KR100563621B1 - Kit for extracting genomic dna from human blood and method for extracting genomic dna using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출할 수 있는 시약들로 이루어진 키트 및 그것을 사용하여 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출하는 방법에 관한 것으로서, 응고되지 않은 인간 혈액에 20mM, pH 7.5의 Tris-HCl 완충 용액으로 이루어진 적혈구 용해용 용액 키트를 가하여, 적혈구, 혈장, 혈소판 성분 등을 제거하고 백혈구 만을 수득하는 제1단계; 수득한 백혈구에 10mM, pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액, 1.0mM EDTA 및 1.0% SDS로 이루어진 백혈구 용해용 용액 키트를 가하여 백혈구의 핵을 용출시키는 제2단계; 용출된 백혈구의 핵에 3M, pH 5.2의 소듐 아세테이트 용액으로 이루어진 단백질 침전용 용액 키트를 가하여 상기 백혈구의 핵으로부터 유전체 DNA 및 핵 단백질을 분리하는 제3단계; 및 상기에서 분리된 유전체 DNA에 10mM, pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액 및 1.0mM EDTA로 이루어진 유전체 DNA 회수용 TE 완충 용액 키트를 가하여 유전체 DNA를 회수하는 제4단계로 이루어진 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출 방법을 제공한다.The present invention relates to a kit consisting of reagents capable of extracting genomic DNA from human blood and a method for extracting genomic DNA from human blood using the same, wherein tris-HCl buffer of 20 mM, pH 7.5 in uncoagulated human blood Adding a solution kit for erythrocyte lysis comprising a solution to remove erythrocytes, plasma, platelet components, and the like and to obtain leukocytes only; A second step of eluting the leukocyte nuclei by adding a leukocyte lysis solution kit consisting of 10 mM, pH 8.0 Tris-HCl buffer solution, 1.0 mM EDTA and 1.0% SDS to the obtained leukocytes; A third step of separating genomic DNA and nuclear protein from the nuclei of the white blood cells by adding a solution kit for protein precipitation consisting of a sodium acetate solution of 3M and pH 5.2 to the nuclei of eluted white blood cells; And a fourth step of recovering the genomic DNA by adding a TE buffer solution kit for genomic DNA recovery consisting of 10 mM, pH 8.0 Tris-HCl buffer solution and 1.0 mM EDTA, to recover the genomic DNA. Provide extraction methods.
혈액, 유전체 DNA, 유전체 DNA 추출용 키트Blood, genomic DNA, genomic DNA extraction kit
Description
도1a는 본 발명에 따른 적혈구 용해용 용액 키트를 나타낸 사진.Figure 1a is a photograph showing a solution kit for erythrocyte lysis according to the present invention.
도1b는 본 발명에 따른 백혈구 용해용 용액 키트를 나타낸 사진.Figure 1b is a photograph showing a solution kit for leukocyte lysis according to the present invention.
도1c는 본 발명에 따른 단백질 침전용 용액 키트를 나타낸 사진.Figure 1c is a photograph showing a solution kit for protein precipitation according to the present invention.
도1d는 본 발명에 따른 유전체 DNA 회수용 TE 완충 용액 키트를 나타낸 사진.Figure 1d is a photograph showing a TE buffer solution kit for genomic DNA recovery according to the present invention.
도2는 본 발명에 따른 실험예1 및 비교예1의 결과를 나타낸 사진.Figure 2 is a photograph showing the results of Experimental Example 1 and Comparative Example 1 according to the present invention.
도3은 본 발명에 따른 실험예2의 결과를 나타낸 사진.Figure 3 is a photograph showing the results of Experimental Example 2 according to the present invention.
도4는 본 발명에 따른 실험예3의 결과를 나타낸 사진.Figure 4 is a photograph showing the results of Experimental Example 3 according to the present invention.
도5a는 본 발명에 따른 실험예4에서 CYP450 3A4의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5a is a photograph showing the results of nucleotide sequence analysis of CYP450 3A4 in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5b는 본 발명에 따른 실험예4에서 포토리아제의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5b is a photograph showing the results of the nucleotide sequence analysis of the photoliase in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5c는 본 발명에 따른 실험예4에서 RANKL의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5c is a photograph showing the results of nucleotide sequence analysis of RANKL in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5d는 본 발명에 따른 실험예4에서 p53 유전자의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5d is a photograph showing the nucleotide sequence analysis of the p53 gene in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5e는 본 발명에 따른 실험예4에서 프리제닐린-1의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5e is a photograph showing the results of the nucleotide sequence analysis of the pre-genelin-1 in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5f는 본 발명에 따른 실험예4에서 BRCA2의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5f is a photograph showing the results of nucleotide sequence analysis of BRCA2 in Experimental Example 4 according to the present invention.
