KR100567612B1 - 바이오틴 생합성 유전자를 함유하는 dna단편 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자를 함유하는 DNA 단편, 상기 DNA 단편을 포함하는 플라스미드, 및 상기 플라스미드를 함유하는 바이오틴-생성 형질전환체에 관한 것이다. 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자를 이용하기 위한 기술 및 유전공학에 의해 바이오틴-생성 미생물을 품종개량시키기 위한 기술이 제공된다.
Description
본 발명은 바이오틴 생합성에 관여하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편 및 그의 용도에 관한 것이다.
바이오틴은 인간, 동물, 식물 및 몇몇 미생물의 필수 비타민으로, 인간 또는 동물의 식품첨가제로 유용하다. 미생물을 이용한 바이오틴의 제조방법으로는, 스트렙토마이세스 또는 마이크로모노스포어를 이용하는 방법 (JP-B-41-21756), 스포로볼로마이세스를 이용하는 방법 (JP-B-42-3074), 바실러스, 크로모박테리움 또는 슈도모나스를 이용하는 방법 (JP-A-56-160998), 스핑고모나스를 이용하는 방법 (JP-A-6-133790) 등이 알려져 있다. 바이오틴 생합성에 관여하며 바이오틴을 생성할 수 있는 미생물로부터 분리된 유전자를 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 촉진시키기 위하여 유전공학기술에 의해 다른 미생물에 도입시킴으로써, 바이오틴 생합성 반응을 촉매할 수 있는 효소의 활성을 증진시켜 바이오틴 생산성을 개선시키는 미생물 품종개량방법 또한 제안되었다 (JP-A-61202686, JP-A-2-27980, JP-A-7-231789 등).
미생물 세포내에서 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자로는, 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 로부터 유래된 bio A, bio B, bio F, bio D, bio C 및 bio H 유전자가 알려져 있다 [Journal of Biological Chemistry, vol. 263, 19577-19585(1988)]. bio A 유전자는 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소를 코딩한다. bio B 유전자는 바이오틴 신타제 활성을 갖는 효소를 코딩한다. bio F 유전자는 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 활성을 갖는 효소를 코딩한다. bio D 유전자는 데스티오바이오틴 합성효소 활성을 갖는 효소를 코딩한다. bio C 유전자는 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에 참여한다. bio H 유전자의 작용은 분명하지 않다. 에스케리키아 콜리내 생합성 경로에서, 세포내 피멜릴 Co-A 는 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소에 의해 7-케토-8-아미노펠라르곤산으로 변환되고, 상기 7-케토-8-아미노펠라르곤산은 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제에 의해 디아미노펠라르곤산으로 변환되고, 상기 디아미노펠라르곤산은 데스티오바이오틴 합성효소에 의해 데스티오바이오틴으로 변환되고, 상기 데스티오바이오틴은 바이오틴 신타제에 의해 바이오틴으로 변환됨으로써, 바이오틴이 합성된다. bio C 유전자가 결실된 경우, 바이오틴 생성량이 감소된다. 따라서, bio C 유전자는 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩한다고 생각되어진다 ["Fermentation 및 Industry", 46, 102-111(1988)]. 에스케리키아 콜리로부터 유래된 bio A, bio B, bio F, bio D, bio C 및 bio H 유전자의 염기서열은 이미 특정화되어져 있다. bio A, bio B, bio F, bio D 및 bio C 유전자가 전사가 하나의 오퍼레이터에 의해 조절되는 오페론을 형성한다는 것은 공지되어 있다.
바이오틴 생합성에 관여하며 에스케리키아 속 이외의 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자로는, 세라티아 마르센스 (Serratia marcescens) 로부터 유래된 유전자 (GenBank data염기, 접근번호 D17468) 및 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 로부터 유래된 유전자 (JP-A-7-231789) 가 보고되어 있다. 상기 유전자들 각각의 염기서열이 특정화되어 있다. 비록 상기 유전자들의 염기서열이 에스케리키아 콜리 유전자의 염기서열과 다르다 할지라도, 전자의 유전자 생성물의 기능 및 바이오틴 생합성 경로는 실질적으로 후자 유전자 (에스케리키아 콜리) 의 경우와 동일하다는 것이 공지되어 있다. 한편, 바이오틴 생합성에 관여하며 바실러스 스파에리쿠스 (Bacillus sphaericus) 로부터 유래된 유전자가 보고되어 있다 (Ohsawa 등, Gene 80, 39-48(1989), Gloeckler 등, Gene 87, 6370(1990)). 바실러스 스파에리쿠스의 유전자는 다음과 같은 점등에서 에스케리키아 콜리의 유전자와 상이하다: 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에 관여하는 유전자, bio 유전자들의 순서 및 클러스터 형성 등 (Gloeckler 등, Gene 87, 63-70(1990)).
그러나, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자에 관하여, 그의 염기서열 및 유전자 생성물의 기능 또는 구조이 전혀 알려지지 않았다. 따라서, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자를 이용 및 유전공학에 의한 바이오틴-생성 미생물의 품종개량 기술이 존재하지 않았다.
이러한 환경하에서, 본 발명자들은 진지하게 연구하여, 그 결과 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 분리하고, 상기 DNA 단편을 벡터에 삽입시킨 후, 상기 벡터를 숙주 세포내로 도입시킴으로써 바이오틴 또는 바이오틴 전구체 제조에 사용되는 형질전환체를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
도 1 은 플라스미드 pJAβ2 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 2 는 플라스미드 pJAW 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 3 은 플라스미드 pJA41 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 4 는 플라스미드 pSP302 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 5 는 플라스미드 pSP304 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 6 은 플라스미드 pSS301 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 7 은 플라스미드 pSS305 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 8 은 플라스미드 pSS304 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
도 9 는 플라스미드 pSS306 의 구조 및 제한효소지도를 나타낸다.
<발명을 실시하기 위한 최량의 양태>
본 명세서에서, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자는 스핑고모나스 속에 속하는 미생물 세포내에서 바이오틴 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자이다. 상기 유전자는, 예를 들어, 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자 (이하 "본 발명 bio F 유전자" 라 칭함), 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자 (이하 "본 발명 bio A 유전자" 라 칭함), 데스티오바이오틴 합성효소 유전자 (이하 "본 발명 bio D 유전자" 라 칭함), 바이오틴 신타제 유전자 (이하 "본 발명 bio B 유전자" 라 칭함), 및 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자 (이하 "본 발명 bio C 유전자" 라 칭함) 를 포함한다.
본 발명 bio F 유전자는, 예를 들어, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소를 코딩하는 대략 1.1 - 1.2 kbp 의 영역을 함유하는 유전자를 포함한다. 그의 보다 구체적인 예로는 서열번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1 또는 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호: 3, 4 또는 5 에 나타낸 염기서열을 갖는 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자가 있다.
본 발명 bio A 유전자로는, 예를 들어, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 대략 1.2 - 1.3 kbp 의 영역을 함유하는 유전자가 있다. 그의 보다 구체적인 예로는 서열번호: 6 또는 7 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 6 또는 7 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호: 8 또는 9 에 나타낸 염기서열을 갖는 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자가 있다.
본 발명 bio D 유전자로는, 예를 들어, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 데스티오바이오틴 합성효소를 코딩하는 약 0.6 kbp 의 영역을 함유하는 유전자가 있다. 그의 보다 구체적인 예로는 서열번호: 10 또는 11 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10 또는 11 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 데스티오바이오틴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호: 12 또는 13 에 나타낸 염기서열을 갖는 데스티오바이오틴 합성효소 유전자가 있다.
본 발명 bio B 유전자로는, 예를 들어, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 바이오틴 신타제를 코딩하는 대략 1.0 - 1.1 kbp 의 영역을 함유하는 유전자가 있다. 그의 보다 구체적인 예로는 서열번호: 14, 15 또는 18 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 14, 15 또는 18 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자; 및 서열번호: 16, 17 또는 19 에 나타낸 염기서열을 갖는 바이오틴 신타제 유전자가 있다.
본 발명 bio C 유전자로는, 예를 들어, 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 대략 0.8 - 0.9 kbp 의 영역을 함유하는 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자가 있다. 그의 보다 구체적인 예로는 서열번호: 20 또는 21 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 20 또는 21 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자; 및 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하고 서열번호: 22 또는 23 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자가 있다.
본 발명 bio F, bio A, bio D, bio B 및 bio C 유전자중 어느 하나를 분리하기 위해 사용되는 미생물은, 그것이 스핑고모나스 속에 속하는 바이오틴-생성 박테리아인 한, 즉, 그것이 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 갖고 있는 한, 천연으로부터 분리된 균주 또는 상기 분리된 균주에 변이를 도입시켜 수득되는 균주중 어느 하나일 수 있다. 상기 미생물로는, 예를 들어, JP-A-133790 에 기재되어 있는 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 균주 및 스핑고모나스 종 SC42405 균주가 있다. 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 균주는 물리화학연구소 (Institute of Physical and Chemical Research) 의 생물학적 계통 저장 장치내에 배포가능한 상태로 보관되어 있다. 스핑고모나스 종 SC42405 균주는 부다페스트 조약에 근거하여 국제통상부 (Ministry of International Trade and Industry) 공업과학기술청 (Agency of Industrial Science and Technology) 산하 국립생명공학연구소 (National Institute of Bioscience and Human-Technology) (일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시-1-쵸메, 1-3) 에 FERM-BP3995 (접근번호) (기탁일: 1992년 9월 3일) 로 기탁되어 있으며 및 미국특허 5,432,067 에 개시되어 있다.
스핑고모나스 속에 속하는 바이오틴-생성 박테리아로부터 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제조하는 방법의 예를 하기에 나타낸다.
먼저, 예를 들어, 문헌 [Biochemica. Biophysica. Acta., vol. 72, 619-629 (1963)] 등에 기재되어 있는 통상의 게놈 DNA 추출방법에 의해 스핑고모나스 속에 속하는 미생물의 게놈 DNA 를 분리한다. 분리된 게놈 DNA 를 Sau 3AI 과 같은 적당한 제한효소를 이용하여 부분적으로 절단하고, 수득된 DNA 단편을 적당한 벡터에 삽입시켜 게놈 DNA 라이브러리를 제조한다. 이 경우 사용되는 벡터로는, 게놈 DNA 라이브러리가 도입된 균주내에서 증식 및 복제될 수 있는 한, 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 상기 벡터로는, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파아지 및 코스미드가 있다.
