KR100544694B1 - Method for regulating tapasin-dependency of MHC class I molecules - Google Patents

Abstract

본 발명은 MHC 클래스 I 분자의 타파신(tapasin)-의존성 조절방법에 관한 것으로, 구체적으로는 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114가 염기성(basic) 잔기에서 산성(acidic) 잔기로 또는 산성 잔기에서 염기성 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 MHC 클래스 I 분자 및 이를 통한 MHC 클래스 I 분자의 타파신-의존성 조절방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of tapasin-dependent regulation of MHC class I molecules, specifically amino acid residue 114 of a wild type MHC class I molecule from basic to acidic or at acidic residues. The present invention relates to a mutant MHC class I molecule characterized by substitution with a basic moiety and a method for modulating tapasin-dependent MHC class I molecule therethrough.

서로 다른 MHC 클래스 I 대립유전자(alleles)는 표면 발현을 위해 타파신에 대해 구별되는 의존성(dependence)을 나타낸다. 본 발명에서는 클래스 I 분자의 2 도메인의 잔기 114가 타파신과의 상호작용에 영향을 주어 타파신 의존성을 결정한다는 것을 밝혔다. 위치 114 에 산성(acidic) 잔기를 갖는 대립유전자는 펩타이드 로딩 및 표면 발현을 위해 타파신에 매우 의존적인 반면, 염기성(basic) 잔기를 갖는 대립유전자는 이들 기능을 위해 타파신을 필요로 하지 않는다. 따라서, 위치 114에서 염기성 잔기를 산성 잔기로 치환하면 타파신-비의존성을 타파신-의존성 표현형으로 바꾸기에 충분하고, 그 역도 가능하다.Different MHC class I alleles exhibit distinct dependencies on tapasin for surface expression. In the present invention, it was found that residue 114 of the two domains of the class I molecule influences the interaction with tapasin to determine tapasin dependence. Alleles with acidic residues at position 114 are highly dependent on tapasin for peptide loading and surface expression, whereas alleles with basic residues do not require tapasin for these functions. Thus, replacing the basic residue with an acidic residue at position 114 is sufficient to convert the tapasin-independent to the tapasin-dependent phenotype, and vice versa.

Description

ＭＨＣ 클래스 Ｉ 분자의 타파신-의존성 조절방법{Method for regulating tapasin-dependency of MHC class I molecules}Method for regulating tapasin-dependency of MHC class I molecules

도 1은 본 발명에서 사용된 HLA 클래스 I 중쇄(heavy chain) 및 그들의 돌연변이 유도체를 코딩하는 cDNA를 삽입시킨 재조합 발현벡터의 모식도이다.1 is a schematic diagram of a recombinant expression vector inserted with a cDNA encoding the HLA class I heavy chain and mutant derivatives thereof used in the present invention.

도 2은 본 발명에서 사용된 타파신을 코딩하는 cDMA를 삽입시킨 재조합 발현벡터의 모식도이다.Figure 2 is a schematic diagram of a recombinant expression vector inserted cDMA encoding tapasin used in the present invention.

도 3은 본 발명에서 사용된 인간 β2m을 코딩하는 cDMA를 삽입시킨 재조합 발현벡터의 모식도이다.3 is a schematic diagram of a recombinant expression vector inserted with cDMA encoding human β2m used in the present invention.

도 4는 여러 MHC 클래스 I 분자들의 세포 표면 발현을 위한 타파신에 대한 다양한 의존성을 보여주는 FACS 히스토그램이다.4 is a FACS histogram showing various dependences on tapasin for cell surface expression of several MHC class I molecules.

도 5는 타파신-비의존성 및 타파신-의존성 MHC 클래스 I 대립유전자들의 아미노산 서열을 비교한 그림이다.5 is a comparison of the amino acid sequences of tapasin-independent and tapasin-dependent MHC class I alleles.

도 6a 및 6b는 쥐 NIH3T3 세포에서 인간 타파신의 기능으로서 MHC 클래스 I 분자의 세포 표면 발현에 대한 잔기 114의 효과를 나타내는 FACS 히스토그램이다.6A and 6B are FACS histograms showing the effect of residue 114 on cell surface expression of MHC class I molecules as a function of human tapasin in murine NIH3T3 cells.

도 7a 및 7b는 인간 721.220 세포에서 인간 타파신의 기능으로서 MHC 클래스 I 분자의 세포 표면 발현에 대한 잔기 114의 효과를 나타내는 FACS 히스토그램이다.7A and 7B are FACS histograms showing the effect of residue 114 on cell surface expression of MHC class I molecules as a function of human tapasin in human 721.220 cells.

도 8a 내지 8d는 펩타이드-로딩 능력에서 MHC 클래스 I 대립유전자에 대한 타파신의 차등적 효과를 나타내는 면역 블롯 사진이다.8A-8D are immunoblot photographs showing the differential effects of tapasin on MHC class I alleles in peptide-loading capacity.

본 발명은 MHC 클래스 I 분자의 타파신(tapasin)-의존성 조절방법에 관한 것으로, 구체적으로는 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114가 염기성(basic) 잔기에서 산성(acidic) 잔기로 또는 산성 잔기에서 염기성 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 MHC 클래스 I 분자 및 이를 통한 MHC 클래스 I 분자의 타파신-의존성 조절방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of tapasin-dependent regulation of MHC class I molecules, specifically amino acid residue 114 of a wild type MHC class I molecule from basic to acidic or at acidic residues. The present invention relates to a mutant MHC class I molecule characterized by substitution with a basic moiety and a method for modulating tapasin-dependent MHC class I molecule therethrough.

시스템의 가장 중요한 임무는 외부세계의 적(바이러스, 미생물, 기생충 등)들이 인체에 침입할 시에 이를 차단하고 퇴치하여 다른 중요한 기관의 정상적인 임무수행에 차질이 없도록 보호하는 것이다. 이러한 면역 시스템은 특이면역을 원활히 운영할 목적으로 다양한 장비를 갖추고 있는데 그 중 제일 중요한 장비가 조직적합항원 (MHC 또는 HLA) 이다. 특이면역은 적들의 침입 사실을 림프구에 알려주는 정보제시 시스템과 이 정보에 의해서 활성화된 림프구가 침입한 적들을 공격하는 효과 시스템으로 나누어진다. 바이러스 등에 의해서 감염된 세포는 바이러스나 미생물의 일부를 토막 내어 그 중 하나의 토막 항원을 조직 항원이 인지하고 결합하여 세포 밖으로 나가서 정보 제시를 한다. 그러면 이러한 정보를 T 세포가 받아들이고 감염된 세포를 죽이게 된다.The system's most important task is to protect the enemy from outside the world (viruses, microorganisms, parasites, etc.) when it enters the human body and prevent it from disrupting the normal mission of other important organs. These immune systems are equipped with a variety of equipment for the purpose of smoothly operating specific immunity, the most important of which is histocompatibility antigen (MHC or HLA). Singular immunity is divided into an information presentation system that informs lymphocytes of their invasion and an effect system that attacks lymphatic invaders activated by this information. A cell infected by a virus or the like cuts out a part of a virus or a microorganism, and one of its membrane antigens is recognized by a tissue antigen, binds to the outside of the cell, and presents information. This information is then accepted by T cells and kills the infected cells.

이러한 조직 적합 항원과 토막 항원이 결합하는 과정에는 여러 도움 단백질(chaperone)들이 관여한다. 그 중에서 타파신(Tapasin)이라는 단백질은 세포질 내에 존재하는 토막 항원을 소포체 내부로 원활히 이동할 수 있도록 도와주며 토막 항원을 다듬어 주어 조직 항원에 잘 결합할 수 있도록 한다. 또한 토막 항원과 결합하지 못한 조직 항원은 불안정하고 불량하여 분해되거나 세포 표면으로 나가지 못하게 되는데 이렇게 세포 내부에서 안정적이지 못한 조직 항원을 붙잡아 두고 질적으로 우수한 조직 항원만이 세포 표면으로 나갈 수 있도록 조절하는 기능도 수행하고 있다. 다시 말해서 한 종류의 미생물이나 바이러스 항원이 단백질분해효소에 의해 1000-10000여 개로 토막 나지만 실제로 한 종류의 조직 항원과 결합하는 토막 항원은 그 조직 항원과 가장 강한 친화력을 지닌 것이다. 이러한 강한 친화력을 지닌 것을 만나야지 만이 조직적합항원은 안정적으로 세포 표면에서 머물러 정보 제시자로서의 역할을 수행한다. 따라서 이러한 강한 친화력을 가진 토막 항원의 생산에 타파신이라는 단백질이 필수적이다. 만약 타파신이 결손 되었거나 돌연변이가 발생하면 정상적인 조직 항원의 세포 표면 발현이 이루어지지 않아서 외부물질의 정보 제시에 실패하고 외부의 침입에 효과적으로 대응하지 못해 병에 걸릴 수밖에 없다.A number of chaperones are involved in the binding of these tissue-compatible antigens and stubs. Among them, tapasin, a protein, helps smoothly move the fragment antigen present in the cytoplasm into the endoplasmic reticulum, and trims the fragment antigen to bind to tissue antigens. In addition, tissue antigens that do not bind to stub antigens are unstable and poor, so they cannot be degraded or go out to the surface of the cells. Thus, it holds the unstable tissue antigens inside the cell and controls only the high quality tissue antigens to reach the cell surface. Is also performing. In other words, one kind of microorganism or virus antigen is chopped into 1000-10000 by protease, but the fragment antigen that actually binds to one type of tissue antigen has the strongest affinity with the tissue antigen. While meeting these strong affinity, histocompatibility antigens remain stable at the cell surface and serve as information presenters. Therefore, a protein called tapasin is essential for the production of a stub antigen having a strong affinity. If tapasin is missing or mutated, normal cell antigens are not expressed on the cell surface, failing to present information on foreign substances and failing to effectively respond to external invasion.

그런데 적(바이러스, 미생물) 침입 시 적의 항원 토막 중 조직 항원과 결합되는 것이 없으면 침입사실을 외부에 알릴 길이 없다. 이와 같은 상황에 대비하여 면역시스템은 100여 종(대립형질 또는 대립유전자: alleles)의 조직적합항원을 개발하고 각 개인은 이 중 12종의 조직 항원을 소유하도록 프로그램을 입력하였다. 그리고 각자가 갖고 있는 12종의 조직 항원을 2다발로 나누어 그 중 1다발(6종의 조직항원)을 자식을 만들 때 상속하도록 입력하였다. 이와 같은 조직항원 상속법에 의해 모든 사람은 부와 모로부터 각각1벌식 도합 2벌(12종)의 조직항원을 소유하게 된다. 12종의 조직항원은 인류에 침입하는 거의 모든 종류의 미생물의 토막항원을 결합하기에 충분하다고 면역시스템은 판단한 것이다. 따라서 이렇게 다양한 조직항원의 성질에 의해서 각 사람이 가지고 있는 조직항원들이 다른 사람이 가지고 있는 조직항원과 같을 확률은 매우 적어지게 되는 것이다.However, if the enemy (virus, microorganism) invasion of enemy antigens are not bound to the tissue antigen, there is no way to inform the outside. In response to this situation, the immune system developed histocompatibility antigens of more than 100 species (alleles or alleles), and each individual entered a program to possess 12 of these tissue antigens. Each of the 12 tissue antigens they had was divided into two bundles, and one of them (six tissue antigens) was inherited when the child was made. According to this method of inheritance of tissue antigens, everyone owns two sets of tissue antigens (12 types) from their parents and parents. The twelve tissue antigens, the immune system judged, are sufficient to bind stub antigens of almost all types of microbes that invade humans. Thus, due to the nature of the various tissue antigens, the probability that each tissue antigen is owned by another person is very small.

최근 여러 연구 결과에 의하면 어떤 조직항원의 경우에는 타파신이 없어도 정상적으로 세포 표면 발현과 더불어 정상적인 T 세포의 활성화를 야기 시키는 것을 관찰하였다. 이와 반대로 다른 여러 연구그룹에서는 타파신이 없는 경우에 비정상적인 조직항원의 성숙과 함께 세포 표면 발현도 저하되어 면역반응이 정상적으로 일어나지 않음을 보고하는 논문이 나왔다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 생각해 볼 때 위에서 설명하였듯이 엄청나게 많은 조직항원이 존재하고 이러한 여러 종류의 조직항원들에 대해 타파신의 의존성이 다르게 나타날 수 있음을 알 수 있다.Recent studies have shown that some tissue antigens cause normal T cell activation in addition to cell surface expression without tapasin. In contrast, several other groups have reported that in the absence of tapasin, immune response does not normally occur because of abnormal cell tissue expression and maturation of abnormal tissue antigens. Based on these findings, it can be seen that as described above, there are a great number of tissue antigens and the dependence of tapasin on these different types of tissue antigens may be different.

