산세포를 혼합비 1:1 내지 1:10으로 융합촉진제의 존재하에서, 30 내지 37℃로 1 내지 15분간 접촉시킴으로써 수행한다. 세포융합을 촉진시키기 위해서는 평균 분자량 1,000 내지 6,000의 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜 또는 센다이바이러스(Sendai virus)등의 융합촉진제나 융합 바이러스를 사용할 수 있다. 또한, 전기자극(예를 들어, 일렉트로포레이션(electroporation))을 이용한 시판되는 세포융합 장치를 이용하여 항체 생산세포와 마엘로마세포를 융합시킬 수 있다.Cell fusion is 1 to 15 at 30 to 37 ° C. in the presence of a fusion promoter in a mixing ratio of 1: 1 to 1:10 of maeloma cells and antibody producing cells in animal cell culture media such as MEM, DMEM, RPME-1640 medium. It is carried out by contact for a minute. In order to promote cell fusion, a fusion accelerator or a fusion virus such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or Sendai virus having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 may be used. In addition, a commercially available cell fusion device using electric stimulation (for example, electroporation) can be used to fuse the antibody-producing cells and the maeloma cells.

(5) 하이브리도마의 선택 및 클로닝(5) Selection and cloning of hybridomas

세포융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선택한다. 그 방법으로, 선택배지에 있어서 세포의 선택적 이식을 이용하는 방법을 예로 들 수 있다. The target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. As the method, a method using selective transplantation of cells in selective medium is exemplified.

즉, 세포 현탁액을 적절한 배지에 희석한 후, 마이크로타이터플레이트 (microtiter plate) 위에 분배하고, 각 웰(well)에 선택배지(HAT 배지 등)을 가한 후, 적당히 선택배지를 교환하여 배양을 수행하면, 생육되어 가는 세포를 하이브리도마로서 수득할 수 있다.That is, after diluting the cell suspension in a suitable medium, it is dispensed on a microtiter plate, and added a selective medium (HAT medium, etc.) to each well, and then cultured by appropriately changing the selection medium. Then, the growing cells can be obtained as hybridomas.

하이브리도마의 선별(screening)은 한계희석법, 형광여기 세포분리(cell sorter)법 등에 의해 수행하고, 최종적으로 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 취득한다.Screening of hybridomas is performed by limiting dilution, fluorescence excitation cell sorter, or the like, and finally monoclonal antibody-producing hybridomas are obtained.

(6) 단일클론 항체의 채취(6) Collection of Monoclonal Antibodies

취득한 하이브리도마로부터 단일클론 항체를 채취하는 방법으로서는, 통상의 세포배지법이나 탈수형성법 등을 예로 들 수 있다.As a method of collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma, the usual cell medium method, dehydration formation method, etc. are mentioned.

세포배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 내지 20 % 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지, 또는 무혈청 배지 등의 동물세포 배양배지 중에서 통상의 배양조건(예를 들어, 37℃, 5% CO₂농도)로 2 내지 14일간 배양하고, 그 배양 상등액으로부터 항체를 취득한다.In the cell culture method, hybridomas are cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10-20% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium (for example, 37 ° C, 5%). CO ₂ concentration) for 2 to 14 days, the antibody is obtained from the culture supernatant.

탈수형성법에 있어서는, 마엘로마 세포 유래의 포유동물과 동종의 동물 복강내에 하이브리도마를 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 1내지 4 주 후에 복수 또는 혈청을 채취한다.In the dehydration method, hybridomas are administered intraperitoneally to animals of the same kind as mammals derived from Maeloma cells, and hybridomas are grown in large quantities. Then, one or four weeks later, ascites or serum are collected.

상기 항체의 채취방법에 있어서, 항체의 정제가 필요하게 되는 경우는 유안염석법, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써 정제한다.In the method for collecting the antibody, when purification of the antibody is required, a well-known method such as the hydrochloride salt method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. is appropriately selected or a combination thereof is purified. .

2. 키메라 항체의 구축2. Construction of Chimeric Antibodies

(1) 인간 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA의 클로닝(1) Cloning of DNA containing base sequence encoding V region of mouse monoclonal antibody against human PTHrP

(i) mRNA의 조제(i) Preparation of mRNA

인간 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA의 클로닝을 수행하기 위하여, 회수된 하이브리도마로부터 공지된 방법, 예를 들어, 구아니딘(guanidine) 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979), 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P et al., Analytical Biochemisty(1987), 162, 156-159) 등에 의해 전세포 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 사 제품)에 첨가된 Oligo(dT)-셀룰로-스핀칼럼 등에 의해 mRNA를 조제한다. 또한, Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia 사 제품)을 이용함으로써, 전 mRNA의 추출조작을 거치지 않고, mRNA의 조제를 수행할 수 있다.In order to perform cloning of DNA comprising a nucleotide sequence encoding the V region of a mouse monoclonal antibody against human PTHrP, a method known from recovered hybridomas, for example, guanidine ultracentrifugal method (Chirgwin, Whole cell RNA was prepared by JM et al., Biochemistry (1979), 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P et al., Analytical Biochemisty (1987), 162, 156-159), and mRNA Purification. MRNA is prepared by Oligo (dT) -cellulose-spin column or the like added to Kit (manufactured by Pharmacia). In addition, by using the Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), it is possible to perform mRNA preparation without undergoing the extraction operation of all mRNAs.

(ii)cDNA의 조제 및 증폭(ii) Preparation and Amplification of cDNA

상기(i)에서 수득한 mRNA로부터, 역전사 효소를 이용하여, L쇄 및 H쇄의 V영역에 있어서 cDNA를 각각 합성한다. cDNA의 합성은 oligo-dT 프라이머 또는 L쇄C영역 혹은 H쇄C영역에 결합할 수 있는 적당한 프라이머(예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 MHC2 프라이머)를 이용할 수 있다.From the mRNA obtained in (i), cDNA is synthesized in the V region of the L chain and the H chain, respectively, using reverse transcriptase. Synthesis of cDNA may use an oligo-dT primer or a suitable primer capable of binding to L chain C region or H chain C region (eg, MHC2 primer having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1).

cDNA 합성 반응은 전기 mRNA와 프라이머를 혼합하여, 역전사 효소의 존재하에서 예를 들어, 52℃로 30분간 반응을 수행한다.The cDNA synthesis reaction is performed by mixing the electric mRNA and the primer, and performing the reaction for 30 minutes at, for example, 52 ° C in the presence of reverse transcriptase.

cDNA의 증폭은 L쇄 및 H쇄와 함께 5'-Ampli FINDER RACE Kit(CLONTECH, 미국)를 이용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1998, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 근거하는 PCR(중합효소 연쇄반응)으로 수행할 수 있다. 즉, 상기에서 합성한 cDNA의 5' 말단에 Ampli FINDER Anchor(서열번호 42)를 연결하고, L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA(이하, L쇄V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA를 「L쇄V영역의 DNA」또는 「L쇄V영역을 코딩하는 DNA」로 약기하기도 한다(H쇄 V영역, C영역등에 대해서도 동일)에 대해서 PCR을 수행한다.Amplification of cDNA was performed with the 5'-Ampli FINDER RACE Kit (CLONTECH, USA) with L and H chains (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998). PCR (polymerase chain reaction) based on -9002, 1998, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). That is, an Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) is connected to the 5 'end of the cDNA synthesized above, and a DNA containing a nucleotide sequence encoding an L chain V region and an H chain V region (hereinafter, referred to as L chain V region). DNA containing the base sequence to be encoded may be abbreviated as "DNA of L chain V region" or "DNA encoding L chain V region" (same for H chain V region, C region, etc.). .

L쇄V영역의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서는, 예를 들어, Anchor프라이머(서열번호2)및 마우스항체의 L쇄 λ쇄 정상영역(C λ영역)의 보존서열로부터 설계한(예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가지는 MLC 프라이머)를 이용할 수 있다. 또한, H쇄V영역의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머로서는, 예를 들어, Anchor 프라이머(서열번호2)및 MHC-G1프라이머(서열번호3)(S. T. Jones et al., technology, 9, 88, 1991) 을 이용할 수 있다.As a primer for amplifying the DNA of the L chain V region, for example, it is designed from the conserved sequences of the Anchor primer (SEQ ID NO: 2) and the L chain lambda chain normal region (C lambda region) of the mouse antibody (e.g., MLC primer having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4) can be used. As primers for amplifying the DNA of the H chain V region, for example, Anchor primer (SEQ ID NO: 2) and MHC-G1 primer (SEQ ID NO: 3) (ST Jones et al., Technology, 9, 88, 1991) ) Can be used.

(iii) DNA의 정제 및 염기서열의 결정(iii) Purification of DNA and Determination of Sequence

PCR 산물에 대하여, 공지된 기술에 의하여 아가로오스젤(agarose gel) 전기영동을 수행하여, 목적으로 하는 DNA 절편을 잘라낸 후, DNA의 회수 및 정제를 수행하여, 벡터 DNA에 연결한다.The PCR product is subjected to agarose gel electrophoresis by a known technique to cut out the DNA fragment of interest, and then to recover and purify the DNA, thereby connecting to the vector DNA.

DNA의 정제는 시판되는 키트(예를 들어, GENEGLEAN II; BI0101)를 이용하여 수행한다. DNA 절편을 클로닝하기 위한 벡터 DNA에는 공지된 것(예를 들어, pUC19, Bluescript 등)을 이용할 수 있다.Purification of DNA is performed using commercially available kits (eg, GENEGLEAN II; BI0101). As vector DNA for cloning a DNA fragment, a known one (for example, pUC19, Bluescript, etc.) can be used.

전기 DNA와 상기 벡터 DNA를 공지된 라이게이션 키트를 이용하여 연결시키고, 재조합 백터를 수득한 후, 수득한 재조합 벡터를 대장균 JM109 등에 도입한 후, 엠피실린 내성 콜로니를 선별하고, 공지된 방법에 근거하여 벡터 DNA을 수득한다(J. Sambrook, et al., "Molecula Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 목적으로 하는 DNA의 염기서열은 상기 벡터 DNA를 제한효소로 절단한 다음, 공지된 방법(예를 들어, 다이데옥시(dideoxy)법)에 의해 결정한다(J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 본 발명에서는 자동 염기서열 결정장치(DNA Sequencer 373A; ABI 사)를 이용하였다.The electrical DNA and the vector DNA are linked using a known ligation kit, a recombinant vector is obtained, the obtained recombinant vector is introduced into E. coli JM109, and then, empicillin resistant colonies are selected and based on a known method. To obtain vector DNA (J. Sambrook, et al., "Molecula Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). The base sequence of the target DNA is determined by cleaving the vector DNA with a restriction enzyme, and then by a known method (eg, the dideoxy method) (J. Sambrook, et al., “Molecular Cloning ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). In the present invention, an automatic sequencer (DNA Sequencer 373A; ABI) was used.

(iv) 상보성 결정 영역(iv) complementarity determining regions

H쇄V영역 및 L쇄V영역은 모두 항원결합부위를 형성하고, 그 전반적인 구조는 서로 유사성을 가지고 있다. 즉, 각각 4가지의 프레임워크(frame work)영역(FR)부분이 3가지의 초가변영역, 즉, 상보성결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. FR의 아미노산 서열은 비교적 잘 보존되어 있으나, 한편, CDR영역의 아미노산 서열의 변이성은 극히 높다(Kabat, E. A. et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 US Dept. Health and Human Services, 1983).Both the H chain V region and the L chain V region form an antigen binding site, and the overall structure has similarities with each other. That is, four framework work areas FR are connected by three hypervariable areas, that is, complementarity determining areas CDR. The amino acid sequence of the FR is relatively well preserved, while the variability of the amino acid sequence of the CDR region is extremely high (Kabat, E. A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983).

전기 4개의 FR의 많은 부분은 β-시트 구조를 가지고, 그 결과 3개의 CDR은 루프를 형성한다. CDR은 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 것도 있다. 따라서, 3개의 CDR은 FR에 의해 상호적으로 입체적으로 가장 가까운 위치로 유지되고, FR은 반대를 이루는 영역의 3개의 CDR과 함께 항원결합부위를 형성한다.Many of the former four FRs have a β-sheet structure, with the result that the three CDRs form a loop. CDRs may in some cases form part of the β-sheet structure. Thus, the three CDRs are held in close proximity to each other stereoscopically by the FR, and the FR forms an antigen binding site with the three CDRs of the opposite region.

이와 같은 사실에 근거하여, 인간PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 가변영역의 아미노산 서열을 Kabat팀에 의해 작성된 항체의 아미노산 서열의 데이타베이스(「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 US Dept. Health and Human Services, 1983)에 적용시켜, 상동성을 조사함으로써 CDR영역을 발견할 수 있다.Based on this fact, the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP was prepared by the Kabat team (see "Sequence of Proteins of Immunological Interest" US Dept. Health and Human Services). , 1983), and CDR regions can be found by examining homology.

(2) 키메라 항체 발견벡터의 작제(2) Construction of chimeric antibody discovery vector

마우스 단일클론 항체의 마우스 L쇄(이하, 항체의 L쇄 또는 H쇄를 표시하는 경우는 마우스에 대해서는「마우스 L쇄」, 인간 항체의 H쇄에 대해서는 「인간 H쇄」와 같이 약기하기도 한다) 및 H쇄V영역을 코딩하는 DNA 절편이 클로닝되면, 이들 마우스 V쇄 영역을 코딩하는 DNA와 연결하여 발현시킴으로써 키메라 항인간PTHrP항 체가 수득된다.Mouse L chain of the mouse monoclonal antibody (hereinafter, when the L chain or the H chain of the antibody is displayed, the abbreviation may be abbreviated as "mouse L chain" for the mouse and "human H chain" for the H chain of the human antibody). And when the DNA fragment encoding the H chain V region is cloned, the chimeric anti-human PTHrP antibody is obtained by linking and expressing the DNA encoding the mouse V chain region.

키메라 항체를 제작하기 위한 기본적인 방법은 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V영역 서열을 포유류 세포의 발현벡터 중에서 이미 존재하는 인간항체 C영역을 코딩하는 서열에 연결하는 것을 포함하게 된다. 또는, 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 V영역의 서열을 인간 항체 C영역을 코딩하는 서열에 연결한 후, 포유류 세포 발현벡터에 연결하는 것을 포함하게 된다.The basic method for preparing chimeric antibodies involves linking the mouse leader sequence and the V region sequences present in the cloned cDNA to sequences encoding human antibody C regions already present in the expression vector of the mammalian cell. Alternatively, the method may include connecting the mouse leader sequence and the V region sequence present in the cloned cDNA to a sequence encoding the human antibody C region, followed by linkage to a mammalian cell expression vector.

인간 항체 C영역을 포함하는 폴리펩티드는 임의의 인간항체의 H쇄C영역 및 인간 항체의 L쇄C영역인 것을 이용할 수 있고, 예를 들어, 인간H쇄인 것에 대해서는 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4, 및 L쇄인 것에 대해서는 Cγ또는 Cκ를 각각 들 수 있다.Polypeptides comprising a human antibody C region can be used as the H chain C region of any human antibody and the L chain C region of a human antibody. For example, for a human H chain, Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4, and Examples of the L chain include Cγ and Cκ, respectively.

키메라 항체의 제조를 위하여는 우선, 2종류의 발현벡터, 즉 인핸서(enhancer)/프로모터(promoter)계와 같은 발현억제영역에 마우스 L쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 인간 H쇄C영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터, 및 인핸서/프로모터계와 같은 발현억제영역에 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 인간 H쇄C영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터를 작제한 다음, 이들 발현벡터에 의해 포유류 세포와 같은 숙주 세포를 동시에 형질전환하고, 형질전환된 세포를 시험관 내(in vitro)또는 생체 내(in vivo) 조건에서 배양하여 키메라 항체를 제조한다(예를 들어, WO91/16928 참조).For the preparation of chimeric antibodies, first, DNAs encoding human L chain V regions and human H chain C regions are expressed in two expression vectors, namely, an expression suppression region such as an enhancer / promoter system. Expression vectors comprising DNAs and expression vectors comprising DNAs encoding mouse H chain V regions and DNAs encoding human H chain C regions are constructed in expression suppression regions such as enhancer / promoter systems. Host cells, such as mammalian cells, are simultaneously transformed and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo conditions to prepare chimeric antibodies (see, eg, WO91 / 16928). ).

또는, 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스 리더 서열 및 마우스 L쇄V영역을 코딩하는 DNA, 인간 L쇄V영역을 코딩하는 DNA와 마우스 리더 서열 및 마우스 H쇄V영 역을 코딩하는 DNA 및 인간 H쇄 C영역을 코딩하는 DNA를 단일의 발현벡터(예를 들어, WO94/11523 참조)에 클로닝하고, 그 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킨 다음, 이 형질전환된 숙주를 시험관 내 또는 생체 내 조건에서 배양하여 목적으로 하는 키메라항체를 생산시켰다.Alternatively, the DNA encoding the mouse leader sequence and the mouse L chain V region, the DNA encoding the human L chain V region and the DNA encoding the mouse leader sequence and the mouse H chain V region and the human H chain present in the cloned cDNA. The DNA encoding the C region is cloned into a single expression vector (see, for example, WO94 / 11523), and the host cell is transformed with the vector, and the transformed host is then subjected to in vitro or in vivo conditions. The target chimeric antibody was produced by culturing at.

(i) 키메라 항체 H쇄의 구축(i) Construction of chimeric antibody H chain

키메라 항체의 H쇄 발현벡터는 마우스의 H쇄V영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 cDNA(이하, 「H쇄V영역의 cDNA」라고도 칭한다)를 인간 항체의 H쇄C영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 게놈 DNA(이하, 「H쇄C영역의 게놈 DNA」라고도 칭한다)를 포함하는 적당한 발현벡터에 클로닝함으로써 수득 할 수 있다. H쇄C영역으로서는 예를 들어, Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4 영역을 들 수 있다.The H-chain expression vector of the chimeric antibody refers to a cDNA (hereinafter also referred to as "c-DNA of the H-chain V region") containing a nucleotide sequence encoding the H-chain V region of a mouse. It can be obtained by cloning into a suitable expression vector containing genomic DNA containing hereinafter (hereinafter also referred to as "genomic DNA of H chain C region"). Examples of the H chain C region include a Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 region.

(i-a) H쇄C영역을 코딩하는 게놈 DNA를 포함하는 키메라 H쇄 발현벡터의 구축(i-a) Construction of chimeric H chain expression vector comprising genomic DNA encoding H chain C region

H쇄C영역을 코딩하는 게놈DNA를 가지는 발현벡터로서는 Cγ1영역을 코딩하는 것에 대해서는 예를 들어, HEF-PMh-gγ1(WO92/19759 참조) 또는 DHFR-△E-RVh-PM1-f(WO92/19759 참조)를 들 수 있다.As an expression vector having genomic DNA encoding the H chain C region, for example, HEF-PMh-gγ1 (see WO92 / 19759) or DHFR-ΔE-RVh-PM1-f (WO92 / 19759).

여기에서, 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 이들 발현벡터에 삽입함에 있어서, PCR법에 의해 그 cDNA에 적당한 염기서열을 도입할 수 있다. 예를 들어, 그 cDNA의 5'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록, 그리고 전사효율을 좋 게 하기 위한 그 cDNA의 개시코돈(codon) 전 부분에 코작(Kozak) 콘센서스 서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머, 및 그 cDNA의 3'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록, 그리고 게놈 DNA의 일차 전사산물이 바르게 스플라이스(splice)되어 mRNA가 되기 위한 스플라이스 도너(splice donor)부위를 가지도록 설계한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것으로, 이들 적당한 염기서열을 발현벡터에 도임할 수 있다.Here, in inserting the cDNA encoding the mouse H chain V region into these expression vectors, an appropriate base sequence can be introduced into the cDNA by PCR. For example, it has a Kozak consensus sequence at the 5'-terminus of the cDNA so as to have an appropriate restriction enzyme recognition sequence and the entire codon of the start codon of the cDNA to improve transcriptional efficiency. A splice donor designed to have a PCR primer designed to designate an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 3'-terminus of the cDNA, and the primary transcript of the genomic DNA to be spliced into mRNA. By performing PCR using a PCR primer designed to have a site, these appropriate nucleotide sequences can be directed to an expression vector.

상기 방법으로 구축한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 적당한 제한효소로 처리한 후, 상기 발현벡터에 삽입하여, H쇄C영역(Cγ1영역)을 코딩하는 게놈DNA를 포함하는 키메라 H쇄 발현벡터를 구축한다.The chimeric H chain expression including genomic DNA encoding the H chain C region (Cγ1 region) is inserted into the expression vector after treatment of the cDNA encoding the mouse H chain V region constructed by the above method with an appropriate restriction enzyme. Construct a vector.

(i-b) H쇄를 코딩하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 포함하는 키메라 H쇄 발현 백터의 구축(i-b) Construction of a chimeric H chain expression vector comprising a cDNA comprising a nucleotide sequence encoding the H chain

H쇄C영역(예를 들어, Cγ1영역)을 코딩하는 cDNA를 가지는 발현벡터는 이하의 방법으로 구축할 수 있다. 즉, 인간형화된 PM1항체의 H쇄V영역 및 인간항체 H쇄C영역Cγ1의 게놈 DNA(N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982)을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터-DHFR-△E-RVh-PM1-f(WO92/19759 참조)와 인간형화 된 PM1항체 L쇄V영역의 게놈 DNA 및 인간 L쇄κ쇄C쇄 영역의 게놈 DNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터-RV1-PM1a(WO92/19759 참조)를 도입한 CHO 세포로부터 mRNA를 조제하고, RT-PCR법에 의해, 인간형화된 PM1항체 H쇄V영역 코딩하는 cDNA 및 인간항체 H쇄 C영역(Cγ1)을 코딩하는 cDNA를 클로닝하고, 그 cDNA를 적당한 제한효소 처리를 수행한 동물세포 발현용 벡터에 연결함으로써, 목적으로 하는 발현벡터가 구축된다.An expression vector having a cDNA encoding an H chain C region (for example, a Cγ1 region) can be constructed by the following method. That is, an expression vector comprising genomic DNA (H. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982) of H chain V region and human antibody H chain C region Cγ1 of humanized PM1 antibody. Expression vector comprising genomic DNA of humanized PM1 antibody L chain V region and DNA encoding human L chain κ chain C chain region with DHFR-ΔE-RVh-PM1-f (see WO92 / 19759) MRNA was prepared from CHO cells into which -RV1-PM1a (see WO92 / 19759) was introduced and the humanized PM1 antibody H chain V region coding by RT-PCR method and human antibody H chain C region (Cγ1) By cloning the cDNA encoding the CDNA and linking the cDNA to the animal cell expression vector subjected to the appropriate restriction enzyme treatment, the desired expression vector is constructed.

여기에서, 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 인간항체 H쇄C영역Cλ1을 코딩하는 cDNA와 직접 연결함에 있어서, H쇄V영역을 코딩하는 cDNA을 포함하는 절편에 PCR법에 의해 적당한 염기서열을 도입할 수 있다. 예를 들어, 그 cDNA의 5'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록, 그리고 전사 효율을 좋게 하기 위해 그 cDNA의 개시 코돈 직전에 코작 콘센서스(consensus)서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머, 및 그 cDNA의 3'-말단에 H쇄C영역Cγ1의 DNA와 직접 결합하기 위한 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것으로, 이들 적당한 염기서열을 그 cDNA에 도입한다.Here, in directly linking the cDNA encoding the mouse H chain V region with the cDNA encoding the human antibody H chain C region Cλ1, a fragment containing the cDNA encoding the H chain V region is appropriately sequenced by PCR. Can be introduced. For example, a PCR primer designed to have an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5'-terminus of the cDNA, and to have a Kozak consensus sequence immediately before the initiation codon of the cDNA to improve transcriptional efficiency. And PCR using a PCR primer designed to have a recognition sequence of a suitable restriction enzyme for directly binding to the DNA of the H-chain C region Cγ1 at the 3'-terminus of the cDNA. Introduced in cDNA.

상기 방법으로 구축한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 적당한 제한효소로 처리한 후, 상기 H쇄C영역Cγ1을 코딩하는 cDNA와 연결하여 pCOS1 또는 pCHO1과 같이 발현벡터에 삽입함으로써, 키메라H쇄를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다.The cDNA encoding the mouse H-chain V region constructed by the above method was treated with a suitable restriction enzyme, and then linked to the c-DNA encoding the H-chain C region Cγ1 and inserted into an expression vector such as pCOS1 or pCHO1. Expression vectors comprising cDNA encoding the can be constructed.

(ii) 키메라 항체 L쇄의 구축(ii) Construction of chimeric antibody L chain

키메라 항체의 L쇄 발현벡터는 마우스 L쇄V영역을 코딩하는 cDNA와 인간 항체의 L쇄C영역을 코딩하는 게놈DNA 또는 cDNA를 연결하고, 적당한 발현벡터에 도입함으로써 수득할 수 있다. L쇄C영역으로서는 예를 들어, κ쇄 또는 λ쇄를 들 수 있다.The L chain expression vector of the chimeric antibody can be obtained by linking the cDNA encoding the mouse L chain V region with the genomic DNA or cDNA encoding the L chain C region of the human antibody, and introducing into an appropriate expression vector. Examples of the L chain C region include a κ chain or a λ chain.

(ii-a) 키메라 L쇄λ쇄를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터의 구축(ii-a) Construction of expression vector comprising cDNA encoding chimeric L chain lambda chain

마우스 L쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 구축함에 있어서, PCR법에 의해 적당한 염기서열을 그 발현벡터에 도입할 수 있다. 예를 들어, 그 cDNA의 5'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록, 그리고 전사 효율을 좋게 하기 위한 코작 콘센서스 서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머, 및 3'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것으로, 이들 적당한 염기서열을 그 cDNA에 도입한다.In constructing an expression vector containing a cDNA encoding a mouse L-chain V region, an appropriate base sequence can be introduced into the expression vector by PCR. For example, PCR primers designed to have a recognition sequence of a suitable restriction enzyme at the 5'-end of the cDNA, and a Kozak consensus sequence for improving transcriptional efficiency, and a restriction enzyme suitable at the 3'-end. PCR is carried out using a PCR primer designed to have a recognition sequence of to introduce these appropriate base sequences into the cDNA.

인간 L쇄 λ쇄C영역을 코딩하는 cDNA는 전체 염기서열을 DNA 합성기로 합성하거나, PCR법에 의해 구축할 수 있다. 인간 L쇄 λ쇄C영역은 이소타입(isotype)의 차이에 의해 적어도 4종류가 존재함이 알려져 있고, 어느 이소타입도 발현벡터의 구축에 이용할 수 있다. 예를 들어, 클로닝된 마우스 단일클론 항체 L쇄λ쇄C영역의 상동성의 검색으로부터, 인간 L쇄λ쇄C영역 절편의 이소타입으로서 Mcg⁺ Ke⁺ Oz^- (accession No. X57819)(P. Dariavach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)의 것을 선택하여 발현벡터의 구축에 이용할 수 있다. 공지된 인간 L쇄λ쇄C영역, 예를 들어, Mcg⁺ Ke⁺ Oz^- 의 cDNA를 구축하기 위하여, 예를 들어, 전체영역을 나누어 합성할 수 있도록 서열번호 11 내지 14에 나타난 4개의 하기 프라이머를 합성한다. 프라이머-MBC1HGP4(서열번호11) 및 MBC1HGP3(서열번호13)은 센스DNA 서열을 가지고, MBC1HGP2(서열번호12)및 MBC1HGP4(서열번호14)는 안티센스DNA 서열을 가지고, 각각의 프라이머의 양단에 20에서 23bp의 상보적 서열을 가지도록 설계한다. The cDNA encoding the human L chain λ chain C region can be synthesized by a DNA synthesizer, or by PCR. It is known that at least four kinds of human L chain λ chain C regions exist due to differences in isotypes, and any isotype can be used for constructing an expression vector. For example, from a search homology of the cloned mouse monoclonal antibody L chain λ chain C region, as the isotype of a human L chain λ chain C region fragment ^{^{^{Mcg + Ke + Oz -. (}}} Accession No. X57819) (P Dariavach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987), can be used to construct expression vectors. In order to construct a cDNA of a known human L chain λ chain C region, for example, Mcg ⁺ Ke ⁺ Oz ⁻ , for example, the following four primers shown in SEQ ID NOs. Synthesize. Primers-MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 11) and MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 13) have sense DNA sequences, MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 12) and MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 14) have antisense DNA sequences, and at 20 across each primer It is designed to have a complementary sequence of 23 bp.

MBC1HGPS(서열번호15) 및 MBC1HGPR(서열번호16)은 외부 프라이머라고 칭하는데, MBC1HGP1 및 MBC1HGP4와 각각 상동한 서열을 가지고 있고, 이에 더하여 각각 적당한 제한효소의 인식 서열을 각각 포함하고 있다. PCR법을 이용하여, 4개의 프라이머를 조합하여 완전한 길이의 cDNA 합성하고, 다음으로 외부 프라이머를 가하여 cDNA의 증폭을 수행한다. PCR법에 의한 조립이라는 것은 MBC1HGP1과 MBC1HGP2, 또는 MBC1HGP3와 MBC1HGP4가 그 상보성 서열에 의해 결합되어 MBC1HGP1-MBC1HGP2 절편과 MBC1HGP3-MBC1HGP4 절편이 합성되고, 또한 각 절편의 상보적 서열에 의해 결합되어 MBC1HGP1-MBA1HGP2 절편과 MBC1HGP3-MBC1HGP4 절편이 합성되고, 또한 각 절편의 상보적 서열에 의해 결합되는 과정을 통해 완전한 길이의 인간L쇄λ쇄C영역을 코딩하는 cDNA가 합성되는 것을 가르킨다. MBC1HGPS (SEQ ID NO: 15) and MBC1HGPR (SEQ ID NO: 16) are referred to as external primers, each having a sequence homologous to MBC1HGP1 and MBC1HGP4, in addition each containing a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme. Using the PCR method, four primers are combined to synthesize full-length cDNA, and then external primers are added to amplify the cDNA. Assembly by PCR means that MBC1HGP1 and MBC1HGP2, or MBC1HGP3 and MBC1HGP4 are joined by their complementarity sequences to synthesize MBC1HGP1-MBC1HGP2 and MBC1HGP3-MBC1HGP4 fragments, and are also joined by the complementary sequence of each MBB1HGP2. The fragment and the MBC1HGP3-MBC1HGP4 fragment are synthesized, and the cDNA encoding the full-length human L-chain lambda chain C region is synthesized through the binding process by the complementary sequence of each fragment.

상기 방법으로 구축한 인간L쇄λ쇄C영역을 코딩하는 cDNA와 상기 방법으로 구축한 마우스L쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 적당한 제한효소 부위간에 연결하고, 또한 pCOS1 또는 pCHO1과 같은 발현벡터에 삽입함으로써, 키메라 항체의 L쇄λ쇄를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다.The cDNA encoding the human L chain λ chain C region constructed by the above method and the cDNA encoding the mouse L chain V region constructed by the above method are connected between appropriate restriction enzyme sites and further inserted into an expression vector such as pCOS1 or pCHO1. By doing so, an expression vector containing a cDNA encoding the L chain λ chain of the chimeric antibody can be constructed.

(ii-b) 키메라 L쇄κ쇄를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터의 구축(ii-b) Construction of an expression vector comprising a cDNA encoding chimeric L chain κ chain

마우스L쇄V영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 구축함에 있어서, PCR법에 의해, 그 cDNA의 5'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록, 그리 고 전사 효율을 좋게 하기 위한 코작 콘센서스 서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머, 및 3'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 가지도록 설계한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것으로, 이들 적당한 염기서열을 그 cDNA에 도입한다.In constructing an expression vector comprising a cDNA encoding a mouse L chain V region, PCR methods are performed to have a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at the 5'-terminus of the cDNA so as to improve transcriptional efficiency. PCR is carried out using a PCR primer designed to have a Kozak consensus sequence and a PCR primer designed to have a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at the 3'-end to introduce these appropriate base sequences into the cDNA. .

마우스L쇄V영역을 코딩하는 DNA와 연결시키기 위한 인간L쇄κ쇄C영역을 코딩하는 DNA는 예를 들어, 게놈 DNA를 포함하는 HEF-PM1k-gk(WO92/19759 참조)로부터 구축할 수 있다.The DNA encoding the human L chain κ chain C region for linking with the DNA encoding the mouse L chain V region can be constructed from, for example, HEF-PM1k-gk (see WO92 / 19759) comprising genomic DNA. .

PCR법에 의한, L쇄κ쇄C영역을 코딩하는 DNA의 5'-말단 및 3'-말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입하고, 상기 방법으로 구축한 마우스L쇄V영역을 코딩하는 DNA와 L쇄κ쇄C영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, pCOS1또는 pCHO1과 같은 발현벡터에 삽입함으로써, 키메라 항체의 L쇄κ쇄를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다.DNA encoding the mouse L chain V region constructed by the above method by introducing a recognition sequence of a suitable restriction enzyme at the 5'-end and 3'-end of the DNA encoding the L-chain κ chain C region by PCR. By connecting the DNA encoding the L chain κ chain C region and inserting it into an expression vector such as pCOS1 or pCHO1, an expression vector comprising a cDNA encoding the L chain κ chain of the chimeric antibody can be constructed.

3. 인간형화된 항체의 작제3. Construction of Humanized Antibodies

(1) 인간 항체와의 상동성 검색(1) homology with human antibodies

마우스 단일클론 항체의 CDR이 인간항체에 이식되어 있는 인간형화된 항체를 작제하기 위해서는 마우스 단일클론 항체의 FR과 인간항체의 FR과의 사이에서 높은 상동성이 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 마우스항 인간PTHrP 단일클론 항체의 H쇄및 L쇄의 V영역을 단백질 데이타베이스를 이용하여 구조가 해명되어 있는 모든 이미 알려진 항체의 V영역과 비교한다. 또한, 동시에 카밧 등에 의한 항체의 길이, 아미노산의 상동성등에 따라 분류된 인간 항체의 하위군(HSG: Human subgroup)(Kabat, E. A. et al., US Dep. Health and Human Services, US Government Pringting Offfices, 1991)과 비교를 수행한다.In order to construct a humanized antibody in which the CDRs of the mouse monoclonal antibody are transplanted into the human antibody, it is preferable that a high homology exists between the FR of the mouse monoclonal antibody and the FR of the human antibody. Thus, the V regions of the H and L chains of the mouse anti-human PTHrP monoclonal antibody are compared to the V regions of all known antibodies whose structure is elucidated using a protein database. At the same time, human subgroups (HSG) (Kabat, EA et al., US Dep. Health and Human Services, US Government Pringting Offfices) classified by Kabat et al. 1991).

인간H쇄V영역의 경우는, 카밧 등에 의한 HSG분류에 의해, HSGI 에서 III로 분류할 수 있고, 마우스항 인간PTHrP 모노클로널항체 H쇄V영역은 HSGIII의 컨센서스서열과 82.7%의 상동성(homology)을 가진다. 한편, 인간L쇄λ쇄V영역은 Kabat팀에 의한 HSG 분류에 의해, HSGI에서 VI로 분류할 수 있고, 마우스항 인간PTHrP 단일클론 항체 L쇄λ쇄V영역은 어느 하위군에 속하는 인간L쇄λ쇄V영역의 컨센서스서열과 높은 상동성을 나타내지 않는다.In the case of human H chain V region, it can be classified into HSGI III by HSG classification by Kabat et al., And mouse H human PTHrP monoclonal antibody H chain V region is 82.7% homologous to the consensus sequence of HSGIII. homology). On the other hand, human L chain λ chain V region can be classified into HSGI and VI by HSG classification by Kabat team, and the mouse anti human PTHrP monoclonal antibody L chain λ chain V region belongs to a human L chain. It does not show high homology with the consensus sequence of the λ chain V region.

따라서, 마우스항인간PTHrP 단일클론 항체를 인간형화하는 때에는 인간 H쇄V영역으로서 HSGIII에 속하고, 가장 상동성이 높은 인간 H쇄V영역, 또는 카노니칼 구조(canonical structure)(Chothis C, et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987)의 일치하는 FR의 구조를 가지는 인간H쇄V영역을 인간형화 된 항체의 구축에 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 인간 L쇄λ쇄V영역의 하위군에는 상동성이 높은 콘센서스 서열이 없기 때문에, 단백질 데이타베이스에 등록되어 있는 가장 높은 상동성을 가지는 인간항체L쇄λ쇄V영역을 인간형화된 항체의 구축에 사용하는 것이 바람직하다.Therefore, when humanizing the mouse anti-human PTHrP monoclonal antibody, it belongs to HSGIII as the human H chain V region, and has the highest homology with the human H chain V region or the canonical structure (Chothis C, et. al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987), preferably use the human H chain V region having a conforming FR structure for the construction of humanized antibodies. Furthermore, since there is no consensus sequence with high homology in the subgroup of the human L chain lambda chain V region, the humanized antibody of human antibody L chain lambda chain V region having the highest homology registered in the protein database. It is preferable to use in the construction of.

(2) 인간형화된 항체 V영역을 코딩하는 DNA의 설계(2) Design of DNA encoding humanized antibody V region

인간형화된 V영역을 코딩하는 DNA을 설계함에 있어서, 제 1단계는 설계의 기 초가 되는 인간항체 V영역을 선택하는 것이다.In designing the DNA encoding the humanized V region, the first step is to select the human antibody V region that is the basis of the design.

본 발명에 있어서, 마우스항체 V영역의 FR과 80%이상 상동성을 가지는 인간항체V영역의 FR을 인간형화된 항체에 이용할 수 있다. 여기에서, H쇄V영역의 FR로서는 하위군III에 속하는 것으로, 예를 들어, S31679(NBRF-PDB, Cuisiner A. M. et al., Eur. J. Immunol. 23, 110-118, 1993)유래의 FR을 실질적으로 동일한 FR의 절편으로서 이용할 수 있다. 또한, L쇄V영역의 FR로서는 예를 들어, 인간항체 HSU03868(GENE-BANK, Deftos M et al., Scand. J. Immunol. 39, 95-103, 1994)유래의 FR1 및 FR3와, 인간항체 S25755(NBRF-PDB)유래의 FR4를 실질적으로 동일한 FR의 절편으로서 이용할 수 있다. In the present invention, FR of the human antibody V region having at least 80% homology with FR of the mouse antibody V region can be used for the humanized antibody. Here, FR of the H-chain V region belongs to subgroup III, for example, FR derived from S31679 (NBRF-PDB, Cuisiner AM et al., Eur. J. Immunol. 23, 110-118, 1993). Can be used as a fragment of substantially the same FR. In addition, as FR of the L-chain V region, for example, human antibodies HSU03868 (GENE-BANK, Deftos M et al., Scand. J. Immunol. 39, 95-103, 1994) derived from FR1 and FR3 and human antibodies FR4 derived from S25755 (NBRF-PDB) can be used as a fragment of substantially the same FR.

또한, 인간항체 S31679는 인간 태아 간장의 cDNA 라이브러리에서 클로닝된 항체이고, 인간항체HSU03968은 신규 인간 L쇄λ쇄V영역의 유전자로서 클로닝된 항체이다.In addition, human antibody S31679 is an antibody cloned from the cDNA library of human fetal liver, and human antibody HSU03968 is an antibody cloned as a gene of a novel human L chain lambda chain V region.

(3) 인간형화된 항체 V영역을 포함하는 폴리펩티드의 작제(3) Construction of polypeptide comprising humanized antibody V region

본 발명의 인간항체는 그 항체의 C영역, 및 V영역의 프레임워크(FR)영역이 인간 유래의 것이고, V영역의 상보성결정영역(CDR)이 마우스 유래의 것이다(도1). 본 발명의 인간형화된 항체의 V영역을 포함하는 폴리펩티드는 주형이 되는 인간항체의 DNA 절편이 입수 가능하다면, PCR 법에 의한 CDR-이식(grafting)이라고 불리는 수법에 의해 작제할 수 있다. 「CDR-이식」이라는 것은 마우스 유래의 CDR을 코딩하는 DNA 절편을 작제하고, 이것을 주형으로 하는 인간 항체의 CDR과 교체하는 수법을 말한다.In the human antibody of the present invention, the C region and the V region of the antibody (FR) region are derived from human, and the complementarity determining region (CDR) of the V region is derived from mouse (Fig. 1). Polypeptides comprising the V region of the humanized antibody of the present invention can be constructed by a technique called CDR-grafting by PCR, as long as DNA fragments of the human antibody as a template are available. "CDR-transplantation" refers to a method of constructing a DNA fragment encoding a mouse-derived CDR and replacing it with a CDR of a human antibody having a template.