상기 수득된 게놈 DNA 라이브러리로부터 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 동정 및 분리하는 방법으로는, 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자가 결핍되어 있어 바이오틴 요구성을 갖는 유전자 결실 돌연변이주내에 게놈 DNA 라이브러리를 도입시키고, 수득된 형질전환체로부터 재획득 바이오틴 생산성을 소유하는 균주를 선별하는 방법을 들 수 있다. 상기 방법에 사용되는 바이오틴-요구성 돌연변이주로는, 스핑고모나스 속의 미생물에 도입된 게놈 DNA 단편이 균주세포내에서 발현될 수 있는 한 임의의 균주가 사용될 수 있다. 상기 돌연변이주는, 예를 들어, 문헌 [Proceeding of National Academy of Sciences U.S.A., vol. 69, 2219 (1972) 및 Journal of Bacteriology, vol. 115, 662 (1973)] 등에 기재되어 있는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 바이오틴-요구성 돌연변이주내에 게놈 DNA 라이브러리를 도입시키는 방법으로는, 세포를 염화칼슘으로 처리하는 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)), 전기천공 방법 (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons. Inc. ISBNO-471-50338-X(1987)) 등과 같은 통상의 방법을 들 수 있다.
수득된 바이오틴-요구성 돌연변이주 형질전환체를 바이오틴을 함유하지 않는 적당한 선별 배지내에서 배양하고, 생장된 형질전환체를 선별한다. 상기 선별된 형질전환체는 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자를 함유하는 DNA 단편을 삽입편 형태로 갖고 있는 벡터를 함유하는 균주의 후보이다.
예를 들어, 벡터가 플라스미드 또는 코스미드인 경우, 알칼리 분해 방법 또는 비등 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 과 같은 통상의 방법에 의해 재조합 벡터를 상기 언급된 형질전환체로부터 추출한다. 벡터가 박테리오파아지인 경우, 밀도-구배 원심분리 또는 이온 교환 크로마토그래피 (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons. Inc. ISBNO-471-50338X(1987)) 와 같은 통상의 방법에 의해 재조합 벡터를 상기 언급된 형질전환체로부터 추출한다. 추출된 재조합 벡터의 염기서열은 생거 디데옥시 사슬종료 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 을 이용하여 분석한다. 따라서, 벡터에 삽입된 DNA 단편의 염기서열을 결정할 수 있다.
결정된 염기서열내에서 빌견되는 500 bp 이상의 오픈 리딩 프레임으로부터, 단백질을 코딩하고 하기에 기재된 각각의 공지된 유전자와 높은 유사 염기서열을 갖는 영역을 선별할 경우, 스핑고모나스 속 박테리아의 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자로 특정될 수 있으며, 이때, DNA 단편이 bio F 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 것일 경우, 상기 유전자는 공지된 bio F 유전자이고; DNA 단편이 bio A 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 것일 경우, 상기 유전자는 공지된 bio A 유전자이고; DNA 단편이 bio D 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 것일 경우, 상기 유전자는 공지된 bio D 유전자이고; DNA 단편이 bio B 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 것일 경우, 상기 유전자는 공지된 bio B 유전자이고; DNA 단편이 bio C 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 것일 경우, 상기 유전자는 공지된 bio C 유전자이다. 하기 또한 가능하다. 각 암호화 영역을 적당한 제한효소로 잘라내고, 각 암호화 영역을 함유하는 서브클론을 제조한다. 각 서브클론을 하기와 같이 유전자 결실 돌연변이주에 도입한다: 서브클론이 bio F 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 DNA 단편인 경우, 이를 F 결실 돌연변이주에 도입시키고; 서브클론이 bio A 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 DNA 단편인 경우, 이를 bio A 결실 돌연변이주에 도입시키고; 서브클론이 bio D 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 DNA 단편인 경우, 이를 bio D 결실 돌연변이주에 도입시키고; 서브클론이 bio B 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 DNA 단편인 경우, 이를 bio B 결실 돌연변이주에 도입시키고; 서브클론이 bio C 결실 돌연변이주를 이용하여 수득된 DNA 단편인 경우, 이를 bio C 결실 돌연변이주에 도입시킨다. 바이오틴을 함유하지 않는 적당한 선별배지상에서 유전자가 도입된 돌연변이주의 생장을 연구함으로써, 생장가능하게된 돌연변이주가 보유하고 있는 서브클론내에 포함된 암호화 영역을 스핑고모나스 속 박테리아의 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자로 특정한다.
더우기, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 등] 에 기재되어 있는 통상의 돌연변이 도입 방법에 의해 상기 수득된 목적 유전자의 기능을 향상시킬 수 있다. 바이오틴 생합성에 참여하는 임의의 유전자내로 돌연변이를 도입할 수 있다. 바이오틴 생산성을 향상시키는데 있어서는, 바이오틴 생합성 경로에서 속도결정단계 (rate-determining step) 인 데스티오바이오틴의 바이오틴으로의 변환을 가능하게 하는 바이오틴 신타제를 코딩하는 bio B 유전자내에 돌연변이를 도입시키는 것이 특히 효과적이다. 도입되는 돌연변이는 효소 활성을 상승시키거나 또는 단백질의 안정성을 개선할 수 있는 단백질 코딩 영역에서의 돌연변이, 또는 유전자 발현을 촉진하는 유전자 발현 조절영역에서의 돌연변이일 수 있다. 돌연변이가 도입된 유전자는, 상기 기재된 바와 같이, 이를 바이오틴 요구성을 갖는 유전자 결실 돌연변이주내로 도입시킴으로써 발현되며, 그의 유전자 결실을 보상하는 능력을 야생형 유전자의 능력과 비교한다. 따라서, 바이오틴 생산성 개선에 기여할 수 있는 돌연변이주 유전자를 선별하는 것이 가능하다. 또한, 바이오틴 생산성 개선에 기여할 수 있는 돌연변이주 유전자는, 돌연변이가 도입된 상기 유전자를 미생물내에서 발현시키고, 도입된 유전자에 의해 코딩되는 효소의 생성량, 효소 활성, 상기 효소에 의해 촉매되는 반응에 의해 생성되는 화합물의 양 등을 야생형 유전자를 사용한 경우의 결과와 비교함으로써 선별될 수 있다. 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소, 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소, 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 및 데스티오바이오틴 합성효소의 활성을, 예를 들어, 문헌 [Y. Izumi 등, Methods in Enzymolozy, vol. 62, 326-338 (1979)] 등에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다. 바이오틴 신타제의 활성은, 예를 들어, 문헌 [I. Sanyal 등, Archives of Biochemistry and Biophysics., vol. 326, 48-56 (1996); A. Mejean 등, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 217, 1231-1237 (1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다.
상기-언급된 돌연변이가 도입된 유전자의 구체적인 예로는 서열번호: 19 에 나타낸 염기서열을 갖는 바이오틴 신타제 유전자가 있다. 상기 유전자에서, 개시코돈(ATG)의 A 를 첫 번째 염기로 할 경우, 서열번호: 16 에 나타낸 염기서열을 갖는 바이오틴 신타제 유전자와 비교하여 -57 번째 염기 및 706 번째 염기가 치환체이다. 돌연변이가 도입된 유전자로는, 서열번호: 5 에 나타낸 염기서열을 갖는 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자를 예로 들 수 있다. 상기 유전자에서, 개시코돈(ATG)의 A 를 첫 번째 염기로 할 경우, 서열번호: 4 로 나타낸 염기서열을 갖는 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자와 비교하여 -ll 번째 염기가 치환체이다.
본 명세서에서, 용어 "바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편" 은 스핑고모나스 속에 속하는 미생물 세포내 바이오틴 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 하나 이상 함유하는 DNA 단편을 의미한다. 상기 DNA 단편은 상기 기재된 방식으로 미생물로부터 분리된 DNA 단편, 또는 다양한 미생물 균주중 어느 하나로부터 유래된 바이오틴 생합성에 참여하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자에 돌연변이를 도입시켜 수득되는 유전자를 결찰시켜 제조된 DNA 단편중 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 염기서열 일부를 갖는 DNA 단편을 제공한다. 상기 DNA 단편은, 예를 들어, 혼성화 방법에 사용되는 프로브 또는 PCR 방법에 사용되는 프라이머로 유용하다. 상기 DNA 단편이 PCR 방법에서 사용되는 프라이머로 사용되는 경우, 그의 염기수가 아닐링의 특이성을 보증하기 위하여 일반적으로 근 것이 바람직하다. 한편, 염기수가 증가할수록, 프라이머 자체는 PCR 반응동안 고차원의 구조를 갖기가 쉬우므로, 어떤 경우 아닐링의 효율이 저하된다. 따라서, 합성후 정제를 위하여 까다로운 조작이 요구된다. 이러한 단점을 고려하여, 염기수는 너무 크지 않은 것이 바람직하다. 대개, 50 이하 15 이상의 염기를 갖는 단일나선 DNA 로 구성된 유전자 단편이 바람직하다. 이러한 DNA 단편의 구체적인 예로는 염기서열 of 표 1 에 나타낸 프라이머 BF, BR, BF1, BR1, Cl 및 C6 의 염기서열중 어느 하나를 갖는 DNA 단편, 및 표 2 에 나타낸 프라이머 BF4, BR4, F2, F3, CDA1, CDA6, CDA3 및 CDA7 의 염기서열중 어느 하나를 갖는 DNA 단편이 있다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| BF | 5'-ATTCTAGAACAGGACTATCAGGCACTCT-3' |
| BR | 5'-TTTCTAGATTCCCCGCGATTGGCGATCA-3' |
| BF1 | 5'-AGCGGCCGAGGATGTGCTTAGGCTGCT-3' |
| BR1 | 5'-CCGTGCCCTTGACCGACACCAGCGCGT-3' |
| C1 | 5'-GCAAGCTTTGTCGCTGCCGCTCGTCATGCTGT-3' |
| C6 | 5'-CGCTCGAGATTCGCGCTTCCTGTTCCTGAC-3' |
| 프라이머 | 염기서열 |
| BF4 | 5'-CGTGATGCTGCGCCTGCTCGGCCACAACAT-3' |
| BR4 | 5'-GCTCTAGACCTCATCGTCCCCCTGAACTTGTT-3' |
| F2 | 5'-GGACTAGTACCGGAATGACAGGCGGACA-3' |
| F3 | 5'-GCCTGCAGCAGAACGTGTGGTCGAAGCC-3' |
| CDA1 | 5'-ATCTGCAGTTGCGCGATGAGGAGGCCACCTTGC-3' |
| CDA6 | 5'-GCAAGCTTATGACGCCGCCTGCGCCTTCGACCA-3' |
| CDA3 | 5'-CTAAGCTTCGAGATCGACGGGGTGGAAATCGAT-3' |
| CDA7 | 5'-CGCTCGAGGGGAGAAGTCCTGGGGGATGATCCC-3' |
바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자는 단백질을 코딩하는 영역 및 그의 상부 또는 하부에 유전자 발현 조절영역을 포함한다.