세포독성(Cytotoxic) T 림프구 (CTL)는 다형성(polymorphic) 주요조직적합복합체(MHC) 클래스(class) I 분자에 의해 제공되는 8 내지 10 아미노산 잔기의 펩타이드 항원을 인식한다 (Rammensee et al., 1993). 항원은 프로테아좀(proteoasomes)에서 분해되고, 결과의 펩타이드는 항원 제공 트랜스포터(TAP)에 의해 소포체(ER)내로 전달되고, 거기서 그들은 클래스 I 중쇄(heavy chain) 및 2-microglobulin (β2m)으로 형성된 새로 합성된 MHC 클래스 I 헤테로다이머(heterodimers)상에 로딩된다 (Heemels 및 Ploegh, 1995). 오직 적절히 연합된(assembled) MHC 클래스 I-펩타이드 복합체만이 분비 경로(pathway)를 따라 세포 표면에 전달(transport)된다.펩타이드 결합은 MHC 클래스 I 펩타이드-로딩 복합체에 의해 촉진되는데 (Cresswell, 2000), 그것은 chaperone calreticulin, thiol oxidoreductase ERp57, TAP, 및 타파신을 포함한다.Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize peptide antigens of 8 to 10 amino acid residues provided by polymorphic major histocompatibility complex (MHC) class I molecules (Rammensee et al., 1993). ). Antigens are degraded in proteaasomes and the resulting peptides are delivered into endoplasmic reticulum (ER) by antigen presenting transporters (TAPs), where they are directed to class I heavy chains and 2-microglobulin (β2m). It is loaded onto the newly synthesized MHC class I heterodimers formed (Heemels and Ploegh, 1995). Only properly assembled MHC class I-peptide complexes are transported to the cell surface along the secretory pathway. Peptide binding is promoted by MHC class I peptide-loading complexes (Cresswell, 2000). , It contains chaperone calreticulin, thiol oxidoreductase ERp57, TAP, and tapasin.

타파신(tapasin)은 ER에 존재하는 48-kDa type I 경막(transmembrane) 당단백질이다 (Ortmann et al., 1997). 타파신-결핍(deficient) 마우스의 분석은 타파신이 클래스 I 항원 제공 경로의 올바른 기능을 위해 필수불가결하다는 것을 명백히 보여주었다 (Garbi et al., 2000; Grandea et al., 2000). 타파신-돌연변이 마우스는 강하게 감소된 표면 클래스 I 분자의 발현 및 안정성을 보여준다.타파신 이중-음성(negative) 세포에 의한 세포질 항원의 제공은 현저히 손상된다 (Garbi et al., 2000). CD8+ T 세포 개발(development) 및 몇몇 바이러스에 대한 면역응답의 결함도 또한 타파신 이중-음성 마우스에서 발견되었다 (Grandea et al., 2000). 최근 연구는 타파신이 클래스 I-펩타이드 복합체의 연합(assembly)에 여러 기능을 한다는 것을 밝혔다. 그것은 중쇄 복합체를 TAP에 연결시키는 역할을 한다 (Sadasivan et al., 1996). 그러나 이 견해는 용해성 형태의 타파신이 TAP과의 상호작용은 실패하나 여전히 클래스 I 펩타이드를 로딩하기에 충분하다는 연구에 의해 도전받는다 (Lehner et al., 1998). 타파신 발현은 또한 TAP 헤테로다이머의 안정성을 향상시키고, ER내로의 총 펩타이드 전달을 증가시킨다 (Lehner et al., 1998; Li et al. 2000). 곤충(insect) 세포에서, 타파신은 ER내에 빈(empty) Kb 분자를 유지시킨다 (Schoenhals et al., 1999). 유사하게, 타파신은 타파신-결핍 인간 721.220 세포의 ER로부터 Kb 분자의 조숙(premature) 이탈을 방지하는데, 이는 타파신이 최적 펩타이드가 로딩될 때까지 ER내에 클래스 I 분자를 유지시키는데 참여할 것이라는 것을 제시한다 (Barnden et al., 2000). 마지막으로, 다른 최근의 연구들은 타파신이 클래스 I 분자의 펩타이드 편집(editing)에 관여할 것이라는 것을 제시하였다 (Lewis 및 Elliott, 1998; Purcell et al., 2001). 비록 타파신이 클래스 I-dedicated 샤페론이라는 데는 의심의 여지가 없지만, 클래스 I 대립유전자(alleles)와의 상호작용동안 타파신의 각 제안된 기능에 대한 실제 메커니즘은 아직 명확하지 않다.Tapasin is a 48-kDa type I transmembrane glycoprotein present in ER (Ortmann et al., 1997). Analysis of tapasin-deficient mice clearly showed that tapasin is indispensable for the correct functioning of the class I antigen presentation pathway (Garbi et al., 2000; Grandea et al., 2000). Tapasin-mutant mice show strongly reduced expression and stability of surface class I molecules. The provision of cytoplasmic antigens by tapasin double-negative cells is markedly impaired (Garbi et al., 2000). Defects in CD8 + T cell development and immune responses to some viruses have also been found in tapasin double-negative mice (Grandea et al., 2000). Recent studies have shown that tapasin has several functions in the assembly of class I-peptide complexes. It serves to link the heavy chain complex to TAP (Sadasivan et al., 1996). However, this view is challenged by studies that soluble forms of tapasin fail to interact with TAP but are still sufficient to load class I peptides (Lehner et al., 1998). Tapasin expression also enhances the stability of the TAP heterodimer and increases total peptide delivery into the ER (Lehner et al., 1998; Li et al. 2000). In insect cells, tapasin retains empty Kb molecules in the ER (Schoenhals et al., 1999). Similarly, tapasin prevents premature departure of Kb molecules from the ER of tapasin-deficient human 721.220 cells, suggesting that tapasin will participate in maintaining class I molecules in the ER until the optimal peptide is loaded. (Barnden et al., 2000). Finally, other recent studies have suggested that tapasin may be involved in peptide editing of class I molecules (Lewis and Elliott, 1998; Purcell et al., 2001). Although there is no doubt that tapasin is a class I-dedicated chaperone, the actual mechanism for each proposed function of tapasin during its interaction with the class I alleles is not yet clear.

MHC 클래스 I 분자상의 타파신 상호작용 부위는 아마도 많은 잔기들을 관여시킬 것이다. 이와 관련하여 최근에 위치 116에서 아스파테이트에서 타이로신으로의 치환이 타파신-의존성 B4402을 타파신에 비의존적으로 펩타이드를 로딩하고 타파신 존재하에 보이는 것과 필적하는 레벨로 세포 표면에 발현될 수 있도록 해준다고 밝혀졌다 (Williams et al., 2002). MHC 클래스 I 중쇄의 위치 116은 어떤 HLA 대립유전자의 TAP뿐만 아니라 타파신 및 calreticulin과의 연합에 영향을 준다 (Neisig et al., 1996; Turnquist et al., 2002; Turnquist et al., 2000). 유사하게, 야생형 HLA-A2 의 위치 115에 글루타민에서 알라닌으로의 치환을 갖는 HLA-A2 돌연변이 단백질은 그들의 TAP, calreticulin 또는 타파신에 감소된 연합성에도 불구하고 야생형 HLA-A2 의 것과 유사한 레벨로 세포 표면에 발현되었다 (Beissbarth et al., 2000). 그러므로, 위치 115 및 116은 샤페론(chaperone) 연 합의 결정기로서 작용하며 결과적으로 세포 표면 발현의 타파신 의존성을 결정할 수 있다고 제시된다. 그러나, 위치 115에서이 글루타민이 HLA 대립유전자들중에 보존적이며, 위치 116 단독으로는 위치 116에서 동일한 B4402 및 B2705 또는 B2702사이의 타파신 의존성의 표현형 차이를 설명할 없다 (도 5).The tapasin interaction site on the MHC class I molecule will probably involve many residues. In this regard, the recent substitution of aspartate to tyrosine at position 116 allows tapasin-dependent B4402 to load peptides independent of tapasin and to be expressed on the cell surface at levels comparable to those seen in the presence of tapasin. (Williams et al., 2002). Position 116 of the MHC class I heavy chain affects the association of tapasin and calreticulin as well as the TAP of certain HLA alleles (Neisig et al., 1996; Turnquist et al., 2002; Turnquist et al., 2000). Similarly, HLA-A2 mutant proteins having a substitution of glutamine to alanine at position 115 of wild type HLA-A2 cells at levels similar to those of wild type HLA-A2 despite their reduced association to their TAP, calreticulin or tapasin. Expressed on the surface (Beissbarth et al., 2000). Therefore, it is suggested that positions 115 and 116 act as determinants of the chaperone sequence and consequently determine tapasin dependence of cell surface expression. However, this glutamine at position 115 is conserved among HLA alleles, and position 116 alone does not account for the phenotypic difference in tapasin dependence between the same B4402 and B2705 or B2702 at position 116 (FIG. 5).

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 다형성 위치 114에서의 아미노산 차이가 모든 HLA 클래스 I 분자들사이의 타파신-의존성의 차이를 설명할 수 있다는 타파신 법칙('tapasin rule')을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have diligently researched to overcome the problems of the prior arts, and as a result, the tapasin law indicates that the amino acid difference at polymorphic position 114 can explain the difference in tapasin-dependency between all HLA class I molecules. The present invention has been completed by identifying the 'tapasin rule'.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 상기 타파신 법칙에 따라 아미노산 잔기 114가 치환된 새로운 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 제공하는 데 있다.Accordingly, the main object of the present invention is to provide a new mutant MHC class I molecule in which amino acid residue 114 is substituted according to the tapasin law.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising a gene encoding the mutant MHC class I molecule.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 이용한 MHC 클래스 I 분자의 타파신-의존성 조절방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for modulating tapasin-dependent MHC class I molecules using the mutant MHC class I molecules.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114가 염기성(basic) 잔기에서 산성(acidic) 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 제공한다.To achieve the object of the present invention, the present invention provides mutant MHC class I molecules, wherein amino acid residue 114 of the wild type MHC class I molecule is replaced with an acidic residue at a basic residue.

또한, 본 발명은 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114가 산성(acidic) 잔기에서 염기성(basic) 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 제공한다.The present invention also provides a mutant MHC class I molecule wherein amino acid residue 114 of the wild type MHC class I molecule is replaced with a basic residue at an acidic residue.

본 발명에서, 야생형 MHC 클래스 I 분자는 인체에 존재하는 100여 종의 MHC 클래스 I 중쇄(heavy chain) 대립유전자(alleles)중 어떤 것에도 적용될 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 예시적으로 B2705, B2702, A0210, A2401, B0801, B5401, B4402, B3501, A3001 대립유전자 및 비고전적(nonclassical) MHC 클래스 I 분자인 HLA-G를 사용하였다.In the present invention, wild-type MHC class I molecules may be applied to any one of about 100 MHC class I heavy chain alleles present in the human body, but embodiments of the present invention include B2705, HLA-G, a B2702, A0210, A2401, B0801, B5401, B4402, B3501, A3001 allele and nonclassical MHC class I molecules was used.

본 발명에서, 상기 염기성 잔기는 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine) 또는 라이신(Lysine)에서 선택된 어느 하나이고, 상기 산성 잔기는 아스파트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic Acid)에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the basic residue is any one selected from histidine, arginine, or lysine, and the acidic residue is any one selected from aspartic acid or glutamic acid. It is characterized by.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기와 같이 돌연변이된 MHC 클래스 I 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding the mutated MHC class I molecules as described above.

본 발명에서, 유전자는 cDNA의 형태가 바람직하며, 발현벡터는 pcDNA3.1과 같은 포유동물 발현벡터가 바람직하다. In the present invention, the gene is preferably in the form of cDNA, the expression vector is preferably a mammalian expression vector such as pcDNA3.1.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114를 산성(acidic) 잔기에서 염기성(basic) 잔기로 치환시키는 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-의존성 MHC 클래스 I 분자를 타파신-비의존성 MHC 클래스 I 분자로 변환시키는 방법을 제공한다.To achieve another object of the present invention, the present invention provides a tapasin-dependent MHC class characterized by replacing amino acid residue 114 of a wild type MHC class I molecule from an acidic residue to a basic residue. Provided is a method for converting an I molecule into a tapasin-independent MHC class I molecule.

