KR100555299B1 - Culture medium of Phellinus gilvus containing sawdust and method for artificially culturing Phellinus gilvus using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마른진흙버섯 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 인공재배하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 톱밥을 주성분으로 포함하는 마른진흙버섯 균사체 및 자실체 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 마른진흙버섯의 종균을 배양하여 균사체를 얻는 단계; 상기 마른진흙버섯 균사체로부터 마른진흙버섯의 자실체 원기를 형성시키는 단계; 및 상기 자실체 원기로부터 자실체를 생육시키는 단계를 포함하는 마른진흙버섯의 인공재배 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 인공 재배하면 기존의 원목을 이용한 재배 방법에 비해 수확량이 증대되고 재배 소요일수가 감소하기 때문에 우수한 약리효과를 가지는 마른진흙버섯을 대량으로 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a dry mud mushroom culture medium and a method for artificially cultivating dry mud mushrooms using the medium, and more specifically, to a dry mud mushroom mycelium and fruiting body culture medium and sawmedium containing sawdust as a main component Culturing the spawn of the dry mud mushrooms using to obtain a mycelium; Forming a fruiting body of the dried mud mushroom from the dried mud mushroom mycelium; And it relates to a method of artificial cultivation of dried mud mushrooms comprising the step of growing fruiting bodies from the fruiting body origin. Artificial cultivation of dried mud mushrooms using the medium of the present invention can be useful for producing large amounts of dried mud mushrooms having excellent pharmacological effects because the yield is increased and the number of days of cultivation is reduced compared to the conventional methods for cultivating solid wood have.
Description
도 1은 톱밥 배지의 조성을 달리한 본 발명의 톱밥 배지를 이용하여 마른진흙버섯 균사체를 배양중인 사진이다.1 is a photograph of culturing dried mud mushroom mycelium using the sawdust medium of the present invention, the composition of the sawdust medium is different.
A: 참나무 톱밥 100%, B: 참나무톱밥 95% +미강 5%,A: 100% oak sawdust, B: 95% oak sawdust + 5% rice bran,
C: 참나무톱밥 90% +미강 10%, D: 참나무톱밥 85% +미강 15%,C: oak sawdust 90% +
E: 참나무톱밥 80% +미강 20%, F: 참나무톱밥 75% +미강 25%,E:
G: 참나무톱밥 70% +미강 30%G: oak sawdust 70% + rice bran 30%
도 2는 참나무 원목 및 톱밥 배지의 조성을 달리한 본 발명의 톱밥 배지를 이용하여 재배한 마른진흙버섯 자실체의 생육된 형태를 나타낸 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the grown form of dried mud mushroom fruiting body cultivated using the sawdust medium of the present invention, the composition of solid oak and sawdust medium.
A: 참나무 원목, B: 참나무 톱밥 100%,A: solid oak, B: 100% oak sawdust,
C: 참나무톱밥 95% +미강 5%, D: 참나무톱밥 90% +미강 10%,C: oak sawdust 95% +
E: 참나무톱밥 85% +미강 15%, F: 참나무톱밥 80% +미강 20%,E: oak sawdust 85% + rice bran 15%, F:
G: 참나무톱밥 75% +미강 25%G: oak sawdust 75% +
도 3은 본 발명의 톱밥 배지를 이용하여 배양한 마른진흙버섯의 자실체로부터 증류수를 이용하여 추출한 추출물의 항암 활성을 원목재배된 마른진흙버섯의 자실체 증류수 추출물의 항암 활성과 비교한 그래프이다.Figure 3 is a graph comparing the anticancer activity of the extract from the fruiting body distilled water extracts of the dried mud mushrooms of the wood cultivation using the distilled water from the fruiting body of dried mud mushrooms cultured using the sawdust medium of the present invention.
도 4a는 본 발명의 톱밥 배지를 이용하여 배양한 마른진흙버섯의 자실체로부터 20%, 40% 및 60% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물의 항암 활성을 원목재배된 마른진흙버섯 자실체 에탄올 추출물의 항암 활성과 비교한 그래프이다.Figure 4a is the anticancer activity of the ethanol extract of dried mud mushroom fruiting body ethanol extract of wood cultivation using 20%, 40% and 60% ethanol from the fruiting body of dried mud mushroom cultured using the sawdust medium of the present invention It is a graph comparing.
도 4b는 본 발명의 톱밥 배지를 이용하여 배양한 마른진흙버섯의 자실체로부터 80% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물의 항암 활성을 원목재배된 마른진흙버섯 자실체 에탄올 추출물의 항암 활성과 비교한 그래프이다.Figure 4b is a graph comparing the anticancer activity of the extract extracted with 80% ethanol from the fruiting body of dried mud mushrooms cultured using the sawdust medium of the present invention and the anticancer activity of the dried mud mushroom fruiting body ethanol extract of wood.
도 5는 본 발명의 톱밥 배양 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 배양하는 과정을 나타낸 공정도이다.5 is a process chart showing a process of culturing dried mud mushrooms using the sawdust culture medium of the present invention.
본 발명은 마른진흙버섯 배양용 배지 및 이를 이용한 마른진흙버섯의 재배방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 톱밥을 주성분으로 포함하는 마른진흙버섯 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 인공재배하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a medium for culturing dried mud mushrooms and a method of cultivating dried mud mushrooms using the same, and more specifically, to a method of cultivating dried mud mushrooms containing sawdust as a main component and artificially culturing dried mud mushrooms using the medium. It is about how to.
마른진흙버섯(Phellinus gilvus)은 상황버섯이라고도 불리며, 민주름버섯목(Aphylophorales), 소나무비닐버섯과(Hymenochaetaceae), 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색 부후균으로 주로 참나무, 뽕나무와 같은 활엽수에 발생하는데, 표고버섯 재배시 참나무 골목에 발생하여 병을 일으킨다(차 등, 1994, 최신버섯재배기술, 농진회, 325p). 마른진흙버섯의 자실체는 코르크질로 단년생 또는 다년생으로 알려져 있으며, 나무에 부착된 편반구형으로 보통 상하가 서로 연결되어있는 군생형으로 발생하고, 크기는 지름 5 내지 12 cm 정도이다. 자실체의 상층표면은 암황갈색으로 융모가 있고, 가장 자리는 갓에 비해서 색이 엷으며, 관공의 표면은 암자갈색으로 mm당 6 내지 8개가 있고, 포자는 4 내지 5 ×3 내지 3.5 ㎛로 타원형이며, 표면은 평활하다고 알려져 있다(Ryvardan, L., 1993, Europeon Polypores, Fungiflora, Norway).Phellinus gilvus, also known as situation mushroom, is a white fungus belonging to Aphylophorales, Hymnenochaetaceae and Phellinus , which occurs mainly on hardwoods such as oak and mulberry. However, shiitake mushroom cultivation occurs in oak alleys and causes disease (Tea et al., 1994, Latest Mushroom Cultivation Technology, Nongjinhoe, 325p). The fruiting bodies of dried mud mushrooms are known as perennial or perennial cork, and occur in a hemispherical shape attached to a tree, usually in a colony type, in which upper and lower sides are connected to each other, and the size is about 5 to 12 cm in diameter. Upper surface of fruiting body is dark yellowish brown with villi, edges are lighter in color than lampshade, and the surface of duct is dark brown with 6 to 8 per mm, spores are 4 to 5 × 3 to 3.5 ㎛ Surface is known to be smooth (Ryvardan, L., 1993, Europeon Polypores, Fungiflora, Norway).
