KR100533147B1 - Modulators of intracellular inflammation, cell death and cell survival pathways - Google Patents

Abstract

B1 단백질, 이의 동소체, 유사체, 단편과 유도체, 이것을 기호화한 DNA와 재조합 생산이 제시되어 있다. 이 단백질은 세포내 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로 조절에 유용하다.The B1 protein, its allotropes, analogs, fragments and derivatives, the DNA encoding them and recombinant production are shown. This protein is useful for regulating intracellular inflammation, cell death and cell survival pathways.

Description

세포 염증, 세포 죽음 및 세포 생존 과정의 조절물질{Modulators of intracellular inflammation, cell death and cell survival pathways} Modulators of intracellular inflammation, cell death and cell survival pathways

본 발명은 세포내 죽음, 세포 생존 경로의 조절물질에 관계하는데, 특히 이들 중에, TNF/NGF 슈퍼페밀리 수용체 및 이와 연합된 세포내 어댑터 단백질, 카스파제 및 카이나제 효소에 관계한다. 좀더 구체적으로는 본 발명은 원래는 CBK로 지정되었으나, 현재는 B1으로 지정된 신규한 단백질, 이의 동소체, 이의 유사체, 단편 및 유도체에 관계하는데, 이 단백질은 세포 죽음, 세포 생존 및 염증 과정에 속하는 다양한 세포내 단백질 및 효소와 함께 직간접적으로 상호작용하는 것이다.The present invention relates to modulators of intracellular death, cell survival pathways, in particular among them TNF / NGF superfamily receptors and their associated intracellular adapter proteins, caspases and kinase enzymes. More specifically, the present invention relates to novel proteins, allotropes, analogs, fragments, and derivatives thereof, originally designated CBK, but now designated as B1, which are involved in a variety of cell death, cell survival, and inflammatory processes. It interacts directly or indirectly with intracellular proteins and enzymes.

종양 괴사 인자/신경 성장 인자(TNF/NGF) 수용체 슈퍼페밀리는 이들 구성 요소의 세포외 도메인사이에 구조적인 유사성으로 정의한다(Bazan, 1993; Beutler and van Huffel, 1994; Smith et al., 1994). p55 TNF 수용체와 Fas/APO1인 두 가지 수용체를 제외하고는 이들 수용체 족의 다양한 성분은 이들 세포내 도메인에서 분명하게 구조적인 유사성을 나타내지 않는다. 그럼에도 불구하고, 수용체간에 기능상 상당한 유사성이 있으며, 이는 이들 수용체들이 공통의 신호체계 경로를 가진다는 것을 의미한다. 이와 같은 유사성의 한 가지 예를 들면, TNF/NGF 족의 몇 가지 수용체는 전사인자 NF-_KB를 활성화시키는 능력이 있다는 것이다. 이와 같은 공통의 능력은 NF-_KB를 활성화시키는 세포질 단백질의 능력으로 설명된다. TNF 수용체 연합된 인자 2(TRAF2)는 TNF/NGF 족의 몇 가지 수용체의 구조적으로 유사한 세포내 도메인에 결합한다. 어떠한 메카니즘에 의해 TRAF2가 작용하는지 그리고 이것이 결합하는 상이한 수용체에 어떻게 반응하는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다.Tumor necrosis factor / nerve growth factor (TNF / NGF) receptor superfamily is defined by structural similarities between the extracellular domains of these components (Bazan, 1993; Beutler and van Huffel, 1994; Smith et al., 1994). . Except for the two receptors, p55 TNF receptor and Fas / APO1, the various components of these receptor families do not clearly show structural similarities in these intracellular domains. Nevertheless, there are significant functional similarities between receptors, which means that these receptors have a common signaling pathway. One example of such similarity is that some receptors of the TNF / NGF family have the ability to activate the transcription factor NF- _K B. This common ability is explained by the ability of cytoplasmic proteins to activate NF- _K B. TNF receptor associated factor 2 (TRAF2) binds to structurally similar intracellular domains of several receptors of the TNF / NGF family. The mechanism by which TRAF2 works and how it responds to the different receptors to which it binds is not yet known.

TRAF1, TRAF2(Rothe, M., Wong, s.c., Henzel, W.J. and Goeddel, D.(1994) Cell 78:681-692; PCT published application WO 95/33051), TRAF3(Cheng, G., et al), TRAF6(Cao et al., 1996a) 등을 포함하는 몇 가지 확인된 단백질을 포함하는 TRAF라고 칭하는 최근에 밝혀진 단백질족의 구성원 중에 하나가 TRAF2이다. TRAF1, TRAF2 (Rothe, M., Wong, sc, Henzel, WJ and Goeddel, D. (1994) Cell 78: 681-692; PCT published application WO 95/33051), TRAF3 (Cheng, G., et al) One member of the recently identified protein family called TRAF, which includes several identified proteins, including TRAF6 (Cao et al., 1996a), is TRAF2.

TRAF 족에 속하는 모든 단백질은 이들의 C-말단 도메인에 아미노산 동일성이 상당히 높고, 반면에 N-말단은 무관하다. TRAF2의 구조를 설명하는 도면 1을 보면, 링 핑거 모티프와 두 개의 TFIIIA-유사 아연 핑거 모티프를 C-말단에 포함하고 있다는 것을 알 수 있다. 분자의 C-말단에는 아미노산 264-358(N-TRAF라 칭함)사이에 이어져 있는 루이신 지퍼부분과 아미노산 359-501(C-TRAF라 칭함)사이에 도메인의 C-말단 부분을 포함하는 "TRAF 도메인"으로 공지된 부분을 포함하고 있는데 이는 TRAF가 수용체에 결합하고 그리고 동종이량체 및 이종이량체를 만들기 위해 다른 TRAF 분자에 결합할 수 있도록 하는 역할을 한다.All proteins belonging to the TRAF family have significantly higher amino acid identity to their C-terminal domains, while the N-terminus is irrelevant. 1, which illustrates the structure of TRAF2, it can be seen that the ring finger motif and two TFIIIA-like zinc finger motifs are included at the C-terminus. At the C-terminus of the molecule is a "TRAF" comprising a C-terminal portion of the domain between the leucine zipper between amino acids 264-358 (called N-TRAF) and the amino acids 359-501 (called C-TRAF). Domain ", which serves to bind TRAF to the receptor and to other TRAF molecules to make homodimers and heterodimers.

TNF/NGF 일부 수용체에 의해 개시되고 TRAF2에 의해 중개되는 신호 전달 캐스캐이드에 의해 전사인자 NF-_KB가 활성화된다. NF-_KB는 이량체형으로 전자인자로 작용하는 Rel 종양유전자에 유사성을 가지는 이량체형 단백질의 구성원이다. 이와 같은 인자들은 산재되어 있고, 다중 유전자의 발현을 조절하는데 참가한다. Ig_K 경사슬 발현 단계에서 B 세포에 구성적으로 존재하는 인자로 처음에는 밝혀졌으나, NF-_KB는 유도성 전사 활성물질로써 작용하는 것으로 밝혀졌다. 대부분 공지의 경우에, NF-_KB는 일차 인자로 작용하는데, 즉, 이의 활성 유도는 새로(de novo) 합성하는 것보다는 세포에 비활성형태로 기존 분자를 활성화시켜 작용하게 되는데, 이는 NF-_KB 유전자를 활성 개시하는 유도성 전사인자에 의존한다. NF-_KB의 효과는 다상유전성이 매우 크다. 이들 상당수의 영향은 세포외 자극에 반응하여 신속하게 유도된 공통적인 특징을 공유한다. NF-_KB 주요 활성화 물질은 바이러스, 박테리아의 성분, 면역 반응을 조절하는 사이토킨, UV 광 및 기타 다른 것을 포함하는 면역 방어 유도물질이다. 따라서, NF-_KB에 의해 유도되는 많은 유전자들은 면역 방어에 기여한다(see Blank et al., 1992; Grilli et al., 1993; Baeuerle and Henkel, 1994, for review).The transcription factor NF- _K B is activated by a signal transduction cascade initiated by TNF / NGF some receptors and mediated by TRAF2. NF- _K B is a member of a dimeric protein with similarity to the Rel oncogene, which acts as an electron factor in its dimeric form. These factors are interspersed and participate in regulating the expression of multiple genes. Although initially identified as a constitutive factor present in B cells in the Ig _K light chain expression step, NF- _K B was found to act as an inducible transcriptional activator. In most known cases, NF- _K B acts as a primary factor, ie its induction of activity acts by activating an existing molecule in an inactive form in the cell rather than de novo synthesis, which is NF- _K. Depends on inducible transcription factors that initiate the B gene. The effect of NF- _K B is very high in multiphase dielectric. Many of these effects share common features that are rapidly induced in response to extracellular stimuli. NF- _K B major activators are immune defense inducers, including viruses, components of bacteria, cytokines that regulate immune responses, UV light and others. Thus, many genes induced by NF- _K B contribute to immune defense (see Blank et al., 1992; Grilli et al., 1993; Baeuerle and Henkel, 1994, for review).

NF-_KB-조절의 한 가지 주요 특징은 이들 인자는 핵을 전치시키고, DNA에 결합하고 전사를 활성화할 수 있도록 유도되는 세포질 DNA 결합 안된 형으로 존재할 수 있다는 것이다. NF-_KB 단백질의 이와 같은 이중형은 적혈구 단백질 안키린(ankyrin)(Gilmore and Morin, 1993)에서 처음으로 구별된 반복 도메인을 포함하는 I-_KB 족 단백질에 의해 조절을 받는다. 자극을 받지 않은 형에서, NF-_KB 이량체는 세포질 위치에 있는 I-_KB 분자와 연합하여 발생하고, NF-_KB-결합된 DNA 서열과의 상호작용 및 전사 활성을 방해한다. NF-_KB 이량체로부터 I-_KB의 분리는 많은 유도성 인자에 의해 이를 활성화시키는 중요한 단계로 구성된다(DiDonato et al., 1995). 이와 같은 조절에 관여하는 메카니즘에 대해 안다는 것은 아직은 요원하다. 다양한 NF-_KB-유도성 인자에 대한 반응성에 대해 세포 특이성을 결정하는 방법을 이해하는 것 또한 요원하다.One major feature of NF- _K B-regulation is that these factors can exist in a cytoplasmic DNA unbound form that is induced to translocate the nucleus, bind DNA and activate transcription. This dual form of the NF- _K B protein is regulated by a group I- _K B protein comprising repeat domains first distinguished from the erythrocyte protein ankyrin (Gilmore and Morin, 1993). In the unstimulated form, NF- _K B dimers occur in association with I- _K B molecules in the cytoplasmic position and interfere with interaction and transcriptional activity with NF- _K B-bound DNA sequences. Separation of I- _K B from NF- _K B dimers consists of an important step of activating it by many inducible factors (DiDonato et al., 1995). It is still far from knowing the mechanisms involved in this regulation. It is also useful to understand how to determine cell specificity for responsiveness to various NF- _K B-inducing factors.

NF-_KB의 가장 강력한 유도성 물질 중에 하나는 사이토킨 종양 괴사 인자(TNF)이다. 두 가지 다른 TNF 인자 즉, p55와 p75 수용체(p55-R 및 p75-R)이다. 이들의 발현 수준은 세포마다 상당히 다르다(Vandenabeele et al., 1995). p75 수용체는 세포 결합된 TNF형에 반응하는 것을 선호하고(TNF는 β-막통과 단백질과 가용성 단백질형으로 발현한다), 반면에 p55 수용체는 가용성 TNF 분자에 더 효과적으로 반응을 한다(Grell et al., 1995). 두 가지 수용체의 세포내 도메인은 구조적으로는 관련이 없고, 다른 세포질 단백질에 결합한다. 그럼에도 불구하고, 이들 두 가지 수용체에 의해 TNF의 세포치사 효과 및 NF-_KB의 유도를 포함하는 TNF 효과중 적어도 일부가 유도될 수 있다. 이와 같은 특징은 세포 특이적이다. p55 수용체는 TNF에 반응하여 이와 같은 효과를 나타낼 수 있는 모든 세포에서 NF-_KB의 활성화 또는 세포치사(cytocidal)를 유도할 수 있다. 비록 p75-R이 다량으로 발현도기는 하지만, p55-R의 자극에 의해서만 반응하여 효과를 나타내는 것도 있다(Vandenabeele et al., 1995). TNF 수용체와는 별도로, TNF/NGF 수용체 족의 다양한 다른 수용체; CD30(McDonald et al., 1995), CD40(Berberich et al., 1994; Lalmanach-Girard et al., 1993), 림포톡신 베타 수용체 및 몇 가지 세포형에서 Fas/APO1(Rensing-Ehl et al., 1995)등은 NF-_KB의 활성을 유도할 수 있다. 또한 NF-_KB 활성화를 효과적으로 자극하는 IL-1 타입I 수용체는 이들과 구조적인 유사성이 없는데도 불구하고 TNF 수용체의 대부분의 효과를 공유한다.One of the most potent inducers of NF- _K B is cytokine tumor necrosis factor (TNF). Two different TNF factors, p55 and p75 receptors (p55-R and p75-R). Their expression levels vary considerably from cell to cell (Vandenabeele et al., 1995). The p75 receptor prefers to respond to cell-bound TNF types (TNF is expressed in β-membrane proteins and soluble protein types), whereas the p55 receptor responds more effectively to soluble TNF molecules (Grell et al. , 1995). The intracellular domains of the two receptors are structurally unrelated and bind to other cytoplasmic proteins. Nevertheless, these two receptors may induce at least some of the TNF effects, including the cytotoxic effects of TNF and the induction of NF- _K B. This feature is cell specific. The p55 receptor can induce the activation or cytotoxicity of NF- _K B in all cells that can exert such effects in response to TNF. Although p75-R is expressed in large amounts, it may be effective only in response to stimulation of p55-R (Vandenabeele et al., 1995). Apart from the TNF receptor, various other receptors of the TNF / NGF receptor family; CD30 (McDonald et al., 1995), CD40 (Berberich et al., 1994; Lalmanach-Girard et al., 1993), lymphotoxin beta receptors and several cell types Fas / APO1 (Rensing-Ehl et al., 1995) can induce the activity of NF- _K B. In addition, IL-1 type I receptors that effectively stimulate NF- _K B activation share most of the effects of TNF receptors despite their structural similarity.

이들 다양한 수용체의 자극으로 인한 NF-_KB의 활성화는 이와 연합된 I-_KB 분자의 유도된 인산화반응으로 인한 것이다. 이와 같은 인산화반응은 I-_KB의 꼬리에 붙어 분해되는데 대부분 프로테아좀(proteasome)에서 발생한다. I-_KB를 인산화시키는 카이나제의 성질 및 이것이 수용체를 자극할 때 작용하는 메카니즘등은 아직 밝혀지지 않았다. 그러나, 최근 2년간 인산화 반응에 참여하는 것으로 보이는 세 가지-수용체 연합된 단백질을 확인하는 일부 수확이 있었다(도 2a와 6을 참조). D. Goeddel과 그의 동료(Rothe et al., 1994)에 의해 처음으로 클론된 TRAF2라 불리는 단백질은 다양한 TNF/NGF 수용체족에 의해 NF-_KB-활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 단백질이 다량으로 발현된 경우에 이 자체가 NF-_KB 활성화를 자극하고, 활성화된 p75 TNF-R(Rothe et al., 1994), 림포톡신 베타 수용체(Mosialos et al., 1995), CD40(Rothe et al., 1995a), CD-30(unpublished data)에 결합하고, 이들에 의해 NF-_KB 유도를 중개한다. TRAF2는 p55 수용체 또는 Fas/APO1 수용체에도 결합하지 않으나, TRADD라고 불리는 p55 수용체-연합된 단백질에는 결합할 수 있는데, TRADD는 MORT1(또는 FADD-Boldin et al., 1995b and 1996)라고 불리는 Fas/APO1-연합된 단백질에 결합할 수 있는 능력을 가진다. RIP(Stanger et al., 1995)라고 불리는 또 다른 수용체-상호작용 단백질은 TRAF2 및 FAS/APO1, TRADD, p55 TNF 수용체 및 MORT-1과 상호작용을 할 수 있다. 따라서, RIP는 세포의 세포독성 유도(세포 죽음)와 관련이 있고, TRAF2와 상호작용을 할 수 있는 능력은 NF-_KB의 활성화에 관련이 있다는 것을 암시하고, 또한 FAS/APO1, MORT-1, p55 TNF 수용체 및 TRADD와 TRAF2사이에 NF-_KB 활성화를 유도하는 경로에서 상호작용을 증강시키는 추가 작용을 한다는 것을 나타낸다. 이와 같은 연합으로 p55 TNF 수용체와 Fas/APO1이 NF-_KB 활성화를 자극시킬 수 있게 한다(Hsu et al., 1995; Boldin et al., 1995; Chinnalyan et al., 1995; Varfolomeev et al., 1996; Hsu et al., 1996). IL-1 수용체에 의한 NF-_KB 활성화를 촉진하는 것은 TRAF2와는 무관하게 일어나고 IRAK라고 불리는 최근에 클론된 IL-1 수용체-연합된 단백질-카이나제가 관여할 수 있다(Croston et al., 1995).The activation of NF- _K B due to the stimulation of these various receptors is due to the induced phosphorylation of the associated I- _K B molecules. This phosphorylation is attached to the tail of I- _K B and degrades, most of which occur in proteasomes. The nature of the kinase that phosphorylates I- _K B and the mechanism by which it stimulates the receptor are not yet known. However, there have been some harvests identifying three-receptor associated proteins that appear to participate in phosphorylation reactions in the last two years (see Figures 2A and 6). A protein called TRAF2, first cloned by D. Goeddel and his colleagues (Rothe et al., 1994), appears to play an important role in NF- _K B-activation by various TNF / NGF receptor families. When a large amount of protein is expressed, it itself stimulates NF- _K B activation, and activated p75 TNF-R (Rothe et al., 1994), lymphotoxin beta receptor (Mosialos et al., 1995), CD40 ( Rothe et al., 1995a), bind to CD-30 (unpublished data) and mediate NF- _K B induction by them. TRAF2 does not bind to either the p55 receptor or the Fas / APO1 receptor, but can bind to the p55 receptor-associated protein called TRADD, which is called Fas / APO1 called MORT1 (or FADD-Boldin et al., 1995b and 1996). -Have the ability to bind to the associated protein. Another receptor-interacting protein called RIP (Stanger et al., 1995) can interact with TRAF2 and FAS / APO1, TRADD, p55 TNF receptor and MORT-1. Thus, RIP is associated with induction of cytotoxicity of cells (cell death), suggesting that the ability to interact with TRAF2 is related to the activation of NF- _K B, and also FAS / APO1, MORT-1 , p55 TNF receptor and TRADD and TRAF2 have a further action to enhance the interaction in the pathway inducing NF- _K B activation. This association allows the p55 TNF receptor and Fas / APO1 to stimulate NF- _K B activation (Hsu et al., 1995; Boldin et al., 1995; Chinnalyan et al., 1995; Varfolomeev et al., 1996; Hsu et al., 1996). Promoting NF- _K B activation by the IL-1 receptor occurs independently of TRAF2 and may involve a recently cloned IL-1 receptor-associated protein-kinase called IRAK (Croston et al., 1995 ).

어떠한 메카니즘에 의해 TRAF2가 활성화되는 지는 아직 모르지만, TRAF2에 결합하는 몇 가지 세포질 분자들이 확인되었다(Rothe et al; Rothe et al., 1995b). 그러나, 이들 분자에 대한 정보가 어떻게 TRAF2가 I-_KB의 인산화 반응을 자극하는지, TRAF2 자체에 임의 효소 활성을 가지고 있는 지에 대한 단서를 제공하지는 못하였다. 두 가지 TNF 수용체에 의한 NF-_KB 유도에서 관찰된 것과 같은 상이한 수용체에 의해 TRAF2 세포 특이적인 활성화 패턴을 나타내는 메카니즘에 대한 임의 정보도 없다.It is not yet known which mechanism activates TRAF2, but several cytoplasmic molecules that bind TRAF2 have been identified (Rothe et al; Rothe et al., 1995b). However, the information on these molecules did not provide clues as to how TRAF2 stimulates the phosphorylation of I- _K B and whether it has any enzymatic activity in TRAF2 itself. There is no arbitrary information on the mechanisms that show TRAF2 cell specific activation patterns by different receptors as observed in NF- _K B induction by the two TNF receptors.

전술한 것에 추가하여, 다양한 TRAF 단백질에서, TRAF2는 p55(CD120a)와 p75(CD120b) TNF 수용체에 결합하고 뿐만 아니라 전술한 다른 어뎁터 단백질을 경유하여 또는 직접 TNF/NGF 수용체족의 다른 몇 가지 수용체에 결합할 수 있는데, FAS/APO1 수용체에서는 MORT-1, TRADD, RIP와 같은 어뎁터 단백질이 있다. 이와 같이 TRAF2는 NF-_KB의 활성화에 상당히 중요하다(Wallach, 1996). 그러나, TRAF3은 시제 TNF/NGF 수용체족의 일부 수용체에 의해 NF-_KB의 활성화를 방해하는 반면에(Rothe et al., 1995a), TRAF6은 IL-1에 의해 NF-_KB의 유도를 방해하는 것에 요구된다(Cao et al., 1996a).In addition to the foregoing, in various TRAF proteins, TRAF2 binds to the p55 (CD120a) and p75 (CD120b) TNF receptors, as well as to several other receptors of the TNF / NGF family of receptors directly or via other adapter proteins described above. In the FAS / APO1 receptor, there are adapter proteins such as MORT-1, TRADD, and RIP. TRAF2 is thus important for the activation of NF- _K B (Wallach, 1996). However, TRAF3 interferes with the activation of NF- _K B by some receptors in the TNF / NGF family of receptors (Rothe et al., 1995a), whereas TRAF6 interferes with the induction of NF- _K B by IL-1. (Cao et al., 1996a).

따라서, NF-_KB 활성화와 세포 생존능을 유지하는데 이의 중요성에 대해, 이와 같은 활성화에 관련된 다양한 세포 경로는 아직 밝혀지지 않았는데, 다양한 TRAF 단백질이 어떻게 직간접적으로 관여하는지 밝혀지지 않았다.Thus, for the importance of maintaining NF- _K B activation and cell viability, the various cellular pathways involved in such activation have not yet been identified, and how various TRAF proteins are directly or indirectly involved.

또한, TNF/NGF 수용체족과 다양한 어뎁터, 중개물질/조절물질 단백질을 포함한 이와 연합된 신호 경로에 대해 공지된 바와 같이(co-pending Israel Patent Application Nos. 114615, 114986, 115319, 116588), TNF와 FAS/APO1 리간드는 세포에 유익한 그리고 해로운 효과를 동시에 가진다. 예를 들면, TNF는 종양이나 감염물질에 대해 유기체의 방어에 기여하고, 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포의 치사를 유도하여, 입상세포의 항균 활성을 증강시켜 손상으로부터 회복되도록 하고, 따라서, 이와 같은 경우에 TNF에 의해 유도된 세포 치사는 바람직한 것이다. 그러나, 과량의 TNF은 유해한데, 이와 같은 TNF는 폐혈증 쇼크, 신경성 식용부진, 류마티스 질환, 염증 및 이식편에 대한 숙주 반응과 같은 다수의 질병에 주요 병인적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 이와 같은 경우에 TNF에 의해 유도된 세포 죽음은 바람직하지 못한 것이다. FAS/APO1 리간드 또한 바람직한 효과와 유해한 효과를 모두 가진다. 이와 같은 FAS/APO1 리간드는 이들의 수용체를 통하여 T-세포가 성숙하는 동안에 자가활성 T 세포를 죽이는데, T 세포가 발생하는 동안에 자가-항원을 인지하는 T 세포를 죽여 자가면역 질환을 방지한다. 또한, 다양한 종양 세포 및 HIV-감염된 세포는 이들의 표면에 FAS/APO1 수용체를 가지고 따라서 이의 리간드 또는 이에 대한 특이적인 항체에 의해 수용체가 활성화됨으로써 파괴되고, 따라서 이들 수용체에 의해 중개된 세포 사멸(apoptosis) 세포내 경로를 활성화시킨다. 그러나, FAS/APO1 수용체는 유해한 효과를 중개할 수도 있는데, 가령, 간세포의 파괴를 수반하는 급성 간염과 같은 특정 질환에서 볼 수 있는 조직의 무절제한 죽음 등을 중개한다.In addition, as is known for its associated signaling pathways including the TNF / NGF receptor family and various adapters, mediators / regulatory proteins (co-pending Israel Patent Application Nos. 114615, 114986, 115319, 116588), FAS / APO1 ligands have both beneficial and detrimental effects on cells. For example, TNF contributes to the defense of organisms against tumors or infectious agents, induces the death of tumor cells and virus-infected cells, enhances the antimicrobial activity of granulocytes and thereby recovers from damage, thus In this case, cell death induced by TNF is preferred. However, excess TNF is deleterious, and it is known that TNF plays a major pathological role in many diseases such as pulmonary shock, anorexia nervosa, rheumatic diseases, inflammation and host response to grafts. In such cases, cell death induced by TNF is undesirable. FAS / APO1 ligands also have both desirable and detrimental effects. Such FAS / APO1 ligands kill autoactive T cells during their maturation through their receptors, which kill T cells that recognize auto-antigens during T cell generation to prevent autoimmune diseases. In addition, various tumor cells and HIV-infected cells have FAS / APO1 receptors on their surface and are thus destroyed by activation of the receptors by their ligands or antibodies specific thereto, thus apoptosis mediated by these receptors. ) Activate intracellular pathways. However, FAS / APO1 receptors may also mediate deleterious effects, such as the indiscriminate death of tissues seen in certain diseases, such as acute hepatitis, which involve the destruction of hepatocytes.

전술한 관점에서, TNF/NGF) 수용체 족의 수용체는 한편으로는 세포 죽음 경로를 유도할 수 있고, 다른 한편으로는 세포 생존 경로를 NF-_KB 유도를 통하여 유도할 수도 있어, 두 가지 정반대되는 경로사이에 세포내에서 균형이 잘 유지됨을 나타낸다. 가령, 암 세포 또는 다른 감염된 또는 병이 든 세포를 최대로 파괴하는 것이 바람직할 경우에, NF-_KB 유도없이 세포 죽음 경로만을 유도하는 TNF 및 FAS/APO1 리간드를 가지는 것이 바람직하다. 반대로, 염증, 이식편-숙주 반응, 급성 간염으로부터 세포를 보호하기 위해서는 TNF 및 FAS/APO1 리간드의 세포 죽음 유도를 차단하고 대신에 NF-_KB 유도를 하는 것이 바람직하다. 비슷하게, 특정 병인상태에서는 p75 TNF 수용체와 IL-1 수용체에 의해 중개되는 세포내 신호 경로를 차단시키는 것이 바람직하고 한편 다른 환경에서는 이와 같은 세포내 경로를 강화시키는 것이 바람직하다.In view of the foregoing, TNF / NGF) receptor family of receptor is the one hand and can induce cell death path, on the other hand it may be induced through the cell survival pathway induction of NF- _K B, which two kinds of the opposite Intracellular balance between pathways is well maintained. For example, when it is desired to maximally destroy cancer cells or other infected or diseased cells, it is desirable to have TNF and FAS / APO1 ligands that induce only cell death pathways without NF- _K B induction. Conversely, in order to protect cells from inflammation, graft-host response, acute hepatitis, it is desirable to block the induction of cell death of TNF and FAS / APO1 ligands and instead induce NF- _K B induction. Similarly, in certain pathogenesis it is desirable to block intracellular signaling pathways mediated by the p75 TNF receptor and IL-1 receptor, while in other circumstances it is desirable to enhance such intracellular pathways.

최근에 본 발명자들은 NIK(이스라엘 특허 출원 117800, 119133 WO 97/37016)이라고 카이나제를 분리하였는데, 이는 TRAF2에 결합을 할 수 있고, NF-B 활성화를 유도하는 인산화반응에 직접적으로 관여한다.Recently we have isolated a kinase called NIK (Israel patent application 117800, 119133 WO 97/37016), which can bind to TRAF2, and NF- It is directly involved in the phosphorylation reaction that induces B activation.

또한, 많은 종류의 카스파제가 여러 연구자들에 의해 분리되었는데(이스라엘 특허 IL 120759), 이들은 상기에서 언급한 어뎁터 단백질(MORT-1/FADD) 또는 어뎁터 단백질과 TNF/NGF 수용체 페밀리의 다양한 수용체간의 복합체와 상호작용을 할 수 있고, 이들은 세포 죽음을 유도하는 단백질분해 작용에 영향을 준다. 따라서, 세포 죽음을 저해하거나 강화시킬 필요가 있을 때, 이와 같은 카스파제의 직접적인 조절이 바람직한데, 예를 들면, 세포 죽음을 저해하고자 할 때, 이와 같은 카스파제의 활성을 저해시키는 것이 바람직하다. 이에 대해, 이들 카스파제의 대부분에서 프로도메인이라고 불리는 부분이 있다고 보고되고 있는데(Hofmann et al., 1997), 이는 세포 죽음 과정의 어뎁터 단백질인 RAIDD(RIP, TRADD와 상호작용을 하고, MORT-1/FADD, p55-TNF-R FAS/APO1와도 상호작용을 함)과 같은 다수의 어뎁터 단백질에도 존재하고; c-IAP1, c-IAP2는 아팝토시스를 저해하는 저해물질로써, TRAF2와 상호작용을 하고, 따라서, 카스파제 저해물질이 되거나 세포 생존과정에서 TRAF2 관련을 자극하여, NF-_KB 활성을 유도할 수 있다. 이와 같이 이들 프로도메인은 "카스파제 보충 도메인"(CARD)(Hofmann et al., 1997)이라고 지정한다. 따라서, 이와 같은 프로도메인(CARD)은 세포 죽음 유도와 연합된 세포내 신호의 조절에 대한 또 하나의 표적이 된다.In addition, many types of caspases have been isolated by several researchers (Israel patent IL 120759), which are complexed with the above-mentioned adapter protein (MORT-1 / FADD) or a complex between the adapter protein and various receptors of the TNF / NGF receptor family. Can interact, and they affect the proteolytic action that leads to cell death. Therefore, when it is necessary to inhibit or enhance cell death, such direct regulation of caspase is desirable, for example, when it is desired to inhibit cell death, it is desirable to inhibit such caspase activity. On the other hand, most of these caspases have been reported to have a portion called prodomains (Hofmann et al., 1997), which interacts with RAIDD (RIP, TRADD), an adapter protein of the cell death process, and MORT-1. / FADD, also interacts with p55-TNF-R FAS / APO1). c-IAP1 and c-IAP2 are inhibitors of apoptosis that interact with TRAF2 and thus induce NF- _K B activity by becoming caspase inhibitors or stimulating TRAF2 involvement in cell survival. can do. As such, these prodomains are designated "Caspase Supplement Domain" (CARD) (Hofmann et al., 1997). Thus, such prodomains (CARDs) are another target for the regulation of intracellular signals associated with cell death induction.

또한, 최근에는 또 다른 단백질 페밀리에 대한 설명이 있었는데(by Yang and Korsmeyer, 1996), 소위 BCL2 단백질 페밀리라고 불리는 것으로, 단백질 BCL2, 이의 동소체 BCL-X(여기에는 BCL-X_L 및 또다르게 접합된 BCL-X_S를 포함), MCL1, A1, BAK, BAD, BAG1, BAX, 아데노바이러스 E1B-19k 및 캐노르하브다티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans (C. elegans)) CED-9 단백질이 모두 포함된다. 이들 단백질중에, BCL2, BCL-X_L, E1B-19k, CED-9는 아팝토시스를 방해하거나 다양한 세포내 발생 과정에 의해 아팝토시스에 대해 보호한다(Yang and Korsmeyer, 1996). BCL2 및 BCL-X_L는 또한 미토콘드리아뿐만 아니라 연질 내세포질 망상 및 핵주변 막에 국소화된 세포내 막-결합된 단백질로써, 이들 단백질의 C-말단은 외부 미토콘드리아 막 또는 세포내 막을 겨냥하고, 이를 삽입하는 역할을 담당하는 신호 고정 서열을 가진다. 일단 다양한 세포내 막에 고정되면, BCL2 및 BCL-X_L 단백질은 이들이 다양한 다른 세포내 단백질과 상호작용을 하는 세포질에 노출된다.In addition, there has recently been a description of another protein family (by Yang and Korsmeyer, 1996), called the BCL2 protein family, a protein BCL2, its allotropes BCL-X (here BCL-X _L and otherwise conjugated). BCL-X _S ), MCL1, A1, BAK, BAD, BAG1, BAX, Adenovirus E1B-19k and Caenorhabditis elegans (C. elegans ) CED-9 proteins . Among these proteins, BCL2, BCL-X _L , E1B-19k, CED-9 protect against apoptosis by disrupting apoptosis or by various intracellular developmental processes (Yang and Korsmeyer, 1996). BCL2 and BCL-X _L are also intracellular membrane-bound proteins localized to soft intracellular reticular and peripheral membranes, as well as mitochondria, whose C-terminus targets and inserts the outer mitochondrial membrane or intracellular membrane. It has a signal fixing sequence that plays a role. Once immobilized on various intracellular membranes, BCL2 and BCL-X _L proteins are exposed to the cytoplasm where they interact with various other intracellular proteins.

어떻게 BCL2, BCL-X_L, E1B-19k, CED-9가 세포를 보호하는 지에 대해서는 충분하게 밝혀진 것은 없지만, 이들의 효과는 상기에서 언급한 것과 같은 CPP32/Yama, ICE-LAP3 (Mch3), ICH-1를 포함하는 ICE/CED-3 페밀리의 ICE 및 ICE-유사형 프로테아제등의 다양한 카스파제등의 세포 죽음 효과물질의 상류가 된다. 사실, CED-9는 C. elegans 죽음 효과물질 프로테아제인 CED-3 및 CED-4의 특이적인 저해물질인 것으로 밝혀졌고, BCL2는 실제, ICH-1(또는 NEDD2라고 불림)의 저해물질, 특히 ICH-1_L는 세포 죽음을 촉진시킨다. 따라서, BCL2, BCL-X_L, CED-9, E1B-19k에 의한 아팝토시스의 정확한 저해 기작은 밝혀지지 않았지만, 세포 죽음 효과물질인 ICE-CED-3의 상류인 것으로 보인다(Yang and Korsmeyer, 1996, Chinnaiyan et al., 1996).It is not clear enough how BCL2, BCL-X _L , E1B-19k, or CED-9 protect cells, but their effects are as mentioned above in CPP32 / Yama, ICE-LAP3 (Mch3), ICH It is upstream of cell death effectants such as various caspases such as ICE and ICE-like protease of ICE / CED-3 family including -1. In fact, CED-9 has been shown to be specific inhibitors of the C. elegans death effector proteases CED-3 and CED-4, and BCL2 is actually an inhibitor of ICH-1 (or NEDD2), in particular ICH -1 _L promotes cell death. Thus, although the exact mechanism of inhibition of apoptosis by BCL2, BCL-X _L , CED-9, E1B-19k is not known, it appears to be upstream of the cell death effector ICE-CED-3 (Yang and Korsmeyer, 1996, Chinnaiyan et al., 1996).