또한, 본 발명은 야생형 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 잔기 114를 염기성(basic) 잔기에서 산성(acidic) 잔기로 치환시키는 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-비의존성 MHC 클래스 I 분자를 타파신-의존성 MHC 클래스 I 분자로 변환시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a tapasin-dependent tapasin-independent MHC class I molecule, wherein amino acid residue 114 of the wild-type MHC class I molecule is replaced with an acidic residue from a basic residue. Provided are methods for converting to MHC class I molecules.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

타파신-결핍 721.220 형질감염체(transfectants)의 연구에서 관찰된 바와 같이 다양한 클래스 I 분자는 효율적인 표면 발현 및 CTL로의 항원 결정기 제공을 위해 타파신에 대한 그들의 의존성이 서로 다르다 (Grandea et al., 1997; Lewis et al., 1998; Peh et al., 1998). 721.220 세포에서, 타파신은 HLA-B2705 allele (B2705)의 고 레벨 표면 발현 또는 CTL로의 바이러스 결정기의 제공을 위해 필요하지 않는다 (Peh et al., 1998). 이와 대조적으로, HLA-B4402 allele (B4402)에 대하여는, 기능적인 항원 제공 및 표면 발현이 타파신에 매우 의존적이며; HLA-B0801 (B0801)은 타파신 의존성 스펙트럼에 있어 B2705 및 B4402 대립유전자 사이에 속한다 (Peh et al., 1998). 그러나, 다양한 클래스 I 분자의 상대적 타파신 의존성의 차이를 결정하는 인자는 분명하지 않다. 타파신의 존재 및 부재하에 B2705에 로딩되는 몇몇 리간드의 아미노산 서열 분석은 타파신 의존성과 리간드의 세포 농도 또는 그들의 HLA-B2705에 대한 결합 친화도사이에 어떠한 명확한 관계도 보여주지 못했다 (Purcell et al., 2001). 이들 발견과 타파신 다형성(polymorphisms)의 상대적 결여를 고려하면(Williams et al., 2000), 타파신에 대한 MHC 클래스 I allele-의존성은 개별 MHC 클래스 I 대립유전자의 성질에 의한 것으로 생각된다.Tapasin-deficient 721.220 Various class I molecules differ in their dependence on tapasin for efficient surface expression and providing antigenic determinants to CTLs (Grandea et al., 1997). Lewis et al., 1998; Peh et al., 1998). In 721.220 cells, tapasin is not required for high level surface expression of HLA-B2705 allele (B2705) or for the provision of viral determinants to CTL (Peh et al., 1998). In contrast, for HLA-B4402 allele (B4402), functional antigen presentation and surface expression are highly dependent on tapasin; HLA-B0801 (B0801) belongs to the B2705 and B4402 alleles in the tapasin dependent spectrum (Peh et al., 1998). However, the factors that determine the difference in relative tapasin dependence of the various class I molecules are not clear. Amino acid sequence analysis of several ligands loaded on B2705 in the presence and absence of tapasin showed no clear relationship between tapasin dependence and cell concentration of ligands or their binding affinity for HLA-B2705 (Purcell et al., 2001). Considering these findings and the relative lack of tapasin polymorphisms (Williams et al., 2000), MHC class I allele-dependence on tapasin is believed to be due to the nature of the individual MHC class I alleles.

따라서, 본 발명자들은 타파신에 대한 MHC 클래스 I 대립유전자의 의존성을 결정하기 위하여 연구 노력한 결과, 놀랍게도 클래스 I 분자의 2 domain의 위치 114의 단일 아미노산이 펩타이드 로딩 및 세포 표면 발현을 위한 타파신에 대한 클래스 I 대립유전자의 의존성을 결정한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 잔기 114를 클래스 I 분자의 타파신-의존성을 결정하는 중요(critical) 인자라는 것을 확인함으로써,우리는 각각의 추정상 타파신 기능을 독립적으로 직접 시험할 수 있었다. 우리는 펩타이드-결합 그루브(groove)를 고친화성 펩타이드-수용성(receptive) 형태를 변형시키는데 있어 타파신의 뚜렷한 기능을 증명하였다.Thus, we have tried to determine the dependence of MHC class I alleles on tapasin and surprisingly found that a single amino acid at position 114 of the two domains of the class I molecule was directed to tapasin for peptide loading and cell surface expression. It was found that it determines the dependence of the class I allele. Moreover, by identifying residue 114 as a critical factor in determining tapasin-dependency of class I molecules, we were able to directly and independently test each putative tapasin function. We have demonstrated the distinct function of tapasin in modifying peptide-binding grooves into high affinity peptide-receptive forms.

아미노산 서열의 비교는 클래스 I 대립유전자가 위치 114에서 자연적 다형성(polymorphisms)을 나타내며, 구체적으로 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 아스파트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스파라긴(asparagines), 또는 글루타민(glutamine)에 한정된다는 것을 보여준다. 우리의 데이터로부터, 아미노산 잔기 114의 측쇄의 성질과 타파신 의존성은 명확히 상호 연관성이 있다 ('타파신 법칙'). 위치 114에서 산성 아미노산 (aspartic acid 또는 glutamic acid)을 갖는 Class I 대립유전자는 타파신과 강하게 연합되며, 고친화성 펩타이드 로딩 및 세포 표면 발현을 위해 타파신에 의존적이다. 대조적으로, 위치 114에서 염기성 아미노산 (histidine)을 함유하는 클래스 I 대립유전자는 타파신에 약하게 결합하며, 고친화성 펩타이드 결합을 위해 타파신을 필요로 하지 않는다. 이로 볼 때, 위치 114에 염기성 아미노산인 아르기닌(arginine)을 함유하는 A0101, A0301, A1101, 또는 A2902와 같은 MHC 클래스 I 대립유전자도 또한 타파신에 비의존적인 고친화성 펩타이드 결합을 나타낼 것으로 기대된다. 비 하전된 아미노산인 아스파라긴(asparagine)을 갖는 Class I 대립유전자는 세포 표면 발현을 위한 타파신 의존성의 중간 레벨을 나타내었다. 이러한 타파신 법칙은 또한 HLA-G와 같은 비고전적(nonclassical) MHC 클래스 I 분자에도 확장될 수 있는데, 타파신의 부재하에 위치 114에 글루탐산을 함유하는 야생형 HLA-G의 세포 표면 발현이 현저히 감소되었다 (도 4). 타파신 법칙은 HLA-E, HLA-F와 같은 다른 비고전적 MHC 클래스 I 분자뿐만 아니라 다른 고전적 MHC 클래스 I 분자에도 적용될 수 있다고 예상된다.Comparison of amino acid sequences indicates that the class I allele exhibits natural polymorphisms at position 114, specifically arginine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, and asparagines. ), Or glutamine. From our data, the nature of the side chains of amino acid residue 114 and tapasin dependence are clearly correlated ('tapas law'). Class I alleles with acidic amino acids (aspartic acid or glutamic acid) at position 114 are strongly associated with tapasin and are dependent on tapasin for high affinity peptide loading and cell surface expression. In contrast, class I alleles containing a basic amino acid at position 114 bind weakly to tapasin and do not require tapasin for high affinity peptide binding. In this regard, MHC class I alleles such as A0101, A0301, A1101, or A2902 containing the basic amino acid arginine at position 114 are also expected to exhibit high affinity peptide bonds independent of tapasin. Class I alleles with the uncharged amino acid asparagine exhibited an intermediate level of tapasin dependency for cell surface expression. This law of tapasin can also be extended to nonclassical MHC class I molecules such as HLA-G, which significantly reduced cell surface expression of wild type HLA-G containing glutamic acid at position 114 in the absence of tapasin ( 4). Tapasin law is expected to be applicable to other classical MHC class I molecules as well as other nonclassical MHC class I molecules such as HLA-E, HLA-F.

즉 조직항원의 단백질 서열 중에서 114번째 아미노산이 산성(acidic)인 경우에는 타파신에 의존적이어서 타파신이 있어야지 만이 정상적인 조직항원의 성숙과 더불어 세포표면 발현이 이루어지고 염기성(basic)인 경우에는 타파신에 비의존적인 성질을 지니게 되어서 타파신의 존재여부에 상관없이 조직항원과 토막항원의 결합이나 세포 밖 발현도 정상적으로 이루어지게 된다는 것을 밝혔다. 이렇게 조직항원의 114번째 아미노산은 토막항원이 결합하게 되는 직접적인 부위이기 때문에 이러한 acidic/basic한 성질 변화에 의해서 조직항원의 모양이 토막항원을 받아들이기에 좋은 형태가 되거나 아니면 타파신에 의한 도움이 있어야지 만이 토막항원을 받아들이기 좋은 형태가 이루어지는 것이다. 좀 더 구체적으로 이야기하면 타파신에 의존적이라고 알려진 조직항원 HLA-B44의 114번째 아미노산(acidic)을 타파신에 비 의존적이라고 알려진 조직항원 HLA-B27의 114번째 아미노산(basic)으로 교체하였을 경우 원래의 성질과는 다르게 HLA-B44 조직항원은 타파신이 존재하지 않아도 정상적으로 토막항원을 인지하여 세포 표면에 안정적으로 발현되어 자신의 기 능을 수행하는 것을 보였고, 반대로 HLA-B27의 114번째 아미노산(basic)이 HLA-B44의 114번째 아미노산(acidic)으로 치환되었을 경우에는 타파신에 매우 의존적인 형태로 바뀌는 것을 관찰하였다. 따라서 조직항원의 114번째 아미노산은 조직항원의 토막항원 결합부위의 모양을 바뀌게 하는 결정적인 부위라는 것을 증명한 것이다.That is, if the 114th amino acid in the protein sequence of the tissue antigen is acidic, it is dependent on tapasin, but it must be tapasin.However, in the case of basic tissue maturation, cell surface expression is achieved. It has been shown to be independant, suggesting that normal binding and extracellular expression of tissue antigens and membrane antigens is normally achieved regardless of the presence of tapasin. Since the 114th amino acid of the tissue antigen is the direct site to which the antigen antigen is bound, the shape of the tissue antigen may be a good form for accepting the antigen antigen by the change of acidic / basic properties or the help of tapasine may be required. It will be a good form to accept the antigen. More specifically, the 114th amino acid of tissue antigen HLA-B44, which is known to be dependent on tapasin, was replaced with the 114th amino acid of HLA-B27, which is known to be independent of tapasin. Unlike the properties, HLA-B44 tissue antigen was recognized as a normal antigen antigen stably expressed even on the surface of the cell even without the presence of tapasin, and showed its function. On the contrary, the 114th amino acid (basic) of HLA-B27 was When substituted with the 114th amino acid of HLA-B44, it was observed to change to a form very dependent on tapasin. Therefore, the 114th amino acid of the tissue antigen proved to be a crucial site for changing the shape of the antigen-binding site of the tissue antigen.

이렇듯, 본 발명은 다형성 위치 114에서의 자연적 아미노산 차이가 모든 HLA 클래스 I 분자들사이의 타파신-의존성의 차이를 설명할 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, 어떻게 잔기 114에서의 돌연변이가 TAP 상호작용을 변화시키지 않고 타파신과의 상호작용에 영향을 주는지 명확하지 않다. 타파신에 대한 의존성의 스펙트럼이 어떻게 클래스 I 분자의 그루브(groove)에 존재하고 집단내 자연적 변이(variation)가 있는 클래스 I 중쇄의 한 위치에 의해 결정되는 지는 명확하지 않다. X-ray crystallography에 의해 얻어진 MHC 클래스 I의 구조 모델은 잔기 114가 클레프트(cleft)의 바닥에 위치하고 클레프트내로 뻗은(point up) 측쇄를 가지고 있음을 보여준다 (Bjorkman et al., 1987; Madden et al., 1992). 이 잔기는 펩타이드-결합 그루브의 D 포켓의 필수 부분이기 때문에 (Madden et al., 1992), 펩타이드 결합에 직접적으로 영향을 준다고 예상된다.As such, the present invention shows that the natural amino acid differences at polymorphic position 114 can account for the difference in tapasin-dependency between all HLA class I molecules. However, it is not clear how mutations at residue 114 affect the interaction with tapasin without altering TAP interaction. It is not clear how the spectrum of dependence on tapasin is determined by the position of the class I heavy chain, which is present in the grooves of class I molecules and where there is natural variation in the population. The structural model of MHC class I obtained by X-ray crystallography shows that residue 114 is located at the bottom of the cleft and has a point up side chain (Bjorkman et al., 1987; Madden et. al., 1992). Since this residue is an integral part of the D pocket of the peptide-binding groove (Madden et al., 1992), it is expected to directly affect peptide binding.