마른진흙버섯은 위암, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암을 비롯한 간암의 절제 수술후 화학요법을 병행할 때 면역기능을 항진시키는 것으로 알려져 예로부터 귀중한 한약재로 사용되었다. 또한, 자궁출혈 및 대하, 월경불순, 장출혈, 오장 및 위장 기능을 활성화시키고 해독작용을 한다. 이케가와 등(Ikegawa et al., Gann, 59, 155, 1968)은 마른진흙버섯이 구름버섯(Coriolus versicolor)과 표고버섯(lentinus edodes)보다 종양 저지율이 높다고 보고하였으며, 메다 등(Protein Nucleic acid Enzyme, 21, 426, 1976)은 항암활성이 96.7%라고 보고하였다. 또한, 정 등(약학회지, 38, 158, 1994)은 균사체의 단백다당체가 육종(Sarcoma)180 복수암 및 고형암을 효과적으로 억제한다고 하였으며, 김 등(Arch. Pharm. Res., 17, 337, 1994)은 항종양 활성을 갖는 다당류를 분석한 결과, 글루코스가 주를 이루고 있으며, 이외에 갈락토스, 만노스, 아라비노스 등으로 이루어져 있다고 보고하였다. 그리고, 공 등(생약학회지, 22, 233, 1991)은 마른진흙버섯 균사체의 열수 추출물이 NK 세포 기능에 작용하여 숙주세포의 비특이적 면역능을 증강시킴으로써 항암활성을 나타내며, 또한 마우스에 투여한 결과 LD50이 1,500 ㎎/㎏ 이상으로 나타나 안정성이 있다고 보고하였다.Dry mud mushrooms have been used as a valuable herbal medicine since they have been shown to enhance immune function when combined with chemotherapy following resection of liver cancer including gastric cancer, esophageal cancer, duodenal cancer, colon cancer, and rectal cancer. In addition, it activates and detoxifies uterine bleeding and treatment, dysmenorrhea, intestinal bleeding, intestinal and gastrointestinal functions. (Ikegawa et al ., Gann , 59, 155, 1968) reported that dried mud mushrooms had higher tumor retardation rate than cloud mushrooms ( Coriolus versicolor ) and shiitake mushrooms ( lentinus edodes ), and protein nucleic acid. Enzyme , 21, 426, 1976) reported an anticancer activity of 96.7%. In addition, Chung et al. ( Journal of Pharmacy , 38, 158, 1994) reported that the protein polysaccharide of mycelium effectively inhibits Sarcoma 180 ascites and solid cancer, and Kim et al . ( Arc. Pharm. Res ., 17, 337, 1994). ) Analyzed the polysaccharides having antitumor activity and reported that glucose is the main ingredient, and that it consists of galactose, mannose, and arabinose. Then, the ball, etc. (Journal of Medicinal Plants, 22, 233, 1991) by a hot-water extract of the dry mud mushroom mycelium by acting on NK cell function, enhance non-specific immunity of the host cell exhibits anticancer activity, and the results of administration to the mouse LD 50 This appeared to be 1,500 mg / kg or more and reported that there was stability.
이와 같이 마른진흙버섯이 항암활성과 면역증강 효과가 우수하다고 보고된 이후 국내에서도 민방에서 항암치료를 위해 마른진흙버섯을 고가로 시판하고 있다. 그러나, 자연산 마른진흙버섯은 희귀하며 가격 또한 매우 고가이기 때문에 입수하기가 곤란한 것으로 알려져 있으며, 산지와 종균에 따라 약리효과도 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 마른진흙버섯을 인공재배하려는 연구가 많이 이루어지고 있다.As described above, dry mud mushrooms have been reported to be excellent in anticancer activity and immune enhancing effect. In Korea, dried mud mushrooms are commercially available at high prices for anticancer treatment. However, natural dry mud mushrooms are known to be difficult to obtain because they are rare and very expensive, and pharmacological effects are also known to vary depending on the region and spawn. Thus, a lot of research has been done to artificially cultivate dried mud mushrooms.
종래의 마른진흙버섯 인공재배는 통상 균주를 확보하고, 균사체 배양배지에서 균주로부터 균사체를 배양한 다음, 자실체 형성 배지에서 상기 균사체로부터 자실체를 형성시켜 마른진흙버섯을 생육시키는 순서로 재배된다.Conventional dry mud mushroom cultivation is usually grown in order to secure a strain, cultivate the mycelium from the strain in a mycelium culture medium, and then form a fruiting body from the mycelium in the fruiting body forming medium to grow the dry mud mushroom.
마른진흙버섯의 균주는 야생 마른진흙버섯을 채취하여 이로부터 균주를 얻거나, 미생물 기탁 연구 기관으로부터 균주를 분양받아 사용하는 방법이 있다. 그러나, 야생 마른진흙버섯은 마찬가지로 자연계에 적게 분포하고, 발생수가 적기 때문 에 이로부터 종균을 얻는 것이 쉽지 않아서 통상 국내의 특정 종균배양소로부터 종균을 구입하여 사용하는 실정이다.As a strain of dried mud mushrooms, there is a method of harvesting wild dried mud mushrooms to obtain a strain therefrom or using a strain obtained from a microbial deposit research institution. However, wild dry mud mushrooms are similarly distributed in the natural world, and because of the low number of occurrences, it is not easy to obtain the seed from them, and the situation is usually used to purchase the seed from a specific seed culture center in Korea.
마른진흙버섯의 균사체 배양배지는 영양공급원으로서 뽕나무 또는 참나무를 주성분으로 하여 기타 다른 나무들을 톱밥상태로 만든 후 여기에 쌀겨 등을 첨가하여 준비한다. 이러한 배양배지는 마른진흙버섯이 충분히 생장할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기질원 등을 공급하여 주는 역할을 하므로 이들의 적당한 배합비율은 최종 생장된 마른진흙버섯의 질과 생장속도에 많은 영향을 미친다. 균사체를 배양하기 위한 종래의 배양배지는 뽕나무 톱밥을 30%로 하여 여기에 쌀겨를 10% 첨가한 것을 기본으로 하고 미루나무나 참나무 또는 오리나무를 각각 30% 정도 배합한 후 여기에 물을 공급하여 조성한다. 경우에 따라서는 쌀을 주성분으로한 순수한 식용 곡류만을 사용하기도 한다. 그리고, 이러한 배지성분을 저장하는 배양용기로는 유리나 플라스틱 또는 폴리 프로필렌(PP)으로 만들어진 병모양의 것이 많이 사용되고 있다.The mycelial culture medium of dried mud mushrooms is prepared by adding mulberry or oak as sawdust to other trees, and adding rice bran to it. The culture medium serves to supply carbon source, nitrogen source and mineral source so that the dry mud mushrooms can grow sufficiently, and their proper mixing ratio greatly affects the quality and growth rate of the dried mud mushroom. Conventional culture medium for cultivating mycelium is based on the addition of 10% of rice bran to mulberry sawdust 30%, and mixes about 30% of cottonwood, oak or alder and supplies water to it. To create. In some cases, only pure edible grains based on rice are used. In addition, as a culture vessel for storing such a medium component, a bottle-shaped one made of glass, plastic, or polypropylene (PP) is frequently used.
마른진흙버섯의 균사체가 충분히 배양되면 이를 자실체 형성 배양배지로 옮겨자실체를 형성시킴으로써 양질의 마른진흙버섯을 생산할 수 있다. 현재까지 자실체를 형성하기 위한 배양 배지로는 원목을 주로 사용한다. 그러나, 실제 인공재배시 자실체의 형성은 어려운 점이 많기 때문에 균사체들이 뭉친 균막 제품이 민간에서 거래되고 있으며, 일부 인공 재배한 버섯이 고가에 거래되고 있는 실정이다. 그러나, 아직까지는 마른진흙버섯을 재배하기 위한 기술이 일반적으로 이루어지고 있지 않은 실정이며, 원목배양시의 관리가 까다로와 오염이 쉽다는 단점이 있다.When the mycelium of dried mud mushrooms is sufficiently cultured, it is possible to produce good quality mud mushrooms by forming the fruiting bodies by transferring them to the fruiting body-forming culture medium. To date, wood is mainly used as a culture medium for forming fruiting bodies. However, since the formation of fruiting bodies during the artificial cultivation is difficult, many of the biofilms in which the mycelium is agglomerated are traded in the private sector, and some artificially grown mushrooms are sold at high prices. However, up to now, the technique for cultivating dry mud mushrooms is not generally made, and there is a disadvantage in that the management of timber cultivation is difficult and pollution is easy.
