KR100560275B1

KR100560275B1 - 케모킨 길항물질로써 아미노 단부가 절두된 ｍｃｐ-2

Info

Publication number: KR100560275B1
Application number: KR1020007003019A
Authority: KR
Inventors: 폴 프루스트; 소피 스투르피; 죠 반다미
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2006-03-10
Also published as: DE69822856D1; JP4233214B2; DE69822856T2; NZ516027A; EP1439231B1; AR013528A1; HUP0003505A2; CZ299479B6; US20050220790A1; DE69838188D1; AU9442098A; NO20001584L; IL135352A; AU750341B2; PL339545A1; WO1999016877A1; AU750606B2; CY1110927T1; HU226414B1; DK1019507T3

Abstract

본 발명은 케모킨 길항 활성을 가지고, 자연 발생적인 MCP-2의 아미노 잔기 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5에 상응하는 NH₂-말단 아미노산이 부족한 아미노-절두된 MCP-2 및 이를 인코드하는 cDNA 서열, 케모킨 효과의 길항 활성을 필요로 하는 질병의 치료 및 진단에 이를 사용하는 것과 이를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.

Description

케모킨 길항물질로써 아미노 단부가 절두된 ＭＣＰ-2{AMINO-TERMINALLY TRUNCATED MCP-2 AS CHEMOKINE ANTAGONISTS}

케모킨은 백혈구세포 화학주성 및 활성화 성질을 가지는 작은 사전-염증성 사이토킨 족으로 구성된다. 처음 사이토킨의 위치에 따라 케모킨 족은 C-C, C-X-C, C-X₃-C 케모킨으로 분류된다(Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997 and Taub D. et al., 1996).

인터루킨-8(IL-8)와 같은 많은 C-X-C이 호중구에 대해 화학주성을 가지나, 단세포 화학주성 단백질-3(MCP-3)와 같은 C-C 케모킨은 단세포, 임파세포, 호산구, 호염기성, NK 세포, 수지상 세포를 포함하는 다양한 백혈구세포에서 활성을 가진다.

케모킨의 NH₂-말단 도메인은 수용체-결합에 관련되고, NH₂-말단 프로세싱으로 케모킨을 활성화시키거나 또는 케모킨을 완전하게 비활성으로 만든다.

C-X-C 케모킨 혈소판 염기성 단백질은 24개 NH₂-말단 잔기를 제거한 후에는 호중구 화학주성 펩티드(NAP-2)가 된다(Walz A. et al., 1989 and Van Damme J. et al., 1990).

IL-8으로부터 최고 8개 NH₂-말단 잔기를 제거하면 화학주성 활성이 강화되지만, 모든 호중구 화학주성 C-X-C 케모킨의 처음 Cys 앞에 있는 Glu-Leu-Arg를 추가로 절단시키면 완전하게 비활성화된다(Clark-Lewis I. et al., 1991).

또 다른 C-X-C 케모킨인 과입세포구 화학주성 단백질-2(GCP-2)를 유사하게 NH₂-말단 단백질 분해(최고 8개 아미노산)하여도 호중구 화학주성 활성에는 영향이 없었다(Proost P. et al., 1993a).

8개 내지 9개의 NH₂-말단 아미노산을 제거한 합성한 C-C 케모킨인, MCP-1, MCP-3, RANTES는 단세포에서는 비활성이고, 이는 수용체 길항물질로 유용하다(Gong J. et al., 1996; and Gong J. et al., 1995).

한 개 메티오닌을 RANTES에 연장시키면, 분자가 완전하게 비활성화되고, Met-RANTES는 고유 RANTES의 길항물질로 작용한다(Proudfoot A.E. et al., 1996).

