KR100547931B1 - 수용성 파클리탁셀 전구약물을 포함하는 조성물 및 이러한조성물을 포함하는 이식가능한 의료장치 - Google Patents

수용성 파클리탁셀 전구약물을 포함하는 조성물 및 이러한조성물을 포함하는 이식가능한 의료장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 수용성 킬레이트화제, 폴리에틸렌 글리콜 또는 중합체, 예를 들어 폴리(1-글루탐산) 또는 폴리(1-아스파트르산)에 공액시킴으로써 형성된 파클리탁셀 및 도세탁셀의 수용성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당해 조성물을 사용하여 종양, 류마티즘성 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하고 종양에 의한 파클리탁셀 흡수량 및 방사성표지된 DTPA-파클리탁셀 종양 이미지화를 예상하는 방법을 기술한다. 다른 양태는 재발협착증의 예방을 위한 삽입가능한 스텐트의 피복물을 포함한다.
파클리탁셀, 도세탁셀, 수용성 킬레이트제, 글루탐산, 아스파르트산, 종양, 자가면역질환, 스텐트

Description

수용성 파클리탁셀 전구약물을 포함하는 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 이식가능한 의료 장치{A composition comprising water soluble parclitaxel prodrugs and an implantable medical device comprising the same}
도 1a는 파클리탁셀, PEG-파클리탁셀 및 DTPA-파클리탁셀의 화학 구조를 도시한 것이다.
도 1b는 PG-파클리탁셀을 제조하기 위한 화학 구조 및 반응식을 도시한 것이다.
도 2는 B16 흑색종 세포 증식에 대한 파클리탁셀, PEG-파클리탁셀 및 DTPA-파클리탁셀의 효과를 도시한 것이다.
도 3은 MCa-4 유방 종양에 대한 DTPA-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다.
도 4는 파클리탁셀, DTPA-파클리탁셀 및 PEG-파클리탁셀로 치료한 후, 12mm의 종양 직경에 도달하는 평균 시간(일수)을 도시한 것이다.
도 5는 111In-DTPA-파클리탁셀 및 111In-DTPA의 정맥내 주사 후, MCa-4 종양을 갖는 마우스의 감마-신티그램을 도시한 것이다. 화살표는 종양을 나타낸다.
도 6은 PBS(pH 7.4)에서 37℃로 측정한 것으로서 PG-파클리탁셀의 가수분해 적 분해를 도시한 것이다. --□--는 가용성 PG에 부착하여 잔류하는 파클리탁셀의 %를 나타내고, --△--는 방출된 파클리탁셀의 %를 나타내며, --○--는 생성된 대사산물-1의 %를 나타낸다.
도 7a는 쥐 유방 종양(1376F)을 갖는 랫트에 대한 PG-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다. -□-는 PG(0.3g/kg)의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내고; -△-는 파클리탁셀(40mg/kg)에 대한 반응을 나타내며; -○-는 PG-파클리탁셀(60mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타낸다.
도 7b는 OCa-I 종양을 갖는 마우스에 대한 PG-파클리탁셀 및 파클리탁셀의 항종양 효과를 나타낸다. -□-는 PG(0.8g/kg)의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내고; -△-는 파클리탁셀(80mg/kg)에 대한 반응을 나타내며; -●-는 PG-파클리탁셀(80mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타내고; -○-는 PG-파클리탁셀(160mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타낸다.
도 7c는 MCa-4 유방 암종을 갖는 마우스에 대한 PG-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다. -□-는 염수의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내고; -△-는 PG(0.6g/kg)의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내며; -◆-는 PG-파클리탁셀(40mg/kg)에 대한 반응을 나타내고; -◇-는 PG-파클리탁셀(60mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타내며; -○-는 PG-파클리탁셀(120mg/kg)에 대한 반응을 나타낸다.
도 7d는 마우스에서 연조직 육종 종양(FSa-II)에 대한 PG-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다. -□-는 염수의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나 타내고; -◇-는 PG(0.8g/kg)의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내며; -○-는 파클리탁셀(80mg/kg)에 대한 반응을 나타내고; -△-는 PG-파클리탁셀(160mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타낸다.
도 7e는 마우스에서 선천적 간암 종양(HCa-I)에 대한 PG-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다. -□-는 염수의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내고; -△-는 PG(0.8g/kg)의 단일 정맥내 투여량에 대한 반응을 나타내며; -○-는 PG-파클리탁셀(80mg/kg)에 대한 반응을 나타내고; -△-는 PG-파클리탁셀(160mg 당량의 파클리탁셀/kg)에 대한 반응을 나타낸다.
도 8은 인산염 완충액(pH 7.4) 중의 PEG-파클리탁셀로부터의 파클리탁셀의 방출 프로파일을 도시한 것이다. 파클리탁셀, -X-; PEG-파클리탁셀, -○-.
도 9는 MCa-4 유방 종양에 대한 PEG-파클리탁셀의 항종양 효과를 도시한 것이다. -□-는 PEG(60mg/kg)의 염수 용액의 단일 정맥내 주사에 대한 반응을 나타내고; -■-는 크레모퍼/알콜 비히클에 대한 반응을 나타내며; -○-는 체중 kg당 파클리탁셀 40mg/kg의 단일 투여량을 나타내며, -●-는 체중 kg당 40mg 당량의 파클리탁셀에서 PEG-파클리탁셀을 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 암, 자가면역 질환 및 재발협착증의 치료에 사용되는 약제학적 조성물 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 파클리탁셀(탁솔) 및 도세탁셀(탁소테레)과 같은 항암제의 약제학적 제제 분야에 관한 것이고, 특히 파클리탁셀을 수용성 잔기에 공액시켜 파클리탁셀을 수용성으로 만드는 분야에 관한 것이다.
태평양 주목인 탁서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 침엽 및 나무껍질에서 추출되는 항미세관 제제인 파클리탁셀은 I 단계 연구 및 초기 II 단계 및 III 단계 시도에서 사람 암에서 항종양 효과가 탁월한 것으로 알려졌다[참조: Horwitz et al., 1993]. 이는 주로 진행된 난소암 및 유방암에서 보고되었다. 탁월한 활성은 소세포 및 비소세포 폐암, 두부(head) 및 경부(neck)암 및 전이성 흑색종에서 증명된다. 그러나, 파클리탁셀을 임상적으로 사용할 때의 주요 문제는 이의 물에서의 불용성이다.
도세탁셀은 타커스 박카타의 침엽으로부터 추출되고 화학적으로 합성된 측쇄와 에스테르화된 비세포독성 전구체인 10-데아세틸 박카틴 III으로부터 반합성적으로 제조된다[참조: Cortes 및 Pazdur, 1995]. 유방암, 폐암, 난소암, 결장암 및 흑색종을 포함한 다양한 암 세포주는 도세탁셀에 반응성인 것으로 알려졌다. 임상적 시도에서, 도세탁셀을 사용하여 유방암, 난소암, 두부 및 경부암 및 악성 흑색종에 대한 완전 반응 또는 부분적 반응을 성취하였다.
파클리탁셀은 전형적으로 크레모퍼 EL(폴리옥시에틸화 피마자유) ml당 파클리탁셀 6mg, 및 탈수 알콜(50% v/v)을 함유하는 농축액으로서 제형화되고 투여 전에 추가로 희석시켜야 한다[참조: Goldspiel, 1994]. 필요한 양의 파클리탁셀을 이동시키는데 필요한 크레모퍼 EL의 양은 크레모퍼로 제형화되는 다른 약물과 함께 투여되는 양보다 훨씬 많다. 혈관확장, 호흡곤란 및 저혈압증을 포함한 몇가지 독성 효과는 크레모퍼로 인한 것이다. 이 비히클은 또한 실험용 동물과 사람에서 심각한 과민성을 일으키는 것으로 알려졌다[참조: Weiss et al., 1990]. 사실, 정맥내 거환 주사로 마우스에게 투여할 수 있는 파클리탁셀의 최대량은 크레모퍼 비히클의 급성 치사 독성에 의해 결정된다[참조: Eiseman et al., 1994]. 또한, 계면활성제인 크레모퍼 EL은 폴리비닐클로라이드 백과 정맥내 투여용 튜브로부터 디(2-에틸헥실)프탈레이트(DEHP)와 같은 프탈레이트 가소제를 걸러내는 것으로 공지되어 있다. DEHP는 동물에서 간독성을 일으키고 설치류에서 발암성인 것으로 알려져 있다. 이러한 파클리탁셀 제제는 또한 시간 경과에 따라 미립자를 형성함으로써 투여하는 동안 여과해야 하는 것으로 알려져 있다[참조: Goldspiel, 1994]. 따라서, 약물을 환자에게 안전하게 전달하기 위해서는 파클리탁셀 용액의 제조 및 투여에 특별한 장치가 필요하고, 이로 인해 불가피하게 경비가 많이 든다.
수용성 파클리탁셀을 수득하기 위한 선행 시도는 2‘-하이드록실 그룹 또는 7-하이드록실 위치에 석시네이트 및 아미노산과 같은 가용성 잔기로 치환시킴으로써 파클리탁셀의 전구약물을 제조함을 포함한다[참조: Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992]. 그러나, 이러한 전구약물은 개발하기에 화학적으로 충분히 안정하다고 밝혀져 있지 않다. 예를 들어, 문헌[참조: Deutsch et al.(1989)]에서는 파클리탁셀의 2’-석시네이트 유도체를 기술하고 있으나, 나트륨 염의 수용해도는 단지 약 0.1%이고, 트리에탄올아민 및 N-메틸글루카민 염은 약 1%에서만 가용성 이다. 또한, 아미노산 에스테르는 불안정하다고 보고되어 있다. 유사한 결과는 문헌[Mathew et al. (1992)]에 보고되어 있다. 그린왈드 등(Greenwald et al.)은 수용성이 우수한 탁솔의 2‘- 및 7-폴리에틸렌 글리콜 에스테르의 합성을 문헌[참조: Greenwald et al., 1994]에서 보고하였으나, 이러한 화합물의 생체내의 항종양 활성에 관한 어떠한 데이터도 보고되어 있지 않다[참조: Greenwald et al., 1995].
이러한 문제를 해결하기 위한 기타의 시도는 파클리탁셀을 리포좀 및 극소구(nanosphere)내에 마이크로캡슐화시킴을 포함한다[참조: Bartoni 및 Boitard, 1990). 리포좀 제형은 유리 파클리탁셀만큼 효과적인 것으로 보고되어 있으나, 2% 미만의 파클리탁셀을 함유하는 리포좀 제형만이 신체적으로 안정하다[참조: Sharma 및 Straubinger, 1994]. 불행히도, 극소구 제형은 독성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 약물의 불용성에 의해 발생되는 문제없이 유효량의 파클리탁셀 및 도세탁셀의 유효량을 전달할 수 있는 수용성 파클리탁셀 제형이 여전히 요구되고 있다.