이에 본 발명자들은 우수한 약리효과를 가진 마른진흙버섯을 인공 배양하여 대량으로 생산하기 위해 실제 버섯으로 생장하게 하는 과정인 자실체 형성 과정에 사용되는 배양 배지를 개선시키기 위해 노력하던 중 기존에 사용하는 원목 대신에 톱밥 배양 배지를 사용해 인공재배한 결과 기존의 원목 재배에 비해 자실체의 형성이 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors tried to improve the culture medium used in the fruiting body formation process, which is the process of growing artificial mushrooms to artificially cultivate a large amount of dried mud mushrooms having excellent pharmacological effect and produce a large amount of wood instead of the conventional wood. As a result of artificial cultivation using a sawdust culture medium, the present invention was completed by confirming that the formation of fruiting bodies is superior to that of conventional wood cultivation.
본 발명의 목적은 톱밥을 주성분으로 포함하는 마른진흙버섯 균사체 및 자실체 배양용 배지를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a medium for culturing dried mud mushroom mycelium and fruiting body containing sawdust as a main component.
본 발명의 다른 목적은 상기 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 인공재배하는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method for artificially cultivating dried mud mushrooms using the medium.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 톱밥을 주성분으로 포함하는 마른진흙버섯 균사체 및 자실체 배양용 배지를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a dry mud mushroom mycelium and fruiting body culture medium containing sawdust as a main component.
또한, 본 발명은In addition, the present invention
1) 상기 배지를 이용하여 마른진흙버섯의 종균을 배양해 균사체를 얻는 단계; 및1) culturing the spawn of the dry mud mushroom using the medium to obtain a mycelium; And
2) 상기 배지를 이용하여 상기 마른진흙버섯의 균사체로부터 마른진흙버섯 자실체를 배양하는 단계를 포함하는 마른진흙버섯을 배양하는 방법을 제공한다.2) provides a method of culturing dried mud mushrooms comprising culturing dried mud mushroom fruiting bodies from the mycelium of the dried mud mushrooms using the medium.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 톱밥을 주성분으로 포함하는 마른진흙버섯 균사체 및 자실체 배양용 배지를 제공한다.The present invention provides a dry mud mushroom mycelium and fruiting medium culture medium containing sawdust as a main component.
본 발명의 배지에 있어서, 톱밥의 재료로 사용되는 원목은 참나무, 뽕나무, 느릅나무 및 사과나무로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 참나무(Quercus sp.)를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 수액의 이동이 정지된 11월경부터 이듬해 2월 사이에 벌채된 참나무 원목을 사용하였으며, 벌목한 참나무 원목을 음지에서 건조하여 수분함량이 35 내지 45%일 때 톱밥 제조기를 사용하여 톱밥을 제조하였다. 제조된 톱밥은 무균상태를 유지하기 위해 121℃에서 90분간 고압살균하였다.In the medium of the present invention, the wood used as the material of the sawdust can be selected from the group consisting of oak, mulberry, elm and apple, it is preferable to use oak ( Quercus sp .). In the present invention, oak logs were harvested between November and February of the year when the movement of the sap was stopped, and the oak logs were harvested by drying the oak logs in the shade and using a sawdust maker when the moisture content is 35 to 45%. Prepared. The prepared sawdust was autoclaved at 121 ° C. for 90 minutes to maintain aseptic status.
본 발명의 배지는 주요성분으로 톱밥을 사용하며, 이에 추가로 영양원을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 한다. 상기 영양원으로는 미강, 밀기울, 콘코브, 왕겨 및 땅콩껍질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 미강인 것이 더욱 바람직하다.The medium of the present invention is characterized in that the sawdust is used as a main component, it is prepared by further mixing the nutrient source. The nutrient source is preferably at least one selected from the group consisting of rice bran, bran, corn cob, rice hull and peanut shell, and more preferably rice bran.
본 발명에서는 톱밥에 미강을 혼합하여 배양배지를 제조하였으며, 톱밥과 미강은 8:2 내지 10:0의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 참나무 톱밥과 미강을 각각 10:0, 9.5:5, 9:1, 8.5:1.5, 8:2, 7.5:2.5, 7:3의 비율로 혼합하여 톱밥 배지를 제조하였으며, 이를 이용하여 마른진흙버섯을 배양한 결과, 10:0 내지 8:2의 비율로 혼합하여 제조한 배지에서의 종균 생장속도가 우수함을 확인하여 참나무 톱밥과 미강의 혼합비율은 10:0 내지 8:2의 비율로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.In the present invention, a culture medium was prepared by mixing rice bran with sawdust, and sawdust and rice bran are preferably mixed at a ratio of 8: 2 to 10: 0. In the present invention, oak sawdust and rice bran were mixed in a ratio of 10: 0, 9.5: 5, 9: 1, 8.5: 1.5, 8: 2, 7.5: 2.5, 7: 3, respectively, to prepare a sawdust medium. As a result of culturing dried mud mushrooms, it was confirmed that the spawn growth rate was excellent in the medium prepared by mixing at a ratio of 10: 0 to 8: 2, and the mixing ratio of oak sawdust and rice bran was 10: 0 to 8: 2. It was found that mixing is preferred.
또한, 본 발명은In addition, the present invention
1) 본 발명의 톱밥을 함유하는 배지로 마른진흙버섯의 종균을 배양하여 균사체를 얻는 단계;1) culturing the spawn of the dry mud mushroom with a medium containing the sawdust of the present invention to obtain a mycelium;
2) 단계 1의 균사체를 본 발명의 톱밥을 함유하는 배지로 배양하여 자실체 원기를 형성시키는 단계; 및2) culturing the mycelium of step 1 in the medium containing the sawdust of the present invention to form fruiting body primitive; And
3) 단계 2에서 형성된 자실체 원기를 본 발명의 톱밥을 함유하는 배지로 배양하여 자실체를 생육시키는 단계를 포함하는 마른진흙버섯의 인공재배 방법을 제공한다.3) It provides an artificial cultivation method of dried mud mushrooms comprising culturing the fruiting body raw material formed in step 2 to the medium containing the sawdust of the present invention to grow fruiting bodies.
본 발명의 인공재배 방법에 있어서, 단계 1의 마른진흙버섯의 종균을 배양하는 것은 본 발명의 톱밥 배양 배지를 사용하여 온도 25 내지 30℃로 25 내지 30일간 배양하는 것이 바람직하다.In the artificial cultivation method of the present invention, culturing the seed mite of the dry mud mushroom of step 1 is preferably incubated for 25 to 30 days at a temperature of 25 to 30 ℃ using the sawdust culture medium of the present invention.
또한, 단계 2의 자실체 원기를 형성시키는 것은 본 발명의 톱밥 배양 배지를 사용하여 습도 90% 이상, 온도 22 내지 27℃로 약 15일간 배양하는 것이 바람직하다.In addition, it is preferable to incubate the fruiting body of step 2 for about 15 days at a humidity of 90% or more and a temperature of 22 to 27 ° C using the sawdust culture medium of the present invention.
또한, 단계 3의 자실체를 생육시키는 것은 본 발명의 톱밥 배양 배지를 사용 하여 습도 70 내지 85%, 온도 25 내지 32℃에서 배양하는 것이 바람직하다.In addition, the growth of the fruiting body of step 3 is preferably cultured at a humidity of 70 to 85%,
본 발명의 마른진흙버섯 인공재배 방법을 자세히 설명하면 하기와 같으며, 제조 과정은 도 5에 간략하게 도시하였다.Detailed description of the dried mud mushroom artificial cultivation method of the present invention is as follows, the manufacturing process is briefly shown in FIG.
<제 1 공정> 종균의 준비<First step> Preparation of spawn
마른진흙버섯 원균을 무균상에서 PDA, MEA 배지 등에 이식한 다음 배양온도 25 내지 30℃의 항온기에서 10 내지 15일간 균사배양을 완료시킨다. 121℃에서 90분간 고압살균된 참나무톱밥 + 미강(8:2) 톱밥배지에 배양된 마른진흙버섯균을 이식한다. 균 이식이 완성된 톱밥종균은 온도 25 내지 30℃에서 25 내지 30일간 종균배양한다.The dry mud fungi were sterilely implanted in PDA, MEA medium, and the like, followed by completion of mycelial culture for 10 to 15 days in an incubator at a culture temperature of 25 to 30 ° C. After transplanting autoclaved oak sawdust + rice bran (8: 2) sawdust medium at 121 ℃ for 90 minutes, cultivate dried mud mushrooms. Sawdust spawn complete with germ transplantation is spawned for 25 to 30 days at a temperature of 25 to 30 ° C.