사람의 MCP-2(Monocyte Chemoattractant Protein-2) 클론은 휴지기의 말초 혈액 임파세포(PBL)와 대비하여 자극을 받은 혈액세포에서 유도된 cDNA 프로브로 차등 라이브러리 스크리닝을 하여 분리하였다(초기에는 "HCl4"로 불리었다, Chang H. C. et al., 1989). cDNA-에서 유도된 단백질 서열은 정제된 천연 MCP-2의 것과 동일하였으나 Gln46가 Lys46를 대체한 가상 대립형질 변이체 또한 분리되었다( (Van Coillie et al., 1997).

MCP-2는 또한 고형상 화학을 이용하여도 합성된 적이 있다(Proost P. et al., 1995).

본 발명의 목적은 케모킨 길항 활성을 가지고, 자연 발생적인 MCP-2의 아미노 잔기 1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5에 상응하는 NH₂-말단 아미노산이 부족한 아미노-절두된 MCP-2이 된다.

좀더 구체적으로는 본 발명의 한 목적은 MCP-2(6-76)로써, 이는 1-5개 NH₂-말단 아미노산이 부족한 MCP-2로써, 이는 도 1 및 서열 3 또는 4에서도 볼 수 있다.

이와 같은 본 발명의 아미노말단이 절두된 MCP-2는 글리코실화된 또는 글리코실화안된 형태가 된다.

"화학주성 길항물질("chemokine antagonist")"이라는 의미는 자연 발생되는 성숙된 완전한 길이를 가지는 케모킨에 대해 길항물질로 작용하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 아미노-말단이 절두된 MCP-2을 코딩하는 DNA로 구성된 DNA 분자로 여기에는 실제 동일한 뉴클레오티드도 포함된다.

"실제 동일한 뉴클레오티드 서열"의 의미에는 주어진 아미노산 서열을 코드하는(유전자 서열의 축중성을 교려하여) 모든 다른 핵산 서열이 포함된다.

본 발명에는 상기 DNA로 구성된 발현벡터, 이와 같은 벡터로 형질변환된 숙주 세포, 본 발명의 이와 같은 아미노-절두된 MCP-2를 준비하는 공정(적절한 배양배지에서 형질변환된 세포를 적절히 배양하는)이 포함된다.

본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 서열은 적절한 플라스미드에 삽입되거나 결찰된다. 일반 만들어지면, 발현벡터는 적절한 숙주세포내로 도입되고, 그 다음 벡터를 발현시켜, 원하는 단백질을 만든다.

본 발명의 임의 재조합 단백질 발현은 적절한 발현벡터를 이용하여 진핵세포(가령, 이스트, 곤충, 포유류 세포) 또는 원핵세포에 영향을 받을 수 있다. 당분야에 공지된 임의 방법을 이용할 수 있다.

예를 들면, 상기 언급한 임의 방법에 의해 얻어진 단백질을 코드하는 DNA 분자는 당분야에 공지의 기술을 사용하여 적절하게 작제된 발현벡터내로 삽입된다(Sambrook et al., 1989). 이중 가닥 cDNA는 호모폴리머 테일링 또는 합성 DNA 링커 또는 평활말단 결찰 기술을 이용한 제한효소 결찰등의 방법을 이용하여 플라스미드 벡터에 결찰되고; DNA 리게이즈를 이용하여 DNA 분자를 결찰시키고, 알칼리 포스포타제를 이용하여 원하지 않는 결합을 방지한다.

원하는 단백질을 발현시키기 위해, 발현벡터는 유전자 발현 및 단백질을 생산할 수 있는 방식으로 원하는 단백질을 코드하는 DNA에 전사 및 해독 조절 정보를 포함하는 특정 뉴클레오티드 서열을 가지고 있어야 한다. 우선, 유전자가 전사되기 위해서는 RNA 폴리메라제가 인지할 수 있는 프로모터로 처리하고, 프로모터에는 폴리메라제가 결합하여, 전사과정을 개시한다.

다양한 효과(강한 프로모터 및 약한 프로모터)를 나타내는 프로모터가 다양하게 많다.