파클리탁셀의 광범위한 사용에 대한 다른 문제는 파클리탁셀이 제조되는 자원이 제한되어 파클리탁셀 치료의 비용이 비싸다는 점이다. 치료 과정에는, 예를 들면 수천 달러의 비용이 필요할 수 있다. 또한, 파클리탁셀 치료에 모든 종양이 반응하지 않는다는 가중된 문제가 있고, 이는 파클리탁셀이 종양까지 이르지 않기 때문일 수도 있다. 따라서, 종양, 류마티즘성 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하고, 혈관형성술 및 스텐팅(stenting)과 같은 외상을 입기 쉬운 혈관의 재발협착증을 예방하기 위한, 긴 혈청 반감기를 갖는 수용성 파클리탁셀 및 관련된 약물의 유효 제형이 즉시 필요하다.
본 발명은 화학치료학적 및 항맥관형성성 약물, 예를 들어 수용성 중합체(예: 폴리글루타민산 또는 폴리아스파르트산) 또는 수용성 금속 킬레이트화제에 공액된 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 조성물을 제공함으로써 선행 기술에서 유래되는 상기 단점 및 기타 단점을 극복하고자 한다. 본원에서 이러한 조성물은 예시의 종양 모델에 대한 항종양제로서 의외로 효과적인 것으로 나타나고, 탁산 또는 탁소이드가 효과적인 것으로 공지되어 있는 모든 질병 또는 상태에 대해 파클리탁셀 또는 도세탁셀도 그 이상으로 효과적일 것으로 기대되고 있다. 본 발명의 조성물은 약물 자체의 불용성과 관련된 단점을 해결하기 위해 수용성 탁소이드를 제공하고, 또한 방출을 조절하는 잇점을 제공하여, 본원에서 단일 정맥 투여 후 종양이 동물 모델에서 근절되는 것을 보여준다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 기타 치료제, 대조제(contrast agent), 및 에토포사이드, 테니포사이드, 플루다라빈, 독소루비신, 다우노마이신, 에모딘, 5-플루오로우라실, FUDR, 에스트라디올, 캠프토테신, 레틴산, 베라파밀, 에포틸론 및 사이클로스포린을 포함하는 약물의 수용성 중합체 공액체를 제조할 수 있다. 특히, 유리 하이드록실 그룹을 갖는 이들 제제는 파클리탁셀에 대해 본원에서 기술한 바와 유사한 화학 반응에 의해 중합체에 공액시킬 수 있다. 이러한 공액은 화학 분야의 일상적 실험 기술내에 익히 공지되어 있고, 본 발명의 청구범위 내에 있다. 이러한 제제는 에토포사이드, 테니포사이드, 캠프토테신 및 에포틸론을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수용성 중합체에의 공액은 약물의 중합체 또는 킬레이트화제에의 공유결합을 의미한다.
또한, 본 발명의 수용성 공액체는 기타 항종양 또는 항암 약물을 포함하는 기타 약물과 함께 투여할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 배합물은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 수용성 파클리탁셀 또는 도세탁셀은, 특정 치료 형태에 있어서, 예를 들어 백금 약물, 독소루비신 또는 다우노루비신과 같은 항생물질 또는 탁솔과 배합하여 사용되는 기타 약물과 배합할 수 있다.
화학치료학적 약물의 중합체에의 공액은 전신 독성을 감소시키고 치료학적 지수를 개선시키기 위한 흥미로운 접근법이다. 분자량이 30kDa를 초과하는 중합체는 정상 모세혈관 및 사구체 내피를 통해 용이하게 확산되지 않으므로, 부적절한 약물-매개 독성으로부터 정상적인 조직을 보호한다[참조: Maeda 및 Matsumura, 1989; Reynolds, 1995]. 한편, 악성 종양은 종종 질환에 걸린 모세혈관 내피, 및 정상적인 조직 맥관계보다 더 큰 투과성을 갖는 것으로 충분히 입증되었다[참조: Maeda 및 Matsumura, 1989; Fidler et al., 1987]. 따라서, 통상적으로 맥관계에 잔류하는 중합체-약물 공액체는 선별적으로 혈관에서 종양으로 누출되어, 활성 치료제의 종양 축적을 야기할 수 있다. 또한, 중합체-약물 공액체는 서방성 약물 데포로 작용하여, 종양 세포에의 연장된 약물 노출을 야기할 수 있다. 최종적으로, 수용성 중합체를 사용하여 약물을 안정화시킬 뿐만 아니라, 기타 불용성 화합물을 가용화시킬 수 있다. 현재, 다양한 합성 및 천연 중합체가 이의 종양 특이적 약물 전달 강화능에 대해 시험되고 있다[참조: Kopecek, 1990, Maeda 및 Matsumura, 1989]. 그러나, 현재 일본의 SMANCS 및 영국의 HPMA-Dox를 포함하여, 단지 소수만이 임상학적 평가 중이다[참조: Maeda 1991; Kopecek 및 Kopeckova, 1993].
본원에 있어서, 탁소이드는 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 화합물 및 탁산 골격(참조: Cortes 및 Pazdur, 1995)을 갖는 기타 화학물질을 의미하는 것이고, 상록수와 같은 천연 원료, 또는 세포 배지 또는 화학적으로 합성된 분자로부터 분리시킬 수 있으며, [2aR-[2aα,4β,4αβ,6β,9α(αR*,βS*),11α,12α,12aα,12bα]]-β-(벤조일아미노)-α-하이드록시벤젠프로판산 6, 12b,비스(아세틸옥시)-12-(벤조일옥시)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-도데카하이드로-4,11-디하이드록시-4a,8,13,13-테트라메틸-5-옥소-7,11-메타노-1H-사이클로데카[3,4]벤즈-[1,2-b]옥세트-9-일 에스테르를 포함하는 화학식 C47H51NO14의 화학물질이 바람직하다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 각각 특정 유형의 종양에 대해 서로 더 효율적이고, 본 발명을 실시할 경우, 특정 탁소이드에 보다 민감한 상기 종양을 수용성 탁소이드 공액체로 치료할 수 있는 것으로 이해된다.
파클리탁셀이 수용성 금속 킬레이트화제에 공액된 이러한 양태에 있어서, 당해 조성물은 또한 킬레이트화된 금속 이온을 포함할 수도 있다. 본 발명의 킬레이트화된 금속 이온은 알루미늄, 붕소, 칼슘, 크롬, 코발트, 구리, 디스프로슘, 에르븀, 유로퓸, 가돌리늄, 갈륨, 게르마늄, 홀뮴, 인듐, 이리듐, 철, 마그네슘, 망간, 니켈, 백금, 레늄, 루비듐, 루테늄, 사마륨, 나트륨, 테크네튬, 탈륨, 주석, 이트륨 또는 아연 중 어느 하나의 이온형일 수 있다. 특정의 바람직한 양태에 있어서, 킬레이트화된 금속 이온은 방사성핵종, 즉 상기 나열된 금속 중 하나의 방사성 동 위원소일 수 있다. 바람직한 방사성핵종에는 67Ga, 68Ga, 111In, 99m Tc, 90Y, 114mIn 및 193mPt가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 실행하는데 사용되는 바람직한 수용성 킬레이트화제에는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세테이트(DOTA), 테트라아자사이클로테트라데칸-N,N',N”,N'"-테트라아세트산(TETA), 하이드록시에틸리덴 디포스포네이트(HEDP), 디머캅토석신산(DMSA), 디에틸렌트리아민테트라메틸렌포스폰산(DTTP) 및 1-(p-아미노벤질)-DTPA, 1,6-디아미노헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산, DPDP 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)-테트라아세트산이 포함되지만, 이에 제한되지는 않으며, DTPA가 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 양태는 또한 111In-DTPA-파클리탁셀을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 파클리탁셀 또는 도세탁셀은 수용성 중합체에 공액시킬 수 있고, 바람직하게는 중합체를 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 2‘- 또는 7-하이드록실, 또는 둘 다에 공액시킬 수 있다. 따라서, 작용성 그룹을 약물 공액화에 사용하는 경우, 파클리탁셀의 C2'-하이드록실을 사용한 상기한 경우와 마찬가지로, 분해성 결합의 경우에는 에스테르를 사용하여 활성 약물이 중합체성 담체로부터 방출된다는 것을 입증한다. 바람직한 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(l-글루탐산), 폴리(d-글루탐산), 폴리(dl-글루탐산), 폴리(l-아스파르트산), 폴리(d-아스파르트산), 폴리(dl-아스파르트산), 폴리에틸렌 글리콜, 상기 나열한 폴리아미 노산과 폴레에틸렌 글리콜과의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산 및 폴리락트산 뿐만 아니라 폴리아크릴산, 폴리(2-하이드록실에틸 l-글루타민), 카복시메틸 덱스트란, 히알루론산, 사람 혈청 알부민 및 알긴산이 포함되지만, 이에 제한되지는 않으며, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아스파르트산 및 폴리글루탐산이 특히 바람직하다. 본 발명의 폴리글루탐산 또는 폴리아스파르트산의 분자량은 바람직하게는 약 5,000 내지 약 100,000이거나 약 20,000 내지 약 80,000 또는 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 60,000이다.
본 발명의 조성물은 하기하는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 용액에 분산시킬 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 용액은 멸균되거나 무균성이고, 물, 완충제, 등장제, 또는 동물 또는 사람 환자에게 투여할 경우, 알레르기 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기타 성분을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 고분자량의 수용성 중합체 또는 킬레이트화제에 공액된 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 화학치료학적 약물 또는 항암 약물을 포함하는 약제학적 조성물로서 기술될 수도 있다. 약제학적 조성물은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산 또는 킬레이트화제, 바람직하게는 DTPA를 포함할 수 있다. 방사성핵종이 항암제 또는 항암 약물로서 사용될 수 있고, 본 발명의 약제학적 조성물은 킬레이트화된 방사성 동위원소의 치료량을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
특정 양태에서, 본 발명은 종양 조직에 의한 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 화학치료학적 약물 흡수량을 측정하는 방법으로 기술될 수 있다. 이런 방법은 약물 및 금속 킬레이트화제와 킬레이트화된 금속 이온의 공액체를 수득하고, 종양 조직을 조성물과 접촉시킨 후, 종양 조직에서 킬레이트화된 금속 이온의 존재를 검출함을 포함한다. 종양 조직에서의 킬레이트화된 금속 이온의 존재는 종양 조직에 의한 흡수량이 지표이다. 킬레이트화된 금속 이온은 방사성핵종일 수 있고, 검출법은 신티그래피일 수 있다. 종양 조직은 또한 동물 또는 사람 환자내에 함유될 수 있고, 조성물은 환자에게 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 특정 양태에서, 환자의 암을 치료하는 방법으로서 기술될 수 있다. 이 방법에는, 수용성 중합체 또는 킬레이트화제에 공액되고 약제학적으로 허용되는 용액에 분산된 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 화학치료학적 약물을 포함하는 조성물을 수득하고, 종양 치료에 유효한 양의 용액을 환자에게 투여함을 포함한다. 바람직한 조성물은 폴리글루탐산 또는 폴리아스파르트산에, 보다 바람직하게는 폴리(l-글루탐산) 또는 폴리(l-아스파르트산)에 공액된 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함한다. 본 발명의 조성물은 비공액된 탁소이드가 효과적인 것으로 밝혀진 유방암, 난소암, 악성 흑색종, 폐암, 위암, 결장암, 두부암 및 경부암 또는 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모든 유형의 암에 효과적인 것으로 이해된다.