상기에서 언급한 다른 BCL2 페밀리 구성요소에 대해서, BAX는 세포 죽음 프로모터이다. BAX는 자체에도 결합하고, BAX 동종이량체의 형으로, 아팝토시스를 촉진한다. BAX는 BCL2 및 BCL-X_L에 결합을 하고, 이와 같은 이종이량체는 아팝토시스에 대한 BCL2의 보호성 효과와 연합된다. 따라서, BAX/BAX 동종이량체 및 BAX/BLC2 이종이량체 양의 균형은 세포가 아팝토시스에 민감한지 또는 아팝토시스에 대해 보호를 받는지를 결정한다. BAX는 또한 다른 미토콘드리아 막에 상당수 국소화된 세포내 막-결합된 단백질인 것으로 보인다(BAX에 대해 상기 전술한 것은 Yang and Korsmeyer, 1996를 참고로 한다). 또한, 상기 BAK 및 BAD 단백질은 또한, BCL2 및 BCL-X_L 활성의 음성 조절물질로 작용하는데, 즉, 이들은 아팝토시스로부터 세포를 보호하는 BCL2 및 BCL-X_L의 능력을 억제한다. BAK 및 BAD는 BCL2 및 BCL-X_L에 결합하고, 따라서, BAX는 BCL2 및 BCL-X_L에 결합하지 못하도록 하고, 따라서 BAX/BAX 동종이량체의 양을 증가시키고, 결과적으로 세포 죽음을 증가시킨다(Yang and Korsmeyer, 1996). 이에 대해, BAK는 직접적으로 BCL2 및 BCL-X_L의 죽음-억제물질 활성을 차단하는 기능을 하는데, 그 이유는 BAK/BCL2 및 BAK/BCL-X_L 이종이량체가 아팝토시스로부터 세포를 보호하는 능력이 부족하기 때문이다. BAD는 BCL2 및 BCL-X_L에 대해 BAX가 결합하는데 대해 경쟁적인 저해물질로 작용하는데, 이는 BAD가 BAX/BCL2 및 BAX/BCL-X_L가 BAX에 대체되어, 죽음을 촉진하는 BAX/BAX 동종이량체의 양을 증가시키게 된다. BAK는 또한 미토콘드리아 세포막에 국소화된 세포내 막 결합 단백질인 것으로 보이나, BAD는 막 고정 서열이 없어, 막 결합 단백질은 아닌 것으로 보인다(Yang and Korsmeyer, 1996).For the other BCL2 family components mentioned above, BAX is a cell death promoter. BAX also binds to itself and promotes apoptosis in the form of BAX homodimers. BAX binds to BCL2 and BCL-X _L , and this heterodimer is associated with the protective effect of BCL2 on apoptosis. Thus, the balance of BAX / BAX homodimer and BAX / BLC2 heterodimer amounts determines whether cells are sensitive to apoptosis or protected against apoptosis. BAX also appears to be an intracellular membrane-bound protein that is largely localized to other mitochondrial membranes (see Yang and Korsmeyer, 1996 above for BAX). In addition, the BAK and BAD proteins also act as negative regulators of BCL2 and BCL-X _L activity, ie they inhibit the ability of BCL2 and BCL-X _L to protect cells from apoptosis. BAK and BAD bind to BCL2 and BCL-X _L, and therefore, BAX is to prevent binding to BCL2 and BCL-X _L, and thus and BAX / BAX same kind is to increase the amount of the dimer, resulting in increased cell death (Yang and Korsmeyer, 1996). In response, BAK directly blocks the death-inhibitor activity of BCL2 and BCL-X _L because BAK / BCL2 and BAK / BCL-X _L heterodimers protect cells from apoptosis. Because of lack of ability to do. BAD acts as a competitive inhibitor of BAX binding to BCL2 and BCL-X _L , which is a BAX / BAX homolog that causes BAD to replace BAX / BCL2 and BAX / BCL-X _L to BAX, promoting death It will increase the amount of dimers. BAK also appears to be an intracellular membrane binding protein localized to the mitochondrial cell membrane, but BAD lacks a membrane anchoring sequence and therefore does not appear to be a membrane binding protein (Yang and Korsmeyer, 1996).

상기 BCL2 페밀리의 또 다른 구성요소는 BAG1으로(Yang and Korsmeyer, 1996), 이는 BCL2의 양성 조절물질로써, 아팝토시스로부터 BCL2 보호 활성을 강화시키고, 세포에서 아팝토시스에 대해 BCL2 보호 활성을 제공하더라도 BCL2에 의해 통상 억제되지 않는 신호에 의해 아팝토시스를 겪는다.Another component of the BCL2 family is BAG1 (Yang and Korsmeyer, 1996), which is a positive regulator of BCL2, which enhances BCL2 protective activity from apoptosis and provides BCL2 protective activity against apoptosis in cells. However, apoptosis is caused by a signal that is not normally suppressed by BCL2.

상기 언급한 BCL-X_L의 또 다른 접합형인 BCL-X_S 단백질은 BCL-X_L 및 BCL2 활성의 길항물질로써, 아팝토시스에 대해 보호 활성을 차단한다(review of Yang and Korsmeyer, 1996).BCL-X _S protein, another conjugated form of BCL-X _L mentioned above, is an antagonist of BCL-X _L and BCL2 activity and blocks protective activity against apoptosis (review of Yang and Korsmeyer, 1996).

상기에서 언급한 바와 같이, BCL2 페밀리 단백질은 세포내에서 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 조절하는데 중요한 역할을 하고, 아팝토시스를 활성적으로 차단하는 단백질 족으로부터 아팝토시스를 촉진하는 또는 항-아팝토시스 활성을 저해하는 단백질로 균형을 이동시켜, 세포 죽음을 증가시키고, 유사하게, 다른 방향으로 균형을 이동시켜, 세포 생존을 증가시킨다. As mentioned above, the BCL2 family protein plays an important role in regulating cell death or cell survival processes in cells and promotes or anti-apoptosis from a family of proteins that actively block apoptosis. Shifting the balance to proteins that inhibit poptotic activity increases cell death, and similarly shifts the balance in the other direction, increasing cell survival.

따라서, 상기에서 언급한 상황하에, 세포에서 아팝토시스를 증가시켜, 세포 죽음을 증가시키고자 하는 경우에는 아팝토시스를 억제하거나 저해하는 BCL2, BCL-X_L 및 이 족의 다른 성분의 활성을 차단시키거나 아팝토시스를 촉진시키거나 또는 BCL2 또는 BCL-X_L의 항-아팝토시스 활성을 저해시키는 BAX, BAK, BAD, BCL-X_S 및 이 족의 다른 성분의 활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 유사하게, 아팝토시스를 감소시켜, 세포의 생존을 증가시키고자 하는 경우에는, 아팝토시스를 억제하는 또는 저해하는 BCL2, BCL-X_L 및 이 족의 다른 성분의 활성을 증가시키거나 상기에서 언급한 이 족의 아팝토시스 프로모터의 활성을 감소시키는 것이 바람직하다.Thus, under the above-mentioned circumstances, if one wants to increase apoptosis in a cell and increase cell death, the activity of BCL2, BCL-X _L and other components of the family that inhibit or inhibit apoptosis is It is desirable to increase the activity of BAX, BAK, BAD, BCL-X _S and other components of the family that block or promote apoptosis or inhibit the anti-apoptotic activity of BCL2 or BCL-X _L. Do. Similarly, when it is desired to reduce apoptosis, thereby increasing cell survival, the activity of BCL2, BCL-X _L and other components of the family that inhibit or inhibit apoptosis may be increased or It is desirable to reduce the activity of the apoptotic promoters of this family mentioned.

본 발명의 목적은 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존을 유도하는 세포내 신호 과정을 조절할 수 있는 신규한단백질, 이의 동소체, 유사체, 단편 또는 이의 유도체를 제공하고, 이와 같은 조절은 NF-_KB 활성화에 관여한 다양한 카스파제의 프로도메인(CARD) 또는 다양한 카스파제의 카이나제 도메인을 통하여 이루어진다. 따라서, 이와 같은 본 발명의 신규한단백질은 카스파제 활성을 직접적으로 조절하는 조절물질(세포 죽음 과정)이 될 수 있고, 카이나제 활성을 통하여 NF-_KB 활성을 조절하는 조절물질(예를 들면, FAS/APO1, p55 TNF-R, p75 TNF-R, IL-1-R, MORT-1,TRADD, RIP, TRAF2, NIK)될 수 있다. 유사하게, 이와 같은 조절물질은 또한 BCL2 족의 성분과 직간접적으로 상호작용할 수 있고, 본 발명의 신규한단백질은 BCL2 또는 이 족의 다른 성분의 활성을 조절할 수 있기 때문에, 이 점에 대해서, 본 발명의 신규한단백질은 다양한 카스파제의 간접적인 조절물질이 될 수 있고, 따라서, BCL2 단백질 족의 성분에 의해 조절을 받을 수 있다.It is an object of the present invention to provide novel proteins, allotropes, analogs, fragments or derivatives thereof that can modulate intracellular signaling processes that induce inflammation, cell death or cell survival, and such regulation is directed to NF- _K B activation. Through the domains of various caspases involved (CARD) or the kinase domains of various caspases. Thus, the novel protein of the present invention may be a modulator (cell death process) that directly modulates caspase activity, and a modulator that modulates NF- _K B activity through kinase activity (eg, For example, FAS / APO1, p55 TNF-R, p75 TNF-R, IL-1-R, MORT-1, TRADD, RIP, TRAF2, NIK). Similarly, such modulators may also interact directly or indirectly with components of the BCL2 family, and in this regard, as the novel proteins of the present invention may modulate the activity of BCL2 or other components of the family, The novel proteins of the invention can be indirect regulators of various caspases and thus can be regulated by components of the BCL2 protein family.

본 발명의 또 다른 목적은 원하는 경우에 염증, 세포 죽음 또는 생존 신호 과정을 저해하는데 이용할 수 있는 본 발명의 상기 신규한단백질, 이의 동소체, 유사체 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 것에 대한 길항물질(가령, 항체, 펩티드, 유기 화합물 또는 일부 동소체)을 제공한다.Another object of the present invention is to provide an antagonist (including, for example, a novel protein, an allotrope, an analog thereof fragment or derivative) of the present invention which can be used to inhibit inflammation, cell death or survival signaling processes if desired. Antibodies, peptides, organic compounds or some allotropes).

본 발명의 또 다른 목적은 염증, 세포 죽음 또는 생존 과정의 조절에 관여하는 또는 이들의 활성에 영향을 주는 추가 단백질 또는 인자를 분리하고, 특징을 조사하고, 이러한 신규한단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 유도체가 결합하여, 이 기능에 관여하는 신호 발생 과정의 상류 또는 하류에 있는 다른 수용체 또는 다른 세포 단백질을 분리 및 확인하는데 있어서, 상기 신규한단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용하는 것에 관계한다.It is another object of the present invention to isolate, characterize, and identify additional proteins or factors that are involved in the regulation of inflammation, cell death or survival processes or affect their activity, and such novel proteins, allotropes, analogs, fragments And the use of the novel proteins, allotropes, analogs, fragments and derivatives thereof in combination with derivatives to isolate and identify other receptors or other cellular proteins upstream or downstream of the signaling processes involved in this function. do.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한단백질 및 가능한 동소체에 결합하거나 또는 상호작용하기 위해 세포내로 도입될 수 있는 저해물질을 제공하는데, 이때 저해물질은 원하는 경우에, 염증, 세포 죽음 또는 생존 과정을 저해하는 작용을 한다.Another object of the present invention is to provide inhibitors that can be introduced into cells to bind to or interact with novel proteins and possible allotropes, which inhibitors, if desired, inhibit inflammation, cell death or survival processes. It works.

또는, 본 발명의 목적은 다클론성 또는 단일클론성 항체를 준비하기 위해 항원으로써 전술한 신규한단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 이용한다. 또는 항체를 이용하여 세포 추출물 또는 형질전환된 세포주와 같은 다른 원료로부터 신규한단백질을 정제할 수 있다.Alternatively, it is an object of the present invention to use the aforementioned novel proteins, allotropes, analogs, fragments and derivatives thereof as antigens for the preparation of polyclonal or monoclonal antibodies. Alternatively, antibodies can be used to purify novel proteins from other sources, such as cell extracts or transformed cell lines.

또한, 이들 항체들을 진단 목적으로 이용할 수 있는데 가령, 카스파제 , 카이나제, BCL2 족에 속하는 단백질 또는 TRAF 단백질에 의해 또는 p55 TNF 수용체, FAS/APO1 수용체 또는 다른 관련 수용체 및 이의 연합 세포 단백질(가령 MORT-1, TRADD, RIP)에 의한 직접적인 중개로 비정상적인 세포 기능과 관련된 질병을 확인하는데 이용할 수 있는데 이는 TRAF 단백질, 카스파제 , 카이나제 또는 BCL2족의 단백질 구성 성분과 상호작용을 통하여 세포내 공정을 직접 또는 간접적으로 조절할 수 있다.In addition, these antibodies can be used for diagnostic purposes, such as by caspases, kinases, proteins belonging to the BCL2 family or TRAF proteins or by p55 TNF receptors, FAS / APO1 receptors or other related receptors and their associated cellular proteins (e.g. Direct intermediation by MORT-1, TRADD, RIP) can be used to identify diseases associated with abnormal cellular function, through intracellular processes through interactions with TRAF protein, caspase, kinase or BCL2 protein components Can be adjusted directly or indirectly.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체를 포함하는 제약학적 조성물과 이에 대한 항체 및 다른 길항물질을 포함하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the novel protein, allotropes, analogs, fragments and derivatives thereof, and a pharmaceutical composition comprising antibodies and other antagonists thereof.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명에 따르면, B1으로 지정된 신규한단백질(원래는 "c-IAP 결합 카이나제"로, CBK로 지정하였는데, 그 이유는 실시예 1에서 볼 수 있는 것과 같이 c-IAP와 어느 정도 상동성을 가지기 때문이나, 이후로부터는 B1으로 칭함)을 분리하였는데, 이는 프로도메인(CARD) 부분, 카이나제 도메인 및 이들 CARD 및 카이나제 도메인사이에 있는 중간 부분을 가지고, 따라서 하기에서 상세하게 설명하는 것과 같이 염증, 세포 죽음 및 세포 생존 과정조절에 관계할 수 있다. 하기에서 또한 설명하겠지만, 세포 죽음 또는 생존 과정 조절은 이들과 상호작용하는 세포내 단백질 타입에 따라 포지티브(보강/강화) 또는 네거티브(저해)가 될 수도 있다.According to the present invention, the novel protein designated B1 (originally "c-IAP binding kinase", designated CBK, because of some homology with c-IAP as can be seen in Example 1). , Hereinafter referred to as B1), which has a prodomain (CARD) moiety, a kinase domain and an intermediate moiety between these CARD and kinase domains, and thus will be described in detail below. And may be involved in regulating inflammation, cell death and cell survival processes. As will also be described below, cell death or survival process regulation may be positive (enhanced / enhanced) or negative (inhibited) depending on the type of intracellular protein interacting with them.

따라서, 본 발명은 B1 단백질, 동소체, 단편, 또는 이의 유사체를 기호화하는 DNA 서열을 제공하는데, B1 동소체, 단편 또는 이의 유사체는 직간접적으로 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정의 세포내 조절물질과 상호작용을 할 수 있고, B1, 동소체, 단편 또는 유사체는 세포내 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정의 세포내 조절물질이 된다.Accordingly, the present invention provides a DNA sequence that encodes a B1 protein, allotrope, fragment, or analog thereof, wherein the B1 allotrope, fragment or analog thereof is directly or indirectly interacted with intracellular modulators of inflammation, cell death or cell survival. Can act, and B1, allotropes, fragments or analogs become intracellular regulators of intracellular inflammation, cell death or cell survival.

본 발명의 상기 DNA 서열의 구체예에는 다음이 포함된다;Specific examples of the DNA sequence of the present invention include the following;

(i) 다음에서 선택되는 DNA 서열;(i) a DNA sequence selected from:

(a) 고유 B1 단백질의 코딩 부분에서 유도된 cDNA 서열;(a) a cDNA sequence derived from the coding portion of native B1 protein;

(b) 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정 또는 이들 모두를 조절할 수 있는 생물학적으로 활성을 가지는 단백질을 기호화하는 (a)의 서열 단편;(b) the sequence fragment of (a) which encodes a biologically active protein capable of modulating inflammation, cell death or cell survival processes or both;

(c) 중간정도의 엄격한 조건하에서 (a)와 (b)의 서열에 하이브리드될 수 있고, 세포내 염증, 죽음 또는 세포 생존 과정을 조절할 수 있는 생물학적으로 활성을 가지는 B1 단백질, 유사체 또는 단편을 기호화하는 DNA 서열;(c) encoding a biologically active B1 protein, analog or fragment which can hybridize to the sequences of (a) and (b) under moderately stringent conditions and which can regulate intracellular inflammation, death or cell survival processes DNA sequence;

(d) (a)-(c)에 정의한 DNA 서열에 유전자 코드의 축중으로 인한 DNA 서열로, 세포내 염증, 죽음 또는 세포 생존 과정을 조절할 수 있는 생물학적으로 활성을 가지는 B1 단백질, 유사체 또는 단편을 기호화하는 DNA 서열;(d) a DNA sequence resulting from the degeneracy of the genetic code in the DNA sequence defined in (a)-(c), wherein the biologically active B1 protein, analog or fragment is capable of controlling intracellular inflammation, death or cell survival processes. DNA sequence to be encoded;

(ii) 도 3에 나타낸 서열의 적어도 일부를 구성하고, 적어도 한 가지 활성 B1 단백질, 동소체, 유사체 또는 단편을 기호화하는 상기 DNA 서열;(ii) said DNA sequence which constitutes at least part of the sequence shown in FIG. 3 and symbols at least one active B1 protein, allotrope, analog or fragment;

(iii) 도 3에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 일부분을 가지는 B1 단백질, 동소체, 유사체 또는 단편을 기호화하는 상기 DNA 서열.(iii) said DNA sequence encoding a B1 protein, allotrope, analog or fragment having at least a portion of the amino acid sequence shown in FIG.

또 다른 측면에서, 본 발명은 진핵세포 또는 원핵세포에서 선택한 숙주세포에서 발현될 수 있는 본 발명에 따른 상기 DNA 서열로 구성된 벡터와 이와 같은 벡터를 포함하는 형질전환된 진핵세포 또는 원핵세포를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a vector consisting of the DNA sequence according to the present invention that can be expressed in a host cell selected from eukaryotic or prokaryotic cells and transformed eukaryotic or prokaryotic cells comprising such a vector. .

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기에서 언급하는 것과 같은 본 발명의 DNA 서열에 의해 기호화되는 B1 단백질, 동소체, 단편, 기능적인 유사체 및 이의 유도체를 제공하는데, 이와 같은 단백질, 동소체, 단편, 유사체 및 이의 유도체는 세포내 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 직간접적으로 또는 이 과정의 다른 세포 조절물질 또는 중개물질과 연합하여 조절할 수 있다.According to another aspect of the present invention there is provided a B1 protein, allotrope, fragment, functional analogue and derivative thereof which is encoded by the DNA sequence of the present invention as mentioned above, such protein, allotrope, fragment, analogue And derivatives thereof may modulate intracellular inflammation, cell death or cell survival processes either directly or indirectly or in conjunction with other cell regulators or mediators of the process.

본 발명의 단백질의 또 다른 구체예는 B1 단백질, 동소체, 단편, 유사체 또는 이의 유도체를 제공하는데, 이때 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체는 도 3에서 설명하는 아미노산 서열의 적어도 일부분을 가진다.Another embodiment of a protein of the invention provides a B1 protein, allotrope, fragment, analog or derivative thereof, wherein the protein, allotrope, analog, fragment and derivative thereof have at least a portion of the amino acid sequence described in FIG. 3.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편을 수득하고, 발현된 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편을 분리하기 위해 필요한 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편의 발현 및 전사후 조절에 적절한 조건하에 전술한 형질전환된 숙주 세포를 생장시키는 것으로 구성된 상기 DNA 서열에 의해 기호화되는 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편을 만드는 방법을 제공한다.The invention also provides for the expression and post-transcriptional regulation of proteins, their allotropes, analogues or fragments, which are necessary to obtain proteins, their allotropes, analogs or fragments according to the invention and to isolate the expressed proteins, their allotropes, analogs or fragments. Provided are methods for making proteins, allotropes, analogs or fragments thereof that are encoded by said DNA sequences consisting of growing the above-described transformed host cells under appropriate conditions.

또 다른 측면에서는, 본 발명은 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편에 특이적인 항체, 또는 이의 활성 단편 또는 이의 유도체를 제공한다.In another aspect, the invention provides antibodies, or active fragments or derivatives thereof, specific for the B1 protein, allotropes, analogs or fragments thereof.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 세포내 신호 발생 과정을 조절하는 다양한 방법을 제공하는데;In another aspect, the present invention provides a variety of methods for regulating intracellular signaling processes, including;

(i) 본 발명의 B1 또는 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체, 단편 또는 이의 유도체가 결합하거나 상호작용하는 다른 분자에 의해 직간접적으로 조절되는 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정 또는 임의 다른 세포내 신호 활성을 조절 또는 중재하는 방법; 이때 이 방법은 세포내로 도입하는데 적절한 형태로 상기 B1 단백질, 동소체, 유사체, 이의 단편 또는 유도체를 한 가지 이상 세포내로 도입시키거나 또는 서열을 운반하는데 적합한 벡터에 한 가지 이상의 B1 단백질, 동소체, 유사체, 이의 단편 또는 유도체를 기호화하는 DNA 서열을 세포내로 도입시키는 세포를 처리하고, 이때 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포에 서열을 효과적으로 도입시킬 수 있는 것이어야 한다.(i) the process of inflammation, cell death or cell survival or any other intracellular signal activity, directly or indirectly regulated by other molecules to which the B1 or B1 protein, its allotropes, analogs, fragments or derivatives thereof bind or interact with How to control or mediate; The method then employs one or more B1 proteins, allotropes, analogs, in a vector suitable for introducing one or more B1 proteins, allotropes, analogs, fragments or derivatives thereof into cells or for transporting sequences in a form suitable for introduction into cells. A cell which introduces a DNA sequence encoding a fragment or derivative thereof into the cell is processed, wherein the vector must be one capable of effectively introducing the sequence into the cell so that the sequence can be expressed in the cell.

(ii) 상기에서 언급한 방법에서, 세포를 처리하는 것은 서열을 운반하는 적합한 벡터의 형태로 상기 B1 단백질, 동소체, 단편, 유사체 또는 이의 유도체를 기호화하는 DNA 서열을 세포내로 도입시키는 것이고, 이때 벡터는 서열이 세포내에서 발현될 수 있도록 세포에 서열을 효과적으로 도입시킬 수 있는 것이어야 한다. (ii) In the above-mentioned method, processing the cell involves introducing into the cell a DNA sequence which encodes the B1 protein, allotrope, fragment, analog or derivative thereof in the form of a suitable vector carrying the sequence, wherein the vector Should be such that the sequence can be efficiently introduced into the cell so that the sequence can be expressed in the cell.

(iii) 상기에서 언급한 방법에서, 세포 처리는 다음으로 구성된 재조합 동물 바이러스 벡터를 세포에 감염시켜서 이루어지는데;(iii) in the above-mentioned method, the cell treatment is achieved by infecting a cell with a recombinant animal viral vector consisting of:

(a)처리될 세포의 표면에 있는 특정 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질(리간드)을 기호화하는 제1서열과 본 발명에 따른 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 제2서열을 가지는 재조합 동물 바이러스 벡터를 작제하고, 일단 세포에서 발현되면, 상기 B1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 및 이의 유도체가 직간접적으로 상호작용하는 다른 세포내 분자에 의해 조절/중개되는 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정의 활성을 직간접적으로 조절할 수 있고;(a) the first sequence encoding a viral surface protein (ligand) capable of binding to a specific cell surface receptor on the surface of the cell to be treated and the B1 protein according to the invention, an isotopic, analogue or fragment thereof and derivative thereof A recombinant animal viral vector having a second sequence is constructed and, once expressed in a cell, inflammation regulated / mediated by other intracellular molecules that directly or indirectly interact with the B1 protein, allotropes, analogs, fragments and derivatives thereof Can directly or indirectly regulate the activity of cell death or cell survival processes;

(b) (a)의 작제된 벡터를 세포에 감염시키는 것으로 구성된다.(b) infecting the constructed vector of (a) with a cell.

(iv) B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음 또는 세포 생존 과정을 조절하는 방법, 이때 이 방법은 상기에서 설명하는 것과 같이 항체, 활성 단편 또는 이의 유도체를 세포에 처리하고, 이때 처리하는 방법은 세포에 상기 항체, 활성 단편, 이의 유도체를 포함하는 적절한 조성물을 제공하는 것으로, 이때 B1 단백질 또는 이의 일부분이 세포 외면에 노출될 경우에, 조성물은 세포외 사용을 위한 것으로 조제하고, B1 단백질이 세포내에 있는 경우에는 조성물을 세포내 용도로 조제한다.(iv) a method of modulating the process of inflammation, cell death or cell survival in cells directly or indirectly regulated by B1, wherein the method treats the cells with an antibody, active fragment or derivative thereof as described above, wherein The method of treatment provides a cell with a suitable composition comprising said antibody, active fragment, derivative thereof, wherein when the B1 protein or portion thereof is exposed to the outer surface of the cell, the composition is prepared for extracellular use, If the B1 protein is intracellular, the composition is prepared for intracellular use.

(v) B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포의 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하는 방법에 있어서, 세포는 본 발명의 B1 단백질을 기호화하는 DNA 서열의 일부분에 대한 안티센스를 기호화하는 올리고누클레오티드 서열로 처리하고, 이때 올리고누클레오티드 서열은 B1 단백질의 발현을 차단할 수 있는 것을 특징으로 한다.(v) a method of modulating inflammation, cell death, cell survival, or other processes of a cell directly or indirectly regulated by B1, wherein the cell encodes an antisense to a portion of the DNA sequence encoding the B1 protein of the invention. Treatment with an oligonucleotide sequence, wherein the oligonucleotide sequence is characterized in that it can block the expression of the B1 protein.

(vi) 상기 방법에서, 올리고누클레오티드 서열은 상기 (ii)에서 언급한 바이러스를 통하여 세포에 도입시키는데, 이때 바이러스의 제 2 서열은 올리고누클레오티드 서열을 기호화한다.(vi) In the method, the oligonucleotide sequence is introduced into the cell through the virus mentioned in (ii), wherein the second sequence of the virus symbolizes the oligonucleotide sequence.

(vii) B1에 의해 직간접적으로 조절되는 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하는 방법에 있어서, 리보자임 과정을 이용하는 방법이 있는데 이는 본 발명의 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 세포 mRNA 서열과 상호작용할 수 있는 리보자임 서열을 기호화하는 벡터를 세포내에서 발현할 수 있는 형으로 세포내에 유입시키고, 이와 같은 라이소자임 서열이 세포에서 발현되면, 세포 mRNA 서열과 상호반응하여 mRNA를 절단하고, 세포에서 B1 단백질의 발현을 방해하게 된다.(vii) In a method of modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes directly or indirectly controlled by B1, there is a method using a ribozyme process, which is a B1 protein of the present invention, an allotrope, analog or fragment thereof and A vector encoding a ribozyme sequence that can interact with the cellular mRNA sequence that encodes the derivative is introduced into the cell in a form that can be expressed intracellularly, and when such a lysozyme sequence is expressed in the cell, it interacts with the cellular mRNA sequence. Thereby cleaving mRNA and disrupting the expression of the B1 protein in the cell.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단백질 존재하는 중간 도메인 또는 카이나제를 경유하여 세포내 신호 발생에 관여하는 프로도메인 또는 카스파제 모집 도메인(CARD) 또는 다른 단백질 또는 효소를 가지는 임의 단백질과 상동성이 있는 또는 직간접적으로 상호작용을 할 수 있는 단백질을 분리 및 확인하는 방법을 제공하는데, 이는 효모 이중-하이브리드 과정을 이용하는데, 이때 CARD, 카이나제, 중간 도메인 또는 이들 도메인중 일부와 상기 단백질을 기호화하는 서열은 한 개 하이브리드 벡터가 가지고 있으며, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 서열은 제 2 하이브리드 벡터가 가지고, 그 다음 벡터는 효모 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용하여, 양성적으로 형질전환된 세포만 분리하고, 제 2 하이브리드 벡터를 추출하여, 상기 CARD-, 카이나제- 또는 중간 도메인-을 포함하는 단백질에 결합하는 단백질을 기호화하는 서열을 얻을 수 있다.In another aspect, the invention relates to any protein having a prodomain or caspase recruitment domain (CARD) or other protein or enzyme involved in intracellular signal generation via an intermediate domain or kinase present in the protein of the invention. Provides a method for isolating and identifying proteins that can interact homologously or directly or indirectly, using a yeast dual-hybrid process, wherein CARD, kinase, intermediate domains or some of these domains are used. The sequence encoding the protein is possessed by one hybrid vector, the sequence of the cDNA or genomic DNA library is possessed by a second hybrid vector, and the vector is then used to transform the yeast host cell, thereby positively transforming it. Only the cells are isolated, and the second hybrid vector is extracted, and the CARD-, kinase- or It is possible to obtain a sequence that encoded a protein that binds to the protein comprising the-middle domain.

본 발명의 또 다른 특징에 있어서, B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하기 위한 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체 또는 이의 혼합물중 적어도 하나를 활성물질로 한다.In another aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition for modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes in cells that are directly or indirectly regulated by B1, wherein the pharmaceutical composition is a B1 protein, an allotrop thereof At least one of an analog or a fragment and a derivative or a mixture thereof is used as the active substance.

상기 제약학적 조성물의 구체예는 B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하기 위한 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하고, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 기호화하는 재조합 동물 바이러스를 활성물질로 한다.Embodiments of the pharmaceutical composition provide a pharmaceutical composition for modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes in cells that are directly or indirectly regulated by B1, wherein the pharmaceutical composition comprises a B1 protein, an allotrope thereof, Recombinant animal viruses which symbolize analogs or fragments and derivatives and encode proteins capable of binding to cell surface receptors are used as active substances.

상기 제약학적 조성물의 또 다른 구체예는 B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하기 위한 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 B1 단백질 mRNA 서열의 안티-센스 서열을 기호화하는 올리고누클레오티드 서열을 활성물질로 한다.Another embodiment of the pharmaceutical composition provides a pharmaceutical composition for modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes in cells that are directly or indirectly regulated by B1, wherein the pharmaceutical composition comprises a B1 protein mRNA sequence. The oligonucleotide sequence encoding the anti-sense sequence of is taken as an active substance.

상기 제약학적 조성물의 구체예는 B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하기 위한 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 B1 단백질 또는 이을 기호화하는 DNA 분자 또는 B1 단백질이 결합하는 또는 이와 상호작용하는 한 가지 이상의 분자와 B1 단백질의 상호작용을 직간접적으로 파괴시킬 수 있는 분자로 구성된다.Embodiments of the pharmaceutical composition provide a pharmaceutical composition for modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes in cells that are directly or indirectly regulated by B1, wherein the pharmaceutical composition is a B1 protein or One or more molecules to which a DNA molecule or B1 protein binds or interacts with a molecule that can directly or indirectly disrupt the interaction of the B1 protein.

상기 제약학적 조성물의 구체예는 B1에 의해 직간접적으로 조절되는 세포에서 염증, 세포 죽음, 세포 생존 또는 다른 과정을 조절하기 위한 제약학적 조성물을 제공하는데, 이때 제약학적 조성물은 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체 효과량 또는 이를 기호화하는 DNA 분자의 효과량 또는 B1 단백질, 동소체, 단편, 유사체 또는 유도체가 결합하는 한 가지 이상의 분자와 B1 단백질, 동소체, 단편, 유사체 또는 이의 유도체와의 상호작용을 직간접적으로 파괴할 수 있는 분자의 효과량으로 구성된다.Embodiments of the pharmaceutical composition provide a pharmaceutical composition for modulating inflammation, cell death, cell survival or other processes in cells that are directly or indirectly regulated by B1, wherein the pharmaceutical composition comprises a B1 protein, an allotrope thereof, Effective amounts of analogs or fragments and derivatives or effective amounts of DNA molecules that symbolize or interact with one or more molecules to which the B1 protein, allotrope, fragment, analog or derivative binds to the B1 protein, allotrope, fragment, analog or derivative thereof It consists of an effective amount of molecules that can destroy directly or indirectly.

상기 제약학적 조성물의 또 다른 구체예는 B1 단백질이 직간접적으로 결합하는 한 가지 이상의 분자에 의해 아팝토시스 조절과 연합된 병인학적 상태를 예방 또는 치료하는 것으로써, 조성물은 B1의 단백질 카이나제 활성을 간섭할 수 있는 분자로 구성된다.Another embodiment of the pharmaceutical composition is to prevent or treat a etiological condition associated with apoptosis regulation by one or more molecules to which the B1 protein binds directly or indirectly, wherein the composition is a protein kinase of B1. It consists of molecules that can interfere with activity.

본 발명의 또 다른 측면에서, 다음과 같은 치료요법적 방법을 제공한다;In another aspect of the invention, the following therapeutic methods are provided;

(i) B1 단백질이 직간접적으로 결합하는 한 가지 이상의 분자에 의해 아팝토시스 조절하는 것과 연합된 병인 상태의 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 치료를 요하는 환자에게 단백질, 동소체, 단편, 유사체 및 이의 유도체 및 이의 혼합물의 효과량 또는 이를 기호화하는 DNA 분자 또는 B1 단백질, 동소체, 단편, 유사체, 유도체 또는 이의 혼합물이 직간접적으로 결합할 수 있는 한 가지 이상의 분자와 B1 단백질 또는 동소체, 단편, 유사체 및 이의 유도체 또는 이의 혼합물과의 상호작용을 직간접적으로 방해할 수 있는 분자의 효과량을 제공하는 것으로 구성된다.(i) a method for the prevention or treatment of a etiological condition associated with the regulation of apoptosis by one or more molecules to which the B1 protein binds directly or indirectly, wherein the method comprises a protein, allotrope, fragment , An effective amount of an analog and derivatives thereof and mixtures thereof or DNA molecules or B1 proteins, allotropes, fragments, analogs, derivatives or mixtures thereof encoding the same, or one or more molecules and B1 proteins or allotropes, fragments thereof And providing effective amounts of molecules that can directly or indirectly interfere with interaction with analogs and derivatives or mixtures thereof.

(ii) B1 단백질이 직간접적으로 관여된 염증 과정, 아팝토시스 과정 또는 예정된 세포 죽음 과정(세포 죽음 경로)을 조절하는 방법에 있어서, 이때 방법은 한 가지 이상의 B1 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체로 세포를 처리하고, 세포의 처리는 세포에 도입하기에 적합한 형태의 B1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 또는 이의 유도체를 도입하거나 또는 서열을 운반하는데 적합한 벡터에 B1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체를 한 가지 이상 기호화하는 DNA 서열을 가지는 벡터를 도입시키고, 이때 벡터는 세포에서 상기 서열이 발현될 수 있도록 세포에 서열을 효과적으로 삽입시킬 수 있는 것이다.(ii) a method of modulating an inflammatory process, apoptosis process or a predetermined cell death process (cell death pathway) involving B1 protein directly or indirectly, wherein the method comprises one or more B1 allotropes, analogs, fragments or derivatives. The treatment of the cells, and the treatment of the cells, involves the introduction of the B1 protein, allotropes, analogs, fragments or derivatives thereof in a form suitable for introduction into the cells, or the B1 protein, allotropes, analogs, fragments or derivatives in a vector suitable for carrying the sequence. A vector having a DNA sequence encoding at least one symbol is introduced, wherein the vector is capable of effectively inserting the sequence into the cell so that the sequence can be expressed in the cell.

(iii) B1 단백질이 직간접적으로 관여된 세포 생존 과정을 조절하는 방법에 있어서, 이때 방법은 한 가지 이상의 B1 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체로 세포를 처리하는데, 세포의 처리는 세포에 도입하기에 적합한 형태의 B1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 또는 이의 유도체를 도입하거나 또는 서열을 운반하는데 적합한 벡터에 B1 단백질, 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체를 한 가지 이상 기호화하는 DNA 서열을 가지는 벡터를 도입시키고, 이때 벡터는 세포에서 상기 서열이 발현될 수 있도록 세포에 서열을 효과적으로 삽입시킬 수 있는 것이다.(iii) a method of regulating a cell survival process in which B1 protein is directly or indirectly involved, wherein the method treats the cell with one or more B1 allotropes, analogs, fragments or derivatives, wherein the treatment of the cell Introducing a vector having a DNA sequence encoding one or more B1 proteins, allotropes, analogs, fragments or derivatives into a vector suitable for carrying or incorporating the B1 protein, allotropes, analogs, fragments or derivatives thereof in a suitable form, In this case, the vector can effectively insert the sequence into the cell so that the sequence can be expressed in the cell.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 다음은 선별 방법 및, 다양한 리간드의 확인 및 생산하는 방법을 제공한다;In another aspect of the invention, the following provides a selection method and a method for identifying and producing various ligands;

(i) B1 단백질과 결합할 수 있는 리간드를 선별하는 방법에 있어서, 단백질이 부착된 친화력 크로마토그래피 매트릭스에 세포 추출물을 접촉시키고, 리간드는 매트릭스에 결합되고, 리간드를 용출시킨 후, 분리하고, 분석한다;(i) A method of selecting a ligand capable of binding to a B1 protein, wherein the cell extract is contacted with an affinity chromatography matrix to which the protein is attached, the ligand is bound to the matrix, the ligand is eluted, separated, and analyzed. do;

(ii) B1 단백질에 결합할 수 있는 리간드에 대한 DNA 서열을 선별하는 방법에 있어서, 효모 이중-하이브리드 과정을 이용하는데, 이때 B1 단백질을 기호화하는 서열은 한 개 하이브리드 벡터가 가지고 있으며, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 서열은 제 2 하이브리드 벡터가 가지고, 그 다음 벡터는 효모 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용하여, 양성적으로 형질전환된 세포만 분리하고, 제 2 하이브리드 벡터를 추출하여, 상기 리간드를 기호화하는 서열을 얻을 수 있다.(ii) A method for selecting DNA sequences for ligands that can bind to B1 protein, using a yeast double-hybrid process, wherein the sequence encoding the B1 protein is possessed by one hybrid vector, cDNA or genome The sequence of the DNA library is possessed by a second hybrid vector, and the vector is then used to transform the yeast host cell to isolate only the positively transformed cells, and extract the second hybrid vector to symbolize the ligand. The sequence can be obtained.