<제 2 공정> 배지재료준비(톱밥, 미강)<Step 2> Preparation of medium material (sawdust, rice bran)
배지 주재료로 사용한 나무는 참나무(Quercus sp.)로 이를 톱밥과 원목으로 사용한다. 원목의 벌채는 수액의 이동이 정지된 11월경부터 이듬해 2월 사이에 벌채된 것을 사용하며 벌목후 음지에서 자연건조한다. 원목은 수분함량이 35 내지 45%일 때 지름 12 내지 15 cm, 길이 20 cm(약 900 g) 정도로 절단하여 사용하며, 톱밥재배용 톱밥은 톱밥제조기로 제조하여 3개월정도 야적한 후 사용하고 첨가제로서는 신선하게 건조된 미강을 사용한다.The wood used as the main media is oak (Quercus sp.), Which is used as sawdust and logs. Log felling is used between November and February of the next year when the movement of sap is stopped, and it is naturally dried in the shade after logging. Solid wood is cut to 12 to 15 cm in diameter and 20 cm in length (about 900 g) when the water content is 35 to 45%. Sawdust for sawdust cultivation is manufactured with a sawdust maker and used after a three-month dead stock. Use freshly dried rice bran.
<제 3 공정> 배지제조 및 살균<Step 3> Production and Sterilization of Medium
마른상황버섯 배지제조시 주재료인 참나무톱밥(수분조절전 중량 900g)에 영양원으로 미강을 부피비율(V/V)로 각 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%씩 첨가하여 균일하게 혼합한다. 배지의 수분함량을 65%로 조절한다음 내열성 폴리프로필렌 봉지에 약 2 kg씩 넣고 마개를 닫아 이를 121℃에서 90분간 고압살균한다. 종균 접종전에 고압살균된 배지를 15℃ 정도로 식힌다.0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30 each of rice bran as a nutrient source in oak sawdust (900g before moisture control), the main ingredient in the production of dried mushroom medium Add by% and mix uniformly. After adjusting the water content of the medium to 65%, put about 2 kg in a heat-resistant polypropylene bag and close the stopper and autoclave it at 121 ℃ for 90 minutes. The autoclaved medium is cooled to 15 ° C. before the seed inoculation.
<제 4 공정> 종균접종 및 배양<Step 4> spawn inoculation and culture
무균실이나 무균상에서 제1공정에서 배양된 마른진흙버섯종균을 15℃로 유지되는 접종실에서 살균, 냉각이 완료된 톱밥배지에 접종한다. 접종방법은 톱밥배지2 kg당 종균을 100 g 정도 넣는다. 이때 내열성비닐봉지를 열고 닫는 작업은 노출시간이 최대한 적게 가능한 빨리 실시하여 잡균에 의해 오염되지 않도록한다. 접종이 끝난 톱밥배지는 온도 20 내지 25℃로 유지되는 배양실에서 25 내지 30일간 배양을 실시한다. 배양시 초기에는 온도를 20 내지 22℃ 정도로 7일 정도 유지한다음 마른진흙버섯균이 톱밥배지에 활착된 다음부터는 25℃ 정도에서 배양을 실시한다.The dry mud mushroom spawn grown in the first step in a clean room or aseptic phase is inoculated into a sawdust medium which has been sterilized and cooled in an inoculation room maintained at 15 ° C. Inoculation method is about 100g of spawn per 2kg sawdust medium. At this time, the opening and closing of the heat-resistant plastic bag should be carried out as soon as possible with the minimum exposure time to prevent contamination by various germs. Sawdust medium after the inoculation is incubated for 25 to 30 days in a culture chamber maintained at a temperature of 20 to 25 ℃. At the beginning of the cultivation, the temperature is maintained at about 20 to 22 ° C. for about 7 days, and then, after the dry mud mushrooms adhere to the sawdust medium, the culture is performed at about 25 ° C.
<제 5 공정> 버섯자실체 발이유도<Fifth Step> Induction of Mushroom Fruits
자실체 발생을 위한 토질은 배수 및 수분유지에 유리한 모래를 선택하며 재배사는 영지버섯재배사를 기준으로 설치한다. 버섯 종균의 배양이 완료되면 톱밥 배지중에서 오염된 배지를 선별하여 폐기한다. 즉, 배양실에서 균사배양이 완료된 배지를 상층부로부터 약 70% 제거한후 충분히 관수하여 버섯발생을 유도한다. 버섯자실체 형성 유도를 위해 습도 90%이상, 온도 22 내지 27℃정도에서 약 15일간 관리하는데 이 시기에 마른진흙버섯의 자실체원기가 형성되며, 자실체원기의 형성을 확인한 다음 습도 70 내지 85%, 온도 25 내지 32℃의 조건으로 버섯생육을 진행한다.Soil for the generation of fruiting body selects sand that is favorable for drainage and water retention, and growers are installed based on the Ganoderma lucidum grower. After incubation of the mushroom spawn, the contaminated medium is selected from the sawdust medium and discarded. That is, after the mycelia culture is completed in the culture chamber, about 70% of the medium is removed from the upper layer, and then sufficiently watered to induce mushroom development. In order to induce the formation of mushroom fruit body, it is maintained for about 15 days at humidity above 90% and temperature of about 22 to 27 ℃. At this time, the fruiting body origin of dried mud mushroom is formed. Mushroom growth is carried out under the conditions of 25 to 32 ℃.
<제 6 공정> 자실체 생육 및 수확<Step 6> fruiting body growth and harvest
마른진흙버섯 자실체 원기가 발생하고, 정상적으로 생육이 진행되면 40 내지 60일 정도 되었을때 갓 직경이 3 내지 10 cm 정도로 생장하며, 생육중인 자실체의 가장자리는 노랑색을 나타내고 생장이 거의 완성된 자실체는 노랑색이 사라지고 자실체가 암갈색으로 되는데 이때 버섯을 수확하여 40 내지 50℃ 건조기에서 2 내지 3일간 버섯을 건조한다.Dry mud mushroom fruit body freshness occurs, and when normal growth progresses, it grows about 3 to 10 cm in diameter when it is about 40 to 60 days, and the edge of growing fruit body is yellow, and the growing fruit body is almost yellow. It disappears and the fruiting body becomes dark brown. At this time, the mushrooms are harvested and the mushrooms are dried for 2 to 3 days in a 40 to 50 ° C. dryer.
본 발명의 톱밥 배양 배지를 사용하여 배양된 마른진흙버섯은 기존의 원목을 사용하여 배양된 마른진흙버섯에 비해 균사의 생장 속도가 약 2배 정도 빠를 뿐만 아니라(표 3 참조), 자실체의 생산 효율도 2배 이상 향상되었다(표 4 참조). 또한, 배양된 버섯 자실체의 일반성분 및 원소성분도 그대로 유지되었다(표 2 및 표 5 참조).Dry mud mushrooms cultivated using the sawdust culture medium of the present invention is not only about twice as fast as the mycelial growth rate compared to the dried mud mushrooms cultivated using conventional wood (see Table 3), the production efficiency of fruiting bodies Figure 2 is improved more than 2 times (see Table 4). In addition, the general and elemental components of the cultured mushroom fruiting body were also maintained (see Table 2 and Table 5).
아울러, 마른진흙버섯은 항암 활성을 가지고 있다고 밝혀져 있는데, 본 발명 의 톱밥 배양 배지를 사용하여 배양된 마른진흙버섯 자실체로부터 물 또는 에탄올을 이용하여 추출한 추출물은 원목 배지를 사용하여 배양된 마른진흙버섯 자실체의 추출물에 비해 훨씬 높은 항암활성을 나타냄을 확인하였다(도 3, 도 4a 및 도 4b 참조).In addition, the dry mud mushrooms have been found to have anti-cancer activity, the extract extracted with water or ethanol from the dried mud mushroom fruiting body cultured using the sawdust culture medium of the present invention is dried mud mushroom fruiting body cultured using the wood medium It was confirmed that the anticancer activity is much higher than the extract of (see Fig. 3, 4a and 4b).
