KR100547553B1

KR100547553B1 - 상황버섯 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100547553B1
Application number: KR1020010059668A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 이성구; 이영순; 조종호
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단; 이성구
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2006-02-01
Also published as: KR20030026613A

Abstract

본 발명은 상황버섯 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성 불균형을 효과적으로 회복시키므로, 이와 관련된 질환을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 목적을 갖는 기능성 식품 또는 음료의 제조에도 이용될 수 있다.

Description

상황버섯 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING GAP JUNCTIONAL INTERCELLULAR COMMUNICATION AND HOMEOSTASIS-RELATED DISEASES COMPRISING PHELLINUS LINTEUS EXTRACT}

도 1은 H₂O₂에 의해 유도된 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제가 상황버섯 추출물(Phellinus linteus extract, PL)에 의해 회복되는지를 SL / DT(Scrape Loading / Dye Transfer)로 확인한 결과이고,

도 2는 H₂O₂에 의해 유도된 코넥신43(Connexin43, Cx43)의 과인산화 (hyperphosphorylation)가 상황버섯 추출물에 의해 억제되는지를 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인한 결과이고,

도 3 내지 5는 각각 H₂O₂에 의해 유도된 ERK1/2, p38 및 JNK 단백질 각각의 활성화(인산화)가 상황버섯 추출물에 의해 억제되는지를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.

본 발명은 상황버섯 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.

갭 결합(Gap Junction)은 인접한 세포간을 연결하는 복합체의 한 형태로서 이웃하는 세포의 내부와 직접적으로 연결시켜 주며, 포유동물에서는 골격근섬유, 몇몇의 신경 및 순환 혈액세포를 제외한 모든 세포에 분포한다(Bennett et al., Neuron, 6:305-320, 1991).

갭 결합의 통로는 두 개의 코넥손(connexon)이라 불리우는 반통로(hemichannel)로 이루어져 있으며, 코넥손은 코넥신(connexin)이라는 작은 단백질 6개의 집합체로 이루어진다. 이 통로의 지름은 약 1.5-2 ㎚ 정도이고, 이것의 크기는 갭 결합을 형성하는 단백질의 종류에 따라 달라지며, 이것을 통해서 작은 분자 (<2,000 Da)나 이온(예: 각종 이온, 물, 당분, 뉴클레오타이드(nucleotide), 아미노산, 지방산, 작은 펩타이드, 약물 및 발암물질) 등이 확산할 수 있게 된다(Loewenstein, Physiol Rev, 61:829-913, 1981). 이러한 갭 결합 통로를 통한 세포간의 물질 흐름을 갭 결합을 통한 세포간 정보전달(Gap Junctional Intercellular Communication, GJIC)이라 부르며, 이것은 ATP를 필요로 하지 않는 수동적 확산에 의해서 이루어진다.

갭 결합의 기능을 종합해 보면, 첫째, 가장 기본적이고도 중요한 기능으로써 세포간의 영양분, 이온, 유동물질의 빠른 평형을 이루게 해주고(Loewenstein, Physiol Rev, 61:829-913, 1981); 둘째, 심근세포, 평활근세포, 뉴론 등의 전기적 흥분세포에서의 전기적 시냅스(synapse)의 역할을 하며(Bennett et al., Neuron, 6:305-320, 1991); 셋째, 환상 뉴클레오타이드(cyclic nucleotide), 칼슘, 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate)와 같은 이차 전달물질을 통과시킴으로써 외부자극에 대한 조직의 반응을 증진시켜 조직의 호르몬에 대한 반응에 관계하며(Lowrence et al., Nature, 272:501-506, 1978); 넷째, 배아단계에서 화학적, 전기적 신호로써 배아 발생을 조절한다(Kalimi et al., J Cell Biol, 107:241-225, 1988).

이와 같이, 갭 결합은 조직에서의 항상성과 인접한 세포로의 빠른 2차 전달 물질의 수송으로 세포반응 조절을 촉진한다. 암을 비롯한 수많은 질병들, 예를 들면, 대뇌허혈, 차코-마리-투드 1형(Chacot-Marie-Tooth disease type 1, CMT1)을 포함한 신경계 질환, 정자형성 이상질환, 심혈관계 고혈압을 포함하는 혈관계 질환, 신장 질환, 간질 및 근질환 등이 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 이상으로 생기는 항상성 불균형에 기인한다는 사실이 각종 문헌에 이미 보고된 바 있다.

