KR100552618B1

KR100552618B1 - 아그로박테리움(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)을 이용한사과 '후지' 품종의 형질전환

Info

Publication number: KR100552618B1
Application number: KR1020030064437A
Authority: KR
Inventors: 김정희; 송관정; 황정환; 신용억
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2006-02-15
Also published as: KR20050028329A

Abstract

본 발명은 국내 사과 재배의 주 품종인 '후지'를, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 형질 전환하는 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 외래 유전자가 도입된 아그로박테리움을 이용해 착색이 증진된 사과 '후지' 품종의 우량계통을 양성하여, 종래 착색에 소요되었던 노동력과 비용의 절감 효과를 가져와 생산의 효율성을 높일 수 있는 형질 전환 기술에 대한 것이다.

사과, 후지, 착색조절, 형질전환, 재분화

Description

아그로박테리움(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)을 이용한 사과 '후지' 품종의 형질전환 {Genetic transformation of 'Fuji' apple using Agrobacterium tumefaciens}

도 1은 아그로박테리움을 이용한 사과 '후지'의 형질전환체를 획득하는 과정을 보여준다(시계 방향으로, A: 후지 신초 증식 과정, B: 형질전환 재료로 사용될 발근된 신초, C: 선발 재분화 배지에서 재분화 되는 모습, D: 항생제 첨가 발근 배지에서 재선발하는 모습, E: 멸균 모래에서 활착시키는 과정, F: 포트에서 순화시키는 과정, G: 온실에 생육 중인 형질전환체).

도 2는 외래 유전자(B-peru)의 삽입 여부 확인을 위하여, 생산된 사과 '후지' 형질전환체의 PCR 분석 결과 및 서던(Southern) 분석한 결과를 보여준다.

도 3은 외래 유전자(DFR)의 삽입 여부 확인을 위한 생산된 사과 '후지' 형질전환체의 서던(Southern) 분석한 결과를 보여준다.

본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 사과 '후지' 품종의 형질전환 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 외래 유전자가 도입된 아그로박테리 움을 이용해 착색이 증진된 사과 '후지' 품종의 우량계통을 양성하여, 종래 착색에 소요되었던 노동력과 비용의 절감 효과를 가져와 생산의 효율성을 높일 수 있는 형질 전환 방법에 대한 것이다.

사과는 작물 특성상 개화에서 결실까지의 기간이 평균 5∼7년이 소요되고, 유전자 조성이 복잡할 뿐 아니라 채소, 화훼류에 비해 식물체 재분화가 힘든 작목이기 때문에, 전통적인 교배 육종으로 신품종을 개발하는데는 오랜 시간과 광대한 포장면적, 인력 및 자본 등이 투자되어야 한다. 그렇지만 생명공학 기법인 형질전환 기술을 이용할 경우 단기간에 새로운 품종의 육성이 가능하다.

사과의 형질전환은 1989년 James(James, Plant Cell Reports, 1989 Vol 7 p658-661)에 의해 시작된 이래 조나골드, 골덴델리셔스, 갈라, 로얄갈라 및 마샬맥킨토쉬 등의 품종을 대상으로 많이 연구되었고, 현재까지도 세계적으로 사과의 형질전환 연구가 많이 보고되고 있다. 그러나 형질전환 기술을 이용하여 형질전환된 사과를 품종화되는 데까지는 시간이 걸리고, 형질전환 효율도 3% 이하로 매우 낮은 편이다. 특히 품종간 재분화 및 형질전환 효율의 차이가 큰 편으로 품종별 안정된 형질전환 체계의 확립이 무엇보다 중요하다.

사과에 대한 국내의 형질 전환 연구는 선진국과 비교해서 그 기술 수준에 있어 큰 격차는 없는 실정이다. 국내에서는 조기개화, 유년성 단축, 고당도, 착색증진, 저장력 증진 관련 유전자들이 클로닝되어 맥킨토쉬위직, 갈라 등에 도입된 바 있다.

특히, '후지'는 주된 국내 재배 품종이나 전면 착색 등의 어려움으로 재배과정에서 봉지씌우기와 벗기기, 적엽, 과실 돌려주기 등이 반드시 필요하여 잔손이 많이 가는 단점이 있었다. 따라서, 형질전환 기술을 이용해 상기 교배육종의 한계점을 극복하여 '후지' 사과 품종의 생산 효율을 증진시키고자 하는 요구가 증대되었다. 하지만, 국내 주 재배 품종인 '후지'는 형질전환이 매우 힘든 품종으로 알려져 있어서 현재까지의 교배육종보다 우수한 형질이 도입된 품종을 쉽게 육성할 수 없었다. 그렇지만 현재까지 사과의 형질전환 연구에 대한 기술축적으로 만족할 만한 성과를 바라보고 있으며 그 결과들을 하기에 상세히 설명한다.