종양을 치료하는 방법은 치료량의 약물 또는 전구약물을 투여하기 전에, 종양에서의 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 흡수량을 미리 예상함을 포함한다. 당해 방법은 파클리탁셀-킬레이트화제-킬레이트화된 금속을 환자에게 투여하여 종양에서 검출하는 상기 논의된 모든 이미지화 기술을 포함할 수 있다. 당해 단계는, 약물 이 종양에 흡수되지 않는 경우에 DTPA-파클리탁셀 치료에 반응할 것으로 기대되지 않은 특정 종양을 측정하는 비용면에서 효과적인 방법을 제공한다. 이미지화 기술을 사용하여 파클리탁셀에의 반응을 예상하여 이에 반응할 것 같지 않은 환자를 확인할 수 있는 경우, 당해 환자의 경우 많은 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 간주된다. 적당량의 화학치료제가 종양에 침착되지 않는 경우, 당해 제제에 대해 종양이 반응할 가능성이 상대적으로 작으리라는 것이 추측된다.
특정 양태에서, 본 발명은 환자의 신체 이미지를 수득하는 방법으로서 기술될 수 있다. 신체 이미지는 파클리탁셀-킬레이트화제 공액체에 킬레이트화된 방사성 금속 이온의 유효량을 환자에게 투여하고, 방사성 금속의 신티그래피 시그날을 측정하여 이미지를 수득함으로써 수득된다.
또한, 본 발명은 일종의 넓은 측면에서, 전신 자가면역 질환을 앓는 환자에게 폴리-l-글루탐산 또는 폴리-l-아스파르트산에 공액된 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함하는 조성물의 유효량을 투여함을 포함하여, 전신 자가면역 질환의 하나 이상의 증상을 경감시키는 방법으로서 기술될 수 있다. 본원에 기술된 내용 중 특히 관심이 가는 것은, 표준 크레모퍼 제형[미국 특허 제5,583,153호]으로 투여시 특정의 경우에 탁솔에 반응하는 것으로 공지된 류마티즘성 관절염의 치료이다. 종양의 치료시와 마찬가지로, 본 발명의 수용성 탁소이드의 효과가 수용성 성분에의 공액화에 의해 감소되지 않을 것이며, 수용성 전구약물은 일정 기간에 걸쳐 활성 약물을 방출하는 방출 조절성 제형으로서 작용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 류마티즘성 관절염에 대해 탁솔과 같은 효과를 가질 뿐만 아니 라, 예를 들어 방출이 조절되는 이점을 제공할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 탁소이드 조성물은 다른 약물, 예를 들어 맥관형성 억제제(AGM-14790)(참조: Oliver et al., 1994) 또는 메토트렉세이트와 함께 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
파클리탁셀이 밸룬 혈관형성술 후에 또한 재발협착증을 억제한다는 발견은 본 발명의 수용성 파클리탁셀 및 도세탁셀이 직접적인 비경구 투여 이외의 여러가지 용도를 발견할 수 있음을 지시한다(WO 제9625176호). 예를 들어, 수용성 파클리탁셀은 관, 단락, 카테터, 인공 이식관, 핀, 심박 조율기와 같은 전기 이식관과 같은 이식 의료 장치용 및 특히 밸룬-팽창가능한 스텐트를 포함하는 동맥 또는 정맥 스텐트용 피복제로서 유용하다고 생각된다. 이러한 양태에 있어서, 수용성 파클리탁셀을 이식가능한 의료 장치에 결합시킬 수 있거나, 또는 수용성 파클리탁셀을 이식가능한 장치의 표면에 수동적으로 흡착시킬 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 스텐트는 중합체-약물 용액에 스텐트를 침지시키거나 이러한 용액을 스텐트에 분무시킴으로써 중합체-약물 공액체로 피복시킬 수 있다. 이식가능한 장치에 적합한 물질은 생물적합성 및 무독성이어야 하고, 니켈-주석 합금, 강과 같은 금속, 또는 생물적합성 중합체, 하이드로겔, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 등 중에서 선택될 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 수용성 파클리탁셀, 특히 PG-파클리탁셀 공액체는 밸룬 혈관형성술 후 동맥 또는 정맥내로 이식하기 위한 스텐트 상에 피복시킨다. 따라서, 본 발명은 특정의 광범위한 국면으로 폴리-l-글루탐산 또는 폴리-l-아스파르트산에 공액된 파클리탁셀 또는 도세탁 셀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여, 혈관 손상 후의 동맥 재발협착증 또는 동맥 폐색증을 억제하는 방법에 관한 것으로 기술될 수 있다. 본 발명의 실행에 있어서, 환자는 예를 들어 맥관 우회술, 혈관 수술, 기관 이식 또는 맥관 또는 동맥 혈관형성술 환자일 수 있고, 본 발명의 조성물은 직접, 정맥내 투여되거나, 스텐트상에 피복시킨 경우에도 스텐트를 혈관 손상 부위에 이식한다.
따라서, 본 발명의 한가지 양태는 폴리글루탐산 또는 폴리아스파르트산에 공액된 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 평활근 세포 증식을 억제하기에 유효한 양으로 포함하는 조성물을 피복시킨 이식가능한 의료 장치이다. 바람직한 장치는 본원에 기술된 본 발명의 조성물로 피복된 스텐트이며, 보다 바람직한 양태에서 스텐트는 밸룬 혈관형성술 후에 사용되도록 채택되며, 피복물은 재발협착증을 억제하는데 효과적이다.
특정의 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 파클리탁셀의 2‘- 또는 7-하이드록실, 또는 둘 다에 공액된 폴리글루탐산을 포함하는 조성물, 또는 파클리탁셀의 2’ 또는 7-하이드록실, 또는 둘 다에 공액된 폴리아스파르트산을 포함하는 조성물로서 기술될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리글루탐산(들)"에는 폴리(l-글루탐산), 폴리(d-글루탐산) 및 폴리(dl-글루탐산)이 포함되고, 용어 "폴리아스파르트산(들)"에는 폴리(l-아스파르트산), 폴리(d-아스파르트산) 및 폴리(dl-아스파르트산)이 포함된다.
달리 정의되어 있지 않으면, 본원에 정의된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있고, 바람직한 방법 및 물질을 이하에 기술한다.
본 발명은 파클리탁셀 및 도세탁셀의 신규한 수용성 제형의 발견 및 생체내에서 종양 세포에 대한 이러한 제형의 놀라운 효능으로부터 기인한다. 난소 암종(OCa-I)을 가진 마우스에 폴리(l-글루탐산) 공액된 파클리탁셀(PG-파클리탁셀)을 투여하면 PG가 없는 파클리탁셀을 동일량 투여한 경우에 비해, 종양 성장을 상당히 지연시킨다. 파클리탁셀을 단독으로 또는 유리 파클리탁셀 및 PG의 배합물로 처리한 마우스에서 초기 종양 성장은 지연되는 것으로 나타나지만, 종양은 10일 후 비처리된 대조군에 필적할 만한 수준으로 재성장한다. 게다가, PG-파클리탁셀 공액체의 최대 허용량(MTD)(160mg 당량의 파클리탁셀/kg)에서, 종양의 성장은 완전히 억제되며, 종양은 감소되며, 처리 후 2개월 동안 관찰된 마우스는 종양으로부터 자유로워 보인다(MTD: 단일 정맥 주사 후 2주 내에 15% 미만의 체중 감소를 야기시키는 최대 투여량으로서 정의됨). 병행 연구에서, 랫트 유방 선암종(13762F)을 가진 랫트에서의 PG-파클리탁셀의 항암 활성을 시험한다. 다시, PG-파클리탁셀의 40 내지 60mg 당량의 파클리탁셀/kg에서 완전한 종양 괴사가 관찰된다. 이러한 놀라운 결과는 중합체-약물 공액체인 PG-파클리탁셀이 단일 정맥 주사 후 마우스 및 랫트 모두에서 충분히 자리잡은 고체 종양들을 성공적으로 괴사시킨다는 것을 입증해 준다. 게다가, pH 7.4에서 반감기가 40일인 PG-파클리탁셀은 공지된 가장 안정한 수 용성 파클리탁셀 유도체 중의 하나이다[참조: Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992; Zhao 및 Kingston, 1991].
DTPA-파클리탁셀은 또한 B16 흑색종 세포주를 사용한 시험관내 항암 효능 검정에서 파클리탁셀만큼 유효한 것으로 본원에서 나타난다. DTPA-파클리탁셀은 단일 주사로 40mg/kg 체중의 투여량에서 MCa-4 유방암에 대한 파클리탁셀의 항암 효과에서 비해 중요한 차이를 나타내지 않는다. 추가로, 111In 표지된 DTPA-파클리탁셀은 감마-신티그래피에 의해 입증된 바와 같이 Mca-4 종양에 축적되는 것으로 나타나며, 이는 본 발명의 킬레이트화제 공액된 항종양 약물이 종양 이미지화에 유용하고 효과적이다는 것을 입증한다.
수용성 파클리탁셀은 수용성 및 방출조절된 파클리탁셀 유도 조성물을 제공함으로써 파클리탁셀계 항암 치료 효능을 개선시키도록 제안되기 때문에, 본 발명의 신규한 화합물 및 방법은 선행 방법 및 조성물에 비해 상당한 진보를 제공한다. 당해 조성물은 선행 파클리탁셀 조성물에서 나타나는 부작용과 관련있는 용매에 대한 필요성을 제거한다. 또한, 항암 활성을 보유하는 것으로 나타나는 방사선 표지된 파클리탁셀은 또한 종양을 이미지화하는데 유용할 것이다. 추가로, 본 발명은 파클리탁셀이 특정 종양에 의해 흡수되는지를 신티그래피, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 X-선 사진법(SPECT) 또는 양성자 방출 단층 X-선 사진법(PET)으로 측정하는 것이다. 이어서, 이러한 측정법을 사용하여 항암 치료 효능을 측정할 수 있다. 이러한 정보는 파클리탁셀 치료를 받을 환자를 선택하는데 있어서 의사에게 도움이 될 것이다.
