KR100541536B1 - The pharmacetical composition for reformation of teleost tissue or acrotism tissue, including ndga and indomethacin - Google Patents

Abstract

본 발명은 노르디히드로구아이아레트산과 인도메타신을 주성분으로 함유하는 형질변환 성장인자-베타(TGF-β)의 활성조절제, 및 같은 성분을 함유하는 경골조직 및 결체조직의 생성조절제에 관한 것이다.The present invention relates to an activity regulator of transforming growth factor-beta (TGF- β ) containing nordihydroguaiaretic acid and indomethacin as a main component, and an agent for production of tibial and connective tissues containing the same component. .

본 발명에 따르면, 경골 및 결체조직의 재생과정을 조절하기 위해 사용하였던 종래의 방법에 비하여 훨씬 낮은 비용으로 부작용 없이 상기 재생과정을 효과적으로 조절할 수 있다.According to the present invention, the regeneration process can be effectively controlled without side effects at a much lower cost than the conventional method used to control the regeneration process of the tibia and the connective tissue.

Description

노르디히드로구아이아레트산과 인도메타신을 함유하는 경골 또는 결체조직 재생용 약학적 조성물{The pharmacetical composition for reformation of teleost tissue or acrotism tissue, including NDGA and indomethacin}The pharmacetical composition for reformation of teleost tissue or acrotism tissue, including NDGA and indomethacin, including nodihydroguaiaretic acid and indomethacin

본 발명은 노르디히드로구아이아레트산(NDGA)을 함유하는 경골 또는 졀체조직 재생용 약학적 조성물 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the regeneration of tibial or body tissues containing nordihydroguaiaretic acid (NDGA).

경골(bone) 조직은 그 조직이 단단하여 흔히 변치않는 불변의 기관으로 오해하기 쉬우나, 우리가 생활하는 동안 끊임없이 파괴되고 새로 생성되는 재조합과정을 거친다. 또한 경골조직과 관련된 질병이나 사고 등에 의해 경골조직이 손상되면 다시 원래의 형태와 기능을 회복하여야 정상적인 생활을 할 수 있다. 이와 같이 경골조직이 재생 혹은 생성되는 과정에서 여러 가지 생체합성 물질들이 관여하지만, 그중에서도 형질변환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)에 속하는 일군의 단백질성 인자들이 작용하는 것이 잘 알려지고 있다. 실제로 이들 TGF-β 계열의 인자들 중 일부는 경골의 재생과정에서 발현되는 것이 보고되어 있고, 경골의 성장이나 형태 형성과정에서도 활발하게 작용한다는 사실이 알려져 있으며, 그 다양한 활용 범위에 대하여 많은 연구가 활발히 수행되고 있다.Tibial tissue is hard and often misunderstood as an immutable and invariant organ, but it undergoes recombination processes that are constantly destroyed and newly produced throughout our lives. In addition, when the tibial tissue is damaged by diseases or accidents related to the tibial tissue, the normal form and function may be restored to restore normal life. Well to have β proteinaceous factor that belongs to a group (transforming growth factor- β, TGF- β) action - this way the tibia tissue is playing or generating a number of bio-synthetic materials that are involved in the process, but, inter alia plasma transforming growth factor It is known. In fact, some of these TGF- β family factors have been reported to be expressed during tibial regeneration, and it is known that they are active during tibial growth and morphogenesis. It is actively performed.

경골조직의 생성과 분해는 각각 조골세포와 파골세포에 의해 수행되는 것으로 알려져 있다. 이들 두 종류의 세포의 활동이 균형있게 진행되어야만 정상적인 경골 조직의 상태가 유지되는 것이다. 만일 어떤 이유로 인해 이 균형이 깨어지게 되면, 골다공증, 파게트 병(Paget's disease), 칼슘 과다혈증, 뼈의 기형 등이 야기되는 것이다. 최근, 자동차 문화의 발달에 따라 각종 골절사고가 다발하고 있으며 뒤이어 경골조직이 재생되어야 하는데 이 과정 또한 경골조직내 두 종류의 세포가 손상된 부위를 제거하고 이 부위에 다시 경골조직을 생성하는 정교한 과정이 이루어져야 한다. The generation and degradation of tibial tissue is known to be performed by osteoblasts and osteoclasts, respectively. The activity of these two types of cells must be balanced to maintain normal tibial tissue. If for some reason this balance is broken, it causes osteoporosis, Paget's disease, calcium hyperemia, bone malformations, and so on. Recently, various fracture accidents occur according to the development of automobile culture, and the tibial tissue must be regenerated. This process also removes the damaged parts of the two types of cells in the tibial tissue, and then generates the tibial tissue again. Should be done.

종래 상기 질병의 치료를 위해 호르몬 제제를 사용하는 경우가 빈번하였으나, 그 부작용이 많이 나타나며, 이러한 호르몬 제제는 예방의 효과는 있으나 일단 손상된 부위에 대한 치료 효과는 미약한 것으로 나타나고 있다.Conventional use of hormonal agents for the treatment of the disease is frequently used, but many side effects occur. These hormonal agents have been shown to have a prophylactic effect, but the therapeutic effect on the damaged area is weak.