본 발명자들은, 면역 활성화 및 항산화 효과만이 알려진 상황버섯 추출물이 세포내 기전 중의 하나인 ERK1/2 및 p38 단백질의 활성화를 억제하여, 이들의 활성화에 의해서 매개되는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형을 효과적으로 회복시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 상황버섯 추출물 함유 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 활성 성분으로서 유효량의 상황버섯(Phellinus linteus) 추출물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 갭 결합(Gap Junction)을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 상황버섯(Phellinus linteus)의 추출물은, 상황버섯, 또는 이의 균사체 또는 이의 건조물을 에탄올 추출 또는 고압열탕 추출함으로써 제조할 수 있다.

구체적으로는, 에탄올 추출법의 경우, 상황버섯, 또는 이의 균사체 또는 이의 건조물을 85 내지 95℃의 온도에서 3 내지 5시간 동안 20 내지 40%의 에탄올 수용액으로 추출하는 공정을 2 내지 3회 반복한 후, 얻어진 추출액을 여과하고 감압농축한 다음 건조함으로써 상황버섯 추출물을 얻을 수 있으며; 고압열탕 추출법의 경우, 상황버섯, 또는 이의 균사체 또는 이의 건조물을 105 내지 115℃의 온도에서 2 내지 3시간 동안 열탕추출하는 공정을 2 내지 3회 반복한 후, 얻어진 추출액을 여과하고 감압농축한 다음 건조함으로써 다당체 성분을 포함하는 상황버섯 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 상황버섯 추출물은 세포내 기전 중의 하나인 ERK1/2 및 p38 단백질의 활성화를 억제하여, 이들의 활성화에 의해서 매개되는 후생적 기작(epigenetic mechanism)인, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형을 효과적으로 회복시키므로, 대뇌허혈, 차코-마리-투드 1형을 포함한 신경계 질환, 정자형성 이상질환, 심혈관계 고혈압을 포함하는 혈관계 질환, 신장 질환, 간질 및 근질환 등의 항상성 관련 질환을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 상황버섯 추출물은 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또 는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 상황버섯 추출물의 통상적인 1일 투여량은 15 내지 170 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는 유효량의 상황버섯 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성을 유지시키기 위한 기능성 식품 또는 음료 조성물을 제공한다. 상기 효과를 나타내기 위하여 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제 및 그밖의 건강보조식품류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상황버섯 추출물을 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기한 건강 증진용 식품 또는 음료를 제조할 수 있으며, 이 경우 최종적으로 제조된 식품 또는 음료 중에 상황버섯 추출물의 함량은 0.1 내지 80 중량% 범위이다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 실시예에서 고체와 고체 혼합물, 액체와 액체, 및 액체와 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 실온에서 수행하였다.

실시예 1: 세포 배양

인체에 가장 많이 분포되어 있고 일반적인 코넥신43(Connexin43)을 주 코넥신으로 갖는 랫트의 간 상피세포주(WB-F344 liver epithelial cell)를 사용하였다.

랫트의 간 상피세포(WB-F344 rat liver epithelial cell; Michigan State University)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린 7.5 mg/L, 스트렙토마이신 7.5 mg/L, 네오마이신 15 mg/L를 섞은 페놀 레드가 없는 D-배지 (GibcoBRL, USA)에서 상대습도 100%, 5% 이산화탄소, 37℃의 조건으로 배양하였으며, 계대 배양은 0.05% 트립신을 이용하여 3∼4일에 1회씩 실시하였다.

실시예 2: 상황버섯 추출물 제조

상황버섯을 90℃에서 4시간 동안 30%의 에탄올 수용액으로 추출하였다. 이 추출공정을 3회 반복한 후, 얻어진 추출액을 260 메쉬(mesh)로 여과하고, 60℃에서 700mmHg로 감압농축하여 25 Brix로 만들었다. 추출농축물을 분사건조법으로 건조하여 상황버섯 추출물을 제조하였다.