또한, 주형이 되는 인간항체의 DNA 절편이 입수 가능하지 않은 경우는 데이터베이스에 등록되어 있는 염기서열을 DNA 합성기로 합성하고, PCR법에 의해 인간형화된 항체V영역의 DNA를 작제할 수 있다. 또한, 아미노산 서열만 데이터베이스에 등록되어 있는 경우는 그 아미노산 서열을 기초로, 카밧 등의 보고(US Dep. Health and Human Services, US Goverment Printing Offices, 1991)하고 있는 항체의 코돈 사용 빈도에 근거하여, 전염기서열을 유추(類推)할 수 있다. 이 염기서열을 DNA 합성기로 합성하고, PCR법에 의해 인간형화된 항체V영역의 DNA를 작제하고, 이것을 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써, 목적으로 하는 폴리펩티드를 작제할 수 있다. If a DNA fragment of a human antibody as a template is not available, a nucleotide sequence registered in a database can be synthesized by a DNA synthesizer, and DNA of the humanized antibody V region can be constructed by PCR. When only the amino acid sequence is registered in the database, based on the amino acid sequence, based on the codon usage frequency of the antibody reported by Kabat et al. (US Dep. Health and Human Services, US Goverment Printing Offices, 1991), Infectious sequence can be inferred. The target polypeptide can be constructed by synthesizing the nucleotide sequence by a DNA synthesizer, constructing the DNA of the humanized antibody V region by PCR, and introducing this into an appropriate host to express it.

이하에, 주형으로 하는 인간 항체의 DNA절편이 입수 가능한 경우의 PCR법에 의한 CDR-이식의 일반적인 개요를 나타낸다.Below, the general outline of CDR-transplantation by PCR method when the DNA fragment of the human antibody used as a template is available is shown.

(i) CDR-이식(i) CDR-transplant

도2에 표시한 바와 같이, V영역을 코딩하는 DNA는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 코딩하는 DNA의 순으로 연결된다.As shown in Fig. 2, the DNA encoding the V region is linked in the order of the DNAs encoding FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.

우선, 각각의 CDR에 대응하는 마우스 유래의 DNA 절편을 합성한다. CDR1 내지 3은 먼저 클로닝한 마우스H쇄V영역 및 L쇄V영역의 염기서열을 기초로 합성된 DNA이다. 이식 프라이머B는 센스방향의 마우스 CDR1과 인간 항체의 FR2에 결합하는 서열을 가지고, 이식프라이머-E는 안티센스 방향의 CDR1과 인간항체의 FR1에 결 합하는 서열을 가지도록 합성한다(이식 프라이머C와 F, 이식프라이머D와 G에 대해서도 동일)(도2(1)). 또한, FR1의 상류영역 및 FR4의 하류영역에 결합할 수 있는 적당한 프라이머(외부 프라이머라고 한다; 도2(1)의 A 및 H)도 합성한다. 또한, 이식 프라이머의 분리, 추출은 공지된 수법에 의해 수행할 수 있다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).First, DNA fragments derived from mice corresponding to respective CDRs are synthesized. CDR1 to 3 are DNA synthesized based on the nucleotide sequences of the mouse H chain V region and L chain V region that were first cloned. Transplant primer B has a sequence that binds to mouse CDR1 in the sense direction and FR2 of the human antibody, and transplant primer-E is synthesized to have a sequence that binds CDR1 in the antisense direction to FR1 of the human antibody (transplant primers C and F The same applies to the transplant primers D and G) (Fig. 2 (1)). In addition, suitable primers (referred to as external primers; A and H in Fig. 2 (1)) which can bind to the upstream region of FR1 and the downstream region of FR4 are also synthesized. In addition, isolation and extraction of transplant primers can be performed by known techniques (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

다음으로, 이식프라이머E와 외부 프라이머A, 이식프라이머B와 F, 이식프라이머C와 G, 이식프라이머D와 외부 프라이머H를 이용하여 제 1 PCR을 수행한다. 그 결과, 각각 절편A-E, 절편 B-F, 절편 C-G 및 절편 D-H를 수득할 수 있다(도2(2)).Next, the first PCR is performed using the transplanted primer E and the outer primer A, the transplanted primers B and F, the transplanted primers C and G, the transplanted primer D and the outer primer H. As a result, segments A-E, segments B-F, segments C-G and segments D-H can be obtained, respectively (Fig. 2 (2)).

전기와 같이, 이식프라이머B의 상류와 이식프라이머E의 하류의 일부영역이 중복되도록 설계되어 있기 때문에(이식프라이머C와 F, D와 G에 대해서도 동일), 이들 절편은 적당한 온도 조건으로 반응시킴으로써, 각각의 상보적 서열에 결합하고, PCR을 수행함으로써, A에서 H까지의 길이를 가지는 DNA에 조립하는 것이 가능하다. 그리고, V영역을 코딩하는 1개의 DNA절편을 수득할 수 있다고 해도, 외부프라이머A와 H를 가하여 제 2 PCR을 수행함으로써, FR1 내지 4는 인간 유래의 것이지만, CDR 1 내지 3은 마우스 유래의 것이 된 인간항체 V영역을 코딩하는 DNA를 수득한다. 그리고, 이것을 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써, 목적으로 하는 폴리핍티드를 수득할 수 있다(도2(3)).As described above, since some regions upstream of the transplant primer B and downstream of the transplant primer E are designed to be overlapped (the same applies to the transplant primers C, F, D, and G), these fragments are reacted at a suitable temperature condition. By binding to each complementary sequence and performing PCR, it is possible to assemble into DNA having a length from A to H. Even if one DNA fragment encoding the V region can be obtained, by performing the second PCR with the addition of the external primers A and H, FR1 to 4 are derived from human, while CDRs 1 to 3 are derived from mouse. DNA encoding the human antibody V region is obtained. Then, by introducing this into a suitable host and expressing it, the target polypipide can be obtained (Fig. 2 (3)).

(ii) 인간형화된 H쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 발현벡터의 구축(ii) Construction of DNA and Expression Vectors Encoding Humanized H Chain V Regions

본 발명에서는 인간형화된 항체의 주형이 되는 인간항체의 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 천연상태에서 입수하기 때문에, 해당 DNA는 H쇄V영역을 코딩하는 DNA의 전염기서열을 DNA합성기로 합성하고, PCR법에 의해 구축할 수 있다.In the present invention, since the DNA encoding the H chain V region of the human antibody serving as the template of the humanized antibody is obtained in a natural state, the DNA synthesizes the infectious sequence of the DNA encoding the H chain V region by a DNA synthesizer. Can be constructed by the PCR method.

마우스항 인간PTHrP단일클론 항체 H쇄V영역는 인간 하위군에 속하는 S31679와 높은 상동성을 가진다. 이 인간 항체를 주형으로서 인간형화된 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 구축하기 위하여, 예를 들어, 서열번호 23 에서 26에 표시한 4개의 프라이머로 나누어 합성한다. 프라이머MBC1HGP1(서열번호23)및 MBC1HGP3(서열번호24)는 센스DNA서열을 가지고, MBC1HGP2(서열번호25) 및 MBC1HGP4(서열번호26)은 안티센스DNA서열을 가지고, 각각의 프라이머의 양단에 15에서 21bp의 상보적 서열을 가지도록 설계한다.The mouse anti human PTHrP monoclonal antibody H chain V region has high homology with S31679 belonging to the human subgroup. In order to construct DNA encoding the humanized H chain V region as a template, this human antibody is synthesized by dividing into four primers shown in SEQ ID NOs: 23 to 26, for example. Primers MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) and MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) have sense DNA sequences, MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 25) and MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) have antisense DNA sequences, 15 to 21 bp across each primer It is designed to have a complementary sequence of.

외부 프라이머MBC1HVS1(서열번호27), MBC1HVR1(서열번호28)은 MBC1HGP1, MBC1HGP4와 각각 상동한 서열을 가지고 있고, 각각 적당한 제한효소의 인식서열을 각각 포함하고 있다. PCR법을 이용하여, 4개의 프라이머를 조립시켜 완전한 길이의 cDNA 합성하고, 또한 외부 프라이머를 가하여 DNA의 증폭을 수행한다. PCR법에 의한 조립이라는 것은, MBC1HGP1과 MBC1HGP2, 또는 MBC1HGP3와 MBC1HGP4가 그 상보적 서열에 의해 결합되고, MBC1HGP1-MBC1HGP3 절편과MBC1HGP2-MBC1HGP4 절편이 합성되고, 또한 각 절편의 상보적 서열에 의해 결합되어, 완전한 길이의 인간형화된 HH쇄V영역의 DNA가 합성되는 것을 가르킨다.The external primers MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) and MBC1HVR1 (SEQ ID NO: 28) each have a sequence homologous to MBC1HGP1 and MBC1HGP4, and each contains a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme. Using PCR, four primers are assembled to synthesize full-length cDNA, and external primers are added to perform DNA amplification. Assembly by the PCR method means that MBC1HGP1 and MBC1HGP2, or MBC1HGP3 and MBC1HGP4 are joined by their complementary sequences, MBC1HGP1-MBC1HGP3 fragments and MBC1HGP2-MBC1HGP4 fragments are synthesized, and are also joined by the complementary sequences of each fragment. This indicates that the DNA of the full-length humanized HH chain V region is synthesized.

인간항체 H쇄C영역은 임의의 인간 H쇄C영역일 수 있고, 예를 들어, H쇄Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 들 수가 있다.The human antibody H chain C region may be any human H chain C region, for example, H chain Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4.

전기 방법으로 구축한 인간형화된 항체 H쇄V영역의 DNA는 임의의 인간항체H쇄C영역, 예를 들어, 인간 H쇄C영역Cγ1영역의 DNA와 연결할 수 있다. 키메라항체 H쇄의 구축으로 서술한 바와 같이, 적당한 제한효소로 처리한 후, 인핸서/프로모터계와 같은 발현 억제 영역을 인간 H쇄C영역을 코딩하는 DNA와 연결하여, 인간형화된 H쇄V영역 및 인간H쇄C영역의 DNA를 포함하는 발현벡터를 작제한다.The DNA of the humanized antibody H chain V region constructed by the above method can be linked with the DNA of any human antibody H chain C region, for example, the human H chain C region Cγ1 region. As described in the construction of the chimeric antibody H chain, after treatment with a suitable restriction enzyme, an expression suppression region such as an enhancer / promoter system is connected with a DNA encoding a human H chain C region to form a humanized H chain V region. And an expression vector comprising the DNA of the human H chain C region.

(iii) 인간형화된 L쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 발현벡터의 구축(iii) Construction of DNA and Expression Vectors Encoding Humanized L-chain V Regions

본 발명에서는 H쇄V영역을 코딩하는 DNA의 경우와 같이, 주형이 되는 인간항체의 L쇄V영역의 DNA를 천연상태로 입수 할 수 없기 때문에, L쇄V영역을 코딩하는 DNA의 전염기서열을 DNA 합성기로 합성하고, PCR법에 의해 구축할 수 있다.In the present invention, since the DNA of the L chain V region of the human antibody serving as the template cannot be obtained in a natural state as in the case of the DNA encoding the H chain V region, the infectious sequence of the DNA encoding the L chain V region Can be synthesized by a DNA synthesizer and constructed by PCR.

마우스항 인간PTHrP 단일클론 항체L쇄V영역과 가장 상동성을 가지는 인간 항체 SU03868을 주형으로서 인간형화된 H쇄V영역의 DNA를 구축하기 위하여, 예를 들어, 서열번호 29 에서 32에 표시한 4개의 프라이머로 나누어 합성한다. 프라이머MBC1LGP1(서열번호29)및 MBC1LGP3(서열번호30)은 센스DNA서열을 가지고, MBC1LGP2(서열번호31) 및 MBC1LGP4(서열번호32)는 안티센스DNA서열을 가지고, 각각의 프라이머의 양단에 15에서 21bp의 상보적 서열을 가지도록 설계한다.In order to construct the DNA of the humanized H chain V region as a template, the human antibody SU03868 having the most homology with the mouse anti human PTHrP monoclonal antibody L chain V region, for example, 4 shown in SEQ ID NOs: 29 to 32 Divided into two primers to synthesize. Primers MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) and MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) have sense DNA sequences, MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) and MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) have antisense DNA sequences, 15 to 21 bp across each primer It is designed to have a complementary sequence of.

외부 프라이머MBC1LVS1(서열번호33), MBC1LVR1(서열번호34)는 MBC1LGP1, MBC1LGP4와 각각 상동한 서열을 가지고 있고, 각각 적당한 제한효소의 인식서열을 각각 포함하고 있다. PCR법을 이용하여, 4개의 프라이머를 조립시켜 완전한 길이의 cDNA 합성하고, 또한 외부 프라이머를 가하여 DNA의 증폭을 수행한다. PCR법에 의한 조립이라는 것은, MBC1LGP1과 MBC1LGP3, 또는 MBC1LGP2와 MBC1LGP4가 그 상보적 서열에 의해 결합되고, MBC1LGP1-MBC1LGP3 절편과 MBC1LGP2-MBC1LGP4 절편이 합성되고, 또한 각 절편의 상보적 서열에 의해 결합되어, 완전한 길이의 인간형화된 HH쇄V영역을 코딩하는 DNA가 합성되는 것을 가르킨다.The external primers MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) and MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34) each have a sequence homologous to MBC1LGP1 and MBC1LGP4, and each contain a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme. Using PCR, four primers are assembled to synthesize full-length cDNA, and external primers are added to perform DNA amplification. Assembly by the PCR method means that MBC1LGP1 and MBC1LGP3, or MBC1LGP2 and MBC1LGP4 are joined by their complementary sequences, MBC1LGP1-MBC1LGP3 fragments and MBC1LGP2-MBC1LGP4 fragments are synthesized, and are also joined by the complementary sequences of each fragment. , DNA encoding the full-length humanized HH chain V region.

인간항체H쇄C영역은 임의의 인간L쇄C영역일 수 있고, 예를 들어, 인간L쇄Cγ나 Cκ를 들 수가 있다.The human antibody H chain C region may be any human L chain C region, for example, human L chain Cγ or Cκ.

전기 방법으로 구축한 인간형화된 항체 L쇄V영역의 DNA는 임의의 인간항체L쇄C영역, 예를 들어, 인간L쇄Cγ영역의 것과 연결할 수 있다. 적당한 제한효소로 처리한 후, 인핸서/프로모터계와 같은 발현 억제 영역의 기초로 인간 L쇄γ쇄C영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 인간형화된 L쇄V영역 및 인간L쇄γ쇄C영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터를 작제한다.The DNA of the humanized antibody L chain V region constructed by the above method can be linked to that of any human antibody L chain C region, for example, human L chain Cγ region. After treatment with an appropriate restriction enzyme, the human L chain γ chain C region is linked to the DNA encoding the human L chain γ chain C region on the basis of an expression suppression region such as an enhancer / promoter system. An expression vector containing a DNA encoding the construct is constructed.

전기 방법에 의하여, 인간형화된 항체의 V영역(항원에 대한 결합활성, 중화활성 등)이 포함되는지의 여부는 반드시 획실한 것이 아니다. 특히, L쇄의 경우는, 마우수항 인간PTHrP 모노클로널항체 L쇄V영역이 아주 드문 Vλx 유전자 유래의 것이기 때문에, 인간형화된 H쇄와의 조합에 의해 COS-7과 같은 동물세포로 발현시켜, 활성의 유무를 검토할 필요가 있다.Whether or not the V region (binding activity to the antigen, neutralizing activity, etc.) of the humanized antibody is included by the foregoing method is not necessarily significant. In particular, in the case of the L chain, since the Maus human PTHrP monoclonal antibody L chain V region is derived from a rare Vλx gene, it is expressed in an animal cell such as COS-7 by combination with a humanized H chain. It is necessary to examine the presence or absence of activity.

인간형화된 항체V영역의 어느 FR이 인간형화된 항체의 결합활성 및 중화활성에 기여하는가를 확실하게 하는 방법으로서, 하이브리드 V영역을 구축하여(참조: Ohtomo, T. et al., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995) 확인하는 것이 유효하다. 본 발명의 인간형화된 항체 L쇄V영역에 있어서, 어떤 아미노산을 변이시 킬 경우에, 활성을 가지는 것이 수득되는가를 조사하기 위하여, 인간형화된 항체의 FR 영역의 절편을 마우스 유래의 FR영역의 절편과 재조합한 것을 코딩하는 DNA를 구축하고, 인간형화를 위한 각 영역의 평가를 수행한다.As a method of confirming which FR of the humanized antibody V region contributes to the binding activity and neutralizing activity of the humanized antibody, a hybrid V region is constructed (see Ohtomo, T. et al., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995). In the humanized antibody L-chain V region of the present invention, fragments of the FR region of the humanized antibody were obtained from a mouse-derived FR region in order to examine what amino acids were obtained when the amino acids were mutated. DNA encoding the fragments and recombinants is constructed and evaluation of each region for humanization is performed.

도3에 나타낸 바와 같이, FR1 및 FR2는 인간항체 유래인 FR3 및 FR4를 마우스항체 유래에 재조합한 V영역을 포함하는 폴리펩티드를 가지는 항체(이와 같은 재조합한 절편을 가지는 항체「하이브리드 항체」라고 한다) FR1만을 인간의 것에 재조합한 하이브리드항체, FR2만을 인간의 것에 재조합한 하이브리드항체를 작제한다. 그리고, 이들 하이브리드 항체를 코딩하는 DNA를 발현벡터에 조합하고, 인간형화된 항체를 일과성으로 발현시켜, 항체의 활성의 유무를 조사한다. As shown in Fig. 3, FR1 and FR2 are antibodies having a polypeptide comprising a V region obtained by recombining FR3 and FR4 derived from a human antibody into a mouse antibody (referred to as an antibody "hybrid antibody" having such a recombinant fragment) A hybrid antibody in which only FR1 was recombined with a human one, and a hybrid antibody in which only FR2 was recombined with a human one are constructed. Then, DNAs encoding these hybrid antibodies are combined with an expression vector, the humanized antibody is transiently expressed, and the presence or absence of the activity of the antibody is examined.

본 발명자는 이 방법을 이용하여 L쇄V영역을 포함하는 폴리펩티드의 항원결합활성 및 중화활성에 대히서 검토한 결과, FR2 및 FR3에 치환해야만 하는 아미노산이 존재하는 것으로 판명하였다.As a result of examining the antigen-binding activity and the neutralizing activity of the polypeptide including the L-chain V region using this method, the present inventors have found that there are amino acids that must be substituted for FR2 and FR3.

본 발명자는 FR2 및 FR3영역에서 활성에 기여하는 아미노산이 존재하는 것이 판명되고, 카밧 등(참조: US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991)에 의해 결정된 항체의 아미노산 번호의 제 36, 45 및 49번째의 아미노산(FR2 영역에 존재한다), 및 제 87번째의 아미노산(FR3 영역에 존재한다)이 활성에 기여하는 아미노산인 것을 확실하게 하였다.The inventors have found that there are amino acids contributing to activity in the FR2 and FR3 regions, and 36 of the amino acid number of the antibody as determined by Kabat et al. (US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991). , The 45th and 49th amino acids (in the FR2 region), and the 87th amino acid (in the FR3 region) were confirmed to be amino acids contributing to the activity.

이 점에서, 본 발명에서는 이들 아미노산을 변이(예를 들어, 치환)시킨 V영역을 포함하는 펩티드를 작제한다.In this regard, in the present invention, a peptide comprising a V region in which these amino acids are mutated (for example, substituted) is constructed.

우선, 전기 CDR-이식에 의해, 아미노산의 변이를 도입시키기 위한 기본이 되는 아미노산 서열을 가지는 V영역을 포함하는 폴리펩티드를 조제한다. 이 기본이 되는 폴리펩티드는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 「버젼 a」로 한다(표 1의 a).First, a polypeptide comprising a V region having an amino acid sequence as a basis for introducing a mutation of an amino acid is prepared by electric CDR-transplantation. This basic polypeptide contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, and is referred to as "version a" (a in Table 1).

다음으로, 이 버젼 a를 기준으로 하여, FR 몇개의 아미노산을 변이시킨 여러가지의 변이형 절편을 작제한다.Next, on the basis of this version a, various variant fragments in which several amino acids of FR are mutated are constructed.

변이의 도입은 목적으로 하는 변이를 도입하려고 하는 아미노산을 코딩하는 올리고누클레오티드(oligonucleotide)프라이머(변이원프라이머)를 설계하고, 그 프라이머를 이용한 PCR에 의해 수행할 수 있다.Introduction of the mutation can be carried out by designing an oligonucleotide primer (mutant one primer) encoding an amino acid to be introduced into the desired mutation, and by PCR using the primer.

상기 방법으로 FR2 및 FR3의 특정 아미노산을 변이시킨 V영역을 포함하는 폴리펩티드(버젼 b 내지 t)가 작제된다(표 1의 b 내지 t).In this manner, polypeptides (versions b to t) comprising a V region in which specific amino acids of FR2 and FR3 are mutated are constructed (b to t in Table 1).

전기 방법으로 구축한 인간형화된 항체 H쇄V영역 각 버젼을 코딩하는 DNA는 임의의 인간항체 L쇄C영역, 예를 들어, 인간 L쇄Cλ영역의 DNA와 연결할 수 있다. 적당한 제한효소로 처리한 후, 인핸서/프로모터계와 같은 발현억제 영역을 인간 L쇄λ쇄C영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 인간형화된 L쇄V영역 각 버젼을 코딩하는 DNA와 인간형화된 L쇄λ쇄C영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 작제한다.The DNA encoding each version of the humanized antibody H chain V region constructed by the above method can be linked to DNA of any human antibody L chain C region, for example, human L chain Cλ region. After treatment with an appropriate restriction enzyme, an expression suppression region such as an enhancer / promoter system is linked to the DNA encoding the human L chain λ chain C region, and humanized with the DNA encoding each version of the humanized L chain V region. A vector containing a DNA encoding an L chain λ chain C region is constructed.

또한, 전기 방법으로 구축한 인간형화된 항체 H쇄V영역 및 인간 H쇄C영역을 코딩하는 DNA와 인간형화된 L쇄V영역 및 인간L쇄C영역을 코딩하는 DNA를 단일의 발현벡터(예를 들어, WO94/11523 참조)에 도입하고, 그리고 그 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환한 다음, 이 형질전환된 숙주를 생체 내 또는 시험관 내 조건에서 배양하여 목적으로 하는 인간형화된 항체를 생산시킬 수 있다.In addition, a single expression vector (eg, DNA encoding humanized antibody H chain V region and human H chain C region and DNA encoding humanized L chain V region and human L chain C region constructed by the above-described method) is used. (See WO94 / 11523), and transforming host cells using the vector, and then culturing the transformed host in vivo or in vitro conditions to produce the humanized antibody of interest. You can.

4. 키메라 항체 및 인간형 항체의 제조4. Preparation of Chimeric Antibodies and Humanized Antibodies

키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 제조하기 위해서는, 전기와 같은 각각 2종류의 발현벡터를 작제한다. 즉, 키메라항체에 대해서는 인핸서/프로모터계와 같은 발현억제영역에 마우스H쇄V영역 및 인간H쇄C영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터를 작제하고, 인간형화된 항체에 대해서는 인핸서/프로모터계와 같은 발현억제영역에 인간형화된 L쇄V영역 및 인간L쇄C영역을 코딩하는 DNA가 연결된 발현벡터를 작제한다. In order to produce a chimeric antibody or a humanized antibody, two kinds of expression vectors as described above are constructed. That is, an expression vector comprising a DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region is constructed in an expression suppression region such as an enhancer / promoter system for a chimeric antibody, and an enhancer / promoter system for a humanized antibody. An expression vector is constructed in which DNA encoding the humanized L-chain V region and human L-chain C region is connected to an expression suppression region as described above.

다음으로, 이들 발현벡터에 의해 포유류 세포를 생체 내 또는 시험관 내 조건에서 배양하여 키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 제조한다(예를 들어, WO91/16928 참조).Next, mammalian cells are cultured in vivo or in vitro with these expression vectors to prepare chimeric or humanized antibodies (see, eg, WO91 / 16928).

또한, H쇄V영역 및 H쇄C영역을 코딩하는 DNA, 및 L쇄V영역 및 L쇄C영역을 코딩하는 DNA를 단일 벡터에 연결하고, 이로써 적당한 숙주세포를 형질전환하여 항체를 생산시킬 수 있다. 즉, 키메라 항체의 발현에는 클로닝된 cDNA에 존재하는 마우스리더 서열 및 마우스H쇄V영역 및 인간L쇄C영역을 코딩하는 DNA와, 마우스리더 서열 및 마우스 L쇄V영역 및 인간 L쇄C영역을 코딩하는 DNA를 단일 발현벡터(예를 들어, WO94/11523 참조)에 도입한다. 인간형화된 항체의 발현에는 인간형화된 H쇄V영역 및 인간 H쇄C영역을 코딩하는 DNA와 인간형화된 L쇄V영역 및 인간 L쇄C영역을 코딩하는 DNA를 단일 발현벡터(예를 들어, WO94/11523 참조)에 도입한다. 그리고, 이들 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환한 다음, 이 형질전화된 숙주를 생체 내 또는 시험관 내 조건에서 배양하여 목적으로 하는 키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 생산시킨다.In addition, the DNA encoding the H chain V region and the H chain C region and the DNA encoding the L chain V region and the L chain C region can be linked to a single vector, thereby transforming an appropriate host cell to produce an antibody. have. That is, the expression of the chimeric antibody includes DNA encoding the mouse leader sequence and the mouse H chain V region and the human L chain C region, and the mouse leader sequence, the mouse L chain V region and the human L chain C region in the cloned cDNA. The DNA encoding is introduced into a single expression vector (see, eg, WO94 / 11523). Expression of the humanized antibody includes DNA encoding humanized H chain V region and human H chain C region, and DNA encoding humanized L chain V region and human L chain C region as a single expression vector (e.g., , WO94 / 11523). Then, the host cells are transformed using these vectors, and the transformed host is then cultured in vivo or in vitro to produce a chimeric or humanized antibody of interest.

이상의 방법으로 목적으로 하는 키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 형질전환체를 배양함으로써 생산된 키메라 항체 또는 인간형화된 항체는 세포내 또는 세포외로부터 분리하여 균일할 때까지 정제할 수 있다.The chimeric antibody or humanized antibody produced by culturing the transformant transformed with DNA encoding the chimeric antibody or humanized antibody of interest by the above method is purified until homogeneous by separating from intracellular or extracellular. can do.

또한, 본 발명의 목적으로 하는 단백질인 키메라 항체 또는 인간형화된 항체의 분리, 정제를 프로테인 A 아가로오스 컬럼을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 그 외에 통상의 단백질로 이용되는 분리, 정제방법을 사용해도 좋고, 어떠한 제한이 있는 것은 아니다. 예를 들어, 각종 크로마토그래피, 한외여과, 염셕, 투석등을 적절히 선택, 조합하면, 키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 분리, 정제할 수 있다. In addition, separation and purification of chimeric or humanized antibodies, which are proteins of the present invention, can be performed using a protein A agarose column. In addition, other separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation. For example, by appropriately selecting and combining various chromatography, ultrafiltration, salt washing, dialysis, and the like, chimeric antibodies or humanized antibodies can be separated and purified.

인간PTHrP에 대한 본 발명의 키메라 항체 또는 인간형화된 항체를 정제하기 위하여, 임의의 발현계를 사용할 수 있다. 예를 들어, 진핵세포를 이용하는 경우는 동물세포(예를 들어, 수립된 포유동물세포계), 진균세포 또는 효모세포 등을 들 수 있고, 원핵세포를 이용하는 경우는 세균세포(예를 들어, 대장균세포 등)등을 사 용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 키메라 항체 또는 인간형화된 항체는 포유류 세포, 예를 들어, COS세포 또는 CHO 세포 중에서 발현된다.In order to purify the chimeric antibody or humanized antibody of the present invention against human PTHrP, any expression system can be used. For example, in the case of using eukaryotic cells, animal cells (for example, established mammalian cell systems), fungal cells, or yeast cells, and the like, and in the case of using prokaryotic cells, bacterial cells (for example, E. coli cells). Etc.) can be used. Preferably the chimeric antibody or humanized antibody of the invention is expressed in mammalian cells, eg, COS cells or CHO cells.

이들 경우, 포유류 세포에서의 발현을 위한 유용한 통상의 프로모터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus immediage early; HCMV)프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV프로모터를 함유하는 발현벡터의 예로는 HCMV-VH-HCλ1, HCMV-VL-HCK 등이고, pSV2neo에 유래하는 것(WO92-19759) 등이 있다.In these cases, conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used. For example, it is preferable to use a human cytomegalovirus immediage early (HCMV) promoter. Examples of expression vectors containing the HCMV promoter are HCMV-VH-HCλ1, HCMV-VL-HCK, and the like, and those derived from pSV2neo (WO92-19759).

또한, 그 외에 본 발명을 위하여 이용할 수 있는 포유동물 세포에 있어서 유전자 발현용 프로모터로서는 렛트로바이러스(retrovirus), 폴리오마바이러스 (poliomavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 시미안(Simian)바이러스40(SV40) 등의 바이러스 프로모터나 인간 폴리펩티드 체인 이롱게이션 펙터-1α(HEF-1α)등의 포유동물세포 유래의 프로모터를 이용하면 좋다. 예를 들어, SV40의 프로모터를 사용하는 경우는 멀리간(Mulligan) 등의 방법(Nature 277, 108, 1979), 또한, HEF-1α프로모터를 사용하는 경우는 Mizushima, S. et al의 방법(Nuclieic Acids Research, 18, 5322, 1990)에 따르면, 용이하게 실시할 수 있다.In addition, as a promoter for gene expression in mammalian cells that can be used for the present invention, retrovirus, polyomavirus, adenovirus, Simian virus 40 (SV40). Virus promoters, such as the above), and promoters derived from mammalian cells, such as human polypeptide chain ligation factor-1α (HEF-1α), may be used. For example, when using the SV40 promoter, Mulligan et al. (Nature 277, 108, 1979), and when using the HEF-1α promoter, Mizushima, S. et al (Nuclieic) Acids Research, 18, 5322, 1990) can be easily carried out.

복제기원으로서는 SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스(papilloma virus)(BPV) 등의 유래의 것을 이용할 수 있고, 또한 숙주세포계중 유전자의 복제 및 증폭을 위하여, 발현벡터는 선택 마커로서 포스포트랜스퍼라제 APH(3')II 또는 I(neo) 유전자, 티미딘키나제(thymidinekinase) 유전자, 대장균 잔틴구아닌포스포릴트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 다이히드로 엽산환원효소(DHFR) 유전자 등을 포함할 수 있다.As the origin of replication, those derived from SV40, polyomavirus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), and the like can be used, and for the replication and amplification of genes in the host cell system, the expression vector is used as a selection marker. Phosphotransferase APH (3 ′) II or I (neo) genes, thymidinekinase genes, E. coli xanthuanine phosphoryltransferase (Ecogpt) genes, dihydrofolate reductase (DHFR) genes, and the like. Can be.

5. 키메라항체 및 인간형 항체의 항원 결합활성 및 중화활성의 평가5. Evaluation of Antigen-binding and Neutralizing Activities of Chimeric and Human Antibodies

(1) 항체의 농도측정(1) measurement of antibody concentration

수득한 정제 항체의 농도측정은 ELISA에 의해 수행할 수 있다.Concentration measurement of the obtained purified antibody can be performed by ELISA.

항체 농도측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같은 방법으로 조제한다: ELISA용 96-웰(well) 플레이트(예를 들어, Maxisorp, NUNC)의 각 웰에 예를 들어, 1㎍/㎖의 농도로 조절한 염소 항인간 IgG 항체 100㎕를 가하여 흡착시킨다. 200 ㎕의 희석 완충제(예를 들어, 50 mM Tris-HC1, 1 mM MgCl₂, 0.1 M NaC1, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN₃, 1% 소 혈청 알부민(BSA), pH7.2)로 블로킹한 후, 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 발현시킨 COS-7 세포 또는 CHO 세포의 배양상등액, 또는 정제 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 단계적으로 희석하여 각 웰에 가하고, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산(nitrophenyl phosphric acid), SIGMA)를 첨가한 다음, 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, 미국)로 측정하였다. 측정농도의 표준으로서, Hu IgG1λPurified(The Binding Site)를 이용할 수 있다. ELISA plates for antibody concentration measurements are prepared in the following manner: in each well of a 96-well plate (eg Maxisorp, NUNC) for ELISA, for example, at a concentration of 1 μg / ml 100 μl of one goat anti-human IgG antibody is added and adsorbed. Blocking with 200 μl dilution buffer (eg 50 mM Tris-HC1, 1 mM MgCl ₂ , 0.1 M NaC1, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN ₃ , 1% bovine serum albumin (BSA), pH7.2) Then, the culture supernatants of COS-7 cells or CHO cells expressing chimeric antibodies, hybrid antibodies or humanized antibodies, or purified chimeric antibodies, hybrid antibodies or humanized antibodies, are diluted in stages and added to each well, 1 MG / mL substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenyl phosphric acid, SIGMA) was added, and then the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader (Bio-Rad, USA). As a standard of measurement concentration, Hu IgG1λ Purified (The Binding Site) can be used.

(2) 항원 결합능의 측정(2) Measurement of antigen binding capacity

항원결합 측정을 위한 ELISA 플레이트는 다음과 같은 방법을 조제한다: ELISA용 96-웰 플레이트의 각 웰에 1㎍/㎖의 농도로 조절한 인간 PTHrP(1-34) 100 ㎕를 가하여 흡착시킨다. 200㎕의 희석완충액으로 블로킹한 후, 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 발현시킨 COS-7 세포 또는 CHO 세포의 배양상등액, 또는 정제된 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 단계 적으로 희석하여 각 웰에 가한 다음, 알칼라인포스파타제(alkali phosphatase)결합 염소 항인간 IgG항체 100㎕를 가하고, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산, SIGMA)를 가한 다음, 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. ELISA plates for antigen binding measurements were prepared as follows: 100 μl of human PTHrP (1-34) adjusted to a concentration of 1 μg / ml was adsorbed to each well of a 96-well plate for ELISA. After blocking with 200 μl of the diluting buffer, the culture supernatant of COS-7 cells or CHO cells expressing chimeric antibodies, hybrid antibodies or humanized antibodies, or purified chimeric antibodies, hybrid antibodies or humanized antibodies were staged. Diluted to each well, and then 100 μl of alkaline phosphatase-binding goat anti-human IgG antibody was added, followed by addition of 1 mg / ml of substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA), followed by 405 nm. Absorbance at was measured with a microplate reader.

(3) 중화활성의 측정(3) Measurement of neutralizing activity

마우스 항체, 키메라 항체 및 인간형화된 항체의 중화활성 측정은, 예를 들어, 렛트 골육종 세포주 ROS17/2.8-5세포(Sato, K. et al., Acta Endocrinology 116, 113-120, 1987)를 이용하여 수행할 수 있다. 즉, ROS17/2.8-5 세포를 4mM의 히드로콜티손(hydrocortisone)으로 자극하여, PTH/PTHrP 리셉터(recepter)를 유도한다. 1mM의 이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX. SIGMA)으로 cAMP의 분해효소를 저해하고, 중화활성을 측정하는 마우스항체, 키메라항체 또는 인간형화된 항체를 PTHrP(1-34)와 등량 혼합하고, 각 항체와 PTHrP(1-34)의 혼합액을 각 웰에 첨가한다. PTHrP의 자극으로 인해 렛트 골육종 세포주 ROS17/2.8-5 세포가 생산하는 cAMP의 양을 측정함으로써 마우스항체, 키메라항체 또는 인간형 항체의 중화능을 평가할 수 있다.Neutralizing activity of mouse antibodies, chimeric antibodies and humanized antibodies can be measured, for example, using the rat osteosarcoma cell line ROS17 / 2.8-5 cells (Sato, K. et al., Acta Endocrinology 116, 113-120, 1987). Can be done. That is, ROS17 / 2.8-5 cells are stimulated with 4 mM hydrocortisone to induce PTH / PTHrP receptors. 1 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX.SIGMA) inhibits cAMP degrading enzymes and equally mixes mouse antibodies, chimeric antibodies or humanized antibodies measuring neutralizing activity with PTHrP (1-34), A mixture of each antibody and PTHrP (1-34) is added to each well. Stimulation of PTHrP allows evaluation of the neutralization capacity of mouse, chimeric or human antibodies by measuring the amount of cAMP produced by the rat osteosarcoma cell line ROS17 / 2.8-5 cells.

(4) PTHrP와 항PTHrP 항체와의 상호작용에 있어서 속도해석(4) Kinetic analysis in the interaction of PTHrP with anti-PTHrP antibodies

본 발명에서는 PTHrP와 항PTHrP항체와의 상효작용에 있어서 속도를 여러가지 수법을 이용하여 해석할 수 있다. 구체적으로는 스켓차아드 도표(Scatchard plot)해석이나 비아코아(BIACORE)라 불리는 표면 플라스마 공명센서(팔마시아 바이오테크사에 의한 개발ㆍ실용화되었다)에 의해 분리정수, 분리속도 정수, 결합속도 정수를 측정하는 것이 가능하지만, 본 발명에서는 그 예로서 비아코아라고 불리는 표면플라스마 공명센서에 의해 해석하는 경우를 설명한다.In the present invention, the rate in the interaction between PTHrP and anti-PTHrP antibodies can be analyzed using various techniques. Specifically, the separation constant, the separation rate constant, and the coupling rate constant are determined by a Scatchard plot analysis or a surface plasma resonance sensor (developed and commercialized by Palmacia Biotech) called BIACORE. Although it is possible to measure, this invention demonstrates the case where it analyzes by the surface plasma resonance sensor called via core as the example.

비아코아의 기본구조는 광원과 플라즈마 디텍터 및 마이크로유로로 이루어진다. 실제로는 카세트식의 센서칩 상에 리간드를 고정화하고, 그곳에 분석물질을 주입한다. 양자간에 친화성이 있으면, 그 결합량이 광학적으로 검출된다.The basic structure of the via core consists of a light source, a plasma detector and a micro flow path. In practice, the ligand is immobilized on the cassette-type sensor chip and the analyte is injected there. If there is affinity between both, the bond amount is optically detected.

그 검출 원리는 표면 플라스마 공명라고 불리는 현상이다. 즉, 유리와 금속박막과의 계면에 전반사하도록 입사하는 광 속에 어떤 각도의 입사광은 표면 플라스마의 여기에 사용되어 없어져 버린다. 그 각도가 금속박막(센서)에 접하고 있는 용매의 농도 변화에 의존하여 변동되며, 비아코아는 이 변동을 검출한다. The principle of detection is a phenomenon called surface plasma resonance. That is, incident light at an angle in the light incident to total reflection at the interface between the glass and the metal thin film is used for excitation of the surface plasma and disappears. The angle fluctuates depending on the concentration change of the solvent in contact with the metal thin film (sensor), and the via core detects this fluctuation.

비아코아에서는 이 변동을 공명 시그널(SPR signal)이라고 부르고, 0.1도의 변화를 1000RU(resonance units)으로 하고 있다. 1000RU는 표면적 1 ㎟의 박금 센서상에 약 1ng의 단백질이 결합한 경우의 변화량이고, 단백질의 경우, 50RU(50pg)정도의 변화를 충분히 검출할 수 있다.In Biacoa, this variation is called a resonance signal (SPR signal), and the change of 0.1 degrees is set to 1000RU (resonance units). 1000 RU is a change amount when about 1 ng of protein is bound on a 1 mm 2 foil sensor, and in the case of protein, a change of about 50 RU (50 pg) can be sufficiently detected.

검출된 시그널은, 비아코아에 포함된 컴퓨터가 센서그램이라고 불리는 결합 곡선으로 변환하고, 리얼타임에 컴퓨터 디스플레이상에 그려진다(하목철(夏目徹) 외, (1995) 실험의약, 13, p563-569.)(Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145, p229-240).The detected signal is converted into a coupling curve called a sensorgram by a computer included in Viacoa, and drawn on a computer display in real time (Ham Cheol et al., (1995), Experimental Medicine, 13, p563-569). (Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145, p229-240).

상기 비아코아에 의해 본 발명의 항PTHrP항체의 카이네틱스파라미터, 즉 해리 정수(KD), 해리속도 정수(Kdiss) 및 결합속도 정수(Kass)를 측정할 수 있다.The kinetic parameters of the anti-PTHrP antibody of the present invention, ie, dissociation constant (KD), dissociation rate constant (Kdiss) and binding rate constant (Kass), can be measured by the via core.