따라서 경골조직의 재생과 관련하여, 형질변환 성장인자-베타(TGF-β) 및 TGF-β류에 속하는 BMP(bone morphogenic protein)에 주의가 집중되고 있다.Therefore, in relation to the regeneration of the tibial tissue, attention is focused on the transforming growth factor-beta (TGF- β ) and the BMP (bone morphogenic protein) belonging to the TGF- β family.

본 발명자들은 이러한 TGF-β 계열의 조절인자들을 연구하던 중, 이들 인자들은 모두 경골조직 내에 이미 다량 함유되어 있고 체내에서 필요에 따라 수시로 만들어진다는 사실을 발견하였다. 따라서 종전에는 경골 조직이나 결체조직의 생성을 조절하기 위해 TGF-β를 직접 외부로부터 투여하는 방법을 사용하였지만, 체내에는 이미 다량의 TGF-β가 분비되므로, TGF-β를 굳이 외부로부터 투여하지 않더라도 필요한 만큼의 TGF-β는 작용하고 있는 셈이다. 따라서 이러한 TGF-β의 활성을 조절하는 능력을 갖는 물질을 투여하는 것이 경골 및 결체조직의 생성을 보다 효과적으로, 즉 생체에 대한 부작용이 적고 낮은 가격으로, 조절하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명자들은 TGF-β와 그 유사 단백질들이 리폭시게나아제의 활성을 조절하여 작용한다는 사실을 밝히고, 이 점을 이용하여, 노르디히드로구아이아레트산(NDGA)과 인도메타신이 TGF-β의 활성을 조절하는 능력을 갖는다는 것을 최초로 입증하였으며, 이러한 세포실험 결과에 기초하여 본 발명을 완성하였다.While studying these TGF- β family of regulators, the inventors found that all of these factors are already contained in tibial tissue in large quantities and are frequently made in the body as needed. Thus Previously, but using the method of direct administration of the TGF- β from the outside to control the generation of the tibia tissue or connective tissue, the system has therefore already secrete large amounts of TGF- β, even without administration of the TGF-β from the outside venture As much TGF- β as needed is working. Therefore, it is thought that administration of a substance having the ability to modulate the activity of TGF- β can be used to more effectively regulate the production of tibia and connective tissue, that is, with less side effects on the living body and at a lower price. The inventors of the TGF- β and the like proteins ripok saying that control the activity of cyclooxygenase by acting, by using this, Nord-dihydro-old child ah inlet acid (NDGA) and indomethacin TGF- β It was demonstrated for the first time that it has the ability to modulate activity, and the present invention was completed based on the results of these cell experiments.

노르디히드로구아이아레트산(NDGA)[1,4-비스(3,4-디히드록시페닐)-2,3-디메틸부탄]은 하기 식으로 나타내지는 바와 같이 분자량이 302.4이며, 두 개의 디히드록시벤젠 고리를 가진 비교적 간단한 화합물로서, Larrea divaricata (crestote bush), Myristica fragrans, Kadsura longgipedunculata 등에서 추출되거나 화학적으로도 합성가능한 물질이다.Nordihydroguaiaretic acid (NDGA) [1,4-bis (3,4-dihydroxyphenyl) -2,3-dimethylbutane] has a molecular weight of 302.4 and is represented by As a relatively simple compound with dihydroxybenzene ring, it is extracted or chemically synthesized from Larrea divaricata (crestote bush), Myristica fragrans, Kadsura longgipedunculata and the like.

(NDGA)(NDGA)

또한, 이 NDGA와 함께 사용할 인도메타신은 1963년에 최초 발명되어 류마티스성 관절염 치료제로 널리 사용되고 있다.Indomethacin for use with this NDGA was first invented in 1963 and is widely used as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.

이 약품은 기본적으로 사이클로옥시게나아제의 저해제로 작용하며, 본 발명에서는 NDGA의 효과를 조절하는 보조제로 사용된다.This drug acts essentially as an inhibitor of cyclooxygenase and is used as an adjuvant to modulate the effects of NDGA in the present invention.

본 발명에서는 NDGA의 조골과정에서의 효과를 알아보기 위하여, 조골과정중에 필연적으로 다량 발현되는 알칼린포스파타아제(ALP) 효소활성을 측정하여 경골 형성의 지표로 한다. In the present invention, in order to determine the effect of NDGA in the osteogenic process, the alkaline phosphatase (ALP) enzyme activity, which is inevitably expressed in large amounts during the osteogenic process, is measured as an index of tibia formation.

우선 간단한 실험을 통하여 TGF-β가 조골세포의 작용을 돕는다는 사실을 알 수 있다(도 1). 또한, 본 발명자들은 아라키돈산 대사물(즉, 에이코사노이드 화합물)이 이 과정에서 작용한다는 사실을 발견하였다.First, through a simple experiment it can be seen that TGF- β helps the work of osteoblasts (Fig. 1). In addition, the inventors have found that arachidonic acid metabolites (ie, eicosanoid compounds) act in this process.

