KR100549662B1 - 러시아산 무미 추출물 또는 분획물을 함유하는면역활성증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 러시아산 무미(Russian Mumie)의 분획물을 함유하는 면역활성 증강을 위한 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 무미 추출물인 펄빅산으로부터 유래된 FA1, FA2 또는 FA3 분획물을 함유하는 면역활성증강용 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 무미로부터 유래한 펄빅산 분획물은 대식세포에 의한 활성산소종(ROS) 및 질산(NO) 생산을 증진시키거나, 스플레노사이트 증식효과를 나타냄으로써 면역활성을 증가시키는 의약품으로 사용할 수 있다. 또한, 세포에 대한 독성이 없으므로 감염성 질환 치료제로 사용할 수 있다.

무미, 휴믹 물질, 펄빅산, 활성산소종, 질산, 대식세포, 면역활성증강, 감염성질환, 의약품

Description

러시아산 무미 추출물 또는 분획물을 함유하는 면역활성증강용 조성물{Composition comprising the extract or fraction isolated from Russian Mumie for activation of Immunity}

도 1 은 러시아산 무미로부터 분획하는 과정을 간략하게 나타낸 도이고,

도 2a 는 FA_total, HA, LMW1 및 LMW2의 전자 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 2b 는 무미의 에탄올 추출물의 전자 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 3 은 무미 분획의 IR 스펙트럼이고,

도 4a 내지 4c는 가공하지 않은 무미, 무미의 FA 분획들 및 HA 고분자량 분획들의 방출 형광 스펙트럼이고,

도 5 는 무미와 그 분획들에 대한 HPSEC 분석 스펙트럼이고,

도 6a 는 대식세포에 PMA 유도 후 FA 분획을 처리하여 ROS 생성률을 관찰한 도이고,

도 6b 는 FA 분획들 처리 후의 대식세포에 의한 자연적 ROS 생성을 관찰한 도이고,

도 7 은 무미 분획들의 ROS 생성에 미치는 효과를 나타낸 도이고,

도 8 은 무미 분획들의 NO 생성에 미치는 효과를 나타낸 도이고,

도 9 는 무미의 분획들이 스플레노사이트 증식에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 러시아산 무미(Russian Mumie)의 추출물 또는 분획물을 함유하는 면역활성의 증진을 위한 조성물에 관한 것이다.

세균, 바이러스 감염 또는 염증반응시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O₂ ^-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species) 및 질산(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 및 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개 (cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조 절세포로서, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다.

또한, 방사성치료 또는 화학치료와 같은 항암치료시 조혈모세포들이 조혈과정 중 손상을 입게 되어 연속적으로 관련된 조혈세포와 면역세포들이 감소되고, 이로 인해 종종 조혈과 면역작용의 형성에 장애가 발생한다. 결과적으로, 환자들은 종종 빈혈과 림프구 감소증, 혈소판 감소증 또는 과립백혈구 감소증을 경험하게 되며, 이것은 심각하고 치명적인 감염을 일으키고 환자들의 사망률을 높이게 된다. 임상적으로, 항암치료나 골수이식후에 골수성장인자인 G-CSF, GM-CSF, IL-1 ∼12, M-CSF 및 EPO 등을 사용하고 있으며, 이들 성장인자는 서로 상승작용을 일으키면서 CFU 와 BFU에서부터 세포 분화 및 생성을 촉진시키고, 세포의 이동, 식세포 작용, 슈퍼옥사이드 생성, 항체 자극에 따른 백혈구의 세포 독작용 등도 증가시킨다.

한편, 지중합체(geopolymer) 및 자연 생미네랄(biomineral)은 최근에 식품 첨가제 및 의약품의 개발을 위한 원재료로서 매우 주목을 받고 있다. 현재 이탄(peat), 부니(sapropel), 무미(mumie)와 같은 자연적 휴믹화 산물을 기초로 하여, 임상에 다양하게 적용될 수 있는 약물들이 개발되고 있다.

본 발명에 사용된 무미(Mumie, 실라짓, shilajit)는 반 고형성의 검은색 레진(resin)으로, 산에 서식하는 등대풀속(Euphobia) 및 달구지풀(클로버, Trifolium) 식물, 그리고 지의류의 장기간의 휴믹화로 인하여 형성된다. 무미 휴무스(Mumie humus)는 유기 물질 60 내지 80%, 미네랄 물질 20 내지 40%, 그리고 미량원소(trace element)로 이루어져 있다. 타지키스탄(Tajikistan) 사람들은 일상적으 로 음식에 무미를 사용한다. 몇몇의 생물학적 활성을 갖는 무미를 함유한 음식첨가물이 특허화되었으며 제조되고 있다. 무미는 인디안 사회에서 건강과 관련되어 원기회복제(rejuvenator; 라사야나, rasayana)로 사용되고 있다. 이 물질은 지식의 습득 및 기억을 증진시키는 활성이 있는 화학 성분을 함유하고 있다. 무미는 비뇨기 질환, 당뇨(Bhattacharya, S.K., Activity of shilajit on alloxan-induced hyperglycemia in rat, Fitoterapia, volume LXVI, No. 4, pp328-, 1995), 소화장애, 신경계 질환, 결핵, 만성기관지염, 천식, 빈혈, 뼈의 골절 및 다른 질환들에 처방되고 있다. 무미는 거의 3000년동안 여러 나라에서 전통의약품으로서 사용되었음에도 불구하고, 무미의 구성성분의 구조나 물리화학적 특성, 그리고 그의 치료효능의 기작에 관하여 충분히 연구되지 못한 상태이다.

임상의 적용을 위하여, 면역자극 및 동화작용활성이 있는 음식첨가제 뿐만 아니라, 무미는 액상추출물의 형태(가공된 무미)로 사용된다. 무미의 수가용성분획에서 유기물질의 주요 성분은 펄빅산(fulvic acids)이다. 이런 휴믹물질들(humic substances)은 이탄(peat)과 부니(sapropel) 및 다른 휴무스 물질(humus matters)에 풍부하게 존재하며, 이것들은 의학적으로 중요성을 가진다. 그럼에도 불구하고, 휴믹물질들의 생물학적 효과는 그들의 화학구조나 물리화학적성질에 따라 각각 다르다. 휴믹물질들의 화학적 조성, 구조 및 작용기는 매우 다르며 이것은 그 기원(origin), 연도(age)와 습도(humidity), 공기(aeration), 온도 및 미네랄 환경(mineral micro-environment) 등과 같은 휴믹화 과정의 조건에 따라 변한다. 무미 형성 지역은 휴믹화과정의 조건에 있어서 지구의 다른 지역과 현저하게 다른 특정 생태계이다. 현재 중요한 연구활동들은 토양, 이탄, 부니, 바다, 강 및 다른 저수지들로부터 분리, 수집된 휴믹 물질들의 물리 화학적 특성을 연구하는 것으로 초점이 맞추어져 있다.

무미의 수추출물은 마우스의 복막의 대식세포에서 식세포작용 및 사이토카인 분비를 활성화시킨다. 무미함유 약물의 적용은 피질의 흉선층의 림프구의 증식을 야기시키고, 그들의 림프절 및 스플린의 흉선의존적부위로의 이동을 야기시킨다. 토양 및 저수지에서 분리된 펄빅산은 중성백혈구(neutrophil) 및 T-림프구의 기능적활성정도를 자극시킨다.