본 발명의 항PTHrP항체는 해리 정수(KD값)이 작은 값일수록 더 높은 중화활성을 가지는 점에서 바람직하다. 본 발명의 항PTHrP항체에 있어서, KD값은 1.86 ×10^-7 이하인 것이 바람직하고, 1.86 ×10^-8 이하인 것이 바람직하고, 3.58 ×10^-10 이하인 것이 가장 바람직하다.The anti-PTHrP antibody of the present invention is preferable in that the smaller the dissociation constant (KD value), the higher the neutralizing activity. In the anti-PTHrP antibody of the present invention, the KD value is preferably 1.86 x 10 ^-7 or less, preferably 1.86 x 10 ^-8 or less, and most preferably 3.58 x 10 ^-10 or less.

또한, KD값은 해리속도 정수(Kdiss)및 결합속도 정수(Kass)의 두가지의 변수로부터 결정된다(KD = Kdiss/Kass). 따라서, Kdiss의 값이 작아지고, Kass의 값이 커지면, KD값이 적어지는 것은 확실하다.Also, the KD value is determined from two variables: dissociation rate constant (Kdiss) and coupling rate constant (Kass) (KD = Kdiss / Kass). Therefore, as the value of Kdiss decreases and the value of Kass increases, it is evident that the KD value decreases.

구체적으로는 본 발명의 항PTHrP항체의 경우, Kdiss의 값이 1.22 ×10^-1 [1/sec]이하이면 좋다. 바람직하게는 Kdiss의 값이 1.22 ×10^-2 이하이고, 보다 바람직하게는 3.16 ×10^-4 이하이고, 가장 바람직하게는 2.32 ×10^-4 [1/sec]이하이다.Specifically, in the case of the anti-PTHrP antibody of the present invention, the value of Kdiss may be 1.22 x 10 ^-1 [1 / sec] or less. Preferably, the value of Kdiss is 1.22 x 10 ^-2 or less, more preferably 3.16 x 10 ^-4 or less, and most preferably 2.32 x 10 ^-4 [1 / sec] or less.

한편, Kass의 값은 6.55 ×10⁴ [1/M.Sec]이하이면 좋다. 바람직하게는 Kass의 값은 6.55 ×10⁵ 이하이고, 보다 바람직하게는 0.883 ×10⁶ 이하이고, 가장 바람직 하게는 1.03 ×10⁶ [1/M.Sec]이하이다.On the other hand, the value of Kass may be 6.55 x 10 ⁴ [1 / M.Sec] or less. Preferably, the value of Kass is 6.55 × 10 ⁵ or less, more preferably 0.883 × 10 ⁶ or less, and most preferably 1.03 × 10 ⁶ [1 / M.Sec] or less.

또한, Kdiss의 값이 1.22 ×10^-1 [1/Sec]이하이고, 또한 Kass의 값이 6.55 ×10⁴ [1/M.Sec]이상의 항PTHrP항체도 바람직하다.Furthermore, anti-PTHrP antibodies having a Kdiss value of 1.22 x 10 ^-1 [1 / Sec] or less and a Kass value of 6.55 x 10 ⁴ [1 / M.Sec] or more are also preferable.

더욱 구체적으로는 본 발명의 항PTHrP 항체는 KD값은 1.02 ×10^-1 내지 1.86 ×10^-7 [M]의 범위이고, 1.02 ×10^-11 내지 1.02 ×10^-10 내지 1.86 ×10 ^-8 [M]의 것이 바람직하고, 1.34 ×10^-10 내지 3.58 ×10^-10 [M]의 것이 보다 바람직하고, 2.25 ×10 ^-10 내지 3.58 ×10^-10 의 것이 가장 바람직하다.More specifically, the anti-PTHrP antibody of the present invention has a KD value in the range of 1.02 × 10 ⁻¹ to 1.86 × 10 ⁻⁷ [M], and 1.02 × 10 ⁻¹¹ to 1.02 × 10 ⁻¹⁰ to 1.86 × 10 ⁻⁸ [ M] is preferable, 1.34 x 10 ^-10 to 3.58 x 10 ^-10 [M] is more preferable, and 2.25 x 10 ^-10 to 3.58 x 10 ^-10 is most preferable.

또한, Kdiss 값은 7.38 ×10^-5 내지 1.22 ×10^-1 [1/Sec]의 범위이고, 7.38 ×10^-5 내지 1.22 ×10^-2 [1/Sec]인 것이 바람직하고, 1.66 ×10^-4 내지 3.16 ×10^-4 [1/Sec]인 것이 바람직하고, 1.66 ×10^-4 내지 2.32 ×10^-4 [1/Sec]인 것이 바람직하다.Also, Kdiss value of 7.38 × 10 ^-5 to 1.22 × 10 ^-1 is in the range of [1 / Sec], 7.38 × 10 -5 to ^{1.22 × 10 -2 [1 / Sec} ] and should preferably, 1.66 × 10 ^- is ^{from 4} to 3.16 × 10 ^-4 to the [1 / Sec] is preferably, 1.66 × 10 ^-4 to ^{2.32 × 10 -4 [1 / Sec} ] is preferred.

그리고, Kass 값은 6.55 ×10⁴ 내지 1.24 ×10⁷ [1/M.Sec]의 범위이고, 6.55 ×10⁵ 내지 1.24 ×10⁶ [1/M.Sec]인 것이 바람직하고, 7.23 ×10⁵ 내지 1.03 ×10⁶ [1/M.Sec]의 것이 보다 바람직하고, 0.883 ×10⁶ 내지 1.03 ×10⁶ [1/M.Sec]인 것이 가장 바람직하다.The Kass value is in the range of 6.55 × 10 ⁴ to 1.24 × 10 ⁷ [1 / M.Sec], preferably 6.55 × 10 ⁵ to 1.24 × 10 ⁶ [1 / M.Sec], and is 7.23 × 10 ⁵ To 1.03 × 10 ⁶ [1 / M.Sec] is more preferable, and 0.883 × 10 ⁶ to 1.03 × 10 ⁶ [1 / M.Sec] is most preferable.

이들 KD값, Kdiss 값 및 Kass 값은 스켓차아드 도표해석, 또는 비아코아 등의 표면 플라스마 공명 센서에 의해 수득할 수 있으나, 비아코아를 이용하여 수득하는 것이 바람직하다.These KD values, Kdiss values, and Kass values can be obtained by a skewcard plot analysis, or by surface plasma resonance sensors such as via core, but preferably obtained by using via core.

6. 항PTHrP 항체 또는 인간형화된 항체를 유효성분으로 포함하는 의약조성물 및 고칼슘 혈증억제제.6. A pharmaceutical composition and a hypercalcemia inhibitor comprising an anti-PTHrP antibody or a humanized antibody as an active ingredient.

PTHrP에 대한 항체 또는 인간형화된 항체의 치료효과를 확인하는 데는, PTHrP에 대한 항체 또는 인간형화된 항체를 고칼슘 혈증을 나타내는 동물에 투여하고, 고칼슘 혈증의 지표를 측정함으로써 그 치료효과를 확인할 수 있다. 또한, 고칼슘 혈증을 나타내는 동물 및 고칼슘혈증환자에 있어서는 자주 저인혈증이 확인되는 바, 본 발명의 항체는 이 저인혈증을 개선하기 위해 이용할 수 있다.In confirming the therapeutic effect of the antibody or humanized antibody against PTHrP, the therapeutic effect can be confirmed by administering the antibody or humanized antibody to PTHrP to an animal showing hypercalcemia and measuring the index of hypercalcemia. . Also, in animals and hypercalcemia patients exhibiting hypercalcemia, hypophosphatemia is frequently identified, and the antibody of the present invention can be used to improve this hypophosphatemia.

본 발명에서 사용되는 항체는 전기 해리정수, 해리속도정수 및 결합속도정수를 가지는 항PTHrP 항체(인간 항체, 키메라 항체, 프라이머다이즈드 항체를 포함한다), 또는 PTHrP에 대한 인간형화된 항체이다. 이 항체는 PTHrP에 결합함으로써, PTHrP의 활성을 중화하는 항체이고, 특히, 바람직하게는 인간형화된 #23-57-137-1 항체를 예로 들 수 있다. 인간형화된 #23-57-137-1 항체의 제조방법은 실시예 1 내지 3에 기재되어 있다.Antibodies used in the present invention are anti-PTHrP antibodies (including human antibodies, chimeric antibodies, primerized antibodies) having a dissociation constant, dissociation rate constant and binding rate constant, or humanized antibodies to PTHrP. This antibody is an antibody which neutralizes the activity of PTHrP by binding to PTHrP, and especially the humanized # 23-57-137-1 antibody is mentioned preferably. Methods of making humanized # 23-57-137-1 antibodies are described in Examples 1-3.

본 발명에서 사용되는 항체는, 염석법, HPLC 등을 이용한 겔여과법, 프로테인 A 컬럼 등을 이용한 친화성 크로마토그래피법 등의 통상의 정제수단을 조합하여 고순도로 정제할 수 있다. 이와 같은 정제된 항체는 방사면역측정법(RIA), 효소면역측정법(EIA, ELISA), 또는 형광항체법(Immunofluorescence Analysis)등의 통상의 면역학적 수단에 의해, 고민감도로 PTHrP를 인식하는 것을 확인할 수 있다.Antibodies used in the present invention can be purified with high purity by combining conventional purification means such as salting method, gel filtration using HPLC, affinity chromatography using protein A column and the like. Such purified antibodies can be confirmed to recognize PTHrP with high sensitivity by conventional immunological means such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), or fluorescence antibody (Immunofluorescence Analysis). have.

고칼슘혈증을 나타내는 동물로는 PTHrP를 생산하는 종양세포를 면역기능이 저하 또는 결실된 실험동물에 이식함으로써 작제된 모델동물을 사용할 수 있다. 이식된 동물세포로서는 인간유래의 동물세포가 바람직하고, 예를 들어, 인간췌장암 PAN-7을 들 수 있다. 또한, 종양세포를 이식된 면역기능이 저하 또는 결실된 동물로서는 누드마우스, SCID 마우스를 예로 들 수 있다.As an animal showing hypercalcemia, a model animal constructed by transplanting tumor cells producing PTHrP into an experimental animal with reduced or deleted immune function can be used. As a transplanted animal cell, human-derived animal cell is preferable, For example, human pancreatic cancer PAN-7 is mentioned. In addition, examples of animals with reduced or deleted immune function in which tumor cells have been transplanted include nude mice and SCID mice.

고칼슘혈증의 억제평가는 혈중칼슘 농도, 체중감소, 또는 운동량의 저하를 시간을 두고 관찰하고, 그 개선되는 정도를 평가함으로써 수행한다. Evaluation of inhibition of hypercalcemia is carried out by observing a drop in blood calcium concentration, weight loss, or exercise over time and evaluating the extent of improvement.

본 발명의 PTHrP에 대한 항체 또는 인간형화된 항체를 유효성분으로 포함하는 의약조성물 및 고칼슘혈증억제제는 비경구적으로 전신적 또는 국소적으로 투어할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주사, 절육내 주사, 복강내 주사를 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절한 투여방법을 선택할 수 있다. 유효투여량은 일회에 체중 1㎏당 0.01㎎ 내지 1000㎎의 범위로 선택된다. 또는 환자당 5 내지 10000㎎/body, 바람직하게는 50 내지 1000㎎/body의 투여량을 선택할 수 있다.Pharmaceutical compositions and hypercalcemia inhibitors comprising the antibody or humanized antibody against PTHrP of the present invention as an active ingredient can be parenterally or systemically or topically toured. For example, intravenous injection, intracutaneous injection and intraperitoneal injection can be selected, and an appropriate administration method can be selected according to the age and symptoms of the patient. The effective dosage is selected in the range of 0.01 mg to 1000 mg / kg body weight at one time. Or a dosage of 5-10000 mg / body, preferably 50-1000 mg / body, per patient.

본 발명의 PTHrP에 대한 항체 또는 인간형화된 항체를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물 및 고칼슘혈증억제제는 투여경로 순서로 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서 물, 의약적으로 허용되는 유기용제, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피놀리돈, 카 르복실비닐폴리머, 카르복실메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 카제인, 젤라틴, 다이글리세린, 프로필렌글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아린산, 인간혈청알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토오스, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 예로 들 수 있다. 사용된 첨가물은 본 발명의 제형에 따라 상기 중에서 또는 조합하여 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition and the hypercalcemia inhibitor including the antibody against PTHrP or the humanized antibody of the present invention as an active ingredient may also include a pharmaceutically acceptable carrier or additive in the order of administration route. Examples of such carriers and additives are water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpinolidon, carboxylvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, pectin, methylcellulose Surfactants acceptable as ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, diglycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, pharmaceutical additives Etc. can be mentioned. Additives used are selected from among, or in combination with, the formulations of the present invention, but are not limited thereto.

또한, 본 발명의 항체는 여러가지 암(악성종양)에 의해 유발되는 고칼슘혈증에 널리 사용할 수 있다. 이들 종양은 특히 한정되는 것은 아니고, 단일암 뿐만 아니라, 복수암이 함께 발병하는 경우도 포함된다. 암종으로서는 예를 들어, 췌장암, 간암, 인두암, 후두암, 설암, 치육암, 식도암, 위암, 담관암, 유방암, 자궁암, 전립선암 및 악성임파종등을 들 수 있다.In addition, the antibody of the present invention can be widely used for hypercalcemia caused by various cancers (malignant tumors). These tumors are not particularly limited, and include not only single cancers but also cases where multiple cancers develop together. Examples of the carcinoma include pancreatic cancer, liver cancer, pharynx cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, dental carcinoma, esophageal cancer, gastric cancer, bile duct cancer, breast cancer, uterine cancer, prostate cancer, and malignant lymphoma.

도 1은 본 발명의 항체 모식도이다.1 is a schematic diagram of the antibody of the present invention.

도 2는 CDR-이식 개요를 나타내는 도면이다.2 is a diagram showing a CDR-graft scheme.

도 3은 V영역의 FR 및 CDR의 평가를 나타낸 도면이다.3 shows evaluation of FR and CDR of the V region.

도 4는 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.4 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 5는 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.5 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 6은 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.6 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 7은 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.7 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 8은 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.8 shows measurement results of antibody binding activity.

도 9는 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.9 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 10은 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.10 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 11은 항체결합활성의 측정결과를 나타낸 도면이다.11 shows the results of measurement of antibody binding activity.

도 12는 인간형화된 항체의 중화활성을 나타낸 도면이다.12 shows the neutralizing activity of humanized antibodies.

도 13은 인간형화된 항체의 중화활성을 나타낸 도면이다.Figure 13 shows the neutralizing activity of humanized antibodies.

도 14는 인간형화된 항체의 중화활성을 나타낸 도면이다.14 shows the neutralizing activity of humanized antibodies.

도 15는 고칼슘혈증 모델 동물에 대한 본 발명의 항체의 효과를 나타낸 도면이다.15 is a diagram showing the effect of the antibody of the present invention on hypercalcemia model animals.

도 16은 고칼슘혈증 모델 동물에 대한 본 발명의 항체의 효과를 나타낸 도면이다.16 is a diagram showing the effect of the antibody of the present invention on hypercalcemia model animals.

도 17은 고칼슘혈증 모델 동물에 대한 본 발명의 항체의 효과를 나타낸 도면이다.17 is a diagram showing the effect of the antibody of the present invention on hypercalcemia model animals.

도 18은 고칼슘혈증 모델 동물에 대한 본 발명의 항체의 효과를 나타낸 도면이다.18 is a diagram showing the effect of the antibody of the present invention on hypercalcemia model animals.

도 19는 센서칩의 PTHrP의 고정화 샌서그램을 나타낸 도면이다.19 is a view showing an immobilized sander diagram of PTHrP of the sensor chip.

도 20은 본 발명의 항체의 속도론적 해석 결과를 나타낸 도면이다.Fig. 20 shows the results of the kinetic analysis of the antibody of the present invention.

도 21은 본 발명의 항체의 속도론적 해석 결과를 나타낸 도면이다.Fig. 21 shows the results of the kinetic analysis of the antibody of the present invention.

도 22는 본 발명의 항체의 속도론적 해석 결과를 나타낸 도면이다.Fig. 22 shows the results of the kinetic analysis of the antibody of the present invention.

도 23은 본 발명의 항체의 속도론적 해석 결과를 나타낸 도면이다.Fig. 23 shows the results of the kinetic analysis of the antibody of the present invention.

도 24는 본 발명의 항체의 속도론적 해석 결과를 나타낸 도면이다.Fig. 24 shows the results of the kinetic analysis of the antibody of the present invention.

도 25는 본 발명의 인간형화된 항체에 대하여 배설율에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타낸 도면이다.Figure 25 shows the results of experiments on the effect on the excretion rate for the humanized antibody of the present invention.

도 26은 본 발명의 인간형화된 항체에 대하여 혈장 속 인농도에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타낸 도면이다.Figure 26 shows the results of experiments on the effect on the phosphorus concentration in the plasma of the humanized antibody of the present invention.

도 27은 고칼슘혈증 마우스에 항PTHrP항체를 투여한 후 외견상의 임상적 여러 증상을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다(생물의 형태).Figure 27 is a photograph showing the results of observation of various clinical symptoms after administration of anti-PTHrP antibody to hypercalcemia mice (type of organism).

도 28은 고칼슘혈증 마우스에 항PTHrP항체를 투여한 후 외견상의 임상적 여러 증상을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다(생물의 형태).28 is a photograph showing the results of observing various clinical symptoms after administration of anti-PTHrP antibody to hypercalcemia mice (type of organism).

도 29는 고칼슘혈증 모델을 이용하여, 항PTHrP항체를 투여한 후 자발 운동량의 경일(經日) 변화를 대조군(생리 식염수 투여)와 비교한 도면이다.FIG. 29 is a diagram comparing the change in spontaneous momentum after administration of anti-PTHrP antibody with the control group (physiological saline administration) using the hypercalcemia model.

도 30은 고칼슘혈증 모델을 이용하여, 항PTHrP항체를 투여한 후 자발 운동량의 경일 변화를 대조군(생리 식염수 투여)와 비교한 도면이다.30 is a diagram comparing the change in spontaneous momentum after administration of anti-PTHrP antibody with the control group (physiological saline administration) using the hypercalcemia model.

도 31은 고칼슘혈증 모델을 이용하여, 항PTHrP항체를 투여한 후 자발 운동량의 경일 변화를 대조군(생리 식염수 투여)와 비교한 도면이다.31 is a diagram comparing the change in spontaneous momentum after administration of anti-PTHrP antibody with a control group (physiological saline administration) using a hypercalcemia model.

[발명을 실시하기 위한 바람직한 형태]Preferred Mode for Carrying Out the Invention

이하, 참고예 및 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예로 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and examples. However, the present invention is not limited to the technical scope of these Examples.

참고예1 : 항PTHrP(1-34)마우스 단일클론 항체 생산 하이브리도마의 작제 Reference Example 1 Construction of Anti-PTHrP (1-34) Mouse Monoclonal Antibody-producing Hybridomas

인간PTHrP(1-34)에 대한 단일클론 항체 생산 하이브리도마#23-57-154 및 #23-57-137-1의 작제는 좌등간이(佐藤幹二)팀에 의해 수행되었다(Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8,849-860, 1993).Monoclonal Antibody Production Against Human PTHrP (1-34) The construction of hybridomas # 23-57-154 and # 23-57-137-1 was performed by a team of left brewer (Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8,849-860, 1993).

면역원으로 사용하기 위하여, PTHrP(1-34)(Peninsula 제품)와 담체 단백인 사이로글로부린(thyrogolburin)을 카르보다이이미드(carbodiimide)(Dojinn)를 이용하여 결합하였다. 사이로글로부린과 결합한 PTHrP(1-34)를 투석하고, 단백 농도로서 2㎍/㎖가 되도록 조제한 후, 플로인트 어쥬번트(Difco)로 1 : 1로 혼합하여 에멀젼(emulsion)을 작제한 다음, 16마리의 자성 BALB/C 마우스의 등부위 피하 또는 복강내에 동물당 100 ㎍을 11회 면역하였다. 처음 면역은 플로인트 완전 어쥬번트를 이용하고, 2회째 이후의 추가면역에는 플로인트 불완전 어쥬번트를 사용하였다.For use as an immunogen, PTHrP (1-34) (from Peninsula) and the carrier protein thyrogolburin were bound using carbodiimide (Dojinn). Dialysis of PTHrP (1-34) combined with cyroglobulin and preparation to a protein concentration of 2 µg / ml, followed by mixing 1: 1 with Float Adjuvant (Difco) to prepare an emulsion, and then 16 100 μg per animal was immunized 11 times subcutaneously or intraperitoneally of female BALB / C mice. Initial immunization was done using Float Complete Adjuvant and Float Incomplete Adjuvant was used for further immunization after the second.

면역한 마우스의 혈청 속의 항체역가의 측정은 이하의 방법으로 수행하였다: 즉, 마우스 꼬리 정맥에서 채혈하고, 혈청분리 후 RIA 완충액으로 희석한 항 혈청과¹²⁵ I 표식 PTHrP(1-34)를 혼합하고, 결합활성을 측정하였다. 항체역가가 상승한 마우스의 복강에 담체 단백을 결합하지 않은 PTHrP(1-34)를 동물 당 50 ㎍을 최종 면역하였다. Determination of antibody titers in the serum of immunized mice was performed by the following methods: blood collection from mouse tail vein, antisera diluted with RIA buffer after serum separation, and ¹²⁵ I-labeled PTHrP (1-34). , Binding activity was measured. 50 μg per animal was finally immunized with PTHrP (1-34) without carrier protein in the abdominal cavity of mice with elevated antibody titers.

최종 면역 3일째에 마우스를 도살하고, 비장을 적출한 후, 비장 세포와 마우스 마엘로마 세포주 P3x63Ag8U.1을 50% 폴리에틸렌글리콜 4000을 이용하는 통상의 방법에 따라 세포 융합하였다. 세포융합한 세포를 2 ×10⁴/웰의 세포수로 85매의 96-웰 플레이트에 분배하고, 하이브리도마의 선별은 HAT배지를 이용하여 수행하였다.On day 3 of the last immunization, mice were slaughtered and spleens were removed, and the spleen cells and mouse maeloma cell line P3x63Ag8U.1 were fused in the usual manner using 50% polyethyleneglycol 4000. The fusion cells were distributed in 85 96-well plates at a cell number of 2 × 10 ⁴ / well, and hybridoma selection was performed using a HAT medium.

하이브리도마의 선별은 HAT 배지속에서 생육하는 것이 확인된 웰의 배양상등액을 고정화 RIA법으로 PTHrP 인식 항체의 유무를 측정하여 선택함으로써 수행하였다. 항체와의 결합능이 확인된 웰으로부터 하이브리도마를 회수하고, 15% FCS를 포함하는 RPMI-1640에 OPI-supplement(Sigma)를 첨가한 배지에 현탁하고, 한계희석법으로 하이브리도마의 단일화를 실시하였다. PTHrP(1-34)와의 결합능이 강한 클론 #23-57-154 및 #23-57-137-1을 수득하였다.Hybridoma selection was performed by selecting the culture supernatant of the wells confirmed to be grown in HAT medium by measuring the presence or absence of PTHrP recognition antibody by immobilized RIA method. Hybridomas were recovered from the wells with confirmed binding ability, suspended in medium containing OPI-supplement (Sigma) in RPMI-1640 containing 15% FCS, and hybridomas were unified by limiting dilution. It was. Clones # 23-57-154 and # 23-57-137-1 with strong binding to PTHrP (1-34) were obtained.

또한, 하이브리도마 클론#23-57-137-1은 mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1로서, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 평성 8년 8월 15일에 FERM BP-5613으로 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁하였다.In addition, hybridoma clone # 23-57-137-1 is a mouse-mouse hybridoma # 23-57-137-1, and the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (Institute of Industry and Technology, Higashi, Ibarakiken, Higashi 1-chome, 1 and 3) On August 15, 8, he made an international deposit with FERM BP-5613 under the Budapest Treaty.

실시예1 : 인간PTHrP(1-34)에 대한 마우스 단일클론 항체의 V영역을 코딩하 Example 1 : Encoding V region of mouse monoclonal antibody against human PTHrP (1-34)

는 DNA의 클로닝 Cloning of the DNA

인간 PTHrP(1-34)에 대한 마우스 단일클론 항체 #23-57-137-1의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 다음과 같은 방법으로 클로닝하였다.DNA encoding the variable region of mouse monoclonal antibody # 23-57-137-1 against human PTHrP (1-34) was cloned in the following manner.

(1) mRNA의 작제(1) Construction of mRNA

하이브리도마 #23-57-137-1 으로부터 mRNA를 Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech 사)를 이용하여 조제하였다. 하이브리도마 #23-570137-1의 세포를 추출 완충액으로 완전히 균질화하고, 올리고(dT)-셀룰로오스-스핀컬럼 (Oligo(dT)-Cellulose Spun Column)으로 mRNA를 정제하고, 에탄올 침전을 수행하였다. 수득된 mRNA 침전물은 용출 완충액에 용해하였다.MRNA from hybridoma # 23-57-137-1 was prepared using the Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech). Cells of hybridoma # 23-570137-1 were completely homogenized with extraction buffer, mRNA was purified with oligo (dT) -Cellulose Spun Column and ethanol precipitation was performed. The obtained mRNA precipitate was dissolved in the elution buffer.

(2) 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 유전자의 cDNA의 작제 및 증폭(2) Construction and amplification of cDNA of gene encoding mouse H chain V region

(i) #23-57-137-1 항체 H쇄V영역 cDNA의 클로닝(i) Cloning of # 23-57-137-1 antibody H chain V region cDNA

인간PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 H쇄V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝은 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1998; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 의해 수행하였다. 5'-RACE 법에는 5'-Ampli FINDER RACE kit(CLONETECH 사)를 이용하고, 조작은 키트 첨부의 처방에 따라 수행하였다. cDNA 합성에 사용하는 프라이머는 마우스 H쇄 정상영역(C영역)과 결합한 MHC2 프라이머(서열번호1)를 이용하였다. 전기 방법으로 조제한 mRNA 약 2 ㎍을 주형으로 MHC2 프라이머 10 pmole을 가하여, 역전사효소와 52 ℃, 30분간 반응시킴으로써 cDNA로의 역전사를 수행하였다.Cloning of the DNA encoding the H chain V region of a mouse monoclonal antibody against human PTHrP was performed by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1998). Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). In the 5'-RACE method, a 5'-Ampli FINDER RACE kit (CLONETECH Co., Ltd.) was used, and the operation was performed according to the prescription attached to the kit. As primers used for cDNA synthesis, an MHC2 primer (SEQ ID NO: 1) coupled with the mouse H chain constant region (C region) was used. About 2 μg of the mRNA prepared by the above method was added as a template to 10 pmole of MHC2 primer, and reverse transcription to cDNA was performed by reacting with a reverse transcriptase at 52 ° C. for 30 minutes.

6N NaOH로 RNA를 가수분해(65 ℃, 30분간)한 후, 에탄올 침전에 의해 cDNA를 정제하였다. T4RNA 리가제로 37 ℃로 6시간, 실온으로 16시간 반응함으로써 합성한 cDNA의 5'말단에 Ampli FINDER Anchor(서열번호 42)를 연결하였다. 이것을 주형으로 PCR에 의해 증폭하기 위한 프라이머로서 Anchor 프라이머(서열번호 2) 및 MHC-G1 프라이머(서열번호 3)(S. T. Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991)을 사용하였다. RNA was hydrolyzed (65 ° C., 30 min) with 6N NaOH, and then cDNA was purified by ethanol precipitation. Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) was connected to the 5 'end of the synthesized cDNA by reacting with T4RNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours. Anchor primer (SEQ ID NO: 2) and MHC-G1 primer (SEQ ID NO: 3) (S. T. Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991) were used as primers to amplify this by PCR as a template.

PCR용액은 그 50 ㎕ 속에 10 mM Tris-HCI(pH 8.3), 50 mM KC1, 0.25 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl₂ , 2.5 유니트의 TaKaRa Taq(다까라 주조), 10 pmole 의 Anchor 프라이머, 및 MHC-G1프라이머-및 Ampli FINDER Anchor를 연결한 cDNA의 반응혼합물 1 ㎕를 함유하며, 반으시에는 이 용액에 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하였다. PCR은 Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer)를 이용하여, 94 ℃로 45초간, 60℃로 45초간, 72 ℃로 2분간의 온도 사이클로 30회 수행하였다.The PCR solution was diluted in 50 μl of 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 50 mM KC1, 0.25 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl ₂ , 2.5 units of TaKaRa Taq (cast). 1 μl of the reaction mixture of 10 pmole Anchor primer and cDNA linked to the MHC-G1 primer- and Ampli FINDER Anchor was contained, and 50 μl of mineral oil was superimposed on the solution. PCR was performed 30 times with a thermal cycler Model 480J (Perkin Elmer), a temperature cycle of 45 seconds at 94 ℃, 45 seconds at 60 ℃, 2 minutes at 72 ℃.

(ii) #23-57-137-1 항체 L쇄V영역의 cDNA의 클로닝(ii) Cloning of cDNA of # 23-57-137-1 antibody L chain V region

인간 PTHrP에 대한 마우스 모노클로널의 L쇄V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝은 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1998; Belyavski, A. et al., Nucleim Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 의해 수행하였다. 5'-RACE법에는 5'-Ampli Finder RACE Kit(Clonetech)를 이용하고, 조작은 키트 첨부의 처방에 따라 수행하였다. cDNA 합성에 사용하는 프라이머는 마우 스 oligo-dT 프라이머를 이용하였다. 전기 방법으로 조제한 mRNA 약 2 ㎍을 주형으로 oligo-dT 프라이머를 가하여, 역전사효소와 52 ℃, 30분간 반응시킴으로써 cDNA로의 역전사를 수행하였다. 6N NaOH로 RNA를 가수분해(65 ℃, 30분간)한 후, 에탄올 침전에 의해 cDNA를 정제하였다. 합성한 cDNA의 5'말단에 전기 Ampli FINDER Anchor를 T4RNA 리가제로 37 ℃로 6시간, 실온으로 16시간 반응시킴으로써연결하였다. Cloning of the DNA encoding the L chain V region of the mouse monoclonal to human PTHrP is described by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1998; Belyavski, A. et al., Nucleim Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). In the 5'-RACE method, a 5'-Ampli Finder RACE Kit (Clonetech) was used, and the operation was carried out according to the prescription attached to the kit. As a primer for cDNA synthesis, a mouse oligo-dT primer was used. About 2 μg of the mRNA prepared by the above method was added to the oligo-dT primer as a template, and the reverse transcription to cDNA was performed by reacting the reverse transcriptase with 52 ° C. for 30 minutes. RNA was hydrolyzed (65 ° C., 30 min) with 6N NaOH, and then cDNA was purified by ethanol precipitation. The 5 'end of the synthesized cDNA was connected by reacting the electric Ampli FINDER Anchor with T4RNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours.

마우스L쇄λ쇄 정상 영역의 보존서열로부터 PCR 프라이머MLC(서열번호 4)를 설계하고, 394 DNA/RNA 합성기(ABI 사)를 이용하여 합성하였다. PCR 용액은 그 100㎕ 속에 10mM Tris-HC1(pH 8.3), 50mM KCl, 0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl₂ , 2.5 유니트의 AmpliTaq(PERKIN ELMER), 50 pmole의 Anchor 프라이머(서열번호 2), 및 MLC(서열번호 4) 및 Ampli FINDER Anchor을 연결한 cDNA의 반응혼합물 1 ㎕를 함유하며, 반응시에는 이 용액에 50㎕의 미네랄오일을 상층하였다. PCR은 Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer)를 이용하고, 94 ℃로 45초간, 60℃로 45초간, 72 ℃로 2분간의 온도 사이클로 35회 수행하였다.PCR primer MLC (SEQ ID NO: 4) was designed from the conserved sequences of the mouse L chain λ chain normal regions, and synthesized using a 394 DNA / RNA synthesizer (ABI). PCR solution was prepared in 100 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.25 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mM MgCl ₂ , 2.5 units of AmpliTaq (PERKIN ELMER), 50 pmole of Anchor 1 μl of a reaction mixture of a primer (SEQ ID NO: 2) and a cDNA linking MLC (SEQ ID NO: 4) and an Ampli FINDER Anchor was contained, and 50 μl of mineral oil was superimposed on the solution. PCR was performed using a thermal cycler model 480J (Perkin Elmer), 35 cycles of temperature at 94 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes.

(3) PCR 생성물의 정제 및 절편화(3) Purification and fragmentation of PCR products

전기 방법으로 PCR법에 의해 증폭한 DNA 절편을 3% Nu Sieve GTG 아가로오스 (FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. H쇄V영역으로서 약 550 bp 길이, L쇄V영역으로 약 550 bp 길이의 DNA 절편을 함유하는 아가로오스편을 잘라내어, GENECLEAN II Kit(BIO101)을 이용하여, 키트 첨부의 처방에 따라 DNA 절편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올로 친점시킨 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다. 수득한 DNA 용액 1 ㎕를 제한효소 XmaI(New England Biolabs)에 의해 37 ℃로 1시간 절단하였다. 이 절단 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의해 DNA을 회수하였다.DNA fragments amplified by PCR by the above method were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio. Products). Agarose fragments containing DNA fragments of about 550 bp in length and approximately 550 bp in L chain V region are cut out, and DNA fragments are prepared according to the prescription of the kit using GENECLEAN II Kit (BIO101). Was purified. Purified DNA was intimate with ethanol and dissolved in 20 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA solution. 1 μl of the obtained DNA solution was cut at 37 ° C. by restriction enzyme XmaI (New England Biolabs) for 1 hour. This cleavage mixture was extracted with phenol and chloroform and the DNA was recovered by ethanol precipitation.

이러한 방법으로 5'-말단에 EcoRI 인식 서열을 가지고, 3'-말단에 XmaI인식서열을 가지는 마우스H쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 수득하였다.In this manner, DNA encoding the mouse H chain V region and DNA encoding the L chain V region having an EcoRI recognition sequence at the 5'-end and an XmaI recognition sequence at the 3'-end were obtained.

상기 방법으로 조제한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 EcoRI-XmaI DNA 절편과 EcoRI 및 XmaI로 절단함으로써 조제한 pUC19 벡터를 DNA 라이게이션 키트 ver. 2(다까라 주조)를 이용하여, 첨부된 처방에 따라 16 ℃로 1시간 반응시켜 연결하였다. 다음으로, 10 ㎕의 상기 연결혼합물을 대장균 JM109 컴피덴트 세포(닛폰 진) 100㎕에 가하여, 이 세포를 빙상에서 15분간, 42 ℃로 1분간, 또한 빙상에서 1분간 정치하였다. 다음으로 300 ㎕의 SOC 배지 (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)를 가하여, 37℃로 30분간 배양한 다음, 100 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖의 엠피실린, 0.1 mM의 IPTG, 20 ㎍/㎖의 X-gal을 포함하는 LB한천배지 또는 2xYT한천배지(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)상에 이 대장균을 도말하고, 37 ℃로 하룻밤 배양하여 대장균 형질전환체를 수득하였다. The DNA ligation kit ver. Was prepared by cutting the EcoRI-XmaI DNA fragment containing DNA encoding the mouse H-chain V region and DNA encoding the L-chain V region and pUC19 vector prepared by cutting with EcoRI and XmaI. Using 2 (Tadaka casting), the reaction was carried out at 16 ° C. for 1 hour according to the attached prescription. Next, 10 µl of the above-mentioned linkage mixture was added to 100 µl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the cells were allowed to stand on ice for 15 minutes, at 42 ° C for 1 minute, and on ice for 1 minute. Next, 300 μl of SOC medium (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, followed by 100 μg / ml or 50 μg / ml. On LB agar medium or 2 × YT agar medium containing empicillin, 0.1 mM IPTG, 20 μg / ml X-gal (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) E. coli was smeared and cultured overnight at 37 DEG C to obtain an E. coli transformant.

이 형질전환체를 100 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖의 엠피실린을 함유하는 LB배지 또는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 37 ℃로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 플라스미드 추출기 PI-100 ∑(클라보우)또는 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드 DNA를 조제하고, 이에 대한 염기서열을 분석하였다.The transformant was incubated overnight at 37 ° C. in LB medium containing 100 μg / ml or 50 μg / ml of empicillin or 2 ml of 2 × YT medium at 37 ° C., and the plasmid extractor PI-100 from the bacterial batch Alternatively, plasmid DNA was prepared using QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN), and the nucleotide sequence thereof was analyzed.

(4) 마우스항체 V영역을 코딩하는 DNA의 염기서열 결정(4) Determination of the base sequence of the DNA encoding the mouse antibody V region

전기 플라스미드 속의 cDNA 코딩 영역의 염기서열을 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin-Elmer))를 이용하고, DNA 시퀀서 373A(ABI 사 Perkin-Elmer)에 의해 결정하였다. 서열결정용 프라이머로서 M13 Primer M4(다까라 주조)(서열번호 5) 및 M13 Primer RV (다까라 주조)(서열번호 6)을 이용하여, 양방향의 염기서열을 확인함으로써 서열을 결졍하였다.The base sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by a DNA Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) using a DNA sequencer 373A (Perkin-Elmer, ABI). The sequences were determined by confirming bidirectional sequencing using M13 Primer M4 (Takara Casting) (SEQ ID NO: 5) and M13 Primer RV (Takara Casting) (SEQ ID NO: 6) as primers for sequencing.

이러한 방법으로 수득한 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 'MBC1L24'라고 명명하였다. 플라스미드 MBC1H04 및 MBC1L24에 포함되는 마우스#23-57-137-1 항체의 H쇄V영역 및 L쇄V영역을 코딩하는 DNA의 염기서열(대응하는 아미노산 서열을 포함한다)을 각각 서열번호 57, 65로 나타낸다. H쇄V영역을 포함하는 폴리펩티드 및 L쇄V영역을 포함하는 폴리펩티드는 어느 것이라도 각각 서열번호 57, 65로 표시되는 연기서열의 제 58번째(글루타민(glutamine)을 코딩한다)로부터 개시되어 있다. 이들 아미노산 서열을 H쇄V영역을 포함하는 폴리펩티드에 대해서는 서열번호 46, L쇄V영역을 포함하 는 폴리펩티드에 애해서는 서열번호 45로 나타낸다.The plasmid containing the DNA encoding the mouse H chain V region derived from hybridoma # 23-57-137-1 obtained in this manner was named 'MBC1L24'. The base sequences (including the corresponding amino acid sequences) of the DNA encoding the H chain V region and L chain V region of the mouse # 23-57-137-1 antibodies contained in the plasmids MBC1H04 and MBC1L24 were SEQ ID NOs: 57 and 65, respectively. Represented by The polypeptide comprising the H chain V region and the polypeptide comprising the L chain V region are disclosed from the 58th (encoding glutamine) of the smoke sequence represented by SEQ ID NOs: 57 and 65, respectively. These amino acid sequences are shown in SEQ ID NO: 46 for polypeptides containing an H chain V region and SEQ ID NO: 45 for polypeptides containing an L chain V region.

또한, 전기 플라스미드 MBC1H04 및 MBC1L24를 가지는 대장균은 Escherichia coli JM109(MBC1H04) 및 Escherichia coli JM109(MBC1L24)로서, 공업기술원 생명공학 공업 기술연구소(이바라키켄 쯔구바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 평성 8년 8월 15일에 Escherichia coli JM109(MBC1H04)에 애해서는 FERM BP-5628; 및 Escherichia coli JM109(MBC1H04)에 대해서는 FERM BP-5627로서 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁하였다.In addition, Escherichia coli JM109 (MBC1H04) and Escherichia coli JM109 (MBC1L24), which have the electric plasmids MBC1H04 and MBC1L24, were evaluated in the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (Ibarakiken Tsugubashi Higashi 1-chome 1 and 3). FERM BP-5628 for Escherichia coli JM109 (MBC1H04) on 15 August; And Escherichia coli JM109 (MBC1H04) were deposited internationally in accordance with the Budapest Treaty as FERM BP-5627.

(5) 인간PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체 #23-57-137-1의 CDR의 결정(5) Determination of CDRs of Mouse Monoclonal Antibody # 23-57-137-1 Against Human PTHrP

H쇄V영역 및 L쇄V영역의 전반 구조는 사로 유사성을 가지고 있고, 각각 4가지의 프레임워크 부분이 3가지의 초가변영역, 즉, 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. 프레임 워크의 아미노산 서열은 비교적 잘 보전되어 있으나, 한편, CDR영역의 아미노산 서열의 가변성은 극히 높다(Kabat, E. A. et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983).The first half structure of the H chain V region and the L chain V region has a similarity to each other, and four framework portions are connected by three hypervariable regions, that is, complementarity determining regions (CDRs). While the amino acid sequence of the framework is relatively well preserved, the variability of the amino acid sequence of the CDR regions is extremely high (Kabat, EA et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983). .