따라서, 기존의 원목을 이용한 재배방법에 비해 톱밥 배양배지를 이용하여 인공재배하는 본 발명의 방법을 이용하면 수확량 증대 및 재배소요일수 단축 효과를 볼 수 있으며, 톱밥 배양배지를 이용한 재배는 원목을 이용한 재배와는 달리 작업과정 상당부분을 기계화 가능하고, 1년에 동일장소에서 2 내지 3기작 재배가 가능하기 때문에 다양한 약리효과를 가지는 마른진흙버섯을 대량으로, 저렴한 비용으로 생산할 수 있다.Therefore, using the method of the present invention artificially cultivated using a sawdust culture medium compared to the conventional cultivation method using the wood can be seen to increase the yield and shorten the number of days required, cultivation using sawdust culture medium using wood Unlike cultivation, much of the working process can be mechanized, and two to three machines can be cultivated in the same place a year, so that dry mud mushrooms having various pharmacological effects can be produced in large quantities at low cost.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 마른진흙버섯 종균의 배양Example 1 Cultivation of Dry Mud Mushroom Seedling
<1-1> 마른진흙버섯균의 배양적 특성 조사<1-1> Culture characteristics of dried mud mushrooms
마른진흙버섯 원균(Phellinus gilvus)(생명공학연구원 유전자은행 KCTC 6653)을 5 mm 원형 × 5 mm 두께로 PDA(MERCK), MEA(MERCK), YEA(MERCK) 또는 Czapek(MERCK) 배지 20 ㎖에 이식한 다음 배양온도 10 내지 35℃의 항온기에서 10 일간 균사 배양하였다. 각 배양배지에서 균사를 배양한 후 배양 배지 및 배양 온도에 따른 균사 생장량을 측정하였다.Phellinus gilvus (KCTC 6653), 5 mm round × 5 mm thick, was transplanted into PDA (MERCK), MEA (MERCK), YEA (MERCK) or Czapek (MERCK) medium Then, mycelial incubation for 10 days in a thermostat of 10 to 35 ℃ culture temperature. After the mycelia were cultured in each culture medium, the mycelial growth was measured according to the culture medium and the culture temperature.
그 결과, 마른진흙버섯 균사는 PDA, MEA 배지에서 생육이 양호하며, 배양온도는 25 내지 30℃에서 생육이 가장 빠르다는 것을 알 수 있었다(표 1).As a result, it was found that the dry mud mushroom mycelium grows well in PDA and MEA medium, and the fastest growing temperature is 25 to 30 ° C. (Table 1).
<1-2> 마른진흙버섯의 종균 배양<1-2> spawn culture of dried mud mushrooms
종균 배양 배지로는 121℃에서 90분간 고압살균한 참나무(Quercus sp.)의 톱밥과 미강을 혼합하여 사용하였다. 대조군으로는 참나무 원목을 사용하였다. 참나무 원목의 벌채는 수액의 이동이 정지된 11월경부터 이듬해 2월 사이에 벌채된 것을 사용하였으며 벌목후 음지에서 자연건조하였다. 원목의 절단은 수분함량이 35 내지 45%일 때 지름 12 내지 15 cm, 길이 20 cm(약 900 g) 정도로해서 사용하였으며, 톱밥재배용 톱밥은 톱밥제조기로 제조하여 3개월 정도 야적한후 사용하였고, 첨가한 미강은 신선하게 건조된 미강(칠곡농약사, 정미소)을 사용하였다. 먼저 종 균 배양용 배지의 주성분인 참나무톱밥과 미강의 이화학적 성분을 분석하였다. 성분의 이화학적 분석은 농촌진흥청의 토양이화학분석법(한기학, 1988)에 따라 수행하였다. CaO, MgO, K2O는 조제된 공시시료 10 g을 삼각 플라스크에 평량한 후 0.1 N HCl 용액 50 ㎖을 가하고, 상온에서 회전진탕기로 1시간 동안 진탕한 후에 여과지로 여과한 다음 그 여액을 원자흡수분광기(Atomic Absorption Spectrophotometer)(Perkin Elmer 2380)로 측정하였다. 전탄수화물은 티우린법(Tyurin)으로, 전질소는 젤달법(Kjeldahl)으로, P2O5는 비색법으로, pH는 건조시료 5 g을 증류수 25 ㎖에 30분간 침적시킨 후 pH 미터(Fisher model-50)로 분석하였(한기학, 1988, 토양이화학분석법, 농촌진흥청, 26~214).As a seed culture medium, sawdust and rice bran of autoclaved oak (Quercus sp.) Were used at 90 ° C. for 90 minutes. Oak wood was used as a control. Logging of oak logs was used between November and February of the next year when the movement of sap was stopped, and was naturally dried in the shade after logging. When cutting the wood, the water content was 35 to 45%, and the diameter was 12 to 15 cm and the length was 20 cm (about 900 g). The sawdust for the sawdust was manufactured using a sawdust maker and used after 3 months of unloading. The added rice bran was freshly dried rice bran (chilgok pesticide, rice mill). First, physicochemical components of oak sawdust and rice bran were analyzed. Physicochemical analysis of the components was carried out according to the Soil Physicochemical Analysis (Han Ki-hak, 1988). CaO, MgO, and K 2 O were weighed out in 10 g of the prepared sample in an Erlenmeyer flask, and then 50 ml of 0.1 N HCl solution was added.Then, the mixture was shaken with a rotary shaker at room temperature for 1 hour, filtered through filter paper, and the filtrate It was measured by an Atomic Absorption Spectrophotometer (Perkin Elmer 2380). Total carbohydrates were Tiurin method, total nitrogen was Geljal method, P 2 O 5 was colorimetric method, pH was immersed 5 g of dry sample in 25 ml of distilled water for 30 minutes and then pH meter (Fisher model) -50) (Han Ki Hak, 1988, Soil Physicochemical Analysis , Rural Development Administration, 26 ~ 214).
그 결과, T-C는 참나무톱밥(32.2%)과 미강(38.9%)이 비슷하였고, T-N은 미강(2.2%)이 참나무톱밥(0.58%)보다 더 높았으며, C/N비는 참나무톱밥이 32.2%, 미강이 17.7%로 나타났고, P2O5, MgO, K2O는 미강이 참나무톱밥보다 많이 함유하고 있었다(표 2).As a result, TC was similar in oak sawdust (32.2%) and rice bran (38.9%), and TN was higher in rice bran (2.2%) than oak sawdust (0.58%) and C / N ratio was 32.2% in oak sawdust. , the rice bran showed a 17.7%, P 2 O 5, MgO, K 2 O were rice bran contains more than oak sawdust (Table 2).
상기에서 tr은 함유량이 극미하여 측정할 수 없음을 나타낸다.In the above, tr indicates that the content is extremely small and cannot be measured.