진핵세포의 경우에, 숙주의 성질에 따라 상이한 전사 및 해독 조절 서열이 이용될 수 있다. 이들은 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 원숭이 바이러스등과 같은 바이러스 소스로부터 유도될 수 있는데, 이와 같은 프로모터의 조절 시그날은 발현 수준이 높은 특정 유전자와 연합되어 있다. 예를 들면, 허피스 바이러스(Herpes virus)의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 이스트 gal4 유전자 프로모터등이 된다. 억제 및 활성화를 위해 전사 개시 조절 시그날이 선택되어, 유전자의 발현을 조절한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 분자는 전사 및 해독 조절 시그날을 가지고 있는 벡터로 삽입하고, 이 벡터는 숙주 세포안으로 원하는 유전자 서열을 결합시킬 능력을 가지고 있는 벡터로 삽입한다.

도입된 DNA에 의해 안정적으로 형질변환된 세포는 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 선택할 수 있도록 한가지 이상의 표식을 도입시켜서 선별할 수 있다. 표식은 주광성, 영양요구변이성, 살충제 저항성(가령 항생제), 또는 구리등과 같은 중금속에 대해 제공된다. 선택성 표식 유전자는 발현될 DNA 유전자에 바로 연결될 수 있고 또는 동공 트렌스펙션에 의해 동일한 세포안으로 도입될 수 있다. 본 발명의 단백질이 가장 적절하게 합성될 수 있는데 필요한 추가 원소가 필요할 수도 있다.

특정 플라스미드 또는 바이러스성 벡터를 선택하는데 중요한 인자는 다음과 같다; 벡터를 포함하지 않는 비-수용 세포로부터 벡터를 포함하는 수용세포를 인지하고 선별하는데 용이성; 특정 숙주에서 원하는 벡터의 복사체 수; 상이한 종의 숙주세포간에 벡터가 "셔틀"할 수 있는 지의 여부등이 된다.

일단 DNA 구조체의 발현을 위해 벡터 또는 DNA 서열을 포함하는 구조체를 준비하였을 경우에, 이는 다양한 수단 가령, 형질변환, 트랜스펙션, 접합, 원형질 융합, 전기천공, 인산칼슘-침전, 직접 마이크로인젝션등을 이용하여, 적절한 숙주세포안으로 도입시킨다.

숙주세포는 진핵세포 또는 원핵세포가 될 수 있다. 적절하게는 사람, 원숭이, 생쥐, 차이니즈 햄서터 오버리(CHO)와 같은 포유류 진핵세포와 같은 진핵세포가 되는데, 그 이유는 이들은 단백질 분자가 되기 위한 해독후 변형(가령, 정확한 부위에서 정확한 폴딩 또는 글리코실화반응)을 제공한다. 또한, 이스트 세포는 글리코실화반응을 포함하는 해독후 펩티드 변형을 실행할 수 있다. 여러 가지 재조합 DNA 전략은 강력한 프로모터 서열을 이용하고, 이스트에서 원하는 단백질을 생산하는데 이용할 수 있는 많은 수의 플라스미드를 이용하는 것이다. 이스트는 클론된 포유류 유전자 생성물에서 리더 서열을 인지하고, 리더 서열을 포함하는 펩티드를 분비한다(가령, pre-펩티드).

벡터를 도입시킨 후에, 숙주세포는 선택성 배지에서 생장시키고, 이는 벡터를 포함하는 세포가 생장하는 것을 선별할 수 있다. 클론된 유전자 서열이 발현되면, 원하는 단백질이 만들어진다.

본 발명의 아미노-말단 절두된 MCP-2는 당분야에 공지의 기술을 이용하여 준 비할 수 있는데, 예를 들면, 정립된 화학적 합성 과정으로, 자동화된 고형-상 펩티드 합성기를 이용하고, 크로마토그래피 정제를 한다.