본 발명에서는 타파신이 타파신-의존성 대립유전자에서 펩타이드-결합 그루브의 형태를 펩타이드-수용성 상태로 변환시키고 안정화하는데 중요한 역할을 한다고 제안한다. 이 기능은 자연적 클래스 I 서브타입 및 위치 114에서 부위-지향적 치환을 갖는 돌연변이의 펩타이드 로딩을 분석하여 얻어진 결과에 의해 뒷받침된다. 타파신의 부재하에, B4402 분자는 그것의 자연적 리간드를 효율적으로 로딩할 수 없는 반면, 위치 114에서의 아스파트산에서 히스티딘으로의 치환은 그 분자를 효율적으로 펩타이드 로딩할 수 있도록 한다 (도 8a). 동일한 실험 조건하에서, 타파신의 추가는 B4402가 고 친화성으로 펩타이드 리간드를 로딩할 수 있도록 해준다. 아스파트산 또는 글루탐산의 음 하전된 측쇄는 펩타이드-결합 그루브에서 입체 장해물(steric hindrances)을 제공하여 펩타이드의 강한 결합을 방해할 것이다. 타파신과 상호작용시, 펩타이드-결합 클레프트는 아마도 펩타이드 골격 및 MHC 클래스 I 측쇄사이의 보존된 수소 결합을 파괴함으로써 펩타이드-수용형인 개방형으로 전이될 것이다. 그러한 시나리오에서, 고친화성 펩타이드는 저친화성 펩타이드보다 더 효율적으로 펩타이드-결합 그루브를 폐쇄함으로써 타파신으로부터 펩타이드-로딩된 MHC 클래스 I 분자의 해리 및 후속 세포 표면으로의 수송을 개시할 것이다. 이 가설을 뒷받침해주는 것으로서, 타파신-연합된 및 펩타이드-로딩된 H-2Ld 클래스 I 분자가 서로 다른 형태를 가진다 것과 (Carreno et al., 1995) 타파신이 항원 결합 클레프트에서 펩타이드의 존재에 민감한 클래스 I 중쇄의 영역과 상호작용하며, 이는 고친화성 및 저친화성 펩타이드-로딩된 형태를 판별할 수 있는 타파신의 능력을 반응한다는 것 (Yu et al., 1999) 이 보고되었다.The present invention suggests that tapasin plays an important role in converting and stabilizing the form of peptide-binding grooves into a peptide-soluble state in tapasin-dependent alleles. This function is supported by the results obtained by analyzing the peptide loading of mutants with site-directed substitution at the natural class I subtype and position 114. In the absence of tapasin, the B4402 molecule is unable to efficiently load its natural ligand, whereas the substitution of aspartic acid for histidine at position 114 allows for efficient peptide loading of the molecule (FIG. 8A). Under the same experimental conditions, the addition of tapasin allows B4402 to load peptide ligands with high affinity. The negatively charged side chains of aspartic acid or glutamic acid will provide steric hindrances in the peptide-binding grooves that will interfere with the strong binding of the peptides. Upon interaction with tapasin, the peptide-binding cleft will probably be transferred to the peptide-receptive open form by breaking the conserved hydrogen bonds between the peptide backbone and the MHC class I side chain. In such scenarios, high affinity peptides will initiate dissociation of tapasin and peptide-loaded MHC class I molecules and subsequent transport to cell surface by closing the peptide-binding grooves more efficiently than low affinity peptides. In support of this hypothesis, tapasin-associated and peptide-loaded H-2Ld class I molecules have different forms (Carreno et al., 1995) and tapasin is sensitive to the presence of peptides in antigen binding clefts. It has been reported that it interacts with regions of the class I heavy chain, which responds to the ability of tapasin to discriminate between high-affinity and low-affinity peptide-loaded forms (Yu et al., 1999).

타파신-의존성 B4402와 대조적으로, 위치 114에서 염기성 잔기를 함유하는 클래스 I 분자의 펩타이드-결합 그루브는 타파신에 관계없이 개방 상태를 형성하여 적당한 펩타이드를 받아들이는 것으로 보인다. 따라서, B2705 및 B44D114H는 타파신의 도움없이 광범위한 스펙트럼의 펩타이드 레파토리를 결합하여 이어서 세포 표면에 수송할 수 있다. 타파신의 부재하에, ER을 떠나는 클래스 I 분자가 펩타이드 에 의해 전부 확인(conformed)될 수 있으나, 이들 펩타이드는 일반적으로 저 친화성으로서 표면에서 불안정하게 된다. 이와 달리, 타파신-의존성 대립유전자에도 적용가능한 것처럼, 타파신은 미최적(suboptimal) 펩타이드에서 고친화성 펩타이드로의 교환을 촉매한다. 이 아이디어는 왜 B2705 가 타파신-양성 대조군에서 관찰된 것과 유사한 레벨로 721.220 세포 표면에 발현되면서도 B2705에 결합된 펩타이드의 레파토리가 타파신의 존재 및 부재간에 차이를 보이는 지 (Purcell et al., 2001) 를 설명할 수 있다.In contrast to tapasin-dependent B4402, peptide-binding grooves of class I molecules containing basic residues at position 114 appear to open up regardless of tapasin to accept the appropriate peptide. Thus, B2705 and B44D114H can bind a broad spectrum of peptide repertoires and then transport them to the cell surface without the help of tapasin. In the absence of tapasin, class I molecules leaving the ER can all be conformed by peptides, but these peptides are generally low affinity and become unstable at the surface. In contrast, as applicable to tapasin-dependent alleles, tapasin catalyzes the exchange of suboptimal peptides to high affinity peptides. This idea is why the repertoire of peptides bound to B2705 differs between the presence and absence of tapasin while B2705 is expressed on the surface of 721.220 cells at levels similar to those observed in tapasin-positive controls (Purcell et al., 2001). This can be explained.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1 : 재조합 DNA 구조물의 제조Example 1 Preparation of Recombinant DNA Constructs

본 발명에서 사용된 모든 HLA 클래스 I 중쇄(B2705, B2702, A0210, A2401, B0801, B5401, B4402, B3501, A3001 대립유전자 및 nonclassical HLA-G0101) 및 그들의 돌연변이 유도체를 코딩하는 cDNA는 포유동물 발현벡터 pcDNA3.1/Neomycin vector (Invitrogen, San Diego, CA)내로 삽입시켰다. 상기 HLA 클래스 I 중쇄들의 cDNA 및 아미노산 서열을 서열번호 1 내지 20에 나타내었다. 이렇게 생성된 재조합 발현벡터의 모식도를 도 1에 도시하였다. 인간 타파신을 코딩하는 cDNA는 Dr. Cresswell (Yale University, New Haven, CT)로부터 제공받았으며, 이를 pcDNA3.1/Hygro vector (Invitrogen)내로 서브클로닝(subcloning)하였다. 생성된 재조합 발현벡터의 모식도를 도 2에 도시하였다. 인간 β2m 을 코딩하는 cDNA는 pcDNA3.1/Neomycin vector (Invitrogen)내에 포함시켰다. 생성된 재조합 발현벡터의 모식도를 도 3에 도시하였다. HLA 클래스 I 분자의 점돌연변이체(Point mutants)는 Pfu DNA polymerase (Stratagene, San Diego, CA)로 PCR에 의해 코돈을 변화시킴으로써 만들었다. 모든 돌연변이체의 서열은 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되었다.The cDNAs encoding all HLA class I heavy chains (B2705, B2702, A0210, A2401, B0801, B5401, B4402, B3501, A3001 alleles and nonclassical HLA-G0101) and their mutant derivatives used in the present invention are mammalian expression vector pcDNA3. Inserted into .1 / Neomycin vector (Invitrogen, San Diego, Calif.). The cDNA and amino acid sequences of the HLA class I heavy chains are shown in SEQ ID NOs: 1-20. A schematic diagram of the generated recombinant expression vector is shown in FIG. 1. CDNA encoding human tapasin is described by Dr. It was provided by Cresswell (Yale University, New Haven, CT), which was subcloned into pcDNA3.1 / Hygro vector (Invitrogen). A schematic diagram of the generated recombinant expression vector is shown in FIG. 2. CDNA encoding human β2m was included in the pcDNA3.1 / Neomycin vector (Invitrogen). A schematic diagram of the generated recombinant expression vector is shown in FIG. 3. Point mutants of HLA class I molecules were made by changing codons by PCR with Pfu DNA polymerase (Stratagene, San Diego, Calif.). The sequence of all mutants was confirmed by sequencing.

실시예 2: 형질감염된 세포주(cell lines)의 제조Example 2: Preparation of Transfected Cell Lines

쥐(murine) NIH3T3 세포를 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, Utah), penicillin (50 U/ml), 및 streptomycin (50 ug/ml)로 보충된 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM; Life Technologies, Rockville, MD)에서 배양하였다. NIH3T3 세포를 상기 인간 β2m cDNA 또는 인간 β2m 및 인간 tapasin cDNAs를 포함하는 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen)로 형질감염(transfect)시켰다. 5×10⁶ 개의 세포를 GenePorter 2 방법 (Gene Therapy Systems, Inc., San Die해, CA)을 이용하여 형질감염시켰다. 인간 β2m (NIH3T3.hβ2m)를 발현하는 안정한 클론(clones)을 0.5 mg/ml G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 첨가하여 선택하였다. 인간 β2m 및 인간 tapasin 둘다를 발현하는 안정한 형질감염체(stable transfectants) (NIH3T3.hβ2m.hTpn) 를 0.5 mg/ml G418 및 0.35 mg/ml hygromycin (Life Technologies) 항생제로 처리하여 이에 저항성을 보이는 세포들을 선별함으로써 획득하였다. 인간(human) 721.220 세포에서 타파신 발현은 인간 타파신을 코딩하는 cDNA를 포함하는 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen)를 electroporation 방법에 의해 형질감염시킴으로써 회복되었으며, 형질감염체는 0.35 mg/ml hygromycin에 저항성을 보 이는 세포들을 선택하여 721.220.hTpn 세포주를 만들었다. 721.220 및 721.220.hTpn 세포는 10 % FBS, 2 mM glutamine, penicillin (50 U/ml), 및 streptomycin (50 ug/ml)를 함유하는 RPMI 1640 medium (Life Technologies)에서 배양되었다.Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM; Life Technologies) supplemented with murine NIH3T3 cells with 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, Utah), penicillin (50 U / ml), and streptomycin (50 ug / ml) , Rockville, MD). NIH3T3 cells were transfected with the human β2m cDNA or pcDNA3.1 vector (Invitrogen) comprising human β2m and human tapasin cDNAs. 5 × 10 ⁶ cells were transfected using the GenePorter 2 method (Gene Therapy Systems, Inc., San Die, Calif.). Stable clones expressing human β2m (NIH3T3.hβ2m) were selected by addition of 0.5 mg / ml G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). Stable transfectants expressing both human β2m and human tapasin (NIH3T3.hβ2m.hTpn) were treated with 0.5 mg / ml G418 and 0.35 mg / ml hygromycin (Life Technologies) antibiotics to show cells resistant to it. Obtained by screening. Tapasin expression in human 721.220 cells was recovered by transfection of the pcDNA3.1 vector (Invitrogen) containing cDNA encoding human tapasin by electroporation, and the transfectants were resistant to 0.35 mg / ml hygromycin. The cells were selected to make the 721.220.hTpn cell line. 721.220 and 721.220.hTpn cells were cultured in RPMI 1640 medium (Life Technologies) containing 10% FBS, 2 mM glutamine, penicillin (50 U / ml), and streptomycin (50 ug / ml).

실시예 3: MHC 클래스 I 분자의 세포 표면 발현을 위한 타파신에 대한 다양한 의존성 - 유동 세포측정법(Flow cytometry)Example 3: Various dependence on tapasin for cell surface expression of MHC class I molecules-Flow cytometry

본 발명에서 사용된 단클론 항체 (mAb) W6/32 (ATCC 사, US) 는 오직 β2m 와 연합된 MHC 클래스 I heavy chains 만을 인식한다. 마우스 mAb HLA-B Ab-1 (NeoMarkers, Fremont, CA) 는 HLA-B 대립유전자를 특이적으로 인식한다. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-콘쥬게이트된 고트(goat) 항-마우스 IgG 및 horseradish peroxidase (HRP)-콘쥬게이트된 streptavidin은 각각 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA) 및 Pierce (Rockford, IL)에서 구입하였다.The monoclonal antibody (mAb) W6 / 32 (ATCC, US) used in the present invention recognizes only MHC class I heavy chains associated with β2m. Mouse mAb HLA-B Ab-1 (NeoMarkers, Fremont, CA) specifically recognizes the HLA-B allele. Fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated goat anti-mouse IgG and horseradish peroxidase (HRP) -conjugated streptavidin are Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., respectively. (West Grove, PA) and Pierce (Rockford, IL).

MHC 클래스 I 분자의 표면 발현은 유동 세포측정법(flow cytometry) (FACScalibur, Becton Dickinson Biosciences, Mountain View, CA)에 의해 결정하였다. 세포 (1×10⁶)를 1% bovine serum albumin (BSA)을 함유하는 냉(cold) PBS로 2회 세척하고, 포화 농도의 mAb W6/32로 1시간동안 4℃에서 배양하였다. 정상 마우스 IgG 를 각 시험에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 1% BSA 를 함유하는 냉 PBS로 2회 세척하고, 30분간 FITC-콘쥬게이트된 고트 항-마우스 IgG 로 염색(stain)하였다. 총 10,000 게이트된 이벤트(events)를 FACScalibur cytometer에 의해 수집하고, CellQuest software (Becton Dickinson Biosciences)로 분석하였다.Surface expression of MHC class I molecules was determined by flow cytometry (FACScalibur, Becton Dickinson Biosciences, Mountain View, CA). Cells (1 × 10 ⁶ ) were washed twice with cold PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and incubated at 4 ° C. for 1 hour with saturated concentrations of mAb W6 / 32. Normal mouse IgG was used as a negative control for each test. Cells were washed twice with cold PBS containing 1% BSA and stained with FITC-conjugated goth anti-mouse IgG for 30 minutes. A total of 10,000 gated events were collected by FACScalibur cytometer and analyzed with CellQuest software (Becton Dickinson Biosciences).