배지 조성물의 함유량을 측정한 뒤 참나무톱밥과 미강을 혼합하여 종균 배양용 배지를 제조하였다. 참나무톱밥(수분조절전 중량 900 g)과 영양원인 미강을 각각 100:0, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 및 70:30의 부피비(v/v %)로 균일하게 혼합하였다. 배지의 수분함량을 65%로 조절한다음 내열성 폴리프로필렌 봉지에 약 2 kg씩 넣고 마개를 닫아 이를 121℃에서 90분간 고압살균하였다. 종균 접종전에 고압살균된 배지가 15℃ 정도가 되도록 식혔다. 이렇게 제조된 각각의 톱밥 배지 2 kg에 PDA 또는 MEA 배지에서 25 내지 30℃로 10일간 균사 배양한 원균 100 g을 접종하였다. 접종시 내열성비닐봉지를 열고 닫는 작업은 노출시간이 최대한 적도록 가능한 빨리 실시하여 잡균에 의해 오염되지 않도록 하였다. 접종이 끝난 톱밥배지는 온도 20 내지 25℃로 유지되는 배양실에서 25 내지 30일간 배양을 실시하였다. 배양시 초기에는 온도를 20 내지 22℃ 정도로 7일정도 유지하였으며, 마른진흙버섯균이 톱밥배지에 활착된 다음부터는 25℃ 정도에서 배양하였다. 또한, 대조군으로는 참나무 원목에 상기 원균을 이식하여 약 56일 동안 배양하였다. 배양후 각 배양배지에 따른 마른진흙버섯 균사의 밀도를 측정하여 균사 생장 속도를 확인하였다.After measuring the content of the medium composition, oak sawdust and rice bran were mixed to prepare a seed culture medium. Volumetric ratios of oak sawdust (900 g before moisture control) and rice bran as nutrients were 100: 0, 95: 5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 and 70:30, respectively (v / v%). Mixed uniformly). The moisture content of the medium was adjusted to 65%, and then, about 2 kg were added to the heat-resistant polypropylene bag, and the stopper was closed. The solution was autoclaved at 121 ° C. for 90 minutes. The autoclaved medium was cooled to about 15 ° C. before spawn inoculation. 2 g of each sawdust medium thus prepared was inoculated with 100 g of prokaryotic mycelial culture at 25 to 30 ° C. for 10 days in PDA or MEA medium. Opening and closing the heat-resistant plastic bag during inoculation was carried out as soon as possible to minimize the exposure time to prevent contamination by various bacteria. After inoculation, the sawdust medium was cultured for 25 to 30 days in a culture chamber maintained at a temperature of 20 to 25 ℃. Initially, the temperature was maintained at about 20 to 22 ° C. for about 7 days, and the dried mud mushrooms were cultivated at sawdust medium and then cultured at about 25 ° C. In addition, as a control, the prokaryote was transplanted to oak logs and incubated for about 56 days. After incubation, the mycelial growth rate was confirmed by measuring the density of dried mud mushroom mycelia according to each culture medium.
그 결과, 본 발명에서 제조한 톱밥배지에 따른 배양완성일수는 25 내지 30일로 대조군인 원목배지의 배양완성일수 56일보다 배양소요일수가 약 1/2로 단축되었 다. 같은 배양일수 25일 내지 30일에서도 원목배지의 균사밀도보다 더 높게 나타났다. 균사의 생장 속도는 미강 5% 및 10% 함유 톱밥배지가 25일로 가장 빨랐다. 또한, 균사의 밀도는 미강을 20% 및 25% 함유하는 톱밥배지가 높은 것으로 나타나 미강의 첨가밀도가 높아질수록 균사밀도도 높아짐을 알 수 있었다. 그러나, 미강 30%를 함유하는 톱밥배지는 푸른곰팡이(Trichoderma sp.)에 모두 오염되었다. 이는 배지내 영양성분 과다로 오염병원균의 서식이 용이한 것으로 판단되었다(표 3 및 도 1).As a result, the number of days of culture completion according to the sawdust medium prepared in the present invention is 25 to 30 days, the number of culture days required to reduce the number of days required to cultivation than 56 days of the control medium wood medium was reduced to about 1/2. The same culture days 25-30 days were higher than the mycelial density of wood medium. The growth rate of mycelia was the fastest with 25 days of sawdust medium containing 5% and 10% of rice bran. In addition, the density of hyphae was high in sawdust medium containing 20% and 25% of rice bran, and the higher the added density of rice bran, the higher the mycelial density. However, sawdust medium containing 30% of rice bran was contaminated with blue fungus ( Trichoderma sp.). This was judged to be easy to inoculate contaminating pathogens due to excessive nutrients in the medium (Table 3 and Figure 1).
* 균사밀도 : ++ = 저, +++ = 중, ++++ = 고* Mycelial density: + + = low, + + + = medium, + + + + = high
<실시예 2> 톱밥 배지를 이용한 마른진흙버섯 자실체의 배양Example 2 Cultivation of Dry Mud Mushroom Fruiting Body Using Sawdust Medium
실시예 1에서 마른진흙버섯 종균의 배양을 완료한 뒤 톱밥배지중에서 오염된 배지를 선별하여 폐기하였다. 자실체 배양을 위한 토질은 배수 및 수분유지에 유 리한 모래를 선택하였으며, 재배사는 영지버섯 재배사를 기준으로 설치하였다. 배양실에서 균사배양이 완료된 후 내열성 폴리프로필렌 봉지의 상층부로부터 약 70%의 배지를 제거한 후 충분히 관수하여 버섯 발생을 유도하였다. 버섯자실체 형성 유도를 위해 습도 90% 이상, 배양 온도 22 내지 27℃정도에서 약 15일간 배양하여 마른진흙버섯의 자실체가 원기를 형성하도록 하였다. 자실체의 원기 형성을 확인한 다음 습도 70 내지 85%, 온도 25 내지 32℃의 조건으로 버섯생육을 진행하였다. 마른진흙버섯 자실체 원기가 형성되고 정상적으로 생육이 진행되면 40 내지 60일 정도 될때에 갓 직경이 3 내지 10 cm 정도로 생장하며, 생육중인 자실체의 가장자리는 노랑색을 나타내고 생장이 거의 완성된 자실체는 노랑색이 사라지고 자실체가 암갈색으로 되는데 이때 버섯을 수확하여 40 내지 50℃ 건조기에서 2 내지 3일간 버섯을 건조하였다. 버섯이 생산되고 난뒤 초발이 소요일수, 자실체 생체중(g), 자실체 건물중(g)을 측정하여 배양배지에 따른 버섯 자실체의 생산효율을 확인하였다.After completion of the incubation of the dry mud mushroom spawn in Example 1, the contaminated medium in the sawdust medium was selected and discarded. The soil for cultivation of fruiting body was selected sand that is free for drainage and water retention, and the grower was installed based on the Ganoderma lucidum grower. After the mycelial culture was completed in the culture chamber, about 70% of the medium was removed from the upper layer of the heat-resistant polypropylene bag, and then sufficiently watered to induce mushroom development. To induce mushroom fruit body formation, the fruit body of the dried mud mushroom was incubated for about 15 days at a humidity of 90% or higher and a culture temperature of 22 to 27 ° C. for about 15 days. After confirming the primordial formation of the fruiting body, mushroom growth was carried out under the conditions of humidity of 70 to 85%,
그 결과, 내열성 폴리프로필렌 봉지를 제거하고 관수로 버섯발생을 유도한후 버섯원기가 형성되는 초발이 소요일수는 톱밥배지 처리별로 11 내지 13일로 나타나 대조군인 원목배지 배양에서의 초발이 소요일수 12일과 비슷하였다. 또한, 대조군인 원목 배지에서의 생체중은 231 g, 건물중은 38.7 g, 생산효율은 25.6%로 나타난 것에 비해 미강을 10% 첨가한 톱밥배지의 생체중은 577 g, 건물중은 97 g, 생산효율은 64.1%로 나타나 참나무 원목을 그대로 사용하는 것 보다는 톱밥배지를 사용하 는 것이 생산효율이 높았으며, 톱밥 배지에 포함되는 미강은 0 내지 20% 부피비로 함유되는 것이 생산효율이 좋았다(표 4 및 도 2). 따라서, 도 2에서 보는 바와 같이 참나무 원목 배지를 이용하여 재배한 마른진흙버섯에 비해 톱밥 배양배지(톱밥 자체 또는 미강 첨가 배지)를 이용하여 재배한 마른진흙버섯의 자실체 생체중이 훨씬 커서 수확량이 우수함을 알 수 있다.As a result, the number of days required for the initial development of mushroom base after removing the heat-resistant polypropylene bag and inducing mushroom generation by irrigation was 11 to 13 days for each sawdust medium treatment. Similar. In addition, 231 g, 38.7 g of dry weight, and 25.6% of production efficiency in control wood logs, 577 g of sawdust medium with 10% of rice bran, 97 g of dry weight, and production efficiency. 64.1% showed higher production efficiency than using oak logs as it was, and rice bran contained in sawdust medium contained 0 to 20% by volume ratio (Table 4 and 2). Therefore, as shown in Figure 2, compared to the dry mud mushrooms cultivated using the oak wood medium medium, the fruit body weight of the dried mud mushrooms cultivated using the sawdust culture medium (sawdust itself or rice bran added medium) is much larger, the yield is excellent Able to know.