본 발명의 케모킨은 Fmoc(9-플로레닐메톡시카르보닐), tBoc(t-부톡시카르보닐) 또는 다른 아미노산에서 적절한 측쇄 보호기가 있는 또는 없는 다른 필적할만한 화학적 합성물질을 이용하여 합성할 수 있다. 측쇄 보호기가 있는 또는 없는 아미노산은 HBTU/HOBt[2-(1H-벤조트리아졸-1yl)-1,1,3,3-테트라메틸-우라미늄 헥사플로로포스페이트/1-하이드록시벤조트리아졸)로 미리 활성화시키고, 증가되는 펩티드 사슬에 결합시킨다. 잔기를 첨가하기 전에, 보호기(가령, Fmoc)는 α-아미노기로부터 제거한다. 합성을 한 후에, 모든 보호기를 제거하고, 고유 전체 길이를 정제하고, 화학적으로 또는 효소적으로 폴딩시켜(시스테인사슬간에 이왕화결합을 형성하는 것을 포함), 본 발명에 상응하는 케모킨으로 만든다.

이 목적에 적절한 공지의 방법을 이용하여 천연, 합성 또는 재조합 단백질을 정제하는데, 예를 들면, 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 등(Proost P. et al., 1996)의 통상적인 방법을 이용한다. 추가 정제 과정은 본 발명의 단백질을 정제하는데 이용될 수 있는데, 예를 들면, 표적 단백질에 결합하여, 컬럼내에 포함된 겔 매트릭스상에서 생성되고 고정되는 단클론항체를 이용하는 친화력 크로마토그래피 또는 헤파린에 친화력이 있는 크로마토그래피를 이용한다. 단백질을 포함하는 정제안된 준비물은 컬럼을 통과시킨다. 헤파린 또는 특정 항체를 이용하여 단백질이 컬럼에 결합되고, 불순물은 통과된다. 세척을 한 후에, 단백질은 pH 또는 이온강도를 변화시키면서 겔로부터 용출시킨다.

본 발명의 아미노-말단 절두된 MCP-2운 질병의 치료 및 진단에 이용될 수 있는데, 이때 해당되는 질병은 케모킨의 길항활성이 요구되는 질병이 된다. 이와 같은 질병을 예로들면, 염증성 질환, 엔지오제네시스- 조혈 관련된 질병, 종양, 감염성 질환 가령, HIV, 자가-면역 질환, 아테롬성경화증, 폐 질환 및 피부 질환등이 된다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 질병의 치료를 위한 약물을 제조하는데 있어서, 본 발명의 단백질을 이용하는 것을 제공한다.

약물은 한가지 이상의 제약학적 수용가능한 담체 또는 부형제와 함께 본발명의 단백질로 구성된 제약학적 조성물의 형태로 적절하게 제공된다. 이와 같은 제약학적 조성물이 본 발명의 또 다른 측면이 된다.

본 발명의 추가 구체예로는 상기 언급한 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로써 본 발명의 아미노-말단 절두된 MCP-2의 약리학적 활성 양을 이와 같은 질병이 발생할 위험이 있는 환자 또는 이와 같은 병인성을 이미 가지는 환자에 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나, 본 발명을 이에 한정시키고자 함은 아니다. 실시예는 특정 도면과 함께 제공된다.

도 1은 MCP-2의 아미노산 서열 및 이의 알려진 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다. 시그날 서열은 이탤리체로 표시하였고, C-잔기는 굵은 글자로 표시하였다. 화살표는 본 발명의 아미노-말단 절두된 MCP-2(6-76)의 처음 아미노산을 나타 낸다. 밑줄은 MCP-2 변이체와는 다른 아미노산을 나타낸다.

도 2는 아미노-말단 절두된 MCP-2(6-76)의 SDS-PAGE이다.

라인 1은 천연 MCP-2(1-76, 100ng/lane)이다.