하기되는 아리키돈산 대사 경로에 따르면 아라키돈산의 대사에는 크게 2종류의 효소가 관여한다.According to the following arachidonic acid metabolic pathway, two kinds of enzymes are largely involved in the metabolism of arachidonic acid.

본 발명자들은 NDGA가 아라키돈산의 대사경로 중 리폭시게나아제에 의한 대사과정을 억제함으로써 효과적으로 TGF-β의 조골세포에 대한 효과를 억제한다는 사실을 실험에 의해 입증하였다(도 2). 또한 본 발명자들은 또 하나의 대사경로인 사이클로옥시게나아제에 의한 대사과정을 억제하는 인도메타신에 의해서는 TGF-β의 효과가 촉진된다는 사실을 알아내었다(도 2). 참고로 본 발명자들은 여러 가지 저해제를 조사해 보았으나, NDGA와 인도메타신이 가장 우수한 효과를 나타내고 세포에 대한 독성도 매우 적은 것으로 나타났다.The inventors demonstrated by experiment that NDGA effectively inhibits the effect of TGF- β on osteoblasts by inhibiting the metabolic process of lipoxygenase in the metabolic pathway of arachidonic acid (FIG. 2). In addition, the inventors have found that the effect of TGF- β is promoted by indomethacin, which inhibits metabolic processes by cyclooxygenase, another metabolic pathway (FIG. 2). For reference, the present inventors investigated various inhibitors, but NDGA and indomethacin showed the best effect and showed very low toxicity to cells.

따라서, 종전에는 고가의 유전공학적 제품인 TGF-β나 BMP(bone-morphogenic protein)의 투여에 의해서만 조골과정을 제어하고자 하였으나, 본 발명에 의한 NDGA 및 인도메타신 함유 조성물을 사용함으로써 생체내에서 자연적으로 합성분비되는 TGF-β나 BMP의 효과를 조절함으로써 조골과정을 제어하는 것이 실현되는 것이다.Therefore, in the past, the osteogenic process was only controlled by the administration of expensive genetic engineering products, such as TGF- β or BMP (bone-morphogenic protein), but in vivo by using the composition containing NDGA and indomethacin according to the present invention. By controlling the effects of synthetic secreted TGF- β or BMP, controlling the osteoblast process is realized.

경골조직의 또다른 촉진제인 스테로이드 제제에 대한 실험에서도 유사한 결과가 나타났으며(도 4), 따라서 경골의 생성이나 재생에 NDGA와 인도메타신 복합제가 보편적인 조성물로 사용될 수 있는 것이다.Similar results were shown in the experiments on steroid preparations, another promoter of tibial tissue (FIG. 4), so that the combination of NDGA and indomethacin can be used as a universal composition for the production or regeneration of tibia.

이와 같은 효과는 경골 조직에만 그치지 않고 다른 종류의 세포나 조직에 대해서도 나타나며, 섬유아세포나 표피세포에서도 TGF-β와 아라키돈산 대사물 간에 깊은 관계가 있다. 일반적으로 피부에 상처가 나거나 혈관봉합 수술등에 의해 체내에 상처나 염증이 났을 때에도 혈소판 유래 성장 인자와 TGF-β가 합성분비되어 상처의 치료와 감염방지, 기능회복에 절대적으로 중요한 역할을 담당한다. 이들 성장 인자들은 조직을 형성하는 세포들의 증식을 촉진하여 상처를 치유하는 효과를 갖는다. 즉, TGF-β도 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 효과가 있는데 이는 조직의 손상을 치유하는 과정에서 매우 중요한 부분이다. 이 효과는 배양된 섬유아세포(NH3T3)에 대해서도 재현되었으며(도 5), 이 효과도 경골조직에서와 마찬가지로 NDGA에 의해 효과적으로 제어됨이 실험에 의해 확인되었다(도 6). 섬유아세포는 인대 등 결체조직을 형성하는 대표적인 세포이다. 따라서 이 세포에 대한 분열조절 효과는 결체조직의 손상치유와 직접적으로 연관되어 있다. 특히, 이와 같은 결체조직의 생성과정에서 생체합성된 TGF-β가 필요 이상으로 작용하여 상처에 흉터를 남기기도 하고 봉합된 혈관을 막히게도 하는 등 부작용을 일으킬 수 있으므로, TGF-β의 활성을 제어할 수 있는 본 발명의 조성물은 이러한 점에서도 대단히 유용하다.This effect extends to other types of cells and tissues, not just to tibial tissues, and there is a deep relationship between TGF- β and arachidonic acid metabolites in fibroblasts and epidermal cells. In general, platelet-derived growth factor and TGF- β are secreted even when the skin is injured or injured due to a wound or angioplasty, thus playing an important role in wound healing, infection prevention, and function recovery. These growth factors have the effect of healing wounds by promoting the proliferation of cells forming tissues. In other words, TGF- β has an effect of promoting the proliferation of fibroblasts, which is a very important part in the process of healing tissue damage. This effect was also reproduced in cultured fibroblasts (NH3T3) (FIG. 5), and it was confirmed by experiment that this effect was effectively controlled by NDGA as in tibia tissue (FIG. 6). Fibroblasts are representative cells that form connective tissues such as ligaments. Thus, the dividing regulatory effect on these cells is directly related to the healing of connective tissue. In particular, in the process of generating connective tissue, biosynthetic TGF- β acts more than necessary, causing scarring and clogging the closed blood vessels, thereby controlling TGF- β activity. The composition of the present invention that can be used is also very useful in this respect.