이와 같은 사실에 근거하여, 인간 PTHrP에 대한 마우스 단일클론 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 카밧 등에 의해 작성된 항체의 아미노산 서열의 데이터베이스에 적용시켜서, 상동성을 조사함으로써 CDR영역을 표2에 나타낸 바와 같이 결정하였다.Based on this fact, the CDR regions were determined by applying the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP to the database of the amino acid sequence of the antibody prepared by Kabat et al. Decided.

V영역 V area 서열번호 SEQ ID NO: CDR 1 CDR 1 CDR2 CDR2 CDR3 CDR3 H쇄V영역 H-chain V area 57 57 31 - 35 31-35 50 - 66 50-66 99 - 107 99-107 L쇄V영역 L-chain V area 65 65 23 - 34 23-34 50 - 60 50-60 93 - 105 93-105

실시예 2 : 키메라 항체의 구축 Example 2 Construction of Chimeric Antibodies

(1) 키메라 항체H쇄의 구축(1) Construction of chimeric antibody H chain

(i) H쇄V영역의 구축(i) Construction of H-chain V area

인간H쇄C영역 Cλ1의 게놈DNA를 포함하는 발현벡터에 연결하기 위하여 클로닝한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 PCR법에 의해 수식하였다: 후방 프라이머 MBC1-S1(서열번호 7)은 V영역의 리더 서열의 5'-측을 코딩하는 DNA에 결합하고, 또한, 코작 콘센서스 서열(Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)및 제한효소 Hind III의 인식서열을 가지도록 설계하였다. 전방 프라이머MBC1-a(서열번호 8)은 J영역의 3'-측을 코딩하는 DNA 서열에 결합하고, 또한, 스플라이스 도너 서열 및 제한효소 BamHI의 인식서열을 가지도록 설계하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq (다까라 주조)를 이용하여, 50 ㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.07 ㎍의 플라스미드 MBC1H04, 프라이머로서 MBC1-a 및 MBC1-S1을 각각 50 pmole, 2.5 U의 TaKaRa Ex Taq, 0.25 mM의 dNTP 포함하는 조건으로 첨가 완충액을 사용하여 50 ㎕의 미네랄오일을 상등하고, 94℃로 1분간, 55℃로 1분간, 72℃로 2분간의 온도 사이클로 30 회 수행하였다. PCR법에 의해 증폭한 DNA 절편을 3% Nu Sieve GTG 아가 로오스(FMC Bio. Products)를 이용하여 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다.DNA encoding the mouse H chain V region cloned in order to connect to the expression vector containing the genomic DNA of human H chain C region Cλ1 was modified by PCR: the rear primer MBC1-S1 (SEQ ID NO: 7) is a V region. Binds to the DNA encoding the 5'-side of the leader sequence of and also contains the Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and restriction enzyme Hind. It is designed to have the recognition sequence of III. The forward primer MBC1-a (SEQ ID NO: 8) was designed to bind to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region and also to have a splice donor sequence and a recognition sequence of restriction enzyme BamHI. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), in 50 μl reaction mixture, 0.07 μg of plasmid MBC1H04 as template DNA, MBC1-a and MBC1-S1 as primers, 50 pmole, 2.5 U TaKaRa Ex Taq, respectively. 50 μl of mineral oil was equalized using addition buffer with 0.25 mM dNTP and subjected to 30 cycles of temperature at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes. DNA fragments amplified by PCR were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

437bp 길이의 DNA 절편를 함유하는 아가로오스 젤 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit(BI0101)을 이용하여, 키트 첨부의 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올 침전으로 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다. 수득한 DNA 용액 1 ㎕를 제한효소 BamHI, Hind III(다까라 주조)에 의해 37 ℃ 1시간 절단하였다. 이 절단혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의해 DNA을 회수하였다.The agarose gel portion containing the 437 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the kit attachment. The purified DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in 20 µl of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution. 1 μl of the obtained DNA solution was cut at 37 ° C. for 1 hour by restriction enzymes BamHI, Hind III (Tadaka casting). The cleaved mixture was extracted with phenol and chloroform and the DNA was recovered by ethanol precipitation.

상기 방법으로 조제한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 Hind III-BamHI DNA 절편을 Hind III 및 BamHI로 절단함으로써 조제한 pUC19 벡터에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위하여, 프라이머 M13 Primer M4 및 M13 Primer RV를 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin-Elmer))를 이용하고, DNA 시퀀서 373A(Perkin-Elmer)에 의해 염기서열을 결정하였다. 올바른 염기서열을 가지는 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 가지고, 5'-측에 Hind III 인식서열 및 코작 서열, 3'-측에 BamHI 인식서열을 가지는 플라스미드를 'MBC1H/pUC19'로 명명하였다.Hind III-BamHI DNA fragments containing DNA encoding the mouse H chain V region prepared by the above method were subcloned into pUC19 vectors prepared by cleavage with Hind III and BamHI. In order to confirm the nucleotide sequence of this plasmid, primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV were used with a Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer), followed by DNA sequencer 373A (Perkin-Elmer). The base sequence was determined. Having a DNA encoding a mouse H chain V region derived from hybridoma # 23-57-137-1 having the correct nucleotide sequence, Hind III recognition sequence and Kozak sequence on 5 'side, BamHI on 3' side The plasmid having the recognition sequence was named 'MBC1H / pUC19'.

(ii) cDNA 타입의 마우스-인간 키메라H쇄를 작제하기 위한 H쇄V영역의 구축(ii) Construction of H-chain V region for constructing mouse-human chimeric H-chain of cDNA type

인간 H쇄C영역 Cλ1의 cDNA와 연결하기 위하여 상기 방법으로 구축한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 PCR법에 의해 수식하였다: H쇄V영역을 수식하기 위한 후방 프라이머MBC1HVS2(서열번호 9)는 V영역의 리더 서열의 최초를 코딩하는 서열의 2번의 아스파라긴산을 글리신으로 변환하고, 또한, 코작 콘센서스 서열(Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)및 Hind III 및 EcoRI 인식서열을 가지도록 설계하였다. H쇄V영역을 수식하기 위한 전방 프라이머MBC1HVR2(서열번호 10)은 J영역의 3'-측을 코딩하는 DNA 서열에 결합하고, 또한, C영역의 5'-측의 서열을 코딩하고 Apa I 및 Sam I 인식서열을 가지도록 설계하였다.The DNA encoding the mouse H chain V region constructed by the above method was linked by PCR to connect with the cDNA of the human H chain C region Cλ1: back primer for modifying the H chain V region MBC1HVS2 (SEQ ID NO: 9) Converts 2 aspartic acids of the sequence encoding the first of the leader sequence of the V region to glycine, and also the Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and Hind III and EcoRI recognition sequences. The front primer MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) for modifying the H chain V region binds to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region, and also encodes the 5'-side sequence of the C region and Apa I and It is designed to have Sam I recognition sequence.

PCR은 TaKaRa Ex Taq (다까라 주조)를 이용하여, 50 ㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.6 ㎍의 플라스미드 MBC1H/pUC19, 프라이머로서 MBC1HVS2 및 MBC1HVR2를 각각 50 pmole, TaKaRa Ex Taq를 2.5 U, 0.25 mM의 dNTP를 포함하는 조건으로, 첨부된 완충액을 사용하여, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하여 94 ℃ 1분간, 55 ℃ 1분간, 72 ℃ 1분간의 온도 사이클로 30회 수행하였다. PCR법에 의해 증폭한 DNA절편을 1 % Sea Kem GTG 아가로오스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 456 bp 길이의 DNA절편을 함유하는 아가로오스 젤 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit (BI0101)을 이용하고, 키트에 첨부된 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올 침전시킨 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다.PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), 50 μl of plasmid MBC1H / pUC19 as template DNA, MBC1HVS2 and MBC1HVR2 as primer, 50 pmole and TaKaRa Ex Taq 2.5 U, 0.25 mM in 50 μl reaction mixture, respectively. Under conditions including dNTP, 50 μl of mineral oil was superimposed on the attached buffer solution for 30 times at a temperature cycle of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute. DNA fragments amplified by PCR were isolated by agarose gel electrophoresis using 1% Sea Kem GTG Agarose (FMC Bio. Products). The agarose gel portion containing the 456 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the prescription attached to the kit. The purified DNA was ethanol precipitated, and then dissolved in 20 µl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution.

수득한 DNA용액 1 ㎕를 제한효소 EcoRI 및 Smal (다까라 주조)에 의해 37 ℃로 1시간 절단하였다. 이 절단혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의해 DNA을 회수하였다. 상기 방법으로 조제한 마우스 H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 EcoRI-SmaI DNA 절편을, EcoRI 및 Smal로 절단함으로써 조제한 pUC19 벡터에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위하여, 프라이머 M13 Primer M4 및 M13 Primer RV를 프라이머로서 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Perkin-Elmer)를 이용하고, DNA 시퀀서 373A(Perkin-Elmer)에 의해 염기서열을 결정하였다. 올바른 염기서열을 가지는 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 가지고, 5'-측에 Hind III 인식서열 및 Kozak 서열, 3'-측에 ApaI 및 SmaI 인식서열을 가지는 플라스미드를 'MBC1Hv/pUC19'로 명명하였다.1 μl of the obtained DNA solution was cut at 37 ° C. for 1 hour by restriction enzymes EcoRI and Smal. The cleaved mixture was extracted with phenol and chloroform and the DNA was recovered by ethanol precipitation. EcoRI-SmaI DNA fragments containing DNA encoding the mouse H chain V region prepared by the above method were subcloned into pUC19 vectors prepared by digestion with EcoRI and Smal. In order to confirm the nucleotide sequence of this plasmid, the nucleotide sequence was determined by using DNA terminator cycle sequencing kit (Perkin-Elmer) using primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV as primers, and by DNA sequencer 373A (Perkin-Elmer). . Having the DNA encoding the mouse H chain V region derived from hybridoma # 23-57-137-1 having the correct nucleotide sequence, Hind III recognition sequence on the 5 'side and Kozak sequence, ApaI on the 3' side And the plasmid having the SmaI recognition sequence was named 'MBC1Hv / pUC19'.

(iii) 키메라 항체 H쇄의 발현벡터의 구축(iii) Construction of expression vector of chimeric antibody H chain

인간 항체H쇄C영역Cγ1을 포함하는 cDNA는 이하의 방법으로 조제하였다: 즉, 인간형화된 PM1항체의 H쇄V영역 및 인간항체 H쇄C영역CγIgG1의 게놈 DNA(N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982)을 코딩하는 발현벡터-DHFR-△E-RVh-PM-1-f(WO92/19759 참조)와 인간형화된 PM1항체 L쇄V영역의 DNA 및 인간 항체L쇄κ쇄C영역의 게놈 DNA를 코딩하는 발현벡터-RV1-PM1a(WO92/19759 참조)를 도입한 CHO 세포로부터 mRNA를 조제하고, RT-PCR법으로 인간형화된 PM1항체 H쇄V영역및 인간항체 C영역 Cλ1을 포함하는 cDNA를 클로닝하고, puC19의 Hind III와 BamHI 부위에 서브클로닝하였다. 염기서열을 확인한 후, 올바른 서열을 가지는 플라스미드를 'pRVh-PM1f-cDNA'라고 명명하였다.The cDNA comprising the human antibody H chain C region Cγ1 was prepared by the following method: genomic DNA of the H chain V region and human antibody H chain C region CγIgG1 of humanized PM1 antibody (N. Takahashi, et al. , DNA 29 and human antibody L chain of humanized PM1 antibody L chain V region with expression vector-DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f (see WO92 / 19759) encoding Cell 29, 671-679 1982). mRNA prepared from CHO cells into which the expression vector-RV1-PM1a (see WO92 / 19759) encoding genomic DNA of the κ-chain C region was prepared and humanized PM1 antibody H-chain V region and human antibody by RT-PCR method CDNA containing C region Cλ1 was cloned and subcloned into Hind III and BamHI sites of puC19. After confirming the nucleotide sequence, the plasmid having the correct sequence was named 'pRVh-PM1f-cDNA'.

DHFR-△E-RVh-PM-1-f상의 SV 40 프로모터와 DHFR 유전자와의 사이에 존재하는 Hind III 부위, 및 EF-1α프로모터와 인간형화된 PM1항체H쇄V영역과의 사이에 존재하는 EcoRI 부위를 결실한 발현벡터를 작제하고, 인간형화된 PM1 항체H쇄V영역 및 인간항체 C영역 Cλ1을 포함하는 cDNA의 발현벡터의 구축을 위해 사용하였다.Hind III site between SV 40 promoter and DHFR gene on DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f and between humanized PM1 antibody H chain V region of EF-1α promoter An expression vector lacking an EcoRI site was constructed and used for construction of an expression vector of cDNA comprising a humanized PM1 antibody H chain V region and a human antibody C region Cλ1.

pRVh-PM1f-cDNA를 BamHI로 절단한 후, Klenow 플라그멘트로 평활화하고, 또한, Hind III로 절단하고, Hind III-BamHI 평활화 절편을 조제하였다. 이 Hind III-BamHI 평활화 절편을 상기 Hind III 부위 및 EcoRI 부위가 결실하였다. DHFR-△E-RVh-PM1-f를 Hind III 및 Smal로 절단함으로써 조제한 발현벡터에 연결하고, 인간형화된 PM1항체 H쇄V영역 및 인간 항체 C영역Cλ1을 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현벡터 RVh-Rm1f-cDNA를 구축하였다. pRVh-PM1f-cDNA was cleaved with BamHI, then smoothed with Klenow fragment, further cleaved with Hind III, and Hind III-BamHI smoothed fragments were prepared. This Hind III-BamHI smoothed fragment deleted the Hind III site and the EcoRI site. An expression vector RVh comprising a cDNA encoding humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody C region Cλ1, linked to an expression vector prepared by cleaving DHFR-ΔE-RVh-PM1-f with Hind III and Smal. -Rm1f-cDNA was constructed.

인간형화된 PM1 항체 H쇄V영역 및 인간항체C영역Cλ1을 코딩하는 cDNA 를 포함하는 발현벡터 RVh-PM1f-cDNA를 ApaI 및 BamHI로 절단한 후, H쇄C영역을 포함하는 DNA 절편을 회수하고, ApaI 및 BamHI로 절단함으로써 조제한 MBC1Hv/pUC19에 도입하였다. 이러한 방법으로 작제한 플라스미드를 'MBC1HcDNA/pUC19'로 명명하였다. 이 플라스미드는 마우스 항체의 H쇄V영역 및 인간 항체 C영역Cλ1을 코딩하는 cDNA 절편을 EcoRI 및 BamHI로 절단하고, EcoRI 및 BamHI로 절단함으로써 조재한 발현 백터 pCOS1에 도입하였다. 이러한 방법으로 수득한 키메라 항체의 발현 플라스미드를 'MBC1HcDNA/pCOS1'라고 명명하였다. 또한, 발현벡터pCOS1은 HEF-PMh-gλ1(WO92/19759 참조)로부터 EcoRI 및 SmaI 절단에 의해 항체 유전자를 제거하고, EcoRI-NotI-BamHI Adaptor(다까라 주조)를 연결함으로써 구축하였다.After digesting the expression vector RVh-PM1f-cDNA comprising the humanized PM1 antibody H chain V region and cDNA encoding human antibody C region Cλ1 with ApaI and BamHI, DNA fragments containing the H chain C region were recovered. It was introduced into MBC1Hv / pUC19 prepared by cleavage with, ApaI and BamHI. The plasmid constructed in this way was named 'MBC1HcDNA / pUC19'. This plasmid was introduced into the expression vector pCOS1 prepared by cleaving the cDNA fragments encoding the H chain V region and the human antibody C region Cλ1 of the mouse antibody with EcoRI and BamHI and cutting with EcoRI and BamHI. The expression plasmid of the chimeric antibody obtained by this method was named 'MBC1HcDNA / pCOS1'. In addition, the expression vector pCOS1 was constructed by removing the antibody gene by EcoRI and SmaI cleavage from HEF-PMh-gλ1 (see WO92 / 19759), and linking the EcoRI-NotI-BamHI Adaptor (Cadaka casting).

또한, CHO 세포에서의 발현에 이용하기 위한 플라스미드르 작제하기 위해, 플라스미드 MBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI로 절단하고, 수득한 키메라 항체 H 쇄 서열을 포함하는 DNA 절편을 EcoRI 및 BamHI로 절단함으로써 조재한 발현플라스미드 pCHO1에 도입하였다. 이러한 방법으로 수득한 키메라 항체의 발현 플라스미드를 'MBC1HcDNA/pCHO1'라고 명명하였다. 또한, 발현벡터 pCHO1은 DEFR-△E-rvH-PM1-f(WO92/19759 참조)로부터 EcoRI 및 SamI 절단에 의한 항체 유전자를 제거하고, EcoRI-NotI-BamHI Adaptor(다까라 주조)를 연결함으로써 구축하였다.In addition, expression was prepared by digesting plasmid MBC1HcDNA / pUC19 with EcoRI and BamHI and cutting the DNA fragment containing the obtained chimeric antibody H chain sequence with EcoRI and BamHI to construct a plasmid for use in expression in CHO cells. It was introduced into plasmid pCHO1. The expression plasmid of the chimeric antibody obtained by this method was named 'MBC1HcDNA / pCHO1'. In addition, the expression vector pCHO1 was constructed by removing the antibody gene by EcoRI and SamI cleavage from DEFR-ΔE-rvH-PM1-f (see WO92 / 19759) and linking EcoRI-NotI-BamHI Adaptor It was.

(2) 인간L쇄 정상영역의 구축(2) Construction of human L chain normal region

(i) 클로닝 벡터의 작제(i) Construction of Cloning Vectors

인간 L쇄 정상영역을 포함하는 pUC19 벡터를 구축하기 위하여, Hind III 부위 결실 pUC19 벡터를 작제하였다: pUC19 벡터 2 ㎍를 20 mM Tris-HC1(pH 8.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8U의 Hind III(다까라 주조)를 포함하는 반응혼합액 20 ㎕속에 37 ℃로 1시간 절단하였다. 절단혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올 침전에 의해 회수하였다.To construct a pUC19 vector comprising a human L-chain normal region, a Hind III site deletion pUC19 vector was constructed: 2 μg of the pUC19 vector was 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 100 The reaction mixture containing mM KCl, 8 U Hind III (Castle Cast) was cut at 37 ° C. for 1 hour. The cleavage mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.

회수한 DNA를 50 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10 mM MgCl₂ , 1 mM DTT, 100 mM Nacl, 0.5 mM dNTP, 6 U의 클레나우 플라그먼트(GIBCO BRL)을 포함하는 50 ㎕의 반응혼합액 속에 실온에서 20분간 반응시켜, 말단을 평활화시켰다. 반응혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 벡터 DNA를 에탄올 침전에 의해 회수하였다.The recovered DNA was reacted with 50 μl of reaction mixture containing 50 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 100 mM Nacl, 0.5 mM dNTP, 6 U of Klenow Plasma (GIBCO BRL). The reaction was allowed to react at room temperature for 20 minutes to smooth the terminals. The reaction mixture was extracted with phenol and chloroform and vector DNA was recovered by ethanol precipitation.

회수한 벡터 DNA를 50 mM Tris-HC1(pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5%(v/v) 폴리에틸렌글리콜 8000 및 0.5 U의 T4 DNA 리가제(GIBCO BRL)를 함유 하는 반응혼합액 10 ㎕ 속에 16 ℃로 2시간 반응시켜 연결시켰다. 반응혼합액 5 ㎕를 대장균 JM109 컴피턴트 세포(competent cell, 닛폰 진) 100 ㎕에 가하고, 빙상에서 30분간 정치한 다음, 42 ℃로 1분간, 또한 빙상에서 1분간 정치하였다. SOC 배지 500 ㎕를 가하고, 37 ℃에서 1시간 인큐베이션한 후, X-gal과 IPTG를 표면에 도포한 2 ×YT 한천배지(50 ㎍/㎖ 엠피실린 포함)(Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)를 뿌리고, 37 ℃로 하룻밤 배양하여 형질전환체를 수득하였다. The recovered vector DNA was digested with 50 mM Tris-HC1 (pH 7.6), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (v / v) polyethylene glycol 8000 and 0.5 U of T4 DNA ligase (GIBCO BRL). The reaction mixture containing 10 μl was reacted at 16 ° C. for 2 hours and connected. 5 µl of the reaction mixture was added to 100 µl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and allowed to stand on ice for 30 minutes, and then left at 42 ° C for 1 minute and on ice for 1 minute. 500 μl of SOC medium was added and incubated for 1 hour at 37 ° C., followed by 2 × YT agar medium containing 50 μg / ml empicillin coated with X-gal and IPTG (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and incubated overnight at 37 ° C. to obtain transformants.

형절전환체를 50 ㎍/㎖의 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 37 ℃로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 Plasmid Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여, 첨부된 처방에 따라 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드를 Hind III 로 절단하고, Hind III 부위가 결실하고 있는 것을 확인한 플라스미드를 pUC10△Hind III라고 명명하였다.The transformant was incubated overnight at 37 ° C. in 2 ml of 2 × YT medium containing 50 μg / ml of empicillin, and the plasmid DNA was purified from the cell batch using the Plasmid Mini Kit (QIAGEN) according to the attached prescription. It was. The purified plasmid was cut with Hind III, and the plasmid which confirmed that the Hind III site was deleted was named pUC10ΔHind III.

(ii) 인간L쇄λ쇄 정상영역을 코딩하는 DNA의 구축(ii) Construction of DNA Encoding Human L Chain λ Chain Normal Region

인간항체 L쇄λ쇄C영역은 Mcg⁺ Ke⁺ oz^-, Mcg^-Ke^-Oz ^-, Mcg^- Ke^-Oz⁺, Mcg^- Ke⁺Oz^-의 적어도 4종류의 이소타입이 알려져 있다(P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987). #23-57-137-1 마우스L쇄λ쇄C영역과 상보성을 가지는 인간항체L쇄λ쇄C영역을 EMBL 데이터베이스로 검색한 결과, 이소타입이 Mcg⁺ Ke⁺ oz^-(Accession No. X57819)(P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)의 인간항체 L쇄λ쇄가 가장 높은 상보성을 나타내고, #23-57-137-1 마우스 L쇄λ쇄C영역과의 상보성은 아미노산 서열로 64.4 %, 염기서열로 73.4 %이었다.Human antibody L chain λ chain C region ^{^{^{Mcg + Ke + oz -, Mcg}}} - Ke - Oz -, Mcg - Ke - Oz +, Mcg - Ke + Oz - of at least 4 different isotypes of known (P. Dariavach , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987). # 23-57-137-1 mouse L chain λ chain C region and human antibody L chain λ chain C region a result of the search to the EMBL database with the complementarity, the isotype ^{^{^{Mcg + Ke + oz - (Accession}}} No. X57819) Human antibody L chain λ chain (P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) shows the highest complementarity and # 23-57-137-1 mice Complementarity with L-chain lambda chain C region was 64.4% by amino acid sequence and 73.4% by nucleotide sequence.

거기에서, 이 인간 항체 L쇄λ쇄C영역을 코딩하는 DNA의 구축을 PCR법을 이용하여 수행하였다. 각 프라이머의 합성은 394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)(ABI 사)를 이용하여 수행하였다. HLAMB1(서열번호 11)및 HLAMB3(서열번호 13)은 센스 DNA 서열을 가지고, HLAMB2(서열번호 12) 및 HLAMB4(서열번호 14)는 안티센스 DNA 서열을 가지고, 각각의 프라이머의 양단에 20 애서 23 bp의 상보적 서열을 가진다.There, DNA construction encoding this human antibody L chain lambda chain C region was carried out using the PCR method. Synthesis of each primer was performed using a 394 DNA / RNA synthesizer (ABI). HLAMB1 (SEQ ID NO: 11) and HLAMB3 (SEQ ID NO: 13) have a sense DNA sequence, HLAMB2 (SEQ ID NO: 12) and HLAMB4 (SEQ ID NO: 14) have an antisense DNA sequence, 20 asterisks 23 bp across each primer. Has a complementary sequence of

외부 프라이머 HLAMBS(서열번호 15), HLAMBR(서열번호 16)은 HLAMB1, HLAMB4와 각각 상동한 서열을 가지고 있고, 또한 HLAMBS는 EcoRI, Hind III, BlnI 인식서열을 HLAMBR은 EcoRI 인식서열을 각각 포함하고 있다. 제 1PCR로 HLAMB1-HLAMB2와 HLAMB1-HLAMBR4의 반응을 수행하였다. 반응 후, 그들을 등량 혼합하고, 제 2 PCR로 조립을 수행하였다. 또한, 외부 프라이머HLAMBS 및 HLAMBR을 첨가하고, 제 3 PCR로 조립을 수행하였다. 또한, 외부 프라이머 HLAMBS 및 HLAMBR을 첨가하고, 제 3PCR에 의해 전체 길이 DNA를 증폭시켰다.The outer primers HLAMBS (SEQ ID NO: 15) and HLAMBR (SEQ ID NO: 16) have the same sequence as HLAMB1 and HLAMB4, respectively, and HLAMBS contains EcoRI, Hind III, and BlnI recognition sequences, and HLAMBR contains EcoRI recognition sequences, respectively. . The reaction of HLAMB1-HLAMB2 and HLAMB1-HLAMBR4 was performed with the first PCR. After the reaction, they were mixed in an equal amount and granulation was performed by second PCR. In addition, external primers HLAMBS and HLAMBR were added and assembly was performed by third PCR. In addition, external primers HLAMBS and HLAMBR were added and full length DNA was amplified by the third PCR.

PCR은 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 사용하고, 첨부된 처방에 따라 수행하엿다. 제 1 PCR으로는 5 pmole의 HLAMBI 및 0.5 pmole의 HLAMB2와 5U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 포함하는 100 ㎕의 반응혼합액, 또는 0.5 pmole의 HLAMB3 및 5 pmole의 HLAMB4와 5U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 포함하는 100㎕의 반응혼합액을 이용하고, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하여 94℃로 1분간, 60℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 5회 수행하였다. 제 2 PCR은 반응액을 50 ㎕ 씩 혼합하고, 50㎕의 상층하고, 94℃로 1분간, 60℃로 1분간, 72℃로 1분간의 온도 사이클로 3회 수행하였다. 제 3 PCR은 반응액에 외부 프라이머HLAMBS 및 HLAMBR을 각 50 pmole 씩 첨가하고, 94 ℃로 1분간, 60 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 30회 수행하였다. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting) and according to the attached prescription. In the first PCR, 100 μl of reaction mixture containing 5 pmole of HLAMBI and 0.5 pmole of HLAMB2 and 5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), or 0.5 pmole of HLAMB3 and 5 pmole of HLAMB4 and 5 U of TaKaRa Ex Taq 100 µl of the reaction mixture containing (cast) was used, and 50 µl of mineral oil was superimposed thereon for 5 minutes at a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. In the second PCR, 50 µl of the reaction solution was mixed, 50 µl of the upper layer was performed three times in a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. In the third PCR, 50 pmole of each of the external primers HLAMBS and HLAMBR was added to the reaction solution, and the reaction was performed 30 times in a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C.

제 3 PCR 산물의 DNA 절편을 3 % 저융점 아가로오스(NuSieve GTG Agarose, FMC)로 전기영동한 다음, GENECLEAN Kit(BI0101)을 이용하고, 첨부된 처방에 따라 겔로부터 회수, 정제하였다.DNA fragments of the third PCR product were electrophoresed with 3% low melting point agarose (NuSieve GTG Agarose, FMC), and then recovered and purified from the gel using the GENECLEAN Kit (BI0101) according to the attached prescription.

수득한 DNA절편을 50 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM Mgcl2, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 8U의 EcoRI(다까라 주조)를 포함하는 20 ㎕의 반응혼합액 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. 절단혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전으로 회수한 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 8 ㎕에 용해하였다.Obtained DNA fragments were 1 hour at 37 ° C. in 20 μl reaction mixture containing 50 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM Mgcl2, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 8 U of EcoRI Cut. The cleavage mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in 8 µl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution.

플라스미드 pUC19 △Hind III 0.8 ㎍ 을 같은 방법으로 EcoRI로 절단하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에타올 침전에 의해 회수하였다. 절단한 플라스미드 pUC19 △Hind III 를 50 mM Tris-HC1 (pH 9.0), 1 mM MgCl2, 알칼라인포스페라제(E. coli C75, 다까라 주조)를 함유하는 반응혼합액 50 ㎕ 속에서 37 ℃, 30 분간 반응시켜 탈인산처리(BAP 처리)하였다. 반응액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의해 회수한 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다.0.8 [mu] g of the plasmid pUC19 [Delta] Hind III was digested with EcoRI in the same manner, extracted with phenol and chloroform and recovered by ethanol precipitation. The plasmid pUC19 ΔHind III was digested in a reaction mixture containing 50 mM Tris-HC1 (pH 9.0), 1 mM MgCl2, and alkaline phosphase (E. coli C75, Casta) at 37 ° C for 30 minutes. The reaction was dephosphorized (BAP treatment). The reaction solution was extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in 10 µl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution.

상기 BAP 처리한 플라스미드 pUC19 △Hind III 1 ㎕와 먼저 PCR 산물인 4 ㎕ 와를 DNA Ligation Kit Ver. 2(다까라 주조)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 수득한 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.1 μl of the BAP-treated plasmid pUC19 ΔHind III and 4 μl of the PCR product were first obtained by DNA Ligation Kit Ver. 2 (Dakada casting) was used to connect, and E. coli JM109 competent cells were transformed. The resulting transformant was incubated overnight in 2 ml of 2 x YT medium containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmid was purified from the bacterial batch using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

상기 플라스미드에 대하여, 클로닝된 DNA의 염기서열의 확인을 수행하였다. 염기서열의 결정에는 373A DNA 시퀀서(ABI 사)를 이용하고, 프라이머로는 M 13 프라이머 M4 및 M 13 프라이머 RV(다까라 주조)를 이용하였다. 그 결과, 클로닝된 DNA의 내부에 12 bp 의 결실이 있다는 것이 판명되었다. 이 DNA를 포함하는 플라스미드를 'Cλ△/pUC19'라고 명명하였다. 여기에서 그 부분을 보충하기 위한 프라이머 HCLMS(서열번호 17), HCLMR(서열번호 18)을 새로이 합성하고, PCR로 다시 올바른 DNA의 구축을 수행하였다.With respect to the plasmid, the base sequence of the cloned DNA was confirmed. 373A DNA sequencer (ABI Co., Ltd.) was used for the determination of the nucleotide sequence, and M 13 primer M4 and M 13 primer RV (Tadaka casting) were used as the primer. As a result, it was found that there was a deletion of 12 bp inside the cloned DNA. The plasmid containing this DNA was named "CλΔ / pUC19". Here, primers HCLMS (SEQ ID NO: 17) and HCLMR (SEQ ID NO: 18) for replenishing the portion were newly synthesized, and the correct DNA was again constructed by PCR.

제 1 PCR로 결신 DNA를 포함하는 플라스미드 Cλ△/pUC19를 주형으로 하고, 프라이머 HLAMBS 와 MCLMR, HCLMS 와 HLANBA로 반응을 수행하였다. PCR산물을 각각 정제하고, 제 2 PCR로 조립을 수행하였다. 또한, 외부 프라이머 HLAMBS 및 HLAMB4를 첨가하고, 제 3 PCR에 의해 전 길이 DNA를 증폭시켰다.The plasmid CλΔ / pUC19 containing the ligated DNA was used as a template by the first PCR, and the reaction was carried out by primers HLAMBS and MCLMR, HCLMS and HLANBA. PCR products were each purified and assembly was performed by a second PCR. In addition, external primers HLAMBS and HLAMB4 were added and full length DNA was amplified by third PCR.

제 1 PCR으로는, 주형으로서 Cλ△/pUC19 0.1 ㎍, 프라이머 HLAMBS 및 HCLMR 각 50 pmole, 또는 HCLMS 및 HLAMB4 각 50 pmole, 5U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 함유하는 100 ㎕의 반응혼합액을 이용하고, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하여 94 ℃로 1분간, 60 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 30 회 수행하였다. In the first PCR, a reaction mixture containing 100 μl of 0.1 μg of CλΔ / pUC19, 50 pmoles each of primers HLAMBS and HCLMR, or 50 pmoles each of HCLMS and HLAMB4, and 5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Casting) was used. 50 µl of mineral oil was added to the upper layer, followed by 30 times with a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C.

PCR 산물 HLAMBRS-HCLMR(236 bp), HCLMS-HLAMB4(147 bp)를 각각 3 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하였다. 제 2 PCR에서는 정제 DNA 절편 각 40ng, 1U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 함유하는 20 ㎕의 반응혼합액을 이용하고, 25 ㎕의 미네랄오일을 상층하고 94 ℃로 1분간, 60 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 5 회 수행하였다. PCR products HLAMBRS-HCLMR (236 bp) and HCLMS-HLAMB4 (147 bp) were each electrophoresed with 3% low melting agarose gel, and then recovered and purified from the gel using GENECLEANII Kit (BI0101). In the second PCR, 20 µl of the reaction mixture containing 40 ng of purified DNA fragments and 1 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Casting) was used, and 25 µl of the mineral oil was superimposed at 94 캜 for 1 minute at 60 캜. For 5 minutes, it was carried out in a temperature cycle of 1 minute to 72 ℃.

제 3 PCR로는 제 2 PCR 반응액 2 ㎕, 외부 프라이머 HLAMBS, HLAMB4 각 50 pmole, 5U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 함유하는 100 ㎕의 반응혼합액을 이용하고, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하였다. PCR은 94 ℃로 1분간, 60 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 30 회 수행하였다. 제 3 PCR 산물인 357 bp 의 DNA 절편을 3% 저융점 아가로오스겔로부터 회수, 정제하였다. As the third PCR, 100 µl of the reaction mixture containing 2 µl of the second PCR reaction solution, 50 pmole of each of the external primers HLAMBS, HLAMB4, and 5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Casting) was used. It was. PCR was performed 30 times in a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. A 357 bp DNA fragment, a third PCR product, was recovered and purified from 3% low melting agarose gel.

수득한 DNA 절편 0.1 ㎍을 EcoRI로 절단한 다음, BAP 처리한 플라스미드 pUC19△Hind III에 서브클로닝 하였다. 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.0.1 μg of the obtained DNA fragment was digested with EcoRI, and then subcloned into plasmid pUC19ΔHind III treated with BAP. E. coli JM109 competent cells were transformed, cultured overnight in 2 ml of 2 x YT medium containing 50 µg / ml empicillin, and plasmids were purified from the bacterial batches using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 플라스미드에 대하여 염기서열을 M13 프라이머 M4, M13 프라이머RV(다까라 주조)를 이용하고, 373A DNA 시퀀서(ABI 사)로 결정하였다. 결실되지 않은 염기서열을 가지고 있는 것이 확인된 플라스미드를 'Cλ/pUC19'로 명명하였다.The nucleotide sequence of the purified plasmid was determined by using a 373A DNA sequencer (ABI) using M13 primer M4 and M13 primer RV (Castle cast). The plasmid confirmed to have an undeleted base sequence was named 'Cλ / pUC19'.

(iii) 인간L쇄κ쇄 정상영역을 코딩하는 DNA의 구축(iii) Construction of DNA Encoding Human L Chain K Chain Normal Region

플라스미드 HEF-PM1k-gk(WO92/19759)으로부터 L쇄κ쇄C영역을 코딩하는 DNA 절편을 PCR법을 이용하여 클로닝하였다: 394 DNA/RNA 합성기(ABI 사)를 이용하여 합성한 전방 프라이머HKAPS (서열번호 19)는 EcoRI Hind III, BlnI 인식서열을 후방 프라이머 HKAPA (서열번호 20)은 EcoRI 인식서열을 가지도록 설계하였다.DNA fragments encoding L chain κ chain C regions from plasmid HEF-PM1k-gk (WO92 / 19759) were cloned using PCR: Forward primers HKAPS synthesized using a 394 DNA / RNA synthesizer (ABI). SEQ ID NO: 19) was designed to have an EcoRI Hind III, BlnI recognition sequence and the rear primer HKAPA (SEQ ID NO: 20) has an EcoRI recognition sequence.

주형이 되는 플라스미드 HEF-PM1k-gk 0.1 ㎍, 프라이머 HKAPS, HKAPA 각 50 pmole, 5U의 TaKaRa Taq(다까라 주조)를 함유하는 100 ㎕의 반응혼합액을 이용하고, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하였다. 94 ℃로 1분간, 60 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 30 회 수행하였다. 360 bp 의 PCR 산물을 3% 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, GENECLEAN Kit(Bi0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하였다.100 µl of the reaction mixture containing 0.1 µg of the plasmid HEF-PM1k-gk serving as the template, primers HKAPS, 50 pmole of each of HKAPA, and 5 U of TaKaRa Taq (Daka Casting) was used, and 50 µl of mineral oil was superimposed. 30 cycles were carried out for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. The 360 bp PCR product was electrophoresed on 3% low melting agarose gel, and then recovered and purified from the gel using a GENECLEAN Kit (Bi0101).

수득한 DNA 절편을 EcoRI로 절단한 다음, BAP 처리한 플라스미드 pUC19△Hind III에 서브클로닝 하였다. 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.The obtained DNA fragment was digested with EcoRI, and then subcloned into plasmid pUC19ΔHind III treated with BAP. E. coli JM109 competent cells were transformed, cultured overnight in 2 ml of 2 x YT medium containing 50 µg / ml empicillin, and plasmids were purified from the bacterial batches using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 플라스미드의 염기서열을 M13 프라이머 M4, M13 프라이머RV(다까라 주조)를 이용하고, 373A DNA 시퀀서(ABI 사)로 결정하였다. 올바른 염기서열을 가지고 있는 것이 확인된 플라스미드를 'Cκ/pUC19'로 명명하였다.The nucleotide sequence of the purified plasmid was determined by 373A DNA sequencer (ABI) using M13 primer M4 and M13 primer RV (Castle cast). Plasmids that were confirmed to have the correct sequence were named 'Cκ / pUC19'.

(3) 키메라 항체 L쇄 발현벡터의 구축(3) Construction of chimeric antibody L chain expression vector

키메라#23-57-137-1 항체L쇄발현벡터를 구축하였다: 플라스미드 Cλ/pUC19, Cκ/pUC19의 인간항체 정샹영역의 바로 앞에 존재하는 Hind III, BlnI 부위에 #23- 57-137-1 L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 연결함으로써, 각각 키메라 #23-57-137-1 항체L쇄V영역 및 L쇄λ영역 또는 L쇄κ쇄정상영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 pUC19 벡터를 작제하였다. EcoRI 절단에 의해 키메라항체 L쇄를 코딩하는 DNA를 잘라내고, HEF 발혁벡터로 서브클로닝을 수행하였다.A chimeric # 23-57-137-1 antibody L expression vector was constructed: # 23-57-137-1 at the Hind III, BlnI site immediately preceding the human antibody constant region of plasmids Cλ / pUC19, Cκ / pUC19. By connecting the DNA encoding the L chain V region, a pUC19 vector was constructed that contains the chimeric # 23-57-137-1 antibody L chain V region and DNA encoding L chain λ region or L chain κ chain normal region, respectively. It was. DNA encoding the chimeric antibody L chain was digested by EcoRI cleavage and subcloning was performed with HEF development vector.

즉, 플라스미드 MBC1L24로부터 #23-57-137-1 항체L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 PCR법을 이용하여 클로닝하였다. 각 프라이머의 합성은 394 DNA/RNA 합성기(ABI 사)를 이용하여 수행하였다. 후방 프라이머 MBCCHL1(서열번호 21)은 Hind III 인식서열과 코작 서열(서열번호 22)는 BgIII, EcoRI 인식서열을 가지도록 설계하였다. That is, DNA encoding the # 23-57-137-1 antibody L chain V region from plasmid MBC1L24 was cloned by PCR. The synthesis of each primer was performed using a 394 DNA / RNA synthesizer (ABI). The rear primer MBCCHL1 (SEQ ID NO: 21) was designed to have the Hind III recognition sequence and the Kozak sequence (SEQ ID NO: 22) to have the BgIII and EcoRI recognition sequences.