예를 들어, 숙주 세포내에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터의 구축시 상기 영역을 숙주 세포내에서 기능할 수 있는 프로모터에 연결시키는 단계에서 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 단백질을 코딩하는 영역으로 구성된 DNA 단편이 사용될 수 있다.
유전자 발현 조절영역은 단백질을 코딩하는 영역의 상부 또는 하부에 위치하고 단백질을 위한 유전자 발현의 조절에 중요한 영향을 미치는 10 내지 수백의 염기쌍으로 이루어진 영역이다. 특히, 단백질을 코딩하는 영역의 상부에 위치한 프로모터는 중요한 유전자 발현 조절영역이다. 유전자 발현 조절영역의 구체적인 예로는, 서열번호: 16 에서 개시코돈 (ATG) 의 A 를 +l 번째 염기로 할 경우, -222 번째 염기에서부터 -1 번째 염기까지의 염기서열을 갖는 영역, 및 서열번호: 4 에서 개시코돈 (ATG) 의 A 를 +l 번째 염기로 할 경우, -201 번째 염기에서부터 -1 번째 염기까지의 염기서열을 갖는 영역이 있다.
유전자 발현 조절영역은, 예를 들어, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 단백질을 코딩하는 영역의 전후의 염기서열에 점돌연변이, 결실 또는 부가와 같은 돌연변이를 도입시키고, 상기 유전자를 미생물내에서 발현시키고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소의 생성량, 효소 활성, 상기 효소에 의해 촉매되는 반응에 의해 생성된 화합물의 양 등을 측정하고, 돌연변이의 도입이 측정치를 현저하게 변화시키는 영역을 찾아냄으로써 특정화된다. 또한, 상기 언급된 유전자의 단백질 코딩 영역 대신에 상기 양 또는 효소 활성의 용이한 측정을 가능하게 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험을 수행하는 것이 가능하다. 유전자 발현 조절영역은 상기 방법에 의해 이를 특정함으로써 수득될 수 있다.
수득된 유전자 발현 조절영역은 치환, 결실 또는 부가와 같은 돌연변이를 도입시킴으로써, 예를 들어, 상기 기재된 PCR 방법에 의해 보다 높은 수준의 유전자 발현을 가능하게 하는 유전자 발현 조절영역으로 개질되어질 수 있다. 또한, 돌연변이 등에 기인하여 증대된 양 또는 증대된 효소 활성을 갖는 목적 단백질을 생성할 수 있는 돌연변이주로부터 유전자를 분리함으로써 보다 높은 수준의 유전자 발현을 가능하게 하는 유전자 발현 조절영역을 수득하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 발현 조절영역으로는, 각각 서열번호: 24 및 25 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자 발현 조절영역을 들 수 있다.
바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 상기 언급된 유전자 발현 조절영역으로 구성되어 있는 DNA 단편은, 예를 들어, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물에서 유전자 발현을 위한 벡터의 구축용으로 사용될 수 있다.
바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자 또는 상기 유전자 염기서열 일부를 포함하는 상기 수득된 DNA 단편을 숙주 세포내 복제가능한 벡터에 삽입시킴으로써, 상기 유전자 또는 그의 일부를 숙주 세포내로 도입시키기 위한 벡터를 구축할 수 있다. 더우기, 유전자 발현 조절영역을 상기 유전자의 단백질을 코딩하는 영역 상부에 연결시킨 후, 벡터에 삽입시킴으로써, 숙주 세포내에서 상기 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 구축할 수 있다.
이 경우 사용되는 DNA 단편으로는, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래되고 상기 기재된 방식으로 수득되는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 적당한 제한효소를 이용하여 미리 적당한 크기로 절단함으로써 상기 DNA 단편과 벡터의 결찰을 촉진시켜 수득되는 DNA 단편; 및 적당한 제한효소부위가 존재하지 않을 경우 PCR 에 의해 바이오틴 생합성에 관여하는 각 유전자 말단에 임의의 제한효소부위를 도입시켜 수득되는 DNA 단편이 있다.
벡터에 삽입되는 유전자로는, 상기 언급된 본 발명 bio F, bio A, bio D, bio B 및 bio C 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 사용하는 것으로 충분하다. 예를 들어, 상기 유전자 모두 또는 일부를 벡터에 삽입시킬 수 있다. 또한, 다수의 특정 유전자를 특정 효소 활성을 증가시키기 위하여 삽입시킬 수 있다. 필요한 경우, 이후 설명되는 형질전환체의 선별용으로 유용한 약물-내성 유전자와 같은 선별마커 유전자, 및 숙주 세포 게놈과 상동적 재조합에 사용될 수 있는 게놈 DNA 들을 상기 언급된 유전자(들)과 함께 하나의 동일한 베터에 삽입시킬 수 있다.
단백질을 코딩하는 영역 상부에 연결되는 유전자 발현 조절영역으로는, 그것이 숙주 세포내에서 유전자 발현을 조절하는 기능을 갖는 한 임의의 염기서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 스핑고모나스 속에 속하는 미생물인 경우, 상기 기재된 바와 같은, 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 유전자 발현 조절영역을 들 수 있다. 숙주 세포가 에스케리키아 콜리 세포인 경우, 에스케리키아 콜리내에서 유전자 발현 조절 활성을 갖는 상업적으로 수득가능한 프로모터를 사용할 수 있다.
DNA 단편이 삽입되는 벡터로는, 숙주 세포, 예를 들어, 미생물 세포내에서 복제가능한 한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 스핑고모나스 속에 속하는 미생물 세포인 경우, 불화합군 플라스미드중 P 군에 분류되어 있는 RK2, 및 RK2 로부터 유래된 플라스미드 벡터 (Plasmids, vol. 13, 149-153 (1985), Journal of Bacteriology, vol. 167, 604-610 (1986)), 불화합군 플라스미드중 Q 군에 분류되어 있는 RSF1010, 및 RSF1010 로부터 유래된 플라스미드 벡터 (Gene, vol. 16, 237-247 (1981)) 등이 사용될 수 있다. 숙주 세포가 에스케리키아 콜리 세포인 경우, 상업적으로 수득가능한 플라스미드, 파아지 등이 사용될 수 있으며, 이들은 에스케리키아 콜리내에서 복제가능하다.
이렇게 구축된 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포, 예를 들어, 숙주 미생물 세포내에 도입시킴으로써 형질전환체가 제조될 수 있다.
바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 도입된 숙주 세포는, 도입된 DNA 단편이 안정적으로 숙주세포에 의해 유지되고, 유전자가 이들내에서 발현되는 한 특별히 제한되지 않는다. 숙주 세포로는, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물, 에스케리키아 콜리 등의 세포를 들 수 있다.
벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 방법으로는, 통상의 유전공학 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 숙주 미생물내로 도입시키는 방법으로는, 세포를 염화칼슘으로 처리하는 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)), 전기천공 방법 (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons. Inc. ISBNO-471-50338-X(1987)) 등과 같은 통상의 방법을 들 수 있다. 또한, 상동적 재조합을 이용하여 목적 DNA 단편을 숙주 세포의 게놈내로 도입시키는 유전자 도입 방법을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 유래된 게놈 DNA 단편을 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 DNA 단편의 각 말단에 연결시키고, 연결된 단편을 벡터에 삽입시킨 후, 상기 벡터를 숙주 세포내로 도입시킨다. 벡터상의 게놈 DNA 와 숙주 세포의 게놈 DNA 사이에서 상동적 재조합이 일어나는 경우, 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 숙주 세포의 게놈내로 도입시켜 형질전환체를 만든다.
상기 기재된 방식으로 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 도입시켜 수득되는 혈질전환 미생물은, 벡터내에 포함되어 있고 유전자와 함께 숙주 세포내로 도입된 선별마커 유전자의 표현형에 근거하여, 효과적으로 선별될 수 있다. 예를 들어, 선별마커 유전자가 앰피실린-내성 유전자, 상기 세포를, 유전자 도입후, 앰피실린을 함유하는 적당한 영양배지상에 스트리킹시키고, 나타난 콜로니를 후킹 업 (hooking up) 방법으로 분리함으로써, 형질전환체를 수득할 수 있다. 따라서, 도입되는 DNA 단편으로 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 갖는 형질전환체를 수득할 수 있다. 상기 형질전환체를 바이오틴과 바이오틴 생합성용 전구체인 7-케토-8-아미노펠라르곤산, 7,8-디아미노펠라르곤산 및 데스티오바이오틴의 제조용으로 사용할 수 있다.
본 발명은 실시예를 참조하여 하기에 보다 상세히 설명되어지나, 실시예에 의해서 한정되지 않는다.
실시예 1. 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자의 분리
(1-A) 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 게놈 DNA 의 제조
스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 한 루프를 가득 200 ml 의 LB 배양배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl) 에 접종하고, 30℃ 에서 15 시간동안 진탕배양을 실시하고, 대수생장기 (logarithmic growth phase) 에서 원심분리 (8,000 rpm, 10 분) 에 의해 박테리아 세포를 수집하였다. 수집한 세포를 20 ml 의 A 완충액 (25% 수크로스, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 에 현탁하고, 2.5 ml 의 리소자임 클로리드 용액 (50 mg/ml) 을 첨가한 후, 37℃ 에서 30 분동안 항온배양하였다. 그후, 여기에 2.5 ml 의 SDS 용액 (10% (v/v)) 및 0.25 ml 의 EDTA 용액 (0.5 M) 을 첨가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 상기 혼합물을 항오배양시키기 위하여 동일량의 TE 포화된 페놀을 첨가하고, 생성된 혼합물을 서서히 교반시킨 후 원심분리 (10,000 rpm, 10 분) 시킨 후, 상부층을 회수하여 단백질제거를 수행하였다. 상기 단백질제거 공정을 5 회 이상 반복하였다. 회수된 상부층 부피 2 배의 에탄올을 회수된 상부층에 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 둥근 유리막대로 감아올려 DNA 를 회수하고, 70% 에탄올로 세척하고, 공기로 건조시킨 후, 20 ml 의 TE 완충액에 용해시키고, 20 ㎕ 의 RNase (10 mg/ml)를 첨가한 후, 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 따라서, 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 의 게놈 DNA 약 21 mg 을 함유하는 DNA 용액 을 수득하였다.