파클리탁셀은 2가지 방식, 즉 약물 담체로서 작용하는 수용성 중합체에 파클리탁셀을 공액시키고, 항종양 약물을 수용성 킬레이트화제로 유도화함으로써 수용성으로 만들 수 있다. 후자의 접근법은 또한 방사성핵종(예: 111In, 90Y, 166 Ho, 68Ga, 99mTc)을 사용한 표지화, 핵 이미지화 및/또는 방사선 치료 연구를 위한 기회를 제공한다. 파클리탁셀, 폴리에틸렌 글리콜-파클리탁셀(PEG-파클리탁셀), 폴리글루탐산-파클리탁셀 공액체(PG-파클리탁셀) 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산-파클리탁셀(DTPA-파클리탁셀)의 구조가 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 특정 양태에서, DTPA-파클리탁셀 또는 기타 파클리탁셀-킬레이트화제 공액체(예: EDTA-파클리탁셀, DTTP-파클리탁셀 또는 DOTA-파클리탁셀)는, 예를 들어, 수용성염(나트륨 염, 칼륨 염, 테트라부틸암모늄 염, 칼슘 염, 제이 철 염 등)의 형태로 제조할 수 있다. 이들 염은 종양 처리용 치료제로서 유용할 수 있다. 두 번째로, DTPA-파클리탁셀 또는 기타 파클리탁셀-킬레이트화제는 111In 또는 99mTc와 같은 방사성핵종으로 표지화될 경우 방사선 트레이서로서 사용되어 핵 이미지화 기술과 조합하여 특정 종양을 검출할 수 있는 진단제로서 유용하다. 파클리탁셀(탁솔) 및 도세탁셀(탁소테레) 이외에 기타 탁산 유도체를 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용할 수 있고, 이러한 모든 조성물 및 방법은 첨부된 청구의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
DTPA-파클리탁셀의 독성 연구, 약리역학 및 조직 분포는 마우스에서 단일 투 여 정맥내 주사로 관찰되는 DPTA-파클리탁셀의 LD50(50% 치사량)이 약 110 mg/kg 체중이다는 것을 제시한다. 파클리탁셀의 제한된 용해도 및 정맥내 투여와 연관된 비히클 독성에 의해 부과되는 투여량-용적 한계로 인해 직접적으로 파클리탁셀과 비교하기란 어렵다. 그러나, 본 발명의 기술된 내용에 견주어, 화학 치료법 분야의 숙련가는 사람 환자에게 사용하기 위한 임상 연구에 효과적이고 최대로 허용되는 투여량을 결정한다.
본 발명의 특정 양태에서, 중합체-파클리탁셀 공액체로 피복된 스텐트는 재발협착증, 즉, 밸룬 혈관형성술에 따른 동맥 폐색증을 예방하는데 사용할 수 있다. 관상동맥 혈관형성술에서 밸룬 팽창가능한 스텐트를 사용한 임상 실험에서의 최근 결과는 표준 밸룬 혈관형성술에 비해 효능에서 상당한 잇점 및 재발협착증의 감소를 보여주었다[참조: Serruys et al., 1994]. 반응 대 손상 가설에 따르면, 신생혈관내막 형성이 증가된 세포 증식과 연관된다. 현재, 여론은 자발적 죽상동맥경화증 및 가속화된 죽상동맥경화증 모두에 있어서 혈관 병변을 일으키는 중요한 과정은 평활근 세포(SMC) 증식인 것으로 주장하고 있다[참조: Phillips-Hughes 및 Kandarpa, 1996]. 동맥 손상 후 SMC 표현형 증식은 종양성 세포의 증식과 유사하기 때문에, 항종양 약물이 신생동맥내막 SMC 축적을 예방하는데 유용할 수 있다. 지속적으로 충분한 농도로 이들 제제를 방출시킬 수 있는 중합체-결합된 항증식제로 피복된 스텐트는 과증식 동맥내막의 증식 및 매체의 내강으로의 내부 성장을 예방함으로써 재발협착증을 감소시킨다.
파클리탁셀은 마우스 모델에서 콜라겐 유도 관절염을 억제하는 것으로 나타 났기 때문에[참조: Oliver et al., 1994], 본 발명의 제형은 또한 자가면역 및/또는 염증성 질환(예: 류마티즘성 관절염)의 치료에 유용한 것으로 예상된다. 튜불린에의 파클리탁셀의 결합은 평형 상태를 안정한 미세관 중합체로 이동시키고, 이는 후기의 G2 유사분열 단계에서 세포를 차단하여 이러한 약물이 진핵 세포 복제의 강한 억제제가 되게 한다. 몇몇 메카니즘은 파클리탁셀에 의한 관절염 억제에 관련될 수 있다. 예를 들어, 파클리탁셀의 상 특이적 세포독성 효과는 빠르게 증식하는 염증성 세포, 및 또한 파클리탁셀 억제, 세포 유사분열, 이동, 화학주성, 세포내 전이 및 호중구 H2O2 생성에 영향을 준다. 또한, 파클리탁셀은 통합된 내피 세포 이동을 차단함으로써 항맥관형성 활성을 가질 수 있다[참조: Oliver et al., 1994]. 따라서, 본 발명의 중합체 공액된 전구약물은 류마티즘성 관절염의 치료에서 유리 파클리탁셀로서 유용한 것으로 예상된다. 본원에 기술된 중합체 공액된 제형은 또한 약물의 서방성 이점 및 보다 큰 용해도 이점을 제공한다. 제형을 관절염에 걸린 관절 부위에 직접 주사하거나 주입할 수 있는 것도 또한, 관절염의 치료 국면이다.
주사용으로 적합한 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약제학적 제제는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 제형을 멸균시켜야 하고, 주사용 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고, 미생물, 예를 들면, 세균 및 진균의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유 하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물 작용은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등으로 예방할 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.
멸균 주사액은 필요한 양의 활성 화합물을, 필요한 경우, 상기의 각종 기타 성분과 함께 적절한 용매에 도입시킨 후, 여과 멸균시켜 제조한다. 일반적으로, 분산액은 각종 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입시켜 제조한다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 상기 멸균 여과 용액으로부터의 추가의 바람직한 성분을 제공하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에서 사용되는 용어 “약제학적으로 허용되는 담체”는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제, 항진균제 및 등장제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 상기 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 활성 성분과 비혼화성인 통상적인 매질 또는 제제 이외에, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충성 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수도 있다.
용어 “약제학적으로 허용되는”은 또한 동물 또는 사람에게 투여하는 경우 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않는 분자 전체 및 조성물을 의미한다.
수용액으로 비경구 투여하기 위해, 예를 들면, 용액은 필요한 경우, 적당히 완충시켜야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스를 사용하여 등장성으로 만들어야 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내 및 복강내 투여용으로 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 기술에 비추어 당해 기술 분야의 전문가들에게 공지되어 있다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증한다. 하기 실시예에 기재된 기술은 본 발명을 실시하는데 충분히 작용하도록 본 발명의 발명자에 의해 개발된 기술이기 때문에, 당해 분야의 전문가들은 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 양식을 구성하는데 기여할 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 당해 분야의 전문가들은 본 발명의 기술을 토대로 많은 변화가 본 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않는 범위내에서 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있는 특정한 양태내에서 수행할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
DTPA-파클리탁셀
DTPA-파클리탁셀의 합성:
무수 DMF(2.2ml) 중의 파클리탁셀(100mg, 0.117mmol)의 용액에 0℃에서 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA A)(210mg, 0.585mmol)을 가한다. 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 교반한다. 현탁액을 여과(0.2㎛ 밀리포어 필터)하여 미반응 DTPA 무수물을 제거한다. 여액을 증류수에 붓고, 4℃에서 20분 동안 교반한 다음, 침전물을 수집한다. 조 생성물을 C18 실리카 겔 플레이트상에서 예비 TLC에 의해 정제하고, 아세토니트릴/물(1:1)로 전개시킨다. 파클리탁셀의 Rf 값은 0.34이다. Rf 값이 0.65 내지 0.75인 파클리탁셀 위의 밴드는 스크래핑에 의해 제거하고, 아세토니트릴/물(1:1)로 용출시키며, 용매를 제거하여 생성물로서 DTPA-파클리탁셀(융점: >226℃ 분해) 15mg(수율 10.4%)을 수득한다. UV 스펙트럼(물 중의 나트륨 염)은 228nm에서 최대 흡수를 나타내는데, 이는 또한 파클리탁셀의 특징이다. 질량 스펙트럼: (FAB) m/e 1229 (M+H)+, 1251 (M+Na), 1267 (M+K). 1H NMR 스펙트럼(DMSO-d6)에서, DTPA의 NCH2CH2N 및 CH2COOH의 공명은 δ2.71 내지 2.96ppm에서 신호의 복합 시리즈로서 및 δ3.42ppm에서 다중선으로서 각각 나타난다. 5.51ppm으로 이동된 파클리탁셀의 4.10ppm에서 C7-H의 공명은 7-위치에서 에스테르화를 나타낸다. 스펙트럼의 나머지는 파클리탁셀의 구조와 일치한다.
DTPA-파클리탁셀의 나트륨 염은 또한 에탄올 중의 DTPA-파클리탁셀 용액을 동량의 0.05M NaHCO3에 가한 다음, 동결건조시켜 수용성 고형 분말(용해도 > 파클리탁셀 20mg 당량/ml)을 수득한다.
DTPA-파클리탁셀의 가수분해 안정성:
DTPA-파클리탁셀의 가수분해 안정성은 촉진된 상태하에 연구되었다. 간단하게, DTPA-파클리탁셀 1mg을 0.5M NaHCO3 수용액(pH 9.3) 1ml에 용해시키고, HPLC로 분석한다. HPLC 시스템은 C18 4㎛ 실리카 겔이 충전된 워터스(Waters) 150×3.9mm(내경) 노바-팍(Nova-Pak) 칼럼, 퍼킨-엘머 아이소크레아틱(Perkin-Elmer isocratic) LC 펌프, PE 넬슨(Nelson) 900 시리즈 인터페이스, 스펙트라-피직스(Spectra-Physics) UV/Vis 검출기 및 데이터 스테이션으로 구성된다. 용출액(아세토니트릴/메탄올/0.02M 암모늄 아세테이트 = 4:1:5)은 228nm에서 자외선 검출과 함께 1.0ml/분으로 작동한다. DTPA-파클리탁셀 및 파클리탁셀의 체류 시간은 각각 1.38분 및 8.83분이다. 피크 면적을 정량화하고, 표준 곡선과 비교하여 DTPA-파클리탁셀 및 파클리탁셀의 농도를 측정한다. 0.5M NaHCO3 용액에서 DTPA-파클리탁셀의 추산된 반감기는 실온에서 약 16일이다.