PCR은 10 mM Tris-HC1(pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl₂ , 0.2 mM dNTP, 0.1 ㎍의 MBC1L24, 프라이머로서 MBCCHL1 및 MBCCHL3를 각 50 pmole, 1 ㎕의 AmpliTaq(PERKIN ELMER)를 함유하는 100 ㎕의 반응혼합액을 이용하고, 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하였다. 94 ℃로 45초간, 60 ℃로 45초간, 72 ℃로 2분간의 온도 사이클로 30 회 수행하였다. PCR contains 10 mM Tris-HC1 (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTP, 0.1 μg MBC1L24, MBCCHL1 and MBCCHL3 as primers, 50 pmole each, 1 μl AmpliTaq (PERKIN ELMER) 100 µl of the reaction mixture was used, and 50 µl of mineral oil was superimposed. Thirty times were carried out with a temperature cycle of 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and two minutes at 72 ° C.

446 bp 의 PCR 산물을 3% 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, GENECLEAN Kit(Bi0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다. PCR 산물 1 ㎕를 각각 10 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8U의 Hind III(다까라 주조)및 8U의 EcoRI(다까라 주조)를 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에 37 ℃로 1시간 절단하였다. 절단혼합 액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올 침전으로 회수하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 8 ㎕에 용해하였다.446 bp PCR product was electrophoresed on 3% low melting agarose gel, then recovered and purified from the gel using GENECLEAN Kit (Bi0101), 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution 20 Dissolved in μl. 1 μl of PCR product was each containing 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U Hind III (Tadaka casting) and 8 U EcoRI (Takada casting) It cut | disconnected at 37 degreeC in 20 microliters of mixed liquid for 1 hour. The cleavage mixture was extracted with phenol and chloroform and the DNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 8 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution.

플라스미드 pUC19 1 ㎍을 같은 방법으로 Hind III 및 EcoRI로 절단하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의해 회수하고, 알칼라인포스파타제(E. coli C75, 다까라 주조)로 BAP 처리하였다. 반응액을 페놀 및 클로로형태을 추출, DNA 를 에탄올 침전으로 회수한 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다.1 μg of plasmid pUC19 was cleaved with Hind III and EcoRI in the same manner, extracted with phenol and chloroform, recovered by ethanol precipitation, and BAP treated with alkaline phosphatase (E. coli C75, casta). The reaction solution was extracted with phenol and chloro form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in 10 µl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution.

BAP 처리한 플라스미드 pUC19 1 ㎕와 먼저 PCR 산물 4 ㎕를 DNA Ligation Kit Ver. 2(다까라 주조)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트세포(닛폰 진)에 전술한 방법으로 형질전환하였다. 이것을 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 한천배지에 뿌리고, 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 배지 2 ㎖로 37 ℃로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 염기서열을 결정한 후, 올바른 염기서열을 가지는 플라스미드를 'CHL/pUC19'로 명명하였다.1 μl of the BAP-treated plasmid pUC19 and 4 μl of the first PCR product were prepared using DNA Ligation Kit Ver. 2 (Tadaka casting) was used to connect, and E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene) were transformed by the method described above. This was sprinkled on 2 x YT agar medium containing 50 µg / ml empicillin, incubated overnight at 37 DEG C. with 2 ml of 2 x YT media containing 50 µg / ml empicillin, followed by QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). ) To purify the plasmid. After determining the nucleotide sequence, the plasmid having the correct nucleotide sequence was named 'CHL / pUC19'.

플라스미드 Cλ/pUC19, Cκ/pUC19 각 1 ㎍을 각각 20 mM Tris-HC1(pH 8.5), 10mM MgCl₂ , 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8U의 Hind III(다까라 주조)및 2U의 BlnI(다까라 주조)를 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에 37 ℃로 1시간 절단하였다. 절단혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올 침전으로 회수한 다음, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다.1 μg of each of the plasmids Cλ / pUC19, Cκ / pUC19 was respectively 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U Hind III (cast cast) and 2 U BlnI Carbo casting) was cut at 37 DEG C for 1 hour in 20 mu l of the reaction mixture. The cleavage mixture was extracted with phenol and chloroform and the DNA was recovered by ethanol precipitation and then dissolved in 10 [mu] l of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution.

#23-57-137-1 L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 CHL.pUC19 로부터 8 ㎍을 같은 방법으로 Hind III 및 BlnI로 절단하였다. 수득한 409bp의 DNA 절편을 3 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, GENECLEANII Kit(Bi0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다. 8 μg from the plasmid CHL.pUC19 containing DNA encoding the # 23-57-137-1 L chain V region was digested with Hind III and BlnI in the same manner. The obtained 409 bp DNA fragment was electrophoresed with 3% low melting agarose gel, then recovered from the gel using GENECLEANII Kit (Bi0101), purified, 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution Dissolved in 10 μl.

이 L쇄V영역DNA 4 ㎕를 BAP 처리한 플라스미드 Cλ/pUC19 또는 Cκ/pUC19 각 1 ㎕에 서브클로닝하고, 대장균 JM109 컴피턴트세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 3 ㎖로 하룻밤 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 이것들을 각각 플라스미드 'MBC1L(λ)/pUC19' 및 'MBC1L(κ)/pUC19'로 명명하였다.4 μl of this L-chain V region DNA was subcloned into 1 μl of each of the BAP-treated plasmid Cλ / pUC19 or Cκ / pUC19 and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated overnight with 3 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). These were named plasmids 'MBC1L (λ) / pUC19' and 'MBC1L (κ) / pUC19', respectively.

플라스미드 MBC1L(λ)/pUC19 및 MBC1L(κ)/pUC19를 각각 EcoRI로 절단하고, 3 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, 743 bp의 DNA 절편을 GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다. Plasmids MBC1L (λ) / pUC19 and MBC1L (κ) / pUC19, respectively, were digested with EcoRI, electrophoresed with 3% low melting agarose gel, and 743 bp DNA fragments were gelled using GENECLEANII Kit (BI0101). Were recovered, purified, and dissolved in 10 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution.

발현벡터로서 플라스미드 HEF-PM1k-gk 2.7 ㎍를 EcoRI로 절단하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올 침전에 의해 회수하였다. 회수한 DNA 절편을 BAP 처리한 다음, 1 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동하고, 6561 bp의 DNA 절편을 GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다.2.7 μg of the plasmid HEF-PM1k-gk as the expression vector was digested with EcoRI, extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA fragments were subjected to BAP treatment, followed by electrophoresis on 1% low melting agarose gel, and 6561 bp DNA fragments were recovered from the gel using GENECLEANII Kit (BI0101), purified, and 10 mM Tris-HC1 ( pH 7.4), 10 μl of 1 mM EDTA solution.

BAP 처리한 HEF 벡터 2 ㎕를 상기 플라스미드 MBC1L(λ) 또는 MBC1L(κ) EcoRI 절편 각 3 ㎕로 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 2 ㎖로 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. Two μL of BAP-treated HEF vectors were linked to 3 μL of each of the plasmid MBC1L (λ) or MBC1L (κ) EcoRI fragments, and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated with 2 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 플라스미드를 20 mM Tris-HC1(pH 8.5), 10 mM MgCl₂ , 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8U의 Hind III(다까라 주조) 및 2U의 PvuI(다까라 주조)를 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. 절편이 올바른 방향으로 삽입되어 있다면 5104/2195 bp, 역방향으로 삽입되어 있다면 4387/2926 bp의 절단절편이 생김에 의해, 올바른 방향으로 삽입되어 있는 플라스미드를 각각 'MBC1L(λ)/neo' 및 'MBC1L(κ)/neo'로 명명하였다.The purified plasmid was prepared using a reaction mixture containing 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U Hind III (Takada casting) and 2 U PvuI (Takara casting). It cut | disconnected at 37 degreeC in 20 microliters for 1 hour. If the fragment is inserted in the correct direction, 5104/2195 bp and 4387/2926 bp if the fragment is inserted in the reverse direction, the plasmids inserted in the correct direction are separated into 'MBC1L (λ) / neo' and 'MBC1L, respectively. (κ) / neo '.

(4) COS-7 세포의 트렌스펙션(transfaction)(4) Transfaction of COS-7 Cells

키메라 항체의 항원결합 활성 및 중화활성을 평가하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 이용하여 COS-7세포를 형질전환시켰다: 즉, 키메라 항체의 알과성발현은 플라스미드 MBC1HcDNA/pCOS1과 MBC1L(λ)/neo, 또는 MBC1HcDNA/pCOS1과 MBC1L(κ)/neo와의 조합에서 Gene Pulser 장치(Bio-Rad)를 이용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS-7 세포에 동시 형질도입하였다. PBS(-) 중에 1 ×10⁷ 세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 COS-7 세포 0.8 ㎖에, 각 플라스미드 DNA 10 ㎍을 가하고, 1,500 V, 25 ㎌의 정전용량으로 펄스를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 2 %의 Ultra Low igG 소 태아 혈청(GIBCO)를 함유하는 DMEM배지(GIBCO)에 현탁하고, 10㎝ 배양플레이트를 이용하여 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 72시간 배양한 후, 배양상등액을 모아서, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하고, ELISA의 시료에 이용하였다.In order to assess the antigen binding and neutralizing activity of chimeric antibodies, COS-7 cells were transformed using an electroexpressing plasmid: ie, the overexpression of chimeric antibodies was determined by plasmids MBC1HcDNA / pCOS1 and MBC1L (λ) / neo, Alternatively, COS-7 cells were cotransduced by electroporation using a Gene Pulser device (Bio-Rad) in a combination of MBC1HcDNA / pCOS1 and MBC1L (κ) / neo. To 0.8 ml of COS-7 cells suspended at 1 × 10 ⁷ cells / ml cell concentration in PBS (−), 10 µg of each plasmid DNA was added and pulsed at a capacitance of 1,500 V and 25 Hz. After a 10 minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were suspended in DMEM medium (GIBCO) containing 2% Ultra Low igG fetal bovine serum (GIBCO) and incubated in a CO ₂ incubator using a 10 cm culture plate. Incubated at. After incubation for 72 hours, the culture supernatant was collected, cell debris was removed by centrifugation, and used for ELISA samples.

또한, COS-7 세포의 배양상등액으로부터 키메라 항체의 정제는 AffiGel Protein A MAPSII 키트(Bio-Rad)를 이용하여 첨부된 처방에 따라 수행하였다.In addition, purification of chimeric antibodies from the culture supernatant of COS-7 cells was performed using the AffiGel Protein A MAPSII kit (Bio-Rad) according to the attached prescription.

(5) ELISA(5) ELISA

(i) 항체농도의 측정(i) Determination of antibody concentration

항체농도 측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같은 방법으로 조제하였다: ELISA용 96-웰 플레이트(Maxisorp, NUNC)의 각 웰을 고정화 완충액(0.1 M NaHCO₃, 0.02 % NaN₃)으로 1 ㎍/㎖의 농도에 조제한 염소 항인간 IgG 항체(TAGO) 100 ㎕로 고정화하고, 200 ㎕의 희석 완충액(50 mM Tris-HC1, 1mM MgCl₂, 0.1 M NaCl, 0.05 % Tween 20, 0.02 % NaN₃, 1 % 소 혈청 알부민(BSA), pH 7.2)으로 블로킹한 후, 키메라 항체를 발현시킨 COS 세포의 배양상등액 또는 정제 키메라 항체를 단계 희석하여 각 웰에 가하였다. 1시간 실온에서 배양하고, PBS-Tween20으로 세척한 다음, 알칼라인포스파타제 결합 염소 항 인간 IgG 항체(TAGO) 100 ㎕를 가하였다. 1시간 실온에서 배양하고, PBS-Tween20로 세척한 다음, 1 ㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산, SIGMA)을 가한 다음, 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 농도 측정의 표준으로서 HuIgG1λPurified (The Binding Site)를 이용하였다.ELISA plates for antibody concentration measurements were prepared in the following manner: Each well of a 96-well plate (Maxisorp, NUNC) for ELISA was prepared at 1 μg / ml with immobilization buffer (0.1 M NaHCO ₃ , 0.02% NaN ₃ ). Immobilized with 100 μl of goat anti-human IgG antibody (TAGO) prepared at the concentration, 200 μl of dilution buffer (50 mM Tris-HC1, 1 mM MgCl ₂ , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN ₃ , 1% bovine) After blocking with serum albumin (BSA), pH 7.2), the culture supernatant of purified COS cells expressing chimeric antibodies or purified chimeric antibodies were added in steps to each well. Incubated at room temperature for 1 hour, washed with PBS-Tween20, and then 100 μl of alkaline phosphatase-bound goat anti human IgG antibody (TAGO) was added. Incubated at room temperature for 1 hour, washed with PBS-Tween20, 1 mg / mL substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was added, and the absorbance at 405 nm was measured by a microplate reader. . HuIgG1λ Purified (The Binding Site) was used as a standard for concentration measurement.

(ii) 항원결합능의 측정(ii) Determination of antigen binding capacity

항원결합 측정을 위한 ELISA 플레이트는 다음과 같은 방법으로 조제하였다: ELISA용 96-웰 플레이트의 각 웰을 고정화 완충액으로 1 ㎍/㎖의 농도로 조제한 인간 PTHrP(1-34) 100 ㎕로 고정화하였다. 200 ㎕의 희석 완충액으로 블로킹한 후, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 발현시킨 COS-7 세포의 배양상등액 또는 정제 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 단계 희석하여 각 웰에 가하였다. 실온에서 배양하고, PBS-Tween20으로 세척한 후, 알칼라인포스파타제 결합 염소 항 인간 IgG항체(TAGO) 100 ㎕를 가하였다. 실온에서 배양하고, PBS-Tween20으로 세척한 다음, 1 ㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산, SIGMA)을 가한 다음, 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. ELISA plates for antigen binding measurements were prepared in the following manner: Each well of a 96-well plate for ELISA was immobilized with 100 μl of human PTHrP (1-34) prepared at a concentration of 1 μg / ml in immobilization buffer. After blocking with 200 μl dilution buffer, the culture supernatant or purified hybrid or humanized antibody of COS-7 cells expressing the hybrid antibody or humanized antibody was added to each well by step dilution. After incubation at room temperature and washing with PBS-Tween20, 100 μl of alkaline phosphatase-bound goat anti human IgG antibody (TAGO) was added. Incubated at room temperature, washed with PBS-Tween20, 1 mg / ml substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was added, and the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader.

그 결과, 키메라 항체는 인간PTHrP(1-34)에 대한 결합능을 가지고 있고, 클로닝한 마우스항체 V영역의 올바른 구조를 가지는 것이 나타내었다(도 4). 또한, 키메라 항체에 있어서 L쇄C영역이 λ쇄 또는 κ쇄의 어느 것에 있어서도 항체의 PTHrP(1-34)에 대한 결합능은 변화하지 않고, 인간형화된 항체의 L쇄C영역은 인간형화된 항체 L쇄λ쇄를 이용하여 구축하였다.As a result, it was shown that the chimeric antibody has a binding ability to human PTHrP (1-34) and has the correct structure of the cloned mouse antibody V region (Fig. 4). In addition, the binding ability of the antibody to PTHrP (1-34) of the L-chain C region of the chimeric antibody does not change in either the λ chain or the κ chain, and the L-chain C region of the humanized antibody is a humanized antibody. It was constructed using L chain λ chain.

(6) CHO 안정생산 세포주의 수립(6) Establishment of CHO Stable Production Cell Lines

키메라항체의 안정된 생상세포주를 수립하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 CHO 세포(DXB11)에 도입하였다: 즉, 키메라항체의 안정된 생산세포주 수립은 CHO 세포용 발현 플라스미드 MBC1HcDNA/pCHO1과 MBC1L(λ)/neo. 또는 MBC1HcDNA/pCHO1과 MBC1L(κ)/neo와의 조합으로, Gene Pulser 장치(Bio-Rad)를 이용하여 일렉트릭포레이션에 의해 CHO세포에 동시 형질도입하였다. 각각의 발현벡터를 제한효소 PvuI로 절단하여 직쇄 DNA로 만들고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전으로 DNA를 회수하여 일렉트릭포레이션에 이용하였다. PBS(-)중에서 1 ×10⁷ 세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 CHO세포 0.8 ㎖로, 각 플라스미드 DNA 10 ㎍을 가하고, 1,500V, 25 ㎌의 정전용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간 회복기간을 둔 후, 일렉트릭포레이션 처리된 세포를 10 % 소 태아혈청(GIBCO)를 첨가한 MEM-α배지(GIBCO)에 현탁하고, 3장의 96-웰 플레이트(Falcon)을 이용하여 CO₂ 인큐베이터로 배양하였다. 배양 개시 다음 날에 10 % 소 태아혈청(GIBCO) 및 500 ㎎/㎖의 GENETICIN(G418Sulfate, GIBCO)의 선택배지를 교환하고, 항체유전자기 도입된 세포를 선택하였다. 선택배지 교환 후, 2주 동안을 전후로 현미경으로 세포를 관찰하고, 순조로운 세포증식을 확인한 후에, 상기 항체 농도 측정 ELISA로 항체생산량을 측정하고, 항체생산량이 않은 세포를 선별하였다.In order to establish stable live cell lines of chimeric antibodies, the electric expression plasmids were introduced into CHO cells (DXB11): That is, the establishment of stable production cell lines of chimeric antibodies was achieved by expression plasmids MBC1HcDNA / pCHO1 and MBC1L (λ) / neo. Alternatively, in combination with MBC1HcDNA / pCHO1 and MBC1L (κ) / neo, CHO cells were co-transduced by electroporation using a Gene Pulser device (Bio-Rad). Each expression vector was digested with restriction enzyme PvuI to make straight-chain DNA, extracted with phenol and chloroform, and then the DNA was recovered by ethanol precipitation and used for the electroporation. To 0.8 ml of CHO cells suspended at a cell concentration of 1 × 10 ⁷ cells / ml in PBS (−), 10 μg of each plasmid DNA was added and pulsed at a capacitance of 1,500 V and 25 Hz. After 10 min recovery at room temperature, the electroporated cells were suspended in MEM-α medium (GIBCO) with 10% fetal bovine serum (GIBCO), and three 96-well plates (Falcon) were used. And incubated in a CO ₂ incubator. On the day after incubation, the selection medium of 10% fetal bovine serum (GIBCO) and 500 mg / ml GENETICIN (G418Sulfate, GIBCO) was exchanged and cells transduced with antibody genes were selected. After the selective medium exchange, the cells were observed under a microscope for two weeks, and after confirming smooth cell proliferation, the antibody production was measured by the antibody concentration measuring ELISA, and cells without antibody production were selected.

항체를 안정적으로 생산하는 생산 세포주를 확대배양하기 위하여, 로울러 병(roller bottle)에 2%의 Ultra Law IgG 소 태아혈청 첨가, 리보누클레오시드(ribonucleoside), 데옥시리보누클레오시드(deoxyribonucleoside)를 포함하지 않는 MEM배지를 이용하고, 대량 배양을 수행하였다. 배양 3 내지 4일째에 배양상등액을 회수하고, 0.2 ㎛의 필터(Millipore)에 의해 세포파쇄물을 제거하였다.To expand the production cell lines stably producing antibodies, 2% Ultra Law IgG fetal bovine serum was added to roller bottles, ribonucleosides and deoxyribonucleosides. Mass culture was performed using MEM medium not included. Culture supernatants were collected on the third to fourth days of culture, and cell debris was removed by a 0.2 μm filter (Millipore).

CHO 세포의 배양상등액으로부터 키메라 항체의 정제는 POROS 프로테인 A 칼럼(PerSeptive Biosystems)를 이용하여 ConSep LC100(Millipore)로 첨부된 처방에 따라 수행하고, 중화활성의 측정 및 고칼슘 혈증 모델 동물에서의 약효시험에 이용하였다. 수득한 정제 키메라 항체의 농도 및 항원결합활성은 상기 ELISA계로 측정하였다.Purification of chimeric antibodies from the culture supernatant of CHO cells was carried out using POROS Protein A column (PerSeptive Biosystems) according to the regimen attached to ConSep LC100 (Millipore), for the determination of neutralizing activity and for the efficacy test in hypercalcemia model animals. Was used. The concentration and antigen binding activity of the obtained purified chimeric antibody were measured by the ELISA system.

실시예 3 : 인간형화된 항체의 구축 Example 3 Construction of Humanized Antibodies

(1) 인간형화된 항체 H쇄의 구축(1) Construction of humanized antibody H chain

(i) 인간형화된 H쇄V영역의 구축(i) Construction of humanized H chain V region

인간형화된 #23-57-137-1항체 H쇄를 PCR법에 의한 CDR-이식에 의해 작제하였다. 인간항체 S31679(NBRF-PDB, Cuisinier A. M. et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-18, 1993) 유래의 FR를 가지는 인간형화 #23-57-137-1 항체H쇄(버젼“a”)의 작제를 위한 6개의 PCR 프라이머를 사용하였다. CDR-이식프라이머 MBC1HGP1(서열번호 23) 및 MBC1HGP3(서열번호 24)는 센스 DNA 서열을 가지고, 그리고 각각 프라이머의 양단에 15에서 21 bp의 상보적 서열을 가진다. 외부 프라이머 MBC1HVS1(서열번호 27) 및 MBC1HGP1 (서열번호 28)은 CDR 이식프라이머 MBC1HGP1 및 MBC1HGP4와 상동성을 가진다.Humanized # 23-57-137-1 antibody H chain was constructed by CDR-graft by PCR method. Humanized # 23-57-137-1 antibody H chain having version FR from human antibody S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier AM et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-18, 1993) Six PCR primers were used for the construction of a ”). CDR-graft primers MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) and MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) have a sense DNA sequence and each have a complementary sequence of 15 to 21 bp across the primer. The outer primers MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) and MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 28) have homology with the CDR grafting primers MBC1HGP1 and MBC1HGP4.

CDR-이식프라이머MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 및 MBC1HGP4는 요소변성 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 분리하고(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 겔로부터의 추출은 "crush and soak" 법((Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)로 수행하였다.CDR-grafted primers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 were isolated using urea-modified polyacrylamide gels (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), and extraction from gels The "crush and soak" method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

즉, 각각 1nmole의 CDR-이식프라이머를 6 % 변성 폴리아크릴아미드겔로 분리하고, 목적으로 하는 크기의 DNA 절편의 고정을 실리카겔 박층판상에서 자외선을 조사하여 수행하고, "crush and soak" 법으로 겔로부터 회수하고 20 ㎕의 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액에 용해하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq (다까라 주조)를 이용하여, 100 ㎕의 반응혼합액에 상기와 같은 방법으로 조제한 CDR-이식프라이머 MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 및 MBC1HGP4를 각각 1 ㎕, 0.25 mM의 dNTP 및 2.5 U의 TaKaRa Ex Taq 를 포함하는 조건으로, 첨가완충액을 사용하여 94 ℃로 1분간, 55 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 5회 수행하였다. 또한 50 pmole의 외부 프라이머 MBC1HVS1 및 MBC1HVR1을 가하여, 같은 온도 사이클을 30회 수행하였다. PCR법에 의해 증폭한 DNA 절편을 4 % Nu Sieve GTG 아가로오스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다.That is, 1 nmole of CDR-grafted primers were separated by 6% modified polyacrylamide gel, and fixing of DNA fragments of desired size was performed by irradiating UV light on silica gel lamination plate, and gel by "crush and soak" method. And were dissolved in 20 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), in which 1 µl, 0.25 mM dNTP, and 2.5 U of CDR-transformers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4, prepared in the same manner as above, in 100 µl reaction mixture. Under conditions including TaKaRa Ex Taq, the addition buffer was used five times in a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, and 1 minute at 72 ° C. In addition, 50 pmole external primers MBC1HVS1 and MBC1HVR1 were added to perform the same temperature cycle 30 times. DNA fragments amplified by PCR were separated by agarose gel electrophoresis using 4% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

421 bp 길이의 DNA 절편을 함유하는 아가로오스 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit(BI0101)을 이용하여, 키트 첨부의 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 정 제한 DNA를 에탄올 침전시킨 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다. 수득한 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 Hind III로 절단함으로써 조제한 pUC19에 서브클로닝하고, 염기서열을 결정하였다. 올바른 서열을 가지는 플라스미드를 'hMBCHv/pUC19'라고 명명하였다.The agarose portion containing the DNA fragment of 421 bp length was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the kit attachment prescription. After ethanol precipitation of the positive restriction DNA, it was dissolved in 20 µl of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA solution. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by cleavage with BamHI and Hind III, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid with the correct sequence was named 'hMBCHv / pUC19'.

(ii) 인간형화된 H쇄cDNA를 위한 H쇄V영역의 구축(ii) Construction of H chain V region for humanized H chain cDNA

인간 H쇄C영역 Cλ1의 cDNA와 연결하기 위하여 상기 방법으로 구축한 마우스 인간형화된 H쇄V영역의 DNA를 PCR법에 의해 수식하였다. 후방 프라이머MBC1HVS2는 V영역의 리더 서열의 5'-측을 코딩하는 서열과 결합하고, 또한, 코작 콘센서스 서열(Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), Hind III 및 EcoRI 인식서열을 가지도록 설계하였다. H쇄V영역의 DNA를 수식하기 위한 전방 프라이머MBC1HVR2(서열번호 10)은 J영역의 3'-측을 코딩하는 DNA 서열에 결합하고, 또한, C영역의 5'-측의 서열을 코딩하고 Apa I 및 Sam I 인식서열을 가지도록 설계하였다.In order to connect with the cDNA of the human H chain C region Cλ1, the DNA of the mouse humanized H chain V region constructed by the above method was modified by PCR. The back primer MBC1HVS2 binds to the sequence encoding the 5'-side of the leader sequence of the V region, and also the Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), Hind III and EcoRI recognition sequence. The forward primer MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) for modifying the DNA of the H-chain V region binds to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region, and also encodes the 5'-side sequence of the C region and Apa. It is designed to have I and Sam I recognition sequences.

PCR은 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조)를 이용하여, 주형 DNA로서 0.4 ㎍의 hMBCHv/pUC19를 이용하고, 프라이머로서 MBC1HVS2 및 MBC1HVR2를 각각 50 pmole, 2.5 U의 TaKaRa Ex Taq, 0.25 mM의 dNTP를 포함하는 조건으로, 첨부된 완충액을 사용하여, 94 ℃ 1분간, 55 ℃ 1분간, 72 ℃ 1분간의 온도 사이클로 30회 수행하였다. PCR법에 의해 증폭한 DNA절편을 3 % Nu Sieve GTG 아가로오스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다. PCR using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting) using 0.4 μg of hMBCHv / pUC19 as template DNA, MBC1HVS2 and MBC1HVR2 as primers, 50 pmole, 2.5 U TaKaRa Ex Taq, 0.25 mM dNTP, respectively. Under the condition of the above, using the attached buffer, the reaction was carried out 30 times in a temperature cycle of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. DNA fragments amplified by PCR were isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio. Products).

456 bp 길이의 DNA절편을 함유하는 아가로오스 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit (BI0101)을 이용하고, 키트에 첨부된 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올 침전시킨 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다. 수득한 PCR 반응혼합액을 EcoRI 및 Smal로 절단하여 조제한 pUC19에 서브클로닝하고, 염기서열을 결정하였다. 이러한 방법으로 수득한 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스H쇄V영역을 코딩하는 DNA를 함유하고, 5'-측에 EcoRI 및 Hind III 인식서열 및 Kozak 서열, 3'-측에 ApaI 및 SmaI 인식서열을 가지는 플라스미드를 'hMBC1v/pUC19'로 명명하였다. The agarose portion containing the 456 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the prescription attached to the kit. The purified DNA was ethanol precipitated, and then dissolved in 20 µl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by cleavage with EcoRI and Smal, and the nucleotide sequence was determined. DNA encoding the mouse H chain V region derived from hybridoma # 23-57-137-1 obtained by this method, containing EcoRI and Hind III recognition sequences and Kozak sequences, 3'- A plasmid having ApaI and SmaI recognition sequences on the side was named 'hMBC1v / pUC19'.

(2) 인간형화된 H쇄 발현벡터의 구축(2) Construction of humanized H chain expression vector

hPM1항체 H쇄 cDNA의 서열을 포함하는 플라스미드 RVh-PM1f-cDNA를 ApaI 및 BamHI로 절단하고, H쇄C영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA절편을 회수하고, ApaI 및 BamHI로 절단함으로써 조제한 hMBC1v/pUC19에 도입하였다. 이러한 방법으로 조제한 플라스미드를 'hMBC1v/pUC19'로 명명하였다. 이 플라스미드를 인간형화된 #23-57-137-1항체의 H쇄V쇄영역 및 인간 H쇄C영역Cλ1를 코딩하는 DNA를 포함하고, 5'-말단에 EcoRI 및 Hind III 인식서열, 3'-말단에 BamHI인식서열을 가진다. 플라스미드 hMBC1HcDNA/pUC19에 포함되는 인간형화된 H쇄 버젼 “a”의 염기서열 및 대응하는 아미노산 서열을 서열번호 58에 나타내었다. 또한, 버젼 a의 아미노산 서열을 서열번호 56에 나타내었다. hMBC1v prepared by cleaving the plasmid RVh-PM1f-cDNA comprising the sequence of hPM1 antibody H-chain cDNA with ApaI and BamHI, recovering a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the H-chain C region, and cutting it with ApaI and BamHI. introduced in / pUC19. The plasmid prepared in this way was named 'hMBC1v / pUC19'. This plasmid contains DNA encoding the H chain V chain region and the human H chain C region Cλ1 of the humanized # 23-57-137-1 antibody, and the EcoRI and Hind III recognition sequences at the 5'-end, 3 ' -Has the BamHI recognition sequence at the end. The base sequence of the humanized H chain version “a” included in the plasmid hMBC1HcDNA / pUC19 and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 58. In addition, the amino acid sequence of version a is shown in SEQ ID NO: 56.

hMBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI로 절단하고, 수득한 H쇄 서열을 포함하 는 DNA 절편을 EcoRI 및 BamHI로 절단함으로써 조제한 발현 플라스미드 pCOS1에 도입하였다. 이러한 방법으로 수득한 인간형화된 항체의 발현 플라스미드를 'hMBC1HcDNA/pCOS1'이라고 명명하였다.hMBC1HcDNA / pUC19 was introduced into the expression plasmid pCOS1 prepared by cleaving with EcoRI and BamHI and cutting the DNA fragments containing the obtained H chain sequence with EcoRI and BamHI. The expression plasmid of the humanized antibody obtained by this method was named 'hMBC1HcDNA / pCOS1'.

또한, CHO세포에서의 발현에 이용하기 위한 플라스미드를 제작하기 위한 hMBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI로 절단하고, 수득한 H쇄서열을 포함하는 DNA 절편을 EcoRI 및 BamHI로 절단함으로써 조제한 발현 플라스미드 pCHO1에 도입하였다. 이러한 방법으로 인간형화된 항체의 발현 플라스미드를 'hMBC1HcDNA/pCHO1'으로 명명하였다.In addition, hMBC1HcDNA / pUC19 for preparing a plasmid for use in expression in CHO cells was cut into EcoRI and BamHI and introduced into an expression plasmid pCHO1 prepared by cutting the DNA fragment containing the obtained H chain sequence with EcoRI and BamHI. It was. The expression plasmid of the humanized antibody in this way was named 'hMBC1HcDNA / pCHO1'.

(3) L쇄하이브리드 가변영역의 구축(3) Construction of L chain hybrid variable region

(i) FR1, 2/FR 3, 4 하이브리드 항체의 작제(i) Construction of FR1, 2 / FR 3, 4 Hybrid Antibodies

인간형화된 항체와 마우스(키메라)항체의 FR영역을 재조합한 L쇄를 코딩하는 DNA를 구축하고, 인간형화를 위한 각 영역의 평가를 수행하였다. CDR 2내에 존재하는 제한효소 A flII 절단부위를 이용함으로써 FR1 및 2는 인간항체 유래, FR3 및 4는 마우스항체 유래가 되는 하이브리드 항체를 작제하였다: 플라스미드 MBC1L(λ)/neo 및 hMBC1L(λ)/neo 각 10 ㎍를 10 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01 %(w/v) BSA, AflII(다까라 주조) 10 U를 함유하는 반응혼합액 100 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. 반응액을 2% 저융점 아가로오스겔로 전기영동하고, 플라스미드 MBC1L(λ)/neo로부터 6282 bp의 절편(c1으 로 한다) 및 1022 bp의 절편(c2로 한다), 플라스미드 hMBC1L(λ)/neo로부터 6282 bp의 절편(h1로 한다) 및 1022 bp의 절편(h2로 한다)을 GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하였다.DNA encoding the L chain obtained by recombining the FR regions of the humanized antibody and the mouse (chimeric) antibody was constructed, and evaluation of each region for humanization was performed. By using restriction enzyme A flII cleavage sites present in CDR 2, FR1 and 2 were constructed from human antibodies, FR3 and 4 were derived from mouse antibodies: plasmids MBC1L (λ) / neo and hMBC1L (λ) / 10 μg each of neo reaction mixture containing 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) BSA, AflII (Tadaka casting) 10 U It cut | disconnected at 37 degreeC in 100 microliters for 1 hour. The reaction solution was electrophoresed on a 2% low melting agarose gel, a 6282 bp fragment (to be c1) and a 1022 bp (to be c2) from the plasmid MBC1L (λ) / neo, plasmid hMBC1L (λ) A 6282 bp fragment (called h1) and a 1022 bp fragment (called h2) from / neo were recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101).

회수한 c1, h1 절편 각 1 ㎍에 대하여 BAP 처리를 수행하였다. DNA를 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전으로 회수한 후, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 10 ㎕에 용해하였다.BAP treatment was performed on 1 µg of each of the recovered c1 and h1 fragments. DNA was extracted with phenol and chloroform, recovered by ethanol precipitation, and dissolved in 10 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution.

BAP 처리한 c1 및 h1 절편 1 ㎕을 각각 h2, c2 절편 4 ㎕에 연결하고(4 ℃, 하룻밤), 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 2 ㎖로 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 1 μl of B1 treated c1 and h1 fragments were linked to 4 μl of h2 and c2 fragments (4 ° C., overnight) and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated with 2 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 플라스미드를 10 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT, 및 ApaLI(다까라 주조) 2U, Hind I(다까라 주조) 8U 또는 Hind III (다까라 주조)8U를 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. c1-h2가 올바르게 연결되어 있다면, ApaLI로 5560/1246/498 bp, BamHI/Hind III로 7134/269 bp의 절단절편이 생김으로써, 플라스미드의 확인을 수행하였다. Purified plasmids were treated with 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ and 1 mM DTT, and ApaLI (Cast Cast) 2U, Hind I (Cast Cast) 8U or Hind III (Cast Cast) 8U. In 20 µl of the reaction mixture containing was cut at 37 ℃ 1 hour. If c1-h2 was correctly linked, the plasmid was confirmed by generating 5560/1246/498 bp of ApaLI and 7134/269 bp of BamHI / Hind III.

인간 FR1, 2/마우스 FR3, 4하이브리드 항체 L쇄를 코딩하는 발현벡터를 'h/mMBC1L(λ)/neo'로 명명하였다. 한편, h1-c2의 클론이 수득되지 않기 때문에, pUC 벡터상에 제조합되기 때문에 HEF 벡터에 클로닝하였다. 그 때, 아미노산 치환이 없는 인간형화된 항체L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 hMBC1La λ/pUC19, 및 FR3 내의 91 위치(카밧의 규정에 따른 아미노산 번호 87 위치)의 티로신을 이소로이신으로 치환한 인간형화된 항체 L쇄V영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 hMBC1Ldλ/pUC19를 주형으로 이용하였다.The expression vector encoding human FR1, 2 / mouse FR3, 4 hybrid antibody L chain was named 'h / mMBC1L (λ) / neo'. On the other hand, since a clone of h1-c2 was not obtained, it was cloned into the HEF vector since it was synthesized on the pUC vector. Then, tyrosine at position 91 (amino acid number 87 position according to Kabat's definition) in plasmid hMBC1La λ / pUC19 containing DNA encoding humanized antibody L chain V region without amino acid substitution was replaced with isoleucine. The plasmid hMBC1Ldλ / pUC19 containing DNA encoding the substituted humanized antibody L chain V region was used as a template.

플라스미드MBC1L(λ)/pUC19, hMBC1Laλ/pUC19 및 hMBC1Ldλ/pUC19의 각 10 ㎍를 10 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10 mM MgCl_{2 ,} 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01 % (w/v) BSA, Hind III 16 U, AflII 4U를 함유하는 반응혼합액 30 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. 반응액을 2 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동하고, 플라스미드 MBC1L(λ)/pUC19에서 215 bp(c2'), 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19 및 hMBC1Ldλ/pUC19로부터 각각 3218 bp(hal', hd1')의 DNA절편을 GENECLEAN II Kot(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하였다.Each 10 μg of plasmid MBC1L (λ) / pUC19, hMBC1Laλ / pUC19 and hMBC1Ldλ / pUC19 was added to 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) The reaction mixture was cut at 37 ° C. for 1 hour in 30 μl of a reaction mixture containing BSA, Hind III 16 U, and AflII 4U. The reaction solution was electrophoresed on 2% low melting agarose gel and 218 bp (c2 ') at plasmid MBC1L (λ) / pUC19, 3218 bp (hal', hd1 ') from plasmids hMBC1Laλ / pUC19 and hMBC1Ldλ / pUC19, respectively. DNA fragments were recovered from the gel using GENECLEAN II Kot (BI0101) and purified.

hal', hdl' 절편을 각각 c2' 절편에 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 2 ㎖로 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. hal', hdl' 절편을 포함하는 플라스미드를 각각 플라스미드 'm/hMBC1Laλ/pUC19' 및 'm/hMBC1Ldλ/pUC19'로 명명하였다.The hal 'and hdl' fragments were respectively linked to c2 'fragments and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated with 2 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Plasmids containing hal ', hdl' fragments were named plasmids 'm / hMBC1Laλ / pUC19' and 'm / hMBC1Ldλ / pUC19', respectively.

수득한 플라스미드 m/hMBC1Laλ/pUC19, m/hMBC1Ldλ/pUC19를 EcoRI로 절단하였다. 각각 743 bp의 DNA 절편을 2 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 20 ㎕에 용해하였다.The obtained plasmids m / hMBC1Laλ / pUC19 and m / hMBC1Ldλ / pUC19 were digested with EcoRI. Each 743 bp DNA fragment was electrophoresed on a 2% low melting agarose gel, then recovered from the gel using GENECLEANII Kit (BI0101), purified, 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution. Dissolved in 20 μl.

각 DNA 절편 4 ㎕를 전술한 BAP 처리한 HEF 벡터 1 ㎕에 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 2 ㎖로 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 4 μl of each DNA fragment was linked to 1 μl of the above-described BAP-treated HEF vector and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated with 2 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 각 플라스미드를 20 mM Tris-HC1(pH 8.5), 10 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT, 100 mM KCl, Hind III (다까라 주조)8U, PvuI(다까라 주조)2U를 포함하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에서 1시간 절단하였다. 절편이 올바른 방향으로 삽입되어 있지 않다면, 5104/2195 bp, 역방향으로 삽입되어 있다면 4378/2928 bp의 절단 절편이 생김으로써 플라스미드의 확인을 수행하였다. 이들을 마우스 FR1, 2/인간 FR3. 4하이브리드항체 L쇄를 코딩하는 발현벡터 'm/hMBC1Laλ/neo' 및 'm/hMBC1Ldλ/neo'로 명명하였다.Each purified plasmid was subjected to a reaction mixture containing 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ and 1 mM DTT, 100 mM KCl, Hind III (Takara Casting) 8U, PvuI (Takara Casting) 2U. 1 hour was cut in the μL. If the fragment was not inserted in the correct direction, 5104/2195 bp and 4378/2928 bp cleavage fragments were generated if inserted in the reverse direction to confirm the plasmid. These were mouse FR1, 2 / human FR3. The expression vectors 'm / hMBC1Laλ / neo' and 'm / hMBC1Ldλ / neo' encoding the 4 hybrid antibody L chains were named.

(ii) FR1/FR2 하이브리드 항체의 작제(ii) Construction of FR1 / FR2 Hybrid Antibodies

CDR내에 존재하는 SnaBI 절단부위를 이용함으로써 같은 방법으로 FR1과 FR2의 하이브리드 항체를 작제하였다: 플라스미드 MBC1L(λ)/neo 및 h/mMBC1L(λ)/neo 각 10 ㎍를 10 mM Tris-HC1(pH 7.9), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01 %(w/v) BSA, SnaBI(다까라 주조)6U을 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단한 다음, 20 mM Tris-HC1(pH 8.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0.01 %(w/v) BSA, PvuI 6U을 함유하는 반응혼합액 50 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절 단하였다.Hybrid antibodies of FR1 and FR2 were constructed in the same manner by using SnaBI cleavage sites present in the CDRs: 10 μg of each of the plasmids MBC1L (λ) / neo and h / mMBC1L (λ) / neo was 10 mM Tris-HC1 (pH). 7.9), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) BSA, SnaBI (Takara Casting) 6U containing 20U of the reaction mixture was cut for 1 hour at 37 ℃, 1 hour cutting at 37 ° C. in 50 μl reaction mixture containing 20 mM Tris-HC1 (pH 8.5), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0.01% (w / v) BSA, PvuI 6U It was.