휴믹산은 눈의 감염, 출혈성 눈의 감염증, 가축의 감염치료(Guofan, Tang, Jiangxi; Humic acids, 3, 1984 in application of Fulvic acid and its derivatives in the field of agriculture and medicine, First edition, June 1993)에 사용되고, 펄빅산은 기관지암 및 피부 궤양의 치료에 사용된다(Yuan, Shenyuan; Fulvic acid, 4, 1988 in application of Fulvic acid and its derivatives in the field of agriculture and medicine, First edition, June 1993).

그러나, 무미의 FA 분획의 대식세포에 의한 ROS 와 NO 생산 및 림프구 증식에 대한 영향은 아직까지 밝혀진 바 없다.

그리하여, 본 발명에서는 무미의 분획화, IR, UV/VIS, 형광현미경을 이용한 분석, 고압 크기배제 크로마토그래피로 특징을 밝히고, 펄빅산을 함유한 FA 분획의 대식세포에 의한 ROS 와 NO 생산 및 림프구 증식에 대한 영향을 조사하여 면역력을 증강시킴을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 러시아산 무미로부터 추출, 분리한 분획물 중 펄빅산(FA) 분획들을 함유하는 면역증강용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 러시아산 무미 추출물 또는 분획물을 함유하는 면역저하 또는 면역계 손상로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 면역력을 증강시키는 러시아산 무미의 추출물 또는 분획물을 함유하는 감염성질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 러시아산 무미(Russian Mumie)의 추출물 또는 분획물을 함유하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명은 러시아산 무미 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 면역저하 또는 면역계 손상로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 면역력증강 효능을 갖는 러시아산 무미의 추출물 또는 분획물을 함유하는 감염 또는 염증으로 인한 각종 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 면역증강용, 면역저하 또는 면역계 손상로 인한 질환의 예방 및 치료용 또는 감염 또는 염증으로 인한 각종 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총중량에 대하여 러시아산 무미 추출물 및 분획물을 0.5 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 및 분획물은 하기와 같은 제조공정으로 제조될 수 있다.

건조시킨 러시아산 무미를 통상적인 추출방법에 따라 제조할 수 있는데, 예를 들어, 무미 재료를 각종 분쇄기기로 분쇄 또는 파쇄하고 이를 추출재료의 약 1 내지 5배의 0.1 내지 2몰의 수산화나트륨과 같은 염기성용액을 사용하여 실온에서 12시간 내지 48시간동안 교반하고, 원심분리를 통하여 상층액인 조추출물을 수득하는 제 1 단계;

상기 조추출물에 염산, 황산, 질산과 같은 강산을 가하여 pH 1.0 내지 2.0, 바람직하게는 pH 1.0으로 산성화시키고, 이어 원심분리를 수행하여 상층액인 펄빅산(FA) 및 휴믹산(HA)을 수득한 다음, 펄빅산 용액인 상층액에 다시 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 강염기를 가하여 pH를 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 pH 7.0로 조정한 후 0.2 내지 0.5㎛ 필터로 여과하여, 10,000 내지 15,000의 분자량을 갖는 FA_total 용액을 수득하는 제 2 단계;

상기 제 2단계의 최종 수득된 FA_total 용액에 에탄올을 첨가하여 최종농도 60 내지 70%, 바람직하게는 66%로 제조한 후, 원심분리하여 상층액 및 침전물 1을 수득하고, 상층액에 다시 에탄올을 첨가하여 최종농도 80 내지 90%, 바람직하게는 85%로 제조한 후 원심분리하여 상층액 및 침전물 2을 수득한 다음 각각의 침전물 1 및 2를 투석, 바람직하게는 10kDa 컷-오프 투석 튜브를 사용한 투석을 수행하여 FA1 및 FA2 분획을 수득하는 제 3 단계;

상기 제 2단계의 최종 수득된 FA_total 용액을 투석, 바람직하게는 10kDa 컷-오프 투석 튜브를 사용한 투석을 수행하여 수득된 FA_total 용액을 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 통과시킨 후 0.3 내지 2.0몰, 바람직하게는 각각 0.5몰, 2.0몰 또는 0.3몰의 염화나트륨 용액들을 사용하여 단계적으로 용출시켜 FA3, FA4 및 FA5 분획을 수득하는 제 4 단계;

이어, 상기 제 3단계의 85% 에탄올에 가용한 분획을 농축시켜 저분자량의 물질로 포화된 용액에 동량의 에탄올을 가한 후에 재침전함으로써 LMW1 및 LMW2 분획을 수득하는 제 5 단계로 이루어진 단계를 포함하는 러시아산 무미로부터 면역활성 증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기공정으로부터 얻은 러시아산 무미 조추출물을 각종 세파덱스 컬럼 크로마토그래피법, 예를 들어, 세파크릴 S-300, 세파덱스 G-50, 세파덱스-G-25 등의 다공성 수지 컬럼을 시행하여 추가의 정제된 분획물들을 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 러시아산 무미 추출물은 통상의 분획방법으로 추가의 분획공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp 6-7, 1998).

본 발명은 또한 상기 제조방법으로부터 분리된 하기와 같은 특성을 갖는 러시아산 무미의 추출물 또는 분획물들을 제공한다.

상기 FA_total은 분자량이 10,000 내지 15,000이고, UV/VIS에서는 402nm 및 665nm에서 최대흡수파장을 보이고, IR에서는 3400, 1450 및 1090cm^-1에서 흡수밴드들을 나타낸다.

FA1 분획은 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 2.3중량%이고, UV/VIS에서 402 및 665nm에서 최고의 흡수파장을 나타내며, IR에서는 3400, 2900, 1720, 1600, 1450 및 1350cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 370, 395, 435 및 480nm에서 나타나는 특징을 갖는다.

FA2 분획은 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 1.8중량%이고 UV/VIS에서 402 및 665nm에서 최고의 흡수파장을 나타내며, IR에서는 3400, 2900, 1720, 1600 및 1350cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 415nm에서 나타나는 특징을 갖는다.

FA3 분획은 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 0.6중량%이고, IR에서는 3400cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 395 및 480nm에서 나타나는 특징을 갖는다.

상기 러시아산 무미 추출물인 (FA_total) 및 분획물(FA1, FA2 및 FA3)은 대식세포에서의 활성산소종(ROS)의 생성, 질산(NO)의 생성 및 스플레노사이트의 증식관찰 실험에서 긍정적인 결과를 나타내어 면역활성증강 효과를 확인할 수 있다.

FA_total은 펄빅산을 함유하고 있으며, 펄빅산은 중성백혈구 및 T-림프구를 황성화시키므로 이를 함유하는 조성물은 면역활성증강효과를 기대할 수 있다.