시험관내에서 B16 마우스 흑색종 세포 성장에 대한 DTPA-파클리탁셀의 효과:
세포를 24-웰 플레이트에서 2.5×104세포/ml의 농도로 접종하고, 50:50 둘베코(Dulbecco) 개질된 최소 필수 배지(DEM) 및 10% 송아지 혈청을 함유하는 F12 배지에서 37℃에서 24시간 동안 5.5% CO2의 97% 가습화 대기에서 성장시킨다. 이어서, 배지를 파클리탁셀 또는 DTPA-파클리탁셀을 5×10-9M 내지 75×10-9M의 농도로 함유하는 새로운 배지로 대체시킨다. 40시간 후, 세포를 트립신 처리하여 방출시키고, 코울터 계수기(Coulter counter)로 계수한다. 세포 배지 중의 DMSO(파클리탁셀을 용해시키기 위해 사용함) 및 0.05M 중탄산나트륨 용액(DTPA-파클리탁셀을 용해시키기 위해 사용함)의 최종 농도는 0.01% 미만이다. 이러한 용매의 양은 대조군 연구에 의해 측정된 바와 같이 세포 성장에 어떠한 영향도 미치지 않는다.
B16 흑색종 세포 성장에 대한 DTPA-파클리탁셀의 효과는 도 2에 도시한다. 각종 농도로 40시간 배양 후, DTPA-파클리탁셀 및 파클리탁셀을 세포독성에 관하여 비교한다. 파클리탁셀 및 DTPA-파클리탁셀의 IC50은 각각 15nM 및 7.5nM이다.
유방 암종(MCa-4) 종양 모델에 대한 항종양 효과:
암컷 C3Hf/Kam 마우스의 오른쪽 대퇴부 근육에 유방 암종(MCa-4)을 접종한다(5×105세포/마우스). 종양이 8mm로 성장했을 때(약 2주), 파클리탁셀 또는 DTPA-파클리탁셀의 단일 투여량을 체중 1kg당 파클리탁셀 10, 20 및 40mg 당량에 가한다. 대조군 연구에서, 염수 및 염수로 희석된(1:4) 무수 알콜/크레모퍼 50/50을 사용한다. 종양 성장은 매일 3개의 직교하는 종양 직경을 측정함으로써 측정한다. 종양의 직경이 12mm에 달할 경우, 종양 성장 지연을 계산한다. 종양이 약 15mm일 경우, 마우스를 희생시킨다.
종양 성장 곡선은 도 3에 도시한다. 대조군과 비교하여, 파클리탁셀 및 DTPA-파클리탁셀 둘 다는 투여량 40mg/kg에서 항종양 효과를 나타낸다. 또한, 데이터를 분석하여 종양의 직경이 12mm에 도달하는 평균 일수를 측정한다. 통계학적 분석에 따르면, DTPA-파클리탁셀이 염수 처리된 대조군에 비해 투여량 40mg/kg(p<0.01)에서 종양 성장을 상당히 지연시킨다는 것을 알 수 있다. 종양의 직경이 12mm에 달하는 평균 시간은 파클리탁셀에 대한 9.4일에 비해 DTPA-파클리탁셀에 대해 12.1일이다.
111In으로 DTPA-파클리탁셀의 방사선 표지:
2㎖ V형 바이알에 0.6M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.3) 40㎕, 0.06M 나트 륨 시트레이트 완충액(pH 5.5) 40㎕, 에탄올 중의 DTPA-파클리탁셀 용액 20㎕(2w/v%) 및 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.5) 중의 111InCl3 용액(1.0mCi) 20㎕를 연속적으로 가한다. 실온에서 30분 동안 항온배양한 후, 표지된 111In-DTPA-파클리탁셀은 유동상으로서 염수에 이어, 에탄올을 사용하여 C18 셉-팩(SeP-Pac) 카트리지를 통해 혼합물을 통과시킴으로써 정제한다. 유리 111In-DTPA(3% 미만)를 염수로 제거하고, 111In-DTPA-파클리탁셀은 에탄올 세정액으로 수집한다. 에탄올을 질소 기체하에 증발시키고, 표지된 생성물을 염수로 재구성한다. 방사 화학적 수율: 84%.
111In-DPTA-파클리탁셀의 분석:
HPLC을 사용하여 반응 혼합물과 IIIIn-DTPA-파클리탁셀의 순도를 분석한다. 시스템은 LDC 이중 펌프, ODS 5㎛ 실리카 겔로 충전된 100×8.0mm(내경)의 워터스 칼럼으로 구성된다. 칼럼은 물과 메탄올 구배 혼합물(15분에 걸쳐 메탄올 0% 내지 85% 구배)을 사용하여 1㎖/분의 유속으로 용출시킨다. 구배 시스템은 NaI 결정 검출기와 스펙트라-피직스 UV/Vis 검출기로 모니터링한다. HPLC 분석에 의해 증명된 바와 같이, 셉-팩 카트리지로 정제하여 체류 시간이 2.7분인 111In-DTPA를 대부분 제거한다. 111In-DTPA는 아마도 DTPA-파클리탁셀 중의 미량의 DTPA 오염물질로부터 유래하는 것 같다. 111In-DTPA-파클리탁셀의 방사선 크로마토그램은 12.3분에서의 피크가 사실상 표제 화합물임을 나타내는 이의 UV 크로마토그램과 상관관계가 있다. 동일한 크로마토그래피 조건하에 파클리탁셀의 체류 시간은 17.1분이다. 최종 제제의 방사 화학적 순도는 HPLC 분석법으로 측정한 바, 90%이다.
전신 신티그래피:
암컷 C3Hf/Kam 마우스의 우측 대퇴부 근육에 유방 암종(MCa-4)을 접종한다(5×105세포). 종양이 직경 12mm로 성장하면 마우스를 2개의 그룹으로 나눈다. 그룹 I에 있어서, 마우스를 나트륨 펜토바르비탈을 복강내 주사하여 마취시킨 다음 111In-DTPA-파클리탁셀(100 내지 200mCi)을 꼬리 정맥에 주사한다. 중간 에너지 시준기가 장착된 γ-카메라를 마우스(그룹당 3마리) 위로 배치한다. 주사하고 5, 30, 60, 120, 240분 및 24시간 후, 5분 동안 일련의 획득물을 수집한다. 그룹 II에 있어서, 대조군으로서 마우스에 111In-DTPA를 주사하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 따른다. 도 5는 111In-DTPA와 111In-DTPA-파클리탁셀을 주사한 동물의 γ-신티그램을 나타낸다. 111In-DTPA는 혈장으로부터의 신속한 제거율, 신장에서의 최소 체류와 함께 뇨 중의 신속하고 높은 배출 및 종양, 간, 장관 및 기타 기관 또는 체부에서의 무시해도 좋은 체류를 특징으로 한다. 대조적으로, 111In-DTPA-파클리탁 셀은 파클리탁셀과 유사한 약리학적 프로파일을 나타낸다[참조: Eiseman et al., 1994]. 뇌에서의 방사성은 무시해도 좋다. 간과 신장은 가장 큰 조직:혈청 비율을 갖는다. 방사선 표지된 DTPA-파클리탁셀의 간담즙성 배출 또는 이의 대사 산물은 혈액으로부터 약물을 제거하는 주요 경로 중의 하나이다. 파클리탁셀과 달리, 111In-DPTA-파클리탁셀의 상당량은 또한, 파클리탁셀을 제거하는데 있어서 작은 역할만 하는 신장을 통해서 배출된다. 종양은 111In-DPTA-파클리탁셀을 상당히 흡수한다. 이러한 결과는 111In-DPTA-파클리탁셀이 특정 종양을 검출하고, 종양에서 111In-DPTA-파클리탁셀의 흡수량을 정량화할 수 있음을 증명하며, 이는 또한 파클리탁셀 치료에 대한 환자의 선택을 보조할 수 있다.
실시예 2
폴리글루탐산-파클리탁셀
본 실시예는 파클리탁셀이 수용성 중합체인 폴리(l-글루탐산)(PG)에 공액됨을 예시해준다. 약물 담체로서 사용되는 수용성 중합체의 잠재력을 충분히 확립되어 있다[참조; Kopecek, 1990; Maeda 및 Matsumura, 1989]. 약물-중합체 공액체는 다른 불용성 약물을 용해시키는 능력 이외에, 약물의 조절된 방출을 위한 서방성 데포로서 또한 작용한다.
PG-파클리탁셀의 합성
PG는 리소좀성 효소에 의해 쉽게 분해될 수 있고, 혈장 중에서 안정하며, 약물 부착용으로 충분한 작용성 그룹을 함유하기 때문에, 파클리탁셀용 담체로서 선택한다. 아드리아마이신[참조: Van Heeswijk et al., 1985; Hoes et al., 1985], 사이클로포스파마이드[참조: Hirano et al., 1979] 및 Ara-C[참조: Kato et al., 1984]를 포함한 몇가지 항종양 약물을 PG에 공액시킨다.
PG 나트륨 염(분자량: 34K, 제조원: 시그마사, 0.35g)을 물에 용해시킨다. 수용액의 pH를 0.2M HCl을 사용하여 2로 조절한다. 침전물을 수집하여 증류수로 투석하고, 동결건조하여 PG 0.29g을 수득한다.
무수 DMF(1.5㎖) 중의 PG(75㎎, 반복 단위 FW 170, 0.44mmol) 용액에 파클리탁셀 20㎎(0.23mmol, PG/파클리탁셀 몰 비=19), 디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 15㎎(0.073mmol) 및 미량의 디메틸아미노피리딘(DMAP)을 가한다. 반응을 실온에서 4시간 동안 진행시킨다. 박막 크로마토그래피(TLC, 실리카)는 파클리탁셀(Rf=0.55)이 중합체 공액체(Rf=0, 이동상, CHCl3/MeOH = 10:1)로 완전히 전환되었음을 보여준다. 반응 혼합물을 클로로포름에 붓는다. 생성된 침전물을 수집하고 진공하에서 건조시켜, 중합체-약물 공액체 65㎎을 수득한다. 출발 물질에서의 파클리탁셀 대 PG의 중량비를 변화시킴으로써, 다양한 파클리탁셀 농도를 갖는 중합체 공액체를 합성할 수 있다.