본 발명에 의한 NDGA와 인도메타신을 주성분으로 함유하는 경골조직 또는 결체조직의 재생용 약학적 조성물은 통상의 부형제 또는 첨가제와 함께 정제, 캡슐제, 시럽제 같은 경구투여용 제제, 주사제, 좌제, 외용연고 또는 크림 제제, 첩부제 등으로 제제될 수 있으며, 투여량은 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라 조절되어야 하나, 통상 70kg 체중의 성인 남자를 기준으로 10mg 내지 700mg 활성성분의 양이 바람직하게 사용된다. 인도메타신은 필요에 따라 전처리 또는 후처리하여 사용되며, NDGA와 인도메타신의 비율은 바람직하게는 1:10 내지 10:1의 몰비로 사용된다.The pharmaceutical composition for regeneration of tibial or connective tissue containing NDGA and indomethacin according to the present invention may be used for oral administration such as tablets, capsules, and syrups with conventional excipients or additives, injections, suppositories, and external ointments. Or it may be formulated as a cream preparation, a patch, etc., the dosage should be adjusted according to the symptoms, weight, age, sex, etc. of the patient, but the amount of 10mg to 700mg active ingredient based on a 70kg adult male preferably Used. Indomethacin is used after pretreatment or aftertreatment as necessary, and the ratio of NDGA and indomethacin is preferably used in a molar ratio of 1:10 to 10: 1.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하나 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to preferred embodiments, but the present invention is not limited thereto.

(실시예)(Example)

재료material

아라키돈산 흡수를 저해하는 5,8,11,14-에이코사테트라인산(ETYA), 아라키돈산 특이성 및 비특이성 아실-CoA 합성효소 및 모든 시클로옥시게나아제는 시그마로부터 구입하였다. 노르디히드로구아이아레트산(NDGA), 시클로옥시게나아제에 대한 5-리폭시게나아제의 선택적 저해제 및 인도메타신, 특이적 시클로옥시게나아제 저해제도 시그마로부터 구입하였다. 5-LO 활성화 단백질 또는 FLAP의 특이적 저해제인 MK886 은 영(Dr. R.Young, Merck Frosst) 박사가 제공하였고, 효소의 활성 부위에 결합하는 5-LO의 특이적 저해제 및 LTD4 수용체 길항제인 ZM198,614는 포스터(Steven Foster, Zeneca Pharm Inc.) 박사가 제공하였다. 또한 LTD4 수용체 길항제 및 부분적 5-LO 저해제인 RG12525는 마이클 장 박사(Dr. Michael Chang, Rhone-Poulenc-Rorer, Inc.)가 제공하였다. 류코트리엔 LTB4 및 펩티도-류코트리엔 LTC4, LTD4 및 LTE4는 바이오몰(BioMol)의 제품을 사용하였다. 5,8,11,14-Eicosatetraic acid (ETYA), arachidonic acid specific and nonspecific acyl-CoA synthase and all cyclooxygenases that inhibited arachidonic acid uptake were purchased from Sigma. Nodihydroguaiaretic acid (NDGA), selective inhibitors of 5-lipoxygenase against cyclooxygenase and indomethacin, specific cyclooxygenase inhibitors were also purchased from Sigma. MK886, a specific inhibitor of 5-LO activating protein or FLAP, was provided by Dr. R. Young, Merck Frosst, and ZM198, a specific inhibitor of 5-LO and LTD4 receptor antagonist that binds to the active site of the enzyme. 614 was provided by Dr. Foster (Zeneca Pharm Inc.). RG12525, an LTD4 receptor antagonist and a partially 5-LO inhibitor, was provided by Dr. Michael Chang, Rhone-Poulenc-Rorer, Inc. Leukotriene LTB4 and Peptido-Lucotriene LTC4, LTD4 and LTE4 used the product of BioMol.

jun-B, c-fos 및 c-jun을 위한 항체는 샌타. 크루즈 바이오텍(Santa Cruz Biotech., California)의 제품을 사용하였다. 소 태아 혈청 및 모든 세포 배양 시약은 집코(GIBCO BRL Life Technol., Inc.)의 제품을 사용하였고, CHO 세포발현 재조합 인체 TGF-β1은 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) 제품을 사용하였다. 모든 다른 화학약품들은 시그마(Sigma)의 것을 사용하였다.Antibodies for jun-B, c-fos and c-jun are Santa. The product of Santa Cruz Biotech., California was used. Fetal bovine serum and all cell culture reagents were manufactured by Gibco BRL Life Technol., Inc., and CHO cell expression recombinant human TGF- β 1 was used by Boehringer Mannheim. All other chemicals used Sigma's.