본 발명은 상기와 같은 사과 '후지' 품종의 재배과정에서 단점을 해결하기 위한 것으로, 사과 '후지' 품종에 대하여, 아그로박테리움을 이용하여 형질전환을 할 수 있는 기술 체계를 확립하는 것을 목적으로 한다.

보다 상세하게는, 상기 형질전환 기술을 아그로박테리움과의 공동배양 단계, 아그로박테리움과의 공동배양 후 재분화 및 선발단계로 나누어 형질전환에 영향을 주는 요인들을 각 단계별로 규명하고, 상기 형질전환 기술로 획득한 형질전환체의 유전자 발현 분석을 통해 사과 '후지' 품종의 형질전환 기술 체계를 확립하는 것이다.

더 나아가서는 이 기술 체계의 확립이 금후 기타 사과 품종의 형질전환 기술 체계 확립에도 도움을 주는데 있다. 또한, 이러한 품종 개량이라는 목적의 달성으로 이전에 소요되었던 노동력과 비용을 절감시켜 생산의 효율성을 극대화시키고자 한다.

따라서, 본 발명은 사과 '후지' 품종을 형질 전환하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 아그로박테리움을 이용하여 사과 '후지' 품종을 형질 전환하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 형질 전환된 사과 '후지' 품종의 사과를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 사과 '후지' 품종의 형질전환 방법은,

1) 사과 신초를 배양하여 발근 배지에서 발근시키는 단계;

2) 외래유전자가 도입된 아그로박테리움을 배양하는 단계;

3) 사과 신초의 잎 절편에 상기 2)에서 배양된 아그로박테리움을 접종하는 단계;

4) 상기 3)의 아그로박테리움을 접종시킨 사과 신초의 잎 절편을 배양하는 단계;

5) 상기 4)에서 배양된 사과 신초의 어린 잎 절편을 재분화 배지에서 다시 배양하여 재분화시키는 단계;

로 이루어짐을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 사과 '후지' 품종의 형질전환 방법은 상기 형질전환 단계를 거쳐 생성된 형질전환체의 유전자 발현 분석 과정, 즉 우리가 원하는 유전자가 식물 유전체에 삽입되었는지를 확인하는 과정을 포함한다.

본 발명에 따른 사과 '후지' 품종의 형질전환 방법은, 실험 대상인 사과 신초의 어린잎 배양기간, 사과 신초의 어린잎 절편에 감염시킬 아그로박테리움의 농 도, 생장 배지 첨가물의 농도 등의 외부조건을 달리하는 시도 등을 통해서 종래의 형질전환 방법보다 재분화 및 형질전환율이 우수한 사과 '후지' 품종을 획득하였다.

본 발명에 따른 사과 '후지' 품종의 형질전환체 제조방법은 외래유전자 DFR 또는 B-peru 유전자가 도입된 아그로박테리움을 사과 신초의 발근 배지 8주째 유엽을 접종 절편으로 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 아그로박테리움을 배양과 접종시, 아그로박테리움의 농도를 OD₆₀₀값 0.7, 1.0 또는 1.3으로 조절하여 배양하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 아그로박테리움을 사과 신초의 잎에 접종 후 공동배양 배지에서 배양시 첨가하는 아세토시린곤의 농도는 200μM임을 특징으로 한다.

본 발명 특징은 상기의 아세토시린곤을 넣어서 배양된 사과 신초의 잎을 재분화 선발배지에 치상시 이 재분화 선발배지는 MS 무기염류, LS 비타민, IBA, TDZ, 수크로오스 및 다이신 한천(daishin agar; cat No. D1004, Duchefa사 제조)을 포함하며, 이 재분화 선발배지에 첨가하는 세포탁심(cefotaxime)과 카나마이신(kanamycin)을 각각 350mg/L 및 50mg/L의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명을 형질전환 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같 다.