(1-B) 게놈 DNA 라이브러리의 제조
(1-A) 에서 수득된 43 ㎍ 의 게놈 DNA 를 부분적으로 절단하기 위하여 15 U 의 제한효소 Sau 3 AI 로 37'C 에서 2 분동안 처리하였다. 부분적인 절단에 의해 수득된 게놈 DNA 단편을 제한효소 Bam HI 으로 절단하고 탈인산화시킨 플라스미드 벡터 pUC19 (다까라 슈조사 제조) 와 혼합하였다. 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여, 부분적인 절단에 의해 수득된 게놈 DNA 단편을 첨부된 사용안내서에 따라 플라스미드 벡터 pUC19 와 결찰시켜 다양한 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다.
(1-C) 바이오틴 생합성에 관여하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 플라스미드의 선별
(1-B) 에서 수득된 재조합 플라스미드를 유전자 펄서 (pulser) (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 bio F 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R874), bio A 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R879), bio B 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R875) 및 bio C 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R876) 균주에 각각 도입시켰다 (Journal of Bacteriology, vol. 94, 2065-2066 (1972), Journal of Bacteriology, vol. 112, 830-839 (1972)). 이렇게 처리된 균주를 바이오틴이 없는 선별 아가 플레이트 (1.48% Na2HPO4-7H2O, 0.3% KH2PO4, 0.05 NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.005% 앰피실린, 1.5% 아가) 상에 스트리킹하고, 상기 아가 플레이트를 37℃ 에서 2 일동안 항온배양하였다. 배지상에서 생장하여 콜로니를 형성하는 균주를 취한 후 LB 배지상에서 37℃, 16 시간동안 항온배양하였다. 상기 균주로부터 알칼리 분해 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 에 의하여 플라스미드를 추출하고, 제한효소로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 조사하여 각각의 결실 돌연변이주내에 도입시킨 재조합 플라스미드가 표 3 에 나타낸 크기의 삽입 단편을 함유하는 것을 확인하였다.
| 결합이 있는 균주 | 수득된 플라스미드 | 삽입된 단편의 크기 (kbp) |
| R874 | pBC01 | 1.8 |
| R879 | pBC02 | 2.8 |
| R875 | pBC03 | 1.4 |
| R876 | pBC04 | 1.4 |
| pBC05 | 3.7 |
(1-D) 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 함유하는 DNA 단편의 염기서열 분석
(1-C) 에서 수득된 재조합 플라스미드 pBC01, pBC02, pBC03, pBC04 및 pBC05 에 대하여, 하기 기재된 방식으로 킬로 서열용 결실 키트 (다까라 슈조사 제조) 을 이용하여 다양한 크기의 삽입 단편을 함유하는 결실 클론을 제조하였다.
재조합 플라스미드 pBC01, pBC02, pBC03, pBC04 및 pBC05 각 20 ㎍ 을 하기 효소로 절단하였다; pBC01: Sma I 및 Kpn I, pBC02: Pst I 및 Xba I, pBC03, pBC04 및 pBC05: Xba I 및 Sse 8387 I. 페놀로 추출하여 상기 효소를 제거한 후, DNA 를 에탄올로 침전시켰다. 수득된 DNA 를 100 ㎕ 의 Exo III 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-메르캅토에탄올) 에 용해시킨 후, 여기에 180 유니트의 엑소뉴클레아제 III 를 첨가하고, 생성된 혼합물을 교반시키고, 이후 37℃ 에서 항온배양하였다. 1 분 간격으로, 생성된 용액 10 ㎕ 를 샘플링한 후, 100 ㎕ 의 빙냉 MB 뉴클레아제 완충액 (40 mM Na-아세테이트 (pH 4.5), 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl2, 10% 글리세롤) 과 혼합하고, 65℃ 에서 5 분동안 처리하여 엑소뉴클레아제 III 를 불활성화시켰다. 상기 수득된 용액을 37℃ 로 냉각시킨 후, 50 유니트의 MB 뉴클레아제를 첨가하고, 이후 60 분동안 항온배양하였다. 페놀로 추출하여 상기 효소를 제거한 후, DNA 를 에탄올로 침전시켰다. 수득된 DNA 를 50 ㎕ 의 클레나우 완충액 (7 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2, dNTP 각 0.1 mM) 에 용해시키고, 2 유니트의 클레나우 단편을 첨가한 후, 37℃ 에서 15 분동안 항온배양하였다. 100 ㎕ 의 결찰 용액 A 에 10㎕ 의 생성된 용액 및 이후 12 ㎕ 의 결찰 용액 B 를 첨가한 후, 16℃ 에서 I 시간동안 항온배양하였다. 그후, 에탄올로 침전시켜 DNA 를 농축시키고, 5 ㎕ 의 멸균수에 용해시키고, 생성된 용액을 에스케리키아 콜리 JMIO9 에 도입시켰다. 이렇게 처리된 에스케리키아 콜리 JM109 를 앰피실린 (0.005%)-함유 LB 배양배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl, 1.5% 아가) 의 아가 플레이트상에 스트리킹하고, 아가 플레이트를 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 생성된 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 삽입 DNA 단편의 크기를 조사하였다. 삽입 단편을 함유하는 8 개의 클론 (250 bp 내지 1.8 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBCO1 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 12 개의 클론 (250 bp 내지 2.8 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBCO2 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 6 개의 클론 (250 bp 내지 1.4 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBCO3 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 6 개의 클론 (250 bp 내지 1.4 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBCO4 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 15 개의 클론 (250 bp 내지 3.7 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBCO5 의 결실 클론으로 선별하였다.
각 결실 클론의 DNA 를 알칼리 분해 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 으로 추출하였다. 추출물 300 ng 을 주형으로 사용하고 및 M13 프라이머 M4 (다까라 슈조사 제조) 또는 M13 프라이머 RV (다까라 슈조사 제조) 를 프라이머로 사용하여, ABI 프리즘 다이 터미네이터 싸이클 시퀀싱 레디 반응 키트 (퍼킨-엘머사 제조)를 이용함으로써 서열 반응을 수행하고, 자동 염기서열 분석기 373A (퍼킨-엘머사 제조) 를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
재조합 플라스미드 삽입 단편의 염기서열중 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 특정하기 위하여, 공지된 각각의 bio F 유전자, bio A 유전자, bio D 유전자, bio B 유전자 및 bio C 유전자와 염기서열의 동일성이 매우 높은 단백질을 코딩하는 영역을, 상기 단편내에 존재하고 각각 상기 유전자에 해당하는 스핑고모나스 속 박테리아의 유전자로 특정된 500 bp 이상의 오픈 리딩 프레임으로부터 선별하였다. pBC01 은 bio F (서열번호: 3)를 포함한다. pBC02 는 bio D (서열번호: 12) 및 bio A (서열번호: 8) 를 포함한다. pBC03 은 bio D (서열번호: 16) 를 포함한다. pBC04 및 pBC05 각각은 bio D (서열번호: 22) 를 포함한다. 독립적으로 수득된 pBC01 및 pBC02 의 삽입 단편 염기서열을 비교하여 pBC01 및 pBC02 삽입단편의 조합이 게놈상의 연속적인 DNA 인 것을 밝혔다. 따라서, bio F, bio D 및 bio A 가 오페론을 형성한다는 것이 확인되었다.
실시예 2. 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자의 분리
(2-A) 스핑고모나스 종 SC42405 게놈 DNA 의 제조
스핑고모나스 종 SC42405 한 루프를 가득 200 ml 의 LB 배양배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl) 에 접종하고, 30℃ 에서 15 시간동안 진탕배양하고, 대수기 박테리아 세포를 원심분리 (8,000 rpm, 10 분) 에 의해 수집하였다. 수집된 세포를 20 ml 의 A 완충액 (25% 수크로스, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 에 현탁시키고, 2.5 ml 의 리소자임 클로리드 용액 (50 mg/ml) 을 첨가한 후, 37℃ 에서 30 분동안 항온배양하였다. 그후, 여기에 2.5 ml 의 SDS 용액 (10% (v/v)) 및 0.25 ml 의 EDTA 용액 (0.5 M) 을 첨가하고, 생성된 혼합물은 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 항온배양된 혼합물에 동일량의 TE 포화 페놀을 첨가하고, 생성된 혼합물을 서서히 교반시킨 후, 원심분리 (10,000 rpm, 10 분) 시키고, 이후 상부층을 회수하여 단백질제거를 수행하였다. 상기 단백질제거 공정을 5회 이상 반복하였다. 회수된 상부층의 2 배 에탄올을 회수된 상부층에 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 동근 유리막대로 감아올려 DNA 를 회수하고, 70% 에탄올로 세정하고, 공기로 건조시킨 후, 20 ml 의 TE 완충액에 용해시키고, 20 ㎕ 의 RNase (10 mg/ml) 를 첨가한 후, 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 이렇게 하여, 약 21 mg 의 스핑고모나스 종 SC42405 게놈 DNA 를 함유하는 DNA 용액을 수득하였다.
(2-B) 게놈 DNA 라이브러리의 제조
(2-A) 에서 수득된 50 ㎍ 의 게놈 DNA 를 15 U 의 제한효소 Sau 3 AI 으로 37℃ 에서 2.5 분동안 처리하여 부분적으로 절단하였다. 부분적인 절단에 의해 수득된 게놈 DNA 단편을, 제한효소 Bam HI 으로 절단한 후 탈인산화시킨 플라스미드 벡터 pUC19 (다까라 슈조사 제조) 와 혼합하였다. 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여, 부분적인 절단에 의해 수득된 게놈 DNA 단편을, 첨부된 사용안내서에 따라 플라스미드 벡터 pUC19 와 결찰시켜 다양한 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다.