서로 다른 클래스 I 대립유전자 중에서, 클래스 I 발현을 위한 타파신에 대한 의존성은 다양하다. B4402, 및 그보다 낮은 정도로 B0801은 세포 표면 발현을 위해 타파신-의존성인 반면, B2705 는 타파신-독립성이다 (Peh et al., 1998). 타파신 의존성의 allele-특이적 변화가 다른 클래스 I 분자까지 확장가능한지 평가하기 위해, 우리는 NIH3T3.hβ2m (-hTpn) 및 NIH3T3.hβ2m.hTpn (+hTpn) 세포에서 10개의 서로다른 클래스 I 대립유전자의 세포 표면 발현을 시험하였다. pcDNA3.1 벡터속으로 클로닝된 각각의 MHC 클래스 I 대립유전자들을 NIH3T3 세포의 경우 GenePorter 2 방법에 의해, 인간 721.220 세포의 경우에는 electroporation 방법에 의해 일시적 형질감염 (transient transfection)시키고 48시간 후에 MHC 클래스 I 분자의 세포표면 발현양상을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 인간 타파신의 부재하에, MHC 클래스 I 대립유전자의 표면 발현 스펙트럼(spectrum)은 형질감염된(transfected) 세포의 풀(pools)에서 명백하였다 (도 4). 고 레벨의 표면 발현이 B2705, B2702, A0210, A2401, B0801, 및 B5401 대립유전자에서 관찰되었다. 이들 대립유전자와 대조적으로, B4402, B3501, A3001, 및 흥미롭게 HLA-G0101, a nonclassical MHC 클래스 I 분자에서는 5배 이상 낮은 표면 발현이 관찰되었다 (도 4, middle row). 그런데, 인간 타파신의 발현이 B4402, B3501, A3001, 및 HLA-G의 표면 발현을 완전히 회복시켰다 (도 4, middle row).B0801 및 B5401 의 표면 레벨도 인간 타파신의 발현시 적은 정도지만 증가되었다 (도 4, right row). 그러나, 인간 타파신의 발현이 B2705, B2702, A0210, 및 A2401 의 표면 레벨에 영향을 주지 않았다 (도 4, left row). 클래스 I 중쇄의 면역침전은 각각의 형질감염체에서 본질적으로 유사한 레벨의 이들 분자가 합성되었다는 것을 보여주었으며, 이는 클래스 I 대립유전자의 표면 발현의 차이가 형질감염체사이의 클래스 I 중쇄의 세포 레벨의 변화에 의한 것이 아니라는 것을 가리킨다 (데이터 미도시). 종전 연구에서와 같이 (Peh et al., 1998), 우리의 데이터는 클래스 I 표면 발현이 타파신에 의해 영향을 받는 정도가 진실로 대립유전자-의존적이라는 것을 가리킨다.Among the different class I alleles, the dependence on tapasin for class I expression varies. B4402, and to a lesser extent B0801 is tapasin-dependent for cell surface expression, while B2705 is tapasin-independent (Peh et al., 1998). To assess whether allele-specific changes in tapasin dependence are expandable to other class I molecules, we present 10 different class I alleles in NIH3T3.hβ2m (-hTpn) and NIH3T3.hβ2m.hTpn (+ hTpn) cells. Cell surface expression was tested. Each MHC class I allele cloned into the pcDNA3.1 vector was transient transfected by the GenePorter 2 method for NIH3T3 cells or by electroporation method for human 721.220 cells and 48 hours after MHC class I alleles The cell surface expression patterns of the molecules were analyzed by flow cytometry. In the absence of human tapasin, the surface expression spectrum of the MHC class I allele was evident in the pools of transfected cells (FIG. 4). High levels of surface expression were observed in the B2705, B2702, A0210, A2401, B0801, and B5401 alleles. In contrast to these alleles, over five-fold lower surface expression was observed in B4402, B3501, A3001, and interestingly HLA-G0101, a nonclassical MHC class I molecule (FIG. 4, middle row). However, the expression of human tapasin completely restored the surface expression of B4402, B3501, A3001, and HLA-G (FIG. 4, middle row). The surface levels of B0801 and B5401 also increased to a small extent in the expression of human tapasin ( 4, right row). However, expression of human tapasin did not affect the surface levels of B2705, B2702, A0210, and A2401 (FIG. 4, left row). Immunoprecipitation of class I heavy chains showed that essentially similar levels of these molecules were synthesized in each transfectant, indicating that differences in the surface expression of the class I alleles were associated with the cellular levels of the class I heavy chains between the transfectants. Indicates that it is not due to change (data not shown). As in previous studies (Peh et al., 1998), our data indicate that the extent to which class I surface expression is affected by tapasin is truly allele-dependent.

도 4는 세포 표면 발현을 위한 타파신에 대한 MHC 클래스 I 분자의 다양한 의존성을 보여준다. 도 4에서 NIH3T3.hβ2m 및 NIH3T3.hβ2m.hTpn 세포를 지시된 중쇄를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, mAb W6/32로 배양하고, FITC-콘쥬게이트된 고트 항-마우스 항체로 간접 면역형광에 의해 염색하고, FACS 분석을 하였다. FACS 히스토그램은 인간 타파신 부재(thin lines) 및 존재(thick lines)하에 세포에 대해 보여진 것이다. 모크(mock)-형질감염된 NIH3T3 세포의 염색은 채워진(filled) 히스토그램으로 보여진다. 도 5는 타파신-비의존성 및 타파신-의존성 클래스 I 대립유전자의 아미노산 서열을 비교한 것이다.4 shows various dependences of MHC class I molecules on tapasin for cell surface expression. In FIG. 4 NIH3T3.hβ2m and NIH3T3.hβ2m.hTpn cells were transfected with DNA encoding the indicated heavy chains, incubated with mAb W6 / 32, and indirect immunofluorescence with FITC-conjugated goth anti-mouse antibody. Stain and FACS analysis. FACS histograms are shown for cells in the absence and thick lines of human tapasin. Staining of mock-transfected NIH3T3 cells is shown as a filled histogram. 5 compares the amino acid sequences of tapasin-independent and tapasin-dependent Class I alleles.

실시예 4: 위치 114의 단일 아마노산이 표면 발현을 위한 타파신에 대한 클래스 I 분자의 의존성을 결정한다 - 유동 세포측정법(Flow cytometry)Example 4: Single Amanoic Acid at Position 114 Determines Dependence of Class I Molecules on Tapasin for Surface Expression-Flow cytometry

실시예4에서도 실시예3에서와 같은 항체 및 유동세포측정법을 이용하였다. 타파신은 거의 다형성(polymorphism)을 보이지 않으므로 (Williams et al., 2000), 타파신에 대한 다양한 의존성은 각 클래스 I 대립유전자들사이의 아미노산 차이에 의해 설명되어져야 한다. 이들 차이는 주로 클래스 I 분자의 12 도메인에 위치한다. 그러므로, 우리는 타파신 의존성에 관여될 가능성이 있는 아미노산을 결정하기 위해 이들 도메인의 서열들을 정렬하였다.MHC 클래스 I 분자는 타파신 의존성에 의해 3가지 그룹으로 나눠진다: 타파신 비의존성, 타파신 의존성, 및 약한 타파신 의존성 (도 5). 흥미롭게도, 타파신-비의존성 클래스 I 대립유전자는 위치 114에 히스티딘(histidine)을 함유한 반면, 타파신-의존성 대립유전자는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (아스파트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid))을 함유한다. 타파신에 약한 의존성 대립유전자인 B0801 및 B5401는 이 위치에 비하전된(uncharged) 아스파라진(asparagines)을 함유한다 (도 5). 데이터베이스 분석은 모든 HLA 클래스 I 분자의 위치 114가 다음 6 아미노산중 하나에 의해 나타내어진다는 것을 보여준다: 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine) (염기성), 아스파트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) (산성), 아스파라진(asparagines), 및 글루탐산(glutamine) (비하전된). 위치 114에서의 아미노산의 측쇄가 클래스 I 대립유전자의 타파신 의존성의 정도를 결정하는 지를 시험하기 위해, 우리는 여러 치환 돌연변이를 구축하고, 표면 발현을 위한 타파신에 대한 그들의 의존성을 검사하였다. 놀랍게도, 야생형 B2705의 위치 114에 히스티딘에서 아스파트산으로의 치환을 함유하는 B27H114D가 더 이상 타파신 비의존성을 나타내지 않았고, 대신에 표면 발현을 위해 타파신-의존성 표현형을 나타내었다 (도 6a). A0101, A0301, A1101, 또는 A2902와 같은 몇몇 MHC 클래스 I 대립유전자들에서 아르기닌이 발견되므로, 우리는 그와 같이 B2705 (B27H114R) 에서 히스티딘 대신에 아르기닌을 치환하고, 표면 발현을 위한 타파신에 대한 그것의 의존성을 시험하였다. 인간 타파신이 없는 경우에 B27H114R 의 표면 발현은 야생형 B2705에서 관찰된 레벨에 필적하였고, 인간 타파신의 발현에 의해 영향을 받지 않았으며 (도 6a), 이는 아르기닌이 어떤 MHC 클래스 I 대립유전자에 타파신 비의존성을 부여하는 면에서 위치 114에서의 히스티딘을 기능적으로 대체할 수 있다는 것을 가리킨다. B4402의 위치 114에서 아스파트산에서 히스티딘으로의 치환 (B44D114H)은 타파신-비의존성 표면 발현을 초래하였다 (도 6b). 아스파트산에서 아스파라긴으로의 치환 (B44D114N)은 타파신에 대한 약한 의존성의 표면 발현을 초래하였으며 (도 6b), 이는 위치 114에 아스파라긴을 함유하는 야생형 B0801 및 B5401에서 관찰된 발현과 유사하였다 (도 4). 이들 결과는 HLA 클래스 I 대립유전자의 타파신 의존성이 위치 114에서 아미노산의 성질, 즉 아미노산의 측쇄의 전하에 의해 결정된다는 것을 명확히 가리킨다.In Example 4, the same antibody and flow cytometry as in Example 3 were used. Since tapasin shows almost no polymorphism (Williams et al., 2000), the various dependencies on tapasin should be explained by the amino acid differences between each class I allele. These differences are mainly located in the 12 domains of class I molecules. Therefore, we aligned the sequences of these domains to determine the amino acids that are likely to be involved in tapasin dependence. MHC class I molecules are divided into three groups by tapasin dependency: tapasin independent, tapasin dependent , And weak tapasin dependence (FIG. 5). Interestingly, the tapasin-independent class I allele contains histidine at position 114, while the tapasin-dependent allele has an amino acid residue (aspartic acid or glutamic acid) with an acidic side chain. acid)). The dependent alleles B0801 and B5401, which are weak to tapasin, contain asparagines uncharged at this position (FIG. 5). Database analysis shows that position 114 of all HLA class I molecules is represented by one of the following 6 amino acids: histidine, arginine (basic), aspartic acid, glutamic acid ) (Acidic), asparagines, and glutamic acid (uncharged). To test whether the side chains of amino acids at position 114 determine the degree of tapasin dependency of the class I allele, we constructed several substitution mutations and examined their dependence on tapasin for surface expression. Surprisingly, B27H114D, containing histidine to aspartic acid substitution at position 114 of wild type B2705, no longer showed tapasin-independent, but instead showed a tapasin-dependent phenotype for surface expression (FIG. 6A). Since arginine is found in some MHC class I alleles, such as A0101, A0301, A1101, or A2902, we thus replace arginine in place of histidine in B2705 (B27H114R) and replace it with tapasin for surface expression. Was tested. In the absence of human tapasin, the surface expression of B27H114R was comparable to the level observed in wild type B2705 and was not affected by the expression of human tapasin (FIG. 6A), indicating that arginine was not able to tapasin to any MHC class I allele. It indicates that the histidine at position 114 can be functionally substituted in terms of giving dependency. Substitution of aspartic acid for histidine (B44D114H) at position 114 of B4402 resulted in tapasin-independent surface expression (FIG. 6B). Substitution of aspartic acid with asparagine (B44D114N) resulted in a weak expression of surface dependence on tapasin (FIG. 6B), which was similar to the expression observed in wild-type B0801 and B5401 containing asparagine at position 114 (FIG. 4). These results clearly indicate that the tapasin dependency of the HLA class I allele is determined by the nature of the amino acid at position 114, ie the charge of the side chains of the amino acid.