(iii) B1에 의해 중개되는 세포 활성을 조절하는 리간드를 확인하고 생산하는 방법에 있어서;(iii) identifying and producing a ligand that modulates cellular activity mediated by B1;

a) 도 3에 나타낸 B1 아미노산 서열(기본적으로는 B1의 프로도메인(CRAD)은 모두 포함)의 적어도 일부분으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 선별하고;a) selecting a ligand capable of binding to a polypeptide consisting of at least a portion of the B1 amino acid sequence shown in FIG. 3 (basically including all of the B1 prodomain (CRAD));

b) 선별 단계에서 결합할 수 있는 것으로 발견된 TNF/NGF 수용체족의 수용체 일부의 리간드, BCL2, TRAF2 또는 다른 수용체의 일부를 제외한 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;b) identifying and characterizing ligands excluding BCL2, TRAF2 or other ligands of a portion of the receptors of the TNF / NGF family of receptors found to be able to bind in the selection step;

c) 실제 분리된 형으로 리간드를 만들고 정제한다.c) Ligands are purified in actual isolated form.

(iv) B1에 의해 중개되는 또는 조절되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하고 생산하는 방법에 있어서;(iv) identifying and producing a ligand capable of modulating cellular activity mediated or regulated by B1;

a) 도 3에 나타낸 프로도메인(CARD)을 포함하는 B1 서열의 적어도 C-말단으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 선별하고;a) selecting a ligand capable of binding to a polypeptide consisting of at least the C-terminus of the B1 sequence comprising the prodomain (CARD) shown in FIG. 3;

b) 선별 단계에서 결합할 수 있는 것으로 발견된 TNF/NGF 수용체족의 수용체 일부의 리간드, BCL2, TRAF2 또는 다른 수용체의 일부를 제외한 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;b) identifying and characterizing ligands excluding BCL2, TRAF2 or other ligands of a portion of the receptors of the TNF / NGF family of receptors found to be able to bind in the selection step;

c) 실제 분리된 형으로 리간드를 만들고 정제한다. c) Ligands are purified in actual isolated form.

(v) B1에 의해 중개되는 또는 조절되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하고 생산하는 방법에 있어서;(v) identifying and producing a ligand capable of modulating cellular activity mediated or regulated by B1;

a) 도 3에 나타낸 B1의 모든 카이나제 도메인을 실제 포함하는 B1 서열의 적어도 N-말단 부분으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 선별하고;a) selecting a ligand capable of binding to a polypeptide consisting of at least an N-terminal portion of the B1 sequence that actually comprises all of the kinase domains of B1 shown in FIG. 3;

b) 선별 단계에서 결합할 수 있는 것으로 발견된 TNF/NGF 수용체족의 수용체 일부의 리간드, BCL2, TRAF2 또는 다른 수용체의 일부를 제외한 리간드를 확인하고 특징을 조사하고;b) identifying and characterizing ligands excluding BCL2, TRAF2 or other ligands of a portion of the receptors of the TNF / NGF family of receptors found to be able to bind in the selection step;

c) 실제 분리된 형으로 리간드를 만들고 정제한다. c) Ligands are purified in actual isolated form.

vi) B1에 의해 중개되는 또는 조절되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하고 생산하는 방법에 있어서;vi) a method for identifying and producing a ligand capable of modulating cellular activity mediated or regulated by B1;

a) B1에 의해 중개되는 활성을 조절할 수 있는 분자를 선별하고;a) selecting molecules capable of modulating the activity mediated by B1;

b) 이 분자를 확인하고 특징을 조사하고;b) identifying and characterizing this molecule;

c) 실제 분리된 형으로 리간드를 만들고 정제한다. c) Ligands are purified in actual isolated form.

v) 본 발명의 단백질에 의해 중개되는 또는 조절되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하고 생산하는 방법에 있어서;v) identifying and producing ligands capable of modulating cellular activity mediated or regulated by the proteins of the invention;

a) 본 발명의 단백질에 의해 중개되는 활성을 조절할 수 있는 분자를 선별하고;a) selecting molecules capable of modulating the activity mediated by the proteins of the invention;

b) 이 분자를 확인하고 특징을 조사하고;b) identifying and characterizing this molecule;

c) 실제 분리된 형으로 리간드를 만들고 정제한다. c) Ligands are purified in actual isolated form.

본 발명의 다른 특징은 다음의 발명의 상세한 설명에서 제시될 것이다.Other features of the invention will be presented in the following detailed description of the invention.

도 1은 TRAF2 분자의 구조를 도면으로 설명하는 것이다.1 illustrates the structure of TRAF2 molecules in a diagram.

도 2는 염증, 세포 죽음 및 세포 생존(NF-kB 활성화) 과정에 관계하는 단백질의 일부를 설명하는 다이아그램이다.2 is a diagram illustrating some of the proteins involved in the process of inflammation, cell death and cell survival (NF-kB activation).

도 3(A,B)에서는 본 발명의 B1 단백질의 유추된 아미노산 서열(A) 및 이를 기호화하는 결정된 누클레오티드 서열(B)을 나타내는 것이고, 이때 아미노산 서열에서는 B1의 카이나제 도메인(N-말단 말단에 박스 부분) 및 B1의 CARD 도메인(C-말단에 있는 밑줄 친 부분)을 나타낸다.3 (A, B) shows the inferred amino acid sequence (A) of the B1 protein of the present invention and the determined nucleotide sequence (B) symbolizing the same, wherein in the amino acid sequence, the kinase domain (N-terminal end) of B1 Box portion) and the CARD domain of B1 (underlined portion at the C-terminus).

도 4는 다른 사람 조직에서 B1 발현의 노던 분석을 나타내는 것으로, 대부분 사람 조직 타입에서 B1이 발현된다는 것을 나타내고; 4 shows a northern analysis of B1 expression in other human tissues, indicating that B1 is expressed in most human tissue types;

도 5는 NF-_KB 활성, 세포 죽음 가능성 및 JNK 활성에 대해 다른 B1 구조체를 나타낸 것이다.5 shows different B1 structures for NF- _K B activity, cell death potential and JNK activity.

도 6은 도 6 및 실시예 3의 다른 구조체로 실시한 NF-kB 활성화 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the NF-kB activation results performed with the other structures of Figure 6 and Example 3.

도 7은 상기 구조체의 일부에서 실행한 JNK1 활성화 결과를 나타낸 것이다.7 shows the results of JNK1 activation performed on part of the construct.

도 8은 B1이 TRAF1에 자체 연합하여, in vivo에서 결합한다는 것을 보여준다.8 shows that B1 self-associates with TRAF1 and binds in vivo .

본 발명은 프로도메인 또는 CARD 도메인(카스파제 모집 도메인)을 가지고, RIP-카이나제 도메인에 유사한 단백질 카이나제 도메인을 가지는 신규한B1 단백질에 관계한다. 본 발명의 B1 단백질은 염증, 세포 죽음(아팝토시스), 세포 생존(NF-_KB 활성화) 경로에 관계하는 다수의 세포내 단백질과 상호작용할 수 있을 가능성이 dLT다. 이와 같은 상호작용은 다양한 단백질에 결합되어 또는 프로도메인(CARD)를 통하여 이들 단백질과 상호작용을 하거나, 카이나제 도메인의 활성을 통하여 또는 동시에 이와 같은 여러 가지 타입의 상호작용이 일어날 수 있을 것이다. 예를 들면, B1은 프로도메인(CARD)을 가지는 다수의 단백질을 모집하고, 그 다음 이의 카이나제 도메인을 통하여 이들을 인산화한다. 유사하게, B1은 일부 경우에 다양한 다른 프로도메인을 포함하는 단백질에 대해 이의 프로도메인(CARD)을 통하여 도킹 또는 모집 단백질로 작용하고, B1의 카이나제 도메인에 대한 기질이 아닐 수도 있고, B1은 CARD 도메인이 아닌 카이나제 도메인을 통하여서만 다양한 단백질과 상호작용을 한다.The present invention relates to a novel B1 protein having a prodomain or CARD domain (a caspase recruitment domain) and a protein kinase domain similar to the RIP-kinase domain. The B1 protein of the invention is likely dLT capable of interacting with a number of intracellular proteins involved in the pathways of inflammation, cell death (apoptosis), cell survival (NF- _K B activation). Such interactions may be coupled to various proteins or interact with these proteins through a CARD or various types of such interactions may occur at the same time or through the activity of a kinase domain. For example, B1 recruits a number of proteins with prodomains (CARDs) and then phosphorylates them through its kinase domain. Similarly, B1 acts as a docking or recruiting protein through its prodomain (CARD) to a protein containing various other prodomains in some cases, and may not be a substrate for the kinase domain of B1, and B1 It interacts with various proteins only through the kinase domain, not the CARD domain.

여기에 상세히 설명된 것과 같이 또한, 결합 분석 결과는 본 발명의 신규한 B1단백질이 BCL2 단백질에 결합할 수 있는 가능성을 제시한다. 이런 발견은 B1단백질이 BCL2 활성의 제어자, 특히 아팝토시스의 제어에 관한 가능성을 제기한다. 초기의 생물학적 활성 분석에서 또한, B1단백질이 아팝토시스에 대한 BCL2의 예방효과를 억제할 가능성이 제기되고 있다. 이것은 B1단백질 그 자체가 세포 사멸을 야기하지는 않지만 , FAS-R, p55 TNF-R 그리고 RIP(B1, FAS-R, p55 TNF-R 또는 RIP 세포에서 발현할 수 있는 운반체로 공동-형질전환된 세포에 대한 상기 부가, 아래 실시예2)와 같은 다른 세포 사멸 유도물질과 함께 세포에 부가될 때, 세포 사멸을 강화하는 역할을 한다는 관찰 견해이다. 그래서, B1이 BAX나 BAK에 동일한 방식으로 작용하지 않을 수도 있다는 가능성이 제기된다. 이것들은 그자신 동일 이합체의 형태로 세포사멸을 야기할 수 있다(위의 배경부분을 참고), 그러나 B1은 아마도 BAD에 동일한 방식으로 작용할 수도 있는데 이것은 BCL2에 결합하거나 BAX 또는 BAK에 대한 결합을 방해함으로써 BCL2를 음성적으로 제어하는 역할을 해 더 자유로운 BAX와 BAK를 야기하고 교대로 이것이 증가된 세포사멸을 야기한다. (위의 배경 부분을 참고). As described in detail herein, the results of the binding assay also reveal the possibility that the novel B1 protein of the present invention can bind to the BCL2 protein. This finding raises the possibility that the B1 protein is involved in the control of BCL2 activity, in particular apoptosis. Early biological activity assays also raise the possibility that the B1 protein inhibits the prophylactic effect of BCL2 on apoptosis. This does not cause B1 protein itself to cause cell death, but cells co-transformed into a carrier capable of expressing FAS-R, p55 TNF-R and RIP (B1, FAS-R, p55 TNF-R or RIP cells). It is an observational view that the addition to the above, when added to the cell together with other cell death inducers such as Example 2 below, enhances cell death. Thus, the possibility arises that B1 may not act in the same way on BAX or BAK. These can cause apoptosis in the form of the same dimers themselves (see background above), but B1 may also act in the same way on BAD, which binds to BCL2 or interferes with binding to BAX or BAK. Thereby negatively controlling BCL2, leading to more free BAX and BAK, which in turn causes increased cell death. (See background section above).

게다가, 위에서 밝힌 NF-_KB의 활성과 세포 생존에 관하여, B1은 또한 NF-_KB 활성화의 감소를 통해 B1 카이나제 활성을 야기하는 방식으로 세포 사멸을 강화하는 관찰된 활성을 획득할 수도 있는데, B1의 이런 카이나제 활성이 NF-_KB의 활성의 유도를 위해 필요한 다양한 단백질(예, NIK)을 조정하는 역할을 할 수 있다. 이 결과로 축소된 NF-κB 활성이 일어날 것이고, 연이어 세포 생존이 감소할 것이다. 이런 측면에서 B1이 FAS-R, p55 TNF-R 또는 RIP와 같은 세포 사멸 유도물질과 합해질 때 이로 인해 그들의 세포 사멸 활성이 증가한다는 것은 흥미롭다. p55 TNF-R와 FAS-R 그리고 아마도 RIP 역시 증가된 카스파제 활성으로 절정을 이루는 세포사멸 경로를 유도하는 것을 제외하고는 NF-_KB의 활성을 유도하는데, 이것은 유도된 세포 사멸을 어느 정도 상쇄한다. 약간의 세포에서는 TNF가 세포를 죽이지 않는데, 이것은 TNF 수용체에 의한 NF-_KB 활성의 유도에 기인한 것이지 이들 수용체에 의한 공동-유도된 세포 사멸 경로의 실패에 기인한 것은 아니다는 것이 관찰되고 있다. 그래서 이들 세포에서는 NF-_KB 매개의 세포 생존 경로가 분명히 세포 사멸 경로보다 더 활성을 띤다. 그래서, NF-_KB 유도를 봉쇄함으로써 FAS-R, p55 TNF, RIP 매개의 세포 사멸을 강화하는 것이 가능해 질 것이다, 그리고 본 발명의 B1 단백질도 이런 역할을 수행해 FAS-R, p55-TNF-R 또는 RIP과 합쳐졌을 때 세포 사멸을 강화할 수 있을 것이다.In addition, with respect to NF- _K B activity and cell survival as set forth above, B1 may also acquire the observed activity of enhancing cell death in a manner that results in B1 kinase activity through a decrease in NF- _K B activation. This kinase activity of B1 may serve to modulate various proteins (eg NIK) required for the induction of NF- _K B activity. As a result, reduced NF-κB activity will occur, followed by decreased cell survival. In this respect it is interesting that when B1 is combined with apoptosis inducers such as FAS-R, p55 TNF-R or RIP, this increases their apoptosis activity. p55 TNF-R and FAS-R and possibly RIP also induce NF- _K B activity, except that it induces apoptosis pathways climax with increased caspase activity, which somewhat offsets induced cell death. do. In some cells, it has been observed that TNF does not kill cells, which is due to the induction of NF- _K B activity by TNF receptors and not the failure of co-induced cell death pathways by these receptors. . Thus, in these cells, NF- _K B -mediated cell survival pathways are clearly more active than cell death pathways. Thus, by blocking NF- _K B induction, it will be possible to enhance FAS-R, p55 TNF, RIP mediated cell death, and the B1 protein of the present invention also plays a role such as FAS-R, p55-TNF-R Or when combined with RIP may enhance cell death.

위의 견해에서, B1이 염증, 세포 사멸 또는 세포 생존 경로를 다양한 방식으로 제어하고 심지어 동시에 제어하는 것도 가능할 수 있다는 것이 제시된다. B1은 NF-_KB 활성을 억제하거나, 심지어 세포 사멸이나 또는 세포 생존 경로에 관련된 다른 세포내 단백질에 NF-_KB 의 효과에 독립적으로 또는 부가하여 작용할 수 있다.In view of the above, it is suggested that B1 may be able to control and even simultaneously control inflammation, cell death or cell survival pathways in various ways. B1 may act to inhibit NF- _K B activity or even independently or in addition to the effect of NF- _K B on other intracellular proteins involved in cell death or cell survival pathways.

그래서, B1은 광범위한 세포내 단백질, 특히, 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로에 관여하는 것들을 조절하는 능력을 가지고 있는 것으로 보인다. 아래에 상세히 설명되어 있는 것과 같이, 많은 공지된 세포내 단백질은 프로도메인(CARD)을 가지고 있으며, RAIDD, c-IAP1, c-IAP2 그리고 다른 것들을 포함한 세포 사멸 경로에 관여하는 다양한 어댑터일 뿐만 아니라 ICE, ICH-1, Mch6과 다른 것들을 포함한 세포의 단백 분해 파괴(세포 사멸 경로)에 관여하는 다양한 카스파제 효소들이기도 하다. 이런 방식으로 B1은 다양한 카스파제와 그들과의 공통된 CARD를 통하여 직간접적으로 결합하고 그래서 그들 활동을 조절할 수 있다. 이런 조절은 양성이다, 즉, B1은 다양한 카스파제를 집중시켜 그들의 단백분해 활성을 강화해 증가된 세포 사멸을 야기하는 역할을 할 수 있다. 또한, B1은 c-IAP1의 서열을 이용해 분리되었기 때문에 아팝토시스 억제물질인 c-IAP1와 상동성을 가진다. c-IAP1은 프로도메인(CARD)을 가지며 카스파제를 이용한 아팝토시스 억제를 통해 이들의 활성을 예방할 수 있다. B1은, 그런 이유로, c-IAP1와 직간접적으로 상호작용해 이것의 아팝토시스 억제를 억눌러 증가된 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 게다가, B1은 자신의 CARD를 통한 다양한 카스파제와의 직간접적 상호작용을 통해 이들을 카이나제 도메인을 통한 인산화시켜 조절할 수 있다, 그리고 이런 식으로 B1은 카스파제 활성을 증가시킬 것이다.Thus, B1 appears to have the ability to regulate a wide range of intracellular proteins, especially those involved in inflammation, cell death and cell survival pathways. As detailed below, many known intracellular proteins have prodomains (CARDs) and are not only diverse adapters involved in cell death pathways, including RAIDD, c-IAP1, c-IAP2, and others, but also ICE. It is also a variety of caspase enzymes involved in the proteolytic destruction (cell death pathway) of cells, including ICH-1, Mch6 and others. In this way, B1 can be combined directly or indirectly through various caspases and their common CARD and thus regulate their activity. This regulation is positive, ie B1 can play a role in concentrating various caspases to enhance their proteolytic activity resulting in increased cell death. In addition, since B1 was isolated using the sequence of c-IAP1, it has homology with c-IAP1, an apoptosis inhibitor. c-IAP1 has a prodomain (CARD) and can prevent their activity through the inhibition of apoptosis using caspase. For that reason, B1 can interact directly or indirectly with c-IAP1 to suppress its apoptosis inhibition, resulting in increased cell death. In addition, B1 can be regulated by phosphorylating them through the kinase domain through direct or indirect interactions with various caspases through its CARD, and in this way B1 will increase caspase activity.

좀더 간접적인 방식으로, B1은 RAIDD, c-IAP1, c-IAP2 그리고 CARD를 가진 다른 것들과 같은 어뎁터와 직간접적으로 상호작용함으로써 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로내 좀더 상류 단백질과 상호작용할 수 있다. 예를 들면, RAIDD는 RIP와 TRADD와 같은 세포내 단백질과 공통 사멸 도메인을 통해 상호 작용하고 이것들이 차례로 MORT-1, p55-TNF-R 그리고 FAS-R과 같은 단백질과 상호작용한다. 이런 방식으로, B1은 RAIDD와 상호작용을 통해 아마도 이들 사멸-효과 수용체와 단백질에 간접적으로 연결될 수 있다. 유사하게, c-IAP1와 c-IAP2는 TRAF2 단백질과 상호작용하고 이것이 차례로 p75-TNF-R과 상호작용하고 MORT-1, p55-TNF-R 그리고 FAS-R과 TRADD뿐만 아니라 TRAF2와 RIP사이에서도 이런 상호 작용을 통해서 상호 작용할 수 있다. 따라서, B1은 전술된 어댑터 단백질, 효과 단백질 그리고 수용체에 간접적으로 연결되어 세포 사멸 과정을 간접적으로 조절할 수 있다. 이런 간접적 조절은 아마도 양성일 것이다, 즉, 이것은 강화된 세포 사멸을 야기할 수 있다.In a more indirect manner, B1 can interact with upstream proteins in inflammation, cell death and cell survival pathways by directly or indirectly interacting with adapters such as RAIDD, c-IAP1, c-IAP2 and others with CARD. . For example, RAIDD interacts with intracellular proteins such as RIP and TRADD through a common killing domain, which in turn interact with proteins such as MORT-1, p55-TNF-R and FAS-R. In this way, B1 may be indirectly linked to these kill-effect receptors and proteins, possibly through interaction with RAIDD. Similarly, c-IAP1 and c-IAP2 interact with the TRAF2 protein, which in turn interacts with p75-TNF-R and not only between MORT-1, p55-TNF-R and FAS-R and TRADD, but also between TRAF2 and RIP. You can interact through this interaction. Thus, B1 can be indirectly linked to the aforementioned adapter proteins, effect proteins and receptors to indirectly regulate the cell death process. This indirect regulation is probably positive, ie it can cause enhanced cell death.

또한, B1이 TRAF2와 적어도 간접적(c-IAP1을 통해)으로 연결됨으로써 이것이 NF-_KB의 유도와 관련된 세포 생존 경로에도 관여할 가능성이 제기된다. TRAF2가 NIK에 직접적으로 결합하는지는 알려지지 않고 있는데(Malinin et al., 1997) 여기서 NIK는 직접적으로 NF-_KB의 활성과 이로 인한 세포 생존의 유도에 관계한다. 따라서, TRAF2를 간접적으로 조절함으로써, B1은 또한 세포 생존도 조절할 수 있다. 또한, B1은 자신의 카이나제 도메인을 통해서 MAP 카이나제 경로(NIK가 일부를 이루고 있다)에 훨씬 더 직접적으로 관여해 NF-_KB 활성의 유도와 세포 생존을 야기한다. 하지만 위에서 언급되었듯이, B1이 세포 사멸을 강화한다는 사실에 비추어, B1은 세포 생존 과정의 조절에 부정적 역할을 할 것이다, 즉, B1은 TRAF2를 조절하거나 또는 NF-_KB 활성을 야기하는 방식으로 MAP카이나제 경로에 관계할 것이다.In addition, the linkage of B1 to TRAF2 at least indirectly (via c-IAP1) raises the possibility that it is also involved in cell survival pathways associated with the induction of NF- _K B. It is not known whether TRAF2 binds directly to NIK (Malinin et al., 1997), where NIK is directly involved in the activity of NF- _K B and thereby induction of cell survival. Thus, by indirectly regulating TRAF2, B1 can also regulate cell survival. In addition, B1 is much more directly involved in the MAP kinase pathway (which is part of NIK) through its kinase domain, leading to induction of NF- _K B activity and cell survival. However, as mentioned above, in the light of the fact that B1 enhances cell death, B1 will play a negative role in the regulation of cell survival processes, ie, B1 regulates TRAF2 or induces NF- _K B activity. It will be related to the MAP kinase pathway.

B1은 세포내 신호전달 경로, 특히, 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로의 조절에 중요한 역할을 할 수도 있다, 그리고 이와 같이 B1은 세포 생존에서 세포사멸 유도로 균형을 이동시키는 방식으로 이들을 조절하는 역할을 하는데 이것은 B1이 세포사멸 유도에 대해 가진 관찰된 강화효과(구체예2)와 일치한다. B1은 그래서 직간접적으로 이들 경로를 구성하는 다양한 성분 단백질에 대한 세포내 신호전달 활동의 조절자로 간주된다.B1 may play an important role in the regulation of intracellular signaling pathways, in particular inflammation, apoptosis and cell survival pathways, and thus B1 regulates them by shifting the balance from cell survival to induction of apoptosis. This is consistent with the observed potentiating effect of B1 on induction of apoptosis (Example 2). B1 is thus considered a regulator of intracellular signaling activity for the various component proteins that make up these pathways, directly or indirectly.

그래서, 제약학적으로 B1의 다양한 사용을 고려할 때, 모든 경우에서 B1이 다중적 역할, 즉, 세포 사멸 과정을 강화할 수 있고 동시에 능동적으로 NF-_KB 유도를 억제해 세포 생존 경로를 억제하거나, 또는 B1 결합하는 실제적 단백질/효소나 세포내 이들의 상대적 양에 따라, 어떤 세포에서는 세포 생존 경로를 억제하고 또 다른 세포에서는 세포 사멸 억제물질을 억압함으로써 세포 사멸 경로를 강화하는 역할을 할 수 있다는 것을 이해하는 것이 중요하다.Thus, given the various uses of B1 pharmacologically, in all cases B1 can enhance the multiple role, i.e., apoptosis process and at the same time actively inhibit NF- _K B induction to inhibit cell survival pathways, or Depending on the actual protein / enzyme binding to B1 or their relative amount in the cell, it is understood that in some cells it may play a role in strengthening the cell death pathway by inhibiting cell survival pathways and in others suppressing cell death inhibitors. It is important to do.

그런 까닭에, 일반적으로, 다음에서 제기되는 것과 같이, 증가된 세포 사멸이 바람직할 때(예, 종양, HIV-감염 세포등에서), 이런 목적을 성취하기 위하여 B1을 사용하는 것이 가능하다. 가령, B1이 세포에 직접적으로 투여되거나 또는 이것을 기호화한 DNA 분자를 세포내에 유도하여 B1발현을 증가시킬 수도 있다. Therefore, in general, when increased cell death is desired (eg in tumors, HIV-infected cells, etc.), as raised below, it is possible to use B1 to achieve this goal. For example, B1 may be administered directly to a cell, or the DNA molecule encoding the symbol may be induced intracellularly to increase B1 expression.

유사하게, TNF 또는 FAS-리간드에 의해 유도된 세포 사멸, 예를 들면, 다양한 염증, 자가면역 질병, 이식편-대-숙주반응들로부터 세포를 구하고 대신 세포 생존을 촉진하는 것이 바람직한 상황에서, B1 길항물질이 아마도 이런 목적을 성취하기 위하여 사용될 것이다. 예를 들면, 항-B1 항체, 항-과민 B1 서열을 가진 올리고누클레오티드, B1 서열을 가진 리보효소, 또는 B1 활성을 억제하도록 고안된 다양한 펩티드와 유기분자들과 같은 B1 길항물질이 투여될 수 있다.Similarly, in situations where it is desirable to obtain cells from TNF or FAS-ligand induced cell death, eg, various inflammations, autoimmune diseases, graft-versus-host reactions and instead promote cell survival, B1 antagonism Matter will probably be used to accomplish this purpose. For example, B1 antagonists can be administered, such as anti-B1 antibodies, oligonucleotides with anti-hypersensitive B1 sequences, ribosomes with B1 sequences, or various peptides and organic molecules designed to inhibit B1 activity.

그래서, B1의 사용이 이하에서 언급될 때, 이들은 다양한 세포내 과정이나 질병에 대한 B1의 조절 효과의 측면에서 진술될 것이다, 그리고 이런 조절이 세포사멸 경로를 고려할 경우에는 긍적적이고 세포 생존 경로를 고려할 경우에는 부정적이다라는 전술된 측면에서 이해되어야 한다.Thus, when the use of B1 is mentioned below, they will be stated in terms of the regulatory effect of B1 on various intracellular processes or diseases, and if such regulation is considered apoptosis pathways, it will be positive and take into account cell survival pathways. It should be understood from the above-mentioned aspect that the case is negative.

본 발명은 생물학적으로 활성화된 유사체, 단편과 유도체 그리고 B1 단백질, 유사체, DNA 서열에 의해 기호화된 단백질의 단편과 유도체를 기호화하는 DNA뿐만 아니라 생물학적으로 활성화된 B1을 기호화한 DNA 서열에 관계한다. 이와 같은 유사체, 단편, 유도체를 만드는 것은 표준 과정을 참고로 하는데(실시예 참고; Sambrook, 1989), DNA 인인코딩 서열에서, 하나이상의 코돈을 제거하거나 또는 추가하거나 다른 코돈으로 치환하여 고유 단백질에 비해 적어도 하나의 아미노산 잔기가 변화가 된 기호화된 유사체를 만든다. 수용 가능한 유사체는 어떤 다른 결합이나 효소 활성을 중재하거나 또는 하지않고, 다시 말하면, 직간접적으로 추가 하류 단백질이나 다른 요소에 결합하거나 상호작용하지 않고 또는 단일 의존 반응을 촉매하지 않고(예, 카이나제 반응) 적어도 프로도메인(CARD)이나 B1의 카이나제 또는 이들 도메인의 둘 또는 어느 하나의 적어도 활성 부분을 보유한 것들이다. 이와 같은 방식으로 소위 도메인-네가티브 효과를 가지는 유사체가 생산되는데, 즉, 유사체는 프로도메인을 통하여 다른 단백질과 결합하는 능력이 부족하거나 이와 같은 결합이 있는 후에 연속한 신호발생 능력이 없는 것이다. 이와 같은 유사체는 천연 B1 단백질과 경쟁함으로써 전술한 것과 같이 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로를 조절하는데 이용된다. 유사하게, 소위 도미넌트-포지티브 유사체는 B1 효과를 강화시키는 작용을 하기 위해 생산한다. 이들은 다른 단백질에 대한B1 관련 결합 성질과 동일한 또는 더욱 우수한 성질을 가질 수 있고 천연 B1 단백질의 신호발생 성질과 카이나제 활성의 동일한 또는 더 우수한 성질을 가진다. 유사한 방식으로 본 발명의 클론의 생물학적으로 활성이 있는 단편을 유사체를 만드는 전술한 방법에 따라 만들 수 있다. 본 발명의 DNA 서열의 적절한 단편은 다른 단백질에 대한 B1 결합 능력을 보유한 단백질 또는 폴리펩티드를 기호화하는 것이거나 전술한 임의 다른 결합 또는 효소 활성을 중개하는 단백질 또는 폴리펩티드를 기호화하는 것이다. 따라서, 본 발명의 기호화된 단백질 단편은 유사체에 대해 전술한 것과 같이 도미넌트-네가티브 또는 도미넌트-포지티브 효과를 가지도록 만든다. 유사하게, 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편의 하나이상의 아미노산 잔기의 곁사슬을 변형시켜 유도체를 만들거나 또는 항체, 효소, 수용체등과 같은 다른 분자에 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편을 공액시켜 만드는 것은 본 기술 분야에 공지되어 있다.The present invention relates to biologically activated analogs, fragments and derivatives and DNA sequences encoding biologically activated B1 as well as DNAs encoding fragments and derivatives of B1 proteins, analogs and proteins encoded by DNA sequences. The preparation of such analogs, fragments, and derivatives refers to standard procedures (see Examples; Sambrook, 1989), in which the DNA encoding sequence removes, adds, or substitutes one or more codons for the native protein. At least one amino acid residue creates a modified analogue. Acceptable analogs do not mediate or otherwise mediate any other binding or enzymatic activity, that is, do not directly or indirectly bind or interact with additional downstream proteins or other elements or catalyze a single dependent reaction (eg, kinase Response) at least the prodomain (CARD) or the kinase of B1 or those having at least the active portion of two or either of these domains. In this way analogs with so-called domain-negative effects are produced, ie the analogs lack the ability to bind other proteins through the prodomain or lack continuous signaling after such binding. Such analogs are used to regulate inflammation, apoptosis and cell survival pathways as described above by competing with native B1 proteins. Similarly, so-called dominant-positive analogs are produced to act to enhance the B1 effect. They may have the same or better properties than B1 related binding properties to other proteins and have the same or better properties of signaling and kinase activity of native B1 proteins. In a similar manner biologically active fragments of the clones of the invention can be made according to the methods described above for making analogs. Suitable fragments of the DNA sequences of the present invention are those that symbolize a protein or polypeptide that possesses the B1 binding ability to another protein or which encode a protein or polypeptide that mediates any of the other binding or enzymatic activities described above. Thus, the symbolized protein fragments of the present invention are made to have a dominant-negative or dominant-positive effect as described above for analogues. Similarly, modifying the side chains of one or more amino acid residues of a protein, its allotropes, analogs or fragments to make derivatives or by conjugating the protein, its allotropes, analogs or fragments to other molecules such as antibodies, enzymes, receptors, etc. Known in the art.

B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 본 발명의 상기 DNA 서열중에서 고유 B1 단백질의 코딩 부분으로부터 유도된 cDNA 서열과 하이브리드할 수 있는 DNA 서열도 포함되는데 이와 같은 하이브리드반응은 약간 엄격한 조건하에서 실행하고 이와 같은 하이브리드할 수 있는 DNA 서열은 생물학적으로 활성이 있는 B1 단백질을 기호화한다. 따라서, 이와 같은 하이브리드가능한 DNA 서열에는 고유 B1의 cDNA 서열에 상대적으로 균질성이 큰 DNA 서열을 포함하고, 이는 다양한 B1 단백질 동소체가 될 수 있는 B1 단백질 유사 서열이 되거나 또는 B1 단백질의 활성을 가지는 단백질을 기호화하는 B1 단백질 유사 서열 그룹에 속하는 단백질을 기호화하는 자연 발생 서열이 된다 또한, 이들 서열에는 자연상태에서는 발생되지 않는 합성에 의해 만들어지는 서열을 포함하는데 이는 고유 B1 단백질 cDNA 서열과는 유사하나 다수의 원하는 변형을 포함하는 것이다. 이와 같은 합성 서열에는 B1 단백질의 활성을 가지는 B1 단백질 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 모든 가능성이 있는 서열을 포함한다.Also included in the DNA sequence of the present invention for encoding B1 protein, its allotropes, analogs or fragments and derivatives are DNA sequences capable of hybridizing with cDNA sequences derived from the coding portion of the native B1 protein. This hybridizable DNA sequence, which runs underneath and encodes a biologically active B1 protein. Thus, such hybridizable DNA sequences include DNA sequences that are relatively homogeneous to the cDNA sequence of native B1, which may be proteins that have a B1 protein-like sequence that can be a variety of B1 protein allotropes or that have a B1 protein activity. Being a naturally occurring sequence that encodes a protein belonging to a group of symbolic B1 protein-like sequences, these sequences also include sequences produced by synthesis that do not occur in nature, similar to native B1 protein cDNA sequences but It includes the desired variant. Such synthetic sequences include all possible sequences that symbolize B1 protein allotropes, analogs or fragments and derivatives having the activity of the B1 protein.

자연 발생 B1 단백질과 유사한 서열을 얻기 위해서는 다양한 조직으로부터 자연적으로 유도된 DNA 또는 RNA 샘플을 선별하고 분리하는 표준 과정에 따라 천연 B1 단백질 cDNA 또는 이의 일부분을 프로브로 이용한다(가령, Sambrook et al., 1989에 제시한 표준 공정).To obtain sequences similar to naturally occurring B1 proteins, native B1 protein cDNA or portions thereof are used as probes according to standard procedures for selecting and isolating naturally derived DNA or RNA samples from various tissues (eg, Sambrook et al., 1989). Standard process presented in).

유사하게, B1 단백질의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 다양한 합성 B1 단백질 유사 서열을 만들기 위해, 이와 같은 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 만드는 것과 관계가 있는 표준 공정을 여러 가지 이용하는데 하기에서 상술하고 있다.Similarly, to make a variety of synthetic B1 protein analogous sequences that symbolize allotropes, analogs or fragments and derivatives of the B1 protein, the following uses a variety of standard processes that are involved in making such allotropes, analogs or fragments and derivatives. It is mentioned above.

B1 단백질에 "실제 상응하는" 단백질 또는 폴리펩티드에는 B1 단백질 또는 B1 유사체인 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.Proteins or polypeptides "actually corresponding" to the B1 protein include polypeptides or proteins that are B1 proteins or B1 analogs.

B1 단백질에 상응하는 유사체는 B1 단백질의 아미노산중 한 가지 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결손되거나 삽입되어 생성된 단백질이 B1 단백질에 상응하는 생물학적 활성이 동일한 또는 더 큰 단백질이 되어야 한다. Analogs corresponding to the B1 protein must be proteins in which one or more of the amino acids of the B1 protein has been replaced, deleted or inserted with the same or larger biological activity corresponding to the B1 protein.

B1-결합 단백질에 실제 상응하도록 하기 위해서는 동소체와 같은 B1 단백질의 서열에 만들어지는 변화는 아주 적은 것이다. 변화의 수는 10미만이고 적절하게는 5이하의 변화, 가장 적절한 수는 3이하가 된다. 임의 기술을 이용하여 실제 B1 단백질에 상응하는 생물학적으로 활성을 가지는 단백질을 만들 수 있는데, 한 가지 기술은 단백질을 기호화하는 DNA에 통상적인 돌연변이 기술을 이용하는 것으로 약간의 변화가 있다. 이와 같은 클론에 의해 발현되는 단백질들은, 예를 들어, 프로도메인(CARD), 카이나제 결합 위치를 가진 다양한 다른 단백질에 또는 B1 그자체에 결합하고 위에서 언급한 세포내 경로의 조절과 중재에서 이들 다른 단백질들이나 B1의 활성을 조절하는 능력에 의해 선별될 수 있다.In order to actually correspond to the B1-binding protein, very few changes are made to the sequence of the B1 protein as the allotrope. The number of changes is less than 10, suitably less than 5, and the most appropriate number is less than 3. Any technique can be used to create a biologically active protein that corresponds to the actual B1 protein. One technique is a slight change, using conventional mutation techniques in the DNA that encodes the protein. Proteins expressed by such clones may, for example, bind to CARD, various other proteins with kinase binding sites or to B1 itself and to regulate and mediate the intracellular pathways mentioned above. It can be selected by other proteins or by their ability to modulate the activity of B1.

"보존성" 변화는 단백질의 활성에 변화를 주지 않고, 단백질의 크기, 전하, 모양을 변화시키지는 않는 것으로 우선 선별하여 생물학적 활성에 변화를 주지 않는 것이 된다.A "conservation" change does not change the activity of the protein and does not change the size, charge, or shape of the protein, which is first screened and does not change biological activity.