(2-C) 바이오틴 생합성에 관여하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드의 선별
(2-B) 에서 수득된 재조합 플라스미드를 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 bio F 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R874), bio A 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R879), bio B 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R875) 및 bio C 결실 돌연변이주 에스케리키아 콜리 (R876) 균주에 각각 도입시켰다 (Journal of Bacteriology, vol. 94, 2065-2066 (1972), Journal of Bacteriology, vol. 112, 830-839 (1972)). 이렇게 처리된 균주를 바이오틴이 없는 선별 아가 플레이트 (1.71% Na2HPO4-12H2O, 0.3% KH2PO4, 0.05 NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.005% 앰피실린, 0.2 mM IPTG, 1.5% 아가) 상에 스트리킹하고, 상기 아가 플레이트를 37℃ 에서 2 일동안 항온배양하였다. 배지상에서 생장하여 콜로니를 형성하는 균주를 취한 후 LB 배지상에서 37℃, 16 시간동안 항온배양하였다. 상기 균주로부터 알칼리 분해 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 에 의하여 플라스미드를 추출하고, 제한효소로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 조사하여 각각의 결실 돌연변이주내에 도입시킨 재조합 플라스미드가 표 4 에 나타낸 크기의 삽입 단편을 함유하는 것을 확인하였다.
| 결합이 있는 균주 | 수득된 플라스미드 | 삽입된 단편의 크기 | |
| R874 | pBC11 | 2.3 | |
| R879 | pBC12 | 2.2 | |
| pBC13 | 2.6 | ||
| R875 | pBC14 | 1.9 | |
| R876 | pBC15 | 2.0 |
(2-D) 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 함유하는 DNA 단편 염기서열의 분석
(1-C) 에서 수득된 재조합 플라스미드 pBC11, pBC12, pBC13, pBC14 및 pBC15 에 대하여, 하기 기재된 방식으로 킬로 서열용 결실 키트 (다까라 슈조사 제조) 을 이용하여 다양한 크기의 삽입 단편을 함유하는 결실 클론을 제조하였다.
재조합 플라스미드 pBC11, pBC12, pBC13, pBC14 및 pBC15 각 20 ㎍ 을 하기 효소로 절단하였다; pBC11: Xba I 및 SSse 8387 I, pBC12 및 pBC13: Pst I 및 Xba I, pBC14 및 pBC15: Xba I 및 Kpn I. 페놀로 추출하여 상기 효소를 제거한 후, DNA 를 에탄올로 침전시켰다. 수득된 DNA 를 100 ㎕ 의 Exo III 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-메르캅토에탄올) 에 용해시킨 후, 여기에 180 유니트의 엑소뉴클레아제 III 를 첨가하고, 생성된 혼합물을 교반시키고, 이후 37℃ 에서 항온배양하였다. 1 분 간격으로, 생성된 용액 10 ㎕ 를 샘플링한 후, 100 ㎕ 의 빙냉 MB 뉴클레아제 완충액 (40 mM Na-아세테이트 (pH 4.5), 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl2, 10% 글리세롤) 과 혼합하고, 65℃ 에서 5 분동안 처리하여 엑소뉴클레아제 III 를 불활성화시켰다. 상기 수득된 용액을 37℃ 로 냉각시킨 후, 50 유니트의 MB 뉴클레아제를 첨가하고, 이후 60 분동안 항온배양하였다. 페놀로 추출하여 상기 효소를 제거한 후, DNA 를 에탄올로 침전시켰다. 수득된 DNA 를 50 ㎕ 의 클레나우 완충액 (7 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2, dNTP 각 0.1 mM) 에 용해시키고, 2 유니트의 클레나우 단편을 첨가한 후, 37℃ 에서 15 분동안 항온배양하였다. 100 ㎕ 의 결찰 용액 A 에 10㎕ 의 생성된 용액 및 이후 12 ㎕ 의 결찰 용액 B 를 첨가한 후, 16℃ 에서 I 시간동안 항온배양하였다. 그후, 에탄올로 침전시켜 DNA 를 농축시키고, 5 ㎕ 의 멸균수에 용해시키고, 생성된 용액을 에스케리키아 콜리 JMIO9 에 도입시켰다. 이렇게 처리된 에스케리키아 콜리 JM109 를 앰피실린 (0.005%)-함유 LB 배양배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl, 1.5% 아가) 의 아가 플레이트상에 스트리킹하고, 아가 플레이트를 37℃ 에서 16 시간동안 항온배양하였다. 생성된 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 삽입 DNA 단편의 크기를 조사하였다. 삽입 단편을 함유하는 9 개의 클론 (250 bp 내지 12.3 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBC11 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 8 개의 클론 (250 bp 내지 2.2 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBC12 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 10 개의 클론 (250 bp 내지 2.6 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBC13 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 8 개의 클론 (250 bp 내지 1.9 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBC14 의 결실 클론으로 선별하였다. 삽입 단편을 함유하는 8 개의 클론 (250 bp 내지 2.0 kbp 로 약 250 bp 씩 크기가 차이남) 을 pBC15 의 결실 클론으로 선별하였다.
각 결실 클론의 DNA 를 알칼리 분해 방법 (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 으로 추출하였다. 추출물 300 ng 을 주형으로 사용하고 및 M13 프라이머 M4 (다까라 슈조사 제조) 또는 M13 프라이머 RV (다까라 슈조사 제조) 를 프라이머로 사용하여, ABI 프리즘 다이 터미네이터 싸이클 시퀀싱 레디 반응 키트 (퍼킨-엘머사 제조)를 이용함으로써 서열 반응을 수행하고, 자동 염기서열 분석기 373A (퍼킨-엘머사 제조) 를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
재조합 플라스미드 삽입 단편의 염기서열중 바이오틴 생합성에 관여하는 유전자를 특정하기 위하여, 공지된 각각의 bio F 유전자, bio A 유전자, bio D 유전자, bio B 유전자 및 bio C 유전자와 염기서열의 동일성이 매우 높은 단백질을 코딩하는 영역을, 상기 단편내에 존재하고 각각 상기 유전자에 해당하는 스핑고모나스 속 박테리아의 유전자로 특정된 500 bp 이상의 오픈 리딩 프레임으로부터 선별하였다. pBC11 은 bio F (서열번호: 4) 를 포함한다. pBC12 및 pBC13 각각은 bio D (서열번호: 11) 을 포함한다. pBC14 는 bio B (서열번호: 17) 를 포함한다. pBC15 는 bio C (서열번호: 23) 를 포함한다. 독립적으로 수득된 pBC12, pBC13 및 pBC15 의 삽입 단편 염기서열을 비교한 결과, pBC12, pBC13 및 pBC15 삽입단편의 조합은 게놈상의 연속적인 DNA 이고; bio C 의 종료코돈 TGA 및 bio D 의 개시코돈 ATG 는 염기서열 TG 에서 서로 겹치고; bio D 의 종료코돈 TGA 및 bio A 의 개시코돈 ATG 는 염기서열 TG 에서 서로 겹치고; bio C, bio D 및 bio A 는 오페론을 형성한다는 것이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 플라스미드 pJAW 의 제조
(E) 플라스미드 벡터 pJA β2 의 제조
플라스미드 벡터 RK2 로부터 유래된 플라스미드 벡터 pJAJ7 (Journal of Bacteriology, vol. 162, 604-614 (1986)) 1 ㎍ 을 제한효소 Pst I 및 Bam HI 으로 절단하고, 생성된 단편의 양 말단을 DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조사 제조)를 사용하여 첨부된 사용안내서에 따라 블런트화시켰다. 이렇게 처리된 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 약 10 kbp 의 DNA 단편을 단리하였다. 별개로, 2 ㎍ 의 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) (스트라타진 클로닝 시스템사 제조) 를 제한효소 Hae III 로 절단하고, 생성된 단편의 양 말단을 DNA 블런팅 키트 (다까라 슈조사 제조)를 사용하여 첨부된 사용안내서에 따라 블런트화시켰다. 이렇게 처리된 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 약 0.7 kbp 의 DNA 단편을 단리하였다. 상기 수득된 전체 약 10 kbp 의 DNA 단편 및 전체 약 0.7 kbp 의 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 사용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 pJA β2 라 명명하였다 (도 1).
(F) 플라스미드 pJAW 의 제조
실시예 1, (1-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 5 에 나타낸 프라이머 BF 및 BR 을 사용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KC1, 0,002(v/v)% Tween 20, 1.5 mM MgCl2, 각각 40 μM 씩의 DNTP, 20 pmol 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 3U UlTmaTmDNA 폴리머라제 (퍼킨-엘머사 제조)/100 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 1 분간, 55℃ 에서 1 분간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간의 30 반응 싸이클, 및 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio B 암호화 영역 상부 145 bp 에서부터 암호화 영역 하부 154 bp 까지 총 1325 bp 를 함유하고 상기 1325 bp 서열의 각 말단에 Xba I 부위가 도입된 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Xba I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편 및 플라스미드 벡터 pJA β2 를 제한효소 Xba I 으로 절단하고 절단된 플라스미드 벡터를 탈인산화시켜 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pJAW 라 명명하였다 (도 2).
| 프라이머 | 염기서열 |
| BF | 5'-ATTCTAGAACAGGACTATCAGGCACTCT-3' |
| BR | 5'-TTTCTAGATTCCCCGCGATTGGCGATCA-3' |
| BF1 | 5'-AGCGGCCGAGGATGTGCTTAGGCTGCT-3' |
| BR1 | 5'-CCGTGCCCTTGACCGACACCAGCGCGT-3' |
| C1 | 5'-GCAAGCTTTGTCGCTGCCGCTCGTCATGCTGT-3' |
| C6 | 5'-CGCTCGAGATTCGCGCTTCCTGTTCCTGAC-3' |
실시예 4. pJAW 가 도입된 형질전환체의 제조
실시예 3 에서 수득된 플라스미드 pJAW 를 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 형질전환체인 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJAW 를 수득하였다.
실시예 5. 재조합 플라스미드 pJA41 의 제조
실시예 3 에서 수득된 플라스미드 pJAW 를 제한효소 Eco 52I 및 Bsp 1286I 로 부분적으로 절단시켜 수득된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜, bio B 개시코돈 ATG 의 A 를 +l 번째 염기로 하는 경우, -72 번째 염기에서부터 718 번째 염기까지의 염기서열을 갖는 pJAW 로부터 결실에 의해 형성된 약 11.8 kbp 의 DNA 단편을 회수하였다. 한편, 실시예 1, (I-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 5 에 나타낸 프라이머 BF1 및 BR1 을 사용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KC1, 0,002(v/v)% Tween 20, 1.5 mM MgCl2, 각각 40 μM 씩의 DNTP, 20 pmol 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 3U UlTmaTmDNA 폴리머라제 (퍼킨-엘머사 제조)/100 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 0.5 분간, 60℃ 에서 1 분간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간의 30 반응 싸이클, 및 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio B 개시코돈 ATG 의 A 를 +l 번째 염기로 하는 경우, -75 번째 염기에서부터 721 번째 염기까지의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 제조하였다. 이후, 상기 DNA 단편을 제한효소 Eco 52I 및 Bsp 1286I 로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 약 0.8 kbp 의 DNA 단편을 회수하였다. 회수된 DNA 단편의 염기서열을 분석하여 서열번호: 19 에 나타낸 염기번호 1 에서 1336 까지의 염기서열을 확인하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pJA41 이라 명명하였다 (도 3).