본 발명은 상기 특징을 갖는 러시아산 무미 추출물(FA_total) 또는 추가의 정제 공정으로 분리되는 분획물들(FA1, FA2 및 FA3)로 부터 선택된 하나이상의 분획물을 함유하는 면역활성증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 본 발명은 상기 특징을 갖는 러시아산 무미 추출물(FA_total) 또는 추가의 정제 공정으로 분리되는 분획물들(FA1, FA2 및 FA3)로 부터 선택된 하나이상의 분획물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 면역결핍, 면역저하 또는 면역계 손상으로 인한 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 화학요법 및 방사선요법과 같은 항암요법에 의한 면역기능의 저하 또는 골수이식 후 면역저하로 인한 질환, 면역계손상으로 인한 에이즈 및 면역기능의 저하로 인한 암질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 면역력증강 효능을 갖는 러시아산 무미의 추출물 또는 분획물을 함유하는 감염 또는 염증으로 인한 각종 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 조성물은 박테리아나 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 및 치료제로 사용할 수 있으며, 세포에 대한 독성이 없으므로 눈의 감염증, 출혈성 눈의 감염증(hemorrhagic eye infection), 식도염, 식도암(esophagal tumor), 기관지염, 아토피성 피부염, 욕창 및 피부궤양(skin ulcer)과 같은 피부염증질환에 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 및 분획물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 및 분획물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 러시아산 무미 추출물 및 분획물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 러시아산 무미 추출물 및 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 러시아산 무미 추출물 및 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 및 분획물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 러시아산 무미 추출물 및 분획물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물을 포함하는 조성물은 상기와 같은 제형으로 골성장 촉진 및 골다공증 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 러시아산 무미 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품류 등이 있다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 또한 상기 제조방법으로부터 수득된 러시아산 무미 분획물 FA1, FA2 및 FA3로부터 선택된 하나이상의 분획물 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제조한다.

본 발명의 상기 러시아산 무미 분획물은 면역활성 증가 및 감염성질환의 예방의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 러시아산 무미 분획물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 식품 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 1 ∼ 30g, 바람직하게는 3 ∼10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 러시아산 무미 분획물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 크실리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 무미 조추출물의 제조

카자흐스탄(Kazakhstan, Ust'-Kamenogorsk)의 산악지대에서 수집된 무미 100g을 0.5M 수산화나트륨 용액 500㎖에 넣고 상온에서 16시간동안 교반하였다. 잔 여물(휴민 및 다른 비가용성화합물) 35.4g을 원심분리(3,900×g, 15분)를 수행하였다. 이의 상층액을 분리하여 조추출물을 제조하였다(도 1 참조).

실시예 2. 무미 분획 및 휴믹물질들 분리

본 발명의 무미로부터 휴믹물질들(humic substances)을 분리하는 과정은 기존의 분획법으로 수행하였으며, 다양한 pH의 물에 대한 휴믹물질의 용해도차이에 따라 분획을 실시하였다(도 1 참조).

2-1. 휴믹산, 히마토멜란산 및 점액성물질 제조

실시예 1의 상층액에 염산을 가하여 pH를 1.0으로 산성화시키고, 침전물인 휴믹산(humic acid, HA) 6.1g을 수득하였다. 상기 원심분리 후, 펄빅산(fulvic acid, FA) 용액은 pH 7.0으로 조정하고, 0.45㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 하기 실시예 2-2에서 에탄올 침전 또는 이온교환크로마토그래피로 분획하였다.

히마토멜란산(hymatomelanic acid, HymA) 및 진녹색의 점액성 물질은 HA 및 휴민으로부터 100% 에탄올을 사용하여 추출함으로써 각각 수득되었다.

2-2. LMW 분획들 및 펄빅산 분획들(FA1, FA2)의 제조

에탄올 침전에 의한 펄빅산(FA) 용액의 분획은 유디나의 방법(Yudina et al.; Chem. Plant. Mater., 4, pp33-38, 1998)에 약간의 변형을 가하여 수득하였다. 분획방법으로 펄빅산 용액에 에탄올을 연속적, 단계적으로 가하고, 결과물인 침전물을 원심분리하였다. 본 발명자는 다양한 농도를 가진 에탄올을 사용하여, FA_total 용액을 고분자량 및 저분자량 분획으로 분리하였다.

요약하자면, 에탄올 침전과정은 하기와 같은 과정으로 수행되었다.

상기 펄빅산(FA_total) 액체상 용액을 에탄올(최종농도가 66%(v/v))과 혼합하여 고분자량의 비가용성 FA(FA1)를 침전시켰다. 원심분리로 침전물을 분리시킨 다음, 수득된 상층액에 에탄올(최종농도가 85%(v/v))을 가하여 다시 비가용성 FA(FA2)를 침전시켰다. 처음 용액에 존재했던 24g의 FA_total용액은, 66% 및 85% 농도의 에탄올로 침전되어 각각 ∼14.8g 및 ∼9.2g으로 수득되었다. 두 FA 분획들은 10kDa 컷-오프 투석 튜브(10kDa cut-off dialysis tube, Sigma Co., 미국)를 사용하여 투석되어졌고, 각각의 분획을 FA1 및 FA2로 명명하였다(도 1 참조).

상기에서, 85% 에탄올 침전 및 원심분리 후에 수득한 상층액인 에탄올 가용 분획을 회전증발기(rotary evaporator)를 사용하여 처음 부피의 10%까지로 농축시켰다. 침전된 회색의 잔여물 7.5g을 원심분리하여 동량의 에탄올을 가한 후에 포화된 액상용액으로부터 재침전함으로써 더 정제되었다. 그 결과로, 에탄올 비가용성인 흰색의 잔여물(분획 LMW1) 및 용액이 수득되었다. 이 용액을 증발시켜 쓴 흑갈색의 점성있는 물질(분획 LMW2)의 펠렛 24.3g을 수득하였다(도 1 참조).

2-3. 펄빅산 분획들 (FA3, FA4, FA5)의 제조

이온교환크로마토그래피에 의한 펄빅산(FA) 분획을 수득하기 위하여, 전체 FA(FA_total) 용액은 10kDa 컷-오프 투석 튜브(10kDa cut-off dialysis tube)를 사용하여 투석되어졌다. 투석된 FA_total 10g을 디에틸아미노에틸(DEAE)-셀룰로오스 컬럼(Fluka Co., 스위스)에 통과시켰다. DEAE-셀룰로오스에 흡착된 물질은 연속적 으로 0.5M 염화나트륨용액, 2M 염화나트륨용액 및 0.3M 염화나트륨용액으로 용출되었다. 수득된 분획들은 FA3, FA4, FA5로 명명되었으며 각각 ∼7.3g, ∼0.4g, ∼1.9g의 양으로 수득되었다. 하기의 실험을 위하여, 이 분획들은 10kDa 컷-오프 투석 튜브를 사용하여 증류수에 반하여 투석되어졌다.

실시예 3. UV/VIS를 이용한 분광학적 분석

상기 무미 분획들의 UV/VIS 스펙트럼은 울트로스펙 4000 스펙트로포토메터(Ultrospec 4000 spectrophotometer, Pharmacia Biotech사, Uppsala, Sweden)를 사용하여 조사되었고, 1-㎝ 쿼쯔 큐벳(1-㎝ quartz cuvette)에서 200 내지 800㎚에서 스캐닝하였다.

FA_total, HA 및 LMW2의 전자 스펙트럼은 파장이 증가함에 따라 흡광도에 있어서 완만한 하향곡선을 보였다(도 2a 참조). FA1 내지 FA5 분획들은 FA_total 과 같은 형태의 스펙트럼을 보였으며, 이것은 다른 천연물질 재료들에서 추출한 휴믹 물질의 특징과 같다.

LMW1 분획의 전자 스펙트럼은 벤조산 및 이의 유도체에 특이적인 275 내지 280nm의 범위에서 최대의 흡수를 보였다.

가공하지 않은 무미의 에탄올 추출물의 전자스펙트럼은 지오포르피린(geoporphyrin) 및 클로린(chlorins)을 함유하는 휴무스 시료의 스펙트럼과 유사하다. 포르피린-유사 색소에 대한 가장 높은 흡광은 402nm였고, 클로린 이 풍부한 침전물에 대한 가장 높은 흡광은 665nm에서였다(도 2b 참조).