B1 단백질의 보존성 치환체는 폴리펩티드에 있는 적어도 한 개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열로 보존성을 유지하면서 치환된 유사체이다. 이와 같은 치환은 적절하게는 표 1A에서 제시하는 것에 따라 이루어지는데, 치환체는 B1 단백질의 생물학적 활성 특징을 유지하면서 합성된 폴리펩티드 분자의 변형된 구조적 그리고 기능적 성질을 제공하는 일상적인 실험에 의해 결정한다.Conservative substituents of the B1 protein are analogs in which at least one amino acid in a polypeptide is substituted while maintaining conservativeness with a different amino acid sequence. Such substitutions are suitably made as set forth in Table 1A, wherein the substituents are determined by routine experimentation to provide modified structural and functional properties of the synthesized polypeptide molecule while retaining the biologically active characteristics of the B1 protein.

원래 아미노산 Original amino acid 예시적인 치환체 Exemplary Substituents AlaAla Gly; SerGly; Ser ArgArg LysLys AsnAsn Gln; HisGln; His AspAsp GluGlu CysCys SerSer GlnGln AsnAsn GluGlu AspAsp GlyGly Ala; ProAla; Pro HisHis Asn; GlnAsn; Gln IleIle Leu; ValLeu; Val LeuLeu Ile; valIle; val LysLys Arg; Gln; GluArg; Gln; Glu MetMet Leu; Tyr; IleLeu; Tyr; Ile PhePhe Met; Leu; TyrMet; Leu; Tyr SerSer ThrThr ThrThr SerSer TrpTrp TyrTyr TyrTyr Trp; PheTrp; Phe ValVal Ile; LeuIle; Leu

또는 B1 단백질의 치환체의 또 다른 그룹은 다음의 표 1B에 있는 것과 같이 폴리펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산을 제거하고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이 된다. 폴리펩티드에서 이루어진 이와 같은 치환은 Schulz et al., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 and Figs. 3-9 of Creighton, T.E. Protein; Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983의 표 1-2에 제시한 것과 같은 상이한 종간의 단백질 유사성에서 아미노산 변화 빈도를 분석한 결과를 기초로 한 것이다. 이와 같은 분석을 기초로 하여 또 다른 보존성 치환체는 다음의 다섯 가지 그룹중 하나에서 교환이 이루어진 것이다.Or another group of substituents for the B1 protein, wherein at least one amino acid in the polypeptide is removed and a different residue is inserted at that position, as shown in Table 1B below. Such substitutions made in polypeptides are described in Schulz et al., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798 and Figs. 3-9 of Creighton, T.E. Protein; Structure and Molecular Properties, W.H. Based on analysis of the frequency of amino acid changes in protein similarity between different species, as shown in Table 1-2 of Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Based on this analysis, another conservative substituent was exchanged in one of the following five groups.

1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기; Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)1. a small aliphatic, nonpolar or weakly polar residue; Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly) 2. 극성 음전하를 띈 잔기와 이의 아미드; Asp, Asn, Glu, Gln2. polar negatively charged residues and amides thereof; Asp, Asn, Glu, Gln 3. 극성 양전하를 띈 잔기; His, Arg, Lys3. polar positively charged residues; His, Arg, Lys 4. 큰 지방족 비극성 잔기; Met, Leu, Ile, Val(Cys)4. large aliphatic nonpolar residues; Met, Leu, Ile, Val (Cys) 5. 큰 방향족 잔기; Phe, Tyr, Trp5. large aromatic residues; Phe, Tyr, Trp

괄호안에 있는 세 가지 아미노산은 단백질 구조에 중요한 역할을 한다. Gly는 어떠한 측쇄도 가지지 않는 유일한 것이고 따라서 사슬에 유연성을 부여한다. 그러나 이는 α사슬이외의 제2차 구조 형성을 촉진시키는 경향이 있다. Pro는 이의 구조적인 특징으로 인하여, 사슬을 단단하게 억압하고 일반적으로 β-회전과 같은 구조를 만드는 경향이 있고, 일부 경우에는 Cys는 단백질의 폴딩에 중요한 역할을 하는 이황화결합에 참가할 수 있다. Tyr은 이의 수소결합 가능성 때문에 Ser, Thr와 상당히 유사한 특징을 가진다.The three amino acids in parentheses play an important role in protein structure. Gly is the only one that does not have any side chains and thus gives the chain flexibility. However, this tends to promote the formation of secondary structures other than the α chain. Because of its structural features, Pro tends to harden the chains and create structures such as β-rotation in general, and in some cases Cys can participate in disulfide bonds, which play an important role in the folding of proteins. Tyr is quite similar to Ser and Thr because of its hydrogen bonding potential.

본 발명에 따른 전술한 것과 같은 보존성 아미노산 치환은 본 기술분야에 공지된 것이고, 아미노산 치환 후에 폴리펩티드의 생물학적 그리고 구조상의 성질을 유지할 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 대부분의 결손 및 치환은 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 특징에 파격적인 변화를 주지는 않는다. " 특징"은 , 예를 들면, 프로도메인(CARD)을 지닌 다른 단백질에 결합, 또는 위에서 언급된 것과 같이 세포 사멸 또는 생존의 카이나제 활성과 조절과 같은 생물학적 활성에서의 변화 및 α-사슬, β-쉬트 등의 2차 구조에서의 변화를 정의하는 포괄적인 방식으로 정의된다.Conservative amino acid substitutions as described above according to the present invention are known in the art and it can be expected that the amino acid substitutions can maintain the biological and structural properties of the polypeptide. Most of the deletions and substitutions according to the invention do not result in disruptive changes in the characteristics of the protein or polypeptide molecule. "Characteristics" refer to changes in biological activity such as, for example, binding to other proteins with prodomains (CARDs), or kinase activity and regulation of cell death or survival, as mentioned above, It is defined in a comprehensive way to define changes in secondary structures such as β-sheets.

본 발명에 이용할 수 있는 B1 단백질의 유사체를 만들기 위해 이용될 수 있는 단백질에 아미노산 치환제를 만드는 예는 임의 공지의 방법을 포함하는데 이는 미국 특허 RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585; 4,737,462(Mart et al.,); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,) 및 리신 치환된 단백질은 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에 상술하고 있다.Examples of making amino acid substitutions in proteins that can be used to make analogues of the B1 protein that can be used in the present invention include any known method, which is described in US Pat. 4,959,314; 4,588,585; 4,737,462 to Mart et al .; 5,116,943 (Koths et al.,); 4,965, 195 to Namen et al. 4,879, 111 to Chong et al .; 5,017,691 (Lee et al.,) And lysine substituted proteins are detailed in US Pat. No. 4,904,584 (Shaw et al.,).

전술한 B1 단백질의 활성에 큰 변화를 주지 않는 보존성 치환이외에, TRAF-결합 단백질의 활성이 상당히 증가되도록 하는 보존성이 약한 치환 및 다소 무작위 치환도 본원 발명의 범위에 속한다.In addition to conservative substitutions that do not significantly change the activity of the B1 protein described above, weakly conservative substitutions and somewhat random substitutions that result in a significant increase in the activity of the TRAF-binding protein are also within the scope of the present invention.

치환 또는 결손의 정확한 효과를 확인하였을 경우에, 당업자는 치환, 결손 등의 효과를 일상적인 결합 및 세포 죽음 검사를 통하여 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 이와 같은 표준 테스트를 이용하는 선별은 과도한 실험을 요하지는 않는다.Once the exact effects of substitutions or deletions have been identified, those skilled in the art will recognize that the effects of substitutions, deletions and the like can be assessed through routine binding and cell death tests. Screening using these standard tests does not require excessive experimentation.

유전자 수준에서, 이와 같은 유사체는 B1 단백질을 기호화하는 DNA 서열의 누클레오티드에 부위-직접적인 돌연변이를 이용하여 유사체를 기호화하는 DNA 서열을 만들고, DNA을 합성하고 재조합 세포 배양물에서 폴리펩티드를 발현시켜 만들 수 있다. 일반적으로 유사체는 천연 발생 단백질과 동일한 또는 생물학적 활성이 양적으로 증가된다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologu, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989).At the genetic level, such analogues can be made by using site-direct mutations in the nucleotides of the DNA sequence encoding the B1 protein to make a DNA sequence that encodes the analog, synthesizing the DNA and expressing the polypeptide in recombinant cell culture. . In general, analogs have a quantitative increase in the same or biological activity as naturally occurring proteins (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologu, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989).

B1 단백질 고유 또는 초기 준비된 유사체를 기호화하는 DNA의 부위-돌연변이를 이용하여, 동일한 폴리펩티드를 기호화하는 또는 천연 서열과는 다른(공지의 유전자 코드의 축중으로 인한 변화 때문에) 서열을 가지는 B1 단백질을 준비할 수 있다. 부위-특이적인 돌연변이는 원하는 돌연변이를 가지는 DNA 서열을 기호화하는 특정 올리고누클레오티드 서열과 인접한 상당수의 누클레오티드을 이용하여 유사체를 만들 수 있는데 유사체는 반대로 된 결손 양측에 안정한 이중 나선을 만들기 위해 충분한 크기의 프라이머 서열을 제공한다. 일반적으로 길이가 20 내지 25개 누클레오티드로 된 프라이머가 적절한데 서열의 각 측면에는 약 5 내지 10개의 상보 누클레오티드가 바뀔 수 있다. 일반적으로, 부위-특이적인 돌연변이 기술은 당업자에게 공지된 기술이고, 이는 Adelman et al., DNA 2;183(1983)에 예시하고 있다.Site-mutation of DNA encoding the B1 protein native or initially prepared analogs can be used to prepare a B1 protein that encodes the same polypeptide or has a sequence that differs from the native sequence (due to changes due to degeneracy of the known genetic code). Can be. Site-specific mutations can produce analogs using a large number of nucleotides adjacent to a particular oligonucleotide sequence that encodes a DNA sequence with the desired mutation, which can produce a primer sequence of sufficient size to create a stable double helix on either side of the reversed defect. to provide. Generally primers of 20 to 25 nucleotides in length are suitable, with about 5 to 10 complementary nucleotides alternating on each side of the sequence. In general, site-specific mutation techniques are those known to those skilled in the art and are exemplified in Adelman et al., DNA 2; 183 (1983).

인지하는 바와 같이, 부위 특이적인 돌연변이 기술은 일반적으로 단일 가닥 및 이중 가닥형으로 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위-특이적인 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 Messing et al., Third Cleveland Symposim on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor, A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981)에 상술하고 있는 M13 파아지이다. 이들 파아지는 시판되는 것을 이용할 수 있고 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다. 또는 복제원점을 포함하는 한가닥 파아지를 포함하는 벡터를 이용하여 단일-가닥 DNA를 얻을 수 있다(Veira et al., Meth. Enzymol. 153;3, 1987).As will be appreciated, site specific mutation techniques generally utilize phage vectors that exist in single stranded and double stranded forms. Typical vectors useful for site-specific mutations are the M13 phages detailed in Messing et al., Third Cleveland Symposim on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor, A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). These phages are commercially available and are generally known to those skilled in the art. Alternatively, single-stranded DNA can be obtained using a vector comprising single-stranded phage containing the origin of replication (Veira et al., Meth. Enzymol. 153; 3, 1987).

일반적으로, 본 발명에 따르는 부위-직접적인 돌연변이는 관련 폴리펩티드를 기호화하는 DNA 서열을 포함하는 한 가닥 벡터를 얻어야 한다. 원하는 돌연변이된 서열을 가지는 올리고누클레오티드 프라이머는 자동화된 DNA/올리고누클레오티드 합성을 이용하여 준비한다. 이와 같은 프라이머를 단일가닥 단백질 서열을 포함하는 벡터에 어닐링하고 대장균 폴리메라제 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합효소로 처리하여 돌연변이를 포함하는 가닥을 완전히 합성한다. 따라서, 돌연변이된 서열과 제2가닥은 원하는 돌연변이를 가진다. 이와 같은 이형이중 벡터를 이용하여 대장균(E. coli) JM101와 같은 적절한 세포에 형질 도입시키고 돌연변이된 서열을 가지는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.In general, site-directed mutations according to the present invention should yield a single stranded vector comprising a DNA sequence encoding the relevant polypeptide. Oligonucleotide primers with the desired mutated sequences are prepared using automated DNA / oligonucleotide synthesis. Such primers are annealed to a vector comprising a single stranded protein sequence and treated with a DNA polymerase such as E. coli polymerase I Klenow fragment to fully synthesize the strand containing the mutation. Thus, the mutated sequence and the second strand have the desired mutation. Such heterologous double vectors are used to transduce appropriate cells, such as E. coli JM101, and to clone clones comprising recombinant vectors with mutated sequences.

이와 같은 클론을 선택한 후에, 돌연변이된 TRAF-결합 단백질 서열을 제거하여 적절한 벡터에 옮기고, 이때 벡터는 일반적으로 적절한 숙주에 트랜스펙션을 위해 이용되는 형태의 발현 벡터가 된다.After selecting such clones, the mutated TRAF-binding protein sequence is removed and transferred to the appropriate vector, where the vector is generally the expression vector of the form used for transfection into the appropriate host.

따라서, TRAF-결합 단백질을 기호화하는 유전자 또는 핵산은 PCR 및 화학적 올리고누클레오티드 합성과 같은 공지의 DNA 또는 RNA 증폭 기술을 이용하여 in vitro, in vivo에서 감지, 수득 및 변형된 것이다. PCR을 이용하면 반복된 DNA 폴리머라제 반응에 의해 특정 DNA를 증폭(수를 증가)시킬 수 있다. 이와 같은 반응은 클로닝을 대신할 수 있는데; 이때 모든 핵산 서열을 알아야 한다. PCR을 실행하기 위해, 원하는 서열에 상보적인 프라이머를 만든다. 일반적으로 자동화된 DNA 합성에 의해 프라이머를 만들 수 있다. 프라이머는 유전자의 임의 부분에 하이브리드할 수 있도록 만들어진 것이기 때문에, 상보적인 염기 쌍에 짝이 잘못된 것(mismatch)을 견딜 수 있도록 환경을 만든다. 이와 같은 잘못이룬 쌍을 증폭시키면 돌연변이된 생성물을 만들게 되고 새로운 성질을 가지는 펩티드가 형성된다(가령, 부위 특이적인 돌연변이)(Ausubel., Ch.16). 또한, PCR에서 역전사효소를 이용하여 커플링 상보적인 DNA(cDNA) 합성하여, 클로닝없이 프로락틴 수용체의 세포외 도메인 합성을 위한 출발물질로 RNA를 이용한다.Thus, the gene or nucleic acid that encodes a TRAF-binding protein is one that is detected, obtained and modified in vitro, in vivo using known DNA or RNA amplification techniques such as PCR and chemical oligonucleotide synthesis. PCR can be used to amplify (increase in number) specific DNA by repeated DNA polymerase reactions. Such a reaction can replace cloning; All nucleic acid sequences should be known at this time. To run the PCR, a primer complementary to the desired sequence is made. In general, primers can be made by automated DNA synthesis. Because primers are designed to hybridize to any part of a gene, they create an environment that can tolerate mismatches to complementary base pairs. Amplification of such misleading pairs results in mutated products and the formation of peptides with new properties (eg site specific mutations) (Ausubel., Ch. 16). In addition, coupling complementary DNA (cDNA) synthesis using reverse transcriptase in PCR, using RNA as a starting material for the synthesis of the extracellular domain of the prolactin receptor without cloning.

또한, PCR 프라이머는 증폭된 유전자 부분의 양단에 종료 코돈이 있는 것과 같은 특징 및 새로운 제한효소 절단 부위를 가지는 등과 같이 만든다. 증폭된 유전자 서열의 5'와 3'말단에 제한효소 절말단위가 위치하면, TRAF-결합 단백질 또는 이의 단편을 기호화하는 유전자 단편이 벡터에 다른 서열 및 클로닝 부위를 결찰하도록 만들 수 있다.In addition, PCR primers are made such as having a termination codon at both ends of the amplified gene portion, having a new restriction enzyme cleavage site, and the like. The restriction enzyme end-points at the 5 'and 3' ends of the amplified gene sequences can cause the gene fragments that symbolize TRAF-binding proteins or fragments thereof to ligation other sequences and cloning sites into the vector.

PCR 또는 RNA 및 DNA를 증폭시키는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 야기에서 제시하는 기술에 따라 과도한 실험없이도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. DNA 또는 RNA를 증폭시키는 공지된 방법은 폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR)과 관련된 증폭 과정(참고; 미국 특허, 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188(Mullis et al.,); 4,921,794(Tobor et al.,); 5,142,033(Innis et al.,); 5,122,464(Wilson et al.,); 5,091,310(Innis); 5,066,584(Gyllensten et al.,); 4,889,818(Gelfand et al,); 4,994,370(Silver et al.,); 4,766,067(Biswas); 4,656,134(Ringold); Innis et al., eds, PCR Protocols; A Guide to Method and Applications) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위해 주형으로 표적 서열에 안티센스 RNS를 이용하여 RNA 중개된 증폭(미국 특허 5,130,238(Malek et al., NASBA) 및 항체 라벨링이 된 DNA 증폭을 이용하여 복합된 면역-PCR(Ruzick et al., Science 260;487(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotechniques 9;1378(1993); Sano et al., Science 258;120(1992); Sano et al., Biotchnique 9;1378(1991)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.PCR or other methods of amplifying RNA and DNA are known to those skilled in the art and can be used in accordance with the present invention without undue experimentation, according to the techniques presented in Yagi. Known methods for amplifying DNA or RNA include amplification processes associated with polymerase chain chain reaction (PCR) (see US Pat. No. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188 (Mullis et al.,); 4,921,794 to Tobor et al. ;); 5,142,033 (Innis et al.,); 5,122,464 (Wilson et al.,); 5,091,310 (Innis); 5,066,584 (Gyllensten et al.,); 4,889,818 (Gelfand et al,); 4,994,370 (Silver et al.,) ); 4,766,067 (Biswas); 4,656,134 (Ringold); Innis et al., Eds, PCR Protocols; A Guide to Method and Applications) and RNA mediated amplification using antisense RNS to target sequences as templates for double stranded DNA synthesis (Ruzick et al., Science 260; 487 (1993); Sano et al., Science 258; 120, combined with US Pat. No. 5,130,238 (Malek et al., NASBA) and antibody labeled DNA amplification). (1992); Sano et al., Biotechniques 9; 1378 (1993); Sano et al., Science 258; 120 (1992); Sano et al., Biotchnique 9; 1378 (1991).

유사한 방식으로 B1 단백질의 생물학적으로 활성 단편이나 동소체를 B1 단백질의 유사체에 관해 전술한 것과 같이 만들 수 있다. B1 단백질의 적절한 단편은 적어도 프로도메인-관련 결합 능력 또는 다른 카이나제 활성을 보유하고, 다양한 다른 단백질의 생물학적 활성 및 B1 단백질과 직접 또는 간접적으로 관련된 세포내 경로를 중재할 수 있는 것을 말한다. 따라서, B1 단백질 단편은 유사체에 대해 전술한 것과 같이 도미넌트-네가티브 또는 도미넌트-포지티브 효과를 가지도록 만든다. 이와 같은 단편은 본 발명의 유사체의 특정 부류를 나타내는데 즉, 이들은 완전한 B1 단백질에서 유도된 B1 단백질의 일부이고, 다시 말하자면, 이와 같은 일부분 또는 단편은 원하는 활성의 일부를 가진다. 이와 같은 단편은 펩티드가 될 수 있다.In a similar manner, biologically active fragments or allotropes of the B1 protein can be made as described above for analogs of the B1 protein. Appropriate fragments of the B1 protein are those that retain at least prodomain-related binding capacity or other kinase activity and are capable of mediating the biological activity of various other proteins and intracellular pathways that are directly or indirectly related to the B1 protein. Thus, the B1 protein fragment is made to have a dominant-negative or dominant-positive effect as described above for the analogues. Such fragments represent a specific class of analogs of the invention, ie they are part of the B1 protein derived from the complete B1 protein, that is to say that such part or fragment has part of the desired activity. Such fragments can be peptides.

유사하게, 당업자에게 공지된 것과 같이, B1 단백질, 이의 유사체, 단편의 하나이상의 아미노산 잔기의 측쇄에 표준 변화 또는 다른 분자 가령, 항체, 효소, 수용체 등에 B1 단백질, 유사체 또는 단편을 결합시켜 유도체를 만들 수 있다. 따라서, 여기에서 언급하는 "유도체"는 당업자에게 공지된 방법으로 잔기의 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 그룹에 있는 기능기로부터 만든 유도체를 포함하고 이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 유도체는 이와 같은 단편이 B1 단백질로 동일한 또는 더 큰 생물학적 활성을 가진다면 탄수화물 도는 인산 잔기와 같은 화학적 부분을 가질 수 있다.Similarly, as is known to those skilled in the art, derivatives may be made by binding a B1 protein, analog or fragment to a side chain of one or more amino acid residues of a B1 protein, analog or fragment thereof, such as an antibody, enzyme, receptor or the like. Can be. Thus, the "derivatives" referred to herein include derivatives made from functional groups in the side chains or N- or C-terminal groups of the residues by methods known to those skilled in the art and are also within the scope of the present invention. Derivatives may have chemical moieties such as carbohydrates or phosphate residues if such fragments have the same or greater biological activity as the B1 protein.

가령, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 2차 아민과 반응한 카르복실기의 아미드, 아실 부분을 형성한 아미노산의 자유 아미노시 또는 N-아실 유도체(가령, 알카노일 또는 카르복실 아로일 기) 또는 아실 부분을 형성하는 자유 히드록실 기의 O-아실 유도체(가령, 세릴 또는 트레오닐 잔기)를 포함한다.For example, the derivatives may be aliphatic esters of carboxyl groups, ammonia or amides of carboxyl groups reacted with primary or secondary amines, free amino or N-acyl derivatives of amino acids that form acyl moieties (eg alkanoyl or carboxyl aroyl groups) Or O-acyl derivatives (eg, seryl or threonyl residues) of free hydroxyl groups forming an acyl moiety.

"유도체"는 한 아미노산이 20개의 자연 발생 아미노산중 하나로 변화되지 않은 유도체만을 포함하는 것이다."Derivative" is intended to include only derivatives in which one amino acid has not been changed to one of the 20 naturally occurring amino acids.

B1 단백질은 단백질 또는 폴리펩티드 즉, 아미노산 서열이다. 정의에 따르면, B1 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하는 큰 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드는 본 발명의 기초적인 그리고 신규한특징에 영향을 주지 않는 한 이와 같은 폴리펩티드도 본 발명의 범위에 속하는데 가령, 이들은 B1 단백질의 생물학적 활성을 보유하거나 증가된 활성을 가지고 또는 B1 단백질의 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 남기기 위해 절단될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 다른 아미노산 또는 펩티드와 B1 단백질의 융합 단백질을 포함한다.The B1 protein is a protein or polypeptide, ie amino acid sequence. By definition, a polypeptide consisting of a large amino acid sequence comprising the entire amino acid sequence of a B1 protein is within the scope of the present invention, as long as such polypeptides do not affect the basic and novel features of the present invention. It may also be cleaved to retain the biological activity of the protein or to leave a protein or polypeptide with increased activity or with a biological activity of the B1 protein. Thus, the present invention includes fusion proteins of other amino acids or peptides with the B1 protein.

신규한클론 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 다음과 같은 용도를 가질 수 있다;Novel clone proteins, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof may have the following uses;

(i)이들을 이용하여 그들이 결합하는 세포내 단백질의 직간접적 조절을 통한 세포 생존 경로가 조절된다. 가령, 이들 경로의 강화된 활성을 원치 않는 상태, 즉, 항-종양, 면역-자극 응용과 같은 세포 사멸에 우호적인 이들을 억제하는 것이 바람직할 때 B1, 이의 동소체, 유사체, 단편, 또는 유도체에 의한 이런 조절이 억제되는 것이 바람직하다. 이와 같은 상황에서 본 발명의 단백질, 이들의 유사체, 단편 또는 유도체가 이들이 세포 생존 경로를 억제할 때, 공지된 표준 공정에 따라 세포에 유도될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 DNA 클론에 의해 기호화된 단백질이 세포내에 존재하고 이들이 바람직한 상황에서 세포내로 유도되어야 하기 때문에, 이들 단백질의 특이적 도입을 위한 시스템이 필요하다. 이렇게 하는 한가지 방법은 재조합 바이러스(예, Vaccina로부터 유도된 것)를 다음의 두 가지 유전자: 특이적으로 어떤 세포(CD4 임파구와 관련된 백혈병)에 결합하는 AIDS(HIV)바이러스 gp120 단백질과 같이 세포에 의해 특이적으로 발현되는 세포 표면 단백질에 결합하는 리간드나 또는 공지된 수용체를 가진 세포에 특이적으로 결합해 재조합바이러스 운반체가 이런 세포에 결합할 수는 있도록 하는 능력을 가는 다른 리간드를 기호화한 유전자; 그리고 본 발명의 단백질을 기호화한 유전자가 도입될 DNA로 만드는 것이다. 그래서, 바이러스 표면위의 세포 표면 결합 단백질의 발현이 종양 세포나 다른 수용체 운반 세포에 특이적인 바이러스를 대상으로 할 것이고 이 후에 서열을 기호화한 단백질이 바이러스를 통하여 세포속으로 도입될 것이다, 그리고 일단 세포속에서 발현되면 세포 생존 경로가 억제되어 이들 세포에 원하는 세포 사멸이나 면역-자극 효과가 나타날 것이다. 이런 재조합 동물 바이러스의 조합은 표준방법에 의한다(참고; Sambrook et al.,1989). 또 다른 가능성은 세포에 의해 흡수되고 발현될 수 있는 올리고누클레오티드의 형태로 기호화된 단백질의 서열을 도입하는 것이다.(i) These are used to regulate cell survival pathways through direct and indirect regulation of the intracellular proteins to which they bind. For example, by B1, its allotropes, analogs, fragments, or derivatives when it is desired to inhibit the enhanced activity of these pathways, ie those that are favorable for cell death, such as anti-tumor, immune-stimulatory applications. It is desirable that such control is suppressed. In such situations, the proteins, analogs, fragments or derivatives thereof of the invention may be induced in cells according to known standard procedures when they inhibit cell survival pathways. For example, since the proteins encoded by the DNA clones of the present invention are present in cells and must be induced intracellularly in the desired situation, a system for the specific introduction of these proteins is needed. One way to do this is by cells such as the AIDS (HIV) virus gp120 protein, which binds a recombinant virus (e.g., derived from Vaccina) to two genes specifically: certain cells (leukemia associated with CD4 lymphocytes). Genes encoding ligands that bind specifically expressed cell surface proteins or other ligands that bind specifically to cells with known receptors and have the ability to bind recombinant cells to such cells; Then, the protein of the present invention is made into DNA to which the encoded gene is introduced. Thus, the expression of cell surface binding proteins on the virus surface will target viruses specific for tumor cells or other receptor-carrying cells, after which the encoded protein will be introduced into the cell through the virus, and once the cells Expression in the gut would inhibit cell survival pathways, resulting in the desired cell death or immuno-stimulatory effects on these cells. Combinations of such recombinant animal viruses are by standard methods (Sambrook et al., 1989). Another possibility is to introduce the sequence of the encoded protein in the form of oligonucleotides that can be taken up and expressed by the cell.

유사하게, B1단백질, 이의 동소체, 유사체, 단편 또는 유도체가 동시에 또는 달리 세포 사멸 과정을 강하할 때, 이들은 위와 언급된 바와 같이 증가된 항-종양, 면역-자극 또는 다른 세포 사멸 활성을 제공하기 위하여 세포에 투여될 수 있다. Similarly, when the B1 protein, its allotropes, analogs, fragments or derivatives simultaneously or otherwise lower the cell killing process, they provide for increased anti-tumor, immune-stimulating or other cell killing activity as mentioned above. May be administered to the cells.

(ⅱ)이들은 AIDS, 패혈증 또는 이식편-대-숙주 거부에서와 같은 조직 손상의 경우에 세포 생존 경로를 강화하거나 확대하는데 사용된다. 이럴 때는 세포 사멸 경로를 봉쇄하거나 세포 생존 경로를 자극하는 것이 바람직하다. 이런 상황하에서는 B1단백질이 실제로 세포 생존 과정을 억제하거나 또는 세포 사멸 과정을 자극하거나 확대할 때, 표준 공정에 의해 세포속으로 본 발명의 B1 단백질의 앤티센스 코딩 서열을 가진 올리고누클레오티드를 도입하는 것이 가능하다. 이것이 효과적으로 이 단백질의 mRNA 해독을 봉쇄해 그들의 발현을 봉쇄함으로써 원하지 않는 효과를 억제할 것이다. 이런 올리고누클레오티드는 위의 재조합 바이러스 방식을 이용해 세포에 도입되고 바이러스에 의해 운반되는 두 번째 서열도 올리고누클레오티드 서열이 될 것이다. (Ii) They are used to enhance or expand cell survival pathways in the case of tissue damage, such as in AIDS, sepsis or graft-versus-host rejection. In this case, it is desirable to block the cell death pathway or stimulate the cell survival pathway. Under these circumstances it is possible to introduce oligonucleotides with the antisense coding sequence of the B1 protein of the invention into the cell by standard procedures when the B1 protein actually inhibits the cell survival process or stimulates or augments the cell death process. Do. This would effectively block the mRNA translation of the protein and block their expression, thus inhibiting unwanted effects. Such oligonucleotides will also be oligonucleotide sequences which are introduced into cells and carried by the virus using the above recombinant viral approach.

또 다른 가능성은 세포내 신호 활성을 방해하기 위해 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것이다.Another possibility is to use antibodies specific for the proteins of the invention to interfere with intracellular signal activity.

원하지 않는 효과를 방지하는 또 다른 방법은 최근에 개발된 라이소자임 방식이다. 라이소자임은 특이적으로 RNA를 절단하는 촉매 RNA 분자이다. 라이소자임은 선택된 표적 RNA를 절단하도록 만들 수 있는데 가령, 본 발명의 단백질을 기호화하는 mRNA를 절단하도록 만들 수 있다. 이와 같은 라이소자임은 단백질의 mRNA에 특이적인 서열을 가지고, mRNA의 절단 후에 이와 상호작용하여(상보적인 결합), 단백질 발현을 감소 또는 완전히 못하도록 할 수 있는데, 발현 감소 정도는 표적 세포에 있는 라이소자임 발현정도에 따라 달라진다. 선택된 세포(가령, TRAF2 결합 단백질을 가지는 세포)내로 라이소자임을 유도시키기 위해, 플라스미드, 동물 바이러스(레트로바이러스) 벡터등과 같은 적절한 벡터를 이용하는데 이들은 i) 바이러스가 라이소자임을 기호화하는 cDNA와 같은 제 2 서열을 가지도록 하는 목적에 이용된다(Methods etc., concerning ribozymes see Chen et al., 1992;Zhao and Pick, 1993).Another way to prevent unwanted effects is the recently developed lysozyme method. Lysozyme is a catalytic RNA molecule that specifically cleaves RNA. Lysozyme can be made to cleave selected target RNAs, for example, to cleave mRNAs encoding the proteins of the invention. Such a lysozyme has a sequence specific for the mRNA of the protein, and can interact with (complementary binding) after cleavage of the mRNA, thereby reducing or not completely reducing the expression of the protein. Depends on. To induce lysozyme into selected cells (eg, cells with TRAF2 binding proteins), appropriate vectors such as plasmids, animal virus (retroviral) vectors, etc. are used, i) a second such as cDNA which symbolizes that the virus is a lysozyme. It is used for the purpose of having a sequence (Methods etc., concerning ribozymes see Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993).

(ⅲ) 이들에 결합할 수 있는 다른 단백질을 분리하고 확인하고 클론하는데 이용되는데, 가령, 세포내 염증, 세포사멸과 세포 생존 과정 관계된 단백질을 분리, 확인, 클론한다. 가령, 본 발명의 단백질을 기호화하는 DNA 서열을 효모 이중 -하이브리드 시스템에 이용하는데, 이때 기호화된 단백질이 클론 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 기호화하는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 다른 서열("prey")을 분리, 클론 및 확인하는데 "bait"로 이용된다. 동일한 방식에서, 본 발명의 단백질이 다른 세포 단백질 가령 수용체의 TNF/NGF 슈퍼페밀리의 다른 수용체 또는 다른 BCL2 페밀리의 다른 구성원들에 결합하는지를 결정할 수 있다.(Iii) is used to isolate, identify, and clone other proteins that can bind to them, for example, to isolate, identify, and clone proteins involved in intracellular inflammation, apoptosis, and cell survival. For example, a DNA sequence that encodes a protein of the present invention is used in a yeast double-hybrid system, where a cDNA or other sequence ("prey") of a genomic DNA library that encodes a protein that the encoded protein can bind to a clone protein. It is used as "bait" to isolate, clone and identify. In the same way, one can determine whether the protein of the invention binds to other cellular proteins such as other receptors of the TNF / NGF superfamily of receptors or other members of other BCL2 families.

(ⅳ) 기호화된 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이용하여 동일 종류의 다른 단백질 가령, 프로도메인(CARD)또는 카이나제 도메인, 또는 기능적으로 관계가 있는 단백질, 그리고 세포내 신호 과정에 관련된 단백질을 분리, 확인 및 클론할 수 있다. 이와 같은 용도로, 전술한 효모 두 가지 하이브리드 시스템을 이용하거나 최근에 개발된 PCR 클로닝 후에 엄격하지 않은(non-stringent) 서던 하이브리드반응을 이용하는 시스템을 이용할 수 있다.(Iii) symbolic proteins, their allotropes, analogs or fragments and derivatives, for use in other proteins of the same class, such as prodomain (CARD) or kinase domains, or functionally related proteins, and intracellular signaling processes Related proteins can be isolated, identified and cloned. For this purpose, it is possible to use two yeast hybrid systems as described above or a system using a non-stringent Southern hybrid reaction after recently developed PCR cloning.

(ⅴ) 본 발명의 기호화된 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이용하는 또 다른 방법은 B1 단백질에 관련된 단백질 또는 세포내 신호 과정에 관계하는 다른 단백질 또는 인자에 결합할 수 있는 능력을 가지는 다른 단백질 또는 인자를 분리 및 확인하기 위한 친화성 크로마토그래피 방법에 사용하는 것이다. 이와 같은 용도에서, 본 발명의 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체는 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 개별적으로 부착시키고 그 다음 세포 추출물 또는 세포내 신호 공정에 관계하는 것으로 보이는 분리된 단백질 또는 인자와 접촉시킨다. 친화력 크로마토그래피 후에 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 결합된 다른 단백질 또는 인자를 용출시키고, 분리하여 특징을 조사한다.(Iii) Another method of using the symbolized proteins, allotropes, analogs or fragments thereof and derivatives thereof of the present invention is directed to a protein related to the B1 protein or another having the ability to bind to other proteins or factors involved in intracellular signaling processes. It is used in affinity chromatography methods to isolate and identify proteins or factors. In such uses, the proteins, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof of the present invention are individually attached to an affinity chromatography matrix and then contacted with isolated proteins or factors that appear to be involved in cellular extracts or intracellular signaling processes. Let's do it. After affinity chromatography, other proteins or factors bound to the protein, its allotropes, analogs or fragments and derivatives are eluted and separated for characterization.

(ⅵ) 전술한 것과 같이, 본 발명의 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 이뮤노겐(항원)으로 이용하여 이에 대한 특이적인 항체를 만들 수 있다. 이와 같은 항체를 이용하여 세포 추출물 또는 이와 같은 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 생산하는 형질전환된 세포로부터 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다. 또한, 이들 항체를 이용하여 과도한 또는 과소한 TRAF2 유도된 세포 효과를 가지는 수용체 시스템의 이상이 있는 것과 관련된 질병을 확인하기 위한 진단을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질이 관련된 기능이상의 세포내 신호 시스템과 질병이 관련이 있는 경우에 이와 같은 항체들은 중요한 진단 도구가 될 수 있다. "항체"란 다클론성 항체, 단일클론성 항체, 키메라 항체, 가용성 또는 분리형의 라벨된 항체에 대한 항-이디오타입(anti-d) 항체 및 항원에 결합할 수 있는 고유 항체의 Fc 단편이 부족한 Fab, F(ab')₂ 단편 등을 포함한다.(Iii) As described above, the antibodies of the present invention, allotropes, analogs or fragments thereof and derivatives thereof can be used as immunogens (antigens) to make specific antibodies thereto. Such antibodies can be used to purify proteins of the invention from transformed cells that produce cell extracts or such proteins, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof. In addition, these antibodies can be used to make diagnoses for identifying diseases associated with abnormalities in the receptor system that have excessive or underestimated TRAF2-induced cellular effects. Thus, such antibodies may be an important diagnostic tool when the disease of the protein of the present invention is associated with a dysfunctional intracellular signaling system. "Antibody" refers to Fc fragments of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, anti-idiotype antibodies against soluble or isolated labeled antibodies, and native antibodies capable of binding to antigens. Lacking Fab, F (ab ') ₂ fragments, and the like.