실시예 6. pJA41 을 도입시킨 형질전환체의 제조
실시예 5 에서 수득된 플라스미드 pJA41 을 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJA41 을 수득하였다.
실시예 7. 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJAW 및 JCM7511/pJA41 의 바이오틴 생산성
스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJAW 및 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJA41 각각 한 루프씩을 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO41 0.15% MgSO4·7H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 유전자를 도입시키지 않은 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4 0.15% MgSO4·7H2O (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 2 일 동안 (250 rpm) 배양시켜 예비배양액을 수득하였다. 그후, 상기 수득된 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJAW 및 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJA41 의 예비배양액 각 200 ㎕ 씩을 10 ml 의 배양배지 (4% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO41 0.05% KC1, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.001% FeSO4-7H2O, 0.001% MnSO4-4-6H2O, 0.000002% 티아민 HC1, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 의 예비배양액 200 ㎕ 를 10 ml 의 배양배지 (4% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO41 0.05% KC1, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.001% FeSO4-7H2O, 0.001% MnSO4-4-6H2O, 0.000002% 티아민 HCl (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 4 일동안 배양하였다 (250 rpm). 각 배양액에 축적된 생성 바이오틴의 농도를 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) IFO 3070 균주를 이용한 미생물 정량 방법 (Izumi 및 Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", p. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985) 에 의해 측정하여 표 6 에 나타낸 바와 같은 생성 바이오틴의 농도를 확인하였다.
| 균주 | 바이오틴 생산성* | 바이오틴 농도 (mg/L) |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 | 1 | 0.037 |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJAW | 2.1 | 0.078 |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pJA41 | 6.9 | 0.260 |
* 유전자가 도입되지 않은 균주의 바이오틴 생산성과 비례한 수치.
실시예 8. 재조합 플라스미드 pSP302 의 제조
실시예 1 에서 수득된 플라스미드 pBC01 을 제한효소 Bam HI 및 Pst I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 bio F 암호화 영역중 많은 부분, 및 bio F 상부에 존재하는 영역인 bio F, bio D 및 bio A 발현 조절 영역을 함유하는 영역을 함유하는 약 1.4 kbp 의 DNA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 DNA 단편과 제한효소 Bam HI 및 Pst I 으로 절단된 플라스미드 벡터 pbluescript SKII(+) (스트라타진 클로닝 시스템사 제조) 을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용설명서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pBCO6 이라 명명하였다.
또한, 실시예 1 에서 수득된 플라스미드 pBC02 를 제한효소 Pst I 및 Eco RI 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜, bio F 암호화 영역 일부, bio D 및 bio A 의 암호화 영역, 및 bio A 하부에 존재하는 bio F, bio D 및 bio A 의 3'-비번역 영역을 포함하는 약 2.2 kbp 의 DNA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 DNA 단편 및 제한효소 Pst I 및 Eco RI 로 절단된 플라스미드 pBC06 를 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용설명서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSP105 라 명명하였다.
또한, 플라스미드 pSP105 를 제한효소 Bam HI 및 Hind III 로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜, bio F, bio D 및 bio A 의 암호화 영역 및 bio F, bio D 및 bio A 의 발현 조절 영역을 포함하는 약 3.6 kbp DNA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 DNA 단편 및 제한효소 Bam HI 및 Hind III 로 절단된 플라스미드 pJA41 를 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용설명서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSP302 라 명명하였다 (도 4).
실시예 9. pSP302 를 도입시킨 형질전환체의 제조
실시예 8 에서 수득된 플라스미드 pSP302 를 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP302 를 수득하였다.
실시예 10. 재조합 플라스미드 pSP304 의 제조
실시예 1, (1-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 5 에 나타낸 프라이머 C1 및 C6 를 사용하여 PCR 을 수행하여, bio C 암호화 영역 상부의 387 bp 에서부터 암호화 영역 하부의 196 bp 까지 총 1435 bp 를 함유하고, 상기 1435 bp 서열의 상류말단에 Hind III 부위를 도입시키고, 하류말단에는 Xho I 부위를 도입시킨 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Hind III 및 Xho I 로 절단시켜 수득된 단편과 플라스미드 pSP302 를 제한효소 Hind III 및 Xho I 로 절단시켜 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용설명서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSP304 라 명명하였다 (도 5).
실시예 11. pSP304 를 도입시킨 형질전환체의 제조
실시예 10 에서 수득된 플라스미드 pSP304 를 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP304 를 수득하였다.
실시예 12. 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP302 및 JCM7511 /pSP304 의 바이오틴 생산성
스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP302 및 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP304 각각 한 루프씩을 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 유전자를 도입시키지 않은 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 2 일 동안 (250 rpm) 배양시켜 예비배양액을 수득하였다. 그후, 상기 수득된 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP302 및 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP304 의 예비배양액 각 200 ㎕ 씩을 10 ml 의 배양배지 (4% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.001% FeSO4-7H2O, 0.001% MnSO4-4-6H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.0)) 를 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 의 예비배양액 200 ㎕ 를 10 ml 의 배양배지 (4% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO41 0.05% KC1, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.001% FeSO4-7H2O, 0.001% MnSO4-4-6H2O (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 4 일동안 배양하였다 (250 rpm). 각 배양액에 축적된 생성 바이오틴의 농도를 락토바실러스 플란타룸 IFO 3070 균주를 이용한 미생물 정량 방법 (Izumi 및 Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", p. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985) 에 의해 측정하여 표 7 에 나타낸 바와 같은 생성 바이오틴의 농도를 확인하였다.
| 균주 | 바이오틴 생산성* | 바이오틴 농도 (mg/L) |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 | 1 | 0.12 |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP302 | 2.8 | 0.33 |
| 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511/pSP304 | 8.6 | 1.0 |
* 유전자가 도입되지 않은 균주의 바이오틴 생산성과 비례한 수치.
실시예 13. 실시예 2 에서 수득된 게놈 DNA 를 이용한 재조합 플라스미드 pSS301 의 제조
실시예 2, (2-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 8 에 나타낸 프라이머 BF4 및 BR4 를 사용하여, PCR 반응을 수행하였다 [반응조성: 1 x Expand HF 완충액, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 씩의 각 DNTP, 300 nM 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 2.6 U ExpandTm 고정확도 PCR 시스템 효소 혼합물 (베링거 만하임사 제조)/50 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio B 암호화 영역 상부 151 bp 에서부터 암호화 영역 하부 151 bp 까지 총 1358 bp 를 함유하고 상기 1358 bp 서열의 각 말단에 Xba I 부위가 도입된 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Xba I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편 및 플라스미드 벡터 pJA β2 를 제한효소 Xba I 으로 절단하고 절단된 플라스미드 벡터를 탈인산화시켜 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS301 이라 명명하였다 (도 6).
| 프라이머 | 염기서열 |
| BF4 | 5'-CGTGATGCTGCGCCTGCTCGGCCACAACAT-3' |
| BR4 | 5'-GCTCTAGACCTCATCGTCCCCCTGAACTTGTT-3' |
| F2 | 5'-GGACTAGTACCGGAATGACAGGCGGACA-3' |
| F3 | 5'-GCCTGCAGCAGAACGTGTGGTCGAAGCC-3' |
| CDA1 | 5'-ATCTGCAGTTGCGCGATGAGGAGGCCACCTTGC-3' |
| CDA6 | 5'-GCAAGCTTATGACGCCGCCTGCGCCTTCGACCA-3' |
| CDA3 | 5'-CTAAGCTTCGAGATCGACGGGGTGGAAATCGAT-3' |
| CDA7 | 5'-CGCTCGAGGGGAGAAGTCCTGGGGGATGATCCC-3' |
| R1 | 5'-CCCTGCCCGTATGGCAAGCG-3' |
실시예 14. pSS301 가 도입된 형질전환체의 제조
실시예 13 에서 수득된 플라스미드 pSS301 을 스핑고모나스 종 SC42405 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 종 SC42405/pSS301 을 수득하였다.
실시예 15. 스핑고모나스 종 SC42405/pSS301 의 바이오틴 생산성
스핑고모나스 종 SC42405/pSS301 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 유전자를 도입시키지 않은 스핑고모나스 종 SC42405 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 상기 2 종류의 박테리아를 30℃ 에서 2 일 동안 (250 rpm) 배양시켜 예비배양액을 수득하였다. 그후, 상기 수득된 스핑고모나스 종 SC42405/pSS301 의 예비배양액 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.001% MnSO4·4∼6H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 스핑고모나스 종 SC42405 의 예비배양액 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.001% MnSO4·4∼6H2O (pH 7.0)) 를 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 상기 2 종류의 박테리아를 30℃ 에서 4 일동안 배양하였다 (250 rpm).
각 배양액에 축적된 생성 바이오틴의 농도를 락토바실러스 플란타룸 IFO 3070 균주를 이용한 미생물 정량 방법 (Izumi 및 Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", p. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985) 에 의해 측정하여 표 9 에 나타낸 바와 같은 생성 바이오틴의 농도를 확인하였다.
| 균주 | 바이오틴 생산성* | 바이오틴 농도 (mg/L) |
| 스핑고모나스 종 SC42405 | 1 | 4.1 |
| 스핑고모나스 종 SC42405/pSS301 | 4.0 | 17 |
* 유전자가 도입되지 않은 균주의 바이오틴 생산성과 비례한 수치.
실시예 16. 실시예 2 에서 수득된 게놈 DNA 를 이용한 재조합 플라스미드 pSS305 의 제조
실시예 2, (2-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 8 에 나타낸 프라이머 F2 및 F3 를 사용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 1 x Expand HF 완충액, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 씩의 각 DNTP, 300 nM 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 2.6 U ExpandTm 고정확도 PCR 시스템 효소 혼합물 (베링거 만하임사 제조)/50 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio F 암호화 영역 상부 201 bp 에서부터 암호화 영역 하부 46 bp 까지 총 1408 bp 를 함유하고 상기 1408 bp 서열의 상부 말단에 Spe I 부위가 도입되고, 하부 말단에는 Pst I 부위가 도입된 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Pst I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편 및 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) 를 제한효소 Spe I 및 Pst I 으로 절단하여 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS202 라 명명하였다.