PG-파클리탁셀 공액체의 나트륨 염은 생성물을 0.5M NaHCO3에 용해시켜 수득한다. PG-파클리탁셀 수용액을 증류수(MWCO 1,000)로 투석하여 저분자량 오염물과 과량의 NaHCO3 염을 제거한다. 투석물을 동결건조하여 백색 분말 88.6㎎을 수득한다. 이러한 중합체 공액체 중의 파클리탁셀 함량은 UV(하기에 기술함)로 측정한 결과 21%였다. 수율(중합체에 결합된 파클리탁셀로의 전환율, UV): 93%. 이러한 방법으로 사용되는 파클리탁셀 대 PG의 비율을 증가시킴으로써, 파클리탁셀의 함량이 높은(35% 이하) PG-파클리탁셀을 합성할 수 있다.
1H-NMR(GE 모델 GN 500 분광광도계, 500MHz, D2O에서): δ=7.75 내지 7.36ppm(파클리탁셀의 방향족 성분); δ=6.38ppm(C10-H), 5.97ppm(C13-H), 5.63 및 4.78ppm(C2‘-H), 5.55 내지 5.36ppm(C3‘-H 및 C2-H, m), 5.10ppm(C5-H), 4.39ppm(C7-H), 4.10ppm(C20-H), 1.97ppm(OCOCH3) 및 1.18 내지 1.20ppm(C-CH3)은 파클리탁셀의 지방족 성분을 나타낸다. 파클리탁셀의 다른 공명은 PG의 공명에 의해 불분명하다. 4.27ppm(H-α), 2.21ppm(H-γ) 및 2.04ppm(H-β)에서의 PG 공명은 순수한 PG 스펙트럼에 따른다. 중합체 공액된 파클리탁셀을 커플링시킬 경우에는 분해능이 매우 불량하여 충분히 정확하게 측정할 수 없다. 물에 대한 용해도는 >20㎎ 파클리탁셀/㎖이다.
PG-파클리탁셀의 특성화
벡멘(Beckman) DU-640 분광광도계(제조원: 플러톤(Fullerton), CA)로 자외선 스펙트럼(UV)을 수득한다. PG에 공액된 파클리탁셀의 함량은, 수중 중합체 공액체와 메탄올 중의 유리 약물이 동일한 몰 흡광 계수를 갖고 이들 둘 다 램버트 비어 (Lambert Beer)의 법칙을 따른다는 사실을 고려하여, 메탄올 중의 공지된 농도의 파클리탁셀을 사용하여 생성시킨 표준 곡선(λ=228nm)을 기준으로 하는 UV에 의해 산정한다. 이의 UV 스펙트럼에 의해 나타낸 바와 같이, PG-파클리탁셀은 228 내지 230nm에서 λ이동을 갖는 독특한 파클리탁셀 흡수성을 보인다. PG-파클리탁셀 중의 파클리탁셀의 농도는, 230nm에서의 물 중의 중합체 공액체와 228nm에서의 메탄올 중의 유리 약물이 동일한 몰 흡광 계수를 갖고 이들 둘 다 램버트 비어의 법칙을 따른다는 사실을 고려하여, 228nm의 흡수 영역에서의 메탄올 중의 공지된 농도의 파클리탁셀을 사용하여 생성시킨 표준 곡선을 기준으로 하여 산정한다.
PG-파클리탁셀의 겔 투과 크로마토그래피 연구
PG-파클리탁셀의 상대 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 특성화한다. GPC 시스템은 LDC 구배 마스터와 커플링된 두 개의 LDC 모델 III 펌프, PL 겔 GPC 칼럼 및 워터스 990 광 다이오드 어레이 검출기로 이루어진다. 용출제(DMF)를 UV 검출을 270nm로 설정하면서 1.0ml/분으로 배출시킨다. PG에 파클리탁셀을 공액시키면 PG-파클리탁셀의 분자량이 증가하는데, 이는 체류 시간이 PG 6.4분으로부터 PG-파클리탁셀 공액체 5분으로 변화하는 것으로 드러난 GPC 분석 결과에 의해 지시된다. 파클리탁셀 15 내지 25중량%를 함유하는 PG-파클리탁셀의 분자량 계산치는 45 내지 55kDa의 범위이다. 조 생성물은 낮은 분자량의 오염물(체류 시간 8.0 내지 10.0분, 및 11.3분)을 함유하는데, 이는 PG-파클리탁셀을 나트륨 염으로 전환시킨 다음, 투석시킴으로써 효과적으로 제거할 수 있다.
PG-파클리탁셀 공액체의 가수분해적 분해
PG-파클리탁셀을 파클리탁셀 당량 농도 0.4mM에서 pH 6.0, pH 7.4 및 pH 9.6의 인산염 완충액(PBS, 0.01M)에 용해시킨다. 용액을 완만하게 진탕시키면서 37℃에서 항온배양한다. 소정의 시간의 간격으로, 분액(100μl)을 분리하여 동일한 용적의 메탄올과 혼합한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한다. HPLC 시스템은 역상 실리카 컬럼(Nova-Pac, Waters, CA), 1.0ml/분의 유속으로 전달되는 메탄올-물(2:1, v/v)의 이동 상, 및 광 다이오드 검출기로 이루어진다. 각각의 샘플에서 PG 결합된 파클리탁셀, 유리 파클리탁셀 및 기타 분해산물의 농도는, 228nm에서의 각 피크의 몰 흡광 계수가 파클리탁셀과 동일하다는 점을 고려하여, 피크 면적을 파클리탁셀로부터 제조된 별도 수득된 표준 곡선과 비교함으로써 산정한다. 선형 최소 제곱법 회귀 분석에 의해 측정한다. 공액체의 반감기는 pH 6.0, 7.4 및 9.6에서 각각 132, 40 및 4일로 추산된다. HPLC 분석 결과, PBS 용액 중의 PG-파클리탁셀을 항온배양하면 파클리탁셀과 함께, 파클리탁셀보다 더욱 소수성인 것(대상산물-1)을 포함하는 다수의 기타 종이 생성되는 것으로 밝혀졌다. 실제로, pH 7.4에서 PBS 중에서 회수되며 대부분 7-에피파클리탁셀인 것으로 추정되는 대사산물-1의 함량은 100시간 동안 항온배양한 이후의 파클리탁셀의 함량을 초과한다(도 6).
시험관내 연구
pH 7.4에서 PBS 용액으로부터 수득한 분액을 튜불린 중합 검정에 의해 분석한다. 튜불린 조합 반응을 시험 샘플(1.0μM 당량, 파클리탁셀) 및 1.0mM GTP의 존재하에 튜불린(소뇌, Cytoskeleton Inc., Boulder, CO) 농도 1mg/ml(10μM)에서 완충액(pH 6.9) 중에서 32℃에서 수행한다. 튜불린 중합은 시간 경과에 따른 340nm에서의 용액의 흡광도를 측정함으로서 따른다. 15분 후, 염화칼슘(125mM)을 첨가하여 미세관의 CaCl2 유도된 해중합도를 측정한다. PBS에 새로 용해된 PG 파클리탁셀은 미세관을 생성시키는데 불활성인 반면, 3일 동안 배양한 PG-파클리탁셀의 분액은 튜불린 중합을 유발한다. 형성된 미세관은 CaCl2 유도된 해중합에 대하여 안정하다.
세포 성장에 대한 PG 파클리탁셀의 효과도 또한 테트라졸륨 염(MTT) 검정(참조: Mosmann, 1983)에 의해 시험한다. MCF-7 세포 또는 13762F 세포를 24시간 후, 다양한 농도의 PG 파클리탁셀, 파클리탁셀 또는 PG로 처리한 96-웰 미세적정 플레이트에서 2×104세포/ml로 접종하고, 추가의 72시간 동안 배양한다. 이어서, MTT 용액(20㎕, 5mg/ml)을 각 웰에 첨가하고, 4시간 동안 배양한다. 상청액을 흡인하고, 대사적 생존성 세포에 의해 형성된 MTT 포르마잔을 마이크로플레이트 형광 판독기에 의해 590nm의 파장에서 측정한다. 3일간에 걸쳐, PG-파클리탁셀은 종양 세포 증식을 유리 파클리탁셀과 유사한 정도로 억제한다. 사람 유방 종양 세포주 MCF-7에 대해, 수득한 IC50 값은 파클리탁셀에 대해서는 0.59μM이고, PG-파클리탁셀에 대해서는 0.82μM이다(파클리탁셀 당량 단위로 측정함). 13762F 세포주에 대해, PG-파클리탁셀(IC50 = 1.86μM)의 민감도는 파클리탁셀(IC50 = 6.79μM)의 민 감도에 필적할 만하다. 두 세포주 모두에 대하여, PG 단독의 IC50은 100μM 이상이다.
생체내 항종양 활성
모든 동물 연구는 공공 지침에 따라 M.D. 앤더슨 암 센터(M. D. Anderson Cancer Center)의 동물 시설에서 수행하였다. C3H/Kam 마우스를 방사선 종양학 실험부(Department of Experimental Radiation Oncology)의 무병원균 시설에서 사육하고 유지한다. 암컷 C3H/Kam 마우스(25 내지 30g)의 오른쪽 대퇴의 근육에 쥐 난소 암종 세포(OCa-I), 유방 암종(MCa-4), 간 암종(HCa-I) 또는 섬유질 육종(FSa-II)을 주사함으로써 단일 종양을 발생시킨다. 비교 연구에서는, 암컷 피셔 344 랫트(125 내지 150g)에 0.1ml PBS 중의 생존 가능한 13762F 종양 세포 1.0 ×105를 주사한다. 마우스의 종양이 500mm3(직경 10mm)으로 성장하거나, 랫트의 종양이 2400mm3(평균 직경 17mm)으로 성장하는 경우, 처리를 개시한다. 염수 중의 PG-파클리탁셀 또는 크레모퍼 EL 비히클 중의 파클리탁셀의 단일 투여량을 체중 kg당 파클리탁셀 40 내지 160mg 당량으로 변화시킨 투여량으로 제공한다. 대조용 실험에서는, 염수, 크레모퍼 비히클[염수로 희석된(1:4) 50/50 크레모퍼/에탄올], 염수 중의 PG(MW 38K) 용액 및 파클리탁셀/PG 혼합물을 사용한다. 종양 성장을 3개의 직각 종양 직경을 측정함으로써 매일 측정한다(도 7a, 7B, 7C, 7D 및 7E). 종양 용적은 화학식 (A×B×C)/2에 따라 계산한다. 마우스의 절대 성장 지연도(AGD)는 다 양한 약물로 처리한 종양이 마우스에서 500 내지 2000mm3으로 성장하는 시간(일수)에서 염수 대조용으로 처리한 종양이 500 내지 2000mm3으로 성장하는 시간(일수)을 뺀 값으로 정의한다. 표 1에는 파클리탁셀/크레모퍼와 비교한 랫트의 PG 파클리탁셀의 급성 독성을 요약한다. 표 2에는 마우스의 MCa-4, FSa-II 및 HCa-I 종양에 대한 PG-파클리탁셀의 효과에 관한 데이터를 요약한다. 데이터는 또한 도 7a 내지 도 7e에 요약하였다.