실험에 사용된 세포는 오스테오사르코마(osteosarcoma) 세포주인 ROS17/2.8 세포(American Type Culture Collection 제품) 및 MC3T3-E1(Ohu University의 히로아키 박사 제공)를 사용하였다. The cells used in the experiment were ROS17 / 2.8 cells (product of American Type Culture Collection) and MC3T3-E1 (provided by Dr. Hiroaki of Ohu University), which are osteosarcoma cell lines.

세포 배양 및 처리Cell culture and treatment

세포는 다음과 같이 배양 및 보존되었다. 세포를 10% FBS DMEM 중 37℃에서 5% 이산화탄소 존재 하에 96-웰 플레이트에서 10⁵세포/ml로 24 시간 동안 배양하였다. 아라키돈산 저해제를 함유하거나 함유하지 않은 TGF-β1을 첨가하기 위해 배지를 2% FBS DMEM으로 교체하였다. 모든 저해제는 TGF-β 처리 30분 전에 첨가되었다. 저해제는 에탄올이나 디메틸술폭시드에 용해되어, 최종 용매 농도가 0.1%(v/v)를 넘지 않도록 사용되었다.Cells were cultured and preserved as follows. Cells were incubated for 24 hours at 10 ⁵ cells / ml in 96-well plates in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C. in 10% FBS DMEM. The medium was replaced with 2% FBS DMEM to add TGF- β 1 with or without arachidonic acid inhibitor. All inhibitors were added 30 minutes before TGF- β treatment. The inhibitor was dissolved in ethanol or dimethyl sulfoxide and used so that the final solvent concentration did not exceed 0.1% (v / v).

알칼린 포스파타아제 활성 분석Alkaline Phosphatase Activity Assay

알칼린 포스파타아제 활성 분석은 공지(Majeska, 1985)의 방법으로 수행되었다. 인자들과 함께 48시간 동안 항온 보관한 후, 배양물을 PBS로 3회 세척하고 0.05% 트리톤 X-100으로 동결-해동을 반복하여 용해화하였다. 단백질 함량은 마이크로플레이트 사용을 위해 약간의 수정을 가한 로리 등의 방법에 따라 측정하였다. ALK 반응은 10mM p-니트로페놀, 150mM 아미노-메틸프로판올(pH 10.0)로 완충된 5mM 염화 마그네슘의 존재하에 5분 또는 그 이상 수행되었다. 항온처리 후, 1N NaOH를 가하여 반응을 종료시켰다. 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.Alkaline phosphatase activity assays were performed by the method of known (Majeska, 1985). After 48 hours incubation with the factors, the cultures were washed three times with PBS and lysed repeatedly by freeze-thaw with 0.05% Triton X-100. Protein content was determined according to the method of Lori et al. With minor modifications for the use of microplates. The ALK reaction was performed for 5 minutes or longer in the presence of 5 mM magnesium chloride buffered with 10 mM p-nitrophenol, 150 mM amino-methylpropanol (pH 10.0). After incubation, 1N NaOH was added to terminate the reaction. Absorbance was measured at 405 nm wavelength.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)Western Blotting

Jun-B, c-Fos 검출을 위한 인자 처리 3시간 후 배양물을 수확하였다. 배양물을 PBS로 3회 세척하고 0.5% 트리톤 X-100 졸에 용해화하였다. 세포 용해물을 4℃에서 게이지 28의 주사 바늘을 20번 통과시킴으로써 균질화하였다. 단백질 양은 로리(Lowry, 1951)에 의한 방식으로 평가되었다. SDS 및 2-메르캅토에탄올 존재하에 10% 아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하였다. 단백질을 세미드라이트랜스퍼 장치(TE70) 중 니트로셀룰로오스 종이로 50분 동안 이송시켰다. 1차적 항체를 블로트된 니트로셀룰로오스 종이와 밤새 반응시켰고, 이어지는 2차적 항체 결합은 실온에서 3시간 동안 수행하였다. 제2항체와 곤쥬게이트된 알칼린 포스파타아제의 화학적 발광 검출은 디소듐 3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.1^3,7]데칸}-4-일)페닐 포스페이트(CSPD)를 기질로 사용하여 수행되었다.The cultures were harvested 3 hours after treatment with Jun-B, factor for c-Fos detection. Cultures were washed three times with PBS and solubilized in 0.5% Triton X-100 sol. Cell lysates were homogenized by passing 20 times through a needle of gauge 28 at 4 ° C. Protein amount was assessed in a manner by Lowry (1951). Electrophoresis was performed on 10% acrylamide gels in the presence of SDS and 2-mercaptoethanol. The protein was transferred to nitrocellulose paper for 50 minutes in the Semimidite lancer apparatus (TE70). The primary antibody was reacted overnight with the blotted nitrocellulose paper, followed by secondary antibody binding for 3 hours at room temperature. The chemiluminescence detection of alkaline phosphatase conjugated with the second antibody was determined by disodium 3- (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2 '-(5'-chloro) tricyclo [3.3 .1.1 ^3,7 ] decane} -4-yl) phenyl phosphate (CSPD) was used as a substrate.