상기에서 a = (자실체 생체중/배지재료 건물중) ×100A = (fruiting body weight / medium material building) × 100
<실시예 3> 톱밥 배지 배양된 마른진흙버섯의 구성성분 조사Example 3 Investigation of Components of Dry Mud Mushroom Cultured in Sawdust Medium
이에, 경북농업기술원에서 2 내지 5개월 동안 톱밥으로 재배된 마른진흙버섯(P. gilvus)과 3년에 걸쳐 재배된 고려상황버섯(P. linteus) 및 장수상황버섯(P. baumii)의 원소 함량의 구성비를 비교하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 품종별 진흙버섯에 대한 자실체의 원소함량은 탄소가 45.6% 내지 46.8%, 산소 가 40.1% 내지 42.1%, 수소가 5.3% 내지 5.5%, 질소가 0.8% 내지 1.2%, 황은 분석되지 않아 등으로 버섯간의 차이점은 발견되지 않았고, 또한, 원목재배한 진흙버섯과도 성분 함량이 거의 동일하였다. 또한, 일반성분을 분석한 결과를 표 6에 나타내었다. 마른진흙버섯의 수분 함량은 10%로 가장 적은 수분의 함량을 나타내었으며 총식이섬유는 29% 내지 33%를 보여주어 품종 간에 차이점을 보여주지 않았다. 또한, 조회분, 단백질, 비타민 C 등 모든 함량 비교에서 뚜렷한 차이점을 보이지는 않았다. 따라서, 톱밥배지로 재배하여도 마른진흙버섯의 일반성분 및 원소성분은 그대로 유지됨을 알 수 있었다.Therefore, considering the situation of the mushroom (P. linteus) and long life situation mushroom (P. baumii) grown over at Kyungpook National Agricultural Technology 2-5 months dry mud mushroom (P. gilvus) grown in sawdust and three years The results are shown in Table 5 by comparing the composition ratio of the element content. Elemental contents of fruiting body for varieties of mud mushrooms were 45.6% to 46.8%, 40.1% to 42.1% oxygen, 5.3% to 5.5% hydrogen, 0.8% to 1.2% nitrogen, and no sulfur was analyzed. No difference was found, and the content of the ingredients was almost the same as that of the wood-grown mud mushrooms. In addition, the results of analyzing the general components are shown in Table 6. The moisture content of dried mud mushrooms was 10%, showing the lowest water content, and the total dietary fiber showed 29% to 33%, showing no difference among the varieties. In addition, there were no significant differences in all the content comparisons, including ash, protein, and vitamin C. Therefore, even when grown in sawdust medium, the general components and elemental components of the dried mud mushrooms were found to remain as it is.
상기에서 ND는 검출되지 않은 것을 나타낸다.In the above, ND indicates that it was not detected.
<실시예 4> 톱밥 배지 배양된 마른진흙버섯의 항암활성Example 4 Anticancer Activity of Dried Mud Mushroom Cultured in Sawdust Medium
톱밥 배지에서 배양된 마른진흙버섯 자실체로부터 추출물을 분리하여 항암활성을 측정하였다. 먼저 상황버섯 자실체를 잘게 부순후 30배 부피의 멸균증류수를 첨가하여 추출하였다. 추출후 10배로 감압농축을 실시한후 0.45 마이크론 필터로 여과하였다. 필터된 상황버섯 농축액의 총당을 측정하기 위해 안스론 방법(Anthrone method)을 실시하였다(Pons A, et al., J Biochem Biophys Methods, 1981, Mar, 4(3-4):227-31; Pollard MA, et al., Caries Res, 1996, 30(2):132-7). 항암활성을 측정하기 위해 마우스 유래 암세포인 육종고형암(sarcoma) 180 세포(한국세포주은행, KCLB 40066)와 p388 세포(한국세포주은행, KCLB 10046)를 이용하고 SRB 분석법과 MTT 분석법을 이용하였다. 우선 SRB 방법은 세포의 증식 정도만을 측정할 수 있으며, MTT 방법은 세포가 대사과정을 거친 후 그 증식 정도를 알 수 있는 방법으로 이것이 이 두 실험 방법의 차이점이다.Anticancer activity was measured by extracting the extract from dried mud mushroom fruiting body cultured in sawdust medium. First, the situation mushroom fruiting body was finely crushed and extracted by adding 30-fold volume of sterile distilled water. After extraction, the product was concentrated under reduced
<4-1> SRB 분석<4-1> SRB Analysis
먼저 SRB(sulforhodamine B) 방법을 수행하였다. 암세포를 96웰 플레이트에 웰 당 3 만개 정도 접종을 한 후 24시간 동안 RPMI 배지(GIBCO)에서 배양을 하였다. 배양된 암세포에 마른진흙버섯, 고려상황버섯 및 장수상황버섯의 자실체로부터 증류수로 추출한 추출물을 각각 7.5, 15 및 30 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 비교군으로 항암제의 일종인 독소루비신(Ildong Pharm., Korea)은 0.001, 0.01, 0.1, 1 또는 10 μM 농도로 처리하였다. 각 시료를 세포에 처리한 후 48시간 동안 암세포를 더 배양한 뒤 50% TCA(SIGMA)를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 세포를 고정시켰다. 고정 후 증류수로 5회 정도 플레이트를 세척하고 공기건조 시켰다. 공기건조 후 0.4 % SRB 염색약(SIGMA)을 첨가하여 30분 동안 염색하였다. 염색이 종료된 후 1% 아세틱산으로 5회 세척하고 공기건조하였다. 공기건조 후 트리스염(Tris base)을 첨가하여 염색약을 녹여내었다. 그 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 암세포의 생존정도를 측정하였다.First, a sulforhodamine B (SRB) method was performed. Cancer cells were inoculated in a 96 well plate about 30,000 per well and then incubated in RPMI medium (GIBCO) for 24 hours. Cultured cancer cells were treated with extracts of distilled water from fruiting bodies of dried mud mushroom, Korean mushroom and longevity mushroom at concentrations of 7.5, 15 and 30 ㎍ / ml, respectively. In comparison, doxorubicin (Ildong Pharm., Korea), a type of anticancer agent, was treated at a concentration of 0.001, 0.01, 0.1, 1 or 10 μM. Each sample was treated with cells and then cultured with cancer cells for 48 hours, and then the cells were fixed at 4 ° C. for 2 hours by adding 50% TCA (SIGMA). After fixing, the plate was washed 5 times with distilled water and air dried. After air drying, 0.4% SRB dye (SIGMA) was added and stained for 30 minutes. After the dyeing was completed, washed 5 times with 1% acetic acid and air dried. After air drying, Tris salt was added to dissolve the dye. Thereafter, the absorbance was measured at 490 nm to determine the survival of cancer cells.
그 결과, 비교군으로 항암제인 독소루비신은 처리 농도가 증가함에 따라 암세포의 세포생존률이 감소하는 경향을 나타내었으며, 톱밥배지에서 배양한 마른진흙버섯과 함께 상황버섯의 일종인 고려상황버섯과 장수상황버섯 추출물 모두도 처리농도가 증가함에 따라 암세포의 세포생존률이 감소하였다(표 7). 따라서, 톱밥배지에서 배양한 마른진흙버섯은 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.As a result, doxorubicin, an anticancer agent, showed a tendency to decrease the cell viability of cancer cells as the concentration of treatment increased, along with dried mud mushrooms cultured in sawdust medium, Korea mushroom and longevity mushroom Both extracts also decreased the cell viability of cancer cells as the treatment concentration increased (Table 7). Therefore, it was found that the dry mud mushrooms cultured in sawdust medium exhibited anticancer activity.