쥐(murine) NIH3T3 세포에서 전부-레벨 표면 발현을 이루기 위한 인간 타파신의 요구성에 대한 HLA 클래스 I 분자의 대립유전자 다양성은 HLA 클래스 I 분자 및 쥐 항원 제공 장치의 성분, 구체적으로 내생적(endogenous) 쥐 타파신사이의 종(species) 비적합성(incompatibility)에 의한 것일 수도 있다. 그러므로, 우리는 타파신-결핍 인간 721.220 세포에서 B2705, B27H114D, B4402, 및 B44D114H의 발현을 검사하였다. 이들 중쇄(heavy chains)를 코딩하는 유전자를 인간 타파신 (721.220.hTpn)을 안정하게 발현하는 721.220 세포주 및 721.220 세포내로 독립적으로 형질감염시켰다. 721.220 세포에서, B2705의 표면 발현은 타파신-비의존적이 지만, B27H114D의 표면 발현은 상당히 감소되었다 (도 7a). 이와 비교하여, 721.220.hTpn 세포에서, B27H114D 돌연변이체의 표면발현 레벨은 10배 높았으며, 그것의 타파신 의존성을 확인시켰다. B2705와 비교하여, B4402는 타파신 의존성에 대해 정확히 반대의 표현형을 나타내었다. B4402은 표면 발현을 위해 타파신-의존적인 반면, B44D114H의 표면 발현은 타파신-비의존적이었다 (도 7b). 721.220 형질감염체에 대한 분석 결과는 마우스 NIH3T3 세포 형질감염체에서 관찰된 결과와 매우 유사하였다. 그러므로, 우리는 HLA 클래스 I 분자가 세포 유형에 관계없이 표면 발현을 위한 타파신 의존성의 스펙트럼을 나타내며, 위치 114에서 단일 아미노산이 MHC 클래스 I 대립유전자의 타파신 의존성을 결정하기에 충분하다고 결론지었다.Allelic diversity of HLA class I molecules for the requirement of human tapasin to achieve full-level surface expression in murine NIH3T3 cells is a component of HLA class I molecules and mouse antigen presenting devices, specifically endogenous rats. It may also be due to species incompatibility between tapasin. Therefore, we examined the expression of B2705, B27H114D, B4402, and B44D114H in tapasin-deficient human 721.220 cells. Genes encoding these heavy chains were independently transfected into 721.220 cell lines and 721.220 cells stably expressing human tapasin (721.220.hTpn). In 721.220 cells, surface expression of B2705 is tapasin-independent, but surface expression of B27H114D was significantly reduced (FIG. 7A). In comparison, in 721.220.hTpn cells, the surface expression level of the B27H114D mutant was 10-fold higher, confirming its tapasin dependency. Compared with B2705, B4402 showed the exact opposite phenotype for tapasin dependence. B4402 was tapasin-dependent for surface expression, while surface expression of B44D114H was tapasin-independent (FIG. 7B). The assay results for 721.220 transfectants were very similar to those observed for mouse NIH3T3 cell transfectants. Therefore, we concluded that HLA class I molecules exhibit a spectrum of tapasin dependence for surface expression regardless of cell type, and that a single amino acid at position 114 is sufficient to determine the tapasin dependence of the MHC class I allele.

도 6는 쥐 세포에서 인간 타파신의 기능으로서 MHC 클래스 I 분자의 세포 표면 발현에 대한 잔기 114의 효과를 나타낸다. 마우스 NIH3T3.hβ2m 및 NIH3T3.hβ2m.hTpn 세포를 B2705 (도 6a), B4402 (도 6b), 또는 위치 114에서의 치환 돌연변이체의 중쇄를 코딩하는 DNA로 형질감염시켰다. 세포를 mAb W6/32로 배양하고, FITC-콘쥬게이트된 고트 항-마우스 항체로 간접 면역형광에 의해 염색하고, FACS 분석을 하였다. 모크-형질감염된 NIH3T3 대조군 세포의 염색은 점선으로 보여진다.6 shows the effect of residue 114 on cell surface expression of MHC class I molecules as a function of human tapasin in rat cells. Mouse NIH3T3.hβ2m and NIH3T3.hβ2m.hTpn cells were transfected with DNA encoding the heavy chain of B2705 (FIG. 6A), B4402 (FIG. 6B), or a substitutional mutant at position 114. Cells were incubated with mAb W6 / 32, stained by indirect immunofluorescence with FITC-conjugated goth anti-mouse antibody, and subjected to FACS analysis. Staining of mock-transfected NIH3T3 control cells is shown by dashed lines.

도 7은 잔기 114가 인간 세포에서 효율적인 표면 발현을 위한 타파신 의존성의 스펙트럼을 지배한다는 것을 보여준다. 721.220 및 721.220.hTpn 세포를 B2705 또는 B27H114D (도 7a) 및 B4402 또는 B44D114H (도 7b) 중쇄를 코딩하는 DNA로 형 질감염시켰다. 세포를 형질감염한지 48시간 후 mAb HLA-B Ab-1 로 배양하고, FITC-콘쥬게이트된 고트 항-마우스 항체로 간접 면역형광에 의해 염색한 후 FACS 분석을 하였다. 타파신-양성 (thick lines), 타파신-음성 (thin lines), 및 모크-형질감염된 721.220 세포 (dotted lines) 가 보여진다.7 shows that residue 114 dominates the spectrum of tapasin dependency for efficient surface expression in human cells. 721.220 and 721.220.hTpn cells were textured with DNA encoding the B2705 or B27H114D (FIG. 7A) and B4402 or B44D114H (FIG. 7B) heavy chains. 48 hours after transfection, cells were incubated with mAb HLA-B Ab-1, stained with FITC-conjugated goth anti-mouse antibody by indirect immunofluorescence, and subjected to FACS analysis. Tapasin-thick lines, tapasin-negative (thin lines), and mok-transfected 721.220 cells (dotted lines) are shown.

실시예 5: 클래스 I 대립유전자의 펩타이드 로딩은 타파신-의존성이며 잔기 114에 의해 영향을 받는다Example 5 Peptide Loading of Class I Alleles Are Tapas-Dependent and Affected by Residue 114

5-1: 마이크로좀(microsomes)의 제조5-1: Preparation of microsomes

세포주로부터 마이크로좀을 상술한 바와 같이 제조하고 정제하였다 (Saraste et al., 1986). 요약하면, B2705, B27H114D, B4402, or B44D114H 중사슬(heavy chains)을 발현하는 NIH3T3 세포를 인간 타파신 있거나 없이 트립신처리(trypsinized)하고, PBS로 1회 세척하고, 원심분리로 수확하였다. 세포를 0.25 M sucrose, 25 mM potassium acetate, 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM calcium acetate, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 ug/ml leupeptin, 및 0.25 mM PMSF를 함유하는 cavitation 버퍼에 2×10⁸ cells/ml 의 농도로 재현탁하고, 26-gauge needle을 통해 16 통과(passages)에 의해 균질화(homogenized)하였다. 비파괴된 세포 및 핵을 4℃ 에서 10분간 1,500×g 의 원심분리로 제거하였다. 상등액을 4℃ 에서 1시간동안 75,000×g 에서 한외원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 막 펠렛을 cavitation 버퍼에 재현탁하고, 액체 질소에서 스냅-동결하고, 사용전까지 -80℃ 에 보관하였다.Microsomes from cell lines were prepared and purified as described above (Saraste et al., 1986). In summary, NIH3T3 cells expressing B2705, B27H114D, B4402, or B44D114H heavy chains were trypsinized with or without human tapasin, washed once with PBS, and harvested by centrifugation. Cells were placed in 2 × 10 cells in a cavitation buffer containing 0.25 M sucrose, 25 mM potassium acetate, 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM calcium acetate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 ug / ml leupeptin, and 0.25 mM PMSF. Resuspended at a concentration of ⁸ cells / ml and homogenized by 16 passes through a 26-gauge needle. Non-destructed cells and nuclei were removed by centrifugation at 1,500 × g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was ultracentrifuged at 75,000 × g for 1 hour at 4 ° C. The supernatant was removed and the membrane pellet was resuspended in cavitation buffer, snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until use.

5-2: 펩타이드 및 펩타이드 변형(modification)5-2: Peptides and Peptide Modifications

비오틴화된 아미노-말단 잔기를 갖는 GRIDKPILK (ligand for B2705) 및 AEIDKVTGY (ligand for B4402) 펩타이드 및 비변형된 KIPAQFYIL 펩타이드 (95% purity)를 Genemed Synthesis, Inc. (San Francisco, CA)로부터 구입하였다. B2705 및 B4402 펩타이드 리간드의 e-아미노 라이신을 200 ul DMSO 중의 0.2 mg 의 N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB-NOS; Pierce)를 80 ul PBS 및 40 ul 0.5 M 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid (pH 10) 중의 100 ug의 펩타이드와 혼합함으로써 photoreactive cross-linker에 의해 공유결합적으로 변형시켰다. photocross-linking을 위해, 비오틴-변형된 펩타이드를 빙상에서 1시간동안 ANB-NOS 로 배양하였다. 변형 및 라벨링 실험은 암실(dark)에서 수행하였다. 상기 cross-linker변형된 및 비오틴-라벨된 펩타이드를 biotin-GRIDKPILK-ANB-NOS 또는 biotin-AEIDKVTGY-ANB-NOS라고 명명한다. GRIDKPILK (ligand for B2705) and AEIDKVTGY (ligand for B4402) peptides with biotinylated amino-terminal residues and unmodified KIPAQFYIL peptides (95% purity) were synthesized by Genemed Synthesis, Inc. (San Francisco, CA). E-amino lysine of the B2705 and B4402 peptide ligands was added 0.2 mg of N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB-NOS; Pierce) in 200 ul DMSO for 80 ul PBS and 40 ul 0.5 M 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic Covalently modified by photoreactive cross-linker by mixing with 100 ug of peptide in acid (pH 10). For photocross-linking, biotin-modified peptides were incubated with ANB-NOS for 1 hour on ice. Modification and labeling experiments were performed in the dark. The cross-linker modified and biotin-labeled peptides are termed biotin-GRIDKPILK-ANB-NOS or biotin-AEIDKVTGY-ANB-NOS.

5-3: 펩타이드 로딩 및 펩타이드 전위(translocation) 측정5-3: Peptide Loading and Peptide Translocation Measurements

펩타이드-로딩 측정(assay)을 위해, 리포터 펩타이드를 총부피 50 l RM 버퍼 (250 mM sucrose, 50 mM triethanolamine-HCl, 50 mM potassium acetate, 2 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, 및 10 mM ATP)중의 15 l 의 마이크로좀 (concentration of 60 A280/ml)과 혼합하였다. 혼합물을 평바닥 96-웰 조직배양플레이트에서 30 분간 26℃에서 배양하였다. 샘플을 빙상에 유지하면서 단파(365 nm) 자외선 조사에 3분간 노출시켰다. 마이크로좀 막을 RM 버퍼중의 0.5 M 수크로즈 쿠션(cushion)을 통해 원심분리에 의해 수거하였다. 막을 냉 RM 버퍼로 1회 세척하고, 1% digitonin로 용해시키고, cross-linked 단백질을 mAb W6/32로 면역침전 시켰다. 침전물을 12% SDS-PAGE에 의해 분리하고, immobilon-P membrane (Millipore, Bedford, MA)으로 전달하였다. 막을 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS중의 5% skim milk로 1시간동안 블로킹하고, 막을 HRP-콘쥬게이트된 스트렙타비딘으로 1시간동안 배양하였다. 비오틴화된 단백질을 ECL Western blotting reagent (Pierce)을 사용하여 가시화하였다. 펩타이드 경쟁(competition)을 위해, 리포터 펩타이드를 다양한 농도의 비변형된 펩타이드 (KIPAQFYIL)와 혼합한 후, cross-linking 반응시켰다. 펩타이드 전위는 1 mM ATP의 존재 또는 부재하에 26℃에서 30분간 경쟁자(competitor)의 부재하에 비오틴-콘쥬게이트된 리포터 펩타이드와 함께 마이크로좀을 배양한 후에 결정하였다. 마이크로좀 막을 냉 RM 버퍼에서 0.5 M 수크로즈 쿠션을 통해 10분간 75,000×g 의 원심분리에 의해 수거하였다. 냉 RM 버퍼로 2회 세척한 후, 막 펠렛을 샘플 버퍼에 직접 용해시켰다. 샘플을 상술한 대로(Schagger 및 von Jagow, 1987) 저분자량 폴리펩타이드의 해상에 적합한 Tricine/SDS-PAGE상에서 분석하고, HRP-콘쥬게이트된 스트렙타비딘으로 프로빙(probe)하였다. 펩타이드 밴드의 상대 농도(densities)는 imaging densitometer (GS-700, Bio-Rad) 및 MultiAnalyst densitometer software (Bio-Rad)을 사용하여 결정하였다.For peptide-loading assays, reporter peptides were collected in a total volume of 50 l RM buffer (250 mM sucrose, 50 mM triethanolamine-HCl, 50 mM potassium acetate, 2 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, and 10 mM ATP). 15 l of microsomes (concentration of 60 A280 / ml) were mixed. The mixture was incubated at 26 ° C. for 30 minutes in flat bottom 96-well tissue culture plates. The samples were exposed to shortwave (365 nm) ultraviolet radiation for 3 minutes while keeping on ice. Microsome membranes were harvested by centrifugation through a 0.5 M sucrose cushion in RM buffer. Membranes were washed once with cold RM buffer, lysed with 1% digitonin, and cross-linked proteins were immunoprecipitated with mAb W6 / 32. The precipitate was separated by 12% SDS-PAGE and transferred to immobilon-P membrane (Millipore, Bedford, Mass.). The membrane was blocked for 1 hour with 5% skim milk in PBS containing 0.1% Tween-20 and the membrane was incubated for 1 hour with HRP-conjugated streptavidin. Biotinylated proteins were visualized using ECL Western blotting reagent (Pierce). For peptide competition, reporter peptides were mixed with various concentrations of unmodified peptides (KIPAQFYIL) and then cross-linked. Peptide translocation was determined after incubation of microsomes with biotin-conjugated reporter peptides in the absence or of a competitor for 30 minutes at 26 ° C. in the presence or absence of 1 mM ATP. Microsome membranes were harvested by centrifugation at 75,000 × g for 10 minutes through a 0.5 M sucrose cushion in cold RM buffer. After washing twice with cold RM buffer, the membrane pellets were dissolved directly in the sample buffer. Samples were analyzed on Tricine / SDS-PAGE suitable for resolution of low molecular weight polypeptides as described above (Schagger and von Jagow, 1987) and probed with HRP-conjugated streptavidin. Relative densities of peptide bands were determined using imaging densitometer (GS-700, Bio-Rad) and MultiAnalyst densitometer software (Bio-Rad).