반응액을 1.5 % 저융점 아가로오스겔로 전기영동한 후, 플라스미드 MBC1L(λ)/neo로부터 4955 bp (m1) 및 2349 bp (m2), 플라스미드 h/mMBC1L(λ)/neo로부터 4955 bp (hm1) 및 2349 bp (hm2)의 각 DNA 절편을 GENECLEANII Kit(BI0101)을 이용하여 겔로부터 회수, 정제하고, 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액 40 ㎕에 용해하였다.The reaction solution was electrophoresed with 1.5% low melting agarose gel, and then 4955 bp (m1) and 2349 bp (m2) from plasmid MBC1L (λ) / neo and 4955 bp from plasmid h / mMBC1L (λ) / neo ( Each DNA fragment of hm1) and 2349 bp (hm2) was recovered from the gel using GENECLEANII Kit (BI0101), purified, and dissolved in 40 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution.

ml, hml 절편 1 ㎕를 각각 hm2, m2 절편 4 ㎕에 연결하고, 대장균 JM109 컴피턴트세포에 형질전환하였다. 50 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2 ×YT 2 ㎖로 배양하고, 균체회분으로부터 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 1 μl of the ml and hml fragments were linked to 4 μl of the hm2 and m2 fragments, respectively, and transformed into E. coli JM109 competent cells. The cells were incubated with 2 ml of 2 x YT containing 50 µg / ml empicillin, and the plasmids were purified from the bacterial batches using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

정제한 각 플라스미드를 10 mM Tris-HC1(pH 7.5), 10 mM MgCl_{2 ,} 1 mM DTT 및 ApaLI(다까라 주조) 8U 또는 ApaI(다까라 주조) 8U 또는 ApaLI(다까라 주조)2U를 함유하는 반응혼합액 20 ㎕ 속에서 37 ℃로 1시간 절단하였다. Each purified plasmid contains 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 10 mM MgCl _2, 1 mM DTT and ApaLI (Cast Cast) 8U or ApaI (Cast Cast) 8U or ApaLI (Cast Cast) 2U. The reaction mixture was cut at 37 ° C. for 1 hour in 20 μl.

각 절편이 올바르게 연결되어 있다면, ApaI로 7304 bp, ApaLI로 5560/1246/498 bp(ml-hm2), ApaLI로 6538/766 bp, ApaLI로 3535/2025/1246/498 bp(hml-m2)의 절단 절편이 생김으로써 플라스미드의 확인을 수행하였다. If the sections are correctly connected, then 7304 bp with ApaI, 5560/1246/498 bp (ml-hm2) with ApaLI, 6538/766 bp with ApaLI, 3535/2025/1246/498 bp (hml-m2) with ApaLI Identification of the plasmid was performed by the cleavage fragments.

인간 FR1/마우스FR2, 3, 4하이브리드항체 L쇄를 코딩하는 발현벡터를 'mhmMBC1L(λ)/neo'로 명명하였다.The expression vector encoding human FR1 / mouseFR2, 3, 4 hybrid antibody L chain was named 'mhmMBC1L (λ) / neo'.

(4) 인간형화된 항체 L쇄의 구축(4) Construction of Humanized Antibody L Chain

인간형화된 #23-57-137-1항체 L쇄를 PCR법에 의한 CDR-이식에 의해 작제하였다: 인간항체 HSU03868(GEN-BANK, Deftos M. Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) 유래의 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간항체 S25755(NBRF-PDB) 유래의 FR4를 가지는 인간형화된 #23-57-137-1 항체L쇄(버젼“a”)의 작제를 위한 6개의 PCR 프라이머를 사용하였다. Humanized # 23-57-137-1 antibody L chain was constructed by CDR-graft by PCR method: human antibody HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. Scand. J. Immunol., 39, 95-103 , 1994) 6 for the construction of humanized # 23-57-137-1 antibody L chain (version “a”) with FR1, FR2 and FR3 from human antibody and FR4 from human antibody S25755 (NBRF-PDB) PCR primers were used.

CDR-이식프라이머MBC1LGP1(서열번호 29) 및 MBC1LGP3(서열번호 30)는 센스 DNA 서열을 가지고, 그리고 CDR-이식프라이머MBC1LGP2(서열번호 31) 및 MBC1LGP4(서열번호 32)는 안티센스 DNA 서열을 가지고, 그리고 각각 프라이머의 양단에 15에서 21 bp의 상보적 서열을 가진다. 외부 프라이머MBC1LVS1(서열번호 33) 및 MBC1LVR1 (서열번호 34)은 CDR 이식프라이머MBC1LGP1, MBC1LGP4와 상동성을 가진다.CDR-Primer MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) and MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) have sense DNA sequences, CDR-Primer MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) and MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) have antisense DNA sequences, and Each has a complementary sequence of 15 to 21 bp across both primers. The outer primers MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) and MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34) have homology with the CDR grafted primers MBC1LGP1, MBC1LGP4.

CDR-이식프라이머MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 및 MBC1LGP4는 요소변성 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 분리하고(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 겔로부터의 추출은 crush and soak 법((Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)로 수행하였다: 즉, 각각 1nmole의 CDR-이식프라이머를 6 % 변성 폴리아크릴아미드겔로 분리하고, 목적으로 하는 크기의 DNA 절편의 고정을 실리카겔 박층판상에서 자외선을 조사하여 수행하고, crush and soak 법으로 겔로부터 회수하고, 20 ㎕의 10 mM Tris-HC1(pH 7.4), 1 mM EDTA 용액에 용해하였다. CDR-grafted primers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4 were isolated using urea modified polyacrylamide gels (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), and extraction from the gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989): each 1 nmole of CDR-grafted primers were isolated with 6% modified polyacrylamide gels and The fixation of DNA fragments of the desired size was carried out by irradiation with ultraviolet rays on a thin plate of silica gel, and recovered from the gel by crush and soak method, and 20 μl of 10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA solution Dissolved.

PCR은 TaKaRa Ex Taq (다까라 주조)를 이용하여, 100 ㎕의 반응혼합액에 상기와 같은 방법으로 조제한 CDR-이식프라이머MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 및 MBC1LGP4를 각각 1 ㎕, 0.25 mM의 dNTP 및 2.5 U의 TaKaRa Ex Taq 를 포함하는 조건으로, 첨가완충액을 사용하여 94 ℃로 1분간, 55 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 5회 수행하고, 이 반응혼합액에 50 pmole의 외부 프라이머 MBC1LVS1 및 MBC1LVR1을 가하여, 같은 온도 사이클로 30회 반응시켰다. PCR법에 의해 증폭한 DNA 절편을 3 % Nu Sieve GTG 아가로오스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다.PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), in which 1 µl, 0.25 mM dNTP, and 2.5 U of CDR-transformers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4, prepared in the same manner as above, in 100 µl of reaction mixture. Under conditions including TaKaRa Ex Taq, the addition buffer was used five times in a temperature cycle of 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 55 ° C. and 1 minute at 72 ° C., and the reaction mixture was subjected to 50 pmole of external primer MBC1LVS1 and MBC1LVR1 was added and reacted 30 times in the same temperature cycle. DNA fragments amplified by PCR were isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio. Products).

421 bp 길이의 DNA 절편을 함유하는 아가로오스 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit(BI0101)을 이용하여, 키트 첨부의 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 수득한 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 Hind III로 절단합으로써 조제한 pUC19에 서브클로닝하고, 염기서열을 결정하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 'hMBCL/pUC19'라고 명명하였다. 그러나, CDR4의 104 위치(Kabat의 규정에 의한 아미노산 번호 96 위치)의 아미노산이 알기닌으로 되어 있기 때문에, 이것을 티로신으로 수정하기 위한 프라이머 MBC1LGP10R(서열번호 35)를 설계하고 합성하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq (다까라 주조)를 이용하여, 100 ㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.6 ㎍의 플라스미드 hMBCL/pUC19, 프라이머로서 MBC1LVS1 및 MBC1LGP10R을 각각 50 pmole, 2.5 U의 TaKaRa Ex Taq(다까라 주조) 0.25 mM의 dNTP를 포함하는 조건으로, 첨가완충액을 사용하여 50 ㎕의 미네랄오일을 상층하여 94 ℃로 1분간, 55 ℃로 1분간, 72 ℃로 1분간의 온도 사이클로 30회 수행하였다. PCR법에 의해 증폭한 DNA 절편을 3 % Nu Sieve GTG 아가로오스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다.The agarose portion containing the DNA fragment of 421 bp length was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the kit attachment prescription. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by cleavage with BamHI and Hind III, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid obtained in this way was named 'hMBCL / pUC19'. However, since the amino acid at position 104 of CDR4 (amino acid number 96 position according to Kabat's definition) is arginine, a primer MBC1LGP10R (SEQ ID NO: 35) for correcting this with tyrosine was designed and synthesized. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Casting), in 100 μl reaction mixture, 0.6 μg of plasmid hMBCL / pUC19 as template DNA, MBC1LVS1 and MBC1LGP10R as primers, respectively, 50 pmole and 2.5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara). Casting) 50 μl of mineral oil was superimposed on a buffer containing 0.25 mM of dNTP, followed by 30 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, and 1 minute at 72 ° C. DNA fragments amplified by PCR were isolated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio. Products).

421 bp 길이의 DNA 절편을 함유하는 아가로오스 부분을 잘라내고, GENECLEAN II Kit(BI0101)을 이용하여, 키트 첨부의 처방에 따라 DNA절편을 정제하였다. 수득한 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 Hind III로 절단함으로써 조제한 pUC19에 서브클로닝하였다.The agarose portion containing the DNA fragment of 421 bp length was cut out, and the DNA fragment was purified using the GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the kit attachment prescription. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by cleavage with BamHI and Hind III.

M13 Primer M4 프라이머 및 M13 Primer RV 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정한 결과, 올바른 서열을 수득할 수 있기 때문에, 이 플라스미드를 Hind III 및 BlnI로 절단하고, 416 bp의 절편을 1 % 아가로오스 전기영동에 의해 분리하였다. GENECLEAN II Kit(BI0101)을 이용하여, 키트에 첨부된 방법에 따라 DNA절편을 정제하였다. 수득한 PCR 반응혼합물을 Hind III 및 BamHI 로 절단함으로써 조제한 플라스미드 Cλ/pUC19에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 개시코돈이 위치하도록 하였다. 인간형화된 L쇄 버젼 “a”의 염기서열(대응하는 아미노산을 포함한다)을 서열번호 66으로 나타낸다. 또한, 서브클로닝하였다. 버젼 “a”의 염기서열을 서열번호 47로 나타낸다.The sequence was determined using the M13 Primer M4 primers and the M13 Primer RV primers. As a result of the correct sequence, the plasmid was digested with Hind III and BlnI, and 416 bp fragments were subjected to 1% agarose electrophoresis. Separated by. Using the GENECLEAN II Kit (BI0101), DNA fragments were purified according to the method attached to the kit. The obtained PCR reaction mixture was cut into Hind III and BamHI and introduced into the prepared plasmid Cλ / pUC19, so that the start codon of the humanized L chain was located downstream of the EF1α promoter. The base sequence of the humanized L chain version “a” (including the corresponding amino acid) is shown by SEQ ID NO: 66. It was also subcloned. The nucleotide sequence of version “a” is shown in SEQ ID NO: 47.

버젼 “b”를 PCR법에 의한 변성도입을 작제하였다. 버젼 “b”에서는 43 위치(Kabat의 규정에 따른 아미노산 번호 43위치)의 글리신을 프롤린으로, 49위치(Kabat의 규정에 따른 아미노산 번호 49위치)의 글리신을 아스파라긴산으로 변경하도록 설계하였다. 변성원 프라이머(mutagenic primer) MBC1LGP5R(서열번호 36)과 프라이머 MBC1LVS에 의해, 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19를 주형으로 사용하고, PCR을 수행하여 수득한 DNA 절편을 BamHI 및 Hind III로 절단하고, pUC19의 BamHI, Hind III 부위에 서브클로닝하였다. 염기서열을 결정한 후, 제한효소 Hind III 및 AflII로 절단하고, Hind III 및 AflII로 절단한 hMBC1Laλ/pUC19로 연결하였다.The version “b” was constructed to be denatured by PCR. In version “b”, the glycine at position 43 (amino acid number 43 according to Kabat's regulation) was changed to proline and the glycine at position 49 (amino acid number 49 position according to Kabat's regulation) was changed to aspartic acid. DNA fragments obtained by PCR using the plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a template, were digested with BamHI and Hind III by mutagenic primer MBC1LGP5R (SEQ ID NO: 36) and primer MBC1LVS. Subcloned to Hind III site. After determining the nucleotide sequence, it was digested with restriction enzymes Hind III and AflII and linked with hMBC1Laλ / pUC19 digested with Hind III and AflII.

이러한 방법으로 플라스미드를 hMBC1Lbλ/pUC19로 하고, 이 플라스미드를 EcoRI로 절단하고, 인간형화된 L쇄를 코딩하는 DNA를 포함하는 절편을 플라스미드 pCOS1에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 개시 코돈이 위치하도록 하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 'hMBC1Laλ/pCOS1'라고 명명하였다. In this way, the plasmid was designated hMBC1Lbλ / pUC19, the plasmid was digested with EcoRI, a fragment containing DNA encoding the humanized L chain was introduced into plasmid pCOS1, and the humanized L chain downstream of the EF1α promoter. The start codon was positioned. The plasmid obtained in this way was named 'hMBC1Laλ / pCOS1'.

버젼“c”를 PCR법에 의한 변성도입을 이용하여 작제하였다: 버젼 “c”로는 84위치(Kabat의 규정에 의한 아미노산 번호 80위치)의 세린을 프롤린으로 변경되도록 하였다. 변성원 프라이머 MBC1LGP6S(서열번호 37)와 프라이머 M13 Primer RV에 의한 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19를 주형으로 PCR을 수행하고, 수득한 DNA 절편을 BamHI 및 Hind III로 절단하고, BamHI 및 Hind III로 절단함으로써 조제한 pUC19에 서브클로닝하였다. 염기서열을 결정한 후, 제한효소 BstPI 및 Aor 51HI로 절단하고, Bst PI 및 Aor51HI로 절단한 hMBC1Laλ/pUC19로 연결하였다. 이러한 방법으로 프라스미드를 'hMBC1Laλ/pUC19'로 명명하고, 이 플라스미드를 제한효소 EcoREcoRI 부위에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 코돈이 위치되도록 하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 'hMBC1Laλ/pCOS1'로 명명하였다.Version “c” was constructed using denaturation introduction by PCR method: version “c” was allowed to change the serine at position 84 (amino acid number 80 position according to Kabat's definition) to proline. PUC19 prepared by PCR of the plasmid hMBC1Laλ / pUC19 by denaturing primer MBC1LGP6S (SEQ ID NO: 37) and primer M13 Primer RV, cleavage of the obtained DNA fragment with BamHI and Hind III, and cleavage with BamHI and Hind III Was subcloned. After determining the nucleotide sequence, it was digested with restriction enzymes BstPI and Aor 51HI and linked with hMBC1Laλ / pUC19 digested with Bst PI and Aor51HI. In this way, the plasmid was named 'hMBC1Laλ / pUC19' and this plasmid was introduced into the restriction enzyme EcoREcoRI site, so that the codon of the humanized L chain was located downstream of the EF1α promoter. The plasmid obtained in this way was named 'hMBC1Laλ / pCOS1'.

버젼 “d”, “e”및 “f”를 PCR법에 의한 변성도입을 이용하여 작제하였다: 순서대로 “a”, “b”, “c”버젼의 91 위치(Kabat의 규정에 따라 아미노산 번호 87위치)의 티로신을 이소로이신으로 변경하도록 설계하였다. 변성원 프라이머 MBC1LFP11R(서열번호 38)과 프라이머 M-S1(서열번호 44)에 의해 각각 hMBC1LGP11R(서열번호 38)과 프라이머 hMBC1Laλ/pCOS1, hMBC1Lcλ/pCOS1를 주형으로서 PCR을 수행하고, 수득한 DNA 절편을 BamHI 및 HindIII로 절단하고, BamHI 및 HindIII로 절단함으로써 조제한 pUC19에 서브클로닝하였다. 염기서열을 결정한 후, Hind III 및 BlnI로 절단하고, Hind III 및 BlnI로 절단함으로써 조제한 Cλ/pUC19로 연결하였다.Versions “d”, “e” and “f” were constructed using denaturation introduction by PCR: sequence 91 positions of “a”, “b” and “c” versions (amino acid number as defined by Kabat) The tyrosine at position 87) isoleucine. PCR was carried out using hMBC1LGP11R (SEQ ID NO: 38) and primers hMBC1Laλ / pCOS1, hMBC1Lcλ / pCOS1 as a template by the denatured primers MBC1LFP11R (SEQ ID NO: 38) and primer M-S1 (SEQ ID NO: 44), respectively, and the resulting DNA fragments were obtained. Subcloned into pUC19 prepared by cleavage with BamHI and HindIII and cleavage with BamHI and HindIII. After determining the nucleotide sequence, it was cleaved with Hind III and BlnI, and linked with Cλ / pUC19 prepared by cleavage with Hind III and BlnI.

이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 순서대로 'hMBC1Ldλ/pUC19', 'hMBC1Leλ/pCU19' 및 'hMBC1Lfλ/pUC19'로 명명하였다. 이들 플라스미드를 EcoRI 절단하고, 인간형화된 L쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 플라스미드pCOS1의 EcoRI 부위에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 개시 코돈이 위치되도록 하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 각각 순서대로 'hMBC1Ldλ/pCOS1', 'hMBC1Leλ/pCOS1' 및 'hMBC1Lfλ/pCOS1' 로 명명하였다.Plasmids obtained in this manner were named 'hMBC1Ldλ / pUC19', 'hMBC1Leλ / pCU19', and 'hMBC1Lfλ / pUC19' in this order. These plasmids were EcoRI cleaved, a sequence comprising the sequence encoding the humanized L chain was introduced into the EcoRI site of plasmid pCOS1 and the start codon of the humanized L chain was located downstream of the EF1α promoter. The plasmids obtained in this manner were named 'hMBC1Ldλ / pCOS1', 'hMBC1Leλ / pCOS1' and 'hMBC1Lfλ / pCOS1', respectively.

버젼 “g”및“h”를 PCR법에 의한 변성도입을 이용하여 작제하였다: 순서대로 “a”,“d”버젼의 36 위치(Kabat의 규정에 따라 아미노산 번호 36위치)의 히스티신을 티로신으로 변경하도록 설계하였다. 변성원 프라이머 MBC1LGP9R(서열번호 39) 및 M13 Primer RV를 프라이머로서 이용하고, hMBC1Laλ/pUC19를 주형으로 PCR을 수행하고, 수득한 PCR 산물과 M13 Primer M4를 프라이머로서 이용하고, 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19를 주형으로서 또한 PCR을 수행하였다. 수득한 DNA 절편을 HindIII 및 BnlI로 절단하고, HindIII 및 BlnI 로 절단함으로써 조제한 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 MBC1LGP13R(서열번호 40)과 MBC1LVS1을 프라이머로 한 PCR을 수행하였다. 수득한 PCR 절편을 ApaI 및 Hind III로 절단하고, ApaI 및 Hind III로 절단한 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19 및 hMBC1Ldλ/pUC19에 도입하였다. 염기서열을 결정하고, 올바른 서열을 포함하는 플라스미드를 순서대로 hMBC1Lgλ/pUC19 및 hMBC1Lhλ/pUC19로 하고, 이들 플라스미드를 제한효소 EcpRI 절단하고, 인간형화된 L쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 서열을 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 부위에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 개시 코돈이 위치하도록 하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 각각 순서대로 'hMBC1Lgλ/pCOS1' 및 'hMBC1Lhλ/pCOS1'로 명명하였다.Versions “g” and “h” were constructed using denaturation by PCR: histicin at the 36a position (amino acid number 36 position according to Kabat's specification) of the “a” and “d” versions in sequence Designed to change. Denatured primers MBC1LGP9R (SEQ ID NO: 39) and M13 Primer RV were used as primers, PCR was carried out using hMBC1Laλ / pUC19 as a template, the obtained PCR product and M13 Primer M4 were used as primers, and plasmid hMBC1Laλ / pUC19 was used as a template. PCR was also performed as. The obtained DNA fragment was digested with HindIII and BnlI and subcloned into plasmid hMBC1Laλ / pUC19 prepared by cutting with HindIII and BlnI. Using this plasmid as a template, PCR was performed using primers MBC1LGP13R (SEQ ID NO: 40) and MBC1LVS1 as primers. The obtained PCR fragment was digested with ApaI and Hind III and introduced into plasmids hMBC1Laλ / pUC19 and hMBC1Ldλ / pUC19 digested with ApaI and Hind III. Sequences were determined, and the plasmids containing the correct sequence were sequenced to hMBC1Lgλ / pUC19 and hMBC1Lhλ / pUC19, these plasmids were digested with restriction enzyme EcpRI, and the sequence comprising the sequence encoding the humanized L chain was determined by plasmid pCOS1. Was introduced at the EcoRI site, and the start codon of the humanized L chain was located downstream of the EF1α promoter. The plasmids obtained in this manner were named 'hMBC1Lgλ / pCOS1' and 'hMBC1Lhλ / pCOS1' in order.

버젼 “i”, “j”, “k”, “l”, “m”, “n”및 “o”를 PCR법에 의한 변성도입을 이용하여 작제하였다: 변성원 프라이머 MBC1LGP14S(서열번호 41)과 프라이머 V1RV(λ)(서열번호 43)에 의해 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19를 주형으로서 또한 PCR을 수행하고, 수득한 DNA 절편을 ApaI 및 BnlI로 절단하고, ApaI 및 BlnI 로 절단함으로써 조제한 플라스미드 hMBC1Laλ/pUC19에 서브클로닝하였다. 염기서열을 결정하고, 각각의 버젼에 대응한 변이가 도입된 클론을 선택하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 'hMBC1Lxλ/pCOS1(x = i, j, k, l, m, n, o)'로 명명하고, 이 플라스미드를 EcoRI 절단하고, 인간형화된 L쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 부위에 도입하고, EF1α프로모터의 하류에 인간형화된 L쇄의 개시 코돈이 위치되도록 하였다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드를 'hMBC1Lxλ/pCOS1(x = i, j, k, l, m, n,o)'라고 명명하였다. 버젼 “j”, “l”, “m”및 “o”의 염기서열(대응하는 아미노산을 포함한다)을 각각 서열번호 67, 68, 69, 70에 나타낸다. 또한, 이들 각 버젼의 아미노산 서열을 각각 서열번호 48, 49, 50, 51로 나타낸다.Versions “i”, “j”, “k”, “l”, “m”, “n” and “o” were constructed using denaturation by PCR: denaturing primer MBC1LGP14S (SEQ ID NO: 41) And plasmid hMBC1Laλ / pUC19 as a template by PCR and primer V1RV (λ) (SEQ ID NO: 43) as well as to the plasmid hMBC1Laλ / pUC19 prepared by cleavage of the obtained DNA fragment with ApaI and BnlI and cleavage with ApaI and BlnI. Subcloning. Sequences were determined and clones in which the variants corresponding to each version were introduced were selected. The plasmid obtained by this method was named 'hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = i, j, k, l, m, n, o)' and the sequence encoding EcoRI cleavage and encoding the humanized L chain was obtained. It was introduced into the EcoRI site of the containing plasmid pCOS1 and the start codon of the humanized L chain was located downstream of the EF1α promoter. The plasmid obtained by this method was named 'hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = i, j, k, l, m, n, o)'. The base sequences of the versions “j”, “l”, “m” and “o” (including the corresponding amino acids) are shown in SEQ ID NOs: 67, 68, 69 and 70, respectively. In addition, the amino acid sequence of each of these versions is shown by SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, respectively.

버젼 “p”, “q”, “r”, “s”및 “t”는 버젼 “i”, “j”, “m”, “l”또는 “o”의 아미노산 서열의 87 위치의 티로신을 이소로이신으로 치환한 버젼이고, FR3내에 존재하는 제한효소 Aor51MI 절단부위를 이용하여 버젼 “h”를 각 버젼“i”, “j”, “m”, “l”또는 “o”과 연결되어 바뀜으로써 작제하는 것이다. 즉, 발현벡터 플라스미드 hMBC1Lxλ/pCOS1(x = i, j, m, l, o)중에서, CDR3 및 FR3의 일부 및 FR4를 포함하는 Aor51HI 절편 514 bp를 제거하고, 여기에서 발현 플라스미드 hMBC1Lhλ/pCOS1 중에서, CDR3 및 FR3의 일부 및 FR4를 포함하는 Aor514 bp를 연결함으로써 91위치(Kabat의 규정에 의한 아미노산 번호 87 위치)의 티로신이 이소로이신이 되도록 하였다. 염기서열을 결정하고, 각 버젼 “i”, “j”, “m”, “l”및 “o”의 91위치(Kabat의 규정에 의한 아미노산 번호 87 위치)의 티로신이 이소로이신으로 치환되는 클론을 선택하고, 대응하는 버젼을 각각 “p”, “q”, “s”, “r”및 “t”로 하고, 수득한 플라스미드를 'hMBC1Lxλ/pCOS1(x = p, q, s, r, t)'로 명명하였다. 버젼 “p”, “q”, “s”및 “t”의 염기서열(대응하는 아미노산을 포함한다)을 각각 서열번호 71, 72, 73, 74에 나타낸다. 또한, 이들 각 버젼의 아미노산 서열을 각각 서열번호 52, 53, 54, 55에 나타낸다. Versions “p”, “q”, “r”, “s” and “t” refer to tyrosine at position 87 of the amino acid sequence of version “i”, “j”, “m”, “l” or “o” A version substituted with isoleucine, and the version “h” is linked to each version “i”, “j”, “m”, “l” or “o” using a restriction enzyme Aor51MI cleavage site present in FR3. It is to construct. That is, in the expression vector plasmid hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = i, j, m, l, o), a part of CDR3 and FR3 and 514 bp of the Aor51HI fragment including FR4 were removed, and in the expression plasmid hMBC1Lhλ / pCOS1, Tyrosine at position 91 (amino acid number 87 position according to Kabat's definition) is isoleucine by linking Aor514 bp including portions of CDR3 and FR3 and FR4. A clone in which the tyrosine at position 91 (amino acid number 87 position according to Kabat's definition) of each version “i”, “j”, “m”, “l” and “o” is substituted with isoleucine Are selected, and the corresponding versions are “p”, “q”, “s”, “r” and “t”, and the obtained plasmid is “hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = p, q, s, r, t). The base sequences of the versions “p”, “q”, “s” and “t” (including the corresponding amino acids) are shown in SEQ ID NOs: 71, 72, 73 and 74, respectively. In addition, the amino acid sequences of each of these versions are shown in SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 55, respectively.

플라스미드 hMBC1Lqλ/pCOS1를 Hind III 및 EcoRI로 절단하고, Hind III 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pUC19에 서브클로닝하고, 이를 플라스미드 'hMBC1Lqλ/pUC19'로 명명하였다. Plasmid hMBC1Lqλ / pCOS1 was digested with Hind III and EcoRI and subcloned into plasmid pUC19 digested with Hind III and EcoRI, which was named plasmid 'hMBC1Lqλ / pUC19'.

인간형화된 L쇄의 각 버젼에 있어서, 치환된 아미노산의 위치를 표 3에 나타낸다.In each version of the humanized L chain, the positions of the substituted amino acids are shown in Table 3.

(5) COS-7 세포로의 프랜스퍼레이션(5) Transfer to COS-7 Cells

하이브리드 항체 및 인간형화된 #23-57-137-1 항체의 항원결합활성 및 중화 활성을 평가하기 위해, 전기 발현 플라스미드를 COS-7 세포로 일과성에 발현시켰다: 즉, L쇄하이브리드 항체의 일과성 발현에서는 플라스미드 hMBC1HcDNA/pCOS1과 H/mMBC1L(λ)/neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 m/hMBC1Laλ/neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 m/hMBC1Ldλ/neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 hmmMBC1L(λ)/neo, 또는 hMBC1HcDNA/pCOS1과 mhmMBC1L(λ)/neo와의 조합을 유전자 펄서(Gene Pulser) 장치(Bio-Rad)를 이용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS-7세포에 동시 형질도입하였다. PBS(-) 속에 1 ×10⁷세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 COS-7세포 0.8 ㎖에, 각 플라스미드 DNA 10 ㎍을 가하고, 1,500V, 25 ㎌의 정전용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간 회복기간을 둔 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 2 % 의 Ultra Low IgG 소 태아혈청(GIBCO)를 함유하는 DMEM 배양액(GIBCO)에 현탁하고, 10 ㎝ 배양 플레이트을 이용하여 CO₂ 인큐베이터로 배양하였다. 72시간 배양한 후, 배양상등을 모으고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하고, ELISA의 시료에 이용하였다.To assess the antigen binding and neutralizing activity of hybrid and humanized # 23-57-137-1 antibodies, the electric expression plasmids were transiently expressed in COS-7 cells: ie transient expression of L-chain hybrid antibodies. Plasmid hMBC1HcDNA / pCOS1 and H / mMBC1L (λ) / neo, hMBC1HcDNA / pCOS1 and m / hMBC1Laλ / neo, hMBC1HcDNA / pCOS1 and m / hMBC1Ldλ / neo, hMBC1HcDNA / pMBCH1, And mhmMBC1L (λ) / neo were cotransduced into COS-7 cells by electroporation using a Gene Pulser device (Bio-Rad). To 0.8 ml of COS-7 cells suspended in PBS (-) at a cell concentration of 1x10 ⁷ cells / ml, 10 µg of each plasmid DNA was added and pulsed at a capacitance of 1,500 V and 25 Hz. After 10 min recovery at room temperature, the electroporated cells are suspended in DMEM culture (GIBCO) containing 2% Ultra Low IgG Fetal Bovine Serum (GIBCO) and incubated in a CO ₂ incubator using a 10 cm culture plate. Incubated with After 72 hours of incubation, the cultured phases were collected, cell debris was removed by centrifugation, and used for ELISA samples.

인간형화된 #23-57-137-1항체의 일과성 발현으로는 플라스미드 hMBC1HcDNA/pCOS1와 hMBC1Lxλ/pCOS1(x = a ∼ t)의 어느 한 조합을 유전자 펄서(Bio-Rad)를 이용하고, 전기 하이브리드 항체의 경우와 같은 방법으로 COS-7 세포에 형질도입하고, 수득한 배양상등액을 ELISA에 이용하였다.For transient expression of the humanized # 23-57-137-1 antibody, any combination of plasmids hMBC1HcDNA / pCOS1 and hMBC1Lxλ / pCOS1 (x = a to t) was performed using a gene pulsar (Bio-Rad), and an electric hybrid. COS-7 cells were transduced in the same manner as in the case of the antibody, and the obtained culture supernatant was used for ELISA.

또한, COS-7 세포의 배양상등액으로부터 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체의 정제는 AffiGel Protein A MAPSII 키트(Bio-Rad)를 이용하고, 키트 첨부된 처방에 따라 수행하였다.In addition, purification of hybrid or humanized antibodies from the culture supernatant of COS-7 cells was performed using the AffiGel Protein A MAPSII kit (Bio-Rad) and according to the kit attached prescription.

(6)ELISA(6) ELISA

(i) 항체농도의 측정(i) Determination of antibody concentration

항체농도의 측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같은 방법으로 조제하였다: ELISA용 96웰 플레이트(Maxisorp, NUNC)의 각 웰을 고정화 완충액(0.1 M NaHCO₃, 0.02 % NaN₃)으로 1 ㎍/㎖의 농도로 조제한 염소 항인간 IgG항체(TAGO) 100 ㎕로 고정화하고, 200 ㎕의 희석완충액(50 mM Tris0HC1, 1 mM MgCl₂, 0.1 M NaCl, 0.05 % Tween 20, 0.02 % NaN₃, 1 % 소혈청알부민(BSA), pH 7.2)으로 블로킹한 후,하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 발현시킨 COS-7 세포의 배양상등액 또는 정제하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 단계적으로 희석하여 각 웰에 가하였다. 1시간 실온에서 배양하고, PBS-Tween 20으로 세척한 다음, 1 ㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산, SIGMA)를 가한 다음, 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad)로 측정하였다. 농도 측정의 표준으로서 Hu IgG1λ Purified(The Binding Site)를 이용하였다.ELISA plates for measuring antibody concentrations were prepared in the following manner: Each well of a 96 well plate (Maxisorp, NUNC) for ELISA was immobilized at 1 μg / ml with immobilization buffer (0.1 M NaHCO ₃ , 0.02% NaN ₃ ). Immobilized with 100 μl of goat anti-human IgG antibody (TAGO) prepared at a concentration, 200 μl of diluted buffer solution (50 mM Tris0HC1, 1 mM MgCl ₂ , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN ₃ , 1% bovine serum) After blocking with albumin (BSA), pH 7.2), the culture supernatants or purified hybrid or humanized antibodies of COS-7 cells expressing hybrid or humanized antibodies were gradually diluted to each well. Incubated at room temperature for 1 hour, washed with PBS-Tween 20, 1 mg / ml substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was added, and the absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader (Bio). -Rad). Hu IgG1λ Purified (The Binding Site) was used as a standard for concentration measurement.

(ii) 항원결합능의 측정(ii) Determination of antigen binding capacity

항원결합 측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같은 방법으로 조제하였다: ELISA용 96 웰 플레이트의 각 웰을 고정화 완충액으로 1 ㎍/㎖의 농도로 조절한 인간 PTHrP(1-34) 100 ㎕로 고정화하였다. 200 ㎕의 희석완충액으로 블로킹한 후, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 발현시킨 COS-7 세포의 배양상등액 또는 CHO 세포의 배양상등, 또는 정제 키메라 항체, 하이브리드 항체 또는 인간형화된 항체를 단계적으로 희석하여 각 웰에 가한 다음, 알칼라인포스파타제(alkali phosphatase)결합 염소 항인간 IgG항체 100 ㎕를 가하여, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐인산, SIGMA)를 가한 다음, 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트리더(Bio-Rad)로 측정하였다. ELISA plates for antigen binding measurements were prepared in the following manner: Each well of a 96 well plate for ELISA was immobilized with 100 μl of human PTHrP (1-34) adjusted to a concentration of 1 μg / ml with immobilization buffer. After blocking with 200 μl of the dilution buffer, the culture supernatant of COS-7 cells expressing the hybrid antibody or humanized antibody or the culture supernatant of CHO cells, or the dilution of the purified chimeric antibody, hybrid antibody or humanized antibody in stages 100 μl of alkaline phosphatase-binding goat anti-human IgG antibody was added to the wells, and then 1 mg / ml of substrate solution (Sigma 104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was added. Absorbance was measured with a microplate reader (Bio-Rad).

(7) 활성확인(7) Activity check

(i) 인간형화된 H쇄의 평가(i) Evaluation of Humanized H Chains

인간형화된 H쇄 버젼 “a”와 키메라항체 L쇄를 조합한 항체는 키메라항체와 PTHrP 결합능이 동등하였다(도 5). 이 결과는 H쇄V영역의 인간형화는 버젼“a”로 충분하다는 것을 나타낸다. 이하, 인간형화된 H쇄 버젼“a”를 인간형화된 항체의 H쇄로서 이용하였다.The antibody combining the humanized H chain version “a” and the chimeric antibody L chain had the same chimeric antibody and PTHrP binding capacity (FIG. 5). This result indicates that the humanization of the H chain V region is sufficient for the version "a". Hereinafter, the humanized H chain version "a" was used as the H chain of the humanized antibody.

(ii) 하이브리드항체의 활성(ii) the activity of a hybrid antibody

(ii-a) FR1, 2/FR3, 4 하이브리드항체(ii-a) FR1, 2 / FR3, 4 hybrid antibodies

L쇄가 h/mMBC1L(λ)의 경우, 활성은 전혀 확인되지 않았으나, m/hMBC1Laλ 또는 m/hMBC1Ldλ의 경우는 어느것이라도 키메라 #23-57-137-1 항체와 동등의 결합활성을 나타내었다(도 6). 이들 결과는 FR3, 4는 인간형화된 항체로서 문제되지 않지만, FR1, 2내에 치환해야만 하는 아미노산 잔기가 존재하는 것을 시사한다.When the L chain was h / mMBC1L (λ), no activity was confirmed, but either m / hMBC1Laλ or m / hMBC1Ldλ showed equivalent binding activity to the chimeric # 23-57-137-1 antibody ( 6). These results suggest that FR3, 4 is not a problem as a humanized antibody, but there are amino acid residues that must be substituted in FR1, 2.

(ii-b) FR1/FR2 하이브리드 항체(ii-b) FR1 / FR2 hybrid antibody

L쇄가 mhmMBC1L(λ)의 경우, 활성은 전혀 확인되지 않았으나, hmmMBC1L(λ)의 경우는 키메라#23-57-137-1 항체와 동등한 결합 활성을 나타내었다(도 7). 이들 결과는 FR1, 2 중에 FR1은 인간형화된 항체로서 문제되지 않지만, FR2내에 치환해야만 하는 아미노산 잔기가 존재하는 것을 시사한다.When the L chain was mhmMBC1L (λ), no activity was confirmed, but hmmMBC1L (λ) showed binding activity equivalent to that of the chimeric # 23-57-137-1 antibody (FIG. 7). These results suggest that in FR1, 2 FR1 is not a problem as a humanized antibody, but there are amino acid residues that must be substituted in FR2.

(iii) 인간형화된 항체의 활성(iii) activity of humanized antibodies

L쇄로서 버젼 “a”부터 “t”의 각각 한가지를 이용한 인간형화된 항체에 대하여, 항원결합활성을 측정하였다. 그 결과, L쇄 “j”, “l”, “m”, “o”, “q”, “r”, “s”, “t”를 가지는 인간형화된 항체는 키메라항체와 동등한 PTHrP 결합능을 나타내었다(도 8 내지 도 11).Antigen-binding activity was measured for the humanized antibody using each of the versions "a" to "t" as the L chain. As a result, humanized antibodies with L chains “j”, “l”, “m”, “o”, “q”, “r”, “s”, and “t” have a PTHrP binding capacity equivalent to that of chimeric antibodies. Shown (FIGS. 8-11).

(8) CHO 안정된 생산세포주의 수립(8) Establishment of CHO stable production cell line

인간형화된 항체의 안정된 생상세포주를 수립하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 CHO 세포(DXB11)에 도입하였다.In order to establish stable live cell lines of humanized antibodies, electroexpressing plasmids were introduced into CHO cells (DXB11).

즉, 인간형화된 항체의 안정된 생산세포주 수립은 CHO 세포용 발현 플라스미드 hMBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lmλ/pCOS1 또는 hMBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lqλ/pCOS1 또는 hMBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lrλ/pCOS1와의 조합으로, Gene Pulser 장치(Bio-Rad)를 이용하여 일렉트릭포레이션에 의해 CHO세포에 동시 형질도입하였다. 각각 의 발현벡터를 제한효소 PvuI로 절단하여 직쇄 DNA로 만들고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전으로 DNA를 회수하여 일렉트릭포레이션에 이용하였다. PBS(-)중에서 1 ×10⁷ 세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 CHO세포 0.8 ㎖로, 각 플라스미드 DNA 10 ㎍을 가하고, 1,500V, 25 ㎌의 정전용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간 회복기간을 둔 후, 일렉트릭포레이션 처리된 세포를 10 % 소 태아혈청(GIBCO)를 첨가한 MEM-α배지(GIBCO)에 현탁하고, 96 웰 플레이트(Falcon)을 이용하여 CO₂ 인큐베이터로 배양하였다. 배양 개시 다음 날에 10 % 소 태아혈청(GIBCO) 및 500 ㎎/㎖의 GENETICIN(G418 Sulfate, GIBCO)첨가, 리보누클레오시드(ribonucleoside) 및 데옥시리보누클레오시드(deoxyribonucleoside)를 포함하지 않는 MEM-α선택배지(GIBCO)로 교환하고, 항체유전자가 도입된 세포를 선택하였다. 선택배지 교환 후, 2주 동안을 전후로 현미경으로 세포를 관찰하고, 순조로운 세포증식이 확인된 후에, 상기 항체 농도 측정 ELISA로 항체생산량을 측정하고, 항체생산량이 많은 세포를 선별하였다.That is, the establishment of a stable production cell line of humanized antibody was expressed in combination with the expression plasmid hMBC1HcDNA / pCHO1 and hMBC1Lmλ / pCOS1 or hMBC1HcDNA / pCHO1 and hMBC1Lqλ / pCOS1 or hMBC1HcDNA / pCHO1 with hMBC1Lrλ / rr? Rad) was used to cotransduce CHO cells by electroporation. Each expression vector was digested with restriction enzyme PvuI to make linear DNA, extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation and used for electricporation. To 0.8 ml of CHO cells suspended at a cell concentration of 1 × 10 ⁷ cells / ml in PBS (−), 10 μg of each plasmid DNA was added and pulsed at a capacitance of 1,500 V and 25 Hz. After 10 minutes of recovery at room temperature, the electroporated cells were suspended in MEM-α medium (GIBCO) with 10% fetal bovine serum (GIBCO) and CO ₂ using 96-well plates (Falcon). The cells were incubated in an incubator. MEM without 10% fetal bovine serum (GIBCO) and 500 mg / ml of GENETICIN (G418 Sulfate, GIBCO), ribonucleoside and deoxyribonucleoside the day after incubation The cells were transfected with -a selective medium (GIBCO) and introduced into the antibody gene. After selective medium exchange, the cells were observed under a microscope for two weeks, and after smooth cell proliferation was confirmed, the antibody concentration was measured by the antibody concentration measuring ELISA, and cells with high antibody yield were selected.