침전물의 클로린 및 포르피린들은 클로로필 분자의 속성화 산물(diagenetic product)이고, 이것들은 화학적인 화석 또는 휴무스 물질의 생물학적마커로 생각된다. 클로린은 클로로필의 직접적인 속성화 산물인데 반해, 포르피린은 장기간이 클로로필 속성화에 의한 결과이다. 포르피린 유사 색소들은 410nm의 피크로 특징지어지는데 반해 클로린 유사 색소들은 665nm에서 최고의 흡광도를 갖는다 가정함으로써, 클로린이 풍부한 침전물은 1 과 5 사이의 E₄₁₀/E₆₆₅(포르피린/클로린) 비율을 갖는다는 것을 보여주며, 포르피린이 풍부한 침전물은 5에서 10사이의 더 높은 수치를 갖는다.

본 발명자는 가공하지 않은 무미의 에탄올 추출물에 대한 E₄₁₀/E₆₆₅의 비율이 약 3.4임을 확인하였다. 이것은 본 발명의 무미를 클로린이 풍부한 휴무스 재료로서 분류할 수 있음을 말해준다.

실시예 4. 적외선(IR)을 이용한 분광학적 분석

무미 분획들의 적외선 스펙트럼(650 내지 4000cm^-1)은 스펙코드 71 IR 스펙트로포토메터(Specord 71 IR spectrophotometer, Carl Zeizz사, Germany)를 사용하여 브롬화칼륨(KBr) 디스크에서 측정되었고, 2㎎의 건조 시료를 건조된 800㎎의 브롬화칼륨(KBr)과 혼합한 후에, 그 혼합물을 디스크 내로 압착시켰다.

무미 분획의 IR 스펙트럼은 도 3에 나타나 있다. 특이적 흡수 피크를 보이는 순수한 화합물과는 달리, 무미에서 분리한 휴믹 물질은 상대적으로 좀 넓은 밴드를 보였다. 이런 넓은 IR 밴드들은 모든 종류의 유사 작용기에서의 흡수가 겹치기 때문이다.

4-1. FA _total, HA, HymA, 가공하지 않은 무미의 에탄올 추출물 및 휴민의 에탄올 추출물의 IR 스펙트럼

이 휴믹 물질들에 특이적인 흡수밴드들은 FA_total 및 HA 분획들의 IR 스펙트럼에서도 관찰되었다. 3400cm^-1에서의 강한 흡수밴드는 히드록시기, 페놀기, 카복실기 내의 OH 기가 풍부하다는 것을 확인해주며, 또한 이 무미 분획에 아미노 그룹도 또한 많다는 것을 확인해 준다. 2900cm^-1, 1720cm^-1, 1600-1660cm^-1, 1420cm ^-1 및 1240cm^-1 근처에서의 보이는 강한 흡수는 다른 문헌에서 보고되었다. 모든 스펙트럼에서, 넓은 밴드는 3300 내지 3350cm^-1에서 관찰되었고, 이것은 카르복실 그룹에서의 OH기와 관련이 있다. 카르복실 작용기의 존재는 COOH 그룹의 1650 내지 1720cm^-1에서의 강한 흡수에 의해서 확인되었다. 이것은 100% 에탄올 추출에 의해 수득된 시료들 내에 이런 밴드들이 더 짧은 파장(1720cm^-1)에 존재한다는 것을 알려주고, 이것은 그 시료들 안에 비이온화된 COOH 그룹의 함량과 대응될 수 있다.

휴민 및 가공하지 않은 무미의 에탄올 추출물의 스펙트럼은 730 및 -1570cm^{- 1} 부가적인 밴드들을 보여주었다. 그들은 폴리메틸렌체인 및/또는 N-H 결합의 진동에 의한 것이다. 에탄올 추출물과 HA의 스펙트럼에 있어서, 2950cm^-1 부분의 흡수밴드는 또한 특징적이고, 탄화수소에서의 C-H 결합의 신축진동(stretching vibration)에 해당된다. 이 흡수의 강도는 HA<HymA<가공하지 않은 무미의 에탄올 추출물<휴민의 에탄올 추출물 순으로 증가하였다. 이것은 FA_total의 스펙트럼 내에서의, 다당체의 C-O 신축에 해당하는 1090cm^-1에서의 밴드는 다른 분획들의 스펙트럼에서 보다 더욱 잘 나타났다. 상대적으로 지질성 부분인 2930cm^-1 및 2850cm^-1 에서의 피크의 강도가 상대적으로 감소하는 것이 FA_total 분획의 IR 스펙트럼에서 확실히 나타났다.

그러므로, 가공하지 않은 무미 및 이것의 휴민에서의 에탄올 추출물, 그리고 HA 분획들은 탄화수소체인이 매우 긴 조각을 갖는 분자들을 함유하고 있음을 확인할 수 있었다. 이전에 무미에서 확인된 상대적으로 적은 분자량의 화합물들도 추출물 내에 존재할 것이다. 휴믹 물질들은 알킬/아로마틱 단위들의 골격으로 구성되어 있으며, 이것들은 산소 및 질소그룹에 의해 주로 상호결합(cross-linked) 되어있고, 주작용기로 카르복실산, 페놀 및 알콜성 히드록실기들(alcoholic hydroxyls), 케톤기, 퀴논기를 갖는다. 본 발명의 결과에 따르면, FA_total 스펙트럼에서, 긴 탄화수소조각을 갖는 분자들의 피크 특징은 없었다(도 3 참조).

휴민의 에탄올 추출물의 IR 스펙트럼에서, 2850cm^-1에서의 흡수밴드는 3400cm^-1근처에서의 신축 OH 진동의 밴드보다 더욱더 강하게 나타났다. 이것은 이 시료에서의 극성산소를 갖는 그룹(OH, COOH)의 더 적은 부분인 것을 증명한다. 그리고, 분명하게는 이것은 약 pH 7에서의 물과 염기성배지에서의 낮은 용해도와 관련이 있다. 이러한 관점으로 다른 IR 스펙트럼을 조사하면, HymA의 시료는 히드록시기 및 카르복실기를 매우 적게 함유하고 있고, 탄화수소조각이 증가되어있다는 것을 알 수 있다. 이런 관찰로, HymA는 물에 거의 용해되지 않고, 에탄올 같은 유기용매에 훨씬 더 용해가 잘 된다. 2950cm^-1에서 낮은 강도를 보이는 피크는 HA의 IR 스펙트럼에서도 관찰되고, 이것은 시료 내에 탄화수소체인이 어느 정도의 양으로 존재한다는 것을 가르킨다.

HA 및 FA_total의 조성에서 산소를 포함하는 그룹들의 양적차이분석을 하면, FA_total에 OH, COOH, C=O 및 메톡시그룹이 HA 에서보다 훨씬 많은 양으로 존재하였다.

일반적으로, 무미 분획들 중 극성 및 비극성 탄화수소 조각의 상대적인 함량은 IR 스펙트럼으로 결정되지만, 용액상 배지에서의 이들의 용해도와 매우 관련이 있다. 2900cm^-1 근처의 밴드강도가 감소하는 것은 C-H 결합 신축진동으로 인한 것이고, 휴민>HymA>HA>FA의 순으로 용액상배지에서의 용해도가 증가하였다.

실시예 5. 형광현미경을 이용한 분광학적 분석 및 HIX

형광도 측정은 F-2000 스펙트로플루오리메터(F-2000 spectrofluorimeter, Hitachi사, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행하였다.