라인 2는 천연 MCP-2(1-76, 30ng/lane)이다.

라인 3은 천연 MCP-2(6-76, 30ng/lane)이다.

라인 4는 합성MCP-2(1-76, 60ng/lane)이다.

겔은 변성 조건에서 만든 것이고, 단백질은 은으로 착색한 것이다.

도 3은 변형된 MCP-2형의 화학주성 성향을 비교한 것이다.

THP-1 세포상에서 화학주성 활성에 대해 고유 천연(nat) 및 합성(syn)MCP-2(1-76), NH₂-말단 절두된 천연 MCP-2(6-76) 및 COOH-말단 절두된 합성 MCP-2(1-74)을 테스트한 것이다. 결과는 4개 또는 5개 별개 실험으로부터 평균 CI ±SEM을 나타낸 것이다.

도 4는 천연 MCP-2가 단세포에서 칼슘을 이동시키는데에는 MCP-1보다는 약하였다. 고유 MCP-2(15, 50, 150ng/㎖)는 약량에 따라 THP 세포에서 [Ca²⁺]_i를 증가시켰다. 두 개 실험으로부터 한 가지 대표적인 결과를 나타낸 것이다.

실시예 1; 아미노-말단 절두된 MCP-2

재료 및 방법

케모킨 및 면역검사

MCP-2는 Proost P. et al., 1995에서 설명한 것과 같이 합성 및 정제하였다. 특정 항-사람 MCP-2 Ab는 생쥐에서 구하여, 제조업자가 제공하는 조건을 이용하여 합성 MCP-2가 결합하는 세파로즈 컬럼에서 친화력을 이용하여 정제하였다(CNBr-활성화된 Sepharose 4B, Phharmacia, Uppsala, Sweden).

ELISA 플레이트를 친화력에 의해 정제된 항-사람 MCP-2으로 피복시키고, 바이오티닐화된 항-MCP-2를 포집 Ab로 이용하였다. 과산화효소 라벨된 스트렙타아비딘 및 TMB를 이용하여 감지하였다. MCP-2 ELISA 감지 한계는 약 0.1ng/㎖이 된다.

MCP-2의 생산 및 정제

Blood Transfusion Centers of Antwerp and Leuven(Proost P. et al., 1996)에서 구한 132명의 헌혈자로부터 말초혈액 단핵세포-유도된 조건화된 매체로부터 단세포 화학주성 단백질을 정제하였다.

적혈구 및 과립구 세포는 하이드록시에틸 전분(Fresenius AG, Bad Homburg, Germany)에서 침강 및 메트로조 나트륨염 용액에서 농도차 원심분리를 이용하여 제거하였다(Lymphoprep; Nyegaard, Oslo Norway).

단핵세포(60 ×10⁹ cells)는 10㎍/㎖ Con A 및 2㎍/㎖ LPS와 함께 배양하였다(5 ×10⁶ cells/㎖). 48 내지 120시간 후에, 조건화 배지를 회수하고, 정제하기 까지 -20℃에서 유지시킨다.

천연 MCP-2는 Proost P. et al., 1996에서 설명한 것과 같이 4단계 정제과정을 이용하여 정제하였다.

간단하게 설명하자면, 조건화배지는 조절된 포어 글라스 또는 규산에서 농축시키고, 헤파린-세파로즈 컬럼(Pharmacia)상에서 친화력 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제하였다.

MCP-2 면역반응성을 포함하는 분취물은 Mono S(Pharmacia) 영이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가 정제시키고, pH4.0에서 NaCl 농도차를 이용하여 용출시킨다.

천연 MCP-2는 0.1% 트리플로로아세트산 TFA로 균등화시킨 C-8 Aquapore RP-300 컬럼(Perkin Elmer, Norwalk CT)에서 RP-HPLC를 통하여 균질하게 정제한다.