피셔 랫트에서 PG-파클리탁셀의 급성 독성*
그룹 투여량 (mg/kg) 독성으로 죽은 수 체중 감소율 (%) 최악의 상태의 시간(일수 완전 회복시간(일수)
PG-파클리탁셀a 60 1/4 15.7 7 14
PG-파클리탁셀a 40 0/4 11.1 6 11
파클리탁셀b 60 1/4 16.7 6 15
파클리탁셀b 40 0/3 17.9 6 16
염수 1.0ml 0/2 5.2 1 7
PGc 0.3g/kg 0/2 4.3 2 8
크레모퍼 비히클d 2.0ml 0/2 6.9 1 9
*: 약물은 단일 주사로 13672F 종양 함유 피셔 랫트(암컷, 130g)에 정맥내 투여한다.
a: PG-파클리탁셀 용액은 공액체를 염수에 용해시켜(8mg 당량 파클리탁셀/ml) 제조한다. 60mg/kg에서 주사 용적은 랫트당 0.975ml이다.
b: 파클리탁셀 크레모퍼 용액은 에틸 알코올과 크레모퍼의 1:1 혼합물에 파클리탁셀을 용해시켜(30mg/ml) 제조한다. 당해 모액은 주사하기 전에 염수로 추가 희석한다(1:4). 용액에서 파클리탁셀의 최종 농도는 6mg/ml이다. 60mg/kg에서 주사 용적은 랫트당 1.3ml이다.
c: PG 용액은 중합체를 염수에 용해시켜(22mg/ml) 제조한다. 주사량은 0.3g/kg(랫트당 1.8ml)이고, 60mg/kg의 파클리탁셀 투여량과 동일하다.
d: 크레모퍼 비히클은 에틸 알코올과 크레모퍼의 혼합물(1:1)을 염수로 희석시켜(1:4) 제조한다.
생체내 쥐 종양의 상이한 유형에 대한 PG-파클리탁셀의 항종양 효과
종양 약물a 500 내지 2000mm3으로 성장 시간b AGDc t-시험d
MCa-4 염수 PG(0.6g/㎏) 크레모퍼 비히클 PG-파클리탁셀(40㎎/㎏) PG-파클리탁셀(60㎎/㎏) PG-파클리탁셀(120㎎/㎏) 파클리탁셀(40㎎/㎏) 파클리탁셀(60㎎/㎏) 4.8±0.8(5) 9.3±1.1(4) 6.1±0.7(5) 8.6±1.2(4) 14.2±1.1(5) 44.4±2.9(5) 9.0±0.6(4) 9.3±0.3(5) - 4.5 1.3 3.8 9.4 39.6 4.2 4.5 - 0.0114 0.265 0.026 0.0001 ＜0.0001 0.0044 0.0006
FSa-II 염수 PG(0.8g/㎏) 크레모퍼 비히클 PG-파클리탁셀(80㎎/㎏) PG-파클리탁셀(160㎎/㎏) 파클리탁셀(80㎎/㎏) PG+파클리탁셀 1.9±0.1(5) 2.8±0.2(6) 2.2±0.2(6) 3.8±0.4(6) 5.1±0.3(13) 4.2±0.3(6) 3.0±0.2(6) - 0.9 0.3 1.9 3.2 2.3 1.1 - 0.0043 0.122 0.0016 ＜0.0001 0.0002 0.0008
HCa-I 염수 PG(0.8g/㎏) 크레모퍼 비히클 PG-파클리탁셀(40㎎/㎏) PG-파클리탁셀(80㎎/㎏) PG-파클리탁셀(160㎎/㎏) 파클리탁셀(80㎎/㎏) PG+파클리탁셀 7.3±0.3(5) 7.7±0.4(4) 6.8±0.8(5) 8.2±0.7(5) 8.6±0.2(5) 11.0±0.8(4) 6.4±0.5(5) 6.7±0.4(5) - 0.4 -0.5 0.9 1.3 3.7 -0.9 -0.6 - 0.417 0.539 0.218 0.0053 0.0023 0.138 0.294
a: 오른쪽 다리에 500mm3 종양을 갖는 마우스를 정맥내에 단일 주사로 크레모퍼 비히클에서 염수 또는 파클리탁셀 중의 PG-파클리탁셀의 다양한 투여량 (40-120mg당량 파클리탁셀/kg)으로 처리한다. 대조군 동물을 염수(0.6ml), 크레모퍼 비히클(0.5ml), 염수 중의 PG 용액 또는 PG(g/kg)+파클리탁셀(80mg/kg) 로 처리한다.
b: 종양 성장율은 캘리퍼스를 사용하여 3개의 직교하는 직경을 매일 측정함으로써 측정하고, 용적은 (a×b×c)/2로 계산한다. 괄호에 나타낸 것은 각각의 그룹에서 사용된 마우스의 수이다. 500mm3 내지 2000mm3로 성장하는 시간(일수)은 평균±표준 편차로 제시한다.
c: 절대 성장 지연(AGD)은 다양한 약물로 처리된 종양이 500mm3 내지 2000mm3로 성장하는 시간(일수)에서 염수 대조군으로 처리한 종양이 500mm3 내지 2000mm3로 성장하는 시간(일수)을 뺀 값을 의미한다.
d: 500mm3 내지 2000mm3로 성장하는 시간(일수)은 처리 그룹과 스튜던트 t-시험을 사용하는 염수 그룹을 비교한다. P 값은 2면에 존재하고, 0.005 이하인 경우 유효한 것으로 간주한다.
실시예 3
폴리에틸렌 글리콜-파클리탁셀
폴리에틸렌 글리콜-파클리탁셀(PEG-파클리탁셀)의 합성
합성은 2단계로 수행한다. 먼저, 2‘-석시닐-파클리탁셀을 보고된 방법에 따라 제조한다[참조: Deutsch et al., 1989]. 파클리탁셀(200mg, 0.23mmol)과 석신산 무수물(288mg, 2.22mmol)을 무수 피리딘(6ml) 중에서 실온에서 3시간 동안 반응시킨다. 이어서, 피리딘을 증발시키고, 잔기를 물로 처리하고, 20분 동안 교반한 다음, 여과한다. 침전물을 아세톤에 용해시키고, 물을 서서히 가하고, 미세 결정을 수집하여 2’-석시닐-파클리탁셀 180mg을 수득한다. PEG-파클리탁셀을 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ) 매개 커플링 반응에 의해 합성한다. 메틸렌 클로라이드 중의 2‘-석시닐-파클리탁셀(160mg, 0.18mmol) 및 메톡시폴리옥시에틸렌 아민(PEG-NH2, MW: 5,000, 900mg, 0.18mmol)의 용액에 EEDQ(180mg, 0.72mmol)를 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 조 생성물을 에틸 아세테이트에 이어서, 클로로포름-메탄올(10:1)을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피한다. 생성물 350mg을 수득한다. 1H NMR (CDCl3) δ 2.76 (m, 석신산, COCH2CH2CO2), δ 3.36 (PEG, OCH2CH2O), δ 4.42 (C7-H) 및 δ 5.51 (C2'-H). 최대 UV 흡수량은 288nm에서이고, 이는 파클리탁셀의 특성이기도 하다. PEG에 부착시키면 파클리탁셀의 수용성을 현저하게 개선시킨다(> 파클리탁셀 20mg 당량/물 ml).
PEG-파클리탁셀의 가수분해 안정성
PEG-파클리탁셀을 0.4mM의 농도에서 다양한 pH의 인산염 완충액(0.01M)에 용해시키고, 용액을 온화하게 진탕시키면서 37℃에서 항온배양시킨다. 소정의 시간 간격으로 분액(200㎕)을 분리하고 동결 건조시킨다. 생성되는 무수 분말을 겔 침투 크로마토그래피(GPC 분석)를 위해 메틸렌 클로라이드에 재용해시킨다. GPC 시스템은 퍼킨-엘머 PL 겔 혼합 상 칼럼, 퍼킨-엘머 아이소크래틱 LC 펌프, PE 넬슨 900 시리즈 인터페이스, 스펙트라-피직스 UV/Vis 검출기 및 데이터 스테이션으로 구성된다. 용출액(메틸렌 클로라이드)은 228nm로 설정된 UV 검출기를 사용하여 1.0ml/분으로 배출시킨다. PEG-파클리탁셀 및 파클리탁셀의 체류 시간은 각각 6.1분 및 8.2분이다. 피크 면적을 정량화하고, 잔류 PEG-파클리탁셀의 비율 및 방출된 파클리탁셀의 비율을 계산한다. pH 7.4에서 선형 최소제곱법에 의해 측정된 PEG-파클리탁셀의 반감기는 54분이다. pH 9.0에서의 반감기는 7.6분이다. PEG-파클리탁셀로부터 파클리탁셀의 방출 프로파일은 도 8에 도시되어 있다.
시험관내에서 B16 마우스 흑색종 세포를 사용한 PEG-파클리탁셀의 세포독성 연구
DPTA 파클리탁셀을 사용한 세포독성 연구에 기술된 방법에 따라 흑색종 세포를 24웰 플레이트에서 2.5×104세포/ml의 농도로 접종하고, 50:50 둘베코 개질된 최소 필수 배지(DME) 및 10% 송아지 혈청을 함유하는 F12 배지에서 37℃에서 24시간 동안 5.5%의 CO2의 97%의 습한 대기속에서 성장시킨다. 이어서, 배지를 파클리탁셀 또는 이의 유도체를 5×10-9 내지 75×10-9 M의 농도 범위로 함유하는 신선한 배지로 대체시킨다. 40시간 경과 후, 세포를 트립신 처리하여 방출하고, 코울터 계수기로 계측한다. 세포 배지 중의 (파클리탁셀을 용해시키기 위해 사용되는) DMSO 및 (PEG-파클리탁셀을 용해시키기 위해 사용되는) 0.05M 중탄산나트륨의 최종 농도는 0.01% 미만이다. 이러한 용매량은 대조 연구에 의해 결정되는 세포 성장에 아무런 영향을 미치지 않는다. 추가로, 5×10-9 내지 75×10-9M의 파클리탁셀 당량 농도를 생성시키는데 사용되는 농도 범위의 PEG도 또한 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않는다.