리폭시게나아제 활성 측정Measurement of lipoxygenase activity

리폭시게나아제의 활성은 아라키돈산이 리폭시게나아제에 의해 히드로퍼옥시 에이코사테트라엔 산으로 산화되면서 234nm에서 선택적으로 흡광도가 높아진다는 사실을 이용하여 측정하였다.The activity of lipoxygenase was determined using the fact that arachidonic acid was selectively absorbed at 234 nm as it was oxidized to hydroperoxy eicosaterate by lipoxygenase.

리폭시게나아제의 발현 양상Expression patterns of lipoxygenase

5-리폭시게나아제와 이의 활성화에 필요한 5-리폭시게나아제 활성화 단백질(FLAP)의 발현 양상은 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 조사하였다. Expression of 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase activating protein (FLAP) required for its activation was investigated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).

배양된 세포의 전체 RNA를 추출한 후 이를 이용하여 cDNA 라이브러리를 만들어, 이렇게 마련된 cDNA 라이브러리 안에 특정 유전자에 대한 cDNA가 얼마나 있는지 조사한다. 우선 하우스 킵핑 효소인 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)의 cDNA양을 PCR을 통해 측정하고, 이를 이용하여 모든 비교군에 동량의 cDNA가 이용되도록 하였다. 이후 5-리폭시게나아제, FLAP 등에 대해 PCR을 수행하여 그 양을 비교하였다.After extracting the total RNA of the cultured cells to create a cDNA library using this cDNA library to investigate how much cDNA for a particular gene in the prepared. First, the amount of cDNA of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a house keeping enzyme, was measured by PCR, and the same amount of cDNA was used in all comparison groups. Thereafter, PCR was performed on 5-lipoxygenase, FLAP, and the like to compare the amounts.

결과result

TGF-β가 ROS17/2.8 세포에서 알칼린 포스파타아제 활성을 자극한다는 것은 공지되어 있다. 24시간 만에 감지할 만한 증가가 관찰되었고 수일 동안 계속되었다. 아라키돈산이 이 과정에 관여하는지를 알아보기 위해 공지의 아라키돈산 길항제인 ETYA를 TGF-β 첨가 30분 전에 배양물에 가하였다. ETYA는 5 μ M의 낮은 농도에서도 상당한 TGF-β 저해효과를 나타내었고(도 1a), 상기 농도에서 비독성이었다.(표 1)It is known that TGF- β stimulates alkaline phosphatase activity in ROS17 / 2.8 cells. A detectable increase was observed in 24 hours and continued for several days. To determine whether arachidonic acid is involved in this process, ETYA, a known arachidonic acid antagonist, was added to the culture 30 minutes prior to TGF- β addition. ETYA showed a significant TGF- β inhibitory activity even at a low concentration of 5 μ M (Fig. 1a) was, non-toxic at the concentration (Table 1).

아라키돈산의 공지된 대사산물은 프로스타글란딘이고, TGF-β의 경골 재생에 대한 효과는 프로스타글란딘 생성에 의해 중개되는 것으로 알려져 있다. 따라서 강력하고 특이적인 시클로옥시게나아제 저해제인 인도메타신이 사용되었다. 도 1b에 나타난 바와 같이 인도메타신은 약간의 증식 억제를 나타내는 단백질 농도의 감소가 나타났음에도 불구하고, 10 μ M의 높은 농도에서도 효과가 나타나지 않았다.(표 1)A known metabolite of arachidonic acid is prostaglandin, and the effect of TGF- β on tibial regeneration is known to be mediated by prostaglandin production. Therefore, indomethacin, a potent and specific cyclooxygenase inhibitor, was used. As it is shown in Figure 1b indomethacin worn despite the decrease in protein concentration showing some growth inhibition natanateum, and did not show effect even at high concentrations of 10 μ M. (Table 1)

리폭시게나아제 저해제에 이어, NDGA를 시험한 결과, NDGA는 TGF-β의 알칼린 포스파타아제에 대한 효과를 5 μ M의 농도에서 현저히 저해하였다(도 1c). NDGA는 보다 높은 농도에서 약간의 비특이적 효과를 가질 수 있으므로, 더욱 특이적인 리폭시게나아제 저해제, 특히 5-LO는 저해하고, 8, 9, 12 또는 15-LO는 저해하지 않는 ZM230,487, 및 5-LO 활성화 단백질 또는 FLAP의 특이적 저해제인 MK886을 시험하였다. 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이 ZM230,487은 0.1 내지 0.2 μ M의 낮은 농도에서 알칼린 포스파타아제에 대한 TGF-β의 효과를 현저히 저해하였다. MK886도 현저히 저해하였으나, 1-2 μ M 농도에서였다. 반대로, LTD4 수용체 길항제 ZM198,614, 및 5-LO 활성을 부분적으로 차단할 수 있는 LTD4 수용체 길항제 RG12525는 1-2 μ M의 농도에서도 효과가 없었다.Following the lipoxygenase inhibitor, as a result of testing the NDGA, NDGA has the effect of alkaline phosphatase in the TGF- β was significantly inhibited at a concentration of 5 μ M (Fig. 1c). NDGA may have some nonspecific effects at higher concentrations, such that ZM230,487, and 5 inhibit more specific lipoxygenase inhibitors, particularly 5-LO, but do not inhibit 8, 9, 12, or 15-LO MK886, a specific inhibitor of -LO activating protein or FLAP, was tested. As it is shown in FIG. 2 and Table 1 ZM230,487 was significantly inhibited the effects of TGF- β for alkaline phosphatase seen in the low concentration of 0.1 to 0.2 μ M. MK886, but also significantly inhibited, was 1-2 μ M in concentration. Conversely, LTD4 receptor antagonists ZM198,614, and 5-LO RG12525 LTD4 antagonists that can block the activity in part is not effective at a concentration of 1-2 μ M.

TGF-β가 초기 반응 유전자 junB를 증가시킨다는 것은 공지되어 있다. TGF-β1의 ROS17/2.8 세포 내 junB 발현에 대한 효과를 조사하였다. 세포 분해물에서 TGF-β는 junB의 합성을 1시간 이내에 증가시킨다는 것이 밝혀졌다(도 3). TGF-β 처리에 앞서 NDGA(10 μ M)를 첨가한 경우 효과적으로 상기 유전자의 반응을 억제할 수 있었다(도 3).It is known that TGF- β increases the early response gene junB. The effect of TGF- β 1 on junB expression in ROS17 / 2.8 cells was investigated. TGF- β in cell lysates was found to increase the synthesis of junB within 1 hour (FIG. 3). The addition of NDGA (10 μ M) prior to TGF- β treatment was able to effectively inhibit the reaction of the gene (Fig. 3).

한편, 경골세포에 분화촉진효과가 있는 것으로 알려진 스테로이드 제제, 즉, 글루코코르티코이드를 처리하여 NDGA와 인도메타신의 효과를 조사하였다. 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 NDGA는 분명한 억제효과, 인도메타신은 다소의 촉진효과를 나타내었다.On the other hand, the effects of NDGA and indomethacin were examined by treating steroid agents, glucocorticoids, which are known to have differentiation promoting effects on tibial cells. As a result, as shown in Figure 4 NDGA showed a clear inhibitory effect, Indomethacin showed some promoting effect.

LTB4 및 펩티도-류코트리엔들은 ROS17/2.8 세포에서 알칼린 포스파타아제 활성에 실질적인 영향을 주지 않았다. LTB4 and peptido-leukotrienes did not have a substantial effect on alkaline phosphatase activity in ROS17 / 2.8 cells.

[표 1]TABLE 1

저해제의 세포 단백질 함량에 대한 효과 및 ROS17/2.8에서 TGF-β1의 알칼린 포스파타아제 활성에 대한 자극 효과Effect of Inhibitor on Cell Protein Content and Stimulation Effect on TGF- β 1 Alkaline Phosphatase Activity in ROS17 / 2.8

a 단백질은 TGF-β1-처리 배양물의 경우와 비교하여, TGF-β1-처리 및 저해제-처리 배양물의 웰에서 단백질의 백분율로 표시하였다.a protein as compared to the case TGF- β 1- treatment of water culture, TGF- β 1- treatment and inhibitors were expressed as a percentage of the protein in the treatment of water culture wells.

b 저해율(%) = (1-A/B) x 100 [식중, A = 저해제 존재 하 TGF-β 처리에 따른 알칼린 포스파타아제 활성의 증가이고, B = 저해제 부재 하 알칼린 포스파타아제 활성의 증가b% inhibition = (1-A / B) x 100 where A = increase in alkaline phosphatase activity following TGF- β treatment in the presence of inhibitor, B = alkaline phosphatase activity in the absence of inhibitor Increase

리폭시게나아제의 활성 측정 결과, TGF-β를 처리한 후 약 1시간이 경과하면 그 활성이 크게 증가되고 이후 원래의 수준으로 돌아오는 것으로 나타났다(도 7).As a result of measuring the activity of lipoxygenase, about 1 hour after treatment with TGF- β , the activity was greatly increased and then returned to the original level (FIG. 7).

또한, FLAP 발현 양상 조사 결과, TGF-β 처리 후 30분 내에 이들의 mRNA가 양적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 변화는 TGF-β가 5-리폭시게나아제의 mRNA 양을 증가시켜 활성을 조절하는 것을 의미하며, 여기서 제조된 생성물이 조골세포에 작용하여 알칼린 포스파타아제의 활성 증가를 유도하는 것이다(도 8).In addition, the results of FLAP expression pattern showed that their mRNA increased quantitatively within 30 minutes after TGF- β treatment. This change means that TGF- β modulates activity by increasing the amount of mRNA of 5-lipoxygenase, where the product produced acts on osteoblasts to induce increased activity of alkaline phosphatase (Fig. 8).

이상의 실험 결과로부터 나타난 바와 같이, 경골조직을 비롯한 결체조직의 재생 및 생성과정에 아라키돈산 대사 조절물질이 관여하며, 특히 리폭시게나아제 저해제인 NDGA가 이들 재생 및 생성과정의 조절제로 작용함을 알 수 있다.As can be seen from the above experiments, arachidonic acid metabolic regulators are involved in the regeneration and production of connective tissues including tibia, especially NDGA, a lipoxygenase inhibitor, acts as a regulator of these regeneration and production processes. have.

즉, TGF-β가 관여하는 이들 경골 및 결체조직의 재생과정이나 생장과정의 속도 및 정도는 NDGA와 인도메타신에 의해 효과적으로 조절되며, 본 발명의 NDGA 함유 조성물에 의하여 상기 과정의 속도를 조절할 수 있으며, 이 때 발생하는 여러 가지 부작용이나 역효과를 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 경골 및 결체조직의 재생과정을 조절하기 위해 사용하였던 종전의 TGF-β 및 유사단백질 제제나 스테로이드성 제제를 투여하는 방법에 비하여 훨씬 낮은 비용으로, 부작용 없이 상기 재생과정을 효과적으로 조절할 수 있다.That is, the rate and extent of the regeneration or growth process of these tibia and connective tissues involved in TGF- β are effectively controlled by NDGA and indomethacin, and the rate of the process can be controlled by the NDGA-containing composition of the present invention. In addition, various side effects or adverse effects occurring at this time can be prevented. Therefore, according to the present invention, the regeneration process is effectively performed without side effects at a much lower cost than the conventional method of administering TGF- β and pseudoprotein or steroidal agents used to control the regeneration process of tibia and connective tissue. I can regulate it.

도 1a, 1b 및 1c는 본 발명의 실시예에서 ETYA, 인도메타신, NDGA의 ROS17/2.8 세포에서 알칼린 포스파타아제 활성의 TGF-β1-유발 자극에 대한 영향을 나타내는 그래프.1A, 1B and 1C are graphs showing the effect of alkaline phosphatase activity on TGF- β 1 -induced stimulation in ROS17 / 2.8 cells of ETYA, indomethacin, and NDGA in Examples of the present invention.

도 2는 본 발명의 실시예에서 여러 가지 저해제의 ROS17/2.8에서 알칼린 포스파타아제 활성의 TGF-β1-유발 자극에 대한 영향을 나타내는 그래프.FIG. 2 is a graph showing the effect of alkaline phosphatase activity on TGF- β 1 -induced stimulation in ROS17 / 2.8 of various inhibitors in the Examples of the present invention.

도 3은 알칼린 포스파타아제 활성과 비교하여, ROS17/2.8에서 junB 발현의 TGF-β1 자극에 대한 영향을 나타내는 도.3 shows the effect of junB expression on TGF- β 1 stimulation in ROS17 / 2.8 as compared to alkaline phosphatase activity.

도 4는 인도메타신과 NDGA의 ROS17/2.8 세포에서 알칼린 포스파타아제 활성의 덱사메타손(dexamethasone)-유발 자극에 대한 영향을 나타내는 그래프.Figure 4 is a graph showing the effect on dexamethasone-induced stimulation of alkaline phosphatase activity in ROS17 / 2.8 cells of indomethacin and NDGA.

도 5는 TGF-β에 의하여 섬유아세포의 분열이 촉진되는 양상을 보여주는 그래프.5 is a graph showing a mode in which fibroblast division is promoted by TGF- β .

도 6은 NDGA에 의하여 TGF-β의 효과가 억제되고 인도메타신에 의하여 그 효과가 촉진됨을 보여주는 그래프.6 is a graph showing that the effect of TGF- β is inhibited by NDGA and promoted by indomethacin.

도 7은 TGF-β 처리에 따른 ROS17/2.8 세포의 리폭시게나아제 활성의 변화를 나타내는 그래프.7 is a graph showing changes in lipoxygenase activity of ROS17 / 2.8 cells following TGF- β treatment.

도 8은 TGF-β 처리에 따른 5-리폭시게나아제의 발현 양상을 나타내는 그래프.8 is a graph showing the expression pattern of 5-lipoxygenase following TGF- β treatment.

Claims (2)

노르디히드로구아이아레트산(NDGA)과 인도메타신을 1:10 내지 10:1의 몰비로 함유하는 경골조직 재생용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for regeneration of tibial tissue containing nordihydroguaiaretic acid (NDGA) and indomethacin in a molar ratio of 1:10 to 10: 1. 노르디히드로구아이아레트산(NDGA)과 인도메타신을 1:10 내지 10:1의 몰비로 함유하는 결체조직 재생용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for regenerating connective tissue containing nordihydroguaiaretic acid (NDGA) and indomethacin in a molar ratio of 1:10 to 10: 1.