실시예 3: SL / DT (Scrape Loading / Dye Transfer)

발암물질인 H₂O₂에 의해 억제된 갭 결합을 통한 세포간 정보전달이 상황버섯 추출물에 의해 회복되는지를 확인하기 위해, 분자량이 작아 갭 결합을 통과할 수 있는 형광염색 물질인 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow)(Sigma, USA)를 사용하여 SL / DT를 실시한 후, 형광 염색된 세포의 양상을 형광 현미경하에 육안으로 관찰하였다.

상기 실시예 1의 배양 세포를 상기 실시예 2에서 얻어진 상황버섯 추출물(PL) 5 ㎍/㎖ 또는 25 ㎍/㎖로 24시간 동안 전처리한 후, PBS (phosphate-buffered saline)로 세척한 다음, 전처리된 배양 세포를 500 μM의 H₂O₂와 상황버섯 추출물 5 ㎍/㎖ 또는 25 ㎍/㎖로 공동처리하여 1시간 동안 배양하였다(실험군). 음성 대조군으로는 실시예 1에서와 같은 배양조건의 세포를, 양성 대조군으로는 500 μM의 H₂O₂만을 처리하여 1시간 동안 배양한 세포를 이용하였다. 각 군의 처리가 끝난 후 배지를 PBS로 세척하고, 암조건하에 10호 외과용 수술칼날을 사용하여 3개에서 6개정도의 흠집(scrape)을 세포에 만든 후, 루시퍼 옐로우를 처리하고 3분간 방치하였다. PBS로 3번 세척하고 4% 포름알데히드를 이용하여 고정시킨 다음, 블루 필터(Blue filter)의 형광 현미경하에서 세포의 양상을 200배로 관찰하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1로부터, H₂O₂단독 처리한 양성 대조군의 경우 염색된 세포 수가 현저히 적은 반면(도 1b), 상황버섯 추출물을 처리한 실험군의 경우(도 1c 및 1d) H₂O₂를 처리하지 않은 음성 대조군(도 1a)과 거의 유사한 수준으로 염색된 세포가 존재함을 알 수 있다. 이로써, H₂O₂단독 처리한 경우에는 갭 결합을 통한 세포간 정보전달이 강하게 억제되나, 상황버섯 추출물에 의해 이러한 현상이 두드러지게 감소함을 알 수 있다.

실시예 4: 웨스턴 블롯에 의한 코넥신43, ERK1/2, p38 및 JNK 발현 분석

코넥신은 정상상태에서는 p0와 p1만 발현되어 있지만 H₂O₂등의 세포간 정보전달 억제물질 등에 의해 유도된 기전에 의해 과인산화되어 p2를 발현하며, ERK1/2 및 p38은 인산화를 통해 활성화되어 pERK1/2 및 pp38을 각각 발현하는데, 이들 pERK1/2 및 pp38은 코넥신을 직접적으로 과인산화시켜 세포간 정보전달의 억제를 매개하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실에 기초하여, H₂O₂에 의해 유도된 코넥신43(Cx43)의 과인산화, 및 ERK1/2, p38 및 JNK 단백질의 활성화(인산화)가 상황버섯 추출물에 의해 억제되는지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다.

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 처리된 양성 대조군, 음성 대조군, 및 2종류의 실험군(상황버섯 추출물 5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖) 각각의 배양 세포로부터, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsufonyl fluoride, PMSF), 1μM 루펩틴(leupeptin), 0.1μM 소디움 오르쏘반데이트(sodium orthovandate), 5mM 소 디움 플루오라이드(sodium fluoride)가 포함된 20% SDS 세포 용해액을 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 -20℃를 유지하며 프로브 초음파기(sonicator)를 이용하여 10초씩 6회 초음파 분쇄하고, DC 단백질 분석 키트(Bio-Rad, 미국)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 추출된 단백질을 12.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 200V로 1시간 동안 분리하고, 100V, 350mA에서 나이트로셀룰로즈(Nitrocellulose) 막에 1시간 동안 전이시킨 후, 2차 증류수를 이용하여 간단하게 세척하고, 퐁소(Ponseau) S 용액으로 염색하여 전이 정도를 파악하였다. 막은 5%의 건조 탈지유(skim milk)가 포함된 T-PBS(0.1% Tween 20을 포함한 PBS)를 이용하여 블로킹(bloking)을 실시하고, T-PBS를 이용하여 세척하였다. 이어, 1:500으로 희석한 항 Cx43 항체(Chemicon International, Inc.), 1:1000으로 희석한 항 ERK1/2 항체(Zymed laboratories Inc), 항 Active-MAPK 항체(Promega), 항 Active-p38 항체(Promega) 및 항 Active-JNK 항체(Promega), 및 1:100으로 희석한 항 p38 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 항 JNK항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 각각 1시간 정도 반응시킨 후 T-PBS을 이용하여 세척하고, 이어 1:1000으로 희석한 2차 항체(Zymed Laboratories Inc.)와 1시간 정도 반응시킨 다음, T-PBS을 이용하여 세척하였다. ECL 화학발광 감지 시약을 이용하여 감지하고, 막을 15초 내지 1분 동안 X-선(X-ray) 필름에 감광시켰다.