〈실시예〉사과 '후지' 품종의 형질전환

1) 사과 신초를 배양하여 발근 배지에서 발근시키는 단계;

사과 신초의 배양은 MS 무기염류 및 비타민 배지에 BA 1mg/L, IBA 0.3mg/L, GA 0.5mg/L, 수크로오스 30g/L 및 한천(plant agar) 8g/L를 첨가하여 pH 5.8로 조정한 후 가압멸균기(autoclave)에서 121℃, 1.2기압으로 15분간 고압 살균한 배지에서 이루어졌다. 여기서 실제 만드는 배지의 양은 배양하려는 신초의 양에 따라 다르기 때문에 상기에 기재한 식물생장조절제의 양은 1L 기준으로 작성한 것이며, 또한 여기서 말하는 신초란, 기내 배양시의 사과 개체 슈트(shoot : 어린 사과나무) 한 그루를 의미한다.

상기 증식배지로부터 자란 신초를 4주 후 발근배지(1/2 MS배지 + IBA 0.3mg/L + 수크로오스 15g/L + 한천(plant agar) 8g/L)로 치상하였다. 4주 및 8주 후 발근이 된 신초의 어린잎을 아그로박테리움을 접종할 절편으로 사용하였는데, 접종절편은 0.7 ×O.7 cm 정도로 잘라서 사용하였다.

2) 외래유전자가 도입된 아그로박테리움을 배양하는 단계;

형질전환에 이용된 유용유전자는 DFR, B-peru(착색 증진)를 이용하였다. 상기 유전자가 도입된 아그로박테리움의 배양은 카나마이신 10mg/L와 테트라사이클린(tetracycline) 3mg/L를 첨가한 액체 YEB배지(영양 육즙(Nutrient broth) 13.3g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 1.0g/L, 수크로오스 5.0g/L, MgSO₄ 0.24g/L, 박토 한천(Bacto agar) 15g/L) 에 220rpm, 28℃에서 20시간 배양하였는데, 배양 당시의 농도를 OD₆₀₀값 0.7, 1.0, 1.3으로 달리하여 배양하였다.

3) 사과 신초의 어린잎 절편에 상기 2)에서 배양된 아그로박테리움을 접종하는 단계;

유용유전자 DFR, B-peru(착색 증진)가 도입되어 배양된 상기 아그로박테리움을 상기 균배양단계 2)에서의 농도 OD₆₀₀값 0.7, 1.0, 1.3의 세 가지 경우 각각에 대하여 농축 또는 희석을 통해 본 접종단계에서는 OD₆₀₀값 0.7, 1.0, 1.3으로 달리하여 접종하였다. 접종할 때에는 상기에서 농축 또는 희석한 아그로박테리움 현탁 배양 배지를 150rpm, 22℃에서 4시간 동안 진탕(shaking)하여 채취한 잎의 거치를 잘라내고 직사각형으로 자른 후 접종하였다.

4) 상기 3)의 아그로박테리움을 접종시킨 사과 신초의 어린잎 절편을 공동배양 배지에서 배양하는 단계;

접종된 잎은 살균 건조된 킴와이프스(Kimwipes)로 블롯팅(blotting)하여 소독한 후 기존의 공동배양 배지(MS 무기염류 4.4g/L + LS 비타민 5mL/L+ IBA 0.1mg/L + TDZ 5mg/L + 수크로오스 30g/L + 다이신 한천 8g/L)에 감염되는 효율을 높이기 위해 아세토시린곤을 첨가해 3일간 암배양하였다. 이때에도 아세토시린곤 농도를 0, 100, 200 및 400μM로 달리하여 형질전환율을 높이기 위한 시도를 하였다.

5) 상기 4)에서 배양된 사과 신초의 어린 잎 절편을 재분화 선발배지에서 다시 배양하여 재분화시키고 선발하는 단계;

3일간 암배양 후 잎 절편체를, 절편체 표면에 부착된 아그로박테리움들을 제거하기 위하여 세포탁심 350mg/L를 첨가하고, 카나마이신 50mg/L를 첨가한 재분화 선발 배지에 치상하여 4주간 암배양 후 2주 약광 배양, 그 후 2주 강광 배양의 순으로 처리하였다. 선발배지의 기본 조성은 MS 무기염류 4.4g/L에 LS 비타민 5mL/L, IBA 0.1mg/L, TDZ 5mg/L, 수크로오스 30g/L 및 다이신 한천 8g/L를 첨가하였다.