도5g는 본 발명에 따른 실험예4에서 알데히드 데히드로게나제2의 염기 서열 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 5g is a photograph showing the results of the nucleotide sequence analysis of
본 발명은 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출할 수 있는 시약들로 이루어진 키트 및 그것을 사용하여 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a kit comprising reagents capable of extracting genomic DNA from human blood and a method of extracting genomic DNA from human blood using the same.
근래, 인간 유전체 DNA의 염기 서열이 밝혀지고 난 후, 인간의 질병을 치유하거나, 예방하고자 하는 등의 목적으로 유전체 DNA 차원에서 행하는 분자 생물학적인 검사가 활발하게 이루어지고 있다. 즉, 예를 들면, 유전자 차원에서의 질병 검사, 새로 개발된 약물에 대한 효과의 검사, 혈액 공여자의 바이러스나 박테리아 감염 여부를 사전에 알기 위한 검사 뿐만 아니라, 친생자나 범죄자의 확인을 위한 법의학 등의 다양한 분야에서, 인간 세포로부터 추출된 유전체 DNA를 이용하여 그것을 분석하는 것이 오늘날 보편적으로 수행되고 있다. Recently, after the nucleotide sequence of human genomic DNA is known, molecular biological testing at the level of genomic DNA has been actively conducted for the purpose of curing or preventing human diseases. That is to say, for example, disease testing at the genetic level, testing of effects on newly developed drugs, tests to know in advance whether a blood donor is infected with a virus or bacteria, as well as forensics for identification of relatives or offenders. In various fields, the analysis of genomic DNA extracted from human cells is commonly performed today.
이러한 유전자 차원의 검사에서 정확성을 기하기 위해서는 인간의 세포로부터 순도가 높은 유전체 DNA를 대량으로 추출하여 반복 실험함으로써, 재현성있는 결과를 얻도록 하는 것이 중요하다. 고순도의 DNA를 수득하기 위해 지금까지 개발된, 인간의 세포로부터 유전체 DNA를 추출하는 일반적인 방법에는, 페놀, 이소아밀 알코올 등의 유해한 유기 용매를 사용하거나, 단백질 분해 효소 등의 다양한 시약을 사용하기 때문에 요구되는 세척 단계, 단백질 분해 단계 등의 여러 단계가 포함되어 있다. 이러한 방법에 의하면, 여러 단계를 거침으로써 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 다량의 시료를 동시에 처리하는데 한계가 있다(Sambrook,J.,E.F.Fritsch, and T.Maniatis, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CHS Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).In order to ensure accuracy in such a gene-level test, it is important to extract a large amount of high-purity genomic DNA from human cells and repeat the experiment, thereby obtaining reproducible results. The conventional method of extracting genomic DNA from human cells, which has been developed so far to obtain high purity DNA, uses harmful organic solvents such as phenol and isoamyl alcohol, and various reagents such as proteolytic enzymes. Several steps are included, such as required washing steps, proteolytic steps, and the like. This method not only takes a lot of time by going through several steps, but also limits the processing of large amounts of samples simultaneously (Sambrook, J., EFFritsch, and T. Manatis, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CHS Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
최근, 보다 신속하고 간편하게 유전체 DNA를 추출하고자 하는 다양한 방법들이 고안되었으나, 이러한 방법들 또한 단백질 분해 효소 처리 후, 페놀 등의 유해한 유기 용매를 사용하는 기존의 방법과 유사한 방법(Parzer,S., and C.Mannhalter. 1991. A rapid method for the isolation of genomic DNA from citrated whole blood. Biochem.J.273(Pt1):229-231.; Albarino,C.G and V.Romanowski. 1994. Phenol extraction revisited: a rapid method for the isolation and preservation of human genomic DNA from whole blood. Mol. Cell Probes 8:423-427)이거나, 인간 혈액으로부터의 유전자 DNA 추출 과정에 여러 단계를 요구함으로써 많은 시간이 소요되는 방법들(Wang,L., K.Hirayasu, M.Ishizawa, and T.Kobayashi. 1994. Purification of genomic DNA from human whole blood by isopropanol-fractionation with concentrated NaI and SDS. Nuclecic Acids Res. 22:1774-1775.; Robbins,V., M.P.Aguinaga, and M.S.Valenzuela. 1995. Efficiencet isolation of whole genomic DNA frome cell cultures and blood samples. BioTechniques 18:414-418)이다. 2001년 Sambrook, J. 등은 상기한 문제점들을 개선하기 위하여, 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출 과정 중 최고 16시간이 소요되는 단백질 분해 효소를 처리하는 과정을 생략함으로써, 페놀 등의 유해한 유기 용매를 사용하는 단계를 줄임과 동시에 시간을 단축시키는 방법(Sambrook.J, and D.W.Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CHS Laboratory Press. Cold Spring Harbor. N.Y.)을 고안하였으나, 이 방법 또한 대량의 인간 혈액으로부터 다양한 유전체 DNA를 추출하기 위한 목적에는 적합하지 못하다. 