랫트 간 상피세포의 주요 코넥신인 코넥신43의 관찰 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터, 양성 대조군에서는 코넥신43이 강하게 과인산화되어 p2 밴드가 관찰되나, 상황버섯 추출물을 처리한 실험군에서는 음성 대조군과 비슷한 정도로 이러한 p2 밴드가 관찰되지 않음을 알 수 있다. 이로써, H₂O₂에 의해 억제된 갭 결합을 통한 세포간 정보전달이 상황버섯 추출물에 의하여 효과적으로 회복됨을 알 수 있다.

또한, ERK1/2, p38 및 JNK 각각의 관찰 결과를 도 3 내지 5에 각각 나타내었다. 도 3 및 4로부터, 양성 대조군에서는 활성화된 pERK1/2 및 pp38 밴드가 관찰되었으나, 상황버섯 추출물을 처리한 실험군에서는 음성 대조군과 비슷한 정도로 이러한 pERK1/2 및 pp38 밴드가 관찰되지 않음을 알 수 있다. 이로써, 상황버섯 추출물이 이들 기전에 작용하여 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제를 회복시킴을 알 수 있다. 한편, JNK의 관찰 결과를 나타낸 도 5에서는, ERK1/2 또는 p38에서와 같은 강한 회복효과를 보이지 않았다. 이것은 상황버섯 추출물에 의한 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 회복이, 단순한 H₂O₂의 탐식(scavenging) 기능에 의한 것이 아니라 보다 직접적인 간섭에 의한, ERK1/2와 p38의 활성화에 대한 선택적인 방어작용으로 이루어진다는 것을 보여준다(도 3 내지 5에서, 각 시료가 동일하게 로딩(loading)되었음을 보여주기 위해 β- actin 단백질로 확인한 결과를 나란히 도시하였음).

제제예: 본 발명의 상황버섯 추출물을 함유하는 약학 조성물의 제조

상기 실시예 2에서 얻어진 상황버섯 추출물을 사용하여 하기 성분들을 포함하는 약학 조성물을 제조하였다.

상황버섯 추출물 200 mg

비타민 C 50 mg

락토스(담체) 150 mg

총 400 mg

상기 성분들을 잘 혼합하여 캅셀당 총 400 mg이 되도록 경질 젤라틴 캅셀에 충전하였다. 제조된 캅셀을 하루에 1 내지 10개 섭취함으로써 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성 유지 효과를 가져올 수 있다. 상기 조성물들은 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 일반조제법에 따라 정제, 과립제, 산제, 마이크로캅셀, 드링크제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제 등 각종 경구용 제제로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 상황버섯 추출물은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성 유지 효과를 가져 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성 불균형을 효과적으로 회복시키므로, 이와 관련된 질환을 치료하고 예방하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 목적을 갖는 기능성 식품 또는 음료의 제조에도 이용될 수 있다.

Claims

활성 성분으로서 유효량의 상황버섯(Phellinus linteus) 추출물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 갭 결합(Gap Junction)을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형으로 인한 대뇌허혈, 차코-마리-투드 1형을 포함한 신경계 질환 또는 간질을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상황버섯 추출물이, 상황버섯, 또는 이의 균사체 또는 이의 건조물을 에탄올 추출 또는 고압열탕 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상황버섯 추출물의 유효량이 15 내지 170 ㎎/㎏ 체중/일 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
삭제