선발배지에서 재분화된 개체는 일단 많은 개체 수의 생존을 위하여 카나마이신이 없는 증식배지로 이식하였으며, 여기서 증식된 신초들은 재선발을 위해 카나마이신 30mg/L을 첨가한 발근배지에 치상하였다.

성공적인 발근을 보인 개체들은 배양 용기에서 꺼내 멸균수로 배지를 제거한 후 멸균된 모래가 담긴 포트에 이식한 후 포화습도를 유지하여 활착된 개체들은 다시 인공토양(버미큘라이트:펄라이트:원예용 상토=1:1:1)에 이식하여 격리 온실로 옮겨주었다.

이상의 과정을 거쳐 형질전환된 형질전환체들을 수거한 후, 이를 대상으로 우리가 원하는 유전자가 식물 유전체에 삽입되었는지를 하기와 같은 유전자 발현 분석을 통하여 확인하였다.

〈유전자 발현 분석〉

게놈 DNA 분리 :

발근배지에서 선발을 거친 식물체들의 유전자 도입의 재확인을 위해 PCR과 서던(Southern) 분석에 필요한 DNA를 분리하였다. 먼저 어린 잎을 채취하여 멸균수로 세척 후 마이크로튜브(microtube)에 넣어 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄하였다. 분말상태의 잎은 DNA 추출 완충액(50mM 트리스-Cl(pH 8.0), 7M 우레아, 0.3M NaCl, 1% 사르코신(sarcosine))을 첨가하여 잘 섞은 후 동량의 페놀:클로로포름(1:1)을 첨가하여 천천히 뒤집으며 완전히 섞었다.

12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 회수하여 새 튜브로 옮기고 동량의 클로로포름을 첨가하여 12,000rpm에서 10분간 다시 원심분리하였다. 얻어진 상징액을 다시 새 튜브로 옮기고 동량의 이소프로필 알코올과 100㎕의 4.4M 암모늄 아세테이트(pH 5.2)를 첨가하여 냉동고에서 30분 이상 보관한 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다.

침전된 DNA 펠렛을 1㎖의 70% 에탄올을 첨가하여 다시 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 자연 건조시켜 500㎕의 TE 완충용액을 넣어 녹이는데, 여기에 RNase를 50㎍/ml 의 농도로 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 500μL의 페놀:클로로포름을 넣어 잘 섞은 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상징액을 새로운 튜브로 옮겨 50㎕의 3M 아세트산 나트륨과 1㎖의 에탄올을 첨가하여 냉동고에서 30분 이상 둔 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리 하였다.

DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후 건조시켜 100㎕ TE 용액에 완전히 녹인 후, 0.8% 한천 겔에서 전기영동하여 순도를 확인하였고 DNA 양은 형광측정계(fluorometer)로 정량한 후 실험에 사용하였다.

PCR 분석 :

상기의 방법으로 분리한 DNA를 PCR은 NPTII와 표적(target) 유전자 각각의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다.

PCR 분석을 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열(DFR의 경우는 PCR은 생략하고 서던(Southern) 분석만 실시하였음)

유전자	PCR 검출용 서열
nptII	5'-GAGGCTATTCGGCTATGACT-3'
nptII	5'-AATCTCGTGATGGCAGGTTG-3'
B-Peru	5'-TGATCTGCATGACCTACGCC-3'
B-Peru	5'-CCAACGACTTGAGAACGAGG-3'
DFR	5'-GGAGTGTTCCATGTTGCTAC-3'
DFR	5'-TCAACGAGGTTGCTCTCCTC-3'

(프라이머 밴드 길이 : nptII, B-peru는 약 800bp, DFR은 1.4kb)

상기에서 분리한 DNA를 주형으로 한 PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 확장(extension) 과정을 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 후확장(postextension) 후 반응을 종료하였다. 합성된 PCR 산물은 0.8% 한천 겔에서 전기영동하여 밴드를 확인한 결과, 도면 2에서와 같이 69, 71을 제외한 모든 곳에서 우리가 원하는 B-peru 유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다(서던 분석으로 한번 더 확인하였다). 또한 사과는 채소와는 다른 영양번식 작물이라서 형질전환체가 만들어지면 그 개체의 가지(눈)을 접목해서 번식하므로 후대 발현에도 문제가 없다.