(ⅶ) 본 발명에 유용한 항체 단편을 포함하는 항체를 이용하여 샘플에서 본 발명의 클론을 정량적으로 또는 정성적으로 감지하는 또는 본 발명의 클론을 발현하는 세포가 존재하는 지를 감지할 수 있다. 광 현미경, 흐름 세포계산기 또는 형광 측정기가 부착된 형광 라벨된 항체를 이용하는 면역형광 기술을 이용하면 가능하다.(Iii) Antibodies comprising antibody fragments useful in the present invention can be used to quantitatively or qualitatively detect clones of the present invention or to detect the presence of cells expressing the clones of the present invention in a sample. This is possible using immunofluorescent techniques using fluorescently labeled antibodies with light microscopy, flow cytometers or fluorimeters.

본 발명에 유용한 항체(또는 이의 단편)을 본 발명의 클론을 in situ 감지하기 위한 면역형광 또는 면역전자 현미경으로 이용할 수 있다. In situ 감지는 환자에게서 조직 샘플을 떼내고 샘플에 본 발명의 라벨된 항체를 제공하는 것으로 이루어진다. 항체(또는 이의 단편)는 생물학적 샘플에 라벨된 항체(또는 이의 단편)를 겹치게 하여 적절하게 제공할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여, 클론의 존재뿐만 아니라 검사한 조직에서 이의 분포도 감지할 수 있다. 본 발명을 이용하면, 당업자는 이와 같은 in situ 감지를 하기 위해 다양한 조직학적 방법을 변형하여 실시할 수 있을 것이다.Antibodies (or fragments thereof) useful in the present invention can be used with immunofluorescence or immunoelectron microscopy for in situ detection of clones of the present invention. In situ detection consists of removing a tissue sample from a patient and providing a labeled antibody of the invention to the sample. The antibody (or fragment thereof) may be appropriately provided by overlapping the labeled antibody (or fragment thereof) in the biological sample. This process can be used to detect the presence of clones as well as their distribution in examined tissues. Using the present invention, those skilled in the art will be able to implement various histological methods for such in situ sensing.

본 발명의 클론을 검사하는 것은 일반적으로 생물학적 유체, 조직 추출물, 임파세포 또는 백혈구세포 또는 조직 배양물에서 배양시킨 세포등과 같은 새로 배양한 세포 등의 생물학적 샘플을 기호화된 단백질을 확인할 수 있도록 감지 가능한 라벨링된 항체 존재하에 배양하고 공지의 방법에 따라 항체를 감지하는 것으로 구성된다.Examination of the clones of the present invention is generally detectable for biological proteins, such as biological fluids, tissue extracts, lymphocytes or leukocytes, or newly cultured cells, such as cells cultured in tissue culture, to identify the encoded protein. Culture in the presence of labeled antibody and detect the antibody according to known methods.

(ⅷ) 본 발명의 기호화된 단백질을 세포내 다른 단백질에 결합할 수 있는 지에 대해 다수의 다른 단백질의 간접 조절물질로 이용하는데 다른 세포 단백질이 다른 세포내 단백질 또는 막통과 단백질의 세포내 도메인에 직접 결합한다.(Iii) The symbolic protein of the present invention can be used as an indirect regulator of many other proteins as to whether they can bind to other proteins in the cell, where other cellular proteins are directly directed to other intracellular proteins or intracellular domains of transmembrane proteins. To combine.

이와 같은 조절을 위해, 다른 세포내 단백질 또는 막통과 단백질의 세포내 도메인을 전술한 (ⅱ)에 기술한 여러 가지 방법을 이용하여 세포내에 유입시킬 수 있다.For such regulation, other intracellular proteins or intracellular domains of transmembrane proteins can be introduced into cells using the methods described in (ii) above.

임의의 표준 선별 과정을 이용하여 본 발명의 단백질의 분리, 확인 및 특징을 조사할 수 있다. 예를 들면, 선별 과정중 하나인 효모 이중 하이브리드 시스템을 이용하여 본 발명의 단백질을 확인할 수 있다. 유사하게, 본 기술 분야에 공지된 친화력 크로마토그래피, DNA 하이브리드 과정등과 같은 다른 공정을 이용하여 본 발명의 단백질의 분리, 확인 및 특징 조사와 본 발명의 단백질에 결합할 수 있는 추가 단백질, 인자, 수용체 등을 분리, 확인 및 특징을 조사할 수 있다.Any standard screening procedure can be used to examine the isolation, identification and characterization of the proteins of the invention. For example, the yeast dual hybrid system, which is one of the screening processes, can be used to identify proteins of the invention. Similarly, other processes, such as affinity chromatography, DNA hybrid procedures, etc., known in the art, can be used to isolate, identify, and characterize proteins of the invention, and to further protein, factors, which can bind to the proteins of the invention, Receptors, etc. can be isolated, identified and characterized.

또한, 본 발명의 단백질에 결합할 수 있는 발견된 단백질을 비슷한 방식(본 발명의 단백질에 결합할 수 있는 그리고 연합된 신호 과정의 하류에 관계하는 인자를 제공하는 또는 이들의 신호 활성을 가지는 다른 인자, 단백질을 분리, 확인 및 특징을 조사하는데 본 발명의 단백질을 이용한 것과 같은 방식)으로 이용하여 별도의 신호 과정에 관계한 단백질을 제공할 수 있다.In addition, the discovered proteins capable of binding to the proteins of the invention may be provided in a similar manner (providing factors that are capable of binding to the proteins of the invention and downstream of the associated signaling process, or other factors having signaling activity thereof. Can be used in the same manner as the protein of the present invention is used to isolate, identify and characterize the protein.

본 발명의 기호화된 단백질 및 DNA 서열은 임의 표준 재조합 DNA 과정을 이용하면 만들 수 있는데(가령 Sambrook et al., 1989), 적절한 진핵 또는 원핵세포에 단백질을 기호화하는 서열을 포함하는 진핵 또는 원핵 벡터로 형질전환시킨다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질을 만들기 위한 이와 같은 발현 벡터 및 형질전환된 숙주 세포도 포함한다. 전술한 것과 같이 이들 단백질에는 단백질의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 포함하고 따라서 이를 포함하는 벡터에도 이들 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 포함하는 벡터가 포함되고, 형질전환된 숙주세포에도 이와 같은 유사체 및 단편을 만들 수 있는 것이 포함된다. 이들 단백질의 유도체는 형질전환된 숙주 세포에 의해 생산된 단백질 또는 이의 유사체 및 단편을 표준 방법에 의해 변형시킨 유도체가 된다.Symbolic protein and DNA sequences of the invention can be made using any standard recombinant DNA process (e.g., Sambrook et al., 1989), with eukaryotic or prokaryotic vectors comprising sequences that encode proteins in the appropriate eukaryotic or prokaryotic cells. Transform. Thus, the present invention also encompasses such expression vectors and transformed host cells for making proteins of the invention. As mentioned above, these proteins include allotropes, analogs or fragments and derivatives of the proteins and thus also include vectors comprising these proteins, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof, and also include transformed host cells. Included are those that can make such analogs and fragments. Derivatives of these proteins are derivatives in which proteins produced by transformed host cells or analogs and fragments thereof are modified by standard methods.

본 발명은 또한 B1에 의해 중재된 효과를 조절하는 제약학적 조성물에 관계한다. 제약학적 조성물은 활성 성분으로는 (ⅰ) 적절한 발현 벡터에 서브클론된 본 발명의 DNA 서열 하나 이상; (ⅱ) 본 발명에 따른 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체 또는 이의 혼합물; (ⅲ) 본 발명에 따른 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체를 기호화하는 재조합 바이러스 벡터중 하나 이상을 포함한다. The invention also relates to pharmaceutical compositions which modulate the effects mediated by B1. Pharmaceutical compositions may comprise (i) one or more DNA sequences of the present invention subcloned in a suitable expression vector; (Ii) proteins, allotropes, analogs or fragments thereof and derivatives or mixtures thereof according to the invention; (Iii) one or more of the recombinant viral vectors encoding the proteins, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof according to the invention.

제약학적 조성물은 치료할 질병, 환자의 체중 및 의사가 결장한 다른 요인에 따라 환자에게 적절한 양으로 제공된다.The pharmaceutical composition is provided to the patient in an appropriate amount depending on the disease to be treated, the weight of the patient and other factors absent by the physician.

전술한 것과 같이, B1 단백질은 TRAF2의 간접 조절물질이고 이와 같이 TRAF2-NIK-상호작용을 통해 NF-_KB 활성화에 관여한다. 그래서, B1은 세포 생존 경로에서 TRAF2가 독립적으로 또는 다른 분자(p55 TNF 수용체, p75 TNF 수용체, FAS/APO1, MORT-1, TRADD, RIP)와 결합하여 행동하는 방식으로 세포 생존에 일정 역할을 한다. 이런 측면에서, 필요에 따라 TRAF2-NIK 상호작용을 강화시키거나 방해할 수 있는 약물을 고안하는 것이 중요하게 인식되고 있다. 가령, TNF에 의해 유도된 세포 독성을 증가시킬 필요가 있는 경우에 TRAF2-NIK 상호작용을 방해하여 또는 특이적으로 TRAF2 또는 NIK를 방해하여 NF-_KB 활성 유도를 방해하는 것이 바람직하다. 유사하게, TNF에 의해 유도된 세포 독성을 방해할 필요가 있는 경우에 TRAF2-NIK 상호작용을 강화시켜 또는 특이적으로 TRAF2-특이적인 또는 NIK-특이적인 NF-_KB 활성 유도를 강화하여 NF-_KB 활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 약물이 필요한 질병은 아주 많다. 그 가운데, Fas 리간드의 유도에 의해 간 세포의 FAS/APO1 수용체-중재된 죽음을 초래하는 것으로 간에 급성 손상을 주는 급성 간염; 췌장의 β-랑게르한스샘 세포의 죽음과 같은 자가면역-유도성 세포 죽음으로 인한 당뇨; 이식 거부(신장, 심장, 간등)로 인한 세포의 죽음; 다발성 경색으로 뇌에 있는 핍지신경교세포의 죽음; AIDS 바이러스의 증식으로 인한 AIDS-방해된 T 세포의 자살 및 이로 인한 AIDS등이 있다.As mentioned above, the B1 protein is an indirect regulator of TRAF2 and thus participates in NF- _K B activation through TRAF2-NIK-interaction. Thus, B1 plays a role in cell survival in such a way that TRAF2 acts independently or in combination with other molecules (p55 TNF receptor, p75 TNF receptor, FAS / APO1, MORT-1, TRADD, RIP) in the cell survival pathway. . In this respect, it is important to design drugs that can enhance or interfere with TRAF2-NIK interactions as needed. For example, if there is a need to increase the cytotoxicity induced by TNF, it is desirable to interfere with TRAF2-NIK interaction or specifically to interfere with TRF2 or NIK induction of NF- _K B activity induction. Similarly, NF- may be enhanced by enhancing TRAF2-NIK interactions or specifically inducing TRAF2-specific or NIK-specific NF- _K B activity induction where it is necessary to interfere with cytotoxicity induced by TNF. It is desirable to increase _K B activity. Many diseases require such drugs. Among them, acute hepatitis, which causes acute damage to the liver, by inducing Fas ligand resulting in FAS / APO1 receptor-mediated death of liver cells; Diabetes due to autoimmune-induced cell death, such as the death of β-langerhans gland cells of the pancreas; Cell death due to transplant rejection (kidney, heart, liver, etc.); Death of oligodendrocytes in the brain with multiple infarctions; Suicide of AIDS-inhibited T cells due to propagation of the AIDS virus and resulting AIDS.

이와 같은 경우에, FAS/APO1-수용체 중개된 세포 독성(apoptosis) 경로를 방해하고 TRAF2 및 TRAF2-NIK 유도를 통하여 FAS/APO-1 수용체 중재된 NF-_KB 활성을 강화시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 하는 방법중 하나는 세포에 NIK의 양을 증가시키거나 TRAF2와 NIK의 양을 증가시켜 NIK- 또는 TRAF2-NIK 유도된 NF-_KB 활성을 증가시켜 NF-_KB 활성 수준을 증가시켜 세포가 생존할 수 있게 하거나 또는 FAS/APO1 수용체와 TRAF2(또는 TRAF2-NIK)사이에 직접 또는 간접 상호작용을 증가시켜 FAS/APO1 수용체와 세포 독성 중재물질(MACH, 도 2b 참조)과의 상호작용을 감소시켜 NF-_KB 활성 및 세포 생존 유도를 증가시킨다.In such cases, it is desirable to disrupt the FAS / APO1-receptor mediated apoptosis pathway and enhance FAS / APO-1 receptor mediated NF- _K B activity through TRAF2 and TRAF2-NIK induction. One of this way is how to increase the amount of NIK in the cells or to increase the amount of TRAF2 and NIK by increasing the NIK- or TRAF2-NIK-induced NF- _K B cell activity by increasing the activity level of NF- _K B Interaction with the FAS / APO1 receptor and cytotoxic mediators (MACH, see FIG. 2B) by allowing them to survive or by increasing the direct or indirect interaction between the FAS / APO1 receptor and TRAF2 (or TRAF2-NIK). Decrease to increase NF- _K B activity and induction of cell survival.

역으로, 종양과 감염된 세포의 경우(상기 논의 참고), FAS/APO1 수용체-중개된 세포독성을 증가시켜 세포의 죽음을 증가시킨다. 이와 같은 경우에 FAS/APO1 수용체-TRAF2(또는 FAS/APO1 수용체-TRAF2-NIK) 상호작용을 방해하거나 직접적으로 NIK를 방해하여 NF-_KB 활성 유도를 감소시킨다.Conversely, in the case of tumors and infected cells (see discussion above), FAS / APO1 receptor-mediated cytotoxicity is increased to increase cell death. In such cases it interferes with the FAS / APO1 receptor-TRAF2 (or FAS / APO1 receptor-TRAF2-NIK) interaction or directly interferes with NIK to reduce the induction of NF- _K B activity.

본 발명의 B1 단백질이 TRAF2와 상호작용을 할 수 있기 때문에, 이런 상호작용을 강화하거나 억제해 TRAF2의 활성, 특히, NIK와 TRAF2 상호작용과 관련된 NF-_KB 활성 유도를 억제하거나 강화하는 것이 가능하다. B1과 TRAF2사이의 상호작용의 강화나 억제가 직접 또는 다른 단백질(예, c-IAP1, c-IAP2)을 통하여 가능할 수 있으며 이들 단백질은 TRAF2에 결합하고 B1과 직간접적으로 상호작용한다. 그래서 B1단백질에 집중하고 이것의 TRAF2와의 가능 상호작용을 조절함으로써 TRAF2의 활성을 조절함으로써 전술된 것과 같이 p55-TNF-R과 함께 FAS/APO1(FAS-R)의 효과를 조절할 수 있다.Since the B1 protein of the present invention can interact with TRAF2, it is possible to enhance or inhibit this interaction to inhibit or enhance the activity of TRAF2, in particular the induction of NF- _K B activity associated with NIK and TRAF2 interactions. Do. Enhancement or inhibition of the interaction between B1 and TRAF2 may be possible either directly or through other proteins (eg c-IAP1, c-IAP2), which bind to TRAF2 and directly or indirectly interact with B1. Thus the effect of FAS / APO1 (FAS-R) with p55-TNF-R can be modulated as described above by adjusting the activity of TRAF2 by focusing on the B1 protein and modulating its possible interactions with TRAF2.

전술된 것과 같이, B1은 세포사멸의 중재자, 다시 말하면, 다양한 카스파제 효소에 직접 작용할 수 있는데, 이들 효소의 단백 분해 활성이 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 전술된 FAS/APO1(FAS-R) 또는 p55-TNF-R 효과는 B1의 카스파제(예, MACH와 다른 것들) 조절을 통해 직간접적으로 조절될 수 있고 이들 카스파제는 p55-TNF-R, FAS-R 또는 이의 결합 단백질 MORT-1R과 관련되어 있고 명확하게 여기서 중재된 아팝토시스 반응에 영향을 준다. 그래서 만약 B1이 이들 카스파제와 이들의 활성을 증가시키는 방식으로 상호작용한다면, 이런 상호작용은 전술된 것과 같이 세포 사멸이 바람직할 때 증가되어야 한다, 또는 전술된 것과 같이 세포 사멸이 바람직하지 않을 때 감소되어야 한다. As mentioned above, B1 can act directly on mediators of apoptosis, ie, various caspase enzymes, whose proteolytic activity results in cell death. Thus, the above-described FAS / APO1 (FAS-R) or p55-TNF-R effects can be directly or indirectly controlled through caspase (eg, MACH and others) regulation of B1 and these caspases are regulated by p55-TNF- It is related to R, FAS-R or its binding protein MORT-1R and clearly affects the apoptotic response mediated here. So if B1 interacts with these caspases in a way that increases their activity, this interaction should be increased when cell killing is desired as described above, or when cell killing is undesirable as described above Should be reduced.

그러므로, 위의 측면에서 펩티드, 유기 복합물, 항체와 같은 다양한 물질들이 이런 상호작용이 바람직하지 않을 때 B1과 다양한 다른 단백질사이의 상호작용을 억제할 수 있는 특정 약물을 얻기 위하여 선별될 수 있다. 이런 약물은 아마도 특이적으로 B1의 프로도메인(CARD)을 인식하는 것들이 될 것이다. 예를 들면, 펩티드, 유기 분자, 항체 또는 항체 단편으로 이들은 특이적으로 B1 CARD에 결합하여 이것이 다른 CARD-함유 단백질과 상호작용하는 것을 예방한다. 역으로, B1과 다른 단백질 사이의 상호작용이 바람직하면 이것은 (ⅰ)에서 전술된 것과 같이 표준 공정에 의해 세포내 B1의 양을 증가함으로써 강화될 것이다. 여기서 또한, 세포내 B1의 활성이나 이의 다른 단백질과의 상호작용을 강화할 수 있는 다양한 특이적 약물의 선별이 가능하다.Therefore, in the above aspect, various substances such as peptides, organic complexes and antibodies can be selected to obtain specific drugs that can inhibit the interaction between B1 and various other proteins when such interactions are undesirable. These drugs are probably the ones that specifically recognize the B1 prodomain (CARD). For example, peptides, organic molecules, antibodies or antibody fragments which specifically bind to the B1 CARD to prevent it from interacting with other CARD-containing proteins. Conversely, if the interaction between B1 and other proteins is desired, this will be enhanced by increasing the amount of intracellular B1 by standard processes as described above in (iii). Here, also, the selection of various specific drugs capable of enhancing the activity of B1 in the cell or its interaction with other proteins is possible.

또한, 전술된 것과 같이, B1은 염증, 세포 사멸 또는 생존 경로의 조절 효과에 관여하는 카이나제 도메인을 가지고 있다. 따라서, 이 카이나제 도메인은 다양한 단백질과 결합하고 인산화시켜 이들의 활성을 증가 또는 감소시키는 방식으로 염증, 세포사멸 또는 세포 생존 경로의 활성을 증가시키거나 감소시킨다. 따라서, 다양한 펩티드, 유기 복합물, 항체 등이 염증, 세포 사멸 또는 세포 생존 경로를 억제하거나 강화하는 것 중 어느 하나가 바람직할 때 B1의 카이나제 활성을 억제할 수 있는 특정 약물을 얻기 위하여 선별될 수 있다. In addition, as described above, B1 has a kinase domain that is involved in the regulatory effects of inflammation, cell death or survival pathways. Thus, these kinase domains increase or decrease the activity of inflammation, apoptosis or cell survival pathways in a manner that binds and phosphorylates various proteins to increase or decrease their activity. Thus, various peptides, organic complexes, antibodies and the like can be screened to obtain specific drugs capable of inhibiting the kinase activity of B1 when either one is desired to inhibit or enhance inflammation, cell death or cell survival pathways. Can be.

전술된 것과 같이 B1과 이의 프로도메인과 카이나제 도메인을 통한 다른 단백질과의 상호작용의 펩티드 방해물질을 어떻게 만들고 선별하는지의 예는 ICE 또는 ICE-유사 프로테아제의 펩티드 방해물질에 대한 기존 연구, 펩티드 합성을 이용하여 에피토프 분석을 위한 전략과 ICE 기질 특이성에 대한 연구를 기초로 한다. ICE에 의한 펩티드의 효과적인 절단에 필요한 최소 조건은 P₁ 위치에 아스파르트산을 선호하는 절단 위치의 우측에 네 가지 아미노산과 P₁ 위치에 우측에 메틸아민이 절단위치에 관계한다는 것을 알았다(Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). 또한, 프로로로젠 지질 펩티드(테트라펩티드) 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-코마릴-7-아미드)[약어 Ac-DEVD-AMC]는 FAS-R 자극 그리고 다른 아팝토시스 과정 직후에(Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) 세포에서 절단되는 것으로 밝혀진 폴리(ADP-리보즈) 폴리메라제(PARP)에 있는 서열에 상응하고 CPP32(CED/ICE 프로테아제 족의 한 구성원)와 MACH 프로테아제에 의해 효과적으로 절단된다.Examples of how to create and screen peptide blockers of the interaction of B1 with its prodomains and other proteins via the kinase domain, as described above, are existing studies on peptide blockers of ICE or ICE-like proteases, peptides. The synthesis is based on strategies for epitope analysis and the study of ICE substrate specificity. Minimum conditions required for efficient cleavage of peptide by ICE is a methylamine on the right side of the four amino acids and P ₁ on the right side of the cutting location to favor the aspartic acid in the P ₁ position found that between the cutting position (Sleath et al , 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). In addition, the prologogen lipid peptide (tetrapeptide) acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a- (4-methyl-comaryl-7-amide) [abbreviated Ac-DEVD-AMC] is also used for FAS-R stimulation and other Immediately after the apoptosis process (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) and corresponding sequences in poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) found to be cleaved in cells It is effectively cleaved by CPP32 (a member of the CED / ICE protease family) and the MACH protease.

기질의 P1 위치에 Asp가 중요한 것으로 보이기 때문에, 4번째 아미노산이 Asp를 가지는 테트라펩티드와 처음 세 개 잔기 위치에 다양한 아미노산 복합물을 Gelyson(Geysen, 1985; Geysen et al., 1987)이 개발한 방법을 이용하여 프로테아제의 활성 부위에 결합하는 지를 선별하는데 이 방법은 여러 가지 많은 펩티드를 고형 서포트에 붙이고 항체와 특이적인 상호작용을 하는 지를 선별하였다. 특정 펩티드에 MACH프로테아제가 결합하는 것은 방사능 라벨링과 같은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여 감지할 수 있다. Geysen의 방법은 각 하루 작업일동안 적어도 4000펩티드를 테스트할 수 있다.Since Asp appears to be important at the P1 position of the substrate, a method was developed by Gelyson (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987) for tetrapeptides with the fourth amino acid Asp and various amino acid complexes at the first three residues. This method was used to select whether to bind to the active site of the protease. This method was used to attach many different peptides to the solid support and to specifically interact with the antibody. The binding of the MACH protease to a particular peptide can be detected using various methods known to those skilled in the art, such as radiolabeling. Geysen's method can test at least 4000 peptides each working day.

유사한 방법으로, B1과 다른 단백질사이에 상호작용을 결정하는 정확한 결합 부분 또는 유사성이 있는 부분을 밝혀내고, 이런 상호작용을 봉쇄하는 역학을 하는 펩티드, 예를 들면, CARD나 카이나제 도메인을 통해 또는 심지어 B1 CARD나 카이나제 도메인의 중간 도메인을 통해 세포 사멸과 세포 생존 경로의 다른 단백질과 결합하거나 상호작용하는데 있어 천연 B1과 경쟁하는 결합 부분의 서열과 유사한 또는 이에 상보적인 서열을 가지는 합성된 펩티드가 선별된다.In a similar way, it is possible to identify the exact binding moiety or similarity that determines the interaction between B1 and another protein, and through a peptide that acts to block these interactions, such as a CARD or kinase domain. Or synthesized with sequences similar to or complementary to those of the binding moiety that compete with native B1 for binding or interacting with apoptosis and other proteins in the cell survival pathway through the intermediate domain of the B1 CARD or kinase domain. Peptides are selected.

세포내 신호전달 경로의 다른 구성원이 관계한 세포 사멸과 생존 과정을 방해하지 않고 B1 상호작용을 선택적으로 방해하는 펩티드 방해물질을 고안하는 것이 유익하기 때문에, 전술한 것과 같은 분석에서 B1에 결합하는 펩티드의 풀은 B1에 대해서만 특이성이 있는 것만을 선택하는 그런 다른 펩티드에 대해 B1이 선택적으로 결합하는 지를 테스트하기 위해 플로로젠 기질 펩티드로 합성될 수 있다. 예를 들어 B1의 CARD 또는 카이나제 도메인에 특이성이 있는 것으로 확인된 펩티드는 세포 침투성을 강화시키고 염증, 세포 사멸 또는 세포 생존 과정을 조절할 수 있도록 변형된다. Thornberry et al.,(1994)는 테트라펩티드(아실옥시) 메틸 케톤 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC(O)-[2,6-(CF₃)₂]Ph가 ICE의 강력한 방해물질이라고 보고하였다. 유사하게, Milligan et al.,(1992)는 클로로메틸케톤(비가역적) 또는 알데히드(가역적)기를 가지는 테트라펩티드 방해물질이 ICE를 저해하였다고 보고하였다. 또한, 벤질옥시카르복실-Asp-CH₂OC(O)-2,6-디클로로벤젠(DCB)가 ICE를 방해하는 것으로 나타났다(Ashima et al., 1995). 따라서, 유사한 방식으로 선택적으로 CARD 또는 B1의 카이나제 도메인에 결합하는 테트라펩티드를 알데히드기, 클로로메틸케톤(아실옥시)메틸 케톤 또는 CH₂OC(O)-DCB기를 가지도록 변형시켜 B1 활성의 펩티드 조절물질을 만든다. 또한, 침투성을 개선시키기 위해, 펩티드의 세포막 통과성을 강화시킬 수 있도록 화학적으로 변형시키거나 유도시켜 이와 같은 펩티드가 막을 통하여 세포질로 들어갈 수 있도록 한다. Muranishi etal.,(1991)은 세포 막을 통과하는 성질을 개선시킨 친지성 라우릴 유도체를 만들기 위해 라우린산이 있는 티로트로핀-방출 호르몬을 유도하는 것에 대해 보고하였다. Zachria et al.,(1991)은 메티오닌의 설폭시드 산화와 펩티드 결합을 이의 케토메틸렌 이소에스테르(COCH₂)로 대체하여 세포막을 통한 펩티드의 수송을 실행하였다. 이는 당업자가 잘 인지할 수 있는 공지의 변형 및 유도과정의 일부이다.Peptides that bind to B1 in the same assay as described above, because it is beneficial to design peptide blockers that selectively interfere with B1 interactions without interfering with cell death and survival processes involved in other members of the intracellular signaling pathway. The pool of can be synthesized with the phlorogene substrate peptide to test whether B1 selectively binds to such other peptides that select only those specific for B1 only. For example, peptides that have been identified as specific for the CARD or kinase domain of B1 are modified to enhance cell permeability and modulate inflammation, cell death or cell survival processes. Thornberry et al., (1994) reported that tetrapeptide (acyloxy) methyl ketone Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH ₂ OC (O)-[2,6- (CF ₃ ) ₂ ] Ph is a potent ICE. Reported as interfering substance. Similarly, Milligan et al. (1992) reported that tetrapeptide blockers with chloromethylketone (non-reversible) or aldehyde (reversible) groups inhibited ICE. Benzyloxycarboxyl-Asp-CH ₂ OC (O) -2,6-dichlorobenzene (DCB) has also been shown to interfere with ICE (Ashima et al., 1995). Thus, in a similar manner, a tetrapeptide that selectively binds to the kinase domain of CARD or B1 is modified to have an aldehyde group, chloromethylketone (acyloxy) methyl ketone or CH ₂ OC (O) -DCB group to peptide of B1 activity. Create a modulator. In addition, to improve the permeability, chemical modifications or inductions are made to enhance the cell membrane permeability of the peptides so that such peptides can enter the cytoplasm through the membrane. Muranishi et al. (1991) reported the induction of thyrotropin-releasing hormone with lauric acid to make lipophilic lauryl derivatives with improved cell membrane transmembrane properties. Zachria et al. (1991) performed the transport of peptides through cell membranes by replacing sulfoxide oxidation of methionine and peptide bonds thereof with ketomethylene isoester (COCH ₂ ). This is part of a known modification and derivation process that is well known to those skilled in the art.

또한, B1과 CARD, 카이나제 또는 중간 도메인을 통해 여기에 결합하는 단백질과의 상호작용을 방해함으로써 세포 사멸과 세포 생존 경로를 억제할 수 있는 약물 또는 펩티드 방해물질은 세포로 들어갈 수 있는 분자와 결합하거나 복합시킬 수 있다.In addition, drugs or peptide blockers that can inhibit cell death and cell survival pathways by interfering with B1 and CARD, kinases, or proteins that bind to them through intermediate domains, are also known as molecules that can enter the cell. Can be combined or combined.

미국 특허 5,149,782에서는 세포막을 통하여 이동될 분자에 퓨소제닉(fusogenic) 폴리펩티드, 이온-채널 형성 폴리펩티드, 다른 막 폴리펩티드, 미리스틱산, 팔미드산과 같은 긴 사슬 지방산등과 같은 막 혼합물질과 결합시킬 수 있다. 이와 같은 막 혼합 물질은 세포 막의 지질 이중층에 분자 결합물질을 삽입하여 세포질로 이들을 들어가게 할 수 있다고 상술하고 있다.U.S. Patent 5,149,782 can associate a molecule to be transported through a cell membrane with membrane mixtures such as fusogenic polypeptides, ion-channel forming polypeptides, other membrane polypeptides, mystic acids, long chain fatty acids such as palmidic acid, and the like. . Such membrane mixtures have been described as being able to insert molecular binding materials into the lipid bilayer of cell membranes and allow them to enter the cytoplasm.

Low et al.,의 미국 특허 5,108,921에서는 수용체 중개된 엔도사이토시스 활성 메카니즘에 의해 단백질 및 핵산을 포함하나 이에 국한시키지 않는 분자를 막을 통하여 수송하는 방법에 대해 언급하고 있다. 이와 같은 수용체 시스템에는 이들을 인지하는 갈락토즈, 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, 트랜스페린, 아시알글리토프로테인, 트란스코발민(비타민 B₁₂), α-2 마크로글로불린, 인슐린 및 상피 성장 인자(EGF)와 같은 다른 펩티드 성장 인자 등을 포함한다. Low et al.,은 바이오틴 및 폴레이트(folate)와 같은 영양소 수용체를 이용하면 대부분의 세포 표면에 바이오틴 및 폴레이트가 다수 위치하고 막 수용체 중개된 연합적인 막 통과 과정으로 인하여 막을 통한 수송을 강화시킬 수 있다. 따라서, 세포질로 수송할 화합물과 바이오틴 또는 폴레이트와 같은 리간드간사이에 형성된 복합체는 바이오틴 또는 폴레이트를 포함하는 세포 막과 접촉하게 되어 수용체 중개된 막-통과 수송을 개시하고 세포안으로 원하는 화합물이 들어가게 된다.U.S. Patent 5,108,921 to Low et al., Describes a method for transporting molecules, including but not limited to proteins and nucleic acids, through a membrane by means of receptor mediated endocytosis activity mechanisms. Such receptor systems include galactose, mannose, mannose-6-phosphate, transferrin, asialglytoprotein, transcobalmin (vitamin B ₁₂ ), α-2 macroglobulin, insulin and epidermal growth factor (EGF) that recognize them. Other peptide growth factors, and the like. Low et al., Found that nutrient receptors such as biotin and folate enhance the transport through membranes due to the associated membrane transduction process, where a large number of biotin and folate are present on most cell surfaces and membrane receptor mediated. have. Thus, a complex formed between a compound to be transported into the cytoplasm and a ligand such as biotin or folate is brought into contact with the cell membrane containing the biotin or folate to initiate receptor mediated membrane-through transport and entry of the desired compound into the cell. .

ICE는 P₂ 위치에 자유로운 치환을 허용하는 능력을 가진 것으로 알려져 있고, 이와 같은 치환을 견딜 수 있기 때문에 바이오틴을 가진 강력하고 매우 선택성이 큰 친화성 라벨로 예측하고 있다(Thornberry et al., 1994). 결과적으로, P₂ 위치와 테트라펩티드 방해물질의 N-말단을 변형 또는 유도하여 바이오틴 분자를 추가하여 세포막을 통하여 이와 같은 펩티드 방해물질의 침투성을 강화한다.ICE is known to have the ability to allow free substitution at the P ₂ position, and because it can tolerate such substitution, it is predicted to be a strong and highly selective affinity label with biotin (Thornberry et al., 1994). . As a result, a biotin molecule is added by modifying or inducing the N-terminus of the P ₂ position and the tetrapeptide blocker to enhance the permeability of such peptide blocker through the cell membrane.

또한, 본 기술에 공지된 바와 같이, 원하는 펩티드 서열에 리더/신호 펩티드 서열을 융합시켜 "키메라 펩티드"를 만들면 이와 같은 키메라 펩티드는 세포막을 통하여 세포질로 수송될 수 있다.In addition, as is known in the art, when a leader / signal peptide sequence is fused to a desired peptide sequence to make a “chimeric peptide,” such chimeric peptide can be transported into the cytoplasm through the cell membrane.

펩티드 분야에 숙지의 지식을 가진 자는 다른 단백질과의 B1 상호작용을 방해하는 펩티드 억제물질은 전술된 것과 같이 본 발명에 따라 펩티드를 모방한 약물 또는 방해물질을 포함하며 이것들은 좀더 안정적인 방해물질을 만들기 위해 B1의 CARD, 카이나제 또는 중간 도메인에 결합하는 지가 신속하게 선별될 수 있다.Those skilled in the art of peptides, peptide inhibitors that interfere with B1 interactions with other proteins include drugs or inhibitors that mimic peptides according to the present invention, as described above, which make them more stable. The binding to the CARD, kinase or intermediate domain of B1 can be quickly screened.

전술한 것과 같이 세포막을 통하여 펩티드 방해물질의 수송을 실행하거나 강화하기 위한 동일한 수단이 B1특이적 펩티드와 단백질 및 B1의 단백질 동소체, 유사체 또는 단편 적용될 수있다.As described above, the same means for effecting or enhancing the transport of peptide blockers through the cell membrane can be applied to B1 specific peptides and proteins and protein allotropes, analogs or fragments of B1.

명세서를 통하여 언급된 항체에 있어 "항체"란 용어는 다클론성 항체, 단클론성 항체(mAbs), 키메라 항체, 가용성 또는 결합형의 라벨이 된 항체에 대한 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술등과 같이 임의 공지된 기술에 의해 만들 수 있는 항체 단편을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.For antibodies referred to throughout the specification, the term "antibody" refers to anti-idiotypes (anti-Ids) for polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies, soluble or bound labeled antibodies. And include, but are not limited to, antibody fragments that can be made by any known technique, such as cleavage by antibodies and enzymes, peptide synthesis, and recombinant techniques.

다클론성 항체는 항원으로 면역 처리한 동물의 혈장으로부터 유도한 이형 집단 항체 분자를 말한다. 단클론성 항체는 항원에 특이적인 실제 동종의 항체 집단을 의미하는데 이들 집단에는 실제 유사한 에피토프 결합 부위를 가진다. mAbs는 Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975); 미국 특허 4,376,110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES; A LABORATORY MANAUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); and Colligan et al., eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y.,(1992-199)에 상술한 기술을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이의 하류를 포함하는 임의 이뮤노글로블린이 된다. 본 발명의 mAb를 만드는 하이브리도마는 in vitro, in vivo, in situ에서 배양할 수 있다. in vivo 또는 in situ의 고역가의 단클론항체 생산이 적절한 방법이다.Polyclonal antibodies refer to heterologous population antibody molecules derived from the plasma of animals immunized with antigen. Monoclonal antibodies refer to a real homogeneous group of antibodies specific for the antigen, which have in fact similar epitope binding sites. mAbs are described in Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); U.S. Patent 4,376,110; Ausubel et al., Eds., Harlow and Lane ANTIBODIES; A LABORATORY MANAUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); and Colligan et al., eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-199). Such antibodies are any immunoglobulin, including IgG, IgM, IgE, IgA, GILD and downstream thereof. Hybridomas making the mAb of the present invention can be cultured in vitro, in vivo, in situ. High titer monoclonal antibody production in vivo or in situ is an appropriate method.