그밖에 상기한 문제점들을 개선한 유전체 DNA 추출 키트(QIAGEN Inc. Valencia. USA)가 출시되어 있으나, 이 키트 역시 대량의 인간 혈액에서 다량의 유전체 DNA를 추출하는 데에는 많은 비용이 소모된다는 문제점이 있다.Recently, various methods have been devised to extract genomic DNA more quickly and easily, but these methods are also similar to the conventional methods using harmful organic solvents such as phenol after protease treatment (Parzer, S., and C. Mannhalter. 1991. A rapid method for the isolation of genomic DNA from citrated whole blood.Biochem. J. 273 (Pt 1): 229-231 .; Albarino, CG and V. Romanowski. 1994. Phenol extraction revisited: a rapid methods for the isolation and preservation of human genomic DNA from whole blood.Mol. Cell Probes 8: 423-427) or time-consuming methods by requiring multiple steps in the extraction of genetic DNA from human blood (Wang, L., K. Hirayasu, M. Ishizawa, and T. Kobayashi. 1994. Purification of genomic DNA from human whole blood by isopropanol-fractionation with concentrated NaI and SDS.Nuclecic Acids Res. 22: 1774-1775 .; Robbins, V , MPAguinaga, and MS Valenzuela. 1995. Efficiencet isolation of whole genomic DNA frome cell cultures and blood samples.BioTechniques 18: 414-418. In 2001, Sambrook, J. et al. Used harmful organic solvents such as phenol by omitting the process of proteolytic enzymes, which take up to 16 hours of genomic DNA extraction from human blood, to ameliorate these problems. We devised a method that shortened the time and reduced the time (Sambrook. J, and DWRussell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CHS Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY) It is not suitable for the purpose of extracting various genomic DNA from. In addition, a genome DNA extraction kit (QIAGEN Inc. Valencia. USA) has been released that improves the above problems, but this kit also has a problem in that it is expensive to extract a large amount of genomic DNA from a large amount of human blood.
본 발명의 목적은, 대량의 인간 혈액을 대상으로하여 신속하고 간편하게 고순도의 유전체 DNA를 다량 추출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a method for extracting a large amount of high-purity genomic DNA quickly and easily from a large amount of human blood.
본 발명의 또다른 목적은, 대량의 인간 혈액으로부터 신속하고 간편하게 고순도의 유전체 DNA를 다량 추출할 수 있는 시약으로 이루어진 상품화된 키트를 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a commercialized kit consisting of a reagent capable of quickly and simply extracting a large amount of high purity genomic DNA from a large amount of human blood.
본 발명에서는 상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 유전체 DNA 추출을 위한 시료의 대상을 인간의 혈액만으로 국한함으로써, 기존의 인간 세포를 대상으로 하여 유전체 DNA를 추출하기 위해 사용된 다양한 시약을 일부 시약만으로 단순화시킬 수 있고, 시약을 소량 사용하여도 대량의 시료를 대상으로 신속하고 간편하게 순도가 높은 유전체 DNA를 추출할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.In the present invention, as a result of repeated studies to achieve the above technical problem, by limiting the target of the sample for genomic DNA extraction only in human blood, it is used to extract genomic DNA from the existing human cells The present invention has been completed by focusing on the fact that various reagents can be simplified with only a few reagents, and even a small amount of reagents can be used to quickly and easily extract high-purity genomic DNA from a large amount of samples.
본 발명은, (a) 20mM의 pH 7.5인 Tris-HCl 완충 용액으로 이루어진 적혈구 용해용 용액 키트; (b) 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액, 1.0mM의 EDTA 및 0.1%의 SDS(sodium dodecyl sulfate)로 이루어진 백혈구 용해용 용액 키트; (c) 3M의 pH 5.2인 소듐 아세테이트로 이루어진 단백질 침전용 용액 키트; 및 (d) 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액 및 1.0mM EDTA로 이루어진 유전체 DNA 회수용 TE(Tris-HCl·EDTA) 완충 용액 키트;로 이루어진 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출용 용액 키트에 관한 것이다.The present invention, (a) solution kit for erythrocyte lysis consisting of Tris-HCl buffer solution of pH 7.5 of 20mM; (b) a solution kit for leukocyte lysis consisting of Tris-HCl buffer solution at pH 8.0 of 10 mM, 1.0 mM EDTA and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS); (c) a solution kit for protein precipitation consisting of sodium acetate at pH 5.2 of 3M; And (d) TE (Tris-HCl.EDTA) buffer solution kit for genome DNA recovery consisting of Tris-HCl buffer solution at pH 8.0 of 10 mM and 1.0 mM EDTA. will be.