항체가 안정적으로 생산되는 세포주의 배양을 확대하기 위하여, 로울러 병에 리보누클레오시드(ribonucleoside), 데옥시리보누클레오시드(deoxyribonucleoside)를 포함하지 않으며, 2 %의 Ultra Law IgG 소 태아혈청이 첨가된 MEM-α선택배지를 이용하여 대량 배양을 수행하였다. 배양 3 내지 4일째에 배양상등액을 회수하고, 0.2 ㎛의 필터(Millipore)에 의해 세포파쇄물을 제거하였다. CHO 세포의 배양상등액으로부터 인간형화된 항체의 정제는 POROS 프로테인 A 칼럼(PerSeptive Biosystems)를 이용하여 ConSep LC100(Millipore)로 첨부된 처방에 따라 수행하고, 정제된 항체를 중화활성의 측정 및 고칼슘 혈증 모델 동물에서의 약효시험에 이용하였다. 수득한 정제 인간형화된 항체의 농도 및 항원결합활성은 상기 ELISA로 측정하였다.To expand the culture of cell lines in which antibodies are stably produced, roller bottles do not contain ribonucleoside, deoxyribonucleoside, and 2% Ultra Law IgG fetal bovine serum is added Mass culture was performed using the prepared MEM-α selective medium. Culture supernatants were collected on the third to fourth days of culture, and cell debris was removed by a 0.2 μm filter (Millipore). Purification of the humanized antibody from the culture supernatant of CHO cells was performed according to the prescription attached to ConSep LC100 (Millipore) using POROS Protein A column (PerSeptive Biosystems), and the purified antibody was measured for neutralization activity and hypercalcemia model. It was used for drug efficacy test in animals. The concentration and antigen binding activity of the obtained purified humanized antibody were measured by the ELISA.

실시예 4 : 중화활성의 측정 Example 4 Measurement of Neutralizing Activity

마우스 항체, 키메라 항체 및 인간형화된 항체의 중화활성의 측정은, 렛트 골육종 세포주 ROS17/2.8-5세포를 이용하여 수행하였다. 즉, ROS17/2.8-5 세포를 10 % 소 태아혈청(GIBCO)를 포함하는 Ham'SF-12 배지(GIBCO) 속에, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. ROS17/2.8-5세포를 96 웰 플레이트에 10⁴세포/100 ㎕/웰에 심고, 1일간 배양하고, 4 mM의 히드로콜티손(hydrocortisone)과 10 % 소 태아혈청을 포함하는 Ham'SF-12 배지(GIBCO)로 교환하였다. 또한, 3 내지 4일간 배양한 후, 260 ㎕의 Ham'SF-12배지(GIBCO)로 세척하고, 1 mM의 이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX. SIGMA) 및 10%의 소 태아혈청과 10 mM의 HEPES를 포함하는 80 ㎕의 Ham'SF-12를 가하여, 30 분간 37 ℃로 배양하였다.The neutralization activity of the mouse antibody, chimeric antibody, and humanized antibody was measured using the rat osteosarcoma cell line ROS17 / 2.8-5 cells. That is, ROS17 / 2.8-5 cells were cultured in a CO ₂ incubator in Ham'SF-12 medium (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (GIBCO). ROS17 / 2.8-5 cells were planted in 96 well plates at 10 ⁴ cells / 100 μl / well, incubated for 1 day, and Ham'SF-12 containing 4 mM hydrocortisone and 10% fetal bovine serum. Exchange with medium (GIBCO). In addition, after incubation for 3 to 4 days, washed with 260 μl of Ham'SF-12 medium (GIBCO), 1 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX. SIGMA) and 10% fetal bovine serum 80 μl of Ham'SF-12 containing mM HEPES was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.

중화활성을 측정하는 마우스항체, 키메라항체 또는 인간형화된 항체를 미리 10 ㎍/㎖, 3.3 ㎍/㎖, 1.1 ㎍/㎖ 및 0.37 ㎍/㎖의 군, 10 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖의 군, 또는 10 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 0.63 ㎍/㎖ 및 0.31 ㎍/㎖가 되도록 단계적으로 희석하고, 4 ng/㎖로 조제한 PTHrP(1-34)와 등량 혼합하고, 각 항체와 PTHrP(1-34)와의 혼합액 80 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 각 항체의 최종 농도는 상기 항체농도의 4분의 1이 되고, PTHrP(1-34)의 농도는 PBS로 3회 세척한 다음, 100 ㎕의 0.3 % 염산 95 % 에탄올로 세포내의 cAMP를 추출하였다. 수류 아스피레이터(aspirator)로 염산에탄올을 증발시켜, cAMP EIA Kit(CAYMAN CHEMICAL'S)에 첨부된 방법에 따라 cAMP를 측정하였다. 그 결과, 키메라항체와 동등한 항원결합을 가지는 L쇄버젼 중에서, 91위치의 티로신을 이소로이신으로 치환시킨 버젼 “q”, “r”, “s”, “t”를 가지는 인간형화된 항체가 키메라항체에 가까운 중화능을 나타내고, 그 중에서도 버젼 “q”가 가장 강한 중화능을 나타내었다(도 12 내지 도 14).A mouse antibody, chimeric antibody or humanized antibody measuring neutralizing activity was previously determined in a group of 10 µg / ml, 3.3 µg / ml, 1.1 µg / ml and 0.37 µg / ml, 10 µg / ml, 2 µg / ml, 0.5 PTHrP formulated at 4 ng / ml and diluted stepwise to groups of pg / ml and 0.01 ug / ml, or 10 ug / ml, 5 ug / ml, 1.25 ug / ml, 0.63 ug / ml and 0.31 ug / ml Equivalently mixed with (1-34), 80 µl of a mixture of each antibody and PTHrP (1-34) was added to each well. The final concentration of each antibody was one fourth of the antibody concentration, and the concentration of PTHrP (1-34) was washed three times with PBS, and then intracellular cAMP was extracted with 100 µl of 0.3% hydrochloric acid 95% ethanol. . Ethanol hydrochloride was evaporated with a water aspirator and cAMP was measured according to the method attached to the cAMP EIA Kit (CAYMAN CHEMICAL'S). As a result, in the L chain version having the same antigen binding as the chimeric antibody, the humanized antibody having versions “q”, “r”, “s”, and “t” in which tyrosine at position 91 was replaced with isoleucine was chimera. The neutralizing ability close to the antibody was shown, and the version "q" showed the strongest neutralizing ability among them (FIGS. 12-14).

실시예 5 : 고칼슘혈증 모델 동물에서의 약효시험(1) Example 5 Drug Test (1) in Hypercalcemia Model Animals

인간종양-누드마우스 이식계의 고칼슘혈증 모델동물을 이용하여, PTHrP에 대한 키메라항체 및 L쇄 버젼 “m”, “r”및 “q”를 가지는 인간형화된 항체에 대하여 고칼슘혈증에 대한 치료효과를 검토하였다. Therapeutic Effects of Hypercalcemia on Chimeric Antibodies against PTHrP and Humanized Antibodies with L Chain Versions “m”, “r” and “q” Using Human Tumor-Nude Mouse Transplantation Model Animals Was reviewed.

고칼슘혈증모델동물로서 인간췌장암 PAN-7((재)실험동물중앙연구소에서 구입)이식 누드마우스를 이용하였다. 인간췌장암 PAN-7을 이식된 누드마우스는 종양의 증가에 따른 혈중 칼슘농도가 상승하고, 체중감소나 운동량의 저하등의 고칼슘혈증이 발병한다. 고칼슘형증에 대한 치료효과의 검토는 키메라항체 및 인간형화된 항체가 인간췌장암 PAN-7에 의해 일어나는 고칼슘혈증을 개선하는 것을 체중 및 혈중 칼슘 농도를 지표로 하여 평가하였다.Human pancreatic cancer PAN-7 (purchased from the Central Laboratory for Experimental Animals) transplanted as a hypercalcemia model animal was used as a nude mouse. Nude mice implanted with human pancreatic cancer PAN-7 have elevated calcium levels in the blood with increased tumors, hypercalcemia, such as weight loss and decreased exercise. Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was evaluated by weight and blood calcium concentrations that the chimeric and humanized antibodies improve hypercalcemia caused by human pancreatic cancer PAN-7.

인간췌장암 PAN-7의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 챨스리버)를 이용하여 생체 내 조건에서 수행하였다. 약효평가로는 5주령인 웅성 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 챨스리버)를 구입하고, 1주간 순화한 후, 6주령인 동물을 사용하였다. 고칼슘 혈증 모델 동물의 작제 및 군 분류는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 즉, 계대하고 있는 인간췌장암 PAN-7을 추출하고, 3 mm 각 블럭에 잘게 썬 종양덩어리를 마우스의 옆구리 피하에 1마리당 1개씩 이식하였다. 종양을 이식한 후, 2 내지 3주간 종양체적이 충분히 커지게 된 것을 확인한 다음, 종양체적, 혈중 칼슘 농도 및 체중을 지표로서 각 지표가 평균화되도록 군을 나누고, 고칼슘혈증 모델동물로 하였다.Passage of human pancreatic cancer PAN-7 was performed in vivo using BALB / c-nu / nu nude mice (Japanese Hicks River). As a drug efficacy evaluation, male BALB / c-nu / nu nude mouse (Japanese Hawks River), 5 weeks old, was purchased, purified for 1 week, and 6 weeks old animals were used. Construction and grouping of hypercalcemia models of animals were performed in the following manner. That is, passaged human pancreatic cancer PAN-7 was extracted, and a tumor mass chopped on each block of 3 mm was implanted one per mouse subcutaneously. After the tumor was transplanted, it was confirmed that the tumor volume became sufficiently large for 2 to 3 weeks, and then the groups were divided so that the indicators were averaged based on the tumor volume, the blood calcium concentration and the weight, and the hypercalcemia model animals were used.

고칼슘혈증에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 상기에서 작제하여, 군을 나눈 고칼슘혈증 모델동물에 마우스 1마리당 10 ㎍ 또는 30 ㎍의 PTHrP에 대한 키메라항체 또는 L쇄버젼 m, r을 가지는 인간형화된 항체를 꼬리 정맥내에 1회 투여하였다. L쇄버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체는 마우스 1마리당 20 ㎍ 또는 60 ㎍를 꼬리정맥내에 1회 투여하였다. 키메라항체 및 인간형화된 항체를 투여한 후, 1일, 4일, 7일, 11일 째에 혈중칼슘농도 및 체중을 측정하고, 각 항체의 약효평가를 수행하였다. 종양체적은 종양의 장경(amm) 및 단경(bmm)을 측정하고, #의 계산 ab2/2에 의한 종양체적으로서 산출하였다. 혈중칼슘농도는 눈에서 헤머토크릿관을 이용하여 채혈하고, 643 자동 Ca + +/pH 애널라이저(CIBA-CORNING)를 이용하여 전혈 이온화칼슘 농도로서 측정하였다. Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was carried out by the following method: chimeric antibody or L-chain version against PTHrP of 10 μg or 30 μg per mouse in the hypercalcemia model animals, which was constructed above and divided into groups. Humanized antibodies with m and r were administered once into the tail vein. Humanized antibodies with L chain version “q” were administered once in the tail vein with 20 μg or 60 μg per mouse. After administration of the chimeric and humanized antibodies, blood calcium concentration and body weight were measured on the 1st, 4th, 7th, and 11th days, and the efficacy evaluation of each antibody was performed. The tumor volume was measured as the tumor volume by measuring the long diameter (amm) and the short diameter (bmm) of the tumor and calculating the ab2 / 2 of #. The blood calcium concentration was collected in the eye using a hematocrit tube, and measured as whole blood calcium ion concentration using a 643 automatic Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING).

그 결과, 키메라항체 및 L쇄 버젼 “m”, “r”및 “q”를 가지는 인간형화된 항체를 투여함으로써 체중 및 혈중칼슘농도의 빠른 개선 및 지속성이 확인되었다. 그러므로, 본 발명의 키메라항체 및 인간형화된 항체의 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 치료제로서의 유용성을 나타내었다(도 15 내지 도 16).As a result, the rapid improvement and persistence of body weight and blood calcium concentration were confirmed by administering the chimeric antibody and humanized antibody having L chain versions “m”, “r” and “q”. Therefore, the chimeric and humanized antibodies of the present invention have been shown to be useful as therapeutic agents for hypercalcemia associated with malignancies (FIGS. 15-16).

실시예 6 : 고칼슘혈증 모델 동물에서의 약효시험(2) Example 6 : Drug efficacy test in hypercalcemia model animal (2)

인간종양-누드마우스 이식계의 고칼슘혈증 모델동물을 이용하여, PTHrP에 대한 키메라항체 및 L쇄 버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체에 대하여 고칼슘혈증에 대한 치료효과를 검토하였다. A hypercalcemia model animal of human tumor-nude mouse transplantation system was used to examine the effect of treatment on hypercalcemia against humanized antibodies with chimeric antibody and L chain version “q” against PTHrP.

고칼슘혈증에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 상기에서 작제하여, 군을 나눈 고칼슘혈증 모델동물에 마우스 1마리당 10 ㎍ 또는 30 ㎍의 PTHrP에 대한 키메라항체 또는 L쇄버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체를 꼬리 정맥내에 1회 투여하였다. 키메라항체 및 인간형화된 항체를 투여한 후, 1일, 3일, 7일, 10일 째에 혈중칼슘농도 및 체중을 측정하고, 각 항체의 약효평가를 수행하였다. 혈중칼슘농도는 눈에서 헤머토크릿관을 이용하여 채혈하고, 643 자동 Ca + +/pH 애널라이저(CIBA-CORNING)를 이용하여 전혈 이온화칼슘 농도로서 측정하였다. Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was carried out by the following method: chimeric antibody or L-chain version against PTHrP of 10 μg or 30 μg per mouse in the hypercalcemia model animals, which was constructed above and divided into groups. Humanized antibody with “q” was administered once into the tail vein. After administration of the chimeric and humanized antibodies, blood calcium concentration and body weight were measured on the 1st, 3rd, 7th and 10th days, and the efficacy evaluation of each antibody was performed. The blood calcium concentration was collected in the eye using a hematocrit tube, and measured as whole blood calcium ion concentration using a 643 automatic Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING).

그 결과, 인간췌장암 PAN-7 이식 고칼슘혈증 모델에 있어서, 키메라항체 및 L쇄 버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체를 투여함으로써 체중 및 혈중칼슘농도의 빠른 개선 및 지속성이 확인되었다. 그러므로, 본 발명의 키메라항체 및 인간형화된 항체의 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 치료제로서의 유용성을 나타내었다(도 17).As a result, in the human pancreatic cancer PAN-7 transplanted hypercalcemia model, the rapid improvement and persistence of body weight and blood calcium concentration were confirmed by administering a chimeric antibody and a humanized antibody having an L chain version “q”. Therefore, the chimeric and humanized antibodies of the present invention have been shown to be useful as therapeutic agents for hypercalcemia associated with malignancies (FIG. 17).

실시예 7 : 고칼슘혈증 도델 동물에서의 약효시험(3) Example 7 Drug Test in Hypercalcemia Dodel Animals (3)

인간종양-누드마우스 이식계의 고칼슘혈증 모델동물(인간간암 LC-6이식 고칼슘혈증 모델)을 이용하여, PTHrP에 대한 키메라항체 및 L쇄 버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체에 대하여 고칼슘혈증에 대한 치료효과를 검토하였다. A hypercalcemia model animal of human tumor-nude mouse transplantation system (human cancer LC-6 transplant hypercalcemia model) was used for hypercalcemia against humanized antibodies with chimeric antibody and L chain version “q” against PTHrP. The treatment effect was reviewed.

고칼슘혈증모델동물로서 인간간암 LC-6((재)실험동물중앙연구소에서 구입)이식 누드마우스를 이용하였다. 인간간암 LC-6을 이식한 누드마우스는 종양의 증가에 따른 혈중 칼슘농도가 상승하고, 체중감소나 운동량의 저하등의 고칼슘혈증이 발병한다. As a hypercalcemia model animal, human liver cancer LC-6 (purchased from the Central Laboratory for Experimental Animals) was used to transplant nude mice. Nude mice implanted with human liver cancer LC-6 have elevated calcium levels in the blood with increasing tumors, and hypercalcemia, such as weight loss and loss of exercise, occurs.

고칼슘혈증에 대한 치료효과의 검토는 키메라항체 및 인간형화된 항체가 인간간암 LC-6에 의해 일어나는 고칼슘혈증을 개선하는 것을 체중 및 혈중 칼슘 농도를 지표로 하여 평가하였다.Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was evaluated by weight and calcium concentration as an indicator that the chimeric and humanized antibodies improve hypercalcemia caused by human liver cancer LC-6.

인간간암 LC-6의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 챨스리버)를 이용하여 생체 내 조건에서 수행하였다. 약효평가로는 5주령인 웅성 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 챨스리버)를 구입하고, 1주간 순화한 후, 6주령인 동물을 사용하였다. Passage of human liver cancer LC-6 was performed in vivo using BALB / c-nu / nu nude mice (Japanese Hicks River). As a drug efficacy evaluation, male BALB / c-nu / nu nude mouse (Japanese Hawks River), 5 weeks old, was purchased, purified for 1 week, and 6 weeks old animals were used.

고칼슘 혈증 모델 동물의 작제 및 군 분류는 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 계대하고 있는 인간간암 LC-6을 추출하고, 3 mm 각 블럭으로 잘게 썬 종양덩어리를 마우스의 옆구리 피하에 1마리당 1개씩 이식하였다. 종양을 이식한 후, 2 내지 3주간 종양체적이 충분히 커지게 된 것을 확인한 다음, 종양체적, 혈중 칼슘 농도 및 체중을 지표로서 각 지표가 평균화되도록 군을 나누고, 고칼슘혈증 모델동물로 하였다. Construction and grouping of hypercalcemia models of animals was performed in the following manner: extracting human liver cancer LC-6, subcutaneously, and lumping tumor masses chopped into 3 mm square blocks, 1 per mouse, subcutaneously. Dogs were transplanted. After the tumor was transplanted, it was confirmed that the tumor volume became sufficiently large for 2 to 3 weeks, and then the groups were divided so that the indicators were averaged based on the tumor volume, the blood calcium concentration and the weight, and the hypercalcemia model animals were used.

고칼슘혈증에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 상기에서 작제하여, 군을 나눈 고칼슘혈증 모델동물에 마우스 1마리당 10 ㎍ 또는 30 ㎍의 PTHrP에 대한 키메라항체 또는 L쇄버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체를 꼬리 정맥내에 1회 투여하였다. 키메라항체 및 인간형화된 항체를 투여한 후, 1일, 3일, 6일, 10일 째에 혈중칼슘농도 및 체중을 측정하고, 각 항체의 약효평가를 수행하였다. 혈중칼슘농도는 눈에서 헤머토크릿관을 이용하여 채혈하고, 643 자동 Ca + +/pH 애널라이저(CIBA-CORNING)를 이용하여 전혈 이온화칼슘 농도로서 측정하였다. Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was carried out by the following method: chimeric antibody or L-chain version against PTHrP of 10 μg or 30 μg per mouse in the hypercalcemia model animals, which was constructed above and divided into groups. Humanized antibody with “q” was administered once into the tail vein. After administration of the chimeric and humanized antibodies, blood calcium concentration and body weight were measured on the 1st, 3rd, 6th, and 10th days, and the efficacy evaluation of each antibody was performed. The blood calcium concentration was collected in the eye using a hematocrit tube, and measured as whole blood calcium ion concentration using a 643 automatic Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING).

그 결과, 인간간암 LC-6 이식 고칼슘혈증 모델에 있어서, 키메라항체 및 L쇄 버젼 “q”를 가지는 인간형화된 항체를 투여함으로써 체중 및 혈중칼슘농도의 빠른 개선 및 지속성이 확인되었다. 그러므로, 본 발명의 키메라항체 및 인간형화된 항체의 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 치료제로서의 유용성을 나타내었다(도 18).As a result, in the human liver cancer LC-6 transplanted hypercalcemia model, rapid improvement and persistence of body weight and blood calcium concentration were confirmed by administering a humanized antibody having a chimeric antibody and L chain version “q”. Therefore, the chimeric and humanized antibodies of the present invention have been shown to be useful as therapeutic agents for hypercalcemia associated with malignancies (FIG. 18).

실시예 8 : BIACORE를 이용한 PTHrP와 PTHrP항체의 상호작용에 있어서 속도론 적 해석 Example 8 Kinetic Analysis in the Interaction of PTHrP and PTHrP Antibodies Using BIACORE

비아코어(BIACORE)를 이용하여 항원항체 반응의 속도론적 해석을 수행하였다: 항원으로서PTHrP(1-34 + Cys)를 이용하고, C말단 부위 특이적인 센서칩상에 고정화하고, 여러가지 농도로 조절한 정제 항체를 분석시료로 하였다. 수득한 센서그램으로부터 카이네틱스 변수(결합속도 정수 kass 및 해리속도 정수 kdiss)를 산출하였다. 속도론적 해석에 관련하여, 문헌「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosenser based anayltical system」(Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145, p229-240.)를 참고하였다. Kinetic analysis of the antigenic antibody response was performed using BIACORE: purification using PTHrP (1-34 + Cys) as an antigen, immobilized on a C-terminal specific sensor chip, and adjusted to various concentrations. The antibody was used as the assay sample. Kinetic parameters (binding rate constant kass and dissociation rate constant kdiss) were calculated from the obtained sensorgram. Regarding kinetic analysis, see Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosenser based anayltical system (Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145, p229-240.). Reference was made.

(1) 센서칩에서의 PTHrP(1-34 + C)의 고정화(1) Immobilization of PTHrP (1-34 + C) in Sensor Chip

센서칩CM5(Pharmacia)에 PTHrP(1-34 + C)를 고정화한다.PTHrP (1-34 + C) is immobilized on the sensor chip CM5 (Pharmacia).

완충액으로 HBS(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005 % Surfactant P20)를 이용하고, 속도는 5 ㎕/분으로 하였다. 센서칩 CM5 상의 카르복실메틸덱스트란의 카르복실기를 100 ㎕의 0.05 M N-히드록시호박산이미드 (NHS)/0.2 M 염산 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)의 주입 및 100 ㎕의 80 mM 염산 2-(2-피리디닐디티오)에탄아민(PDEA)/0.1 M 보릭산(boric acid) 완충액 pH 8.5의 주입에 의해 활성화하였다. 계속해서 10 ㎕의 5 ㎍/㎖ PTHrP(1-34 + C)/10 mM 초산 나트륨 완충액 pH 5.0을 주입하고, PTHrP(1-34 +C)의 C말단의 Cys 잔기 특이적으로 고정화하였다. 또한, 100 ㎕의 50 mM(L)-시스테인/1 M NaCl/0.1 M 염산을 주입함으로써, 과잉 활성기를 블로킹하였다. 또한, 10 ㎕의 0.1 M 글리신-염산 완층액 pH 2.5 및 10 ㎕의 10 mM 염산을 주입함으로써, 비공유결합을 하고있는 물질을 제거하였다. 이 때 PTHrP(1-34 +C)의 고정량은 226.4 RU(resonance units)이었다(도 19).HBS (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) was used as the buffer and the rate was 5 μl / min. 100 μl of 0.05 M N-hydroxy pumpkin acid (NHS) /0.2 M hydrochloric acid N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (100 μl of the carboxyl group of carboxymethyldextran on sensor chip CM5) EDC) and 100 μl of 80 mM hydrochloric acid 2- (2-pyridinyldithio) ethanamine (PDEA) /0.1 M boric acid buffer pH 8.5. Subsequently, 10 μl of 5 μg / ml PTHrP (1-34 + C) / 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 was injected, and the Cys residues at the C terminus of PTHrP (1-34 + C) were specifically immobilized. In addition, excess activator was blocked by injecting 100 μl of 50 mM (L) -cysteine / 1 M NaCl / 0.1 M hydrochloric acid. In addition, 10 μl of 0.1 M glycine-hydrochloric acid complete solution pH 2.5 and 10 μl of 10 mM hydrochloric acid were injected to remove non-covalent substances. At this time, the fixed amount of PTHrP (1-34 + C) was 226.4 RU (resonance units) (Fig. 19).

(2) 고정화PTHrP(1-34 +C)와 마우스항 PTHrP 정제항체와의 상호작용(2) Interaction of Immobilized PTHrP (1-34 + C) with Mouse Anti-PTHrP Purified Antibody

완충액으로 HBS를 이용하고, 속도는 20 ㎕/분으로 하였다. 항체는 하이브리도마 세포를 Balb/c 마우스에 주입하여 복수화하고, 채취한 복수를 프로테인A칼럼을 이용하여 정제하였다. 정제한 #23-57-137-1 항체를 MBC, 정제한 3F5 항체를 3F5라고 표기하였다. 이들 항체를 HBS를 이용하여 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/㎖의 농도로 조절하였다.HBS was used as the buffer and the rate was 20 μl / min. Antibodies were hybridized by injecting hybridoma cells into Balb / c mice, and the collected ascites was purified using a Protein A column. The purified # 23-57-137-1 antibody was designated MBC, and the purified 3F5 antibody was designated 3F5. These antibodies were adjusted to concentrations of 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg / ml using HBS.

분석은 항체용액의 40 ㎕를 주입하는 2분간을 연결상으로 하고, 그 후에 HBS로 바꾸고, 2분간의 해리상으로 하였다. 해리상 종료 후, 10 ㎕의 10 mM 염산을 주입함으로써, 센서칩을 재생하였다. 이 결합ㆍ해리ㆍ재생을 분석의 1 사이클로 하고, 각종 항체용액을 주입하고, 센서그램을 수득하였다.The analysis was performed for 2 minutes in which 40 µl of the antibody solution was injected as the connecting phase, then changed into HBS, and the dissociation phase for 2 minutes. After the dissociation phase was completed, the sensor chip was regenerated by injecting 10 µl of 10 mM hydrochloric acid. This binding, dissociation and regeneration were taken as one cycle of the assay, various antibody solutions were injected, and sensorgrams were obtained.

(3) 고정화 PTHrP(1-34 + C)와 인간형화된 PTHrP 정제항체와의 상호작용(3) Interaction of Immobilized PTHrP (1-34 + C) with Humanized PTHrP Purified Antibody

런닝완충액으로 HBS를 이용하고, 속도는 20 ㎕/분으로 하였다. 항체를 CHO 세포에 생산시켜 프로테인 A칼럼을 이용하여 정제하였다. 정제한 키메라항체를 'chMBC', 정제한 인간형화된 항체 버젼 m을 'hMBCm', 버젼 q를 'hMBCq'라고 각각 표기하였다. 이들 항체를 HBS를 이용하여 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/㎖의 농도로 조절하였다.HBS was used as a running buffer, and the speed was 20 microliters / min. Antibodies were produced in CHO cells and purified using Protein A column. The purified chimeric antibody was designated as 'chMBC', the purified humanized antibody version m as 'hMBCm' and the version q as 'hMBCq'. These antibodies were adjusted to concentrations of 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg / ml using HBS.

분석은 항체용액의 40 ㎕를 주입하는 2분간을 연결상으로 하고, 그 후에 HBS로 바꾸고, 2분간의 해리상으로 하였다. 해리상종료 후, 10 ㎕의 HCl을 주입함으로써, 센서칩을 재생하였다. 이 결합ㆍ해리ㆍ재생을 분석의 1 사이클로 하고, 각종 항체용액을 주입하고, 센서그램을 수득하였다.The analysis was performed for 2 minutes in which 40 µl of the antibody solution was injected as the connecting phase, then changed into HBS, and the dissociation phase for 2 minutes. After dissociation phase termination, the sensor chip was regenerated by injecting 10 µl of HCl. This binding, dissociation and regeneration were taken as one cycle of the assay, various antibody solutions were injected, and sensorgrams were obtained.

(4) 상호작용의 속도론적 해석(4) Kinetic Analysis of Interactions

목적으로 하는 데이터 영역을 분석하고, 목적으로 하는 반응영역에 대하여 다시 분석을 수행함으로써 반응 패턴의 비교를 수행하였다(도 20 내지 도 24). 도 20 내지 도 24에 있어서, 각 곡선은 도의 윗방향에서 아랫방향을 향해서 각각 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/㎖의 항체농도이다. 또한, 커브피팅에 의한 카이네틱스 변수(결함속도 정수 kass 및 해리속도 정수 kdiss)의 산출을 수행하는 비아코아 전용 해석 소프트웨어인「BIAevaluation 2.1」(Pharmacia)를 이용하여 상호작용의 속도론적 해석을 수행하였다(표 4 내지 표 5).The target data area was analyzed and the analysis of the target reaction area was performed again to compare the reaction patterns (FIGS. 20 to 24). In Figs. 20 to 24, each curve is an antibody concentration of 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 µg / ml, respectively, from the upper direction to the lower direction of the figure. In addition, the kinetic analysis of interactions is performed using BIAevaluation 2.1 (Pharmacia), a BIACOA analysis software that calculates kinetic parameters (defect rate constant kass and dissociation rate constant kdiss) by curve fitting. (Tables 4-5).

MBC 및 3F5의 카이네틱스파라미터Kinetic parameters of MBC and 3F5 MBC MBC 3F5 3F5 kdiss [1/s]kdiss [1 / s] 7.38 ×10^-5 7.38 × 10 ^-5 1.22 ×10^-2 1.22 × 10 ^-2 kass [1/Ms]kass [1 / Ms] 7.23 ×10⁵ 7.23 × 10 ⁵ 6.55 ×10⁵ 6.55 × 10 ⁵ KD [M]KD [M] 1.02 ×10^-10 1.02 × 10 ^-10 1.86 ×10^-8 1.86 × 10 ^-8

키메라항체 및 인간형화된 항체의 카이네틱스파라미터Kinetic Parameters of Chimeric and Humanized Antibodies chH-chλ chH-chλ hMBCCm hMBCCm hMBCq hMBCq kdiss [1/s] (×10^-4 )kdiss [1 / s] (× 10 ^-4 ) 1.66 1.66 3.16 3.16 2.32 2.32 kass [1/Ms] (×10⁶ )kass [1 / Ms] (× 10 ⁶ ) 1.24 1.24 0.883 0.883 1.03 1.03 KD [M] (×10^-10 )KD [M] (× 10 ^-10 ) 1.34 1.34 3.58 3.58 2.25 2.25

또한, 결합속도정수를 구할 때에는, 해석모델 타입4를 이용하였다 (BIAevaluation 2.1 Software Handbook, A1 ∼ A5).In addition, an analysis model type 4 was used to determine the coupling rate constant (BIAevaluation 2.1 Software Handbook, A1 to A5).

실시예 9 : 악성종양 수반성 고칼슘 혈증 모델의 인배출 억제작용 Example 9 : Phosphorus excretion inhibitory effect of malignant tumor-associated hypercalcemia model

악성종양 수반성 고칼슘혈증(HHM)은 종양이 생산하는 PTHrP가 그 원인물질이고, PTHrP는 골흡수 및 신뇨세관에서의 칼슘 제흡수를 항진시키고, 고칼슘혈증을 야기하는 것이 알려져 있다. 한편, 인에 관해서는 PTHrP는 신뇨세관에 있어서 재흡수를 억제하는 결과, 배출촉진 작용을 나타내고, 임상 HHM 환자에 있어서는 자주 저인혈증이 확인되었다. 렛트 악성종양 수반성 고칼슘혈증 모델을 이용하고, 인간형화된 항PTHrP항체의 신장에 있어서, 인배출에 대한 효과를 검토하였다: 인간간암주 LC-6의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본크레아)를 이용하고, 생체 내 조건 에서 수행하였다. 약효평가로는 5주령된 자성 F344/N Jcl-rnu 누드렛트(일본크레아)를 구입하고, 1주간 순화한 후, 6주령된 동물을 사용하였다.It is known that malignant tumor-associated hypercalcemia (HHM) is caused by PTHrP produced by the tumor, and PTHrP is known to increase bone resorption and calcium absorption in the urinary tubules and cause hypercalcemia. On the other hand, in terms of phosphorus, PTHrP suppresses resorption in renal tubules. As a result, PTHrP has an effect of promoting discharge, and hypoglycemia was frequently found in clinical HHM patients. Using the Lett's malignant tumor-associated hypercalcemia model, we examined the effect on phosphorus excretion in the renalization of humanized anti-PTHrP antibodies: passage of human liver carcinoma LC-6 was BALB / c-nu / nu nude mice (Japanese Crea) was used and performed in vivo. For efficacy evaluation, a 5 week old female F344 / N Jcl-rnu nude let (Japanese crea) was purchased, purified for 1 week, and 6 week old animals were used.

악성종양수반성 고칼슘혈증모델의 작제는 이하와 같은 방법으로 수행하였다:즉, 계대하고 있는 인간간암 LC-6 종양을 추출하고, 3 mm 각 블럭으로 잘게 썬 종양덩어리를 렛트의 옆구리 피하에 1마리당 1개씩 이식하였다. 종양덩어리를 이식한 후, 30일을 전후로 하여 종양체적이 충분히 커지게 된 것(3000 ㎣)을 확인한 다음, 혈중 칼슘 농도, 체중을 지표로서 악성종양수반성 고칼슘혈증 모델동물로 하였다.Construction of the malignant tumor-associated hypercalcemia model was carried out in the following manner: extracting human liver cancer LC-6 tumors, and lumping tumor masses chopped into 3 mm square blocks per litter subcutaneously per rat. One implanted. After the tumor was transplanted, it was confirmed that the tumor volume was sufficiently enlarged (3000 kPa) around 30 days, and then, as an indicator of malignant tumor-associated hypercalcemia, the blood calcium concentration and body weight were used as indicators.

신장 클리어런스법에 의한 인배출의 검토는 이하와 같은 방법으로 수행하였다.Examination of phosphorus discharge by the kidney clearance method was performed by the following method.

(1) 신장클리어런스법(1) Kidney clearance method

악성종양수반성 고칼슘혈증 모델동물을 펜트발비탈(넨부탈, 대일본제약(주))로 마취하고, 37 ℃ 온도 매트상에 배위고정하고, 채뇨용으로 방광카뉴레(폴리에틸렌튜브, PE50, 일본 벡튼디킨슨)을 구입한 다음, 대퇴정맥에 인푸젼용 카뉴레(폴리에틸렌튜브, PE10, 일본벡튼이킨슨)을 구입하고, 인푸젼 용액(조성: 0.7 % 이눌린, 5 % 만니톨, 0.2 % 펜트발비탈, 0.9 % 염화나트륨)을 인푸젼펌프(텔퓨젼펌프, STC-525, 텔모)로 유속 2 ㎖/hr로 인푸젼하였다. 50분간 평형화시킨 후, 20분간의 간격으로 5회(피리오드-1부터 피리오드-5까지)의 채뇨를 방광카뉴레로 수행하고, 요샘플로 하였다. 또한 각 채뇨의 중간점에 있어서, 정맥에서 혈액샘플을 헤파린 처리한 주사통으로 약 0.25 ㎖ 채취하였다.Malignant tumor-associated hypercalcemia model animals are anesthetized with pentvalbital (Nenbutal, Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), coordinated on a 37 ° C temperature mat, and bladder canure (polyethylene tube, PE50, Japan) for urine collection. Becton Dickinson), then infusion canuree (polyethylene tube, PE10, Nippon Bectin Ikinson) in the femoral vein, infusion solution (composition: 0.7% inulin, 5% mannitol, 0.2% pentvalbital, 0.9% sodium chloride) was infused with an infusion pump (Telfusion pump, STC-525, Telmo) at a flow rate of 2 ml / hr. After equilibration for 50 minutes, five urine collections (pyrid-1-1 to pyrid-5) at 20 minute intervals were performed with bladder canneures and urinated with urine. At the midpoint of each urine collection, about 0.25 ml of blood samples were collected from a vein into a heparinized syringe.

(2) 항체의 투여(2) Administration of the antibody

상기한 클리어런스 실험의 피리오드(period)-2의 채뇨 개시 시점에서 인간형화된 항 PTHrP 항체를 1 ㎎/㎖/㎏ 정맥내에 투여하였다.Humanized anti-PTHrP antibody was administered intravenously at 1 mg / ml / kg at the time of initiation of the urine collection of period-2 in the clearance experiment described above.

(3) 뇨중 및 혈중 이눌린 및 인농도 측정(3) measurement of urinary and blood inulin and phosphorus concentrations

피리오드-1 부터 피리오드-5에서 수득한 뇨샘플은 뇨량을 측정한 후, 이눌린 및 인농도를 측정하였다. 또한 같은 방법으로 수득한 혈액 샘플은 냉각 원심분리한 후, 혈장샘플로서 이눌린 및 인농도를 측정하였다. 이눌린 농도는 안스론 황산법(Roe, j. H. et al., J Biol Chem 178, 839-845, 1949)으로 축정하였다. 인농도는 일립자동분석장치 7170형으로 무기인 측정용 시약, 오트세라IP(제일화학약품)을 이용하고, 측정 매뉴얼대로 측정하였다(휘그케ㆍ사바로 법).The urine samples obtained from pyrid-1 to pyrid-5 were measured after measuring urine volume and inulin and phosphorus concentrations. In addition, the blood samples obtained by the same method, after cooling centrifugation, inulin and phosphorus concentrations were measured as plasma samples. Inulin concentrations were calculated by anthrone sulfuric acid method (Roe, j. H. et al., J Biol Chem 178, 839-845, 1949). Phosphorus concentration was measured using an automatic chemical analyzer 7170 type, an inorganic reagent, Ocecera IP (Cheil Chemical), according to the measurement manual (Higke-Sabaro method).

(4) 이눌린클리어런스, 인클리어런스 및 이배출율의 산출(4) Calculation of Inulin Clearance, Inclusion, and Discharge Rate

이눌린클리어런스(inulin clearance, Cin), 인클리어런스(phosphate clearance, Cp)및 인배출율(fractional excretion of phosphate, FEp)는 이하의 식으로 산출하였다.Inulin clearance (Cin), phosphorus clearance (Cp) and fractional excretion of phosphate (FEp) were calculated by the following equation.

이눌린클리어런스(inulin clearance, Cin)의 산출Calculation of Inulin Clearance (Cin)

Cin = Uin V / Pin Cin = Uin V / Pin

Cin은 이눌린클리어런그(㎖/㎏/min)을 나타낸다. Uin은 뇨중 이눌린 농도(㎎/㎖)을 나타낸다. V는 단위시간 당의 요량(㎖/㎏/min)을 나타낸다. Pin은 혈중 이눌린 농도(㎎/㎖)을 나타낸다.Cin represents inulin clear rung (ml / kg / min). Uin represents the urine inulin concentration (mg / ml). V represents the urine amount per unit time (ml / kg / min). Pin represents the blood inulin concentration (mg / ml).

인클리어런스(phosphate clearance, Cp)의 산출Calculation of phosphate clearance (Cp)

Cp = Up V/ Pp Cp = Up V / Pp

Cp는 인클리어런스(㎖/㎏/min)을 나타낸다. Up는 요중 인농도(㎎/㎖)을 나타낸다. V는 단위시간당 요량(㎖/㎏/min)을 나타낸다. Pp는 혈중인농도(㎎/㎖)을나타낸다.Cp represents clearance (ml / kg / min). Up represents urine phosphorus concentration (mg / ml). V represents the urine amount per unit time (ml / kg / min). Pp represents blood concentration (mg / ml).