5-4: 공면역침전(coimmunoprecipitation) 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석5-4: Coimmunoprecipitation and Western blot analysis

세포를 프로테아제 저해제로 보충된 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 및 5 mM MgCl2 (pH 7.6)를 함유하는 digitonin buffer 중의 1% digitonin에 용해시켰다. 용해물(Lysates)을 4℃에서 1시간 protein A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech)로 프리클리어하였다. 면역침전을 위해, 샘플을 4℃ 에서 2시간동안 적당한 항체로 배양한 후, protein A-Sepharose 비드를 첨가하였다. 비드를 0.1% digitonin로 4회 세척하고, 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼에서 보일링에 의해 용리시켰다. 단백질을 12% SDS-PAGE에 의해 분리하고, nitrocellulose membrane로 전달하고, 2시간 동안 0.1% Tween-20를 갖는 PBS중의 5% 스킴 밀크로 블로킹(block)하고, 4시간동안 적당한 항체로 프로빙(probe)하였다. 막(membranes)을 0.1% Tween-20을 갖는 PBS로 3회 세척하고, 1시간동안 HRP-콘쥬게이트된 streptavidin (Pierce)와 함께 배양하였다. 면역블롯은 ECL detection reagent (Pierce)로 가시화하였다.Cells were lysed in 1% digitonin in digitonin buffer containing 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, and 5 mM MgCl2, pH 7.6, supplemented with protease inhibitors. Lysates were precleared with protein A-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) at 4 ° C. for 1 hour. For immunoprecipitation, samples were incubated with appropriate antibodies for 2 hours at 4 ° C. and then protein A-Sepharose beads were added. The beads were washed four times with 0.1% digitonin and the bound protein was eluted by boiling in SDS sample buffer. Proteins were separated by 12% SDS-PAGE, delivered to nitrocellulose membrane, blocked with 5% scheme milk in PBS with 0.1% Tween-20 for 2 hours and probed with appropriate antibody for 4 hours. ) Membranes were washed three times with PBS with 0.1% Tween-20 and incubated with HRP-conjugated streptavidin (Pierce) for 1 hour. Immunoblots were visualized with ECL detection reagent (Pierce).

타파신의 부재시, B4402 및 B27H114D의 손상된 세포내 수송(intracellular transport) 및 결과적인 낮은 표면 발현은 펩타이드를 로딩하는 능력 부족 때문일 수도 있다. 펩타이드 로딩에서 타파신의 관여를 조사하기 위해, 우리는 cross-linker-변형된 및 비오틴-라벨된 리포터 펩타이드를 사용하였다. HLA-transfectants에서 유래된 정제 마이크로좀에서 스트렙타비딘으로 프로빙(probing)함으로써, 이들 변형이 MHC 클래스 I 분자에 대한 리포터 펩타이드의 photocross-linking과 MHC 클래스 I 분자내로의 펩타이드 로딩의 모니터링을 가능케 하였다. 우리는 인간 타파신의 존재 또는 부재하에 B4402 및 B44D114H transfectants에서 유래된 완전 마이크로좀을 배양하고 관련없는 다양한 농도의 비라벨된 KIPAQFYIL 펩타이드의 존재하에 B4402 에 고친화성을 갖는 천연 리간드인 100 nM 의 비오틴 -AEIDKVTGY-ANB-NOS 펩타이드(Dibrino et al., 1995)를 배양하였다. 타파신-의존성 펩타이드 로딩의 양은 W6/32-reactive 클래스 I 복합체내로의 라벨된 펩타이드 통합의 레벨을 측정함으로써 결정하였다. 놀랍게도, 인간 타파신의 부재하에 B4402 및 B44D114H 의 펩타이드 로딩 능력에 현저한 차이가 있었다. 경쟁자(competitor)를 첨가하지 않은 경우, B4402에 의한 리포터 펩타이드의 결합 레벨은 B44D114H에서 관찰된 결합의 겨우 25%이었다 (도 8a, first lanes). 더욱이, B4402내로 로딩된 리포터 펩타이드는 저농도(1.6 M)의 비라벨된 펩타이드에 의해 완전히 경쟁에서 축출된(out-competed) 반면, 12.8 M 만큼의 비라벨된 펩타이드도 B44D114H에 결합된 리포터 펩타이드를 완전히 경쟁에서 축출하기에 충분하지 않았다. 그러나, 타파신의 존재하에, B4402 및 B44D114H의 펩타이드 로딩 능력에 식별가능한 차이가 보이지 않았다 (도 8b). 이들 결과는 B4402 분자가 효율적인 펩타이드 로딩을 위해 타파신에 매우 의존적이나, 위치 114에서의 아스파트산에서 히스티딘으로의 치환이 상기 분자를 펩타이드 로딩을 위해 타파신에 비의존적으로 만들었다는 것을 가리킨다. 따라서, 타파신 부재하에 B4402 및 B27H114D의 손상된 세포내 수송 및 감소된 표면 발현은 아마도 펩타이드 로딩의 무능력의 결과일 것이다.In the absence of tapasin, impaired intracellular transport and resulting low surface expression of B4402 and B27H114D may be due to a lack of ability to load peptides. To investigate the involvement of tapasin in peptide loading, we used cross-linker-modified and biotin-labeled reporter peptides. By probing with streptavidin in purified microsomes derived from HLA-transfectants, these modifications enabled the photocross-linking of reporter peptides to MHC class I molecules and the monitoring of peptide loading into MHC class I molecules. We cultivated complete microsomes derived from B4402 and B44D114H transfectants in the presence or absence of human tapasin and 100 nM biotin-AEIDKVTGY, a natural ligand with high affinity to B4402 in the presence of unlabeled varying concentrations of unlabeled KIPAQFYIL peptides. -ANB-NOS peptide (Dibrino et al., 1995) was cultured. The amount of tapasin-dependent peptide loading was determined by measuring the level of labeled peptide integration into the W6 / 32-reactive class I complex. Surprisingly, there was a significant difference in the peptide loading capacity of B4402 and B44D114H in the absence of human tapasin. Without adding a competitor, the binding level of the reporter peptide by B4402 was only 25% of the binding observed in B44D114H (FIG. 8A, first lanes). Moreover, reporter peptides loaded into B4402 were completely out-competed by low concentrations (1.6 M) of unlabeled peptides, while as much as 12.8 M of unlabeled peptides completely blocked reporter peptides bound to B44D114H. It was not enough to ouster the competition. However, in the presence of tapasin, no discernible difference was seen in the peptide loading capacity of B4402 and B44D114H (FIG. 8B). These results indicate that the B4402 molecule is highly dependent on tapasin for efficient peptide loading, but the substitution of aspartic acid to histidine at position 114 made the molecule independent of tapasin for peptide loading. Thus, impaired intracellular transport and reduced surface expression of B4402 and B27H114D in the absence of tapasin are probably the result of inability of peptide loading.

펩타이드 로딩을 위한 B2705 및 B27H114D의 타파신 의존성 분석은 야생형 B2705이 B44D114H을 닮은 반면, B27H114D는 야생형 B4402같이 행동한다는 것을 보여주었다. 인간 타파신의 부재하에, B2705는 리포터 펩타이드, 비오틴-GRIDKPIK-ANB-NOS에 효율적으로 결합하였는데, 그것의 비변형된 형태는 B2705의 고친화성 리간드로 알려져 있다 (Urvater et al., 2001). 고 농도 (12.8 M) 의 비라벨된 펩타이드, KIPAQFYIL는 리포터 펩타이드 결합을 경쟁에서 축출하기에 충분하지 않았다 (도 8c, upper).대조적으로, B2705의 위치 114에서의 히스티딘에서 아스파트산으로의 치환은 그것의 펩타이드 로딩 능력을 현저히 폐지시켰다 (도 8c, lower).그러나, 인간 타파신의 발현은 B27H114D의 펩타이드 로딩 능력을 야생형 B2705과 동일한 레벨까지 크게 향상시켰다 (도 8d, lower 및 upper, respectively).Tapasin dependence analysis of B2705 and B27H114D for peptide loading showed that B27H114D behaves like wild type B4402, while wild type B2705 resembles B44D114H. In the absence of human tapasin, B2705 efficiently bound to the reporter peptide, Biotin-GRIDKPIK-ANB-NOS, its unmodified form is known as the high affinity ligand of B2705 (Urvater et al., 2001). High concentrations (12.8 M) of the unlabeled peptide, KIPAQFYIL, were not sufficient to evoke the reporter peptide bonds from the competition (FIG. 8C, upper). In contrast, histidine to aspartic acid substitution at position 114 of B2705. Significantly abolished its peptide loading capacity (FIG. 8C, lower). However, expression of human tapasin significantly enhanced the peptide loading capacity of B27H114D to the same level as wild type B2705 (FIG. 8D, lower and upper, respectively).

도 8은 펩타이드-로딩 능력에서 클래스 I 대립유전자에 대한 타파신의 차등적 효과를 나타낸다. 마이크로좀 막은 B4402 (도 8a, b), B44D114H (도 8a, b), B2705 (도 8c, d), 또는 B27H114D cDNAs (도 8 c, d)로 형질감염된 NIH3T3.hβ2m (도 8 a, c) 및 NIH3T3.hβ2m.hTpn (도 8 b, d)으로부터 유래되었다. 펩타이드의 상대량을 가장 강한 밴드인 B4402에 대한 백분율로 나타내어 그래프로 만들었다 (도 8 e). 대표적 면역블롯 및 밀도측정(densitometry)의 결과가 나타내어진다.8 shows the differential effect of tapasin on class I alleles in peptide-loading ability. Microsome membranes were NIH3T3.hβ2m (FIG. 8 a, c) transfected with B4402 (FIG. 8 a, b), B44D114H (FIG. 8 a, b), B2705 (FIG. 8 c, d), or B27H114D cDNAs (FIG. 8 c, d). And NIH3T3.hβ2m.hTpn (FIG. 8 b, d). Relative amounts of peptides were plotted as percentages for the strongest band, B4402 (FIG. 8 e). Representative immunoblot and densitometry results are shown.

결론적으로, 우리의 데이터는 클래스 I 분자의 효율적인 펩타이드 로딩을 위한 타파신 의존성의 기능적 다형성(polymorphism)이 위치 114에서 서로 다른 아미노산의 존재에 의해 결정되어 진다는 것을 명확히 보여준다.In conclusion, our data clearly show that the functional polymorphism of tapasin dependence for efficient peptide loading of class I molecules is determined by the presence of different amino acids at position 114.

이상 설명한 바와 같이, 현재 모든 사람에게서 발현되는 조직항원의 종류는 굉장히 다양하고 이러한 다양한 조직항원들은 114번째 아미노산에 의한 타파신의 의존성 규칙을 가지고 있다. 따라서, 이러한 규칙을 고려해서 특정 조직적합항원의 세포표면 발현정도를 인위적으로 조절할 수 있으며, 이는 타파신 의존성에 의해 영향을 받는 여러 임상적 상황들, 예컨대 장기이식수술에서의 이식거부반응, 척추관절염등의 자가면역질환, 타파신을 공격하는 만성 바이러스성 감염의 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다. As described above, there are currently a great variety of tissue antigens expressed in all humans, and these various tissue antigens have a dependency rule of tapasin on the 114th amino acid. Thus, taking into account these rules, it is possible to artificially control the level of cell surface expression of specific histocompatibility antigens, which may be caused by a number of clinical situations that are affected by tapasin dependence, such as transplant rejection in organ transplantation, spondyloarthritis. It can be effectively used for the treatment of autoimmune diseases, such as chronic viral infections attacking tapasin.