<4-2> MTT 분석<4-2> MTT analysis
다음으로 MTT 분석 방법을 수행하였다(Cross P, et al.,Radiat Oncol Investig, 1994, 1:261-269). 암세포를 96웰 플레이트에 웰당 5천개 정도 접종한 후 톱밥 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯, 고려상황버섯, 장수상황버섯의 자실체로부터 물로 추출한 추출물을 각각 7.5, 15 및 30 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 비교군으로 항암제의 일종인 독소루비신을 0.001, 0.01, 0.1, 1 또는 10 μM 농도로 처리하였다. 처리후 4일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)를 각 웰에 접종하고 4시간 더 배양하였다. 배양이 종료된 후 플레이트를 5분 동안 450 ×g에서 원심분리하고 플레이트에 있는 배지를 주의 깊게 제거한 뒤 DMSO 150 ㎕를 첨가하였다. DMSO를 첨가한 후 MTT 시약에 있는 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 녹이기 위해 약 10분 동안 배양하였다. 그 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 암세포의 생 존정도를 측정하였다.Next, MTT analysis was performed ( Cross P, et al., Radiat Oncol Investig , 1994, 1: 261-269). After inoculating about 5,000 cells per well into a 96 well plate, cancer extracts were extracted with water from fruiting bodies of dried mud mushrooms, Korean mushrooms, and longevity mushrooms grown in sawdust culture medium at 7.5, 15, and 30 ㎍ / ml, respectively. In the comparison group, doxorubicin, a type of anticancer agent, was treated at a concentration of 0.001, 0.01, 0.1, 1 or 10 μM. Incubated for 4 days after treatment. After the incubation, MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) was inoculated into each well and incubated for 4 hours. After the incubation was completed, the plate was centrifuged at 450 xg for 5 minutes, the medium in the plate was carefully removed, and 150 μl of DMSO was added. After adding DMSO, the cells were incubated for about 10 minutes to dissolve formazan crystal in MTT reagent. After that, the absorbance at 490 nm was measured to determine the survival of cancer cells.
그 결과, 비교군으로 항암제인 독소루비신은 처리 농도가 증가함에 따라 암세포의 세포생존률이 감소하는 경향을 나타내었으며, 톱밥배지에서 배양한 마른진흙버섯과 함께 상황버섯의 일종인 고려상황버섯과 장수상황버섯 추출물 모두도 처리농도가 증가함에 따라 암세포의 세포생존률이 감소하였다(표 8). 따라서, 톱밥배지에서 배양한 마른진흙버섯은 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.As a result, doxorubicin, an anticancer agent, showed a tendency to decrease the cell viability of cancer cells as the concentration of treatment increased, along with dried mud mushrooms cultured in sawdust medium, Korea mushroom and longevity mushroom Both extracts also decreased the cell viability of cancer cells as the treatment concentration increased (Table 8). Therefore, it was found that the dry mud mushrooms cultured in sawdust medium exhibited anticancer activity.
<4-3> 원목 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 증류수 추출물과의 항암 활성 비교<4-3> Comparison of Anticancer Activity with Distilled Water Extract of Dried Mud Mushrooms Grown in Wood Culture Medium
톱밥 배양배지에서 배양한 마른진흙버섯 자실체의 항암활성을 참나무 원목에 서 배양한 마른진흙버섯 자실체의 항암활성과 비교하기 위해 마른진흙버섯 자실체로부터 증류수를 이용하여 추출물을 제조하여 항암 활성을 측정하였다. 톱밥 배양배지 또는 원목 배양배지에서 생산된 마른진흙버섯 자실체에 30배 분량의 증류수를 첨가하여 8시간동안 추출하여 마른진흙버섯 증류수 추출물을 제조하였다. 각 증류수 추출물을 18.75, 37.5, 75, 150 및 300 ㎍/㎖ 농도로 육종고형암 180 암세포에 처리하여 SRB 분석 방법으로 항암활성을 측정하였다.In order to compare the anticancer activity of the dried mud mushroom fruiting bodies grown in sawdust culture medium with the anticancer activity of the dried mud mushroom fruiting bodies grown in oak logs, extracts were prepared from distilled water from the dried mud mushroom fruiting bodies. A dry mud mushroom distilled water extract was prepared by adding 30 times the amount of distilled water to the dried mud mushroom fruiting body produced in sawdust culture medium or wood culture medium for 8 hours. Each distilled water extract was treated with sarcoma solid cancer 180 cancer cells at the concentration of 18.75, 37.5, 75, 150 and 300 ㎍ / ㎖ and anticancer activity was measured by SRB analysis.
그 결과, 톱밥 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체의 증류수 추출물은 같은 처리 농도에서 원목 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체의 증류수 추출물에 비해 낮은 세포 생존률을 나타내었으며, 처리 농도가 증가함에 따라 세포의 생존률이 비례적으로 감소하였다(표 9 및 도 3). 따라서, 톱밥 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체 증류수 추출물은 원목 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체 증류수 추출물에 비해 항암활성이 뛰어남을 알 수 있다.As a result, the distilled water extract of dried mud mushroom fruiting body grown in sawdust culture medium showed lower cell viability compared to the distilled water extract of dried mud mushroom fruiting body grown in wooden culture medium at the same treatment concentration. This decreases proportionally (Table 9 and FIG. 3). Therefore, it can be seen that the dry mud mushroom fruiting body distilled water extract grown in the sawdust culture medium has superior anticancer activity compared to the dry mud mushroom fruiting body distilled water extract grown in the wood culture medium.
<4-4> 마른진흙버섯 에탄올 추출물의 항암 활성<4-4> Anticancer Activity of Ethanol Extract of Dried Mud Mushroom
톱밥 배양배지에서 배양한 마른진흙버섯 자실체의 증류수 추출물 이외에 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물이 항암활성을 나타내는지, 참나무 원목에서 배양한 마른진흙버섯 자실체의 항암활성과 어떠한 차이가 나는지 비교하였다. 톱밥 배양배지 또는 원목 배양배지에서 생산된 마른진흙버섯 자실체에 20%, 40%, 60% 및 80% 농도의 에탄올을 첨가하여 4시간 동안 추출하였다. 에탄올 농도별 추출액을 각각 6.25 내지 100 ㎍/㎖ 또는 0.625 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 육종고형암 180 암세포에 처리하여 SRB 분석 방법으로 항암활성을 측정하였다.In addition to the distilled water extracts of dried mud mushroom fruiting bodies cultured in sawdust culture medium, the extracts extracted with ethanol as a solvent showed anticancer activity and the difference between the anticancer activity of dried mud mushroom fruiting bodies grown from oak logs. 20%, 40%, 60%, and 80% of ethanol was added to the dried mud mushroom fruiting bodies produced in sawdust culture medium or wood culture medium, and extracted for 4 hours. The ethanol extracts were treated with sarcoma solid cancer 180 cancer cells at concentrations of 6.25 to 100 μg / ml or 0.625 to 10 μg / ml, respectively, to determine anticancer activity by SRB analysis.
그 결과, 각 농도의 에탄올 추출물에 대해 톱밥 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체의 에탄올 추출물은 같은 처리 농도에서 원목 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체의 에탄올 추출물에 비해 낮은 세포 생존률을 나타내었으며, 처리 농도 및 추출용매인 에탄올의 농도가 증가함에 따라 세포의 생존률이 비례적으로 감소하였다(표 10, 도 4a 및 도 4b). 따라서, 톱밥 배양배지에서 성장한 마 른진흙버섯 자실체 에탄올 추출물은 증류수 추출물과 함께 항암활성을 갖고 있으며, 원목 배양배지에서 성장한 마른진흙버섯 자실체의 에탄올 추출물에 비해 항암활성이 뛰어남을 알 수 있었다.As a result, the ethanol extract of dried mud mushroom fruiting body grown in sawdust culture medium showed lower cell viability compared to the ethanol extract of dried mud mushroom fruiting body grown in wood culture medium at the same treatment concentration. And as the concentration of the ethanol extractant increased, the survival rate of the cells was proportionally decreased (Table 10, Figure 4a and 4b). Therefore, the dry mud mushroom fruiting body ethanol extract grown in sawdust culture medium had anticancer activity with distilled water extract, and the anti-cancer activity was superior to the ethanol extract of dried mud mushroom fruiting body grown in wood culture medium.
상기에서 살펴본 바와 같이, 톱밥을 주성분으로 함유하는 배지를 이용하여 마른진흙버섯을 배양하면 기존의 원목재배된 버섯 자실체에 비해 배양소요일수가 짧고, 수확량이 높아 다양한 약리효과를 가진 마른진흙버섯을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.As described above, cultivating dried mud mushrooms using a medium containing sawdust as a main ingredient produces a large amount of dried mud mushrooms having various pharmacological effects due to shorter culture days and higher yields compared to conventional wood-grown mushroom fruiting bodies. It can be useful to
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