인배설율(fractional excretion of phosphate, FEp)의 산출Calculation of fractional excretion of phosphate (FEp)

FEp = Cp / Cin FEp = Cp / Cin

FEp는 인배설율을 나타낸다. Cin은 이눌린클리어런스(㎖/㎏/min)을 나타낸다. Cp는 인클리어런스(㎖/㎏/min)을 나타낸다. 실험은 4마리의 동물을 이용하여 수행하였다. 결과는 그 평균치 ±표준오차로 나타낸다.FEp represents phosphorus excretion rate. Cin represents inulin clearance (ml / kg / min). Cp represents clearance (ml / kg / min). The experiment was performed using four animals. The results are expressed as the mean ± standard error.

인배출율 및 혈중인농도의 결과를 도 25 및 도 26에 나타내었다.The results of phosphorus excretion rate and blood concentration are shown in FIGS. 25 and 26.

도 25는 클리어런스의 각 피리오드(1피리오드는 20분간)와, 신장으로부터의 인배설율(= 인클리어런스/이눌린클리어런스)과의 관계를 나타내는 그래프이다. 또한, 인간형화된 항 PTHrP 항체, 1 ㎎/㎏(i.v.)은 피리오드-2의 처음에 투여하였다. Fig. 25 is a graph showing the relationship between the clearances of each clearance (one period is 20 minutes) and the phosphorus excretion rate from the kidney (= clearance / inulin clearance). In addition, humanized anti-PTHrP antibody, 1 mg / kg (i.v.) was administered at the beginning of pyriod-2.

도 26은 클리어런스의 각 피리오드(1피리오드는 20분간)와, 혈장속의 인농도 와의 관계를 나타내는 그래프이다. 인간형화된 항 PTHrP 항체, 1 ㎎/㎏(i.v.)은 피리오드-2의 처음에 투여하였다. Fig. 26 is a graph showing the relationship between the clearances of each clearance (one period of 20 minutes) and the phosphorus concentration in plasma. Humanized anti-PTHrP antibody, 1 mg / kg (i.v.) was administered at the beginning of pyriod-2.

이상의 결과에 의해, 항체 투여전의 인배셜율(피리오드-1)에 대해서, 항체 투여 후의 인배설율(피리오드-2부터 피리오드-5)는 확실한 억제를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 중화항체를 투여함으로써, 인 배설항진(FEp＞0.2)에 의해 저인혈증상태를 나타내는 상태에 대하여 인 재흡수를 정상화 레벨(인재흡수율 = 1-FEp ＞ 0.8 %)부근까지 회복시켜, 그 결과, 혈중인농도가 정상화하는 경향이 나타났다. 이와 같은 방법으로 PTHrP가 원인으로 일어나는 인배설항진이나 저인혈증 등의 치료제로서 본 항체의 유용성을 나타내었다.As a result of the above, it was confirmed that the phosphorus excretion rate (pyriod-2 to pyriod-5) after the antibody administration showed a certain suppression with respect to the invacial rate (pyriod-1) before antibody administration. In other words, by administering neutralizing antibodies, the phosphorus uptake is restored to the normalized level (a talent absorption rate = 1-FEp> 0.8%) in the state of hypophosphatemia by phosphorus excretion (FEp> 0.2), and as a result, As a result, blood concentrations tended to normalize. In this manner, the present invention has been shown to be useful as a therapeutic agent for pulmonary excretion and hypophosphatemia caused by PTHrP.

PTHrP는 악성종양수반성 고칼슘혈증의 원인물질이기 때문에, PTHrP에 의한 인배설의 증가이나 조직중 고에너지 유기인산 농도의 저하가 예상된다. 따라서, 저인혈증을 수반하는 질환, 예를 들어, 저인혈성구루병, 전인혈성비타민D저항성구루병 등으로는 요중에서의 인배셜 증가가 주된 원인이고, 본 항체에는 이들 질환의 치료제로서 유용하다.Since PTHrP is a cause of malignant tumor-associated hypercalcemia, an increase in phosphorus excretion by PTHrP and a decrease in high energy organophosphate concentration in tissues are expected. Therefore, an increase in urinary tract is a major cause of diseases associated with hypophosphatemia, for example, hypophosphatemic rickets and whole-human vitamin D-resistant rickets. The antibody is useful as a therapeutic agent for these diseases.

실시예 10 : 악성종양수반성 고칼슘혈증의 임상의 여러증상의 개선 Example 10 Improvement of Clinical Symptoms of Malignant Tumor-Related Hypercalcemia

악성종양수반성 고칼슘혈증은 종양이 생산하는 PTHrP가 그 원인물질인고, PTHrP는 골흡수 및 신뇨세관에서의 칼슘 재흡수을 항진하고, 고칼슘혈증을 야기하는 것이 알려져 있다. 또한, 악성종양에 수반하는 고칼슘혈증으로는 직무수행능력 의 악화, 의식장해, 전신권태감, 구토감이나 메스꺼움(식욕부진) 등의 인상상태의 악화가 확인되었다. 이들 임상상태에 대한 항 PTHrP 항체의 효과를 인간종양-누드마우스 이식계 및 인간종양-누드렛트 이식계의 고칼슘혈증 모델동물을 이용하여 검토하였다: 고칼슘혈증 모델동물로서 인간간암 LC-6((재)실험동물중앙연구소에서 구입)이식 누드마우스 및 누드렛트를 이용하였다. 인간간암 LC-6이 이식된 누드마우스 및 누드렛트는 종양의 증가에 수반하는 혈중 칼슘농도가 상승하고, 체온저하, 체중감소나 운동량의 저하등의 고칼슘혈증 상태를 발병시켰다.It is known that malignant tumor-associated hypercalcemia is caused by tumor-producing PTHrP, and PTHrP promotes bone resorption and calcium reabsorption in neurine tubules and causes hypercalcemia. In addition, hypercalcemia associated with malignant tumors was found to be deteriorated in the state of performance such as deterioration of job performance, consciousness of disability, general malaise, nausea and nausea (lack of appetite). The effects of anti-PTHrP antibodies on these clinical conditions were examined using hypercalcemia models of human tumor-nude mouse transplantation and human tumor-nudelet transplantation systems: human liver cancer LC-6 ((re) Transplanted nude mice and nude rats were used. Nude mice and nude rats transplanted with human liver cancer LC-6 developed hypercalcemia states such as elevated blood calcium concentrations with increased tumors, decreased body temperature, weight loss and decreased exercise.

악성종양수반성 고칼슘혈증의 일반 암상상태에 대하여 마우스항PTHrP항체의 개선효과를 인간간암 LC-6-누드마우스 이식계를 이용하여 사진으로 나타내었다. 또한 운동량의 개선, 체온개선 및 식이량 저하의 개선효과는 인간간암 LC-6-누드마우스 이식계를 이용하여 평가하였다.The improvement effect of the mouse anti-PTHrP antibody in the general cancerous condition of malignant tumor-associated hypercalcemia is shown by a human liver cancer LC-6-nude mouse transplantation system. In addition, the effect of improving the amount of exercise, improving the body temperature and lowering the diet was evaluated using the human liver cancer LC-6-nude mouse transplantation system.

1. 고칼슘혈증에 수반하는 외관상의 임상상태의 개선1. Improvement of the apparent clinical condition accompanying hypercalcemia

인간간암 LC-6의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본크레아)를 이용하여 생체 내 조건에서 수행하였다: 약효평가로는 5주령된 자성 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본크레아)를 구입하고, 1주간 순화한 후, 6주령된 동물을 사용하였다.Passage of human liver cancer LC-6 was performed in vivo using BALB / c-nu / nu nude mice (Japanese Crea): as a efficacy evaluation, 5 week old female BALB / c-nu / nu nude mice (Japan) 6 weeks old animals were used after the creases) were purchased and purified for 1 week.

고칼슘혈증모델의 작제 및 군분류는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 계대하고 있는 인간간암 LC-6 을 추출하고, 3 mm 각 블럭으로 잘게 썬 종양덩어리를 마우스의 옆구리피하에 1마리당 1개씩 이식하였다. 종양덩어리를 이식한 후, 27일째에 종양체적이 충분히 커지게 된 것을 확인한 다음, 종양체적, 혈중 칼슘 농 도 및 체중을 지표로서 각 지표가 평균화되도록 군을 분리하고, 고칼슘혈증 모델동물로 하였다.The construction and grouping of hypercalcemia models were performed in the following manner: extracting human liver cancer LC-6, subcutaneously chopped into 3 mm square blocks, one per mouse subcutaneous. Transplanted. After transplanting the tumor mass, it was confirmed that the tumor volume was sufficiently increased on the 27th day, and then the groups were separated so that the indicators were averaged based on the tumor volume, blood calcium concentration and weight, and the hypercalcemia model animals were used.

종양체중은 종양의 장경(amm) 및 단경(bmm)를 측정하고, 가란의 계산 ab² /2에 의해 종양체적으로 산출하였다.Tumor weight was measured for major diameter (amm) and minor axis (bmm) of the tumor and calculating the tumor volume by the computation of Garland ab ^2/2.

혈중 칼슘농도는 안와에서 헤머토크릿관에서 채혈하고, 643 자동 Ca + +/pH 분석기(CIBA-CORNING)를 이용하여 전혈 이온화칼슘 농도로서 측정하였다.Blood calcium levels were collected in hematocrit tubes in the orbit and measured as whole blood ionized calcium concentrations using a 643 automated Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING).

고칼슘혈증에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 상기에서 작제, 군을 분리한 고칼슘혈증 모델동물에 마우스 1마리당 100 ㎍의 PTHrP에 대한 마우스 항체를 종양이식을 한 후, 27, 30, 34, 37일 째에 꼬리 정맥내에 투여하였다. 대조군으로는 인산완충생리식염수를 같은 방법으로 꼬리정맥내에 투여하였다. 항체 투여군 및 대조군 중에서 전형적인 1마리를 각각 선택하고, 정상동물과 함께, 종양이식 41일째에 사진 촬영을 수행하였다. Examination of the therapeutic effect on hypercalcemia was performed by the following method: namely, after the tumor transplantation of the mouse antibody against PTHrP of 100 μg / mouse per mouse in the hypercalcemia model animal prepared and isolated from the group above, Administration was intravenously at tail vein on day 27, 30, 34, 37. As a control, phosphate buffered saline was administered to the tail vein in the same manner. One typical one was selected from the antibody-administered group and the control group, and photographed on the 41st day of tumor transplantation with normal animals.

결과적으로, 인간간암 LC-6 이식 고칼슘혈증 모델에 있어서, 항체 투여 동물(도 27의 중앙 및 도 28의 중앙)은 대조동물(도 27의 오른쪽 및 도 28의 오른쪽)과 같은 정도의 종양덩어리를 유지하는 것에도 관계없이, 정상동물(도 27의 왼쪽 및 도 28의 왼쪽)과 동등의 외견을 나타냄을 물론, 항 PTHrP 항체 투여에 의해 외견상의 임상상태의 개선이 뚜렷한 것으로 확인되었다(도 27 및 28).As a result, in a model of human liver cancer LC-6 transplanted hypercalcemia, the antibody-administered animals (center in FIG. 27 and center in FIG. 28) were able to produce tumor masses on the same level as control animals (right in FIG. 27 and right in FIG. 28). Irrespective of whether it was maintained, it showed the same appearance as the normal animals (left side of FIG. 27 and left side of FIG. 28), and it was confirmed that improvement of the apparent clinical condition was apparent by administration of anti-PTHrP antibody (FIG. 27 and 28).

2. 고칼슘혈증에 수반되는 운동량 저하의 개선2. Improving the momentum decline associated with hypercalcemia

인간간암 LC-6의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본크레아)를 이용하여 생체 내 조건에서 수행하였다: 약효평가로는 5주령된 웅성 F344/N Jcl-rnu 누드렛트(일본크레아)를 구입하고, 1주간 순화한 후, 6주령된 동물을 사용하였다.Passage of human liver cancer LC-6 was performed in vivo using BALB / c-nu / nu nude mice (japanese crea): as a pharmacologic evaluation, 5 week old male F344 / N Jcl-rnu nudes (japanese creatine). 6 weeks old animals were used after 1 week of purification.

악성종양수반성고칼슘혈증모델의 작제 및 군분류는 이하와 같은 방법으로 수행하였다: 즉, 계대하고 있는 인간간암 LC-6 을 추출하고, 3 mm 각 블럭으로 잘게 썬 종양덩어리를 렛트의 옆구리피하에 1마리당 1개씩 이식하였다. 종양덩어리를 이식한 후, 30일째를 전후하여 종양체적이 충분히 커지게 된 것을 확인한 다음, 혈중 칼슘 농도 및 체중을 지표로서 악성종양수반성 고칼슘혈증 모델동물로 하였다.Construction and grouping of malignant tumor-associated hypercalcemia models were carried out in the following manner: extracting human liver cancer LC-6 and subcutaneous tumor mass chopped into 3 mm square blocks under the flank of the rat. One per implant was implanted. After the tumor mass was transplanted, it was confirmed that the tumor volume was sufficiently enlarged around 30 days, and then, as an indicator of blood calcium concentration and body weight, the tumor-causing hypercalcemia model animal was used.

혈중 칼슘농도는 눈에서 헤머토크릿관을 이용하여 채혈하고, 643 자동 Ca + +/pH 애널라이저(CIBA-CORNING)를 이용하여 전혈 이온화칼슘 농도로서 측정하였다.Blood calcium levels were collected in the eye using a hematocrit tube and measured as whole blood calcium ion concentration using a 643 automated Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING).

(1) 자동운동량 측정법(1) Automatic momentum measurement method

자동운동량의 측정은 자발운동량 측정장치 아니맥스(ANIMEX activity meter type SE, FARAD Electronics, Sweden)를 이용하고, 개체마다 폴리제 게이지(급수, 급이하)를 소정의 위치에 설치하였다. 이 장치는 렛트의 운동량을 계측하는 것으로 일정 시간 당 카운트로 기록된다. 측정은 오후 7시부터 다음날 오전 8시까지에서의 13시간 수행하고, 측정결과는 1시간당 카운트수로 하였다.The automatic momentum was measured using a spontaneous momentum measuring device Animax (ANIMEX activity meter type SE, FARAD Electronics, Sweden), and a poly gauge (water supply, water supply) was installed at a predetermined position for each individual. The device measures the amount of exercise of the let, which is recorded as a count per hour. The measurement was performed for 13 hours from 7 pm to 8 am the next day, and the measurement result was counted per hour.

(2) 항체의 투여(2) Administration of the antibody

상기한 바와 같이, 고칼슘혈증을 발병한 렛트를 이용하고, 인간형화된 항 PTHrP항체를 5 ㎎/0.5 ㎖/㎏ 꼬리 정맥내에 투여하였다. 또한 대조군으로는 생리식염수를 같은 방법으로 투여하였다. 측정은 항체투여개체와 대조개체를 상호적으로 측정하였다. 측정일은 항체 투여개체는 항체투여0(투여전일), 2, 4, 7, 14일 째 또는 대조개체는 1, 3, 5, 8, 15일째에 수행하였다.As described above, the rats developing hypercalcemia were used, and humanized anti-PTHrP antibodies were administered in 5 mg / 0.5 ml / kg tail vein. In addition, physiological saline was administered in the same way as a control. The measurement was performed by mutually measuring the antibody administered and the control entity. On the measurement day, antibody administration subjects were performed on antibody 0 (day before administration), 2, 4, 7, 14 days, or control group on 1, 3, 5, 8, 15 days.

그 결과, 대조개체의 자발자동량은 실험기간중 변화가 없거나 또는 감소경향을 나타내는 것에 비하여, 항체투여 개체는 4일 째 이후 자발운동량의 증가가 확인되었다(도 29).As a result, the spontaneous autologous amount of the control subject showed no change or a tendency to decrease during the experimental period, and the antibody-administered subject increased the spontaneous motility after 4 days (FIG. 29).

3. 고칼슘혈증에 수반하는 체온저하의 개선3. Improvement of body temperature accompanying hypercalcemia

인간간암주 LC-6의 계대 및 악성종양수반성 고칼슘혈증 모델의 작제는 상기 2로 표시한 방법과 방법과 같은 방법으로 실시하였다.The construction of the passage of human liver cancer LC-6 and the model of malignant tumor-associated hypercalcemia was carried out by the same method as the method shown in 2 above.

(1) 체온측정법(1) body temperature measurement

체온의 측정은 디지탈온도계를 이용하고, 개체는 펜트바루비탈(넨부탈, 대일본제약(주))으로 마취하고, 온도 센서칩을 직장에 삽입하여 수행하였다.Body temperature was measured using a digital thermometer, and the individual was anesthetized with pentbarubital (Nenbutal, Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and the temperature sensor chip was inserted into the rectum.

(2) 항체의 투여(2) Administration of the antibody

상기한 바와 같이, 고칼슘혈증을 발병한 렛트를 이용하고, 인간형화된 항 PTHrP항체를 1 ㎎/㎖/㎏ 꼬리 정맥내에 투여하였다. 또한 대조군으로는 생리식염수를 같은 방법으로 투여하였다. 또한, 정상 렛트(무투여군)의 체온에 대해서도 동시에 측정하였다. 체온측정은 항체투여개체와 대조개체 및 정상 렛트 어느 것이라도 투여0(투여당일), 1, 2, 3일 째에 수행하였다.As described above, the rats developing hypercalcemia were used, and humanized anti-PTHrP antibody was administered in 1 mg / ml / kg tail vein. In addition, physiological saline was administered in the same way as a control. In addition, the body temperature of the normal let (no administration group) was also measured at the same time. Thermometry was performed on day 0, day 1, 2, and 3 of the administration of the antibody, control and normal rats.

그 결과, 정상 렛트의 체온은 실험기간중 34.2 내지 34.4 ℃로 거의 변화가 없었으나, 악성종양수반성 고칼슘혈증 렛트는 정상 렛트에 비해서, 약 2℃의 온도 저하가 확인되었다. 또한, 이 모델에 인간형화된 항 PTHrP항체를 투여할 경우, 투여 3일째에 정상렛트의 체온으로 회복되는 것이 확인되었다. 이와 같은 방법으로 인간형화된 PTHrP항체는 악성종양수반성 고칼슘혈증 모델에서의 저온저하에 대하여 개선하는 작용을 가지는 것을 나타내었다(도 30).As a result, the body temperature of the normal rat was almost unchanged from 34.2 to 34.4 ℃ during the experimental period, the malignant tumor-associated hypercalcemia rat was confirmed that the temperature drop of about 2 ℃ compared to the normal let. In addition, when the humanized anti-PTHrP antibody is administered to this model, it was confirmed that the body temperature of the normal rat is restored on the third day of administration. Humanized PTHrP antibody in this manner has been shown to have an action to improve the cryogenic lowering in malignant tumor-associated hypercalcemia model (Fig. 30).

4. 고칼슘혈증에 수반되는 식이량 저하의 개선4. Improvement of dietary deficiency associated with hypercalcemia

인간간암 LC-6의 계대 및 약성종양수반성 고칼슘혈증 모델의 작제는 상기 2에 나타낸 방법과 동일한 방법으로 실시하였다. 작제한 모델은 혈중 칼슘 농도 및 체중을 지표로서 각 지표가 평균화하도록 군을 나누고, 이하 실험에 사용하였다.The passage of human liver cancer LC-6 and the construction of weak tumor-associated hypercalcemia model were carried out in the same manner as shown in the above 2. The model created was divided into groups so that the indicators were averaged as blood calcium concentration and weight, and used in the following experiment.

(1) 식이량 측정법(1) dietary measurement method

렛트는 실험기간중, 개별 사육용의 대사 게이지에 넣어, 급수, 급이하에서 사육하였다. 식이량은 당일 오전 9시부터 다음날 오전 9시까지의 24시간 식이량으로 하고, 급이기의 중량을 측정하고, 미리 측정한 중량(풍장중량)과의 차이를 그 개체의 식이량(g)으로 하였다.During the experiment, the rats were placed in metabolic gauges for individual breeding and reared under water supply and feeding. The dietary amount was the amount of food for 24 hours from 9:00 am to 9:00 am the next day, the weight of the feeder was measured, and the difference from the previously measured weight (wind weight) was defined as the dietary amount (g) of the individual. .

(2) 항체의 투여(2) Administration of the antibody

상기한 바와 같이, 고칼슘혈증을 발병하는 렛트(HHM 렛트)를 이용하고, 인간형 항 PTHrP 항체를 5 ㎎/0.5 ㎖/㎏ 꼬리정맥내에 투여하였다. 대조군으로는 생리식염수를 같은 방법으로 투여하였다. 또한, 정상 렛트에 대해서도 생리식염수를 같은 방법으로 투여하였다. 식이량 측정은 항체투여군, 대조군 및 정상 렛트군 어느 것이라도 투여0(투여전일부터 당일), 1(투여당일부터 다음날), 3(투여 3일째부터 다음날), 5일째(투여 5일째부터 다음날)에 수행하였다.As described above, a rat that developed hypercalcemia (HHM let) was used, and humanized anti-PTHrP antibody was administered in 5 mg / 0.5 ml / kg tail vein. As a control group, saline was administered in the same manner. Also, normal saline was administered in the same manner to normal rats. Dietary measurement was performed in any of the antibody administration group, the control group, and the normal rat group. Was performed.

그 결과, 투여직전의 식이량은 고칼슘혈증렛트(개체 5부터 9)에서는 평균으로 8.11 g이고, 정상렛트는 평균 12,06g 이었다. 이와 같은 방법으로 확실히 고칼슘혈증 렛트에서는 식이량의 저하가 확인되었다. 이 모델에 인간형화된 PTHrP항체를 투여할 경우, 대조군에서는 그다지 식이량에 변화가 없는 것에 비해서, 항체 투여군에서는 투여 1일째 이후 정상 렛트의 식이량으로 회복되는 것이 확인되었다. 이와 같은 방법으로 인간형화된 PTHrP항체는 악성종양수반성 고칼슘혈증 모델에서의 식이량 저하에 대해서 개선하는 작용이 탁월한 것을 확인하였다(표6).As a result, the amount of diet immediately before administration was 8.11 g on average in hypercalcemia rats (individuals 5 to 9) and 12,06 g on average in normal rats. In this way, a decrease in diet was confirmed in hypercalcemia rats. When the humanized PTHrP antibody was administered to this model, it was confirmed that in the control group, there was no change in dietary amount, whereas the antibody-administered group recovered to the normal diet after 1 day of administration. In this way, humanized PTHrP antibody was found to be excellent in improving the dietary effect in the malignant tumor-associated hypercalcemia model (Table 6).

식이량에 미치는 영향Effect on food 동물 개체번호 투여 개체별 식이량(g) Animal Individual Number Dosage of Individuals (g) 투여전일 1일전 3일전 5일전 1 day before administration 3 days before 5 days before 정상 렛트Normal let 개체 1 Object 1 생리식염수 Saline solution 13.7 13.7 16.7 16.7 18.63 18.63 18.71 18.71 개체 2 Object 2 생리식염수 Saline solution 14.27 14.27 15.3 15.3 19.55 19.55 19.39 19.39 개체 3 Object 3 생리식염수 Saline solution 9.83 9.83 15.5 15.5 20.72 20.72 19.88 19.88 개체 4 Object 4 생리식염수 Saline solution 10.42 10.42 15.04 15.04 20.28 20.28 22.03 22.03 HHHM 렛트HHHM Let 개체 5 Object 5 생리식염수 Saline solution 10.77 10.77 14.24 14.24 12.66 12.66 11.82 11.82 개체 6 Object 6 생리식염수 Saline solution 6.99 6.99 8.92 8.92 2.59 2.59 14.8 14.8 HHHM 렛트HHHM Let 개체 7 Object 7 항PTHrP항체 Anti-PTHrP Antibodies 7.46 7.46 17.65 17.65 22.52 22.52 17.99 17.99 개체 8 Object 8 항PTHrP항체 Anti-PTHrP Antibodies 12 12 12.38 12.38 20.94 20.94 23.1 23.1 개체 9 Object 9 항PTHrP항체 Anti-PTHrP Antibodies 3.35 3.35 16.65 16.65 20.36 20.36 21.89 21.89

주: 생리식염수 투여량은 0.5 ㎖/㎏ 꼬리 정맥 투여Note: Physiological saline dose is 0.5 ml / kg tail vein

항체 투여량은 5㎎/0.5㎖/㎏ 꼬리 정맥 투여 Antibody dose is 5mg / 0.5ml / kg tail vein administration

이상의 결과에서, 본 발명의 키메라항체 및 인간형화된 항체는 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증의 임상적 여러 증상의 개선약으로서 유용성을 보여주었다.In the above results, the chimeric and humanized antibodies of the present invention have been shown to be useful as drugs for ameliorating various clinical symptoms of hypercalcemia associated with malignancies.

5. 고칼슘혈증에 수반되는 혈액 pH의 개선5. Improvement of blood pH accompanying hypercalcemia

(1) 혈액 pH 측정법(1) blood pH measurement

혈액 pH는 헤파린 처리한 주사통을 이용하고, 심장채혈법을 채취하고, 643 자동 Ca + +/pH 분석기(CIBA-CORNING)를 이용하고 혈액 pH를 측정하였다.Blood pH was measured using a heparinized syringe, cardiac sampling, and 643 automated Ca + + / pH analyzer (CIBA-CORNING) to measure blood pH.

(2) 항체의 투여(2) Administration of the antibody

상기한 바와 같이, 고칼슘혈증을 발병하는 렛트(HHM 렛트)를 이용하고, 인간형 항 PTHrP 항체를 5 ㎎/0.5 ㎖/㎏ 꼬리정맥내에 투여하였다(n = 2). 혈액 pH 측정은 항체투여군 및 대조군의 어느것이라도 투여0(투여당일), 1, 7일째에 수행하였다.As described above, a rat that developed hypercalcemia (HHM let) was used, and humanized anti-PTHrP antibody was administered in 5 mg / 0.5 ml / kg tail vein (n = 2). Blood pH measurements were taken at day 0 (day of administration), 1 and 7 in both antibody and control groups.

그 결과, 고칼슘혈증렛트의 항체투여전의 혈액 pH는 7.49로서(정상렛트의 혈액 pH는 pH 7.40 ±0.02), 전기 모델은 확실히 알카로시스의 상태를 나타내고 있었다. 이 모델에 인간형화된 PTHrP항체를 투여할 경우, 대조군에서는 그다지 혈액 pH 의 변화가 없는 것에 비해서, 항체 투여 7일째에는 정상렛트의 혈액 pH에 가까운 값까지 개선되는 것이 확인되었다. 악성종양수반성 고칼슘혈증(HHM)에 있어서 인상적 여러 증상의 한가지로 신장에서의 증중탄산 이온(HCO₃ ^- )의 배설저해에 근거한 대사성 게이지 알카로시스가 보고되어 있다. 본 발명의 인간형화된 PTHrP항체의 투여는 본 모델에서 혈액 pH를 정상화하는 것으로부터 HHM으로 보여지는 대사성 알카로시스를 개선하는 작용을 가지는 것을 나타내었다(도 31).As a result, the blood pH before antibody administration of the hypercalcemia pellet was 7.49 (the blood pH of the normal pellet was pH 7.40 ± 0.02), and the electrical model clearly showed the state of alkalosis. When the humanized PTHrP antibody was administered to this model, it was confirmed that the control group showed no improvement in blood pH, but improved to a value close to the blood pH of the normal rat on day 7 of antibody administration. Metabolic gauge alkalosis based on inhibition of excretion of bicarbonate ions (HCO ₃ ⁻ ) in the kidney has been reported as one of several impressive symptoms in malignant tumor-associated hypercalcemia (HHM). Administration of the humanized PTHrP antibody of the present invention has been shown to have the effect of improving metabolic alkalosis seen as HHM from normalizing blood pH in this model (FIG. 31).

이상의 결과에서, 본 발명의 키메라항체 및 인간형화된 항체는 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증의 임상적 여러 증상을 개선하기 위한 개선약으로서 유용성을 보여주었다.In the above results, the chimeric and humanized antibodies of the present invention have been shown to be useful as an ameliorating agent for ameliorating various clinical symptoms of hypercalcemia associated with malignancies.

본발명에 의해 PTHrP에 대한 항체, 키메라항체 및 인간형화된 항체가 제공된 다. 이들 항체는 인간에 있어서 항원성이 낮기 때문에 고칼슘혈증, 저인혈증 등의 치료제로서 유용하다.The present invention provides antibodies, chimeric and humanized antibodies to PTHrP. Since these antibodies have low antigenicity in humans, they are useful as therapeutic agents for hypercalcemia and hypophosphatemia.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file

Claims

인간 항체의 L쇄C영역, 및 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 마우스 단클론성 항체의 L쇄V영역으로 구성된 키메라 L쇄.A chimeric L chain consisting of an L chain C region of a human antibody and an L chain V region of a mouse monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 for a human parathyroid hormone related peptide.

삭제delete

제 1항에 있어서,The method of claim 1,

C영역이Cλ영역인 키메라 L쇄.Chimeric L chain in which C region is Cλ region.

인간항체의 H쇄C영역, 및 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 마우스 단클론성 항체의 H쇄V영역으로 구성된 키메라 H쇄.A chimeric H chain consisting of the H chain C region of a human antibody and the H chain V region of a mouse monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 for a human parathyroid hormone related peptide.

삭제delete

제 4항에 있어서,The method of claim 4, wherein

C영역이 Cλ1영역인 키메라H쇄.A chimeric H chain whose C region is a Cλ1 region.

제 1항 또는 제 3항에 기재된 키메라 L쇄 및 제 4항 또는 제 6항에 기재된 키메라 H쇄로 구성된 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 키메라단클론성 항체.A chimeric monoclonal antibody directed against a human parathyroid hormone-related peptide comprising the chimeric L chain according to claim 1 or 3 and the chimeric H chain according to claim 4 or 6.

인간항체 HSU03868(GenBank)의 L쇄V영역에서 유래된 L쇄V영역의 프레임워크 영역 1 내지 3과 인간항체 S25755(NBRF-PDB)의 L쇄V영역에서 유래된 L쇄V영역의 프레임워크 영역 4 및 인간부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 마우스 단클론성 항체의 L쇄V영역의 상보성 결정 영역 1 내지 3(서열번호 59 내지 61)을 포함하는 인간형화된 항체의 L쇄V영역으로 구성된 폴리펩티드.Framework regions 1 to 3 of the L chain V region derived from the L chain V region of human antibody HSU03868 (GenBank) and L chain V region derived from the L chain V region of human antibody S25755 (NBRF-PDB). A polypeptide consisting of the L chain V region of a humanized antibody comprising 4 and complementarity determining regions 1 to 3 (SEQ ID NOs: 59 to 61) of the L chain V region of a mouse monoclonal antibody directed against a human parathyroid hormone-related peptide.

삭제delete

프레임워크 영역 중 카밧(Kabat)의 규정에 의한 제 36번째의 아미노산이 티로신이고, 또한, 동 제 49번째의 아미노산이 아스파르트산이며, 서열번호 48 내지 51로 표시되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드.Polypeptide composed of any one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 48 to 51, wherein the 36th amino acid according to the definition of Kabat in the framework region is tyrosine, and the 49th amino acid is aspartic acid; .

삭제delete

프레임워크 영역 중 카밧(Kabat)의 규정에 의한 제 45번째의 아미노산이 리신이고, 또한, 동 제 87번째의 아미노산이 이소로이신이며, 서열번호 52 내지 55로 표시되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드.Polypeptide consisting of any one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 52 to 55, wherein the 45th amino acid according to the definition of Kabat in the framework region is lysine, and the 87th amino acid is isoleucine .

삭제delete

인간하위군 Ⅲ(Human Subgroup Ⅲ, HSG Ⅲ)의 인간항체의 H쇄V영역에서 유래된 H쇄V영역의 프레임워크 영역 1 내지 4 및 인간 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 마우스 단클론성 항체의 H쇄V영역의 상보성 결정 영역 1 내지 3(서열번호 62 내지 64)을 포함하는 인간형화된 항체의 H쇄V영역으로 구성된 폴리펩티드.H-chain V of the mouse monoclonal antibody against framework regions 1 to 4 of the H-chain V region derived from the H-chain V region of human antibodies of the human subgroup III (HSG III) and human parathyroid hormone-related peptides A polypeptide consisting of the H chain V region of a humanized antibody comprising complementarity determining regions 1 to 3 (SEQ ID NOs: 62 to 64) of a region.

삭제delete

서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형화된 항체의 H쇄V영역으로 구성된 폴리펩티드.A polypeptide consisting of the H chain V region of a humanized antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56.

인간 항체의 L쇄C영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 제 8항, 제 12항 및 제 14항의 어느 한 항의 폴리펩티드로 구성된 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 인간형화된 항체의 L쇄.An L chain of a humanized antibody against a human parathyroid hormone-related peptide consisting of a polypeptide comprising the L chain C region of a human antibody, and the polypeptide of any one of claims 8, 12, and 14.

삭제delete

인간 항체의 H쇄C영역을 포함하는 폴리펩티드, 및 제 16항 또는 제 21항에 기재된 폴리펩티드로 구성된 인간부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 인간형화된 항체의 H쇄.An H chain of a humanized antibody against a human parathyroid hormone-related peptide consisting of a polypeptide comprising the H chain C region of a human antibody and the polypeptide according to claim 16 or 21.

제 24항에 있어서,The method of claim 24,

C영역이 Cλ1영역이고, 프레임워크 영역 1 내지 4가 각각 인간항체 HSGIII의 프레임워크 영역 1 내지 4 유래의 것이고, 및 상보성 결정영역 1 내지 3이 각각 서열번호 62 내지 64로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간형화된 항체의 H쇄.C region is Cλ1 region, framework regions 1 to 4 are each derived from framework regions 1 to 4 of human antibody HSGIII, and complementarity determining regions 1 to 3 each comprise an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 62 to 64 H chain of the humanized antibody.

제 22항에 기재된 인간형화된 항체 L쇄 및 제 24항 또는 제 25항에 기재된 인간형화된 H쇄로 구성된 인간부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 인간형화된 항체.A humanized antibody against a human parathyroid hormone-related peptide consisting of the humanized antibody L chain according to claim 22 and the humanized H chain according to claim 24 or 25.

삭제delete

인간부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 마우스 단클론성 항체의 L쇄V영역을 코드하는 염기서열(서열번호 65)로 구성된 DNA.DNA consisting of a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 65) encoding the L chain V region of a mouse monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 for a human parathyroid hormone related peptide.

삭제delete

인간부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 마우스 단클론성 항체의 H쇄V영역을 코드하는 염기서열(서열번호 57)로 구성된 DNA.DNA consisting of a base sequence (SEQ ID NO: 57) encoding the H chain V region of a mouse monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 for a human parathyroid hormone related peptide.

삭제delete

제 1항 또는 3항에 기재된 키메라 L쇄를 코드하는 DNA.DNA encoding the chimeric L chain according to claim 1.

제 53항에 있어서,The method of claim 53,

키메라 L쇄를 코드하는 DNA가 서열번호 65로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA.DNA consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 65 of the DNA encoding the chimeric L chain.

제 4항 또는 6항에 기재된 키메라 H쇄를 코드하는 DNA.DNA encoding the chimeric H chain according to claim 4 or 6.

제 55항에 있어서,The method of claim 55,

키메라 H쇄를 코드하는 DNA가 서열번호 57로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA.DNA consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 of the DNA encoding the chimeric H chain.

제 8항, 제 12항 및 제 14항의 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 염기서열로 구성된 DNA.DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a polypeptide according to any one of claims 8, 12 and 14.

제 57항에 있어서,The method of claim 57,

서열번호 66 내지 74로 표시되는 어느 한 염기서열로 구성된 Consisting of any one nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 66-74

DNA.DNA.

제 16항 또는 제 21항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 염기서열로 구성된 DNA.DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the polypeptide of claim 16.

제 59항에 있어서,The method of claim 59,

서열번호 58로 표시되는 염기서열로 구성된 Consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 58

DNA.DNA.

제 22항에 기재된 인간형화된 항체의 L쇄를 코드하는 DNA.The DNA which codes the L chain of the humanized antibody of Claim 22.

서열번호 47 내지 55로 표시되는 어느 하나의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열으로 구성된 인간형화된 항체의 L쇄DNA.L-chain DNA of a humanized antibody consisting of a nucleotide sequence encoding any one amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 to 55.

제 62항에 있어서,The method of claim 62,

인간형화된 항체의 L쇄DNA가 서열번호 66 내지 74로 표시되는 어느 한 염기서열으로 구성된 것을 특징으로 하는L-chain DNA of the humanized antibody is characterized by consisting of any one of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 66 to 74

DNA.DNA.

제 24항 또는 제 25항에 기재된 인간형화된 항체의 H쇄를 코딩하는 DNA.A DNA encoding the H chain of the humanized antibody of Claim 24 or 25.

서열번호 56으로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 구성된 인간형화된 H쇄DNA.Humanized H-chain DNA consisting of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56.

제 65항에 있어서,66. The method of claim 65,

인간형화된 항체의 H쇄DNA가 서열번호 58로 표시되는 염기서열로 구성된 H chain DNA of a humanized antibody consists of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 58

DNA.DNA.

제 47항, 제 50항 및 제 53항 내지 66항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the DNA according to any one of claims 47, 50 and 53-66.

제 67항에 기재된 재조합 벡터에 의한 형질전환된 형질전환체.A transformed transformant with the recombinant vector of claim 67.

제 47항, 제 53항 및 제 54항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 발현벡터 및 제 50항, 제 55항 및 제 56항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 수득한 배양액으로부터 인간부갑상선 관련 펩티드에 대한 키메라 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 인간부갑상선 관련 펩티드에 대한 키메라 항체의 제조방법.57. An expression vector comprising the DNA according to any one of claims 47, 53 and 54 and an expression vector comprising the DNA according to any one of claims 50, 55 and 56 A method for producing a chimeric antibody against human parathyroid-related peptides, comprising culturing a transformant and extracting chimeric antibodies against human parathyroid-related peptides from the obtained culture.

제 57항 내지 58항 및 제 61항 내지 63항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 발현벡터, 및 제 59 항 내지 60항 및 제 64항 내지 65항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 수득한 배양액으로부터 인간부갑상선 관련 펩티드에 대한 인간형화된 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 인간부갑상선 관련 펩티드에 대한 인간형화된 항체의 제조방법.An expression vector comprising the DNA according to any one of claims 57 to 58 and 61 to 63, and an expression vector comprising the DNA according to any one of claims 59 to 60 and 64 to 65 A method for producing a humanized antibody against human parathyroid-related peptides, comprising culturing the transformant transformed with the same, and extracting a humanized antibody against human parathyroid-related peptides from the obtained culture.

삭제delete

제 26항에 기재된 항체를 유효성분으로 포함하는 고칼슘 혈증억제제.A high calcium antihypertensive agent comprising the antibody according to claim 26 as an active ingredient.

제 26항에 기재된 항체의 유효성분으로 포함하는 악성종양에 수반하는 고칼슘 혈증억제제.A hypercalcemia inhibitor with a malignant tumor contained as an active ingredient of the antibody according to claim 26.

제 77항에 있어서,78. The method of claim 77 wherein

악성종양이 췌장암, 폐암, 인두암, 후두암, 설암, 치육암, 식도암, 위암, 단관암, 유방암, 신장암, 방광암, 자궁암, 전립선암 및 악성임파종으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한가지인 고칼슘 혈증억제제.At least one hypercalcemia inhibitor selected from the group consisting of pancreatic cancer, lung cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, dental carcinoma, esophageal cancer, gastric cancer, short duct cancer, breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, prostate cancer and malignant lymphoma.

삭제delete

제 26항에 기재된 항체를 유효성분으로 포함하는 저인혈증 개선제.A hypoglycemic improving agent comprising the antibody according to claim 26 as an active ingredient.

제 82항에 있어서,83. The method of claim 82,

저인혈증은 저인혈성 구루병인 것을 특징으로 하는Hypophosphatemia is characterized in that hypophosphatemic rickets

저인혈증 개선제.Hypophosphatemic improvers.

제 82항에 있어서,83. The method of claim 82,

저인혈증은 저인혈성 비타민D 저항성 구루병인 저인혈증인 것을 특징으로 하는 Hypoglycemia is hypophosphatemia, a hypophosphatemic vitamin D resistant rickets.

개선제.Improver.

삭제delete