SDS-PAGE, 아미노산 서열 분석 및 질량 분광분석을 통하여 MCP-형태의 생화학적 특징화

트리스/트리신 겔상에서 변성 상태에서 컬럼 분취물의 순도를 SDS-PAGE에 의해 검사하였다(Proost P. et al., 1996). 단백질은 은으로 착색시키고, 다음과 같은 분자(Mr)표식을 이용하였다; OVA(Mr 45,000), 카르보닉 안하이드라제(Mr 31,000), 콩 트립신 저해제(Mr 21,500), β-락토글로블린(Mr 18,400), 리소자임(Mr 14,400) 및 아프로티닌(Mr 6,500).

정제된 케모킨의 NH₂-말단 서열은 펄스된 액체 477A/120A 단백질 서열화기(Perkin Elmer)와 결합 염기로써 N-메틸피페리딘을 이용하여 Edman 분해에 의해 결정하였다. 50시간 동안 75% 포름산에서 차단된 단백질은 Asp와 Pro사이에서 절단된다. 추가 정제하지 않고, 포름산 절단물을 서열화시킨다.

MCP-2의 분자량은 MALDI/TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight-mass spectrometry)(Micromass TofSpec, Manchester, UK)을 이용하여 결정한다. 알파-시아노-4-하이드록시시나민 산 및 사이토크롬 C를 매트릭스 및 내부 기준으로 각각 이용한다.

화학주성 활성 감지

새로 준비된 단세포(2 ×10⁶ cells/㎖) 또는 단세포 THP-1 세포(0.5 ×10⁶ cells/㎖; 계대배양 후 2일)에서 MCP-2의 화학주성 능력을 시험하였는데 이때 실험은 Boyden 마이크로쳄버에서 5㎛ 포어 크기의 폴리비닐피롤리돈-처리된 폴리카보네이트를 이용한다.

샘플 및 세포는 1㎎/㎖ 사람 혈청 알부민(Red Cross Belgium)가 보충된 HBSS (Life technologies/Gibco BRL, Paisley, Scotland)로 희석시킨다. 37℃에서 2시간 배양 후에, 세포를 고정시키고, Diff-Quick 착색 용액(Harleco, Gibbstown. NJ)으로 착색시킨다음 막을 통하여 이동된 세포는 500배 확대 상태에서 현미경으로 헤아린다.

샘플의 화학주성 지수(CI)(각 쳄버에서 3회 실시)는 기준 배지로 이동된 세포의 수에 대해 샘플로 이동된 세포의 수로 계산된다(Van Damme J. et al., 1992).

감각화 실험을 위해, 세포는 37℃에서 10분간 생물학적으로 활성이 없는 케모킨-변이체로 배양시키고, 이를 Boyden 마이크로쳄버의 상측 웰에 첨가한다. CI의 저해%는 기준 값으로 샘플에 대해 HBSS 처리된 세포에서 CI를 이용하여 계산한 다.

세포 내에 Ca ₂ ⁺ 농도 감지

세포내 칼슘 농도([Ca²⁺ ]_i)는 Wuyts A. et al., 1997에서 설명하는 것과 같이 측정하였다. 정제된 단백질 또는 THP-1 세포(10⁷ cells/㎖)는 Eagle's 최소 필수 배지(EMEM, Gibco) + 0.5% FCS와 형광 지시물질 fura-2(fura-2/AM 2.5 μM; Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands), 0.01% Pluronic F-127 (Sigma, St Louis MO)가 보충된 배지에서 배양시켰다.

37℃에서 30분 후에, 세포는 2회 세척시키고, 10⁶ cells/㎖에서 HBSS, 1mM Ca²⁺, 0.1% FCS(pH7.4에서 10mM Hepes/NaOH로 완충시킨)로 재현탁시킨다. 세포는 10분간 37℃에서 균등화시키고, fura-2 형광은 LS50B 발광 분광광도계(Perkin Elmer)에서 측정하였다.