또한, 실시예 2, (2-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 8 에 나타낸 프라이머 CDA1 및 CDA6 를 사용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 1 x Expand HF 완충액, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 씩의 각 DNTP, 300 nM 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 2.6 U ExpandTm 고정확도 PCR 시스템 효소 혼합물 (베링거 만하임사 제조)/50 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio C 암호화 영역 상부 209 bp, bio C 암호화 영역 726 bp 및 bio D 암호화 영역 전반부 약 300 bp 로 구성되고, 상부 말단에 Pst I 부위가 도입되고, 하부 말단에는 Hind III 부위가 도입된 총 1287 bp 를 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Pst I 및 Hind III 로 절단하고, 생성된 DNA 단편 및 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) 를 제한효소 Pst I 및 Hind III 로 절단하여 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS205 라 명명하였다.
또한, 실시예 2, (2-A) 에서 수득된 게놈 DNA 를 주형으로 사용하고 표 8 에 나타낸 프라이머 CDA3 및 CDA7 을 사용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 1 x Expand HF 완충액, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 씩의 각 DNTP, 300 nM 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 2.6 U ExpandTm 고정확도 PCR 시스템 효소 혼합물 (베링거 만하임사 제조)/50 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 따라서, bio D 암호화 영역 후반부 약 400 bp, bio A 암호화 영역 1251 bp 및 bio A 암호화 영역 하부서열 208 bp 로 구성되고, 상부 말단에 Hind III 부위가 도입되고, 하부 말단에는 Xho I 부위가 도입된 총 1653 bp 를 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 제한효소 Hind III 및 Xho I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편 및 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) 를 제한효소 Hind III 및 Xho I 으로 절단하여 수득된 DNA 단편을 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS206 이라 명명하였다.
상기 기재된 방식으로 수득된 플라스미드 pSS205 를 제한효소 Pst I 및 Hind III 로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리시켜, bio C 암호화 영역 상부의 209 bp, bio C 암호화 영역 762 bp 및 bio D 암호화 영역 전반부 약 300 bp 로 구성되고, 상부말단에 Pst I 부위가 도입되고, 하부말단에 Hind III 부위가 도입된, 총 1287 bp 를 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편과 제한효소 Pst I 및 Hind III 로 절단된 pSS206 을 혼합한 후, 상기 DNA 단편들을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS2071 이라 명명하였다.
다음으로, pSS2071 을 제한효소 Cla I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 자가결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS207 이라 명명하였다.
또한, 플라스미드 pSS202 를 제한효소 Spe I 및 Pst I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리시켜, bio F 암호화 영역 상부 201 bp 에서부터 암호화 영역 하부 46 bp 까지를 포함하고, 상류말단에 Spe I 부위를 도입시키고, 하류말단에 Pst I 부위를 도입시킨, 총 1408 bp 를 함유하는 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Pst I 로 절단시킨 pSS207 과 혼합하고, 상기 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS209 라 명명하였다.
플라스미드 pSS209 를 제한효소 Spe I 및 Xho I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리시켜, bio F, bio C, bio D 및 bio A 를 포함하고, 상류말단에 Spe I 부위를 도입시키고, 하류말단에 Xho I 부위를 도입시킨 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Xho I 로 절단된 pJA β2 와 혼합하고, 상기 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS305 라 명명하였다 (도 7).
실시예 17. 재조합 플라스미드 pSS304 의 제조
실시예 16 에서 수득된 플라스미드 pSS305 를 주형으로 이용하고, 표 8 에 나타낸 M13 프라이머 RV (다까라 슈조사 제조) 및 프라이머 R1 의 조합 및 M13 프라이머 M4 (다까라 슈조사 제조) 및 MUTBL 프라이머 (다까라 슈조사 제조) 의 조합 각각을 이용하여, PCR 을 수행하였다 [반응조성: 1 x Expand HF 완충액, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 씩의 각 dNTP, 300 nM 씩의 각 프라이머, 0.5 내지 100 ng 게놈 DNA, 2.6 U ExpandTm 고정확도 PCR 시스템 효소 혼합물 (베링거 만하임사 제조)/50 ㎕; 반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. PCR 후 Centricon-100 (아미콘사 제조) 을 이용하여 과량의 프라이머 및 과량의 dNTP 를 반응 용액으로 제거한 후, 잔류물에 TF 완충액을 첨가하여 총 부피를 50 ㎕ 로 만든다. 그후, 상기 수득된 용액 0.5 ㎕ 씩을 혼합하였다. 생성된 혼합물에 50 ㎕ 의 10 x Expand HF 완충액, 4 ㎕ 씩의 각 2.5 mM dNTP, 38.62 ㎕ 의 멸균 증류수 및 0.38 ㎕ 의 ExpandTm 고정확 PCR 시스템 효소 혼합물 (3.5 U/㎕) (베링거 만하임사 제조) 을 첨가하고, 상기 수득된 혼합물을 94℃ 에서 10 분동안 가열하고, 37℃ 에서 60 분에 걸쳐 냉각시킨 후, 37℃ 에서 15 분동안 항온배양하였다. 상기 반응 용액에 0.5 ㎕ 의 20 pmol M13 프라이머 RV (다까라 슈조사 제조) 및 0.5 ㎕ 의 20 pmol M13 프라이머 M4 (다까라 슈조사 제조) 를 첨가한 후, PCR 을 수행하였다 [반응 싸이클: 97℃ 에서 2 분간 1 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 10 반응 싸이클, 각각 97℃ 에서 15 초간, 60℃ 에서 30 초간, 이후 72℃ 에서 1.5 분간 15 반응 싸이클 (72℃ 에서 1.5 분간의 반응시간은 매 싸이클마다 20 초씩 증가된다), 72℃ 에서 7 분간의 1 반응 싸이클]. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Not I 및 Hind III 로 절단하고, 제한효소 Not I 및 Hind III 로 절단된 플라스미드 벡터 pbluescript SK(+) (스트라타진 클로닝 시스템사 제조) 와 혼합한 후, 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조)를 이요하여 첨부된 사용안내서에 따라 결찰시켰다. 생성된 클론으로부터, 염기분석에 의해, bio F 개시코돈 (ATG) 의 A 를 +l 번째 염기로 할 경우 -ll 번째 염기 C 가 G 로 치환된 돌연변이 bio F 염기서열 (서열번호: 5) 을 갖는 클론을 선별하였다. 상기 수득된 플라스미드를 플라스미드 pSS201 이라 명명하였다. 그후, 플라스미드 pSS201 을 제한효소 Spe I 및 Pst I 으로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 bio F 암호화 영역 상부의 201 bp 에서부터 암호화 영역 하부의 46 bp 까지의 총 1408 bp 를 함유하고, 상류말단에 Spe I 부위를 도입시키고 하류말단에 Pst I 부위를 도입시킨 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Pst I 로 절단된 pSS207 와 혼합하고, 상기 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS208 이라 명명하였다.
또한, 플라스미드 pSS208 을 제한효소 Spe I 및 Xho I 로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시켜 돌연변이 bio F 와 bio C, bio D 및 bio A 를 포함하고, 상류말단에 Spe I 부위를 도입시키고, 하류말단에 Xho I 부위를 도입시킨 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Xho I 로 절단된 pJA β2 와 혼합하고, 상기 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조) 를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS304 라 명명하였다 (도 8).
실시예 18. pSS304 를 도입시킨 형질전환체 및 pSS305 를 도입시킨 형질전환체의 제조
실시예 17 에서 수득된 플라스미드 pSS304 및 플라스미드 pSS305 를 각각 스핑고모나스 종 SC42405 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 종 SC42405/pSS304 및 스핑고모나스 종 SC42405/pSS305 를 수득하였다.
실시예 19. 스핑고모나스 종 SC42405/pSS304 및 스핑고모나스 종 SC42405/pSS305 의 바이오틴 생산성 및 바이오틴-관련물질 생산성
스핑고모나스 종 SC42405/pSS304 및 스핑고모나스 종 SC42405/pSS305 각각 한 루프씩을 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 유전자를 도입시키지 않은 스핑고모나스 종 SC42405 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 2 일 동안 (250 rpm) 배양시켜 예비배양액을 수득하였다. 그후, 상기 수득된 스핑고모나스 종 SC42405/pSS304 및 스핑고모나스 종 SC42405/pSS305 의 예비배양액 각 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.01% FeSO4·7H2O, 0.1% MnSO4·4∼6H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 스핑고모나스 종 SC42405 의 예비배양액 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.01% FeSO4·7H2O, 0.1% MnSO4·4∼6H2O (pH 7.0)) 를 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 상기 3 종류의 박테리아를 30℃ 에서 4 일동안 배양하였다 (250 rpm).
각 배양액에 축적된 생성 바이오틴의 농도를 락토바실러스 플란타룸 IFO 3070 균주 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 미생물 정량 방법 (Izumi 및 Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", p. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985) 에 의해 측정하였다. 그 결과, 표 10 에 나타낸 바와 같은 바이오틴 및 바이오틴 생합성중 전구체, 즉, 7-케토-8-아미노펠라르곤산, 7,8-디아미노펠라르곤산 및 데스티오바이오틴 (이하 "바이오틴비타머" 라 칭함) 의 농도를 확인하였다.
| 균주 | 바이오틴생산성* | 바이오틴농도 (mg/L) | 바이오틴-비타머생산성* | 바이오틴-비타머농도 (mg/L) |
| 스핑고모나스 종 | 1 | 4.1 | 1 | 25.2 |
| 스핑고모나스 종 SC42405/pSS304 | 0.9 | 3.5 | 11 | 271 |
| 스핑고모나스 종 SC42405/pSS305 | 0.8 | 3.5 | 5.9 | 149 |
* 유전자가 도입되지 않은 균주의 바이오틴 생산성과 비례한 수치.
실시예 20. 재조합 플라스미드 pSS306 의 제조
플라스미드 pSS209 를 제한효소 Spe I 및 Xho I 로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리시켜, bio F, bio C, bio D 및 bio A 를 포함하고, 상류말단에 Spe I 부위를 도입시키고, 하류말단에 Xho I 부위를 도입시킨 DNA 단편을 제조하였다. 상기 수득된 DNA 단편을 제한효소 Spe I 및 Xho I 로 절단된 pSS301 과 혼합하고, 상기 DNA 단편을 결찰 키트 (다까라 슈조사 제조)를 이용하여 첨부된 사용안내서에 따라 서로 결찰시켰다. 상기 수득된 플라스미드를 pSS306 이라 명명하였다 (도 9).
실시예 21. pSS306 이 도입된 형질전환체의 제조
실시예 20 에서 수득된 플라스미드 pSS306 을 스핑고모나스 종 SC42405 에 유전자 펄서 (바이오-라드 래보러토리사 제조) 를 이용하여 전기천공 방법 (사용전압 18 kV/cm, 정전용량 25 μF, 저항 400 Ω) 에 의해 도입시켜 스핑고모나스 종 SC42405/pSS306 를 수득하였다.