키메라 항체는 상이한 부분을 가지는 분자로 뮤린(murin) mAb와 사람 이뮤노글로블린 항상부분에서 유도한 다양한 부분을 가지는 다른 동물종에서 유도할 수 있는 것이다. 주로 키메라 항체는 면역원성을 감소시키는데 이용되고 생산성을 증가시키는데 이용되는데 가령 뮤린 mAb는 하이브리도마에서 높은 역가를 가지나 사람에서는 높은 면역원성을 가지기 때문에 사람/뮤린 키메라 mAb를 이용한다. 키메라 항체와 이를 생산하는 방법에 대해서는 본 분야에 공지되어 있다(Cabily et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81;3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646(1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496(published Feb 19, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494(published Mar 13, 1996); Kudo et al., European Patent Application 184187(published June 11, 1986); Sahagan et al., J. Immunol 137;1066-1074(1986); Robinson et al., International Patent Application No. Wo 8702671(published May 7, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 3439-3443(1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84-214-218(1987); Better et al., Science 240;1041-1043(1988) and Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, supra.Chimeric antibodies are molecules with different moieties that can be derived from different animal species with various moieties derived from murine mAbs and human immunoglobulin alleles. Primarily chimeric antibodies are used to reduce immunogenicity and increase productivity, for example murine mAbs use human / murine chimeric mAbs because they have high titers in hybridomas but high immunogenicity in humans. Chimeric antibodies and methods for producing them are known in the art (Cabily et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81; 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496 (published Feb 19, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494 (published Mar 13, 1996); Kudo et al., European Patent Application 184187 (published June 11, 1986); Sahagan et al., J. Immunol 137; 1066-1074 (1986); Robinson et al., International Patent Application No. Wo 8702671 (published May 7, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 3439-3443 ( 1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.84-214-218 (1987); Better et al., Science 240; 1041-1043 (1988) and Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, supra.

항-이디오타입(항-Id) 항체는 항체의 항원 결합 부위와 일반적으로 연합하는 독특한 결정 부위를 인지하는 항체이다. Id 항체는 항-Id를 만든 mAb원으로써 동일 종 그리고 동일한 유전자형의 동물(가령, 쥐 strain)에 면역처리하여 준비할 수 있다. 면역처리된 동물은 이와 같은 이들 이디오타입 항원결정기에 대한 항체를 준비함으로써 면역처리된 항체의 이디오타입 결정부위를 인지하고 반응한다(참고 미국 특허 4,699,880).An anti-idiotype (anti-Id) antibody is an antibody that recognizes a unique determining site that generally associates with the antigen binding site of the antibody. Id antibodies can be prepared by immunization of animals of the same species and of the same genotype (eg, mouse strain) as the mAb source that produced the anti-Id. Immunized animals recognize and respond to the idiotype determining regions of the immunized antibody by preparing antibodies to these idiotype epitopes (see US Pat. No. 4,699,880).

항-id 항체는 다른 동물에서 소위 항-항-id 항체를 만드는 면역 반응을 유도하는 "이뮤노겐"으로 이용될 수 있다. 항-항-id는 항-ID를 유도한 원래 mAb의 에피토프와 동일하다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정부위에 대한 항체를 이용함으로써 동일한 특이성을 가지는 항체를 발현시키는 다른 클론을 확인할 수 있다.Anti-id antibodies can be used as "immunogens" to induce an immune response that makes so-called anti-anti-id antibodies in other animals. The anti-anti-id is identical to the epitope of the original mAb that induced the anti-ID. Therefore, by using the antibody against the idiotype determining region of the mAb, other clones expressing the antibody having the same specificity can be identified.

따라서, 본 발명의 B1단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체에 대항하여 발생된 mAb을 이용하여 BALB/c 쥐과 같은 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도할 수 있다. 이와 같은 면역처리된 쥐의 췌장 세포를 이용하여 항-Id mAb를 분비하는 항-Id 하이브리드를 생산한다. 또한, 항-Id mAb를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 결합시켜 추가 BALB/c 쥐를 면역처리한다. 이들 쥐의 혈청에는 상기 B1 단백질 또는 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체의 에피토프에 특이적인 고유 mAb의 결합 성질을 가지는 항-항-Id 항체를 포함할 수 있다.Thus, mAbs generated against the B1 protein, its allotropes, analogs or fragments and derivatives of the invention can be used to induce anti-Id antibodies in suitable animals such as BALB / c mice. The pancreatic cells of such immunotreated mice are used to produce anti-Id hybrids that secrete anti-Id mAbs. In addition, the anti-Id mAb is bound to keyhole limpet hemocyanin (KLH) to immunize additional BALB / c mice. The serum of these mice may comprise an anti-anti-Id antibody having the binding properties of the native mAb specific for the epitope of the B1 protein or its allotropes, analogs or fragments and derivatives.

따라서, 항-Id mAbs에는 이들 고유의 이디오타입 에피토프 또는 GRB 단백질-a와 같은 평가할 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프(idiotopes)"를 가진다.Thus, anti-Id mAbs have "idiotopes" that are structurally similar to epitopes to be evaluated, such as these unique idiotype epitopes or GRB protein-a.

"항체"란 용어는 고유 항체뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')₂와 같은 단편을 포함한다. Fab와 F(ab')₂ 단편은 고유 항체의 Fc 단편이 부족하고 순환계로 부터 더 빨리 제거되고 고유 항체보다는 다소 특이성이 적은 조직 결합을 가진다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24;316-325(1983)).The term "antibody" includes fragments such as Fab, F (ab ') ₂ capable of binding to the antigen as well as native antibodies. Fab and F (ab ') ₂ fragments lack Fc fragments of native antibodies and are more quickly removed from the circulation and have somewhat less specific tissue binding than native antibodies (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24; 316-325 (1983).

Fab와 F(ab')₂ 및 본 발명의 항체의 다른 단편을 이용하면 고유 항체 분자에 대해 본 발명에서 상술하고 있는 B1 단백질의 감지와 정량을 할 수 있다. 이와 같은 단편은 일반적으로 파파인(Fab 단편을 만듬) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편을 만듬)과 같은 효소를 이용하여 단백질 분해에 의해 만들 수 있다.Fab and F (ab ') ₂ and other fragments of the antibodies of the invention allow detection and quantification of the B1 protein described herein in detail for native antibody molecules. Such fragments can generally be made by proteolysis using enzymes such as papain (creating Fab fragments) or pepsin (creating F (ab ') ₂ fragments).

항체는 분자에 특이적으로 반응한다면 특이적으로 분자에 결합할 수 있는 능력이 있는 항체에 분자가 결합한다. "에티토프"는 항체에 의해 인지되어 항체가 분자의 임의 부분에 결합할 수 있는 부분을 말한다. 에피토프 또는 "항원 결정부위"는 일반적으로 아미노산 또는 당의 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성이 있는 표면 그룹으로 구성되고 3차 구조적인 특징 및 특이적인 전하 특징을 가진다.If an antibody reacts specifically to a molecule, the molecule binds to an antibody that has the ability to specifically bind to the molecule. "Etitope" refers to a moiety recognized by an antibody so that the antibody can bind to any part of the molecule. Epitopes or “antigen determinants” are generally composed of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or side chains of sugars and have tertiary structural and specific charge characteristics.

"항원"은 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 만들기 위해 동물에 추가 유도할 수 있는 항체에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가진다. 상기에서 언급한 특이적인 반응은 매우 특이적인 방식으로 항원에 상응하는 항체에 반응을 하고 다른 항원에 의해 야기되는 다른 항체에는 반응하지 않는다는 것을 말한다.An “antigen” is a molecule or portion of a molecule that can bind to an antibody that can be further induced in an animal to make an antibody that can bind to an epitope of an antigen. An antigen has one or more epitopes. The specific reactions mentioned above refer to antibodies that correspond to antigens in a very specific manner and not to other antibodies caused by other antigens.

본 발명에 유용한 항체의 일부분을 포함하는 항체를 이용하여 샘플에서 B1 단백질을 정량 또는 정성적으로 감지하거나 본 발명의 B1단백질을 발현시키는 세포의 존재를 확인할 수 있다. 이는 광 현미경, 흐름 세포 계산기 또는 형광측정 감지기가 결합된 형광 라벨된 항체(하기 참조)를 이용한 면역형광 기술을 이용한다.Antibodies comprising a portion of an antibody useful in the present invention can be used to quantitatively or qualitatively detect a B1 protein in a sample or to confirm the presence of cells expressing the B1 protein of the invention. It utilizes immunofluorescent techniques using fluorescently labeled antibodies (see below) incorporating light microscopy, flow cytometry or fluorometry sensors.

본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 조직학적으로 이용하여 면역형광 또는 면역전자 현미경에서 본 발명의 B1 단백질의 in situ 감지한다. In situ 감지는 환자에서 조직학적 견본을 떼내고, 본 발명의 라벨된 항체를 견본에 제공하여 이루어진다. 항체(또는 이의 단편)은 생물학적 샘플에 라벨된 항체(또는 이의 단편)을 제공하거나 겹치게 하여 적절하게 제공할 수 있다. 이와 같은 과정을 이용하여 B1 단백질의 존재를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 검사한 조직에서 이의 분포를 알 수 있다. 본 발명을 이용하면, 당업자는 이와 같은 in situ 감지를 위해 광범위한 다양한 조직학적 방법(가령 착색 과정)을 변형시킬 수 있음을 인지할 것이다.The antibody (or fragment thereof) of the invention is used histologically to detect in situ of the B1 protein of the invention on immunofluorescence or immunoelectron microscopy. In situ detection is done by removing the histological specimen from the patient and providing the labeled antibody of the invention to the specimen. The antibody (or fragment thereof) may be appropriately provided by providing or overlapping the labeled antibody (or fragment thereof) in the biological sample. This procedure can be used to determine the presence of B1 protein as well as to determine its distribution in the tissues examined. Using the present invention, those skilled in the art will recognize that a wide variety of histological methods (such as the staining process) can be modified for such in situ detection.

본 발명의 B1 단백질의 생물학적 검사는 일반적으로 B1 단백질을 확인할 수 있는 감지 가능한 라벨된 항체 존재하에 생물학적 유체, 조직 추출물, 임파세포 또는 백혈구세포와 같은 새로 수득한 조직 또는 조직 배양물에서 배양된 세포를 배양하고, 공지의 여러 가지 방법을 이용하여 항체를 감지하는 것으로 구성된다.Biological testing of the B1 protein of the invention generally involves testing cells cultured in freshly obtained tissues or tissue cultures such as biological fluids, tissue extracts, lymphocytes or leukocytes in the presence of a detectable labeled antibody capable of identifying the B1 protein. Culture and detect the antibody using a variety of known methods.

생물학적 샘플은 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 서포트 또는 담체와 같은 고형상 서포트 또는 담체로 처리한다. 서포트 또는 담체는 전술한 것과 같이 본 발명에 따른 감지 가능한 라벨링된 항체로 처리한 후에 적절한 완충액으로 세척한다. 고형상 서포트 또는 담체를 다시 세척하여 결합안된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체에 결합된 라벨의 양을 통상적인 방법을 이용하여 감지한다.Biological samples are treated with a solid support or carrier, such as nitrocellulose or other support or carrier capable of immobilizing cells, cell particles or soluble proteins. The support or carrier is washed with appropriate buffer after treatment with the detectable labeled antibody according to the invention as described above. The solid support or carrier is washed again to remove unbound antibody. The amount of label bound to the solid support or carrier is sensed using conventional methods.

"고형성 서포트", "고형상 담체", "고형 서포트", "고형 담체", "서포트" 또는 "담체"는 항원 또는 항체가 결합할 수 있는 임의 서포트 또는 담체를 의미한다. 공지의 서포트 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나이론 아밀라제, 천연 또는 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다. 천연 담체는 본 발명의 목적을 위해 어느 정도의 가용성 또는 불용성일 수 있다. 서포트 물질은 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 임의 가능한 구조적인 모양을 가질 수 있다. 따라서, 서포트 또는 담체 모양은 비드와 같은 원형, 시험관의 내부 또는 막대의 외부와 같은 실린더형이 될 수 있다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 스트립등과 같은 편평한 것일 수 있다. 적절한 서포트 또는 담체는 폴리스테렌 비드를 포함한다. 당업자는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 다른 적절한 담체를 이용할 수 있고 임의 실험을 통하여 결정할 수 있다."Solid support", "solid support", "solid support", "solid support", "support" or "carrier" means any support or carrier to which an antigen or antibody can bind. Known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon amylase, natural or modified cellulose, polyacrylamide, gabbro and magnetite. Natural carriers may be to some extent soluble or insoluble for the purposes of the present invention. The support material may have any possible structural shape as long as it can bind an antigen or an antibody. Thus, the support or carrier shape may be circular, such as beads, cylindrical, such as the inside of a test tube or the outside of a rod. Or the surface may be flat, such as a sheet, a test strip, or the like. Suitable supports or carriers include polystyrene beads. One skilled in the art can use other suitable carriers that can bind antigens or antibodies and can determine them through any experiment.

전술된 본 발명의 부여된 많은 항체의 결합 활성은 공지된 방법들에 따라 결정될 것이다. 당업자들은 일상적 실험을 사용함으로써 각각의 결정에 대한 운영 및 최적 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.The binding activity of many of the antibodies conferred of the invention described above will be determined according to known methods. Those skilled in the art will be able to determine the operational and optimal assay conditions for each determination by using routine experimentation.

세척, 교반, 혼합, 여과등과 같은 다른 과정은 특정 상황에 따라 또는Other procedures such as washing, stirring, mixing, filtration, etc. may be

통상적인 과정에 따라 추가할 수 있다. It can be added according to a conventional procedure.

본 발명에 따른 항체는 효소를 연결하여 감지 가능한 라벨링을 하고 효소 면역검사(EIA)에 이용할 수 있다. 다시 이와 같은 효소는 적절한 기질에 노출되었을 때, 분광광도계, 형광 측정 또는 다른 시각적 수단등으로 감지할 수 있는 화학적 부분을 만드는 방식으로 기질과 반응한다. 항체에 감지가능한 라벨링을 하는데 이용되는 효소로는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이소메라제, 효모 알코올 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레이즈, 카탈라제, 포도당-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린-에스테라제 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 효소에 대한 발색 기질을 이용하는 발색 방법으로 감지할 수 있다. 유사하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응의 정도를 시각적으로 비교함으로써 감지할 수 있다. Antibodies according to the invention can be used for enzyme immunoassay (EIA) and detectable labeling by linking enzymes. Again, such an enzyme reacts with a substrate when exposed to an appropriate substrate, creating a chemical moiety that can be detected by spectrophotometry, fluorescence measurements, or other visual means. Enzymes used for detectable labeling of antibodies include maleate dehydrogenase, Staphylococcus nuclease, delta-5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydrogenase, alpha-glycerophosphate dehydrogena Agent, triose phosphate isomerase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonucleases, eurease, catalase, glucose-6-phosphate Dehydrogenase, glucoamylase, acetylcholine-esterase, and the like. It can be detected by the color development method using a color development substrate for the enzyme. It can be detected by visually comparing the extent of enzymatic reaction of the substrate against similarly prepared standards.

다양한 다른 면역검사를 이용하여 감지할 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편에 방사능활성 라벨링을 함으로써, 방사능 면역검사(RIA)를 통한 R-PTPase를 감지할 수 있다. RIA에 대해서는 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY(1978) with particular reference to the chapter entitled "An Imtroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard. T.에 상세하게 기술하고 있다. 방사능활성 에피토프는 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사 등에 의해 감지될 수 있다.Various other immunoassays can be used to detect them. For example, by radioactive labeling of antibodies or antibody fragments, R-PTPase can be detected via radioimmunoassay (RIA). For RIA, Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) with particular reference to the chapter entitled "An Imtroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard. It is described in detail in T. Radioactive epitopes can be detected by counters or scintillation counters or by self-radiation.

형광 화합물로 본 발명에 따른 항체를 라벨할 수 있다. 형광 라벨된 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키면, 형광이 존재하기 때문에 존재를 확인할 수 있다. 흔히 이용되는 형광 라벨링 화합물중에는 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플로로카민 등을 포함한다.Fluorescent compounds can be used to label antibodies according to the invention. When the fluorescently labeled antibody is exposed to light of an appropriate wavelength, the presence of fluorescence can be confirmed. Commonly used fluorescent labeling compounds include fluorescent isothiocyanates, rhodamine, phycoerytin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, and phlolocamine.

항체는 ¹⁵²E 또는 다른 란탄이드과 같은 형광을 발생하는 금속을 이용하여 라벨링을 할 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 기를 이용하여 항체에 결합할 수 있다.Antibodies can be labeled using metals that generate fluorescence such as ¹⁵² E or other lanthanides. Such metals can be bound to antibodies using metal chelate groups such as diethylenetriamine pentaacetic acid (ETPA).

항체는 화학적 발광 화합물에 결합시켜 감지 가능한 라벨링을 할 수 있다. 화학적 발광 화합물이 결합된 항체는 화학 반응 과정동안에 발생하는 발광을 존재를 감지함으로써 결정할 수 있다. 특히 유용한 화학적 발광 라벨링 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 트레오마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리딘염 및 옥살레이트 에스테르이다.Antibodies can bind to chemiluminescent compounds for detectable labeling. Antibodies bound to chemiluminescent compounds can be determined by sensing the presence of luminescence that occurs during the course of a chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, threomatic acridinium esters, imidazoles, acridine salts and oxalate esters.

유사하게, 생물학적 발광 화합물을 이용하여 본 발명의 항체를 라벨링시킬 수 있다. 생물학적 발광은 촉매 단백질이 화학적 발광 반응의 효과를 증가시키는 생물계에서 볼 수 있는 일종의 화학적 발광이다. 생물학적 발광의 존재는 발광의 존재를 감지하여 결정할 수 있다. 라벨링을 목적으로 하는 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린이 있다.Similarly, bioluminescent compounds can be used to label the antibodies of the invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in the biological system in which catalytic proteins increase the effect of chemiluminescence reactions. The presence of biological luminescence can be determined by sensing the presence of luminescence. Important bioluminescent compounds for labeling purposes are luciferin, luciferase and ecuorin.

본 발명의 항체 분자는 "two-site" 또는"sandwich"검사로 공지된 면역측정 검사에 이용할 수 있다. 일반적인 면역측정 검사에서 라벨안된 항체(또는 항체의 단편)의 양은 고형 서포트 또는 담체에 결합된 것이고 감지 가능한 라벨된 가용성 항체를 첨가하면 고형상 항체, 항원 및 라벨된 항체간에 형성된 세 가지 복합체의 감지 및 정량할 수 있다.The antibody molecules of the invention can be used for immunoassay tests known as "two-site" or "sandwich" tests. The amount of unlabeled antibody (or fragment of antibody) in a typical immunoassay is bound to a solid support or carrier and the addition of a detectable labeled soluble antibody detects and detects three complexes formed between the solid, antigen and labeled antibody. Can be quantified.

일반적인 그리고 적절한 면역측정 검사에는 "forward" 검사를 포함하는데 이는 고형상에 결합된 항체를 우선 고형상과 항원 복합체를 형성할 수 있도록 샘플에서 항원을 추출하기 위해 샘플과 접촉시킨다. 적절한 배양 기간 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 반응 안한 항원을 포함하는 유체 샘플 잔류물을 제거하고 양을 모르는 라벨된 항체를 포함하는 용액과 접촉시킨다(이는 "reporter" 분자로 작용을 함). 고형 서포트 또는 담체에 결합된 항원 복합체에 라벨된 항체를 결합시키기 위한 제2배양 기간 후에, 고형 서포트 또는 담체는 2번째로 세척하여 반응 안된 라벨링 항체를 제거한다.Common and appropriate immunoassay assays include a "forward" assay, in which the antibody bound to a solid phase is first contacted with the sample to extract antigen from the sample to form an antigen complex with the solid phase. After an appropriate incubation period, the solid support or carrier is washed to remove fluid sample residues containing unreacted antigen and contacted with a solution containing an unknown amount of labeled antibody (which acts as a "reporter" molecule). . After the second incubation period for binding the labeled antibody to the antigen complex bound to the solid support or carrier, the solid support or carrier is washed a second time to remove unreacted labeling antibody.

또 다른 형태의 "snadwich" 검사는 본 발명의 항원을 유용하게 이용하는 것으로 소위 "simultaneous" 또는 "reverse" 검사를 이용한다. 동시검사는 고형상 서포트에 결합된 항체와 라벨된 항체를 동시에 테스트할 샘플에 첨가하는 1단계 배양 단계로 구성된다. 배양이 완료된 후에, 고형상 서포트 또는 담체를 세척하여 유체 샘플 잔류물과 결합 안된 라벨된 항체를 제거한다. 고형상 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "forward" 샌드위치 검사와 같이 결정된다.Another form of "snadwich" test utilizes the antigen of the present invention usefully, so-called "simultaneous" or "reverse" test. Simultaneous testing consists of a one-step culture step in which the antibody bound to the solid support and the labeled antibody are added to the sample to be tested simultaneously. After incubation is complete, the solid support or carrier is washed to remove labeled antibodies that are not bound to the fluid sample residue. Labeled antibodies associated with a solid support or carrier are determined as in a "forward" sandwich test.

"reverse" 검사에서, 유체 샘플에 라벨된 항체 용액을 우선 첨가하고 적절한 배양 시간 후에 고형 서포트 또는 담체에 라벨 안된 항체를 첨가한다. 제2배양 후에, 고형상은 통상의 방식으로 세척하여 테스트할 샘플에 잔류물과 반응 안된 라벨링된 항체 용액을 제거한다. 고형 서포트 또는 담체와 연합된 라벨된 항체는 "simultaneous" 또는 "forward" 검사와 같이 결정할 수 있다.In the "reverse" test, the labeled antibody solution is first added to the fluid sample and the unlabeled antibody is added to the solid support or carrier after the appropriate incubation time. After the second culture, the solid phase is washed in a conventional manner to remove the labeled antibody solution that has not reacted with the residue in the sample to be tested. Labeled antibodies associated with a solid support or carrier can be determined, such as a "simultaneous" or "forward" test.

전술한 것과 같이, 본 발명은 또한 B1 단백질을 기호화하는 재조합 동물 바이러스로 구성된 제약학적 조성물에 관계하는데, 이들 벡터들은 세포에 B1 단백질 서열을 삽입하기 위한 특정 표적 세포(암 세포) 표면 단백질에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 기호화한다. 또한 본 발명의 제약학적 조성물에는 활성성분으로써 B1 단백질 서열의 안티-센스 서열을 기호화하는 올리고누클레오티드(a)와 다른 단백질과 B1 단백질 상호작용을 차단하는 약물(b)로 구성된다.As mentioned above, the present invention also relates to pharmaceutical compositions consisting of recombinant animal viruses that encode the B1 protein, which vectors will bind to specific target cell (cancer cell) surface proteins for inserting the B1 protein sequence into the cell. Can encode viral surface proteins. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention comprises an oligonucleotide (a) which encodes the anti-sense sequence of the B1 protein sequence as an active ingredient and a drug (b) which blocks the B1 protein interaction with other proteins.

본 발명에 따른 제약학적 조성물에는 원하는 목적을 실행하기 위해 충분한 양의 활성성분을 포함한다. 또한, 제약학적 조성물은 제약학적으로 이용할 수 있는 조제물에 활성화합물을 프로세싱할 수 있는 그리고 환자에게 투약할 조제물을 안정화시킬 수 있는 부형제 및 보조제로 구성된 제약학적 조성물 수용 가능한 담체로 구성되는데 이는 당업자에게 공지되어 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention contains a sufficient amount of the active ingredient to fulfill the desired purpose. In addition, the pharmaceutical composition consists of a pharmaceutical composition acceptable carrier consisting of excipients and auxiliaries capable of processing the active compound into a pharmaceutically available formulation and stabilizing the formulation to be administered to a patient, Known to

B1 단백질 및 이의 동소체 또는 이소타입은 공동 출원에서 언급하고 있는 것과 같이, 세포내 신호발생 경로에 관여하는 다양한 다른 단백질의 발현에는 유사한 방식으로 상이한 패턴의 이소타입과 함께 여러 조직에서 상당히 다른 수준으로 발현되는 것으로 보인다. 이와 같은 차이는 Fas/APO1-리간드와 TNF에 반응하는 조직-특이적 반응을 일으키게 한다. 다른 CED3/ICE 동소체의 경우와 같이(Wang et al.,; Alnemri et al., 1995), 본 발명은 불완전한 CED3/ICE부분(가령, MACHα3)을 포함하는 MACH 동소체는 공동 발현된 MACHα1-MACHα2 분자의 활성에 방해효과를 가지는 것으로 밝혀졌고; 이는 Fas/APO1과 p55-R에 의한 죽음 유도를 차단하는 것으로 밝혀졌다. 세포에서 이와 같은 저해성 동소체의 발현은 Fas/APO1 및 TNF-중개된 세포독성에 대해 세포의 자가-방어 기작에 관여한다. CED3/ICE 족의 다른 프로테아제에서 관찰되는 것보다 상당히 초과한 MACH 동소체의 광범위한 이형성(heterogeneity)으로 인하여 활성 MACH 동소체의 기능을 매우 정교하게 조절할 수 있도록 한다.The B1 protein and its allotropes or isotypes are expressed at different levels in different tissues with different patterns of isotypes in a similar manner to the expression of various other proteins involved in intracellular signaling pathways, as mentioned in the co-application. Seems to be. This difference leads to a tissue-specific response to Fas / APO1-ligand and TNF. As with other CED3 / ICE allotropes (Wang et al., Alnemri et al., 1995), the present invention relates to a MACH allotropy comprising an incomplete CED3 / ICE moiety (e.g., MACHα3) is a co-expressed MACHα1-MACHα2 molecule. It has been found to have an interfering effect on the activity of; It was found to block death induction by Fas / APO1 and p55-R. Expression of such inhibitory allotropes in cells is involved in the cell's self-defense mechanism against Fas / APO1 and TNF-mediated cytotoxicity. The extensive heterogeneity of the MACH allotropes significantly exceeded those observed in other proteases of the CED3 / ICE family, allowing for very precise control of the function of the active MACH allotropes.

전술된 것과 같이, B1단백질 또는 가능 동소체는 다른 조직에 다양한 효과를 가질 수 있다. 예를 들면, 이런 다양한 효과는 다른 단배질의 염증, 세포사멸 또는 세포 생존 과정에서의 이들의 상호작용과 이들 경로의 활성, 특히, 이들 사이의 균형과 이런 균형이 하나의 방식이나 다른 방식으로 이동되는 지의 여부에 대한 이들의 영향과 같은 것이 될 것이다. As mentioned above, the B1 protein or possible allotrope can have various effects on other tissues. For example, these various effects can be attributed to their interactions with other proteins in the process of inflammation, apoptosis or cell survival and the activity of these pathways, in particular the balance between them and the balance shifted in one way or another. It will be the same as their influence on the will.

가능한 B1 단백질중의 일부는 다른 기능을 할 수 있다. 가령, B1 또는 이의 유사체 또는 동소체는 전술된 세포 사멸 또는 생존 과정에 관련없는 다른 세포내 경로에 관여하는 분자들의 결합 위치로써 작용을 한다. Some of the possible B1 proteins can function differently. For example, B1 or an analog or allotrope thereof acts as a binding site for molecules involved in other intracellular pathways that are not involved in the process of cell death or survival described above.

세포 죽음의 원인이 되는 Fas/APO1과 TNF 수용체의 독특한 능력 및 다른 조직-손상 활성을 자극하는 TNF 수용체의 능력으로 인하여 이들 수용체의 기능의 변형은 유기체에 상당히 유해하다. 또한, 이들 수용체의 과도한 또는 결핍된 기능은 다양한 질병의 병인에 기여한다(Vassalli, 1992, Nagata and Golstein, 1995). 수용체의 신호 발생에 참여하는 분자의 확인 및 이들 분자의 활성을 조절하는 방법을 발견하는 것이 새로운 치료요법을 발견하는 것이다. TRAF 단백질과 직간접적으로 상호작용하는 B1 단백질의 추측되는 중요한 역할의 관점 또는 B1과 다양한 카스파제의 상호작용의 관점에서 B1과 이것이 상호작용하는 다른 단백질과의 상호작용에 영향을 주거나 조절해 원할 때 세포 사멸이나 세포 생존을 강화하거나 억제할 수 있는 약물을 고안하는 것이 특히 중요하다.Modification of the function of these receptors is quite detrimental to organisms due to the unique ability of Fas / APO1 and TNF receptors to cause cell death and the ability of TNF receptors to stimulate other tissue-damaging activities. In addition, excessive or deficient function of these receptors contributes to the pathogenesis of various diseases (Vassalli, 1992, Nagata and Golstein, 1995). Identifying molecules that participate in the signaling of receptors and finding ways to modulate the activity of these molecules is finding new therapies. When you want to influence or modulate the interaction of B1 with other proteins with which it interacts, either in terms of the supposed important role of the B1 protein that directly or indirectly interacts with the TRAF protein, or in terms of the interaction of B1 with various caspases. It is particularly important to design drugs that can enhance or inhibit cell death or cell survival.

본 발명은 또한 본 발명의 B1 단백질에 결합할 수 있어 B1 단백질의 활성을 중재 또는 조절할 수 있는 단백질 또는 리간드에 관계한다. 이와 같은 단백질 또는 리간드는 전술한 방법에 따라 선별, 분리 및 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 B1 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 다수의 새로운 리간드가 분리될 수 있다.The present invention also relates to a protein or ligand that can bind to the B1 protein of the invention and can mediate or regulate the activity of the B1 protein. Such proteins or ligands can be selected, isolated and produced according to the methods described above. For example, many new ligands can be isolated, including proteins that can bind to the B1 protein of the invention.

전술한 것과 같이, 이와 같은 신규한 B1-결합 단백질/리간드는 가령, B1 매개 활성의 방해물질 또는 강화물질로 작용하고 이는 전술한 것과 같이 다양한 병인적 상황 및 다른 상황에서 중요한 역할을 한다. 이와 같은 B1-결합 단백질/리간드의 또 다른 기능은 친화력 크로마토그래피에 의해 B1 단백질의 정제를 위한 특정 물질로 사용할 수 있고, 이와 같이 적절한 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 신규한결합 단백질/리간드는 B1 단백질을 포함하는 용액 또는 추출물이 통과시켜 고형 또는 친화성 서포트/매트릭스를 형성하여 이의 정제를 실행할 수 있다. 이와 같은 친화력 크로마토그래피 방법은 공지되어 있고 본 기술에 일반적인 표준 과정에 따른다.As mentioned above, these novel B1-binding proteins / ligands, for example, act as interferers or enhancers of B1-mediated activity, which play an important role in various etiological and other situations as described above. Another function of this B1-binding protein / ligand can be used as a specific material for the purification of the B1 protein by affinity chromatography, and thus the novel binding protein / ligand attached to the appropriate chromatography matrix can bind the B1 protein. The solution or extract comprising can pass through to form a solid or affinity support / matrix to carry out its purification. Such affinity chromatography methods are known and follow the standard procedures common in the art.

유사하게, 본 발명의 전술한 B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 유도체 모두를 이용하여 친화력 크로마토그래피에 의해 이들이 결합하는 염증, 세포 사멸 또는 생존 경로의 다양한 단백질을 정제한다. 가령, B1 단백질, 이의 동소체, 유사체 또는 단편 및 돌연변이체를 이용한 친화력 크로마토그래피를 통해 B1 결합 단백질을 정제할 수 있다. B1 결합 단백질을 확인하고 생산하기 위한 이런 방법에는 선별단계가 포함되는데 이 과정에서 B1단백질 또는 하나이상의 특정 부분이 여기에 결합할 수 있는 단백질 또는 다른 리간드를 얻기 위한 기질 또는 'bait'로 이용된다; 이후 이렇게 얻어진 단백질/리간드를 확인하고 특성화 작업이 이루어지고 연이어 실제적으로 분리되고 정제된 형태로 이런 단백질/리간드를 생산한다. 모든 단계는 당업자에게 공지되어 있고 하기에서 상술한다.Similarly, all of the aforementioned B1 proteins of the present invention, allotropes, analogs or fragments and derivatives thereof are purified by affinity chromatography to purify various proteins of the inflammatory, cell death or survival pathways to which they bind. For example, the B1 binding protein can be purified via affinity chromatography using the B1 protein, its allotropes, analogs or fragments and mutants. This method for identifying and producing B1 binding proteins involves a screening step in which the B1 protein or one or more specific moieties is used as a substrate or 'bait' to obtain a protein or other ligand capable of binding to it; The proteins / ligands thus obtained are then identified and characterized, followed by the production of these proteins / ligands in practically isolated and purified form. All steps are known to those skilled in the art and are detailed below.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명을 하는데 이에 국한시키지는 않는다.The invention is illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting.

i) 두 가지 하이브리드 스크린과 두 가지 하이브리드 β-갈락토시다제 발현 테스트; (ii) 단백질의 유도된 발현, 대사적 라벨링 면역침전; (iii) in vitro 결합; (iv) 세포독성의 평가; (v) 노던 분석 및 서열 분석 그리고 다음의 실시예에서 이용된 다른 공정은 본 발명 이전에 세포내 신호 발생 단백질 및 이의 경로에 대해 공개된 문헌에 상세히 기술하고 있다(Boldin et al., 1995a, 1995b, and Boldin et al., 1996). 이와 같은 공정은 공동 출원중인 이스라엘 출원 114615, 114986, 115319, 116588, 117932, 120367 및 PCT/US96/10521에 상세하게 설명을 하고 있다. 따라서, 이들 공개된 문헌과 출원은 모두 참고문헌으로 포함한다. NIK 단백질과 이의 NF-_KB의 활성화에서의 역할과 이로 인한 세포 생존 그리고 세포 생존 경로에서 TRAF2의 역할(가령, TRAF2 그리고 p55-R, FAS-R, RIP 및 다른 단백질사이의 상호작용)이란 면에서 전술된 공동-소유이며 공동-출원된 IL과 PCT출원들 그리고 Malinin et al(1997)에서 본 발명자에 의해 상세히 설명되었다.i) two hybrid screens and two hybrid β-galactosidase expression tests; (ii) induced expression of proteins, metabolic labeling immunoprecipitation; (iii) in vitro binding; (iv) assessment of cytotoxicity; (v) Northern analysis and sequencing and other processes used in the following examples are described in detail in the published literature on intracellular signaling proteins and their pathways prior to the present invention (Boldin et al., 1995a, 1995b). , and Boldin et al., 1996). Such processes are described in detail in co-pending Israel applications 114615, 114986, 115319, 116588, 117932, 120367 and PCT / US96 / 10521. Accordingly, all of these published documents and applications are incorporated by reference. The role of NIK protein and its activation in NF- _K B and its role in cell survival and cell survival pathways (e.g., the interaction between TRAF2 and p55-R, FAS-R, RIP and other proteins) Co-owned and co-filed IL and PCT applications as described above in detail and by Malinin et al (1997).

실시예1. 신규한 B1단백질의 분리, 서열과 부분 특성화Example 1 Isolation, Sequence and Partial Characterization of Novel B1 Proteins

전술된 공동-소유의 특허 출원문에서 기술된 다양한 방법을 사용하여, 신규한 클론된 단배질 서열이 분리되고, 서열화되고 부분적으로 특성화되었다. 이 DNA 서열은 신규한 단백질을 기호화하는데 이것은 c-IAP 단백질에 대한 동질성과 카이나제 도메인의 보유란 측면에서 c-IAP 결합 카이나제(CBK)로 원래 지칭되었으나 지금은 B1으로 지칭되고 있다. Using the various methods described in the co-owned patent application described above, novel cloned protein sequences were isolated, sequenced and partially characterized. This DNA sequence encodes a novel protein, which was originally referred to as c-IAP binding kinase (CBK) in terms of homogeneity for c-IAP protein and retention of kinase domains, but is now referred to as B1.

간단히 말해, 최근에 발견된 아팝토시스(IAP) 상동체들 c-IAP1과 c-IAP2(참고: Rothe.,1995; Uren et al.,1996;Hofmann et al.,1997)의 세포내 억제물질의 세포내 활성과 이들이 상호작용하는 세포내 단백질을 더욱 상세히 밝히기 위해, c-IAP 서열이 다양한 상동체, 또는 다양한 데이터베이스내의 관련된 서열을 선별하는데 사용되었는데 이들 서열에는 비특징적(그리고 완전히 서열화되지 않은) 발현 서열 태그(ests)를 가진 것들이 포함된다. 이런 방식으로 신규한 클론의 부분 서열이 c-IAP에 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 이전에는 어떤 식으로도 특성화되지 않았던 이런 부분 서열을 이용해, PCR 시발체가 이 신규한 클론의 전체 길이 DNA서열의 PCR클로닝을 위해 준비되었는데, 이 신규한 클론은 상업적으로 얻어진 DNA, cDNA 라이버러리를 원형으로 이용하였다.In short, intracellular inhibitors of the recently discovered apoptosis (IAP) homologues c-IAP1 and c-IAP2 (Rothe., 1995; Uren et al., 1996; Hofmann et al., 1997). In order to elucidate the intracellular activity of and the intracellular proteins with which they interact, c-IAP sequences were used to select various homologs or related sequences in various databases, which were non-specific (and not fully sequenced). Included are those with expression sequence tags. In this way, the partial sequence of the novel clone was found to have high homology to c-IAP. Using this partial sequence, which had not previously been characterized in any way, PCR primers were prepared for PCR cloning of the full-length DNA sequence of this novel clone, which cloned the commercially available DNA, cDNA library into a prototype. Was used.