340㎚ 및 380㎚에서 여기후에, 510㎚에서 형광을 감지하였다. [Ca²⁺]i는 Grynkiewicz 식(Grynkiewicz et al, 1985)을 이용하여 계산하였다. R_max를 결정하기 위해, 세포는 50μM 디지토닌으로 용해시켰다. 연속하여, pH는 20mM Tris를 이용하여 8.5로 조정하였고, R_min 는 용해된 세포에 10mM EGTA을 첨가하여, 수득된다. 이용된 K_d는 224nM이다.

감광화 실험을 위해, 단세포 또는 THP-1 세포는 우선 다른 농도의 완충액, 케모킨 또는 케모킨 길항물질로 자극을 준다. 제 2 자극에서, MCP-2는 완충액으로 미리 자극을 시킨 후에, [Ca²⁺]_i에서 농도를 증가시키면서 이용된다. 제 2 자극은 처음 자극을 준 후 2분경에 실시한다. 제 2 자극에 상응하게 [Ca²⁺]_i 의 저해 비율이 증가되는데, 이는 완충액을 첨가한 후에 시그날로 케모킨 또는 케모킨 길항물질로 미리 침전시킨 후에 시그날을 비교하여 계산한다.

결과

해독후 변형된 MCP-2 형의 분리

특정한 감응성이 있는 ELISA를 이용하여 미토겐 및 엔도톡신에 의해 자극을 받은 말초 혈약 단핵세포에 의매 만들어지는 상이한 MCP-2를 추적한다.

표준 분리 과정(Proost P. et al., 1996)을 이용하여 조건화된 배지를 정제하였는데, 이 방법에는 조절된 포어 글래스에 흡착 및 헤파린 세파로즈 크로마토그래피 방법이 포함된다.

결과적으로, FPLC 모노 S 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 실행하고, C-8 RP HPLC를 이용한 추가 정제 단계를 실행한다. SDS-PAGE 및 MALDI/TOF-MS를 이용하여 분자량을 측정하였다.

다른 형태의 MCP-2를 분리하였다. 고유의 7.5 kDa MCP-2(1-76)에 추가하여, NH₂-말단 절두된 7 kDa의 MCP-2(5개 잔기가 없는) 즉, [MCP-2(6-76)]는 RP-HPLC에 의한 균질성으로 정제하였고, 아미노산 서열 분석으로 확인하였다(도 2). MALDI/TOF-MS(표 I).에서는 고유 MCP-2의 분자량이 8881Da인데(이론적으로는 Mr 8893 Da), MCP-2(6-76)는 분자량이 8365Da으로 나타나, 이는 5개의 NH₂-말단 아미노산이 결손되었다는 것을 확인시켜주는 것이다(이론적인 분자량은 Mr 8384Da). THP-1 화학주성 검사에서 이들 MCP-2형의 기능을 비교하면, 고유 MCP 2는 5ng/㎖에서도 활성이 있지만, 절두된 MCP-2(6-76)는 농도가 0.6 내지 60ng/㎖에서 테스트하였을 경우에 화학주성 활성이 상실된 것으로 나타났다(도. 3). 고유 천연 MCP-2는 합성 MCP-2(1-76)과 두 개 잔기가 없는 COOH-말단 절두된 합성 형, [mcp-2(1-74)](Proost P. et al., 1995)과 능력을 비교하였다.

이와 같은 형태의 최소 효과적인 화학주성 농도는 5ng/㎖로 나타났다(도 3). 화학주성 검사에서 천연 고유 MCP-1와 MCP-2의 특이적인 활성은 필적할만한 것이나(Van Damme J, et al., 1992), MCP-2의 칼슘 이동 능력은 여전히 문제가 있다.