서던(Southern) 분석 :

상기에서 분리된 DNA를 EcoRI, HindIII 및 XbaI 등의 제한효소를 사용하여 절단하고 전기영동 후 나일론 막에 전이시켰다. 라벨링 프로브(labeling probe)는 딕옥시제닌(digoxigenin)-dUTP를 이용하여 제조하였고, 하이브리드화(hybridization) 반응은 DNA가 전이된 나일론 막을 2×SSC로 세척 건조 후 UV-교차 결합기에서 고정시켰다. 고정된 나일론 막을 혼성화 튜브에 넣어 혼성화 용액과 함께 65℃에서 2시간 전처리 후 프로브를 첨가하여 하루동안 진탕(shaking)하였다. 나일론막은 2×SSC/0.1% SDS 용액으로 65℃ 15분, 상온에서 15분간 세척한 후 다시 65℃에서 15분간 세척하였다. 세척한 나일론 막을 건조시킨 후, 카세트 한쪽 면에 붙인 뒤 암실에서 X-레이 필름을 얹고 2시간 노출시킨 뒤 확인한 결과, B-Peru 유전자는 도면 2에서와 같이 F1, F5, F9 및 F10에서, DFR 유전자는 도면 3에서와 같이 F6, F7 및 F8에서 확인할 수 있었다.

본 발명의 형질전환 과정을 통해 수득한 형질전환체를 상기 PCR 분석 및 서던 분석을 통해 재분화율 및 형질전환율을 분석해 본 결과, 본 발명이 목적했던 사과 '후지' 품종의 하기와 같은 만족할 만한 재분화율 및 형질전환율을 획득할 수 있었다.

〈형질전환 결과〉

1) 접종에 사용되는 잎 절편체의 유래별 형질전환 효율을 조사하기 위해 증식 배양 중인 '후지' 신초를 발근 배지로 옮긴 후 4주 째 되는 유엽을 접종 재료로 사용한 경우와 8주 째 되는 유엽을 접종 재료로 사용한 경우를 비교하였다(표 2). 발근 배양 4주된 유엽에서 채취한 절편체의 재분화율은 17.1%, 8주된 유엽에서 채취한 절편체의 재분화율은 12.5%로 재분화율에서는 4주 발근 배양한 유엽이 높게 나타났으나, 형질전환율에 있어서는 8주 배양한 식물체의 잎 절편체가 4주 배양한 식물체의 잎 절편체 보다 현저히 높게 나타났다.

참고로, 형질전환에 사용하는 잎 절편체의 재료는 품종에 따라 차이가 있다. '갈라'의 경우는 발근배양 상태보다는 엽신장 배지에서 유엽을 채취하여 형질전환에 이용하는데 '갈라'의 경우는 증식배양 중인 유엽의 경우 잎 크기가 작아 절단하는데 어려움이 있고, 또한 발근 상태의 잎을 이용했을 때는 재분화 및 형질전환율에 있어서 효율적이지 못하다. 반면, '후지' 및 '맥킨토쉬위직'의 경우는 증식상태의 절편체를 이용할 경우 정부생장이 활발하지 못하고, 측아생장이 활발하여 엽면적이 증가된 유엽을 구별하기가 매우 어렵다. 그러므로, 발근 배지에서 식물체를 배양하여 확장된 유엽의 발생을 촉진시켜 형질전환에 이용하는 것이 효과적이다.

접종할 잎의 배양기간별 재분화 및 형질전환율

처 리	재분화율(%)	형질전환율(%)
발근배지 4주 식물체 유엽	17.1	1.4
발근배지 8주 식물체 유엽	12.5	6.3

2) 아그로박테리움(Agrobacterium) 농도가 형질전환에 미치는 영향을 살펴보기 위해 OD₆₀₀에서 균 배양 농도와 접종 농도를 각각 0.7, 1.0 및 1.3으로 달리 처리한 결과는 표 3과 같았다.

'후지'의 경우 균 배양 단계에서의 농도 0.7과 접종 단계에서의 농도 1.3에서 재분화율과 형질전환율이 가장 높게 나타났는데, Bondt(Bondt, Plant Cell Reports, 1994 Vol 13 p587-593)가 '조나골드'의 형질전환에서 균 접종 농도를 달리하였을 때 균 농도가 증가할수록 형질전환율이 증가하는 경향을 보인 것과는 차이가 있었다. 이는 품종간 차이에 기인하는 것으로 보여진다.