실시예 22. 스핑고모나스 종 SC42405/pSS306 의 바이오틴 생산성
스핑고모나스 종 SC42405/pSS306 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 유전자를 도입시키지 않은 스핑고모나스 종 SC42405 한 루프를 3 ml 의 배양배지 (1% 글리세롤, 2% 펩톤, 0.15% K2HPO4, 0.15% MgSO4·7H2O (pH 7.2)) 를 포함하는 작은 시험관 (18 X 150 mm) 에 접종하였다. 상기 2 종류의 박테리아를 30℃ 에서 2 일 동안 (250 rpm) 배양시켜 예비배양액을 수득하였다. 그후, 상기 수득된 스핑고모나스 종 SC42405/pSS306 의 예비배양액 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.01% FeSO4·7H2O, 0.1% MnSO4·4∼6H2O, 0.005% 테트라싸이클린 (pH 7.0)) 을 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 대조군으로, 스핑고모나스 종 SC42405 의 예비배양액 160 ㎕ 를 8 ml 의 배양배지 (6% 글리세롤, 2% 효모추출물, 0.5% 카사미노산, 0.1% K2HPO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.01% FeSO4·7H2O, 0.1% MnSO4·4∼6H2O (pH 7.0)) 를 포함하는 큰 시험관 (22 X 220 mm) 에 접종하였다. 상기 2 종류의 박테리아를 30℃ 에서 4 일동안 배양하였다 (250 rpm). 각 배양액에 축적된 생성 바이오틴의 농도를 락토바실러스 플란타룸 IFO 3070 균주 및 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 미생물 정량 방법 (Izumi 및 Yamada "Vitaminological Experimental Method II. Water-soluble Vitamins", p. 481-499, Vitaminological Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1985) 에 의해 측정하였다. 그 결과, 표 11 에 나타낸 바와 같은 생성 바이오틴의 농도를 확인하였다.
| 균주 | 바이오틴 생산성* | 바이오틴 농도 |
| 스핑고모나스 종 SC42405 | 1 | 4.1 |
| 스핑고모나스 종 SC42405/pSS306 | 3.9 | 16 |
* 유전자가 도입되지 않은 균주의 바이오틴 생산성과 비례한 수치.
본 발명은 하기를 제공한다:
1) 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자를 함유하는 DNA 단편 .
2) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자, 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자, 데스티오바이오틴 합성효소 유전자, 바이오틴 신타제 유전자, 및 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계의 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 단편.
3) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
4) 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
5) 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
6) 서열번호: 3, 4 또는 5 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
7) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
8) 서열번호: 6 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 6 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
9) 서열번호: 7 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
10) 서열번호: 8 또는 9 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
11) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 데스티오바이오틴 합성효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
12) 서열번호: 10 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 데스티오바이오틴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
13) 서열번호: 11 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 11 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 데스티오바이오틴 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
14) 서열번호: 12 또는 13 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
15) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 바이오틴 신타제를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
16) 서열번호: 14 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 14 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
17) 서열번호: 15 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 15 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
18) 서열번호: 18 에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 신타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
19) 서열번호: 16, 17 또는 19 에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
20) 상기 항목 1 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
21) 서열번호: 20 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 20 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
22) 서열번호: 21 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21 에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 수정 또는 부가에 의해 형성된 아미노산 서열을 갖고 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
23) 서열번호: 22 또는 23 의 염기서열을 갖는 유전자를 함유하는 DNA 단편.
24) 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 염기서열 일부를 갖는 DNA 단편.
25) 상기 항목 24 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자, 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자, 데스티오바이오틴 합성효소 유전자, 바이오틴 신타제 유전자, 또는 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
26) 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 단백질을 코딩하는 영역을 함유하는 DNA 단편.
27) 상기 항목 26 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자, 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자, 데스티오바이오틴 합성효소 유전자, 바이오틴 신타제 유전자, 또는 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
28) 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 유전자의 유전자 발현 조절영역을 함유하는 DNA 단편으로, 상기 영역이 단백질을 코딩하는 영역의 상부에 존재하는 DNA 단편.
29) 상기 항목 28 의 DNA 단편으로, 상기 유전자가 7-케토-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 유전자, 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 유전자, 데스티오바이오틴 합성효소 유전자, 바이오틴 신타제 유전자, 또는 바이오틴 생합성 경로에서 피멜릴 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자인 DNA 단편.
30) 서열번호: 24 또는 25 에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA 단편.
31) 상기 항목 1, 2, 3, 7, 11, 15, 20, 24, 25, 26, 27, 28 및 29 중 어느 한 항의 DNA 단편으로, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물이 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 또는 스핑고모나스 종 SC42405 인 DNA 단편.
32) 상기 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 DNA 단편을 포함하는 벡터.
33) 상기 항목 1 내지 31 중 어느 한 항에 따른 DNA 단편을 숙주 세포내에서 복제가능한 벡터에 삽입시키는 것을 포함하는 벡터의 제조방법.
34) 상기 항목 32 의 벡터로, 유전자 발현 조절영역이 단백질을 코딩하는 영역 상부에 연결되어 있는 벡터.
35) 상기 항목 1 내지 31 중 어느 하나의 DNA 단편 하나 이상 또는 상기 항목 32 또는 34 의 벡터 하나 이상이 숙주 세포내로 도입된 형질전환체.
36) 숙주 세포가 미생물인 상기 항목 35 의 형질전환체.
37) 상기 항목 32 또는 34 의 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 것을 포함하는 형질전환체의 제조방법.
본 발명은 바이오틴 생합성에 관여하며 스핑고모나스 속에 속하는 미생물로부터 유래된 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편, 및 상기 DNA 단편을 이용하여 수득된 바이오틴-생성 형질전환체를 제공하며, 동물, 식물 및 몇몇 미생물의 필수 비타민인 바이오틴의 생산성 개선에 유용하다.
[서열목록]
서열번호: 1
서열길이: 369
서열타입: 아미노산
분자유형: 단백질
토폴로지: 선형
기원
생물체: 스핑고모나스 파우치모빌리스
균주명: JCW7511
서열의 기재
[서열 1a]
[서열 1b]
서열번호: 2
서열길이: 387
서열타입: 아미노산
토폴로지: 선형
분자유형: 단백질
기원
생물체: 스핑고모나스 종
균주명: SC42405
서열의 기재
[서열 2a]
[서열 2b]
[서열 2c]
서열번호: 3
서열길이: 1536
서열타입: 핵산
쇄의수: 이중나선
토폴로지: 선형
분자유형: 게놈 DNA
기원
생물체: 스핑고모나스 파우치모빌리스
균주명: JCM7511
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 427..1536
특징을 결정하는 방법: S
서열의 기재
[서열 3]
서열번호: 4
서열길이: 1408
서열타입: 핵산
쇄의수: 이중나선
토폴로지: 선형
분자유형: 게놈 DNA
기원
생물체: 스핑고모나스 종
균주명: SC42405
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 202..1365
특징을 결정하는 방법: S
서열의 기재
[서열 4]
서열번호: 5
서열길이: 1408
서열타입: 핵산
쇄의수: 이중나선
토폴로지: 선형
분자유형: 게놈 DNA
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생물체: 스핑고모나스 종
균주명: SC42405
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특징을 나타내는 기호: CDS
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특징을 결정하는 방법: S
서열의 기재
[서열 5]
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[서열 8]
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[서열 9]
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[서열 12]
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생물체: 스핑고모나스 종
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[서열 13]
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[서열 14a]
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생물체: 스핑고모나스 종
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[서열 15a]
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생물체: 스핑고모나스 파우치모빌리스
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[서열 16]
서열번호: 17
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생물체: 스핑고모나스 종
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[서열 17]
서열번호: 18
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[서열 18a]
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생물체: 스핑고모나스 파우치모빌리스
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[서열 19]
서열번호: 20
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[서열 20a]
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[서열 21a]
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[서열 22a]
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생물체: 스핑고모나스 종
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특징을 나타내는 기호: CDS
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[서열 23a]
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서열번호: 24
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[서열 24]
서열번호: 25
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생물체: 스핑고모나스 종
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서열의 기재
[서열 25]
Claims (31)
- 서열번호 1, 2, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 18, 20 또는 21의 아미노산서열을 코딩하는 DNA.
- 서열번호 3, 4 또는 5 의 염기서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 2 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 8 또는 9의 염기서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 6 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 7 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 12 또는 13의 염기 서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 10 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 11 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 16, 17 또는 19의 염기서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 14 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 15 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 18 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 20 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 21 의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 DNA.
- 서열번호 16 에서 개시코돈 (ATG) 의 A 를 +1 번째 염기로 할 때 -222 번째 염기에서부터 1 번째 염기까지의 염기서열, 또는 서열번호 4 에서 개시코돈 (ATG) 의 A 를 +1 번째 염기로 할 때 -201 번째 염기에서부터 1 번째 염기까지의 염기서열을 갖는 DNA.
- 서열번호 24 또는 25 의 염기서열을 갖는 DNA.
- 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항, 제 8 항, 제 11 항, 제 15 항, 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 스핑고모나스 속에 속하는 미생물이 스핑고모나스 파우치모빌리스 JCM7511 또는 스핑고모나스 종 SC42405 인 DNA.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 를 갖는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 를 숙주 세포내에서 복제가능한 벡터에 삽입시키는 것을 포함하는 벡터의 제조방법.
- 제 21 항에 있어서, 유전자 발현 조절영역이 단백질을 코딩하는 영역 상부에 연결되어 있는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 하나 이상이 숙주 세포내로 도입된 형질전환체.
- 제 24 항에 있어서, 숙주 세포가 미생물인 형질전환체.
- 제 21 항의 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 것을 포함하는 형질전환체의 제조방법.
- 7-케노-8-아미노펠라르고네이트 합성효소 활성을 갖는 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
- 7,8-디아미노펠라르고네이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 DNA 에 의해 코딩되는 단백질.
- 데스티오바이오틴 합성효소 활성을 갖는 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 DNA 에 의해 코딩되는 단백질.
- 바이오틴 신타제 활성을 갖는 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 DNA 에 의해 코딩되는 단백질.
- 바이오틴 생합성 경로에서 피멜린 Co-A 상부의 생합성 단계에서 반응을 촉매하는 활성을 갖는 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 DNA 에 의해 코딩되는 단백질.
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