<110> KOREA CHUNGANG EDUCATIONAL FOUNDATION <120> Method for regulating tapasin-dependency of MHC class I molecules <130> Gn12371 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (1)..(1089) <223> cDNA of human MHC class I B2705 <400> 1 atgcgggtca cggcgccccg aaccctcctc ctgctgctct ggggggcagt ggccctgacc 60 gagacctggg ctggctccca ctccatgagg tatttccaca cctccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat caccgtgggc tacgtggacg acacgctgtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagagaggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggga gacacagatc tgcaaggcca aggcacagac tgaccgagag 300 gacctgcgga ccctgctccg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360 aatatgtatg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggta ccaccaggac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgccgcg 480 gacacggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540 agagcctacc tggagggcga gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 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ctcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagagaggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggaa cacacagatc ttcaagacca acacacagac tgaccgagag 300 agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360 agcatgtacg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggca taaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcggcg 480 gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcaggac 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gacacgctgg agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B0801 <400> 6 Met Leu Val Met Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Asp Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser 35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln 85 90 95 Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly 115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asn Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 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tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 14 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A0210 <400> 14 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln 85 90 95 Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Phe Gly Cys Asp Val Gly 115 120 125 Ser Asp Gly Arg Phe Leu 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Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser 340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val 355 360 365 <210> 15 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (1)..(1098) <223> cDNA of human MHC class I A3001 <400> 15 atggccgtca tggcgccccg aaccctcctc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 agtggagagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagagg 240 cctgagtatt gggaccagga gacacggaat gtgaaggccc agtcacagac tgaccgagtg 300 gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccatccag 360 ataatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta tgaacagcac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgttgggc ggagcagttg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840 tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagctg 900 tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgccgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020 ggagggagtt acactcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 16 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A3001 <400> 16 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Ser Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met 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Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu 275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Leu Ser Ser Gln Pro 290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala 305 310 315 320 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser 340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val 355 360 365 <210> 17 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (1)..(1098) <223> cDNA of human MHC class I A2401 <400> 17 atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg caggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggacgagga gacagggaaa gtgaaggccc actcacagac tgaccgagag 300 aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccctccag 360 atgatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagcag 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggac gggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ctctgagatg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc ttgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtac cttctggaga ggagcagaga 840 tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900 tcttcccagc ccaccgtccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaacagctc agatagaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 18 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A2401 <400> 18 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln 85 90 95 Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly 115 120 125 Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val 165 170 175 Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu 180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro 195 200 205 Pro Lys Thr His Met Thr His 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cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300 aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360 tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420 gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480 gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600 gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660 tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840 tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900 tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960 gtagtcactg 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(1089) <223> cDNA of human MHC class I B2705 <400> 1 atgcgggtca cggcgccccg aaccctcctc ctgctgctct ggggggcagt ggccctgacc 60 gagacctggg ctggctccca ctccatgagg tatttccaca cctccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat caccgtgggc tacgtggacg acacgctgtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagagaggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggga gacacagatc tgcaaggcca aggcacagac tgaccgagag 300 gacctgcgga ccctgctccg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360 aatatgtatg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggta ccaccaggac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgccgcg 480 gacacggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540 agagcctacc tggagggcga gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B2705 <400> 2 Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala   1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Glu Asp Leu Arg Thr Leu Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Asn Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 3 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1089) <223> cDNA of human MHC class I B4402 <400> 3 atgcgggtca cggcgccccg aaccctcctc ctgctgctct ggggggcagt ggccctgacc 60 gagacctggg ccggctccca ctccatgagg tatttctaca ccgccatgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat caccgtgggc tacgtggacg acacgctgtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccacgagtcc gaggaaggag ccgcgggcgc catggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggga gacacagatc tccaagacca acacacagac ttaccgagag 300 aacctgcgca ccgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca catcatccag 360 aggatgtacg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggta tgaccaggac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgcggcg 480 gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcaggac 540 agagcctacc tggagggcct gtgcgtggag tcgctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcgcgga ccccccaaag acacatgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggtca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacaccgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 4 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B4402 <400> 4 Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala   1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Thr Ser Pro Arg Lys Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Ser Lys Thr Asn Thr Gln                  85 90 95 Thr Tyr Arg Glu Asn Leu Arg Thr Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Asp Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Val Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 5 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1089) <223> cDNA of human MHC class I B0801 <400> 5 atgctggtca tggcgccccg aaccgtcctc ctgctgctct cggcggccct ggccctgacc 60 gagacctggg ccggctccca ctccatgagg tatttcgaca ccgccatgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat ctcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagagaggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggaa cacacagatc ttcaagacca acacacagac tgaccgagag 300 agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360 agcatgtacg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggca taaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcggcg 480 gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcaggac 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gacacgctgg agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B0801 <400> 6 Met Leu Val Met Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala   1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Asp Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asn Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Asp Thr Leu Glu Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 7 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1089) <223> cDNA of human MHC class I B2702 <400> 7 atgcgggtca cggcgccccg aaccctcctc ctgctgctct ggggggcagt ggccctgacc 60 gagacctggg ctggctccca ctccatgagg tatttccaca cctccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat caccgtgggc tacgtggacg acacgctgtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagagaggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggga gacacagatc tgcaaggcca aggcacagac tgaccgagag 300 aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca caccctccag 360 aatatgtatg gctgcgacgt ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggta ccaccaggac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgccgcg 480 gacacggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540 agagcctacc tggagggcga gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagt ccaccgtccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctgctgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtgcagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 8 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B2702 <400> 8 Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala   1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Asn Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 9 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1089) <223> cDNA of human MHC class I B3501 <400> 9 atgcgggtca cggcgccccg aaccgtcctc ctgctgctct ggggggcagt ggccctgacc 60 gagacctggg ccggctccca ctccatgagg tatttctaca ccgccatgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacccagtt cgtgaggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gaggacggag ccccgggcgc catggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggaa cacacagatc ttcaagacca acacacagac ttaccgagag 300 agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca catcatccag 360 aggatgtatg gctgcgacct ggggcccgac gggcgcctcc tccgcgggca tgaccagtcc 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgcggcg 480 gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540 agagcctacc tggagggcct gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc cgtctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900 tcttcccagt ccaccatccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctactgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtccagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 10 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B3501 <400> 10 Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala   1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Pro Arg Thr Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln                  85 90 95 Thr Tyr Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Leu Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 11 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1089) <223> cDNA of human MHC class I B5401 <400> 11 atgcgggtca cggcaccccg aaccctcctc ctgctgctct ggggggccct ggccctgacc 60 gagacctggg ccggctccca ctccatgagg tatttctaca ccgccatgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagtcc gagaggggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaccggaa cacacagatc tacaaggccc aggcacagac tgaccgagag 300 agcctgcgga acctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccgggtctca cacttggcag 360 acgatgtatg gctgcgacct ggggccggac gggcgcctcc tccgcgggca taaccagtta 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgagctcctg gaccgcggcg 480 gacaccgcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtgtggc ggagcagctg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcgcgga ccccccaaag acacacgtga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag gacactgagc ttgtggagac cagaccagca 780 ggagatagaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga 840 tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg ccgaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900 tcttcccagt ccaccatccc catcgtgggc attgttgctg gcctggctgt cctagcagtt 960 gtggtcatcg gagctgtggt cgctactgtg atgtgtagga ggaagagctc aggtggaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcgtccagc gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttga 1089 <210> 12 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (362) <223> Amino acid sequence of human MHC class I B5401 <400> 12 Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala   1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Pro Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Trp Gln Thr Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly         115 120 125 Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asn Gln Leu Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser     290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val 305 310 315 320 Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala         355 360 <210> 13 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1098) <223> cDNA of human MHC class I A0210 <400> 13 atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60 cagacctggg cgggctctca ctccatgagg tatttctaca cctccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt 240 ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 300 gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccgtccag 360 aggatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagttg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcatatga ctcaccacgc tgtctctgac 660 catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 840 tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900 tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 14 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A0210 <400> 14 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala   1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln                  85 90 95 Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Phe Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala         195 200 205 Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro     290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala 305 310 315 320 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val         355 360 365 <210> 15 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1098) <223> cDNA of human MHC class I A3001 <400> 15 atggccgtca tggcgccccg aaccctcctc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 agtggagagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagagg 240 cctgagtatt gggaccagga gacacggaat gtgaaggccc agtcacagac tgaccgagtg 300 gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccatccag 360 ataatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta tgaacagcac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgttgggc ggagcagttg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840 tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagctg 900 tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgccgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020 ggagggagtt acactcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 16 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A3001 <400> 16 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ala   1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Ser Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Arg  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu Gln His Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Trp                 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Leu Ser Ser Gln Pro     290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala 305 310 315 320 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser                 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val         355 360 365 <210> 17 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele (222) (1) .. (1098) <223> cDNA of human MHC class I A2401 <400> 17 atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg caggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggacgagga gacagggaaa gtgaaggccc actcacagac tgaccgagag 300 aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccctccag 360 atgatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagcag 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggac gggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660 catgaggcca ctctgagatg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc ttgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtac cttctggaga ggagcagaga 840 tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900 tcttcccagc ccaccgtccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960 gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaacagctc agatagaaaa 1020 ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080 acagcttgta aagtgtga 1098 <210> 18 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (365) <223> Amino acid sequence of human MHC class I A2401 <400> 18 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala   1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala      50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly         115 120 125 Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu             180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro     290 295 300 Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala 305 310 315 320 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Asn Ser                 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser             340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val         355 360 365 <210> 19 <211> 1017 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (1) .. (1017) <223> cDNA of human MHC class I G0101 <400> 19 atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60 gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300 aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360 tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420 gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480 gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600 gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660 tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720 tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840 tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900 tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960 gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagaa agaagagctc agattga 1017 <210> 20 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN (222) (1) .. (338) <223> Amino acid sequence of human MHC class I G0101 <400> 20 Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala   1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe              20 25 30 Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala          35 40 45 Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser      50 55 60 Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly  65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln                  85 90 95 Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser             100 105 110 Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly         115 120 125 Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly     130 135 140 Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val                 165 170 175 Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu             180 185 190 His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro         195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr     210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu                 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val             260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu         275 280 285 Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro     290 295 300 Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala 305 310 315 320 Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser                 325 330 335 Ser Asp

Claims (6)

야생형 MHC 클래스 I 중쇄 분자의 아미노산 잔기 114가 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine) 또는 라이신(Lysine)에서 선택된 염기성(basic) 잔기에서 아스파트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic Acid)에서 선택된 산성(acidic) 잔기로 인위적으로 치환된 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-의존성 돌연변이 MHC 클래스 I 분자. Amino acid residue 114 of the wild-type MHC class I heavy chain molecule is selected from aspartic or glutamic acid at a basic residue selected from histidine, arginine or lysine. acidic) Tapasin-dependent mutant MHC class I molecule, which is artificially substituted with residues. 야생형 MHC 클래스 I 중쇄 분자의 아미노산 잔기 114가 아스파트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic Acid)에서 선택된 산성(acidic) 잔기에서 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine) 또는 라이신(Lysine)에서 선택된 염기성(basic) 잔기로 인위적으로 치환된 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-비의존성 돌연변이 MHC 클래스 I 분자.Amino acid residue 114 of the wild-type MHC class I heavy chain molecule is selected from histidine, arginine or lysine at an acidic residue selected from aspartic acid or glutamic acid. basic) Tapasin-independent mutant MHC class I molecule, which is artificially substituted with residues. 삭제delete 제 1항 또는 제 2항의 돌연변이 MHC 클래스 I 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.A recombinant expression vector comprising a gene encoding a mutant MHC class I molecule of claim 1. 야생형 MHC 클래스 I 중쇄 분자의 아미노산 잔기 114를 아스파트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic Acid)에서 선택된 산성(acidic) 잔기에서 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine) 또는 라이신(Lysine)에서 선택된 염기성(basic) 잔기로 치환시키는 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-의존성 MHC 클래스 I 분자를 타파신-비의존성 MHC 클래스 I 분자로 변환시키는 방법.Amino acid residue 114 of the wild-type MHC class I heavy chain molecule was selected from histidine, arginine or lysine at an acidic residue selected from aspartic acid or glutamic acid. basic) A method for converting a tapasin-dependent MHC class I molecule to a tapasin-independent MHC class I molecule, characterized in that it is substituted with a residue. 야생형 MHC 클래스 I 중쇄 분자의 아미노산 잔기 114를 히스티딘(Histidine), 아르기닌(Arginine) 또는 라이신(Lysine)에서 선택된 염기성(basic) 잔기에서 아스파트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic Acid)에서 선택된 산성(acidic) 잔기로 치환시키는 것을 특징으로 하는 타파신(tapasin)-비의존성 MHC 클래스 I 분자를 타파신-의존성 MHC 클래스 I 분자로 변환시키는 방법.Amino acid residue 114 of the wild-type MHC class I heavy chain molecule was selected from an acid selected from aspartic or glutamic acid at a basic residue selected from histidine, arginine or lysine. acidic) A method for converting a tapasin-independent MHC class I molecule into a tapasin-dependent MHC class I molecule, characterized by substitution with a residue.

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