아그로박테리움 농도(OD₆₀₀)별 재분화 및 형질전환율

처 리		재분화율(%)	형질전환율(%)
균배양단계	접종단계	재분화율(%)	형질전환율(%)
0.7	0.7	5.0	0.0
	1.0	10.0	2.5
	1.3	15.0	10.0
1.0	0.7	7.5	2.5
	1.0	2.5	0.0
	1.3	2.5	0.0
1.3	0.7	5.0	0.0
	1.0	2.5	0.0
	1.3	5.0	0.0

3) 접종효율을 높이는 효과가 있는 것으로 알려진 아세토시린곤의 첨가로인한 재분화 및 형질전환 효율에 미치는 영향을 살펴본 결과(표 4), 아세토시린곤의 첨가 농도가 증가할수록 재분화 및 형질전환율이 대체로 증가됨을 볼 수 있었는데, 200μM에서 가장 높았고 400μM에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다.

참고로, 아세토시린곤은 Ti-플라스미드의 병원성 유전자인 vir 유전자의 발현유도체로 작용하여 식물조직의 상처를 통해 분비되며, 병원성유도배지에서 아세토시린곤의 첨가가 형질전환율을 증가시킨다고 알려져 왔는데, 작물이나 품종에 따라 적용하는 적정 농도에는 차이가 있으며(Zhang et al., Chemistry & Biology, 2000 Vol 7(No. 8) p611-621), 사과의 경우도 품종별 상당한 차이가 있는 것으로 보고된 바 있다(Norelli et al., Journal of the American Society for Horticultural Science, 1993 Vol 118(No.2) p311-316).

아세토시린곤(Acetosyringone) 농도별 재분화 및 형질전환율

아세토시린곤 농도 (μM)	재분화율(%)	형질전환율(%)
0	0.0	0.0
100	16.7	1.2
200	19.5	4.7
400	3.6	0.0

이상에서와 같이 본 발명의 사과 '후지' 품종의 형질전환 방법을 이용하면 착색이 증진된 사과 '후지' 품종의 우량계통을 양성할 수가 있어, 이전에 착색에 소요되었던 노동력과 비용의 절감 효과를 가져와 생산의 효율성을 높일 수 있다. 더 나아가, 본 발명으로 상기 사과 '후지' 품종의 형질전환 기술 체계가 확립되면 금후 기타 사과 품종의 형질전환 기술 체계의 확립에도 도움을 줄 수 있다. 또한 과수 질병 예방 등 여러 유용 유전자들이 밝혀지면 본 발명의 형질전환 기술을 이용한 신품종의 육성이 가능할 것으로 보인다.

Claims

사과 '후지' 품종의 형질전환체 제조 방법에 있어서,

1) 사과 신초를 배양하여 발근 배지에서 발근시키는 단계;

2) 외래유전자가 도입된 아그로박테리움을 배양하는 단계;

3) 사과 신초의 어린잎 절편에 상기 2)에서 배양된 아그로박테리움을 접종하는 단계;

4) 상기 3)의 아그로박테리움을 접종시킨 사과 신초의 어린잎 절편을 공동배양 배지에서 배양하는 단계;

5) 상기 4)에서 배양된 사과 신초의 어린 잎 절편을 재분화 선발배지에서 다시 배양하여 재분화시키고 선발하는 단계;

를 포함하는 사과 '후지' 품종의 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 2)단계에서 아그로박테리움에 도입된 외래유전자는 DFR 또는 B-peru 유전자임을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 2)단계에서 아그로박테리움의 배양시, 아그로박테리움의 농도를 OD₆₀₀값 0.7, 1.0 또는 1.3으로 조절하여 배양하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 3)단계에서 아그로박테리움의 접종시, 아그로박테리움의 농도를 OD₆₀₀값 0.7, 1.0 또는 1.3으로 조절하여 접종하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 4)단계에서 첨가시키는 아세토시린곤의 농도는 200μM인 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 3)단계에서 접종 절편은 발근 배지 8주째 유엽을 이용하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 5)단계에서 재분화 선발배지는 MS 무기염류, LS 비타민, IBA, TDZ, 수크로오스 및 다이신 한천(daishin agar)을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 5)단계의 재분화 선발배지에 세포탁심(cefotaxime)과 카나마이신(kanamycin)을 각각 350mg/L 및 50mg/L 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.
제 1항에 있어서, 5)단계에서 재분화된 개체들을 발근 배지에서 재선발 할때 첨가하는 카나마이신 농도를 30mg/L로 하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 제조방법.