가공하지 않은 무미, FA 분획(FA _total 및 FA1 내지 FA5) 및 LMW 분획들(LMW1 및 LMW2)은 분석 전에 pH를 중성으로 조정한 후 사용하였다. HymA 및 HA는 0.1M 수산화나트륨 용액에 용해되었다. 방출(emission) 형광분석을 위하여, 시료들을 254nm의 파장으로 여기시켰고, 그 형광강도를 300 내지 500nm의 범위내에서 측정하였다. 방출과 여기 파장를 위한 슬릿(slit) 넓이는 10nm였다. 동시스펙트럼은 여기 모노크로매터 (excitation monochromator)를 사용하여 파장차(Δλ)를 20nm로 하고 250nm에서 600nm까지 스캐닝함으로써 측정되었다.

형광 분광분석법은 휴믹화정도가 증가할 때 더 긴 파장쪽으로 방출 스펙트럼(emission sepctrum)이 이동하는 정도를 정량적으로 측정함으로써, 휴믹화의 정도를 결정하는데 사용될 수 있다. 이전의 연구들은 1차 및 2차 형광 내부-여과효과(fluorescence inner-filtration effects)간의 관계가 정확한 형광데이타의 제시 및 휴믹화지수(humification index, HIX)의 계산에 중요하다고 제시하였다.

HIX 수치는 하기 수학식 1을 사용하여 결정하였다.

상기 수학식 1 중, I(λ)는 여기 파장(excitation wavelength, λ_ex)가 254nm 일 때 여기하면서 그려지는 형광스펙트럼커브를 나타내는 함수이다.

내부-여과효과를 위해 수정된 휴믹화지수(HIX) 수치의 계산에 있어서, 각각 다른 농도의 분획들을 갖는 용액의 휴믹화지수 대 254nm에서의 투과도 (transmittance)의 플롯에 대하여 본 발명자는 직선상의 외삽 (extrapolation)을 수행하였다. 수정된 HIX 수치는 예를 들면 100% 투과도와 같은 무한의 희석에 대응한다.

무미로부터의 FA 분획들 및 HA의 고분자량 분획들의 모든 방출 형광 스펙트럼은 대체적으로 같은 형태를 나타내었다(도 4a 참조). 그리고, 420 내지 460nm에서 최고의 강도를 나타내는 다른 천연물질로부터 수득된 휴믹 물질의 스펙트럼과도 유사하였다.

방출스펙트럼의 특징은, HA 및 FA 분획들(FA_total, FA1 내지 FA5)(460nm)에서보다 가공하지 않은 무미, LMW1 및 LMW2에서 더 짧은 430nm 파장에서 최대값을 갖는 전형적인 넓은 밴드를 보이는 것이었다. 가공하지 않은 무미의 λ_em =430nm에서의 최대값은 이 시료(-31.8%)에서의 저분자량분획들의 높은 함량에 의해서 설명될 수 있다. 본 발명자는 동시형광분석을 사용하였다. 도 4b 및 4c에서와 같이, FA1 내지 FA5 분획들의 동시스펙트럼은 서로 구별되는 스펙트럼선 형태를 보인다. FA2와 FA1, FA3 내지 5의 스펙트럼간에 유의한 차이가 관찰되었다. FA2 분획은 415nm에서 단일피크를 갖는 스펙트럼을 보였다. FA1 및 FA3 내지 FA5 450nm 및 495nm에 서 주요 피크들을 갖는 스펙트럼을 보였다. 이외에 370nm(FA1), 380nm(FA5), 395nm(FA1, FA3, FA5), 415nm, 425nm, 435nm(FA1, FA4, FA5), 480nm(FA1, FA3-5), 520nm(FA1, FA3-5)에서 많은 다른 피크들을 보였다. 일반적으로, FA2 스펙트럼은 FA1 및 FA3-5 스펙트럼보다 더 짧은 최대파장을 나타내었고, FA1 및 FA3-5는 컨쥬게이트된 아로마틱 그룹을 많은 양 포함하는 것으로 나타났다. LMW1이 동시형광스펙트럼에서 270nm에서 단 하나의 피크를 갖는 것에 비해, LMW2 분획은 275 및 345nm에서 두 개의 주요 피크를 나타내었다. 가공하지 않은 무미에서는 3개의 최대피크가 관찰되었다. 하나는 270nm에서 보여지는 피크이고, 나머지는 355-385 및 305-415nm에서 보여지는 넓은 최대피크였다. 425-520nm 내의 작은 피크들은 FA 분획들의 스펙트럼들에서 최대로서 갖은 파장에 위치하였다. 가공하지 않은 무미, LMW1 및 LMW2 시료들의 270nm에서의 피크는 비슷한 스펙트럼 특징을 보이는 벤조산이라 할 수 있다(도 4b 참조). 분획시 사용된 물-에탄올 혼합액에서의 다른 용해도 때문에 생긴 LMW1 및 LMW2 분획들 간의 어떤 비율로 분포되어 있는 벤조산 유도체들에 의한 것이라 생각되어진다.

수정된 HIX 수치의 계산을 위해서, 우리는 HIX와 254nm에서의 투과율의 직선상의 관계를 사용하였다. 관계의 intercepts는 내부 여과효과를 위해 수정된 HIX 수치를 제공한다. 물(pH=7.0)에 용해된 각 분획들에 대한 HIX 수치의 범위는 FA3(11.1)>FA4(4.26)>FA2(3.33)>FA5(3.10)>가공하지 않은 무미(3.13)>FA1(2.23) >LMW2(0.95)>LMW1(-0.08) 순이다. HIX 수치의 편차의 범위는 휴믹화의 정도가 다른 토양으로부터 수득된 시료들에 대한 수치들(1.23 내지 7.65)의 편차를 다소 넘는 다. 최소의 HIX 수치는 LMW1 및 LMW2의 분획에서 보여졌다.

실시예 3 내지 5의 무미 분획들의 분석결과들을 하기 표 1에 정리하였다.

	탄수화물 함량	UV/VIS 데이타 (λmax, nm)	FT IR 데이타(cm-1)	형광 데이타 (λem, nm)
가공하지 않은 무미				270, 370, 410
FAtotal			3400, 1450, 1090
FA1	2.3	402, 665	3400, 2900, 1720 1600, 1450, 1350	370, 395, 435, 480
FA2	1.8	402, 665	3400, 2900, 1720 1600, 1350	415
FA3	0.6		3400	395, 480
FA4	0.6		3400	435, 480
FA5	0.5		3400	380, 395, 435, 480
LMW1		280	3400	270
LMW2	0.3	270	3400	275, 345

실시예 6. HPSEC 분석

시료들은 4개의 펌프와 다양한 파장의 UV-탐지기가 장착된 1100 고성능액체크로마토그래피시스템(1100 high performance liquid chromatography system, Hewelett-Packard사, Palo Alto, CA)을 사용하여 분석되었다. 조박스 PSM 300 컬럼(Zorbax PSM 300 column, Hewelett-Packard사, CA) 및 탐지 파장으로 254, 278, 및 340nm 가 HPSEC 분석에 사용되었다. 컬럼은 길이 25㎝이고 내경(inner diameter)이 6.2㎝이었다. 이동상으로 0.1M NaCl, 0.02M K₂HPO₄ 및 0.02M KH₂ PO₄(pH 6.8)의 조성을 갖는 용액을 사용하였다. 용매 및 모든 시료는 0.2㎛의 멤브레인필 터를 사용하여 여과하였다. 유속은 1.0㎖/분 이었으며, 사용한 시료 주입 부피는 20㎕이었다.

HPSEC 분석에서, FA_total 및 FA1 내지 FA5 분획들은 10kDa 컷-오프 투석 후에 사용되었다. 다른 시료들(가공하지 않은 무미, LMW1, LMW2, 알드리치사 HA)은 투석없이 사용되었다. 무미분획용출액의 탐색을 위하여, UV 탐지기를 254nm에서 사용하였다. 그 이외에도, 벤조산 및/또는 그의 유도체들을 탐지하기 위하여, 278nm 파장을 사용하였고, FA의 특징을 보기 위하여 340nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2a 참조).

가공하지 않은 무미의 크로마토그램은 머무름시간(retention time, R_t)가 5.01, 5.26, 5.60 분일 때에 따라 254nm의 UV 탐지기에서 3개의 주요 피크가 나타났다. 340nm 파장으로 탐지할 때, 가공하지 않은 무미의 크로마토그램은 R_t=4.96분일 때 단 하나의 피크를 보였고(도 5 참조), 이것은 분명히 FA에 의한 결과이다. HPSEC 컬럼으로부터 용출된, 254nm에서 탐지되는 모든 FA 분획들은 크로마토그램에서 미세한 쇼울더를 갖는 넓고, 단일 형태의 분포를 보였다. 유사한 크로마토그램 구조가 다른 자연 원료에서 분리한 FA에서도 또한 나타났으며, 이것은 이런 물질들의 폴리디스퍼젼(polydispersion) 때문이다. 무미에서 분리된 FA1 내지 FA5 분획물들에 대한 R_t 인덱스들은 서로 매우 비슷한 수치를 갖으며,(각각 4.86, 5.00, 4.83, 4.78 및 4.90분) FA_total도 R_t=4.78로 비슷했다. 알트리치사의 HA의 HPSEC 크로마토그 램(254nm)은 단 하나의 피크를 보였고, R_t=4.91이었으며,무미의 FA 분획들의 R_t 수치와 비슷했다.

문헌상의 데이터에 따르면, 강이나 토양에서 분리한 대부분의 휴믹 물질들의 분자량은 2000 내지 15000 달톤으로 측정되었다. 알드리치사의 HA의 평균 분자량은 132000 달톤에서 15000 달톤 정도이다. 본 발명의 무미로부터 분리된 휴믹 물질들의 평균 분자량은 아직 측정되지 않았다. 무미 내에 존재하는 FA는 토양이나 자연 저수지로부터 분리된 것보다 더 높은 분자량을 갖을 것이다. 본 발명의 연구에서, FA 분획들의 머무름시간(R_t=4.78-5.00분)은 알드리치사의 HA의 머무름시간(R_t=4.91분)과 매우 비슷한 수치를 나타내었다. 이것으로 10kDa 컷-오프 투석으로 수득된, 무미로부터의 FA 분획들의 평균 분자량이 10000 내지 15000달톤 범위 내일 것이라고 추정할 수 있다.

254nm에서, LMW1의 크로마토그램은 두 개의 큰 피크(R_t=5.30 및 5.61분)을 갖고, 더욱 작은 분자량의 물질의 지역에서 넓은 쇼울더를 보였다(도 5 참조). 278nm에서 탐색했을 때, LMW1의 크로마토그램은 하나의 피크(R_t=5.28분)를 갖고, 벤조산의 피크에서의 R_t도 5.28분으로 일치한다. LMW1의 HPSEC 분석결과들은 UV 및 형광분광분석데이타와 일치하고 (도 2a, 도 4b) 벤조산 및/또는 그의 유도체들은 이 분획의 주요 구성요소임을 확인해 준다.

LMW2의 첫 번째 및 두 번째 피크 R_t 수치는 5.32 및 5.58분이었다(도 5 참 조). 이런 피크들은 각각 다른 헤테로사이클릭 화합물의 추출에 의한 것이며, 긴 사슬의 지질탄화수소 및 그들의 유도체들이다.

상기 실시예 6의 무미 분획들의 HPSEC에서의 분자량 및 머무름 시간을 표 2에 정리하였다.

	분자량 분포	머무름 시간(Rt, 분)
가공하지않은 무미		254nm	5.01, 5.26, 5.60
		278nm	-
		340nm	4.96
FAtotal	10000-15000	254nm	4.78
		278nm	-
		340nm	-
FA1	10000-15000	254nm	4.86
		278nm	-
		340nm	-
FA2	10000-15000	254nm	5.00
		278nm	-
		340nm	-
FA3	10000-15000	254nm	4.83
		278nm	-
		340nm	-
FA4		254nm	4.78
		278nm	-
		340nm	-
FA5		254nm	4.90
		278nm	-
		340nm	-
LMW1		254nm	5.30, 5.61
		278nm	2.58
		340nm	-
LMW2		254nm	5.32, 5.58
		278nm	-
		340nm	-
HA(알드리치사)		254nm	4.91
		278nm	-
		340nm	-

실시예 7. 전체 탄수화물 함량

원재료 무미 및 무미 분획 내의 전체 탄수화물 함량을 분석하기 위하여, 페놀 반응 방법(한국생화학회, 실험 생화학 3 개정, 탐구당, 1997, pp249-259)을 사용하여 측정하였다.

전체 탄수화물함량은 0.5㎖의 시료(무미분획 4mg을 증류수 1㎖에 용해시킨 것)에 0.5㎖의 50g/ℓ페놀용액을 첨가하여 혼합하고, 다시 2.5㎖의 진한 황산을 첨가하고 빠르게 다시 혼합하였다. 이 용액을 27℃에서 20분간 반응시킨다. 그 다음 이것의 흡광도를 488nm에서 측정하였고, 글루코즈 표준용액을 이용하여 미리 작성한 검량곡선(glucose standard curve)의 흡광도와 비교하였다. 탄수화물 함량분석은 3회 반복하여 수행하였으며, 이 결과는 mg 탄수화물/ g 으로 표기 되었다.

78 내지 80% 에탄올-물(v/v) 혼합물은 다당체로부터 단당체 (monosaccharides) 및 올리고당(oligosaccharides)을 분리하는데 사용되었다. 상기 농도의 에탄올은 잔기에서 다당체를 떨어뜨리는 저분자량의 탄수화물을 추출할 수 있다. 그러므로 FA1 내지 FA5 분획들의 탄수화물들은 FA 조성내의 다당체들이거나 탄수화물의 일부분이고, 반면에 LMW1 및 LMW2 분획들은 주로 단당 또는 올리고당이었다. 탄수화물의 최고치는 FA1 및 FA2에서 관찰되며 각각 2.3㎎/g 및 1.8㎎/g 건조중량이었다. 탄수화물의 함량은 이온교환크로마토그래피에서 분리된 FA3, FA4 및 FA5에서는 훨씬 적으며, 각각 0.8, 0.6, 0.5㎎/g 건조중량 이었다. FA_total으로부터의 다당체의 많은 부분이 DEAE-셀룰로오즈에 흡착되지 않았거나 컬럼으로부터 연속적으로 용출되지 않은 것으로 생각된다. 저분자량의 분획들에서 탄수화물 함량 분 석은 단당 및 올리고당이 LMW2에 거의 없다(0.29㎎/g 건조중량)는 결과를 보여주며 LMW1에는 발견조차 되지 않았다. 가공하지 않은 무미(0.4㎎/g 건조중량)에서의 낮은 탄수화물 함량은 LMW1 및 LMW2 분획이 많은 부분을 차지하고 있는 것 때문이다.

실시예 8. 복강 대식세포의 분리

복강 대식세포는, 8주령 웅성 BALB/C 마우스에 100㎍의 콘카나발린 A를 함유한 생리식염수를 복강에 주사하고 4일 지난 후에 분리되었다.

복강에서 삼출된 세포들은 10단위 헤파린/㎖을 첨가한 차가운 RPMI 1640 배지 10㎖를 가지고 세척(lavage)함으로써 수득되었다. 그 다음, 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신) 및 10% FCS(fetal calf serum)를 함유한 RPMI 1640 배지 내에 복강에서 삼출된 세포를 넣고, 이를 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 10⁶세포 정도로 넣었다. 2시간 후에, 플레이트에 부착되지 않은 세포를 페놀레드가 없는 RPMI 배지로 씻어 버리고, 남아있는 복강 대식세포에 무미 분획을 다양한 농도로 처리하여 하기 실험을 수행하였다.

실시예 9. 통계적 분석

결과들은 모두 평균 ± 표준편차로 표현되었으며, 통계적 비교는 각 쌍의 수치에 대하여 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 하여 수행되었다.

실험예 1. ROS 형성 분석

ROS 형성은 2', 7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)를 사용하여 형광탐색을 하여 분석하였다. 이것은 세포에 들어갈 때, 탈에스테르화되어 이온화된 자유산(ionized free acid), 즉 DCFH가 되고, 이것은 ROS와 반응하여 형광을 띄는 2'7'-디클로로플루오레신(DCF)을 형성한다.

DCFH를 생성하기 위하여, 5mM DCFH-DA 용액을 2.5mM NaOH와 혼합하여 빛이 없는 상온에서, 1시간동안 반응시켜 탈아세틸화하였다. 과산화수소(H₂O₂)는 용액내의 효소 존재하에서 글루코오스의 이화적 전환 글루코스 옥시다제의 효소 반응에 의해 생성되었다. β-D-글루코오스는 글루코오스 옥시다제에 의해 산화되어 D-글루코닉산과 과산화수소를 생산한다.

분석은 24-웰 플레이트에서 시행되었으며, 반응은 20㎕ 글루코오스 옥시다제 스톡을 첨가함으로서 시작되었다. 반응의 끝에, 5.0mM 글루코오스, 0.2U/㎖ 글루코오스 옥시다제, 0.015U/㎖ 호올스래디쉬 퍼록시다제 및 10mM 소디움 포스페이트 완충액에 용해시킨 30μM DCFH(pH 6.5)의 혼합액을 첨가하였다. DCFH 산화는 1420 왈락(Perkin Elmer, UK) 빅터 2 멀티라벨 플레이트 리더 온도 콘트롤(30℃)를 사용하여 형광흡광도를 측정하였다.

해당되는 반응식을 하기에 도시하였다.

요약하자면, 무미 분획 첨가 후에 세포들을 90분 또는 48시간동안 5% CO₂, 37℃에서 배양하였고, DCFH-DA (3μM)의 존재하에서 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate, 1 또는 5μM)에 의해 활성화 되거나 활성화되지 않았다. ROS 생성은 웰당 형광도(λ_ex=485nm, λ_em=535nm)의 증가로서 측정되었다. 형광도는 90분이 될 때까지, 3 내지 4분 간격으로 측정되었으며, 1420 왈락 빅터 2 멀티라벨 플레이트 리더(1420 Wallac Victor 2 multilabel plate reader, Perkin Elmer사, UK)로 37℃ 온도 대조군과 함께 측정되었다.

본 발명의 예비 연구에서 FA의 복강 대식세포의 활성효과는, 장시간(24-48시간)동안 FA_total과 세포를 함께 배양하는 동안 관찰되었으나 단시간(1-2시간)동안 FA_total과 세포를 배양하는 동안에는 단지 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)의 반응에 대한 초기 효과 (priming effect)만 관찰되었다. 세포가 FA_total에 노출되는 시간 (0 내지 5시간)이 증가함에 따라, PMA에 반응한 대식세포에 의한 ROS 생성률은 증가하였다(데이타는 보여지지않음). FA_total과 세포를 90분간 배양하고, 이어서 배지로부터 제거하는 것은 대식세포에 의한 자연적인 그리고 PMA에 의해 자극된 ROS 생성에 대한 유의적인 효과는 없었다. 세포들에 의한 DCFH 산화의 최대율은 FA_total이 존재할 때에 PMA에 대한 반응에서 관찰되었다(도 6a 참조). 이 결과들은 세포배양배지에서의 FA 존재가 PMA-유도 ROS 생성을 강화시킨다는 것을 증명한다.

ROS에 대한 FA의 분자량 및 이온화도의 영향을 분석하기 위하여, 세포들을 FA1 내지 FA5 분획들로 90분동안 미리 처리하였고, PMA-자극된 ROS 생성을 그 후 90분동안 측정하였다. 이 결과들은 에탄올 침전에 의해 분리된 FA1 및 FA2 분획들은 대식세포에서 ROS의 유의적상승을 일으킴을 보여주었다(도 6b 참조). 이온교환크로마토그래피에의해 분리된 FA3 내지 FA5 분획들 중에서, FA3 만이 대식세포에대한 생물학적활성을 가졌으며, FA4는 증가된 이온화도, DEAE-셀룰로오즈에대한 흡착력은 높으나 FA4가 높은 농도(70㎍/㎖)로 처리될 때는 오히려 억제활성을 나타낸다.

대식세포에 의한 자연적인 ROS 생성에 대한 무미 분획들의 영향을 조사하기위하여, 세포들은 48시간동안 FA_total, LMW1 및 LMW2 분획들을 다양한 농도로 세포에 처리하여 배양하였다. 세포배양의 배지는 DCFH-DA를 함유하는 새로운 것으로 대체되었고, 형광강도는 이후 90분동안 측정되었다(도 7 참조). ROS 생성에 있어서 유의적으로 활성화된 것은 FA_total을 20 내지 200㎍/㎖의 농도로 세포에 처리한 경우에만 관찰되었다(p<0.05). 20 내지 200㎍/㎖의 농도의 LMW1으로 처리된 세포들은 대조군과 비교하여 ROS 생성에 있어서 유의적인 변화를 보이지 않았다. 반면, LMW2의 첨가는 ROS 생성에 있어서 감소를 나타내었다. LMW2의 억제효과는 이 분획들의 조성에 저분자량의 물질이 세포독성활성을 나타냄과 관련이 있다.

실험예 2. 질산(NO)생성 측정

상기 실시예 5의 방법과 같이 복강의 대식세포를 분리한 후에, 세포를 무미 분획물 중 하나 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, 0.5㎍/㎖)를 투여하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간동안 배양하였다. 48시간 배양이 끝나고, 상층액을 분리하여 NO의 양을 분석하였다. 아질산 이온(NO₂ ^-)의 농도는 NO이 생성됨을 알려주는 표지로 사용되었다. 배양 배지 내의 아질산이온의 양은 NaNO₂를 기준으로 사용하여 발색정도를 측정하는 방법으로 결정되었다.

요약하면, 100㎕의 세포배양상층액에 동량의 그리스시약(Griess reagent, 0.1% (w/v)N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride + 1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v)phosphoric acid)을 넣고 혼합한 다음 상온에서 20분 두었으며, 그 후 울트로스펙 4000 스펙트로포토메터 (Pharmacia Biotech사, Uppsala, Sweden)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

대식세포를 48시간동안 무미 분획들과 함께 배양시켰고, 배양 상층액들에서의 NO 농도들을 그리스 반응으로 측정한 결과, FA1 및 FA2는 복강 대식세포들의 NO 합성을 용량의존적으로 증가시켰다. FA1 및 FA2 분획들은 NO 생성에 있어서, 각각 2㎍/㎖ 이상일 경우와 20㎍/㎖ 이상일 경우에 유의적인 효과가 있었다. 그리고, FA1 및 FA2 분획들의 200㎍/㎖의 농도에서의 활성효과는 0.5㎍/㎖ LPS의 효과와 유사했다. LMW1 및 LMW2 분획들은 NO 생성을 활성화시키지 않았다(도 8 참조).

실험예 3. 스플레노사이트 증식

BALB/c 마우스의 스플레노사이트를 분리하여 5×10⁶/㎖로 10% FCS, 항생제 및 0.05mM β-머캅토에탄올을 첨가한 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 시료들(0.15mM NaCl을 함유한 인산완충액(pH 7.2)에 용해시킨 것)을 96-웰 플레이트에 최종 농도 0(대조군), 2, 20 또는 100㎍/㎖로 첨가하였다. 그 다음 0.1㎖(5×10⁵세포)의 세포 현탁액 및 0.1㎖의 배지를 웰에 첨가하였다. 무미분획은 첨가하지 않고 5㎍/㎖ 콘카나발린 A를 포함하고 있는 시료를 양성대조군으로 사용하였다. 플레이트들은 37℃, 5% CO_2, 100% 습도의 조건에서 72시간 동안 배양되었다.

다시 각 웰에 [³H]티미딘(1μCi)를 첨가하고, 그 혼합액을 부가적으로 18시간동안 더 배양하였다. 배양 후, 세포들을 글래스 화이버 매트(glass fiber mat) 위에 수집한 다음, 삽입되지 않은 티미딘을 세척하여 제거하고, 그 다음 리퀴드 신티레이션 스펙트로스코피를 사용하여 방사능을 조사하였다. 이 증식실험은 3회 반복되었으며, 대표적인 결과 데이터를 제시하였다.

무미 분획들을 처리한 림프구의 DNA에 [³H]티미딘이 끼어듬을 측정함으로써 본 발명자는 FA1을 처리한 세포에서 [³H]티미딘이 용량의존적으로 증가함을 발견하 였다. 이것은 대조군과 비교하여 20㎍/㎖ 보다 더 높은 농도에서 통계적으로 유의함을 보였다(p<0.05)(도 9 참조). 500㎍/㎖의 FA1 농도에서 [³H]티미딘의 편입수치는 콘카나발린 A 자극에 의한 것의 약 40% 정도 되었다. FA2, LMW1 및 LMW2 분획들은 스플레노사이트 증식에 효과가 없었다.

본 발명의 러시아산 무미 추출물 또는 분획물들은 대식세포에서의 활성산소종 및 NO 생산을 증진시키고, 스플레노사이트의 증식을 촉진시키므로, 면역 억제 및 면역계가 손상된 환자에게 면역력 조절을 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있으며, 또한 감염 또는 염증으로 인한 각종 질환의 예방 및 치료용 의약품으로서 사용할 수 있다.

Claims (16)

1. 무미 재료를 각종 분쇄기기로 분쇄 또는 파쇄하고, 염기성용액을 사용하여 실온에서 12시간 내지 48시간동안 교반하고, 원심분리를 통하여 상층액인 조추출물을 수득하는 제 1 단계;

   상기 조추출물에 강산을 가한 후, 원심분리를 수행하여 상층액인 펄빅산(FA) 및 휴믹산(HA)을 수득한 다음, 펄빅산 용액인 상층액에 다시 강염기를 가하여 pH를 6.5 내지 8.0로 조정한 후 0.2 내지 0.5㎛ 필터로 여과하여 FA_total 용액을 수득하는 제 2 단계;

   상기 제 2단계의 최종 수득된 FA_total 용액에 에탄올을 첨가하여 최종농도 60 내지 70%로 제조한 후, 원심분리하여 상층액 및 침전물 1을 수득하고, 상층액에 다시 에탄올을 첨가하여 최종농도 80 내지 90%로 제조한 후 원심분리하여 상층액 및 침전물 2을 수득한 다음 각각의 침전물 1 및 2를 투석을 수행하여 FA1 및 FA2 분획을 수득하는 제 3 단계;

   상기 제 2단계의 최종 수득된 FA_total 용액을 투석을 수행하여 수득된 FA 용액을 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 통과시키고, 0.3 내지 2.0몰의 염화나트륨 용액들을 사용하여 단계적으로 용출시켜 FA3, FA4 및 FA5 분획을 수득하는 제 4 단계;

   이어, 상기 제 3단계의 85% 에탄올에 가용한 분획을 농축시켜 저분자량의 물질로 포화된 용액에 동량의 에탄올을 가한 후에 재침전시켜 얻어지는 LMW1 및 LMW2 분획을 수득하는 제 5 단계로 이루어진 단계를 포함하는 러시아산 무미로부터 면역활성 증강용 조성물의 제조방법.
2. 제 1항의 제조방법으로 수득된, 분자량이 10,000 내지 15,000이고, UV/VIS에서는 402nm 및 665nm에서 최대흡수파장을 보이고, IR에서는 3400, 1450 및 1090cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내는 것을 특징으로 하는 러시아산 무미 추출물 FA_total.
3. 제 1항의 제조방법으로 수득된, 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 2.3중량%이고, UV/VIS에서 402 및 665nm에서 최고의 흡수파장을 나타내며, IR에서는 3400, 2900,1720, 1600, 1450 및 1350cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 370, 395, 435 및 480nm에서 나타나는 것을 특징으로 하는 러시아산 무미 분획물 FA1.
4. 제 1항의 제조방법으로 수득된, 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 1.8중량%이고 UV/VIS에서 402 및 665nm에서 최고의 흡수파장을 나타내며, IR에서는 3400, 2900,1720, 1600 및 1350cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 415nm에서 나타나는 것을 특징으로 하는 러시아산 무미 분획물 FA2.
5. 제 1항의 제조방법으로 수득된, 분자량이 10,000 내지 15,000이고, 탄수화물 함량이 0.6중량%이고, IR에서는 3400cm^-1에서 흡수밴드들을 나타내고, 형광 방출파장은 395 및 480nm에서 나타나는 것을 특징으로 하는 러시아산 무미 분획물 FA3.
6. 제 2항의 러시아산 무미 추출물 FA_total 을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물.
7. 제 3항 내지 제 5항에 기재된 러시아산 무미의 분획물 FA1, FA2 및 FA3로부터 선택된 하나이상의 분획물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제 2항의 러시아산 무미 추출물 FA_total 을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 눈의 감염증, 출혈성 눈의 감염증, 식도염, 식도암, 기관지염, 아토피성 피부염, 욕창, 피부궤양 또는 피부염증질환의 예방 및 치료용 조성물.
12. 제 3항 내지 제 5항에 기재된 러시아산 무미의 분획물인 FA1, FA2 및 FA3로부터 선택된 하나이상의 분획물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 눈의 감염증, 출혈성 눈의 감염증, 식도염, 식도암, 기관지염, 아토피성 피부염, 욕창, 피부궤양 또는 피부염증질환의 예방 및 치료용 조성물.
13. 삭제
14. 제 6항, 7항, 11항 또는 12항 중 어느 한 항에 있어서, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 또는 멸균주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 삭제
16. 삭제

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