마우스의 MCa-4에 대한 PEG-파클리탁셀의 항종양 효과
고체 유방 종양에 대한 PEG-파클리탁셀의 항종양 효능을 평가하기 위해서, MCa-4 세포(5 x 105 세포)를 암컷 C3Hf/Kam 마우스의 우측 대퇴부 근육에 주사한다. DTPA-파클리탁셀을 사용하는 실시예 1에서 기재한 바와 같이, 종양이 8mm로 성장했을 때(약 2주), 단일 용량의 파클리탁셀 또는 PEG-파클리탁셀을 체중 kg당 파클리탁셀 10, 20 및 40mg당량으로 제공한다. 파클리탁셀을 초기에 동일 용적의 크레모퍼와 함께 무수 에탄올에 용해시킨다. 이 모액을 주입하기 15분 이내에 멸균 생리 용액으로 추가로 희석(1:4 용적)시킨다. PEG-파클리탁셀을 염수(6mg 당량 파클리탁셀/ml)에 용해시키고, 멸균 필터(밀리포어, 4.5μm)를 통해 여과한다. 염수, 파클리탁셀 비히클, 염수로 희석된(1:4) 무수 알콜:크레모퍼(1:1) 및 염수 중의 PEG 용액(600mg/kg 체중)을 대조 실험에 사용한다. 종양 성장률은 3개의 직교하는 종양 직경을 측정함으로써 매일 측정한다. 종양 크기가 직경 12mm에 이르렀 을 때 종양 성장 지연율을 계산한다.
종양 성장 곡선은 도 9에 도시한다. 투여량 40mg/kg에서, PEG-파클리탁셀과 파클리탁셀은 둘 다 종양 성장을 효과적으로 지연시킨다. 그 차이는 통계상으로 중요하지는 않지만, 파클리탁셀이 PEG-파클리탁셀보다 더 효과적이다. 파클리탁셀 처리된 종양은 직경 12mm에 이르는데 9.4일이 걸리는 반면, PEG-파클리탁셀 처리된 종양은 8.5일이 걸린다. 통계상으로, 이들 수치는, 파클리탁셀 비히클에 대하여 6.7일이고 PEG의 염수 용액에 대하여 6.5일인 상응하는 이의 대조군에 비해 중요하다(p>0.05)(도 4).
본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태면에서 기술되었지만, 당해 분야의 숙련인들에게는 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 조성물, 방법 및, 방법의 단계 또는 단계의 순서를 변화시킬 수 있음은 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 성취할 수 있는 한, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 제제가 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당해 기술 분야의 숙련가들에게 명백한 이들 모든 유사 치환체 및 변형체들은 첨부된 청구의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념내에 속한다.
참조 문헌
다음의 참조 문헌은 본원에 기재된 내용에 대해 예시적인 방법 또는 기타 추가의 상세한 설명을 제공하는 정도로, 특별히 참고로 하여 인용되었다.
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본 발명의 조성물은 종양, 류마티즘성 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 효과적일 뿐 아니라 본원발명명의 조성물로 피복한 삽입가능한 이식장치는 재발협착증을 예방하는데 유용하다.

Claims (116)

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  57. 탁소이드, 타목시펜, 에토포사이드, 테니포사이드, 플루다라빈, 독소루비신, 다우노마이신, 에모딘, 5-플루오로우라실, FUDR, 에스트라디올, 캄포테신, 레티노이드, 베라파밀, 에포틸론 또는 사이클로스포린 중에서 선택되는 치료제, 조영제 또는 약물과,
    글루탐산, 아스파르트산 및/또는 리신 잔기인 제1 아미노산 내용물 잔기 50% 이상; 및 상기 제1 아미노산 내용물 잔기 또는 잔기들과 상이한 아미노산을 포함하는 제2 아미노산 내용물 잔기 1% 이상을 포함하는 수용성 아미노산 공중합체로 된 컨쥬게이트를 포함하되, 상기 약물이 상기 공중합체에 공유결합되어 있는 조성물.
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  60. 제59항에 있어서, 약물이 파클리탁셀 또는 탁소테레의 탁소이드인 조성물.
  61. 제57항에 있어서, 약물이 파클리탁셀인 조성물.
  62. 제57항에 있어서, 제1 아미노산 내용물이 글루탐산 잔기인 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 또는 49% 내지 50%의, 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 조성물.
  65. 제63항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% 또는 45%의 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 조성물.
  67. 제63항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% 또는 35%의 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 조성물.
  69. 제57항에 있어서, 공중합체가 1 내지 100,000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 공중합체가 20,000 내지 80,000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
  71. 제69항에 있어서, 공중합체가 25,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
  72. 제69항에 있어서, 공중합체가 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41,000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 46,000, 47,000, 48,000, 49,000 또는 50,000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
  73. 제57항에 있어서, 두개의 상이한 치료제, 조영제 또는 약물을 포함하는 조성물.
  74. 제57항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 10%(w/w) 이상인 조성물.
  75. 제57항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 10% 내지 40%(w/w) 이상인 조성물.
  76. 제57항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 20%(w/w) 이상인 조성물.
  77. 제57항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량에 대하여 20% 내지 40%(w/w) 이상인 조성물.
  78. 제57항에 있어서, 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 리신 및 상기 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기, 아스파르트산 및/또는 리신이 ℓ형인 조성물.
  79. 탁소이드, 타목시펜, 에토포사이드, 테니포사이드, 플루다라빈, 독소루비신, 다우노마이신, 에모딘, 5-플루오로우라실, FUDR, 에스트라디올, 캄포테신, 레티노이드, 베라파밀, 에포틸론 또는 사이클로스포린 중에서 선택되는 치료제, 조영제 또는 약물과,
    글루탐산, 아스파르트산 및/또는 리신 잔기인 제1 아미노산 내용물 잔기 50% 이상 및 상기 제1 아미노산 내용물 잔기 또는 잔기들과 상이한 아미노산을 포함하는 제2 아미노산 내용물 잔기 1% 이상을 포함하는 수용성 아미노산 공중합체를 컨쥬게이트시키되, 상기 약물이 상기 공중합체에 공유결합되는 것을 포함하는 수용성 약물을 제조하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 컨쥬게이트의 수용해도가 치료제, 조영제 또는 약물의 수용해도 보다 큰 제조 방법.
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  83. 제82항에 있어서, 약물이 파클리탁셀 또는 탁소테레의 탁소이드인 제조방법.
  84. 제79항에 있어서, 약물이 파클리탁셀인 제조방법.
  85. 제79항에 있어서, 제1 아미노산 내용물이 글루탐산 잔기인 제조방법.
  86. 제85항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 또는 49% 내지 50%의 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 제조방법.
  87. 제86항에 있어서, 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 제조방법.
  88. 제86항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% 또는 45%의 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 제조방법.
  89. 제88항에 있어서, 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 제조방법.
  90. 제86항에 있어서, 공중합체의 제2 아미노산 내용물이 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 또는 35%의 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기를 갖는 제조방법.
  91. 제90항에 있어서, 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기가 아스파르트산을 포함하는 제조방법.
  92. 제79항에 있어서, 공중합체가 1 내지 100,000 달톤의 분자량을 갖는 제조방법.
  93. 제92항에 있어서, 공중합체가 20,000 내지 80,000 달톤의 분자량을 갖는 제조방법.
  94. 제92항에 있어서, 공중합체가 25,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는 제조방법.
  95. 제92항에 있어서, 공중합체가 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41,000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 46,000, 47,000, 48,000, 49,000 또는 50,000 달톤의 분자량을 갖는 제조방법.
  96. 제79항에 있어서, 두개의 상이한 치료제, 조영제 또는 약물을 포함하는 제조방법.
  97. 제79항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 10%(w/w) 이상인 제조방법.
  98. 제79항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 10% 내지 40%(w/w) 이상인 제조방법.
  99. 제79항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 20%(w/w) 이상인 제조방법.
  100. 제79항에 있어서, 약물량이 컨쥬게이트 질량을 기준으로 하여 20% 내지 40%(w/w) 이상인 제조방법.
  101. 제79항에 있어서, 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 리신 및 상기 글루탐산이 아닌 아미노산 잔기, 아스파르트산 및/또는 리신이 ℓ형인 제조방법.
  102. 약 70%의 글루탐산 잔기와 30%의 아스파르트산 잔기를 포함하고 분자량이 20,000 내지 50,000 달톤인 수용성 아미노산 공중합체와, 파클리탁셀인 약물을 포함하되, 상기 약물이 상기 공중합체에 공유결합되어 있는 컨쥬게이트.
  103. 약 67%의 글루탐산 잔기와 33%의 아스파르트산 잔기를 포함하고 분자량이 20,000 내지 50,000 달톤인 수용성 아미노산 공중합체와, 파클리탁셀인 약물을 포함하되, 상기 약물이 상기 공중합체에 공유결합되어 있는 컨쥬게이트.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 약물량이 10% 이상인 컨쥬게이트.
  105. 제104항에 있어서, 약물량이 상기 컨쥬게이트를 기준으로 하여 10% 내지 40%(w/w)인 컨쥬게이트.
  106. 제102항 또는 제103항에 있어서, 약물량이 상기 컨쥬게이트를 기준으로 하여 20%(w/w) 이상인 컨쥬게이트.
  107. 제106항에 있어서, 약물량이 상기 컨쥬게이트를 기준으로 하여 20% 내지 40%(w/w)인 컨쥬게이트.
  108. 제102항 또는 제103항에 있어서, 글루탐산 잔기, 아스파르트산 잔기 또는 글루탐산 잔기 및 아스파르트산 잔기 모두가 ℓ형인 컨쥬게이트.
  109. 제102항 또는 제103항에 있어서, 분자량이 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41,000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 46,000, 47,000, 48,000 또는 49,000 내지 50,000 달톤인 컨쥬게이트.
  110. 제102항 또는 제103항에 있어서, 분자량이 25,000 내지 50,000 달톤인 컨쥬게이트.
  111. 제102항 또는 제103항에 있어서, 파클리탁셀이 컨쥬게이트를 기준으로 하여 26 내지 30%(w/w)인 컨쥬게이트.
  112. 제111항에 있어서, 파클리탁셀이 컨쥬게이트를 기준으로 하여 26, 27, 28, 29 또는 30%(w/w)인 컨쥬게이트.
  113. 제110항 또는 제111항에 있어서, 분자량이 26,000 내지 30,000 달톤인 컨쥬게이트.
  114. 제113항에 있어서, 분자량이 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000 달톤인 컨쥬게이트.
  115. 50% 내지 80%의 글루탐산 잔기를 갖고 20% 내지 50%의 아스파르트산 잔기를 갖는 수용성 아미노산 공중합체에 파클리탁셀을 컨쥬게이트시키되, 상기 아미노산 잔기의 다수가 글루탐산 잔기이고 상기 공중합체가 20,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 포함하는 파클리탁셀 수용성 약물을 만드는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 컨쥬게이트의 수용해도가 파클리탁셀의 수용해도보다 큰 방법.
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