그러나, Ca²⁺ -이동 실험에서, 두가지 천연 및 합성 MCP-2(1-76)에 대한 최소 효과적인 약량은 천연 고유 MCP-1(1-76)(도 5)의 것과 비교하였을 경우에 10배 이상 높았고, MCP-2(6-76)의 경우는 비활성인 상태를 유지하였다.

그럼에도 불구하고, 고유 MCP-2(50ng/㎖)는 MCP-2(15ng/㎖) 및 MCP-3(10ng/㎖)를 감광화시키는 능력이 있어, 각각 화학주성이 52% 및 45% 저해를 받았다.

Ca²⁺ 검사에서 MCP-2의 낮은 특이 활성으로 인하여, MCP-2(6-76)에 의해 화학 주성 감광화는 Boyden 마이크로쳄버에서 실시하였다. 고유 MCP-2는 단세포 화학주성 검사(Sozzani S. et al., 1994)에서 활성 MCP-1, MCP-2, MCP-3와 교차-감광화를 하는 것으로 보고되었기 때문에, 우리는 천연 비활성 MCP-2(6-76)가 MCP-1, MCP-2, MCP-3, RANTES에 대해서도 감광화시키는지를 조사하였다(표 2). 100ng/㎖ 비활성 MCP-2(6-76)로 THP-1 세포를 미리-배양시키면 10ng/㎖ MCP-1(63%), 5ng/㎖ MCP-2(75%), 30ng/㎖ MCP-3(62%), 100ng/㎖ RANTES(75%)에 의한 화학주성이 상당히 저해를 받을 것이다. 또한, 각 MCP에 대해 3배 낮은 농도에서 화학주성은 100ng/㎖ MCP-2(6-76)에 의해 거의 완전하게(91-100%) 저해를 받았다. 또한, 10ng/㎖과 같은 낮은 농도에서, MCP-2(6-76)는 여전히 MCP-1(3ng/㎖), MCP-2(1.5ng/㎖), MCP 3(10ng/㎖), RANTES(30ng/㎖)에 의해 유도되는 화학주성 활성을 상당히 저해할 수 있었다. 이를 고려하면, MCP-2(6-76)는 자연적으로 만들어지는데, 이는 화학적 유인물질에 비활성이고, 몇 가지 C-C 케모킨에 길항을 하고, 이 효과는 MCP-3에서 가장 우세한 것이다.

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Claims

케모킨 길항 활성을 가지고, 자연 발생적인 MCP-2(Monocyte Chemolactic Protein-2)의 아미노 잔기 1-5에 상응하는 NH₂-말단 아미노산이 아미노-절두되며, 이와 같이 절두된 서열은 SEQ ID NO.3 또는 SEQ ID NO. 4의 서열중 하나가 되는 것을 특징으로 하는 아미노-말단 절두된 MCP-2.
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제 1 항에 있어서, 단백질 전사후 변형에 의해 글리코실화된 형태인 것을 특징으로 하는 아미노-말단 절두된 MCP-2.
제 1 항 또는 제 4 항에 따른 아미노-말단 절두된 MCP-2를 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 5 항의 DNA 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6 항의 발현벡터로 형질변환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항 또는 제 4 항의 아미노-말단 절두된 MCP-2를 생산하는 방법에 있어서, 제 7 항의 형질변환된 숙주 세포를 배양 배지에 배양시켜 벡터에 인코드된 단백질을 발현시키는 것으로 구성된 아미노-말단 절두된 MCP-2 생산 방법.
약물로 이용할 수 있는 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 아미노-말단 절두된 MCP-2.
제 1 항 또는 제 4 항에 따른 아미노-말단 절두된 MCP-2단백질을 활성 성분으로 하고, 한 가지 이상의 제약학적 수용 가능한 담체 또는 부형제로 구성된 케모킨 효과의 길항 활성을 필요로 하는 염증성 질환, HIV-감염, 앙지오제네시스, 조혈-관련 질병 및 종양에서 선택된 질병의 치료 또는 진단용 약학 조성물.
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