결과로써, 알려지지 않은, 즉, B1으로 지칭된 신규한 단백질을 기호화한 신규한 전체-길이 DNA 클론이 획득되었다. B1(DNA와 아미노산)을 위한 서열이 초기에 결정되었다. 추가적 분석과 초기 B1의 서열의 결정으로 아미노산 서열의 N-말단(누클레오티드 서열의 5'말단)에서 약간의 차이가 드러났는데 이 차이에는 첫 19개 유도 아미노 잔기가 포함되었다. 이런 추가 서열 결정과 분석을 통해 도(3A와 B)에서 각각 보인 유도된 B1 단백질 서열과 누클레오티드 서열이 나왔다. As a result, a novel full-length DNA clone was obtained which encodes a novel protein, unknown, namely B1. The sequence for B1 (DNA and amino acids) was initially determined. Further analysis and determination of the initial B1 sequence revealed some differences in the N-terminus of the amino acid sequence (5 'terminus of the nucleotide sequence), including the first 19 derived amino residues. This additional sequencing and analysis led to the derived B1 protein and nucleotide sequences shown in FIGS. 3A and B, respectively.

도3의 아미노산 서열의 분석에서 이 단백질의 N-말단의 끝에 카이나제 모티프가 있음이 제기되었는데 이 단백질은 도3의 누클레오티드 서열의 개방 리딩 프레임(ORF)의 대략 1000개의 첫 누클레오티드에 의해 기호화된다. 또한 아미노산 서열의 C-말단 끝에 공통적인 프로도메인(CARD)구조가 있는데 이것은 아팝토시스 신호전달 경로에 관계하는 많은 세포내 단백질, 예를 들면, c-IAP1, RAIDD(참고:Duan 과 Dixit,1997)과 ICE와 ICH-1과 같은 다른 카스파제에 공통적이다. 도3A에서 묘사된 B1의 아미노산 서열에서 N-말단 카이나제 도메인(박스된 부분)과 C-말단 CARD(밑줄친 부분)가 보인다. 이들 두 도메인의 사이에 B1 단백질의 중간단계 도메인이 있다. Analysis of the amino acid sequence of FIG. 3 suggests that there is a kinase motif at the N-terminal end of the protein, which is encoded by approximately 1000 first nucleotides of the open reading frame (ORF) of the nucleotide sequence of FIG. . There is also a common prodomain (CARD) structure at the C-terminal end of the amino acid sequence, which contains many intracellular proteins involved in apoptotic signaling pathways, such as c-IAP1, RAIDD (Duan and Dixit, 1997). ) And other caspases such as ICE and ICH-1. In the amino acid sequence of B1 depicted in FIG. 3A, the N-terminal kinase domain (boxed portion) and C-terminal CARD (underlined portion) are shown. Between these two domains is the intermediate domain of the B1 protein.

B1의 전술된 도메인은 공지된 RAF형 카이나제와 RIP-카이나제 도메인에 높은 상동성을 가진다. The aforementioned domain of B1 has high homology to known RAF type kinase and RIP-kinase domains.

B1의 전술된 프로도메인은 최근에 'caspase recruitment domain'(참고: Hofmann et al.,1997)을 의미하는 CARD로 지칭되었고 아팝토시스 신호전달 과정동안 다양한 단백질과 상호작용하는 부분역할을 하는 것으로 보인다. 예를 들면, 프로도메인(또는 CARD)을 가지지 않은 p55 TNF-R은 또 다른 세포내 단백질 TRADD와 이들 두 단백질에 존재하는 사멸 도메인 지역을 통해 상호작용한다. 차례로, TRADD는 RIP 및 RAIDD(부가적인 이런 어뎁터 단백질, 참고: Hofmann et al.,1997; Duan 과 Dixit,1997)와 상호작용할 수 있으며 이 모든 것들이 공통적으로 가진 사멸 도메인을 통해서 p55 TNF-R은 직간접적으로 RAIDD와 복합체를 형성할 수 있다. RAIDD는 프로도메인(또는 CARD)를 갖고 있는데 이것은 하나 이상의 카스파제(예, ICH-1(카스파제-2))와 상호작용하거나 결합하여 p55 TNF-R을 이런 카스파제에 연결시켜 카스파제 활성을 통한 아팝토시스를 야기할 수 있다. 유사하게, p75 TNF-R은 공통 모티프를 통하여 TRAF2와 TRAF1과 상호작용할 수 있고 TRAF 단백질은 c-IAP1및 c-IAP2와 상호작용할 수 있다. 유사한 방식으로(참고: Malinin et al., 1997,재 997/37016), TRADD와 상호작용하는 MORT1(FADD)와 상호작용할 수 있는 FAS-R (Fas/APO1)의 능력과 TRAF2와 상호작용하는 TRADD의 능력에 의하여 MORT1은 c-IAP1및 c-IAP2(TRAF2를 경유하여)와 연결되고 그로 인해 ICE, Mch6과 다른 카스파제에 연결되거나 또는 ICH-1, FLICE/MACH 또는 다른 카스파제(전술된 TRADD-RIP-RAIDD상호작용을 통해서)에 연결될 수 있다. p55 TNF-R은 TRADD와 상호작용하는 능력으로전술된 TRADD-TRAF2-cIAP1, c-IAP2-ICE, Mch6 상호작용을 통해 또한 ICE, Mch6과 연결될 수 있다. The aforementioned prodomain of B1 was recently referred to as CARD, meaning 'caspase recruitment domain' (Hofmann et al., 1997) and appears to play a part in interacting with various proteins during the apoptotic signaling process. . For example, p55 TNF-R without prodomains (or CARDs) interacts with another intracellular protein TRADD through the killing domain region present in these two proteins. TRADD, in turn, can interact with RIP and RAIDD (additional such adapter proteins, see Hofmann et al., 1997; Duan and Dixit, 1997), through which all of the common kill domains allow p55 TNF-R to be indirect or indirect. For example, it can form a complex with RAIDD. RAIDD has a prodomain (or CARD), which interacts with or binds one or more caspases (e.g., ICH-1 (caspase-2)) to link p55 TNF-R to such caspase to activate caspase activity. May cause apoptosis. Similarly, p75 TNF-R can interact with TRAF2 and TRAF1 through a common motif and the TRAF protein can interact with c-IAP1 and c-IAP2. In a similar manner (see Malinin et al., 1997, 997/37016), the ability of FAS-R (Fas / APO1) to interact with MORT1 (FADD) to interact with TRADD and TRADD to interact with TRAF2 By its ability, MORT1 is linked to c-IAP1 and c-IAP2 (via TRAF2) and thus to ICE, Mch6 and other caspases or to ICH-1, FLICE / MACH or other caspases (TRAD described above). Through RIP-RAIDD interaction. p55 TNF-R can also be linked to ICE, Mch6 via the TRADD-TRAF2-cIAP1, c-IAP2-ICE, Mch6 interactions described above with the ability to interact with TRADD.

또한, TRAF2가 NF-_KB의 활성화 유도를 통해 세포 생존을 촉진하는 세포내 경로(또는 하나이상의 경로)에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 이런 경로(들)에서 NIK는 NF-_KB로부터 I-_KB를 분리시키고 이를 통해 NF-_KB의 활성화를 야기하는 I-_KB의 인산화에 직접적으로 관여하는 것으로 보인다. 여기서 NF-_KB는 핵에 들어가 다양한 유전자의 전사를 시작시킬 수 있는데 이들 유전자의 발현은 세포 생존에 관계한다(참고: 위의 '배경'부분)It is also known that TRAF2 is involved in intracellular pathways (or more than one pathway) that promote cell survival through induction of activation of NF- _K B. In such a path (s) NIK appears to be directly involved in the phosphorylation of I- _K B for separating the I- _K B from the NF- _K B and this lead to the activation of the NF- _K B through. Here, NF- _K B can enter the nucleus and initiate transcription of various genes, the expression of which is involved in cell survival (see 'Background' section above).

그래서, TRAF2는 세포 사멸과 세포 생존 경로에 관여하고 주어진 시간에 다양한 외부 자극에 대한 반응으로 어떤 단백질이 주도적으로 TRAF2와 상호작용하는가에 따라, 세포는 세포 사멸 또는 세포 생존 유도를 겪게된다. 분명히, 거부성 세포 사멸 또는 세포 생존 경로중 한 쪽으로 이동할 수 있는 다양한 세포내 신호전달 단백질사이에는 세밀한 균형이 있다, 그리고 TRAF2는 이런 균형을 유지하는 핵심단백질이고 어느 한쪽으로의 균형의 이동을 책임진다.Thus, TRAF2 is involved in cell death and cell survival pathways, and depending on which proteins dominately interact with TRAF2 in response to various external stimuli at a given time, cells undergo cell death or induction of cell survival. Clearly, there is a fine balance between the various intracellular signaling proteins that can migrate to either rejective cell death or one of the cell survival pathways, and TRAF2 is a key protein that maintains this balance and is responsible for shifting the balance to either side. .

도1에는, 이런 다양한 도메인을 가진 TRAF2의 구조가 체계적으로 나타나 있다. 그리고 도2에는 다양한 세포 수용체와 세포내 신호전달 단백질사이의 가능 상호작용의 구조와 세포사멸 또는 세포 생존(NF-_KB 활성화) 경로에서 그들의 관여의 구조가 체계적으로 나타나 있다.In Fig. 1, the structure of TRAF2 having these various domains is shown systematically. 2 shows the structure of possible interactions between various cellular receptors and intracellular signaling proteins and the structure of their involvement in apoptosis or cell survival (NF- _K B activation) pathways.

따라서, 본 발명의 신규한 B1 단백질이 염증, 세포 사멸과 세포 생존 경로에 중요한 조절 역할을 가진다는 가능성이 제기된다. B1은 프로도메인(또는 CARD 도메인)을 가지는데 이것은 아마도 c-IAP, c-IAP2, RAIDD와 다양한 카스파제(ICE, ICH-1등)의 프로도메인과 간접적으로 상호작용하고 이를 통해 TRAF2와 다른 다양한 단백질들과 상호작용하는데, 또한 이 단백질들은 RIP, TRADD, p75 TNF-R, MORT-1과 FAS-R을 포함해 TRAF2와 직간접적으로 상호작용한다. B1은 또한 카이나제 도메인을 보유해 MAP 카이나제 경로에 직간접적으로 관여하는데, NIK는 이 경로의 일원이어서 NF-_KB 활성화 경로에 관여 할 수 있다.Thus, the possibility arises that the novel B1 proteins of the invention have important regulatory roles in inflammation, cell death and cell survival pathways. B1 has a prodomain (or CARD domain), which probably indirectly interacts with c-IAP, c-IAP2, RAIDD and other domains of caspase (ICE, ICH-1, etc.), thereby allowing TRAF2 and other In addition to interacting with proteins, they also interact directly or indirectly with TRAF2, including RIP, TRADD, p75 TNF-R, MORT-1 and FAS-R. B1 also possesses a kinase domain, which is directly or indirectly involved in the MAP kinase pathway, which is a member of the pathway and may be involved in the NF- _K B activation pathway.

또한, B1은 c-IAP1에 상동체여서, c-IAP1의 생물학적 활성을 조절함으로써 또는 다른 단백질에 대한 c-IAP1의 결합을 조절함으로써 c-IAP1(그리고 c-IAP2)의 조절자가 될 수있다. 이런 면에서(참고: 아래의 실시예2), B1은 c-IAP 단백질(c-IAP1, c-IAP2)와 간접적으로 상호작용함으로써 그리고 카스파제를 사용하거나 이들의 단백 분해 활성을 제한하는 능력을 교란시키거나 감소시킴으로써 아팝토시스를 증가시키는 역할을 해 그 결과로 더 많은 카스파제가 자유롭게 단백분해 역할을 하게 될 것이다. In addition, B1 is homologous to c-IAP1 and can be a regulator of c-IAP1 (and c-IAP2) by regulating the biological activity of c-IAP1 or by binding c-IAP1 to other proteins. In this respect (see Example 2 below), B1 indirectly interacts with c-IAP proteins (c-IAP1, c-IAP2) and reduces the ability to use caspases or limit their proteolytic activity. By disturbing or decreasing it serves to increase apoptosis and as a result more caspases will freely act as proteolysis.

또 다른 가능성은 B1이 전술된 능력을 통해 TRAF-1과 TRAF2, RAIDD, RIP, TRADD, p55-TNF-R, p75-TNF-R, MORT-1과 FAS-R을 포함한 세포 사멸의 다양한 중재자 및 다양한 카스파제와 직간접적으로 상호작용할 수 있어 이 들 단백질을 카스파제에 연결하고 그래서 이 단백질들이 속하는 세포 사멸 경로에서 중간 작용 물질역할을 수행할 수 있다는 것이다. 이와 같이, B1은 아팝토시스의 중요한 매개체이다. Another possibility is that B1 may be able to express various mediators of apoptosis, including TRAF-1 and TRAF2, RAIDD, RIP, TRADD, p55-TNF-R, p75-TNF-R, MORT-1 and FAS-R, through the aforementioned capabilities and It is possible to interact directly or indirectly with various caspases, linking these proteins to caspases and thus acting as intermediate agents in the cell death pathways to which these proteins belong. As such, B1 is an important mediator of apoptosis.

또 다른 가능성은 전술된 c-IAP 단백질과 B1의 상호작용(간접적)에 의해, B1이 RAF2와 c-IAP의 결합이나 상호작용을 예방해 MAP 카이나제 경로에 대한 TRAF2 활성을 봉쇄할 수 있다는 것이다. 예를 들면, TRAF2-c-IAP 상호작용이 NIK와 TRAF2 상호작용을 위해 중요할 수 있다, 그리고 이것이 c-IAP와 B1사이의 상호작용에 의해 예방된다면, TRAF2-매개의 NF-_KB 활성이 봉쇄되고 결과적으로 세포 생존이 약화되고 세포 사멸이 증가할 것이다.Another possibility is that by the aforementioned (indirect) interaction of c-IAP protein with B1, B1 can block the binding or interaction of RAF2 with c-IAP to block TRAF2 activity on the MAP kinase pathway. . For example, TRAF2-c-IAP interaction may be important for NIK and TRAF2 interaction, and if this is prevented by the interaction between c-IAP and B1, then TRAF2-mediated NF- _K B activity is Blockade and consequently attenuate cell survival and increase cell death.

또 다른 가능성은 B1이 다양한 카스파제의 활성을 억제함에 있어 좀더 직접적인 역할을 할 수 있다는 것이다. 그래서 B1과 다양한 카스파제의 프로도메인(CARD 도메인)사이의 직간접 상호작용을 통해서, B1은 이들 효소의 활성을 증가시키고 이를 통해 이들의 세포 독성을 증가시킬 수 있다. 이런 방식으로, B1은 카스파제를 이용하거나 활성화를 통한 아팝토시스의 직접적 확대자일 수 있다(참고: 아래의 실시예2). Another possibility is that B1 may play a more direct role in inhibiting the activity of various caspases. Thus, through direct and indirect interactions between B1 and the various domains of the caspase (CARD domain), B1 can increase the activity of these enzymes and thereby increase their cytotoxicity. In this way, B1 may be a direct expander of apoptosis with caspase or through activation (see Example 2 below).

또 다른 가능성은 B1이 아직 알려지지 않은 단백질에 결합하거나 상호작용해 세포 사멸 또는 세포 생존을 매개하는 세포내 신호 전달 경로를 조절하는 역할을 할 수 있다는 것이다.Another possibility is that B1 may bind to or interact with proteins that are not yet known and may play a role in regulating intracellular signal transduction pathways that mediate cell death or cell survival.

B1이 RIP-카이나제에 유사한 카이나제 도메인을 가지고 있다는 것은 흥미롭다. RIP는 세포 사멸 매개체(예. p55-TNF-R, p75-TNF-R, MORT-1,TRADD)와 TRAF-2사이를 연결해 NF-_KB 활성과 세포 생존(참고: 도2)을 야기하는 능력을 통해서 또한 세포 사멸과 세포 생존 경로사이의 균형에 관계하는 중심단백질이다. RIP-카이나제 활성은 이런 세밀한 균형에 한 인자인데 이것은 이 카이나제를 위한 기질이 무엇인가, 가령, RIP에 의해 어떤 단백질이 인산화 되는가와 이것이 증가된 아팝토시스 활성화, 감소된 아팝토시스 활성화, 증가된 NF-_KB 활성화 또는 감소된 NF-_KB 활성화 방향으로의 활성에 영향을 주는가에 따라 달라진다. 유사체로써 B1 역시 중요한 역할을 하며 이런 역할에서 있어서 카이나제 활성이 어떤 단백질이 이런 카이나제 활성을 위한 기질이냐 되느냐에 따라 중요해 질 것이다.It is interesting that B1 has a kinase domain similar to RIP-kinase. RIP links the cell death mediators (eg p55-TNF-R, p75-TNF-R, MORT-1, TRADD) with TRAF-2, leading to NF- _K B activity and cell survival (see Figure 2). It is also a central protein involved in the balance between cell death and cell survival pathways through capacity. RIP-kinase activity is a factor in this fine balance, which is what is the substrate for this kinase, for example, what protein is phosphorylated by RIP and that it has increased apoptosis activation, decreased apoptosis Activation, increased NF- _K B activation or decreased NF- _K B activation depends on the activity in the direction. As an analogue, B1 also plays an important role and in this role the kinase activity will be important depending on which protein is the substrate for this kinase activity.

실시예2: B1 단백질의 생물학적 활성의 분석Example 2 Assay of Biological Activity of B1 Protein

(1) 어떤 공지된 단백질이 B1에 결합할 수 있는지 결정하기 위한 사전 결합 분석(1) pre-binding assay to determine which known proteins can bind to B1

DNA 구성체를 준비하고 발현하기 위한 WO 97/37016 방법들로부터 얻은 방법들과 효모 이중-하이브리드 결합분석법을 이용해, 카이나제 도메인이 제거된 B1의 구성체, 즉, 단지 중간 부분과 C-말단 CARD 부분만을 가진 절단된 B1이 세포내 신호전달 경로에 관계한 다양한 공지된 단백질에 대한 결합능력을 시험받았다. 이 초기의 예비 결과는 이 절단된 B1이 BCL2에 결합한다는 것을 암시한다.Using yeast double-hybrid binding assays and methods obtained from WO 97/37016 methods for preparing and expressing DNA constructs, the constituents of B1 from which the kinase domain has been removed, ie, only the middle and C-terminal CARD portions Only cleaved B1 was tested for its ability to bind to a variety of known proteins involved in intracellular signaling pathways. This initial preliminary result suggests that this cleaved B1 binds to BCL2.

(ii) 세포 사멸 또는 세포 생존에 대한 B1의 효과를 결정하기 위한 세포 독성 분석(ii) cytotoxicity assays to determine the effect of B1 on cell death or cell survival

DNA 구성체를 준비하고 세포를 감염/형질전환하고 이들 구성체의 발현 산물에 따른 세포 사멸 또는 세포 생존에 대한 효과를 결정하기 위해 WO 97/37016 방법들로부터 얻은 방법들을 이용하여 전제 길이 B1 단백질을 기호화한 DNA 구성체가 배양중인 세포를 감염시키는데 사용되었다. 또한, 또 다른 실험에서,B1-인코딩 구성체가 RIP, p55-TNF-R과 FAS-R을 기호화한 다른 구성체와 함께 세포를 공동-감염시키는데 사용되었다.Full length B1 protein was encoded using methods obtained from the WO 97/37016 methods to prepare DNA constructs, infect / transform cells and determine the effect on cell death or cell survival according to the expression products of these constructs. DNA constructs were used to infect cells in culture. In another experiment, a B1-encoding construct was also used to co-infect cells with other constructs encoding RIP, p55-TNF-R and FAS-R.

이들 감염으로부터 얻어진 결과는 발현된 B1단백질 그 자체는 세포 사멸을 야기하지 않는 다는 것을 암시한다. 하지만 B1은 RIP, p55-TNF-R 또는 FAS-R과 함께 발현될 때 이들 세포 사멸의 공지된 유도체에 의해 유도된 세포 사멸의 수준을 강화한다.The results obtained from these infections suggest that the expressed B1 protein itself does not cause cell death. However, B1 enhances the level of cell death induced by known derivatives of these cell death when expressed with RIP, p55-TNF-R or FAS-R.

B1이 BCL2에 결합할 수 있다는 위의 (i)에서 얻은 결과로부터는 B1이 BCL2 활성의 억제제 역할, 즉, B1이 아팝토시스에 대해 세포를 보호하는 성향의 BCL2 활성을 예방할 수 있다는 가능성을 제기된다(참고: 위의 '배경'부분), 그리고 이와 같이 B1은 명확하게 RIP, p55-TNF-R 또는 FAS-R 그리고 세포 사멸의 다른 유도물질(위의 '배경'부분에서 전술된)에 의해 유도된 세포 사멸 경로를 강화할 수 있다. 이런 측면에서, B1은 BCL2 페밀리의 일원인 BAD 단백질과 동일한 방식으로 작용할 수 있는데 이 페밀리는 BCL2와 BCL-X_L에 결합해 세포 사멸을 야기하는데 직접적으로 관여하는 것으로 알려진 BAX와 BAK의 수준을 증가시킨다. 또 다른 가능성은 B1이 카이나제 도메인을 통하여, BCL2에 존재하는 인산화 위치에서 BCL2를 인산화시키고 이런 방식으로 아팝토시스에 대해 세포를 보호하는 성향의 BCL2의 활성에 영향을 주어 궁극적으로 B1이 유도된 세포 사멸 강화에 대한 관찰된 효과를 야기한다.The results obtained in (i) above, where B1 can bind to BCL2, raise the possibility that B1 acts as an inhibitor of BCL2 activity, that is, B1 can prevent BCL2 activity, which tends to protect cells against apoptosis. (Note: the 'background' section above), and thus B1 is clearly defined by RIP, p55-TNF-R or FAS-R and other inducers of cell death (described above in the 'background' section above). May induce enhanced cell death pathways. In this respect, B1 can act in the same way as the BAD protein, a member of the BCL2 family, which increases the levels of BAX and BAK known to be directly involved in causing cell death by binding to BCL2 and BCL-X _L. Let's do it. Another possibility is that B1 phosphorylates BCL2 at the phosphorylation site present in BCL2 via the kinase domain and in this way affects the activity of BCL2, which tends to protect cells against apoptosis, ultimately leading to B1 induction. Resulting in observed effects on enhanced cell death.

게다가, B1은 BCL2와 상호작용에 부가되어 또는 독립되어 NF-_KB의 활성화를 유도하고 게다가 NF-_KB 활성화를 야기하는 경로에 작용하는 B1 카이나제 활성을 통하여 NIK와 상호작용하거나 NIK가 일원인 경로내의 다른 카이나제와 상호작용할 수 있다, 또는 이것은 여기서 관련된 다른 어뎁터 단백질(예, TRAF2)에 작용하고 이런 방식으로 감소된 NF-_KB 활성화를 야기해 궁극적으로 감소된 세포 생존과 증가된 세포 사멸을 야기할 수 있다.Furthermore, B1 is is added to the BCL2 interacting with or stand-induced activation of NF- _K B, and also NF- _K B through the B1 kinase activity acting on the path that leads to activation interact with NIK or NIK It can interact with other kinases in the pathway that are members, or it acts on other adapter proteins involved here (eg TRAF2) and in this way leads to decreased NF- _K B activation resulting in decreased cell survival and increase. May cause dead cell death.

그런 까닭에, 요약하면, B1은 염증, 세포 사멸 또는 세포 생존을 야기하는 세포내 신호전달의 조절에서 일정 역할을 하는 것으로 보인다. B1은 분명하게 많은 직접적 방식으로(다양한 단백질의 사용 그리고 카이나제 활성의 활성화 또는 억제 ,또는 카이나제 활성을 통해서) 또는 간접적인 방식으로(다른 다양한 중간매개체,예, BCL2 그리고 c-IAP의 TRAF2등; RAIDD그리고 RIP, TRADD등과의 상호작용을 통해서) 염증, 세포 사멸과 세포 생존경로에 영향을 주는 능력을 가지고 있다. Therefore, in summary, B1 appears to play a role in the regulation of intracellular signaling leading to inflammation, cell death or cell survival. B1 is clearly expressed in many direct ways (using a variety of proteins and through activation or inhibition of kinase activity, or kinase activity) or indirectly (e.g. in various other mediators, e.g., BCL2 and c-IAP). TRAF2, including RAIDD and its interaction with RIP and TRADD, have the ability to influence inflammation, cell death and cell survival.

실시예3: B1 생물학적 활성의 추가적 분석Example 3 Further Analysis of B1 Biological Activity

NF-_KB 활성, 세포 사멸 분석, 노던 분석과 JNK 활성 분석이 다음의 B1과 B1 돌연변이 구성체(참고: 도6)에서 시행되었다.NF- _K B activity, cell death assay, Northern assay and JNK activity assay were performed on the following B1 and B1 mutant constructs (see FIG. 6).

B1(참고: 실시예1) B1 (Note: Example 1)

B1 돌연변이, 47번 위치의 라이신이 알라닌으로 대체된 B1 돌연변이 B1 mutation , B1 mutation in which lysine at position 47 is replaced by alanine

△CARD, PCR에 의해 만들어진 CARD 도메인이 결핍되고 발현 운반체로 클로 닝된 B1 △ CARD, the CARD domain created by PCR and lack of expression in a carrier claw ningdoen B1

△Xba, CARD 도메인이 결핍되었으나 △CARD보다 3'말단이 짧은 제한 위치의 사용과 발현 운반체로의 클로닝에 의해 만들어진 B1 △ Xba, CARD domain but lacking created by the cloning and expression of a used carrier, a 3 'terminal restriction sites is short than △ B1 CARD

△Bam, △Xba에 유사하고 Bam 제한 효소를 이용해 동일한 방식으로 만들어진 B1 Bam △, △ similar to Xba and made in the same way using the restriction enzyme Bam B1

△Nde, 카이나제 도메인과 CARD 도메인의 일부를 포함하고 PCR에 의해 만들어져 발현 운반체로 클로닝된 B1, 그리고 ΔNde , a B1 containing a portion of a kinase domain and a CARD domain and cloned into an expression carrier made by PCR, and

△K, 다음의 시발체를 이용해 PCR에 의해 만들어진 B1 △ K, B1 was made by PCR using the following primer of

1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC;   1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC;

2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA.   2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA.

PCR 단편이 발현 운반체로 클론되었고 시컨싱에 의해 확인되었다.PCR fragments were cloned into expression carriers and confirmed by sequence.

NF-_KB 활성화 WO/37016에서 기술된 것과 같이 리포터 유전자 분석에 의해 측정이 이루어졌다. 간단히 말하면, 세포가 HIV LTR-루시퍼라제 유전자 플라스미드(1 ㎍)과 B1과 B1 돌연변이 발현 운반체(3㎍)로 공동 감염되었다. 감염된 DNA의 양은 '빈(empty)"운반체를 부가해 일정하게 유지되었다. 감염 24시간 후, 세포는 PBS와 리세드로 세척되었다. 루시페라제 분석이 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubed et al에서 기술된 대로 시행되었다. 결과는 도5에서 볼 수있다. NF- _K B Activation Measurements were made by reporter gene analysis as described in WO / 37016. In brief, cells were co-infected with HIV LTR-luciferase gene plasmid (1 μg) and B1 and B1 mutant expression carriers (3 μg). The amount of infected DNA was kept constant by adding 'empty' carriers. 24 hours after infection, cells were washed with PBS and rise. Luciferase assays were described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubed et al. The results can be seen in Figure 5.

세포사멸 분석이 10% 태아 혈청, 비-필수 아미노산, 100U/㎖ 페니실린 그리고 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보정된 Dulbecco의 조작 이이글 최소 필수 배지에서 자라는 293-T 세포에 의해 시행되었다. 293-T 세포(6 ㎝ 접시내 5 ×10⁵세포)가 칼슘 인산염 침전법을 이용해 β-갈락토시다아제 발현 운반체와 함께 다른 구성체의 cDNA로 일시적으로 감염되었다. 아래의 도6에 보이는 이 실험들의 결과에서, 각 접시가 1㎍의 RIP, p55-TNF-R 또는 TRADD 구성체, 1㎍의 각각의 B1과 B1 돌연변이 구성체(또는, 조절로, 빈 운반체), 그리고 1㎍의 pSV- β-gal(프로메가)로 감염되었다. 배양 기간의 마지막에 세포 사멸의 정도가 Boldin et al.,1996에 의해 기술된 것과 같이 β-갈락토시다아제의 결정에 의해 평가되었다. Apoptosis Assay 10% Fetal Serum, Non-Essential Amino Acids, 100 U / mL Penicillin and 100 μg / mL Manipulation of Dulbecco calibrated with streptomycin was performed by 293-T cells growing in Eagle Minimum Essential Medium. 293-T cells (5 × 10 ⁵ cells in 6 cm dish) were transiently infected with cDNA of other constructs along with β-galactosidase expression carriers using calcium phosphate precipitation. In the results of these experiments shown in Figure 6 below, each dish contains 1 μg of RIP, p55-TNF-R or TRADD construct, 1 μg of each B1 and B1 mutant construct (or, as a rule, empty carrier), and Infected with 1 μg pSV-β-gal (promega). At the end of the incubation period, the extent of cell death was assessed by the determination of β-galactosidase as described by Boldin et al., 1996.

노던 분석이 전통적 방식(참고: Boldin et al.,1995)으로 수행되었다, 그리고 B1이 많은 인간 조직에 존재하는 것이 밝혀졌다(도4). Northern analysis was performed in a traditional manner (Boldin et al., 1995), and it was found that B1 is present in many human tissues (FIG. 4).

JNK 활성화는 1.5㎍의 pSR-HA-JNK1 구성체(HA 에피토우프 태그된 JNK-1 발현 운반체)와 4㎍ 각각의 B1과 B1 돌연변이 구성체 발현 운반체로 칼슘 인산염 침전법을 이용해 293-T 세포(6 ㎝ 접시내 5 ×10⁵세포)를 일시적으로 감염시킴으로써 시행되었다. 24시간 후 세포가 용해 버퍼(20mM 헤퍼스 pH 7.6, 10mM ETGA, 40mM β-당인산염, 2.5mM MgCl₂ , 1mM DTT 그리고 1% NP-40)에서 용해되었다. 그리고 Ha-JNK1단백질이 항-HA 항체와 함께 면역침강되었다(참고: Rothe et al., 1995b)(클론12 CA5). 이 카이나제 분석은 30㎕의 카이나제 버퍼(20mM 헤퍼스 pH 7.6, 40mM β-당인산염, 2.0mM MgCl₂ , 2mM DTT, 3nmole ATP 그리고 3uCi의 Γ-P^32-ATP)에서 30℃, 20분동안 시행되었다. 박테리아로 생산된 GST-Jun 단백질(대략 10㎍)이 기질로써 사용되었다. 이런 반응이 2x SDS-운반 버퍼의 부가에 의해 중단되었고 3분 동안 끓여진 후, SDS-PAGE 겔에 의해 분석되었다. 이 결과는 도7에 나타나 있다. JNK activation was expressed in 293-T cells using calcium phosphate precipitation with 1.5 μg of pSR-HA-JNK1 construct (HA epitope tagged JNK-1 expression carrier) and 4 μg of B1 and B1 mutant construct expression carriers, respectively. 5 × 10 ⁵ cells in a cm dish) by temporary infection. After 24 hours cells were lysed in lysis buffer (20 mM Hepars pH 7.6, 10 mM ETGA, 40 mM β-saccharide phosphate, 2.5 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT and 1% NP-40). And Ha-JNK1 protein was immunoprecipitated with anti-HA antibody (Rothe et al., 1995b) (clone 12 CA5). This kinase assay was performed at 30 ° C. in 30 μl kinase buffer (20 mM Hepars pH 7.6, 40 mM β-saccharide phosphate, 2.0 mM MgCl ₂ , 2 mM DTT, 3 nmole ATP and 3 μCi Γ-P ^32- ATP). It was carried out for 20 minutes. Bacteria produced GST-Jun protein (approximately 10 μg) was used as substrate. This reaction was stopped by the addition of 2x SDS-carrying buffer and boiled for 3 minutes before being analyzed by SDS-PAGE gel. This result is shown in FIG.

도6에서 결과가 B1이 NF-_KB 활성화를 직접적으로 유도하는 것을 보여준다. B1이 NF-_KB를 또한 유도해야 하는 것으로 보이지만, 이런 활성은 이것의 카이나제 도메인과 무관해 보이며, B1의 중간매개 도메인의 일부 또는 전부가 기여하는 지와 상관없이 CARD 도메인과 관련된 것으로 추측된다.The results in FIG. 6 show that B1 directly induces NF- _K B activation. Although B1 appears to also induce NF- _K B, this activity appears to be independent of its kinase domain and is believed to be related to the CARD domain regardless of whether some or all of the mediator domain of B1 contributes. do.

또한, 세포 독성 분석은 B1(참고: 실시예2(ii))뿐만 아니라 B1 돌연변이 역시, RIP, p55-TNF-R 또는 TRADD와 함께 발현될 때 세포 사멸의 수준을 증가한다는 것을 보여준다. △CARD, △Nde, △K도 이보다는 낮은 수준이지만 그렇게 하는데 비하여 다른 구성체는 그렇지 못한다. 이것은 적어도 CARD 도메인이 아마도 중간매개 도메인과 합쳐 세포 사멸의 증대에 관여한다는 것을 암시하는 것 같다. In addition, cytotoxicity analysis shows that B1 mutations as well as B1 (see Example 2 (ii)) also increase the level of cell death when expressed with RIP, p55-TNF-R or TRADD. DELTA CARD, DELTA Nde and DELTA K are also lower, but other constructs are not. This seems to suggest that at least the CARD domain is probably involved in mediating cell death in combination with the mediator domain.

JNK 활성화의 결과 역시 적어도 CARD 도메인이 중간매개 도메인과 합쳐 이런 활성화에 관여한다는 것을 암시한다. The results of JNK activation also suggest that at least the CARD domain is involved in this activation in combination with the intermediary domain.

또한, 시행된 실험들에서 B1이 자가 인산화하는 것이 보인다. 이것이 B1이 진정 카이나제라는 증거이다.In addition, the experiments showed that B1 self-phosphorylates. This is evidence that B1 is truly a kinase.

또한, B1이 RIPDP에 상동성을 가지고 있다는 것이 입증되고 있다. 컴퓨터 분석에 따르면 아미노산의 수준에서 두 단백질은 37%의 동질성과 47%의 상동성을 가지고 있다. RIP는 현재 주요 NF-_KB 조절체로 널리 간주되고 있으며, 위의 결과는 B1이 유사하게 행동한다는 것을 암시한다.It is also demonstrated that B1 has homology to RIPDP. Computer analysis shows that at the amino acid level, the two proteins have 37% homology and 47% homology. RIP is now widely regarded as a major NF- _K B regulator, and the above results suggest that B1 behaves similarly.

실시예4: 결합 특성Example 4 Binding Properties

B1과 이의 돌연변이의 결합 특성이 다음의 표6에 나타나 있다. The binding properties of B1 and its mutations are shown in Table 6 below.

표 6                            Table 6

위 표에 나타난 결과로부터 B1이 NF-_KB를 활성화를 유도하는 기능을 할 때, NF-_KB 활성화에 관여하는 것으로 알려진 다른 단백질, 예를 들면 IRAK, TRAF2, NIK, TRAF6 그리고 RIP와 같은 것과의 결합과 상관없이 그렇게 할 수 있다.From the results as shown in Table B1 above the NF- _K B when the ability to induce activation, to be involved in NF- _K B activation, for different proteins, such known, such as IRAK, TRAF2, NIK, TRAF6 and RIP You can do that regardless of the combination of.

그래서, B1은 직간접적으로 이런 활성화 경로의 일부를 구성하는 다른 단백질과의 상호작용을 통해서 NF-_KB 활성화를 유도할 수 있다.Thus, B1 can induce NF- _K B activation directly or indirectly through interactions with other proteins that form part of this activation pathway.

B1의 관찰된 세포 사멸 강화 활성과 관련해, 위의 표로부터 B1이 p55 TNF-R, Fas-R, MORT-1, TRADD, RIP, ICE, ICH-1등과 같은 다양한 세포 사멸 매개체와 상호작용없이 이렇게 할 수 있다는 것으로 보인다. Regarding the observed apoptosis enhancing activity of B1, from the above table, B1 does not interact with various cell death mediators such as p55 TNF-R, Fas-R, MORT-1, TRADD, RIP, ICE, ICH-1, etc. It seems to be possible.

그래서, B1은 이들 다양한 세포 사멸 매개/조절체와의 간접적인 상호작용을 통해서 또는 다른 단백질을 통해서 세포 사멸을 강화하는 역할을 할 수 있다.Thus, B1 can play a role in enhancing cell death through indirect interactions with these various cell death mediators / regulators or through other proteins.

B1의 NF-_KB 활성화와 세포 사멸 강화에 대한 관계의 측면에서, B1은 세포 사멸과 세포 생존을 야기하는 세포내 경로사이의 세밀한 균형에 관계하는 중심 단백질이다. 이런 면에서, B1은 상호작용하는 단백질의 종류에 따라, 세포 사멸과 세포 생존사이의 균형을 이동시킬 수 있다.In terms of the relationship between B1 activation of NF- _K B and enhanced cell death, B1 is a central protein involved in the fine balance between intracellular pathways leading to cell death and cell survival. In this respect, B1 can shift the balance between cell death and cell survival, depending on the type of protein that it interacts with.