또한, 본 발명은, 인간 혈액 중에서 적혈구, 혈장, 혈소판 성분 등을 제거하여 백혈구 만을 수득하는 제1단계; 수득한 백혈구의 핵을 용출시키는 제2단계; 용 출된 백혈구의 핵으로부터 유전체 DNA 및 핵 단백질을 분리하는 제3단계; 및 분리된 유전체 DNA를 회수하는 제4단계;로 이루어진 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로는, 응고되지 않은 인간 혈액에 20mM, pH 7.5의 Tris-HCl 완충 용액을 가하여, 적혈구, 혈장, 혈소판 성분 등을 제거하고 백혈구 만을 수득하는 제1단계; 수득한 백혈구에 10mM, pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액, 1.0mM EDTA 및 1.0% SDS를 가하여 백혈구의 핵을 용출시키는 제2단계; 용출된 백혈구의 핵에 3M, pH 5.2의 소듐 아세테이트 용액을 가하여 상기 백혈구의 핵으로부터 유전체 DNA 및 핵 단백질을 분리하는 제3단계; 및 분리된 유전체 DNA에 10mM, pH 8.0의 Tris-HCl 완충 용액 및 1.0mM EDTA를 가하여 유전체 DNA를 회수하는 제4단계;로 이루어진 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention, the first step of obtaining only white blood cells by removing red blood cells, plasma, platelet components and the like in human blood; Eluting the nuclei of the obtained leukocytes; A third step of separating genomic DNA and nuclear protein from the nuclei of eluted white blood cells; And a fourth step of recovering the separated genomic DNA. The present invention relates to a method of extracting genomic DNA from human blood. More specifically, by adding Tris-HCl buffer solution of 20 mM, pH 7.5 to uncoagulated human blood, A first step of removing red blood cells, plasma, platelet components and the like and obtaining only white blood cells; A second step of eluting the leukocyte nuclei by adding 10 mM, Tris-HCl buffer solution of pH 8.0, 1.0 mM EDTA and 1.0% SDS to the obtained leukocytes; A third step of separating genomic DNA and nuclear protein from the nuclei of the white blood cells by adding a sodium acetate solution of 3M, pH 5.2 to the nuclei of eluted white blood cells; And a fourth step of recovering the genomic DNA by adding 10 mM, Tris-HCl buffer solution at pH 8.0, and 1.0 mM EDTA to the separated genomic DNA; and a method for extracting genomic DNA from human blood.
상기에서 설명한 본 발명의 유전체 DNA 추출용 시약 키트 및 유전체 DNA 추출 방법은, 혈액의 특성에 착안하여 이루어진 것이다. 혈액은 혈장 성분과 세포 성분으로 이루어져 있어, 헤파린 등의 혈액 응고제를 투입하여 응고되지 않은 혈액을 시험관에 넣고 세워두면 투명한 담황색의 액체(혈장)와 세포 성분(적혈구, 혈소판, 백혈구 등)으로 분리된다. 시험관을 기울여 혈장 성분을 제거한 후, 세포 성분에 혈액보다 낮은 삼투압의 식염수를 투입하면, 혈구 속에 수분이 빨려 들어가 용혈 현상이 일어나게 되는데, 본 발명에서는 이러한 혈액의 특성을 이용하여, 먼저 응고 방지제가 처리된 혈액에서 혈장 성분을 제거한 후 저농도 완충 용액을 혈액에 가함으로써, 핵을 포함하고 있지 않은 적혈구, 혈소판 및 소량의 혈장 단백질 등을 미리 제거한다. 이때, 상기 혈장 성분은, 저농도 완충 용액을 혈액에 가하여 적혈구, 혈소판 등을 제거할 때 함께 제거할 수도 있다. 이어서, 남은 백혈구 세포를 낮은 pH에서 SDS 등의 계면 활성제와 접촉시켜, 상기 백혈구 내의 유전체 DNA를 포함하는 핵이 상기 백혈구를 이루는 세포막, 세포질 등과 분리되어 용출된 상태가 되도록 한다. 여기에, 소듐 아세테이트 등의 아세트산염을 가할 경우, 상기 용출된 핵으로부터 유전체 DNA와 핵 단백질이 분리되고, 원심 분리에 의하면 핵 단백질이 침전된 상태로 존재하므로, 상층액 만을 취함으로써 유전체 DNA를 수득할 수 있다. 이러한 유전체 DNA는 이소프로필 알코올에 의해 침전된 후, 에탄올 세척 과정을 통해 협잡물이 포함되지 않은 순도 높은 유전체 DNA화 되고, 이러한 유전체 DNA를 대상으로 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 제한 효소 처리, 염기 서열 분석 등의 분자 생물학적 검사 등을 바람직하게 행할 수 있다.The reagent kit for genomic DNA extraction and the genomic DNA extraction method of the present invention described above are focused on the characteristics of blood. Blood is composed of plasma and cellular components, and blood coagulants, such as heparin, are injected into the test tube, and the blood is separated into transparent pale yellow liquid (plasma) and cellular components (red blood cells, platelets, white blood cells, etc.). . After removing the plasma components by tilting the test tube, when the saline solution with a lower osmotic pressure than the blood is introduced into the cell components, water is sucked into the blood cells to cause a hemolysis phenomenon. In the present invention, the anticoagulant is first treated using the characteristics of the blood. Plasma components are removed from the blood, and a low concentration buffer solution is added to the blood to remove red blood cells, platelets, and a small amount of plasma proteins that do not contain nuclei in advance. In this case, the plasma component may be removed together with a low concentration buffer solution to remove red blood cells, platelets, and the like. Subsequently, the remaining white blood cells are contacted with a surfactant such as SDS at a low pH so that the nucleus containing the genomic DNA in the white blood cells is separated and eluted from the cell membrane, cytoplasm, and the like forming the white blood cells. When an acetate such as sodium acetate is added thereto, the genomic DNA and the nuclear protein are separated from the eluted nucleus, and the nuclear protein is present in the precipitated state by centrifugation. Thus, the genomic DNA is obtained by taking only the supernatant. can do. The genomic DNA is precipitated by isopropyl alcohol, and then purified by ethanol washing to form high-purity genomic DNA containing no contaminants, and the polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzymes are applied to the genomic DNA. Molecular biological tests such as treatment, sequencing and the like can be preferably performed.
이하, 본 발명에 따른 인간 혈액으로부터의 유전체 DNA 추출용 키트 및 그것을 사용하여 유전체 DNA를 추출하는 방법에 대해, 하기 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예 및 첨부된 도면은 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 본 발명은 청구 범위에 기재된 사항을 바탕으로 적절한 변형 및 수정이 가능하다.Hereinafter, a kit for extracting genomic DNA from human blood and a method of extracting genomic DNA using the same according to the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and accompanying drawings. The following examples and the accompanying drawings are not intended to limit the invention, the invention may be appropriately modified and modified based on the matter described in the claims.
실시예Example
제1단계: 헤파린으로 처리된 혈액 300㎕ 및 20mM의 pH 7.5인 Tris-HCl 완충 용액 1.2㎖를 1.5㎖ 짜리 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고, 볼텍스 혼합한 후, 실온에서 10분간 방치하였다. 이어서, 이것을 마이크로 원심 분리기에서 16,000×g 로 30초 동안 원심 분리한 후, 용혈된 적혈구 세포, 혈소판, 혈청 등이 포함된 상층액을 튜브를 기울여 제거하였다. 상기 튜브 바닥에 남은 백혈구 세포에 다시 상기 20mM의 pH 7.5인 Tris-HCl 완충 용액을 가하여 3회 반복하여 세척하였다. 상기 20mM의 pH 7.5인 Tris-HCl 완충 용액을 적혈구 용해용 용액으로서 키트화(도1a참조, 적혈구 용해용 용액 키트Ⅰ)하여 실온에서 보관하였다.Step 1: 300 μl of blood treated with heparin and 1.2 mL of Tris-HCl buffer solution at pH 7.5 of 20 mM were placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, vortex mixed, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Subsequently, this was centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds in a microcentrifuge, and the supernatant containing hemolyzed red blood cells, platelets, serum, and the like was tilted to remove the tube. The white blood cells remaining at the bottom of the tube were added to Tris-HCl buffer solution at pH 7.5 of 20 mM again and washed three times. The 20 mM pH 7.5 Tris-HCl buffer solution was kitted as a solution for erythrocyte dissolution (see FIG. 1A, solution kit for red blood cell lysis) and stored at room temperature.
제2단계: 상기 제1단계에서 세척 후 튜브 바닥에 남아있는 백혈구 세포를 볼텍스 혼합기로 풀어지도록 한 다음, 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액, 1.0mM EDTA 및 0.1%의 SDS의 혼합 용액 600㎕를 첨가한 후, 오비탈 쉐이커에서 30분 동안 교반하여 백혈구 세포의 핵을 용출시켰다. 상기 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액, 1.0mM EDTA 및 0.1%의 SDS의 혼합 용액을 백혈구 용해용 용액으로서 키트화(도1b 참조, 백혈구 용해용 용액 키트Ⅱ)하여 실온에서 보관하였다.Step 2: After releasing the white blood cells remaining in the bottom of the tube after washing in the first step with a vortex mixer, a mixed solution of Tris-HCl buffer solution, 1.0 mM EDTA, and 0.1% SDS 600, pH 8.0 of 10 mM After addition of [mu] l, the nuclei of white blood cells were eluted by stirring in an orbital shaker for 30 minutes. The mixed solution of Tris-HCl buffer solution, 1.0 mM EDTA, and 0.1% SDS at pH 8.0 of 10 mM was kitted as a solution for leukocyte dissolution (see FIG. 1B, solution kit II for leukocyte lysis) and stored at room temperature.
제3단계: 상기 백혈구 세포의 핵이 용출된 튜브에 200㎕의 pH 5.2인 3M 소듐 아세테이트를 가한 후, 볼텍스 혼합하고, 4℃ 마이크로 원심 분리기에서 16,000×g로 3분 동안 원심 분리하여, 핵 단백질을 비롯한 비중이 큰 성분을 침전시킴으로써 백혈구 핵의 유전체 DNA와 핵 단백질을 서로 분리시켰다. 상기 pH 5.2인 3M 소듐 아세테이트 용액을 단백질 침전용 용액으로서 키트화(도1c 참조, 단백질 침전용 용액 키트Ⅲ)하여 실온에서 보관하였다.Step 3: After adding 200 μl of 3M sodium acetate having a pH of 5.2 to the tube from which the nuclei of the leukocyte cells were eluted, vortex-mixed and centrifuged at 16,000 × g for 3 minutes in a 4 ° C. microcentrifuge, the nuclear protein By precipitating a large proportion of components, including the genomic DNA and nuclear protein of the leukocyte nucleus was separated from each other. The 3M sodium acetate solution at pH 5.2 was kitted as a solution for protein precipitation (see FIG. 1C, solution kit III for protein precipitation) and stored at room temperature.
제4단계: 상기 제3단계에서 원심 분리 후의 튜브에 존재하는 상층액을 800㎕ 취하여 또다른 1.5㎖ 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고, 이것에 이소 프로필 알코올을 600㎕ 첨가한 후 잘 혼합하여 유전체 DNA를 침전시켰다. 상기 튜브를 마이크 로 원심 분리기에서 16,000×g로 1분간 원심 분리한 후, 상층액을 조심스럽게 따라 버리고 상기 튜브 바닥에 존재하는 유전체 DNA 펠렛의 손실없이, 흡수지를 사용하여 펠렛 주변의 잔여액까지 완전히 제거하였다. 상기 유전체 DNA 펠렛에 300㎕의 70% 에탄올을 가하고, 상기 튜브를 상하로 수회 흔들어 유전체 DNA 펠렛을 세척하였다. 이를 다시 16,000×g로 1분 동안 원심 분리한 후, 상층액은 따라 버리고 튜브 바닥에 존재하는 유전체 DNA 펠렛 주변의 잔여액은 흡수지로 빨아들여 제거한 후, 실온에서 10분 동안 건조시켰다.Step 4: In the third step, 800 µl of the supernatant present in the tube after centrifugation was transferred to another 1.5 ml microcentrifuge tube, and 600 µl of isopropyl alcohol was added thereto, followed by mixing well to obtain genomic DNA. Precipitated. Centrifuge the tube for 1 min at 16,000 × g in a micro-centrifuge, then carefully decant the supernatant and use sorbent paper to completely remove the residual fluid around the pellet without loss of the genomic DNA pellets present at the bottom of the tube. Removed. 300 μl of 70% ethanol was added to the genomic DNA pellet, and the tube was shaken up and down several times to wash the genomic DNA pellet. After centrifugation for 1 minute at 16,000 x g again, the supernatant was discarded and the remaining liquid around the genomic DNA pellet at the bottom of the tube was removed by absorbing with absorbent paper and dried at room temperature for 10 minutes.
상기 튜브의 바닥에 존재하는 유전체 DNA 펠렛에 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액 및 1.0mM EDTA 혼합액 100㎕를 가하여 유전체 DNA 펠렛을 용해하였다. 상기 용해된 유전체 DNA를 장기간 보관하기 위해 -20~-80℃에 보관하였다. 상기 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 완충 용액 및 1.0mM EDTA 혼합 용액을 유전체 DNA 회수용 TE 완충 용액으로서 키트화(도1d 참조, 유전체 DNA 회수용 TE 완충 용액 키트Ⅳ)하여 실온에서 보관하였다. 상기 총 4단계의 과정을 수행하는 데에는 총 1시간여 소요되었다.The genomic DNA pellet was dissolved by adding 100 μl of a 10 mM pH 8.0 Tris-HCl buffer solution and 1.0 mM EDTA mixture to the genomic DNA pellet at the bottom of the tube. The lysed genomic DNA was stored at -20 ~ -80 ℃ for long term storage. The 10 mM pH 8.0 Tris-HCl buffer solution and 1.0 mM EDTA mixed solution were kitted as TE buffer solution for genomic DNA recovery (see FIG. 1D, TE buffer solution kit IV for genomic DNA recovery) and stored at room temperature. It took a total of about 1 hour to perform the above four steps.
본 발명에 따라, 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출하는 방법으로 수득한 유전체 DNA를 대상으로, 그 순도를 판별하기 위해 하기와 같은 실험을 행하였다.According to the present invention, the following experiments were performed on genomic DNA obtained by a method of extracting genomic DNA from human blood to determine its purity.
실험예1 전기 영동Experimental Example 1 Electrophoresis
0.7% 아가로스 겔 및 1×TBE 완충 용액을 준비하여, 10V/㎝의 전기 영동 조건으로 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA를 전기 영동하였다. 0.5㎍/㎖ 에티 디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후, 300㎚ 자외선 발광기 하에서 폴라로이드 사진으로 촬영하여 전기 영동의 결과를 도2에 나타내었다.A 0.7% agarose gel and 1 × TBE buffer solution were prepared and the electrophoresis of the genomic DNA obtained by the method of the present invention under electrophoresis conditions of 10 V / cm. After staining with 0.5 µg / ml ethidium bromide, the result of electrophoresis was shown in a polaroid photograph under a 300 nm ultraviolet light emitter.
비교예1 전기 영동Comparative Example 1 Electrophoresis
상기 실험예1과 같은 조건 하에서, Sambrook 방법으로 수득한 유전체 DNA 및 상용 유전자 추출용 키트를 이용하여 수득한 유전체 DNA를 대상으로 전기 영동을 실시한 후, 그 결과를 실험예1의 결과와 함께 도2에 나타내었다.Under the same conditions as in Experimental Example 1, electrophoresis was performed on the genomic DNA obtained by the Sambrook method and the commercial DNA extraction kit using the commercial gene extraction kit. Shown in
도2에서, 레인 M은 표준 DNA 마커로서 NEB 2-log DNA ladder를 사용한 사이즈 마커를 나타내고, 레인 1 및 레인 2는 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과를 나타낸다. 또한, 레인 3및 레인 4는 Sambrook 방법으로 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과를 나타내고, 레인 5및 레인 6은 상용 유전자 추출용 키트를 이용하여 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과를 나타낸다.In Fig. 2, lane M shows the size marker using the NEB 2-log DNA ladder as the standard DNA marker, and
도2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과는, 기존의 Sambrook 방법으로 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과나, 상용 유전자 추출용 키트를 이용하여 수득한 유전체 DNA의 전기 영동 결과와 거의 차이를 보이지 않고 깨끗한 단일의 발광선 만을 재현성있게 나타내었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해서도, 단백질, RNA 등의 오염없는 순도 높은 유전체 DNA를 수득할 수 있음을 확인할 수 있다.As shown in Fig. 2, the electrophoresis results of the genomic DNA obtained by the method of the present invention are the electrophoresis results of the genomic DNA obtained by the conventional Sambrook method or the genomic DNA obtained by using a commercial gene extraction kit. There was little difference from the electrophoresis results and only a single clean light emission was reproduced. Therefore, it can be confirmed that even by the method of the present invention, highly contaminated genomic DNAs such as proteins and RNAs can be obtained.
실험예2 제한 효소 절단Experimental Example 2 Restriction Enzyme Cleavage
HindⅢ, MspⅠ, PvuⅡ, RsaⅠ, NotⅠ 및 SacⅠ 등의 제한 효소를 준비하여, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA를 상기 제한 효소들로 처리한 후, 상기 실험예1과 같은 조건하에서 전기 영동하였다. 그 결과를 도3에 나타내었다.Restriction enzymes such as HindIII, MspI, PvuII, RsaI, NotI and SacI were prepared, and the genomic DNA obtained by the method of the present invention was treated with the restriction enzymes, followed by electrophoresis under the same conditions as in Experimental Example 1. The results are shown in FIG.
도3에서, 레인 M은 표준 DNA 마커로서 NEB 2-log DNA ladder를 사용한 사이즈 마커를 나타내고, 레인 1, 레인 2, 레인 3, 레인 4, 레인 5 및 레인 6은 차례대로, HindⅢ, MspⅠ, PvuⅡ, RsaⅠ, NotⅠ 및 SacⅠ를 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA에 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타낸다.In Fig. 3, lane M represents a size marker using the NEB 2-log DNA ladder as a standard DNA marker, and
도3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA를 제한 효소로 처리한 후 전기 영동한 결과는, 표준 DNA 마커와 비교해 보았을때, 상기 유전체 DNA가 상기 제한 효소들에 의해 정확한 위치에서 절단되었음을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 단백질, RNA 등에 의한 오염이나 특정 요인에 의한 변이가 발생하지 않은 순도 높은 유전체 DNA를 수득할 수 있음을 알 수 있다.As shown in Fig. 3, the result of electrophoresis after treatment of the genomic DNA obtained by the method of the present invention with a restriction enzyme showed that the genomic DNA was in the correct position by the restriction enzymes as compared with the standard DNA marker. It can be confirmed that the cut. Therefore, according to the method of the present invention, it can be seen that high-purity genomic DNA can be obtained in which contamination by proteins, RNA, or the like and mutations due to specific factors do not occur.
실험예3 PCR-전기 영동Experimental Example 3 PCR-electrophoresis
본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA에서 CYP450 3A4, 포토리아제(photolyase), RANKL, p53 유전자, 프리제닐린-1(presenilin-1), BRCA2 및 알데히드 데히드로게나제2 위치에 대해 각각 PCR하였다. 1.5% 아가로스 겔 및 1×TBE 완충 용액을 준비하여, 10V/㎝의 전기 영동 조건으로 상기 PCR 결과 산물을 전기 영동한 후, 0.5㎍/㎖ 에티디움 브로마이드로 염색하여 관찰한 결과를 도4에 나타내었다.The genomic DNA obtained by the method of the present invention was PCR for the CYP450 3A4, photolyase, RANKL, p53 gene, presenilin-1, BRCA2 and aldehyde dehydrogenase2 sites, respectively. A 1.5% agarose gel and a 1 × TBE buffer solution were prepared, and the product of the PCR result was subjected to electrophoresis under electrophoresis conditions of 10 V / cm, followed by staining with 0.5 µg / ml ethidium bromide. Indicated.
도4에서, 레인 M은 표준 DNA 마커로서 NEB 2-log DNA ladder를 사용한 사이즈 마커를 나타내고, 레인 1, 레인 2, 레인 3, 레인 4, 레인 5, 레인 6 및 레인 7은 차례로, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA에서 CYP450 3A4, 포토리아제, RANKL, p53 유전자, 프리제닐린-1, BRCA2 및 알데히드 데히드로게나제2 위치에 대한 PCR 후의 전기 영동 결과를 나타낸다,In Figure 4, lane M represents the size marker using the NEB 2-log DNA ladder as the standard DNA marker,
도4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA에서 특이 유전자에 해당하는 부분을 PCR한 후 전기 영동한 결과는, 표준 DNA 마커와 비교해 보았을때 예상되는 정확한 위치에서 뚜렷한 발광을 나타내는 것으로 보아, 상기 유전체 DNA에는 특이 유전자에 해당하는 부분들이 정확하게 존재하며, PCR에 의해서 오염없이 증폭되었음을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 단백질, RNA 등에 의한 오염이 없고, 변이가 발생하지 않은 순도 높은 유전체 DNA를 수득할 수 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 4, the result of electrophoresis after PCR of a portion corresponding to a specific gene in the genomic DNA obtained by the method of the present invention, shows a distinct luminescence at the exact position expected when compared with a standard DNA marker. From the genomic DNA, the parts corresponding to the specific genes are exactly present, and it can be confirmed that the PCR was amplified without contamination. Therefore, according to the method of the present invention, it can be seen that high-purity genomic DNA can be obtained without contamination by protein, RNA, or the like and without mutation.
실험예4 PCR-염기 서열 분석Experimental Example 4 PCR-Base Sequence Analysis
본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA에서 CYP450 3A4, 포토리아제, RANKL, p53 유전자, 프리제닐린-1, BRCA2 및 알데히드 데히드로게나제2 위치에 대해 각각 PCR하였다. 상기 PCR 산물에 대해 염기 서열을 각각 분석하여, 그 결과를 도5a 내지 도5g에 차례로 도시한다.The genomic DNA obtained by the method of the present invention was PCR for the CYP450 3A4, photolyase, RANKL, p53 gene, pregenillin-1, BRCA2 and aldehyde dehydrogenase2 sites, respectively. Each base sequence was analyzed for the PCR product, and the results are sequentially shown in FIGS. 5A to 5G.
도5a 내지 도5g에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 수득한 유전체 DNA를 각각 PCR한 후 상기 PCR 산물에 대한 각 서열 분석한 결과는, 기존에 분석된 각 유전자들의 서열과 오차없이 분석되었고, 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 단백질, RNA 등에 의한 오염이 없고, 변이가 발생하지 않은 순도 높은 유전체 DNA를 수득할 수 있음을 알 수 있다.As shown in Figures 5a to 5g, each of the genomic DNA obtained by the method of the present invention after PCR, the results of each sequence analysis of the PCR product, was analyzed without error with the sequence of each gene analyzed previously, Therefore, according to the method of the present invention, it can be seen that high-purity genomic DNA can be obtained without contamination by protein, RNA, or the like and without mutation.
본 발명에 의하면, 인간의 세포 중에서도 혈액 세포인 백혈구 만을 대상으로 상기 백혈구 핵 내의 유전체 DNA를 추출하고자 하므로, 사용되는 시약을 단순화하고, 또한 시약을 소량 사용함으로써, 경제적이고 간편하게 유전체 DNA를 수득할 수 있다. According to the present invention, since genome DNA in the leukocyte nucleus is to be extracted from only white blood cells, which are blood cells among human cells, genomic DNA can be obtained economically and simply by simplifying the reagents used and by using a small amount of the reagents. have.
또한, 인간 혈액으로부터 유전체 DNA를 추출할 수 있는 시약을 키트화함으로써, 유전체 DNA 추출 단계를 네단계로 간략화하여 보다 신속하게 대량의 시료를 대상으로 유전체 DNA를 추출할 수 있다. 그 결과로서 수득한 유전체 DNA는, 기존의 방법 또는 상용화된 키트를 사용한 것과 다름없는 순도를 가지므로, 유전자 차원의 검사 등에 바람직하게 사용할 수 있다.In addition, by kitting a reagent capable of extracting genomic DNA from human blood, the genome DNA extraction step can be simplified in four steps, and genomic DNA can be extracted from a large volume of samples more quickly. The resulting genomic DNA has a purity that is similar to that of using conventional methods or commercially available kits, and thus can be suitably used for genetic level inspection and the like.
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