293 인간 태생신 세포(5 ×10⁶, 2.5 ×10⁶/PER 10 cm 접시)가 칼슘 인산염 처리에 의해 HA-태그의 B1 단백질(HA-B1)을 기호화한 10㎍의 플라스미드와 플래그-태그된 B1 단백질(FL-B1)을 기호화한 10㎍의 플라스미드 그리고 플래그-태그된 c-IAP-1 단백질(FL-IAP1)을 기호화한 10㎍의 플라스미드 또는 플래그-태그된 TRAF1 단백질(FL-TRAF1)을 기호화한 10㎍의 플라스미드 또는 플래그-태그된 TRAF2 단백질(FL-TRAF2)을 기호화한 10㎍의 플라스미드중 어느 하나에 의해 감염되거나 또는 플래그-태그된 TRAF1와 비-태그된 TRAF2(FL-TR1+TR2)의 10㎍ 혼합체(1:1)로 감염되거나 또는 플래그-태그된 TRAF1 , 비-태그된 TRAF2와 c-IAP-1(FL-TR1+TR2+IAP1)의 10㎍ 혼합체(1:1:1)로 일시적으로 감염되었다. 감염 7시간 후 세포가 세척되었고 18시간 후 세포가 50mM 헤퍼스 pH 7.5, 250mM NaCl, 0.2% NP-40, 5mM EDTA , 1mM 페닐메틸술포닉 플로라이드, 2.0 ㎍/ml 아프로티닌 그리고 20㎍/ml 레우펩틴(분해 버퍼)을 함유한 버퍼에서 분해되었다. 면역침전이 항-FLAG 에피토오프 항체(5 ㎍/할수)와 단백질 G-아가로즈 비드(30㎍/할수)와 함께 1㎖ 할수의 용해질을 배양(2시간, 4℃)해 이루어졌다. 면역침전물이 세 번 용해 버퍼로, 한번 PBS로 세척되었고 10% SDS-PAGE에 의해 분류된 후 질소셀룰로스 막에 전이되었다(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). 웨스던 블라트 분석이 1:1000 희석과 ECL 키트 처리된 항-HA 에피토오프 단일 클론 항체로 시행되었다(Amersham, Buckinghamshire, England).293 human-born cells (5 × 10 ⁶ , 2.5 × 10 ⁶ / PER 10 cm dishes) were flag-tagged with 10 μg of plasmid, which was encoded by HA-tag B1 protein (HA-B1) by calcium phosphate treatment. 10 μg of the plasmid encoding the B1 protein (FL-B1) and 10 μg of the plasmid or flag-tagged TRAF1 protein (FL-TRAF1) symbolized with the flag-tagged c-IAP-1 protein (FL-TRA1). Infected or flag-tagged TRAF1 and non-tagged TRAF2 (FL-TR1 + TR2) by either the 10 μg plasmid that was encoded or the flag-tagged TRAF2 protein (FL-TRAF2) 10 μg mixture of infected or flag-tagged TRAF1, non-tagged TRAF2 with c-IAP-1 (FL-TR1 + TR2 + IAP1) (1: 1: 1) Is temporarily infected. After 7 hours of infection the cells were washed and after 18 hours the cells were washed with 50 mM Hepers pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.2% NP-40, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulphonic fluoride, 2.0 μg / ml aprotinin and 20 μg / ml Digestion was performed in a buffer containing reupeptin (lysis buffer). Immunoprecipitation was accomplished by incubating (2 h, 4 ° C.) 1 ml of lysate with anti-FLAG epitope antibody (5 μg / number) and protein G-agarose beads (30 μg / number). The immunoprecipitates were washed three times with lysis buffer, once in PBS and sorted by 10% SDS-PAGE and then transferred to the nitrogen cellulose membrane (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Wesdon Blot analysis was performed with anti-HA epitope monoclonal antibody treated with 1: 1000 dilution and ECL kit (Amersham, Buckinghamshire, England).

도8로부터 B1이 TRAF2와 자가-결합하고 또한 상호작용할 수 있다는 것은 명확하다. 상호작용의 수준은 대략 자가-결합의 수준과 비슷한 것으로 보인다. TRAF-1 또는 IAP1과의 직접적 상호작용은 관찰되지 않는다.It is clear from FIG. 8 that B1 can self-bind and also interact with TRAF2. The level of interaction appears to be approximately comparable to the level of self-binding. Direct interaction with TRAF-1 or IAP1 is not observed.

실시예5 B1은 V-ATP아제의 E 하부단위에 결합한다.Example 5 B1 binds to the E subunit of V-ATPase.

미끼로써 B1의 CARD 도메인과의 이중 하이브리드 선별을 통해 V-ATP아제의 E 하부단위가 클론되었다(the review by Nelson t al., Experientia 52(1996)pp. 1101-1110).As a bait, through double hybrid screening with the CARD domain of B1 The E subunit of V-ATPase was cloned (the review by Nelson t al., Experientia 52 (1996) pp. 1101-1110).

V-ATP아제의 E 하부단위는 형광표지되고 유기분자나 펩티드의 라이버러리의 다양한 샘플의 존재하에서 B1의 CARD 도메인의 샘플과 배양된다. 배양후, B1-CARD 모티프는 특정 항체와 면역침전되고 이런 침전물과 관련된 형광의 양이 측정된다. 형광표지된 E-단백질의 침전을 방해하는 것으로 밝혀진 분자들은 ATP아제 E-하부단위의 기능을 통해 세포 생존 또는 성장과 염증에 영향을 주는 약물과 같은 잠재적 주도 복합물로 추가로 검사된다. The E subunit of the V-ATPase is fluorescently labeled and incubated with a sample of the CARD domain of B1 in the presence of various samples of libraries of organic molecules or peptides. After incubation, the B1-CARD motif is immunoprecipitated with specific antibodies and the amount of fluorescence associated with these precipitates is measured. Molecules that have been found to interfere with the precipitation of fluorescently labeled E-proteins are further tested with potential predominant complexes such as drugs that affect cell survival or growth and inflammation through the function of the ATPase E-subunit.

지금까지 본 발명이 완벽하게 설명되었기 때문에, 당업자들은 본 발명의 정신과 범위를 벗어남 없이 그리고 과도한 실험없이 이 동일과정이 광범위한 범위의 등가 파라미터, 농도, 그리고 조건하에서 시행될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.Since the present invention has been described so far, those skilled in the art will recognize that this same process can be carried out under a wide range of equivalent parameters, concentrations, and conditions without departing from the spirit and scope of the present invention and without undue experimentation.

본 발명이 특정 구체예들과 관련하여 기술되었지만 추가적으로 변경될 수 있다는 것은 당연하다. 이번 출원은 전반적으로 본 발명의 원칙을 따른 그리고 본 공개의 이런 시발을 포함하는 본 발명의 다양한 변화, 이용 또는 개조를 다루기 위한 것이며 본 발명이 속하는 당분야의 공지되거나 통상적인 관행내에서 결부된 청구범위에 따라 설정된 핵심 특징에 적용될 수 있다. Although the present invention has been described in connection with specific embodiments, it is obvious that the present invention may be further modified. This application is intended to address various changes, uses, or adaptations of the invention, generally in accordance with the principles of the invention and including this initiation of the present disclosure, and to which claims are made within the known or customary practice of the art to which this invention pertains. It can be applied to key features set by scope.

여기서 언급된 모든 참고 문헌(모든 문헌, 요약서, 공고된 미국 또는 다른 외국 출원, 또는 임의 다른 문헌)을 참고문헌으로 하여 제시한다. 또한, 전체 내용도 첨부한다.All references cited herein (all references, abstracts, published US or other foreign applications, or any other references) are incorporated by reference. Also included is the full text.

공지의 방법, 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 구체예에서 기재하는데 있어서 임의 동의를 받지 않았다.References to known and conventional methods have not received any consent from the embodiments of the present invention.

특정 구체예의 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 충분히 제시하는 것으로, 당분야에 숙지된 지식을 가진 자는 실험없이 다양하게 변형 및 조절할 수 있을 것이다. 따라서, 이와 같은 변형 및 수정도 여기에서 제시하는 범위에 등가이다. 여기에서 이용한 기술적인 용어는 설명을 하기 위함이고, 이에 한정하고자 함은 아니고, 본 발명의 용어는 당업자가 이해하고, 실시할 수 있도록 설명하였다.The description of the specific embodiment fully suggests general features of the present invention, and those skilled in the art will be able to make various modifications and adjustments without experimentation. Accordingly, such modifications and modifications are equivalent to the ranges presented here. The technical terminology used herein is for the purpose of description and should not be regarded as limiting. The terminology of the present invention has been described to enable those skilled in the art to understand and practice.

참고문헌references

1. Adelman et al., (1983) DNA 2, 183. Adelman et al., (1983) DNA 2, 183.

2. Alnemri, E.S. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4312-4317.2. Alnemri, E.S. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4312-4317.

3. Ausubel, F.M. et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology.3. Ausubel, F.M. et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology.

4. Baeuerle, P. A., and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol.Baeuerle, P. A., and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol.

5. Bazan, J.F. (1993). Current Biology 3, 603-606.5. Bazan, J.F. (1993). Current Biology 3, 603-606.

6.Berberich, I., Shu, G.L., and Clark, E.A.(1994), J Immunol 153, 4357-66.6. Berberich, I., Shu, G. L., and Clark, E. A. (1994), J Immunol 153, 4357-66.

7. Beutler, B., and van Huffel, C. (1994). Science 264, 667-8.7. Beutler, B., and van Huffel, C. (1994). Science 264, 667-8.

8. Blank, V., Kourilsky, P., and Israel, A. (1992). Trends Biochem. Sci 17, 135-40.8. Blank, V., Kourilsky, P., and Israel, A. (1992). Trends Biochem. Sci 17, 135-40.

9. Boldin, M.P. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270, 337-341.9. Boldin, M.P. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270, 337-341.

10.Boldin, M. P., Varfolomeev, E. E., Pancer, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., and Wallach, D. (1995b). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798.10. Boldin, M. P., Varfolomeev, E. E., Pancer, Z., Mett, I. L., Camonis, J. H., and Wallach, D. (1995b). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798.

11. Boldin, M.P. et al. (1996) Cell 85, 803-815.11.Boldin, M.P. et al. (1996) Cell 85, 803-815.

12. Cao, Z. et al. (1996a) Nature 383, 443-446.12. Cao, Z. et al. (1996a) Nature 383, 443-446.

13. Cao, Z. et al. (1996b) Science 271, 1128-1131.13. Cao, Z. et al. (1996b) Science 271, 1128-1131.

14. Chen, C.J. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:271-273.14. Chen, C.J. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 271-273.

15. Cheng, G., Cleary, A.M., Ye, Z-s., Hong, D.I., Lederman, S. and Baltimore, D. (1995) Science 267:1494-1498.15. Cheng, G., Cleary, A.M., Ye, Z-s., Hong, D.I., Lederman, S. and Baltimore, D. (1995) Science 267: 1494-1498.

16. Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10, 963-973.16. Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10, 963-973.

17. Chinnalyan, A. M., O'Rourke, K., Tewari, M., and Dixit, V.M. (1995) Cell 81, 505-512.17. Chinnalyan, A. M., O'Rourke, K., Tewari, M., and Dixit, V.M. (1995) Cell 81, 505-512.

18. Chinnalyan, A. M. et al. (1996)J. Biol. Chem. 271,4573-457618. Chinnalyan, A. M. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271,4573-4576

19. Creighton, T.E., Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Ca. 1983.19. Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Ca. 1983.

20. Croston, G.E., Cao, Z., and Goeddel, D. V. (1995). J Biol Chem 270, 16514-7.20. Croston, G.E., Cao, Z., and Goeddel, D. V. (1995). J Biol Chem 270, 16514-7.

21. DiDonato, J. A., Mercurio, F., and Karin, M. (1995). Mol Cell Biol 15, 1302-11.21. DiDonato, J. A., Mercurio, F., and Karin, M. (1995). Mol Cell Biol 15, 1302-11.

22. Duan, H. and Dixit, V.M.(1997)Nature 385, 86-8922.Duan, H. and Dixit, V.M. (1997) Nature 385, 86-89

23. Durfee, T. et al. (1993) Genes Dev. 7:555-569.23. Durfee, T. et al. (1993) Genes Dev. 7: 555-569.

24. Field, J. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:2159-2165.24. Field, J. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8: 2159-2165.

25. Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6, 364-369.25. Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6, 364-369.

26. Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274.26. Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274.

27. Gilmore, T.D., and Morin. P.J. (1993). Trends Genet 9, 427-33.27. Gilmore, T. D., and Morin. P.J. (1993). Trends Genet 9, 427-33.

28. Gossen, M. and Bujard, M. (1992) PNAS 89:5547-5551.28. Gossen, M. and Bujard, M. (1992) PNAS 89: 5547-5551.

29. Grell, M., Douni, E., Wajant, H., Lohden, M., Clauss, M., Baxeiner, B., Georgopoulos, S., Lesslauer, W., Kollias, G., Pfizenmaier, K., and Scheurich, P. (1995). Cell 83, 793-802.29.Grell, M., Douni, E., Wajant, H., Lohden, M., Clauss, M., Baxeiner, B., Georgopoulos, S., Lesslauer, W., Kollias, G., Pfizenmaier, K , and Scheurich, P. (1995). Cell 83, 793-802.

30. Grilli, M., Chiu, J.J., and Lenardo, M.J. (1993). Int RevCytol.30. Grilli, M., Chiu, J. J., and Lenardo, M. J. (1993). Int Rev Cytol.

31. Hanks, S. K., Quinn, A.M., and Hunter, T. (1988). Science 241, 42-52.31.Hanks, S. K., Quinn, A.M., and Hunter, T. (1988). Science 241, 42-52.

32. Hofmann K et al.,(1997) TIBS May 22, 1997, p. 155-15632. Hofmann K et al., (1997) TIBS May 22, 1997, p. 155-156

33. Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147, 2964-2969.33. Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147, 2964-2969.

34. Hsu, H., Shu, H.-B., Pan, M.-G., and Goeddel, D.V. (1996). Cell 84, 299-308.34. Hsu, H., Shu, H.-B., Pan, M.-G., and Goeddel, D.V. (1996). Cell 84, 299-308.

35. Hsu, H., Xiong, J., and Goeddel, D.V. (1995). Cell 81, 495-504.35. Hsu, H., Xiong, J., and Goeddel, D.V. (1995). Cell 81, 495-504.

36. Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878.36. Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878.

37. Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53, 3976-3985.37. Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53, 3976-3985.

38.Lalmanach-Girard, A. C., Chiles. T. C., Parker, D. C., and Rothstein, T.L. (1993). J Exp Med 177, 1215-1219.38. Lalmanach-Girard, A. C., Chiles. T. C., Parker, D. C., and Rothstein, T. L. (1993). J Exp Med 177, 1215-1219.

39. Lazebnik, Y.A. et al. (1994) Nature 371, 346-347.39. Lazebnik, Y.A. et al. (1994) Nature 371, 346-347.

40. Malinin, N.L. et al.,(1997) Nature 385, 540-544.40. Malinin, N.L. et al., (1997) Nature 385, 540-544.

41. Mashima, T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 907-915.41. Mashima, T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 907-915.

42. McDonald, P.P., Cassatella, M.A., Bald, A., Maggi, E., Romagnani, S., Gruss, H.J., and Pizzolo, G. (1995). Eur J Immunol 25, 2870-6.42. McDonald, P. P., Cassatella, M. A., Bald, A., Maggi, E., Romagnani, S., Gruss, H. J., and Pizzolo, G. (1995). Eur J Immunol 25, 2870-6.

43. Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Ed. A. Walton. Elsevier, Amsterdam (1981).43. Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Ed. A. Walton. Elsevier, Amsterdam (1981).

44. Milligan, C.E. et al. (1995) Neuron 15, 385-393.44. Milligan, C.E. et al. (1995) Neuron 15, 385-393.

45. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C., and Kieff, E. (1995). Cell 80, 389-399.45. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C., and Kieff, E. (1995). Cell 80, 389-399.

46. Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8, 649.46. Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8, 649.

47. Nagata, S. and Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456.47. Nagata, S. and Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456.

48.Rensing-Ehl, A., Hess, S., Ziegler-Heitbrock, H. W. L,, Riethmuller, G., and Engelmann, H. (1995). J. Inlamm. 45, 161-174.48.Rensing-Ehl, A., Hess, S., Ziegler-Heitbrock, H. W. L ,, Riethmuller, G., and Engelmann, H. (1995). J. Inlamm. 45, 161-174.

49. Rothe, M., Pan, M.-G., Henzel, W.J., Ayres, T.M., and Goeddel, D.V. (1995b). Cell 83, 1243-1252.49.Rothe, M., Pan, M.-G., Henzel, W.J., Ayres, T.M., and Goeddel, D.V. (1995b). Cell 83, 1243-1252.

50. Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V.M., and Goeddel, D. V. (1995a). Science 269, 1424-1427.50. Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V.M., and Goeddel, D. V. (1995a). Science 269, 1424-1427.

51. Rothe, M., Wong, S.C., Henzel, W.J., and Goeddel, D. V. (1994). Cell 78, 681-692.51.Rothe, M., Wong, S. C., Henzel, W. J., and Goeddel, D. V. (1994). Cell 78, 681-692.

52. Rothe, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8241-8246.52. Rothe, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8241-8246.

53. Ruzicka et al., (1993) Science 260, 487.53. Ruzicka et al., (1993) Science 260, 487.

54. Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.54. Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

55. Sano et al., (1992) Science 258, 120.55. Sano et al., (1992) Science 258, 120.

56. Sano et al., (1991) Biotechniques 9, 1378.56. Sano et al., (1991) Biotechniques 9, 1378.

57 Schreiber, E., Matthias, P., Muller, M.M. and Schaffner, W. (1989), Nuc. Acids Res. 17:6419. 57 Schreiber, E., Matthias, P., Muller, M.M. and Schaffner, W. (1989), Nuc. Acids Res. 17: 6419.

58. Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, N.Y. 1798.58. Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, N.Y. 1798.

59. Sleath, P.R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14526-14528.59. Sleath, P. R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14526-14528.

60. Smith, C. A., Farrah, T., and Goodwin, R. G. (1994). Cell 76, 959-962.60. Smith, C. A., Farrah, T., and Goodwin, R. G. (1994). Cell 76, 959-962.

61. Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81, 513-523.61. Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81, 513-523.

62. Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356, 768-774.62. Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356, 768-774.

63. Thornberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33, 3934-3940.63. Thornberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33, 3934-3940.

64. Uren, A.G. et al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 4974-497864. Uren, A.G. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 4974-4978

65. Vandenabeele, P., Declercq, W., Beyaert, R., and Fiers, W. (1995). Trends Cell Biol. 5, 392-400.65. Vandenabeele, P., Declercq, W., Beyaert, R., and Fiers, W. (1995). Trends Cell Biol. 5, 392-400.

66. Varfolomeev, E.E., Boldin, M.P., Goncharov, T.M., and Wallach, D. (1996)., J. Exp. Med. in press.66. Varfolomeev, E.E., Boldin, M.P., Goncharov, T.M., and Wallach, D. (1996)., J. Exp. Med. in press.

67. Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 411-452.67. Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 411-452.

68. Veira et al., (1987) Meth. Enzymol. 153, 3.68. Veira et al., (1987) Meth. Enzymol. 153, 3.

69. Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724.69. Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724.

70. Wallach, D. (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 107-109.70. Wallach, D. (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 107-109.

71. Wang, L. et al. (1994) Cell 78, 739-750.71. Wang, L. et al. (1994) Cell 78, 739-750.

72. Wilks, A.F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1603-1607.72. Wilks, A. F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1603-1607.

73. Yang, E. and Korsmeyer, J. (1996)Blood 88(2), 386-401 73.Yang, E. and Korsmeyer, J. (1996) Blood 88 (2), 386-401

74. Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203, 353-357.74. Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203, 353-357.

75. Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature 365: 448-451.75. Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature 365: 448-451.

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. 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LTD. (B) STREET: WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, P.O.B. 95 (C) CITY: REHOVOT (E) COUNTRY: ISRAEL (F) POSTAL CODE (ZIP): 76100 (G) TELEPHONE: 972-8-9344093 (H) TELEFAX: 972-8-9470739 (A) NAME: WALLACH, DAVID (B) STREET: 24 BOROCHOV STREET (C) CITY: REHOVOT (E) COUNTRY: ISRAEL (F) POSTAL CODE (ZIP): 76406 (A) NAME: BOLDIN, MARK (B) STREET: BEIT CLORE, WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE (C) CITY: REHOVOT (E) COUNTRY: ISRAEL (F) POSTAL CODE (ZIP): 76100 (A) NAME: MALININ, NIKOLAI (B) STREET: BEIT CLORE, WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE (C) CITY: REHOVOT (E) COUNTRY: ISRAEL (F) POSTAL CODE (ZIP): 76100 (ii) TITLE OF OF: MODULATORS OF INTRACELLULAR INFLAMMATION, CELL DEATH AND CELL SURVIVAL PATHWAYS (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: IL 121011 (B) FILING DATE: 05-JUN-1997 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120 125 Ala Leu Gly Val Asn Tyr Leu His Asn Met Thr Pro Pro Leu Leu His 130 135 140 His Asp Leu Lys Thr Gln Asn Ile Leu Leu Asp Asn Glu Phe His Val 145 150 155 160 Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Trp Arg Met Met Ser Leu Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ala Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Tyr 180 185 190 Met Pro Pro Glu Asn Tyr Glu Pro Gly Gln Lys Ser Arg Ala Ser Ile 195 200 205 Lys His Asp Ile Tyr Ser Tyr Ala Val Ile Thr Trp Glu Val Leu Ser 210 215 220 Arg Lys Gln Pro Phe Glu Asp Val Thr Asn Pro Leu Gln Ile Met Tyr 225 230 235 240 Ser Val Ser Gln Gly His Arg Pro Val Ile Asn Glu Glu Ser Leu Pro 245 250 255 Tyr Asp Ile Pro His Arg Ala Arg Met Ile Ser Leu Ile Glu Ser Gly 260 265 270 Trp Ala Gln Asn Pro Asp Glu Arg Pro Ser Phe Leu Lys Cys Leu Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Pro Val Leu Arg Thr Phe Glu Glu Ile Thr Phe Leu Glu 290 295 300 Ala Val Ile Gln Leu Lys Lys Thr Lys Leu Gln Ser Val Ser Ser Ala 305 310 315 320 Ile His Leu Cys Asp Lys Lys Lys Met Glu Leu Ser Leu Asn Ile Pro 325 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Claims (39)

도 3A(서열 1)의 아미노산 서열로 된 B1 단백질 또는 이의 단편을 인코드하며, 이때 B1 단백질의 단편은 다음과 같은 구성을 하며;Encodes the B1 protein or fragment thereof of the amino acid sequence of FIG. 3A (SEQ ID NO: 1), wherein the fragment of B1 protein has the following structure; B1 돌연변이(mut), 47번 위치의 라이신이 알라닌으로 대체된 B1 돌연변이 B1 mutation, B1 mutation in which lysine at position 47 is replaced by alanine △CARD, PCR에 의해 만들어진 CARD 도메인이 결핍되고 발현 운반체로 클로 닝된 B1 △ CARD, the CARD domain created by PCR and lack of expression in a carrier claw ningdoen B1 △Xba, CARD 도메인이 결핍되었으나 △CARD보다 3'말단이 짧은 제한 위치의 사용과 발현 운반체로의 클로닝에 의해 만들어진 B1 △ Xba, CARD domain but lacking created by the cloning and expression of a used carrier, a 3 'terminal restriction sites is short than △ B1 CARD △Bam, △Xba에 유사하고 Bam 제한 효소를 이용해 동일한 방식으로 만들어진 B1 Bam △, △ similar to Xba and made in the same way using the restriction enzyme Bam B1 △Nde, 카이나제 도메인과 CARD 도메인의 일부를 포함하고 PCR에 의해 만들어져 발현 운반체로 클로닝된 B1, 또는 ΔNde , B1 containing a portion of a kinase domain and a CARD domain and made by PCR and cloned into an expression carrier, or △K, 다음의 시발체를 이용해 PCR에 의해 만들어진 B1 △ K, B1 was made by PCR using the following primer of 1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC;1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC; 2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA B1 단백질 및 상기 B1 단편은 염증, 세포사멸 또는 세포 생존 경로의 세포내 매개/조절체와 상호작용하여 직간접적으로 세포 염증, 사멸 또는 생존을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 B1 단백질 또는 이의 단편을 인코드하는 DNA 서열.The B1 protein and the B1 fragment may interact with intracellular mediators / regulators of inflammation, apoptosis or cell survival pathways to directly or indirectly regulate cellular inflammation, death or survival. DNA sequence encoding. 제 1 항에 있어서, 도 3B(서열 2)의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.The DNA molecule of claim 1 having the nucleotide sequence of FIG. 3B (SEQ ID NO: 2). 삭제delete 삭제delete 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 DNA 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. An expression vector comprising the DNA sequence according to claim 1. 제 5 항에 있어서, 진핵 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. The expression vector of claim 5, wherein the expression vector can be expressed in a eukaryotic host cell. 제 5 항 있어서, 원핵 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.The expression vector of claim 5, wherein the expression vector can be expressed in prokaryotic host cells. 제 5-7항 중 어느 한 항에 따른 발현벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 진핵 숙주 세포.A transformed eukaryotic host cell comprising the expression vector according to any one of claims 5-7. 제 5-7항 중 어느 한 항에 따른 발현벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵 숙주 세포. A transformed prokaryotic host cell comprising the expression vector according to any one of claims 5-7. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 DNA 서열에 의해 인코드되는 B1 단백질 또는 B1 단백질 단편에 있어서 세포내 염증, 세포 사멸 또는 세포 생존 경로에서 이 경로의 다른 세포내 조절체나 매개체와 직간접적으로 결합하여 이들 경로를 조절할 수 있고, 이때 B1 단백질의 단편은 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 B1 단백질 또는 B1 단편 단백질.A B1 protein or B1 protein fragment encoded by a DNA sequence according to any one of claims 1 or 2, directly or indirectly with other intracellular regulators or mediators of this pathway in intracellular inflammation, apoptosis or cell survival pathways. Can be combined to regulate these pathways, wherein the fragment of the B1 protein is composed of the following B1 protein or B1 fragment protein. B1 돌연변이(mut), 47번 위치의 라이신이 알라닌으로 대체된 B1 돌연변이 B1 mutation, B1 mutation in which lysine at position 47 is replaced by alanine △CARD, PCR에 의해 만들어진 CARD 도메인이 결핍되고 발현 운반체로 클로 닝된 B1 △ CARD, the CARD domain created by PCR and lack of expression in a carrier claw ningdoen B1 △Xba, CARD 도메인이 결핍되었으나 △CARD보다 3'말단이 짧은 제한 위치의 사용과 발현 운반체로의 클로닝에 의해 만들어진 B1 △ Xba, CARD domain but lacking created by the cloning and expression of a used carrier, a 3 'terminal restriction sites is short than △ B1 CARD △Bam, △Xba에 유사하고 Bam 제한 효소를 이용해 동일한 방식으로 만들어진 B1 Bam △, △ similar to Xba and made in the same way using the restriction enzyme Bam B1 △Nde, 카이나제 도메인과 CARD 도메인의 일부를 포함하고 PCR에 의해 만들어져 발현 운반체로 클로닝된 B1, 또는 ΔNde , B1 containing a portion of a kinase domain and a CARD domain and made by PCR and cloned into an expression carrier, or △K, 다음의 시발체를 이용해 PCR에 의해 만들어진 B1 △ K, B1 was made by PCR using the following primer of 1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC;1. 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATC; 2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA2. 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA 제 10 항에 있어서, 제2항에 따른 DNA에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 B1 단백질. The B1 protein according to claim 10, which is encoded by the DNA according to claim 2. 제 10항 또는 제 11항에 따른 B1 단백질, 이의 단편 및 유도체를 생산하는 방법에 있어서, 상기 단백질, 이의 단편 및 유도체를 발현시키는데 적합한 조건하에서 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 형질전환된 숙주 세포를 생장시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.A method for producing a B1 protein, fragments and derivatives thereof according to claim 10, wherein the host cell is transformed according to claim 8 or 9 under conditions suitable for expressing said protein, fragments and derivatives thereof. Method characterized in that consisting of growing. 제 10항 또는 11항에 따른 B1 단백질, 이의 단편 및 유도체에 특이적인 것을 특징으로 하는 항체.An antibody, characterized in that it is specific for the B1 protein, fragments and derivatives thereof according to claim 10. 제 11항에 있어서, Fab, F(ab')₂ 단편인 것을 특징으로 하는 항체.The antibody of claim 11, wherein the antibody is a Fab, F (ab ′) ₂ fragment. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 간염, 당뇨병, 이식거부, 다발성 경색, AIDS, 종양, 염증 질환 치료를 위해 염증, 세포 사멸, 세포 생존 또는 다른 경로를 직간접적으로 조절하는 약학 조성물에 있어서, 활성성분으로 제 10항 또는 11항에 따른 한 가지 이상의 B1 단백질로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.A pharmaceutical composition which directly or indirectly modulates inflammation, cell death, cell survival or other pathways for the treatment of hepatitis, diabetes, transplant rejection, multiple infarctions, AIDS, tumors, inflammatory diseases, the active ingredient according to claim 10 or 11 Pharmaceutical composition, characterized in that consisting of at least one B1 protein according. 간염, 당뇨병, 이식거부, 다발성 경색, AIDS, 종양, 염증 질환 치료를 위해 세포에서 염증, 세포 사멸, 세포 생존 또는 다른 경로의 활성 기전을 직간접적으로 조절하기 위한 약학 조성물에 있어서, 활성 기전은 제10항 또는 제11항의 B1 단백질에 의해 조절되고, 약학 조성물의 활성성분으로 제 5 항 또는 제 6 항의 벡터를 포함하고, 이때 벡터는 세포 표면에 있는 특정 수용체에 결합할 수 있는 바이러스성 표면 단백질(리간드)를 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. In pharmaceutical compositions for directly or indirectly regulating the mechanism of action of inflammation, cell death, cell survival, or other pathways in cells for the treatment of hepatitis, diabetes, transplant rejection, multiple infarctions, AIDS, tumors, inflammatory diseases, A viral surface protein that is regulated by the B1 protein of claim 10 or 11 and comprises the vector of claim 5 or 6 as an active ingredient of the pharmaceutical composition, wherein the vector is capable of binding to a specific receptor on the cell surface. Pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule encoding a ligand). 제10항 또는 11항에 따른 B1 단백질이 직간접적으로 결합하여 하나 이상의 분자에 의한 아팝토시스의 제어와 관련된 간염, 당뇨병, 이식거부, 다발성 경색, AIDS, 종양, 염증 질환 치료를 위한 약학 조성물에 있어서 활성 성분으로 제10항 또는 제11항의 B1 단백질, 이의 단편 및 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The pharmaceutical composition for the treatment of hepatitis, diabetes mellitus, transplant rejection, multiple infarction, AIDS, tumors, inflammatory diseases associated with control of apoptosis by one or more molecules by direct or indirect binding of the B1 protein according to claim 10 or 11 A pharmaceutical composition, comprising the B1 protein of claim 10 or a fragment thereof and a variant thereof as an active ingredient. 제 10항 또는 11항에 따른 B1 단백질이 직간접적으로 결합하는 하나 이상의 분자에 의한 아팝토시스의 제어와 관련된 간염, 당뇨병, 이식거부, 다발성 경색, AIDS, 종양, 염증의 예방과 치료를 위한 제약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.Pharmaceuticals for the prevention and treatment of hepatitis, diabetes, transplant rejection, multiple infarctions, AIDS, tumors, inflammation associated with control of apoptosis by one or more molecules to which the B1 protein according to claim 10 or 11 directly or indirectly binds. A pharmaceutical composition comprising the DNA molecule of claim 1 as an active ingredient. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 10항 또는 11항에 따른 B1 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 선별하는 방법에 있어서, 상기 단백질이 부착된 친화력 크로마토그래피 메트릭스에 시험 세포 추출물을 접촉시켜, 매트릭스에 리간드가 결합할 수 있도록 한 후, 리간드를 용출시켜, 분리 및 분석하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법. A method for selecting a ligand capable of binding to a B1 protein according to claim 10 or 11, wherein the test cell extract is contacted with an affinity chromatography matrix to which the protein is attached to allow the ligand to bind to the matrix. , Eluting, separating and analyzing the ligand. 제 9항 또는 10항에 따른 B1 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 코딩한 DNA서열의 선별을 위한 방법에 있어서, 이 방법은 이스트 이중-하이브리드(yeast two-hybrid) 방법을 사용하는 것으로, B1 단백질을 인코드하는 서열을 제 1 하이브리드 벡터에 포함시키고, cDNA나 게놈 DNA 라이버러리로부터의 서열을 제 2 하이브리드 벡터에 포함시킨 후, 이들 두 벡터를 이스트 숙주 세포에 형질 감염시킨 후, 양성적으로 형질전환된 세포를 분리하고, 제 2 하이브리드 벡터를 추출하여, 리간드를 인코드하는 서열을 얻는 것을 특징으로 하는 방법. The method for selecting a DNA sequence encoding a ligand capable of binding to the B1 protein according to claim 9, wherein the method uses a yeast two-hybrid method, B1 protein Is included in the first hybrid vector, sequences from the cDNA or genomic DNA library are included in the second hybrid vector, and these two vectors are transfected into the yeast host cell, followed by positive transformation. Isolated cells and extracting a second hybrid vector to obtain a sequence encoding a ligand. B1에 의해 조절/매개되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에 있어서, In the method of identifying a ligand that can modulate the cell activity regulated / mediated by B1, a) B1의 모든 프로도메인(또는 CARD)을 필수적으로 포함하고 도3에서 설명된 B1의 아미노산 잔기의 적어도 일부를 보유한 B1의 한 부분으로 이상으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드의 선별;a) selection of a ligand capable of binding to a polypeptide consisting essentially of all prodomains (or CARDs) of B1 and consisting of at least one portion of B1 containing at least a portion of the amino acid residues of B1 described in FIG. 3; b) BCL2, TRAF2, 또는 TNF/NGF 수용체 페밀리의 일부 수용체 또는 프로도메인(CARD)을 가진 다른 공지된 단백질을 제외하고, 상기 결합능력의 선별단계에 의해 밝혀진 새로운 리간드를 확인 및 특성을 확인하고; 그리고b) identifying and characterizing new ligands identified by the screening step of said binding capacity, except for some of the receptors or prodomains (CARDs) of the BCL2, TRAF2, or TNF / NGF receptor family; And c) 상기 리간드의 존재를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법. c) determining the presence of said ligand. 제 10 항 또는 11 항에 따른 B1에 의해 조절/매개되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에 있어서,In the method for identifying a ligand that can modulate the cell activity regulated / mediated by B1 according to claim 10, a) 프로도메인(또는 CARD)을 포함하고 도3에서 설명된 B1 서열의 적어도 카르복실 말단 부분으로 구성된 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드를 선별하고;a) selecting a ligand comprising a prodomain (or CARD) and capable of binding to a polypeptide consisting of at least the carboxyl terminal portion of the B1 sequence described in FIG. 3; b) BCL2, TRAF2, 또는 TNF/NGF 수용체 페밀리의 일부 수용체 또는 프로도메인(CARD)을 가진 다른 공지된 단백질을 제외하고, 상기 결합능력의 선별단계에 의해 밝혀진 리간드를 확인 및 특성을 확인하고; 그리고b) identifying and characterizing ligands identified by the screening step of said binding capacity, except for some of the receptors or prodomains (CARDs) of the BCL2, TRAF2, or TNF / NGF receptor family; And c) 상기 리간드의 존재를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법. c) determining the presence of said ligand. B1에 의해 조절/매개되는 세포 활성을 조절할 수 있는 리간드를 확인하는 방법에 있어서, In the method of identifying a ligand that can modulate the cell activity regulated / mediated by B1, a) 실질적으로 B1의 모든 카이나제 도메인을 포함하고 도3에서 설명된 B1 서열의 적어도 N-말단 부분에 결합할 수 있는 리간드를 선별하고;a) selecting a ligand comprising substantially all the kinase domains of B1 and capable of binding to at least the N-terminal portion of the B1 sequence described in FIG. 3; b) BCL2, TRAF2, 또는 TNF/NGF 수용체 페밀리의 일부 수용체 또는 프로도메인(CARD)을 가진 다른 공지된 세포내 조절 단백질을 제외하고, 상기 결합능력의 선별단계에 의해 밝혀진 리간드의 확인 및 특성을 확인하고; 그리고b) Confirmation and characterization of the ligands revealed by the screening step of the binding capacity, except for some of the BCL2, TRAF2, or other known intracellular regulatory proteins with prodrome (CARD) of the TNF / NGF receptor family. and; And c) 상기 리간드의 존재를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법. c) determining the presence of said ligand. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete