KR100530885B1 - Pseudomonas flourescence B16 and Method of enhancement of plant growth and Control of the bacterial wilt - Google Patents

Pseudomonas flourescence B16 and Method of enhancement of plant growth and Control of the bacterial wilt Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양으로부터 순수하게 분리 배양한 신규한 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16), B16균주의 돌연변이 균주인 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31), 이를 이용한 작물 생장촉진 방법 및 세균성 시들음병 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 신규 균주는 미생물 제재로 작물에 적용시 작물의 생장을 촉진시킴과 동시에 세균성 식물병에 대한 효과적인 방제방법을 제공하고 이러한 효과가 오래 유지되는 이점을 갖는다.The present invention is a novel strain Pseudomonas fluorescens B16 (Pseudomonas fluorescens B16) purely isolated from the culture culture, Pseudomonas fluorescens K2-31 (Pseudomonas fluorescens K2-31), a mutant strain of B16 strain, crop growth promotion using the same The present invention relates to a method for controlling bacterial wilting disease, wherein the novel strain according to the present invention promotes the growth of crops when applied to crops with microbial agents, and provides an effective control method for bacterial plant diseases and maintains such effects for a long time. Has

Description

슈도모나스 플로레슨스 Ｂ１６ 균주 및 이를 이용한 작물의 생장촉진 방법 및 세균성 시들음병 방제 방법{Pseudomonas flourescence B16 and Method of enhancement of plant growth and Control of the bacterial wilt} Pseudomonas flourescence B16 and Method of enhancement of plant growth and control of the bacterial wilt}

본 발명은 작물 생장 촉진 및 세균성 식물병 방제에 유효한 신규 균주 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 토양으로부터 순수하게 분리 배양한 신규한 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16), 세균성 시들음병에 대한 B16 균주의 돌연변이 균주인 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31), 이를 이용한 작물 생장촉진 방법 및 세균성 시들음병 방제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to novel strains effective for promoting crop growth and controlling bacterial plant diseases, and more specifically, plant strain control methods using the same. More specifically, the novel strain Pseudomonas fluorescens B16 isolated and cultured purely from soil, The present invention relates to Pseudomonas fluorescens K2-31 (Pseudomonas fluorescens K2-31), which is a mutant strain of B16 strain against bacterial wilt, and a method for promoting crop growth and controlling bacterial wilt disease.

종래에 화학농약을 사용하지 않고 식물병을 방제하려는 시도는 다양한 방법으로 이루어졌는데 그 중에 대표적인 방법이 미생물을 이용한 식물병 방제 기술이다.In the past, attempts to control plant diseases without using chemical pesticides have been made in various ways, among which representative methods are plant disease control techniques using microorganisms.

본 발명과 관련된 세균성 시들음병(풋마름병)은 랄스토니아 솔나세아륨 (Ralstonia solnacearum)균에 의해 토마토, 고추, 가지, 담배 등 가지과 작물을 비롯하여 여러 가지 작물을 기주로 하여 발병하여 극심한 시들음 증상을 일으키는 세균성 시들음병(풋마름병)으로서, 뚜렷한 방제책이 없고, 토양 배지는 물론 양액 재배지 상에서도 방제가 어려우며 한 번 발생하면 급속히 진전되어 대부분의 경우 작물 재배에 결정적인 영향을 주기 때문에 이에 대한 구제책이 필요하였다. 본 발명은 상기와 같은 점에 기초하여 안출한 것이다.Bacterial wilting disease (foot blight) associated with the present invention is caused by Ralstonia solnacearum bacteria based on a variety of crops, including eggplant crops such as tomato, pepper, eggplant, tobacco, causing severe wilting symptoms As a bacterial wilting disease (foot blight), there is no clear control measures, and it is difficult to control not only on soil medium but also on nutrient farms, and once developed, it is rapidly progressed and in most cases, a remedy was necessary. The present invention has been devised based on the above points.

따라서 본 발명의 하나의 목적은 신규한 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16) 균주, 길항력을 향상시킨 B16 균주의 돌연변이 균주인 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31)를 제공하는 것이다.Accordingly, one object of the present invention is to provide a novel Pseudomonas fluorescens B16 strain, Pseudomonas fluorescens K2-31, which is a mutant strain of B16 strain with improved antagonism. will be.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키고 세균성 시들음병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for promoting plant growth and controlling bacterial wilting disease using the novel strain.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 균주를 포함하는 미생물 제재를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a microbial preparation comprising the microbial strain.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 길항 물질을 생산하는 유전자 또는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a gene or polypeptide that produces the antagonist.

본 발명의 다른 목적은 상기 분리된 DNA 분자로 형질전환된 발현 벡터, 상기 분리된 DNA 분자로 형질전환된 숙주, 분리된 DNA 분자로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an expression vector transformed with the isolated DNA molecule, a host transformed with the isolated DNA molecule, and a transformed plant transformed with the isolated DNA molecule.

이하에서 첨부 도면을 참고하여 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described in more detail with respect to the present invention.

본 발명은 신규한 미생물 균주인 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16) 균주 및 식물성 병원균에 대한 길항물질 생합성 능력이 향상된 돌연변이 균주인 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31)균주를 제공한다.The present invention provides a novel microbial strain Pseudomonas fluorescens B16 (Pseudomonas fluorescens B16) strain and Pseudomonas fluorescens K2-31 (Pseudomonas fluorescens K2-31) strain mutant with improved antagonist biosynthesis ability against plant pathogens do.

본 발명에 의한 B16 균주의 분리, 기탁 및 돌연변이 균주 K2-31의 제작Isolation, Deposition and Construction of Mutant Strain K2-31 of B16 Strains According to the Present Invention

본 발명의 미생물 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16) 균주는 장수군 계북면 야산의 화본과 잡초 뿌리에서 분리하여 생리실험과 MIDI 검정(Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA), 16S rRNA 염기서열 검사 등을 거처 슈도모나스 플로레슨스로 동정하였고 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16)으로 명명하였다. 이 균주는 1998년 12월 29일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하고 기탁번호 KCTC 0563BP를 부여 받았다. 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주는 저온에서 생장이 왕성한 미생물을 선발하는 과정에서 분리된 것으로 분리한 장소는 해발 500m 정도의 고지대이다. 분리하는 과정은 채집한 잡초 뿌리를 막자사발에서 완전히 분쇄하여 0.1M MgSO4 용액 10ml에 분산시킨 다음 형광성 슈도모나스 균주를 선택적으로 분리할 수 있는 King'B agar 배지로부터 선발하였다.Pseudomonas fluorescens B16 strain of the microorganism strain of the present invention was isolated from wild flowers and weed roots of Gyebuk-myeon, Jangsu-gun, Korea, and physiological experiment and MIDI assay (Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA), 16S rRNA base Sequence tests were identified as Pseudomonas fluorescens and named Pseudomonas fluorescens B16. This strain was deposited on Dec. 29, 1998 to the Genetic Bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and was assigned accession number KCTC 0563BP. Pseudomonas florences B16 strain was isolated during the selection of microorganisms that grew vigorously at low temperatures, and was isolated at an altitude of 500 m above sea level. Separation process was collected from the weed root was completely ground in a mortar and dispersed in 10ml of 0.1M MgSO4 solution and then selected from King'B agar medium that can selectively isolate the fluorescent Pseudomonas strain.

본 발명의 또 다른 미생물 균주 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31)균주는 상기 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16) 균주에 하나의 복제 기점(an origin of replication)을 갖고 EcoR1 site를 갖지 않는 전이성 인자(transposable element)인 Omegon Km을 이용하여 Tn 돌연변이유발(Tn Mutagenesis) 처리를 한 결과 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 질산염/아질산염 조절 단백질과 상동(36%일치, 59%양성)인 유전자에 돌연변이가 나타난 균주이다. 이 균주는 2003년 9월 16일자로 농업생명공학연구원 유전자은행에 기탁하고 기탁번호 KACC 91065를 부여 받았다. 특히 상기 돌연변이에 의해 본 발명의 균주들의 특징인 길항물질의 생산을 억제하는 유전자가 상실된 균주이다. 즉, 본 발명의 슈도모나스 플로레슨스 K2-31균주는 본 발명의 B16 균주와 다른 특성은 모두 동일하되, 상기 Tn 돌연변이유발의 결과로 길항물질 생성을 억제하는 유전자가 저해(inhibition)되어 보다 월등한 길항능력을 나타내는 균주이다.Pseudomonas fluorescens K2-31 strain Pseudomonas fluorescens K2-31 strain of the present invention has an origin of replication in the Pseudomonas fluorescens B16 strain and EcoR1 site Tn Mutagenesis Treatment with Omegon Km, a Transposable Element That Does Not Contain, Produces Tn Mutagenesis Homologous to Homologous Nitrate / Nitrite Regulatory Protein of Pseudomonas aeruginosa ) Is a strain with mutations in the gene. The strain was deposited with the Genetic Bank of Korea Research Institute of Agricultural and Biotechnology on September 16, 2003 and assigned accession number KACC 91065. In particular, by the mutation, a gene whose gene inhibits the production of antagonist which is characteristic of the strains of the present invention is lost. That is, the Pseudomonas florences K2-31 strain of the present invention has all the same characteristics as the B16 strain of the present invention, but is superior to the gene that inhibits antagonist production as a result of the Tn mutagenesis. It is a strain exhibiting antagonistic ability.

본 발명에 의한 B16 균주의 배양학적, 생태학적 특성Culture and Ecological Characteristics of B16 Strains According to the Present Invention

기탁 완료된 B16 균주는 슈도모나스속에 속하는 것으로, 녹황색 형광색소를 형성하고 그람음성 호기성 간균으로 활발한 운동성을 갖는다. 슈도모나스 플로레슨스 B16 (KCTC 0563BP) 는 생장온도의 범위가 아주 넓어서 5℃부터 40℃ 에 걸쳐 생장하며 생육 적온인 28℃ ∼ 30℃ 에서는 18시간 이내에 최대 증식기에 이르고 5℃의 저온에서도 30시간 이내에 대수기에 이른다(도 1). 도 1은 5℃의 King's B배양액에서의 B16균주와 관련 분리 균주의 성장 속도를 나타낸 그래프이다. 도 1에서 T-19, I-10 및 PF-3은 모두 본 발명의 B16 균주와 마찬가지로 슈도모나스 플로레슨스에 속하는 것으로 KB 배지에서 형광성 색소를 분비하는 균주들이다. 도 1의 그래프로부터 본 발명의 B16 균주가 같은 슈도모나스 속 균주들에 대수기 이후에도 빠른 증식을 한다는 것을 확인할 수 있다.The deposited B16 strain belongs to the genus Pseudomonas, which forms a green-yellow fluorescent pigment and has active motility with Gram-negative aerobic bacilli. Pseudomonas florences B16 (KCTC 0563BP) has a wide range of growth temperature and grows from 5 ° C to 40 ° C, reaching maximum growth within 18 hours at 28 ° C to 30 ° C of growth temperature, and within 30 hours at low temperature of 5 ° C. It reaches log phase (Fig. 1). 1 is a graph showing the growth rate of strain B16 and related isolates in King's B culture at 5 ° C. In Figure 1, T-19, I-10 and PF-3 are all belonging to Pseudomonas florences like the B16 strain of the present invention are strains that secrete fluorescent pigments in KB medium. From the graph of Figure 1 it can be seen that the B16 strain of the present invention rapid growth even after the logarithm to the same Pseudomonas strains.

본 발명은 상기 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키고 세균성 시들음병을 방제하는 방법을 제공한다. 즉, 작물을 파종하기 전에 종자를 상기 미생물 균주의 현탁액에 침지 처리하거나, 직접적으로 작물의 근권에 처리하는 과정을 통해 식물의 생장을 촉진하고 세균에 의한 시들음병을 효과적으로 방제할 수 있다.The present invention provides a method for promoting plant growth and controlling bacterial wilted disease using the strain. That is, the seed can be immersed in the suspension of the microbial strain before the seeding of the crop, or directly treated to the root of the crop to promote plant growth and effectively control the wilted disease caused by bacteria.

또한 본 발명은 상기 신규 미생물 균주를 포함하는 식물생장 촉진용 또는 길항력 향상을 위한 미생물 제재를 제공한다. 즉, 상기 신규한 미생물 균주는 통상의 방법을 이용하여 액상 또는 고상의 미생물 제재로 제재화될 수 있다. 즉, 균주를 시드(seed) 접종하여 배양 후, 배양액을 건조매체와 혼합하여 건조하고, 건조가 완료되면 분쇄하여 다른 부형제와 혼합한 후, 분말제형, 입제 또는 액상의 제형으로 제재화될 수 있다.In another aspect, the present invention provides a microbial preparation for promoting plant growth or antagonism including the novel microbial strain. That is, the novel microbial strain can be formulated into a liquid or solid microbial preparation using conventional methods. That is, after seeding and incubating the strain (seed), the culture medium may be mixed with a dry medium and dried, and when the drying is complete, it is ground and mixed with other excipients, it may be formulated into a powder, granule or liquid formulation. .

한편, 본 발명의 다른 양상은 상기 두 미생물 균주에서 길항능력을 나타내는 화합물을 코딩하는 유전자로서 그것의 염기 서열이 서열 1로 나타낸 유전자, 이를 이용하여 형질 전환된 벡터 및 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.On the other hand, another aspect of the present invention provides a gene encoding a compound exhibiting antagonistic ability in the two microorganism strains, the gene whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 1, the vector transformed using the same and the transformed host cell .

길항물질을 코딩하는 유전자Genes encoding antagonists

상기와 같이 본 발명의 슈도모나스 플로레슨스 B16 및 K2-31은 공통적으로 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanaceraum), 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)등의 식물성 병원균에 대해 강한 길항력을 나타내는 바, 이는 상기 본 발명의 균주가 식물성 병원균의 성장을 저해하는 특정 길항물질을 생산함으로 인한 것이며 이러한 길항물질을 생합성하는 유전자의 염기서열은 서열 1(Genebank database No. AY186595, GeneBank Database)과 같다.As described above, Pseudomonas florences B16 and K2-31 of the present invention have a strong antagonist against plant pathogens such as Ralstonia solanaceraum and Agrobacterium tumefaciens. This indicates that the strain of the present invention produces a specific antagonist that inhibits the growth of plant pathogens, and the nucleotide sequence of the gene that synthesizes the antagonist is shown in SEQ ID NO: 1 (Genebank database No. AY186595, GeneBank Database). .

상기 염기 서열(1~4319)은 네 부분으로 구성되는데, 각각은 시스타티오닌 감마-라이에이즈 유사 단백질(cystathionine gamma lyase-like protein; 176~1321, GeneBank Database), 피루브산 포름산염-라이에이즈 활성화 효소 유사 단백질 (pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein;1318~2802, GeneBank Database), 밝혀지지 않은 단백질을 코딩하는 유전자(unknown gene; 2903~3622, GeneBank Database) 및 전사조절 인자 유사 단백질을 코딩하는 유전자 (transcription regulator-like protein; 3823~4254, GeneBank Database) 이다.The base sequence (1 ~ 4319) is composed of four parts, each of the cystathionine gamma lyase-like protein (176-1321, GeneBank Database), pyruvate formate-lyase activating enzyme Pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein (1318-2802, GeneBank Database), unknown genes (2903-3622, GeneBank Database), and genes encoding transcriptional regulator-like proteins (transcription regulator-like protein; 3823-4254, GeneBank Database).

본 발명의 길항물질을 생산하는 유전자는 상기 서열 1의 분리된 DNA 분자 이외에, 엄격한 조건(stringent condition)하에서 서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자 또는 서열 1의 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자도 포함한다. 엄격한 조건이란 혼성화 폴리뉴클레오티드 사이의 특이성을 보증하는 혼성화 조건 또는 그보다 더 엄격한 조건을 의미하는 것으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 고도로 상보적인 서열들만이 동정될 수 있도록 비특이적인 혼성화수를 감소시키는 온도, 및 염농도를 포함하는 혼성화 후 세정 조건 등으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 온도가 60℃ 이상이거나 세척시의 완충액의 농도를 0.1XSSC로 하여 혼성화를 수행하는 것이다.The gene producing the antagonist of the present invention hybridizes to a DNA molecule or a DNA molecule of SEQ ID NO: 1 hybridized to a DNA molecule comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, in addition to the isolated DNA molecule of SEQ ID NO: 1 Also included are DNA molecules that are complementary to the DNA molecule. Stringent conditions refer to hybridization conditions or more stringent conditions that ensure specificity between hybridizing polynucleotides, such that the temperature at which nonspecific hybridization water is reduced so that only highly complementary sequences can be identified in the art to which the present invention pertains, and It may be understood as washing conditions after hybridization including salt concentration. For example, hybridization is performed at a hybridization temperature of 60 ° C. or higher or at a concentration of 0.1 × SSC at the time of washing.

또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 B16 균주로부터 분리된 DNA(서열 1)에 의해 코드화되는 길항물질과 관련한 폴리펩타이드, 즉 서열목록의 서열 2에 상응하는 상기 아미노산 서열을 제공한다. 상기 서열 1에 따른 상기 아미노산 서열 2는 각각 시스타티오닌 감마-라이에이즈 유사 단백질(cystathionine gamma lyase-like protein; Protein ID: AA065397.1, GeneBank Database), 피루브산 포름산염-라이에이즈 활성화 효소 유사 단백질(pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein; Protein ID: AA065398.1, GeneBank Database), 미지의 단백질(unknown protein; Protein ID: AA065399.1, GeneBank Database) 및 전사조절 인자 유사 단백질(transcription regulator-like protein; Protein ID: AA065400.1, GeneBank Database)로 분석되었다.The present invention also provides a polypeptide related to an antagonist encoded by DNA isolated from the B16 strain of the present invention (SEQ ID NO: 1), ie, the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing. The amino acid sequence 2 according to SEQ ID NO: 1 is cystathionine gamma lyase-like protein; Protein ID: AA065397.1, GeneBank Database, pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein ( pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein; Protein ID: AA065398.1, GeneBank Database, unknown protein; Protein ID: AA065399.1, GeneBank Database, and transcription regulator-like protein Protein ID: AA065400.1, GeneBank Database).

또한 본 발명의 또 다른 측면에서 상기 길항물질을 코딩하는 유전자에 의해 형질 전환된 토마토, 고추, 가지, 오이, 참깨, 딸기, 벼, 보리, 잔디 등의 형질전환 식물체를 제공한다. 형질전환 식물체는 통상의 방법을 통해 얻어질 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 신규한 길항물질 생합성 인자를 이용해서 식물에 질병 내성을 부여하거나, 식물의 생장을 촉진시키거나 해충을 방제하는 또 하나의 방법은 식물 또는 식물 종자를 본 발명의 분리된 DNA 분자로 형질 전환시키는 것이다.In another aspect of the invention provides a transgenic plant, such as tomato, pepper, eggplant, cucumber, sesame, strawberry, rice, barley, grass transformed with the gene encoding the antagonist. Transgenic plants can be obtained through conventional methods. In other words, another method of imparting disease resistance to plants, promoting plant growth, or controlling pests by using the novel antagonist biosynthesis factor according to the present invention is that the plant or plant seeds are separated from the DNA of the present invention. It is transformed into a molecule.

본 발명의 분리된 DNA 분자는 종래의 DNA 재조합 기술을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 식물에서는, 형질 전환된 단일 세포로부터 번식력이 있는 식물체가 재분화될 수 있고, 따라서, 식물세포에 도입된 유전자는, 최종적으로, 종자를 통해 몇 세대에 걸쳐서 후손에 전해질 수 있다.Isolated DNA molecules of the present invention can be introduced into cells using conventional DNA recombination techniques. In plants, reproductive plants can be re-differentiated from the transformed single cells, and thus the genes introduced into the plant cells can finally be passed down through the seed to generations.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 분리된 DNA 분자로 형질 전환된 발현 벡터이다. 본 발명에서 사용가능한 발현벡터는 다양한 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등을 포함한다. 바람직한 발현 벡터의 예로는 pUC18, pBluescript 또는 본 발명에서 실제 사용한 pLAFR3을 들 수 있다.Another aspect of the invention is an expression vector transformed with the isolated DNA molecule of the invention. Expression vectors usable in the present invention include various viral vectors or plasmid vectors. Examples of preferred expression vectors include pUC18, pBluescript or pLAFR3 actually used in the present invention.

본 발명의 신규한 길항물질 생합성과 관계있는 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키기 위한 숙주 벡터 시스템은 형질 전환된 세균, 효모와 같은 미생물, 바이러스, 바이러스에 의해 감염된 곤충 세포 시스템, 세균에 의해 감염된 식물 세포를 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, E Coli-pBluescript 숙주-벡터 시스템을 들 수 있다.Host vector systems for expressing polypeptides or proteins related to the novel antagonist biosynthesis of the present invention include transformed bacteria, microorganisms such as yeasts, viruses, insect cell systems infected by viruses, plant cells infected by bacteria can do. Specifically, the E Coli-pBluescript host-vector system may be mentioned.

본 발명에 따라 재조합된 분자는 여러 가지 방법에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 분리된 DNA를 세포에 도입하는 방법 가운데 하나는 Ti 플라스미드를 이용하는 방법이다. 토양 세균인 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)는 Ti 플라스미드(Ti plasmid)라고 불리는 거대한(약 200,000 염기쌍) 플라스미드를 가지고 있다. 이 세균이 식물세포와 접촉하면, T DNA(약 23,000 염기쌍)라고 불리는 단편이 Ti 플라스미드로부터 식물세포의 핵으로 옮겨지고, 형질전환을 하는 동안에 식물의 염색체 중 1개의 임의의 위치에 통합된다. 이와 유사하게 아그로박테리움 라이조지니(Agrobacterium rhizogenes)의 Ri 플라스미드를 이용할 수 있다.Recombinant molecules according to the present invention can be introduced into plant cells by a variety of methods. One of the methods of introducing the isolated DNA of the present invention into cells is a method using Ti plasmid. The soil bacterium Agrobacterium tumefaciens has a huge (about 200,000 base-pair) plasmid called Ti plasmid. When the bacteria come into contact with plant cells, fragments called T DNA (about 23,000 base pairs) are transferred from the Ti plasmid to the nucleus of the plant cells and integrated at any one of the chromosomes of the plant during transformation. Similarly, Ri plasmids of Agrobacterium rhizogenes can be used.

분리된 DNA를 식물 세포에 도입하는 다른 방법은 바이오리스틱스 (Biolistics)이다. 바이오리스틱스 (biological ballistics) 방법은 입자 충격(Particle bombardment)법이라고도 불리우는 것으로, 외래 유전자로 덥 씌워진 또는 내부에 포함하고 있는 작은 금속 입자를 식물에 쏨으로써 원하는 유전자를 식물세포 내로 도입하고 그 결과 식물의 형질전환을 이루고자 하는 방법이다. 바이오리스틱스 방법은 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법이 기능을 하지 못하는 많은 식물체들, 특히 단자엽 식물들을 형질 전환시키는데 이용될 수 있다.Another method of introducing isolated DNA into plant cells is biolithics. Biological ballistics, also called particle bombardment, is a method of introducing small genes covered with or contained in foreign genes into plants to introduce the desired genes into plant cells, resulting in plant It is a way to achieve transformation. Biolithographic methods can be used to transform many plants, especially monocotyledonous plants, for which Agrobacterium transformation does not function.

또 하나의 DNA 도입방법은 미세 주입법(microinjection)이다. 미세주입방법은 현미경에 부착된 미세 조작기(micromanipulator)를 이용하여 매우 가늘게 뽑은 유리 모세관을 통해 소량의 물질을 세포벽이 제거된 원형질체 형태의 식물 세포의 특정 부위에 주입하는 방법이다.Another DNA introduction method is microinjection. The microinjection method is a method of injecting a small amount of material into a specific portion of the plant cell in the form of a protoplast from which the cell wall is removed through a very thin glass capillary using a micromanipulator attached to a microscope.

또 다른 방법은 리포좀(Liposome)을 이용한 방법이다. 지질(lipid) 용액을 DNA나 RNA의 수용액에 떨어뜨리면 지질 간의 소수결합(hydrophobic interaction)에 의하여 DNA나 RNA 수용액을 소량 함유한 지질 소포(lipid vesicle(liposome))가 형성된다. DNA 또는 RNA를 함유한 리포좀은 화학적 성질이 원형질막과 유사하기 때문에 원형질체와 융합을 이룰 있으며 또는 미세 주입법에 의하여 식물세포의 특정 내부기관(예, 액포)으로 주입될 수 있다.Another method is using liposomes. When the lipid solution is dropped into an aqueous solution of DNA or RNA, a lipid vesicle (liposome) containing a small amount of the DNA or RNA solution is formed by hydrophobic interaction between lipids. Liposomes containing DNA or RNA are fused with protoplasts because their chemical properties are similar to those of the plasma membrane, or they can be injected into specific internal organs (eg vacuoles) of plant cells by microinjection.

본 발명의 분리된 DNA를 식물 세포내로 도입하는 다른 방법은 전기충격법 (electroporation)과 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 이용법이다. 전기충격법은 도입하고자 하는 외래 DNA가 녹아있는 수용성 완충액에 식물 원형질체를 넣고 강하고 짧은 전류를 적용하여 순간적으로 DNA가 원형질체 내로 도입되도록 함으로써 식물 염색체 내에 외래 유전자를 도입시킨다. 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))은 매우 강한 흡수력을 가지고 있으며 고농도 PEG 용액에 세포가 위치되면 세포막의 변성을 가져와 순간적으로 PEG 수용액에 첨가되어 있는 DNA가 세포 내로 전달된다.Another method of introducing the isolated DNA of the present invention into plant cells is by electroporation and the use of polyethylene glycol. The electroshock method introduces a foreign gene into a plant chromosome by inserting a plant protoplast into an aqueous buffer in which foreign DNA to be introduced is dissolved, and applying a strong and short current to instantaneously introduce the DNA into the protoplast. Polyethylene glycol (PEG) has a very strong absorption capacity, and when cells are placed in a high concentration PEG solution, the cell membrane is denatured, and the DNA added to the PEG aqueous solution is transferred into the cell.

기내 재분화 배지에 항생제 등의 선별표지를 첨가하여 외래 유전자 도입 후 형질 전환된 세포를 선별해 낸 후 형질전환된 원형질체를 식물체로 재분화시킨다. 이러한 재분화 방법은 식물 종에 따라 달리 채용할 수 있는데, Evans et al., Handbook of Plant Cell, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983) 등의 문헌에 설명되어 있는 공지의 방법을 이용할 수 있다.Selective markers, such as antibiotics, are added to the in vitro regeneration medium to select transformed cells after introduction of foreign genes, and then the transformed protoplasts are regenerated into plants. This regeneration method can be employed differently depending on the plant species, Evans et al., Handbook of Plant Cell, Vol. 1: known methods described in the literature (MacMillan Publishing Co., New York, 1983) and the like can be used.

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 이하의 실시예들은 단지 설명을 위한 것으로 이들 실시예들은 본 발명의 보호범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the following examples are merely illustrative and these examples should not be construed as limiting the protection scope of the present invention.

[실시예] EXAMPLE

본 발명에 의한 B16 균주의 길항물질 생산 능력Antagonist production capacity of B16 strain according to the present invention

본 발명에 의한 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16(Psedomonas fluorescence B16) 및 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Psedomonas fluorescence K2-31)균주의 식물성 병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanaceraum), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 잔토모사스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 등에 대한 길항능력을 테스트하였다. 0.6g의 녹인 아가를 포함하는 50ml의 AB 배지(Agrobacterium minimal medium)를 45℃로 유지하면서 이 AB 배지에 랄스토니아 솔라나세아륨을 밤새 배양한 배양액을 첨가했다. 상기 AB 배지는 배지 1L에 1.0g의 NaH2PO4, 3.0g의 K2HPO4, 0.3g의 MgSO4· 7H2O, 0.15g의 KCl, 1.0g의 NH4Cl, 0.01g의 CaCl2˙2H2O 및 2.5mg의 FeSO4·7H2O을 포함하는 것으로, 글루코오스는 간헐적으로 고압 처리되어(autoclaved) 최종 농도 0.2%로 이 AB 배지에 첨가된다. 상기 배양액이 첨가된 AB 배지가 고형화된 뒤, 균주의 길항물질 생산능력을 시험하기 위해 플레이트에 직접 본 발명의 균주를 스폿팅하였고, 28℃에서 16시간 배양한 뒤에 저지원의 크기를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타나 있다. 본 발명의 균주는 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanaceraum), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)등의 병원균에 대한 길항 능력이 우수한 것으로 나타났다. 또한 본 발명의 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주보다 K2-31 균주가 더 큰 길항력을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.Plant pathogens Ralstonia solanaceraum, Agrobacterium strains of strains Pseedomonas fluorescence B16 and Pseedomonas fluorescence K2-31 according to the present invention Antagonistic ability against Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas campestris, and the like was tested. While maintaining 50 ml of AB medium (Agrobacterium minimal medium) containing 0.6 g of dissolved agar at 45 ° C., the culture medium in which Ralstonia solanaceium was incubated overnight was added to this AB medium. The AB medium contained 1.0 g of NaH 2 PO 4 , 3.0 g of K 2 HPO 4 , 0.3 g of MgSO 4 · 7H 2 O, 0.15 g of KCl, 1.0 g of NH 4 Cl, and 0.01 g of CaCl 2 ˙2H in 1 L of medium. Containing 2 O and 2.5 mg of FeSO 4 .7H 2 O, glucose is autoclaved intermittently and added to this AB medium at a final concentration of 0.2%. After the AB medium to which the culture solution was added was solidified, the strain of the present invention was spotted directly on the plate to test the antagonist production capacity of the strain, and the size of the low support was measured after 16 hours of incubation at 28 ° C. The results are shown in Table 1 below. The strain of the present invention was shown to have excellent antagonistic ability against pathogens such as Ralstonia solanaceraum and Agrobacterium tumefaciens. In addition, it was confirmed that the K2-31 strain has a greater antagonistic activity than the Pseudomonas florences B16 strain of the present invention.

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 작물근권 정착능력 테스트Crop rooting ability test of Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 다양한 작물에 대한 근권 정착 능력을 시험하였다. 즉, 각각의 작물을 5X108cell/ml의 농도로 현탁한 미생물 현탁액에 2시간 동안 침지한 뒤 공기, 중에서 건조하고 DLF플레이트에서 72시간동안 배양한 후 DLF 방법(double layered-filter paper method: Bae,Y.D., H.K.Kim, and C.S.Park.1990. An improved method for rapid screening and analysis of root colonizing biocontrol agents. Kor.J. Plant Pathol. 6: 325-332)을 이용하여 각각의 균수를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타나고 있다. 하기 표 2에 나타나는 바와 같이 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주는 오이, 토마토, 고추, 시금치 같은 다양한 채소작물의 근권에 잘 정착할 뿐만 아니라 보리, 밀, 벼 같은 작물의 근권에도 잘 정착하였다.The rhizosphere fixation ability of various crops of Pseudomonas floreuss B16 strain according to the present invention was tested. That is, each crop was immersed in a suspension of microorganisms suspended at a concentration of 5 × 10 8 cells / ml for 2 hours, dried in air, and incubated for 72 hours on a DLF plate, followed by a DLF method (double layered-filter paper method: Bae , YD, HKKim, and CSPark. 1990. An improved method for rapid screening and analysis of root colonizing biocontrol agents.Kor. J. Plant Pathol. 6: 325-332). The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, Pseudomonas florences B16 strain not only settles well in the roots of various vegetable crops such as cucumbers, tomatoes, peppers, and spinach, but also in the roots of crops such as barley, wheat, and rice.

상기와 같이 균주가 일단 작물의 근권에 정착하게 되면, 정착한 균주는 뿌리가 활력을 갖고 있는 동안 지속적으로 증식하며 새로운 뿌리로 이동하여 정착하는 능력을 가지고 있다. 이를 확인하기 위해 오이 종자를 5X108cell/ml의 농도의 미생물 현탁액에 침지한 뒤 공기 중에서 건조하고 DLF플레이트에서 72시간 동안 배양한 후 각각의 균수를 측정하였다. 하기 표 3에서는 8cm 길이의 오이 뿌리에 B16균주를 포함한 슈도모나스 균주가 콜로니를 형성한 뒤, 뿌리의 각 위치에서의 균주의 밀도를 나타내고 있으며, 하기 표 4에서는 B16균주를 오이 작물에 침지 처리하고 72시간 후에 뿌리의 지상부 1cm 부분에서 균주의 밀도를 나타내고 있다.As described above, once the strain has settled in the root zone of the crop, the settled strain has the ability to continuously proliferate and move to a new root and settle while the root has vitality. In order to confirm this, cucumber seeds were immersed in a microbial suspension of 5X10 8 cell / ml, dried in air, incubated for 72 hours in a DLF plate, and the respective bacterial counts were measured. In Table 3 below, Pseudomonas strain including strain B16 in the roots of 8 cm long form colonies, and shows the density of the strain at each position of the root, and in Table 4 below, the strain B16 was immersed in the cucumber crop. After time, the density of the strain is shown in the 1 cm above ground part of the root.

상기 표 3 및 표 4에서 보듯이 본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16균주는 뿌리의 지상부, 원뿌리 및 곁뿌리에서 우수한 근권 정착 능력을 나타내고 있다.As shown in Table 3 and Table 4, Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention exhibits excellent rooting ability in root, root and side root of the root.

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 작물생장 촉진능력 테스트Crop growth promoting test of Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주를 종자에 처리하거나, 이식하는 작물에 근권 처리하였을 경우 무처리한 경우에 비하여 작물의 생장이 현저하게 촉진된다. 이를 확인하기 위하여 작물의 생장을 촉진시키는 3가지 슈도모나스 균주를 오이 종자에 처리하여(처리농도 108 cfu/ml) 폿트에 심고 15일 후 전전한 유묘의 출현율을 조사하고 30일 후 유묘 생체중을 비교하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 특히 오이, 토마토, 고추의 경우 종자에 처리하였을 때, 유묘의 출현율이 현저하게 향상되었으며 그 이후에도 유묘의 생장이 지속적으로 향상되었음이 확인되었다. 즉, 하기 표 5에서 B16 균주를 처리한 경우 출현율에서 12.1%, 생체 중에서 16.8%의 증가가 나타나고 있다. When Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention is treated to seed or root-wounded to the crop to be transplanted, the growth of the crop is remarkably promoted as compared to the case of no treatment. To confirm this, three Pseudomonas strains promoting crop growth were treated in cucumber seeds (treatment concentration 108 cfu / ml), planted in pots, and the incidence of transferred seedlings after 15 days was examined and seedling live weight was compared after 30 days. . The results are shown in Table 5 below. In particular, cucumber, tomato, and pepper were treated with seeds, the rate of appearance of seedlings was remarkably improved, and the growth of seedlings was continuously improved. That is, when the B16 strain is treated in Table 5, an increase of 12.1% in incidence and 16.8% in vivo is shown.

또한 이식하는 작물의 근권에 B16 균주를 처리한 경우 역시 이식 이후에 작물의 생장이 뚜렷하게 향상된다. 이를 확인하기 위하여 B16 균주 현탁액(108 cfu/ml)에 발아한지 15일된 토마토 유묘의 뿌리를 침지하였다가 폿트에 옮겨 심고 30일 동안 생장시킨 후 비교하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 왼쪽은 B16 야생형(wild type) 균주를 처리한 것이고, 가운데는 생장촉진을 지배하는 유전자를 변형시킨 돌연변이 균주를 접종한 것이며 오른쪽은 무처리한 경우이다. B16 균주를 처리한 경우가 무처리한 경우에 비해 토마토 작물의 생장이 두드러짐을 확인할 수 있다.In addition, when the B16 strain was treated in the root zone of the crop to be transplanted, the growth of the crop was markedly improved after the transplant. To confirm this, roots of tomato seedlings germinated 15 days after germination in B16 strain suspension (108 cfu / ml) were transferred to pots, planted for 30 days, and compared. The results are shown in FIG. In FIG. 2, the left side is treated with a B16 wild type strain, the center is inoculated with a mutant strain modified with a gene that controls growth promotion, and the right side is an untreated case. It can be seen that the growth of tomato crops is more prominent than the case of B16 strain treatment.

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 모잘록병 대한 길항능력 테스트Antagonistic test against Mozalok disease of Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 세균성 시들음병에 대한 길항능력을 확인하기 위하여 오이(Cucumis savita L.), 고추(Capscum annum L.) 및 토마토(Lycopersicon esculentum Mill.)의 종자에 본 발명의 B16 균주의 현탁액(108cell/ml)을 처리하고 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피씨움 울티멈(Pythium ultimum)이 감염된 토양에 파종한 후 모잘록병 발병율을 테스트하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 본 발명의 B16 균주는 상기 식물병원성 곰팡이에 대해 약한 길항력을 가지고 있었지만 이러한 길항력이 작물의 생장촉진 능력과 협력 작용을 함으로써 채소작물의 유묘에 발생하는 모잘록병을 효과적으로 방제하는 결과를 나타내고 있다.In order to confirm the antagonistic ability against bacterial wiltness of Pseudomonas floreuss B16 strain according to the present invention, the seeds of cucumber (Cucumis savita L.), capsicum (Capscum annum L.) and tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Suspensions of B16 strain (10 8 cells / ml) were treated and seeded with Rhizoctonia solani and Pythium ultimum, and then tested for morbidity. The results are shown in Table 6 below. The B16 strain of the present invention had a weak antagonistic ability against the phytopathogenic fungus, but this antagonism has a result of effectively controlling seedling disease occurring in seedlings of vegetable crops by cooperating with the ability to promote growth of crops.

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 토마토의 풋마름병에 대한 길항능력 테스트Antagonistic test against green blight of tomato of Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 항균성 물질은 가지과 작물의 풋마름병에 대하여 강한 억제력을 갖고 있는데, 본 발명의 B16 균주가 갖고 있는 근권 정착능력이 더해지면 토마토의 풋마름병을 효과적으로 방제할 수 있게 된다. 이를 확인하기 위해 이식할 토마토의 뿌리를 본 발명의 B16 균주 현탁액(109 cfu/ml)에 30분간 침지하였다가 폿트에 정식하고, 1주일 후에 풋마름 병원균 현탁액(Ralstonial solancearum 108 cfu/ml) 20ml를 각각의 폿트에 부어 주었다. 풋마름 병원균 현탁액을 처리하고 나서 15일 후에 각각의 발병율을 조사하였다. 그 결과는 도 3에 그래프로 나타내었다. 도 3에서 K2-31균주는 상기한 바와 같이 본 발명의 B16균주에 Omegon Km을 이용하여 Tn 돌연변이를 유발(Tn mutagenesis)시킨 돌연변이주이며 이는 B16균주와 동일한 식물 생장 촉진 능력을 갖고 길항물질 생성력이 강화된 균주이다. 반면, K1-36균주는 같은 돌연변이 유발에 위해 길항력이 상실된 돌연변이주이다. 도 3의 그래프에서 나타나는 바와 같이, 무처리한 토마토에서 약 75%, K1-36균주를 처리한 토마토에서 약 60%의 발병율이 나타나는데 반해, 본 발명의 B16 균주에서는 약 10%의 발병율이 나타나고 K2-31 균주를 처리한 경우 이보다 더 낮은 발병율이 나타난 것으로 판단해볼 때, 본 발명의 형광성 슈도모나스 균주들의 토마토의 세균성 풋마름병에 대한 길항능력은 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.The antimicrobial substance of Pseudomonas florences B16 strain according to the present invention has a strong inhibitory effect against foot blight of eggplant and crops. Will be. B16 strain suspension of the present invention the roots of the tomato to transplant in order to verify this, (10 9 cfu / ml) 30 bungan immersion was formally the pot, and the foot diamond pathogen suspension after one week (Ralstonial solancearum 10 8 cfu / ml ) 20 ml were poured into each pot. The incidence of each was examined 15 days after treatment of the dry skin pathogen suspension. The results are shown graphically in FIG. In FIG. 3, the strain K2-31 is a mutant strain in which Tn mutagenesis is induced by using Omegon Km in the B16 strain of the present invention as described above. Fortified strains. In contrast, strain K1-36 is a mutant that has lost antagonism for the same mutagenesis. As shown in the graph of FIG. 3, the incidence of about 75% in untreated tomatoes and about 60% in tomatoes treated with K1-36 strains, whereas in the B16 strain of the present invention, the incidence of about 10% and K2 When treating the -31 strain was judged to have a lower incidence than this, it was confirmed that the antagonistic ability against the bacterial foot blight of tomato of the fluorescent Pseudomonas strain of the present invention was very excellent.

상기 길항능력은 동일한 실험방법을 사용하여 암면을 배지경(Rockwool medium)으로 하는 수경재배에서도 뚜렷하게 나타났다. 그 결과는 도 4에 사진으로 나타내었다. 도 4에서 각각은 왼쪽부터 차례로 풋마름병에 걸린 토마토, 본 발명의 B16 균주를 처리한 토마토, 본 발명의 K2-31을 처리한 토마토, 건강한 토마토이다. 도 4의 사진에서도 역시 본 발명의 형광성 슈도모나스 균주들의 토마토의 세균성 풋마름병에 대한 길항능력은 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.The antagonistic ability was clearly seen in hydroponic cultivation using rockwool medium as the rock wool using the same experimental method. The result is shown in the photograph in FIG. In Fig. 4, each is a tomato with foot blight from the left, a tomato treated with B16 strain of the present invention, a tomato treated with K2-31 of the present invention, and a healthy tomato. In the photo of Figure 4 it was also confirmed that the antagonistic ability against the bacterial foot blight of tomato of the fluorescent Pseudomonas strain of the present invention was very excellent.

길항물질 생합성에 관계된 DNA의 재조합Recombination of DNA Related to Antagonist Biosynthesis

본 발명에 의한 슈도모나스 플로레슨스 B16의 염색체 DNA를 샘브룩 등의 방법(Sambrook, J.,E.F. fritsch, andd T.Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York, U.S.A.)으로 분리해냈다. 본 발명의 B16균주의 유전자 도서관(genomic library)를 만들기 위해 전체 염색체를 Sau3AⅠ으로 부분적으로 자르고 이 DNA 단편들을 pLAFR3(Tra-, Mob+, RK2 replicon, Tetr: [26] Staskawicz, B., D.Dahlbeck,N.Keen,and C.Napoli.1987. Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of Pseudomonas syringae pv. glycinea.J.Bateriol.169:5789-5794) 플라스미드의 BamHⅠ위치에 라이게이션 (ligation) 하였다. 라이게이션된 DNA 단편을 박테리오파지 λ에 삽입하고 E. coli HB101에 트렌스펙션한(transfection) 후, 상기 과정으로 제조된 pLAFR3 유도체를 트리페어렌탈 메이팅(triparental mating; Fiurski, D.H. and D.R. Helinski.1979. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1684-1652) 방법으로 슈도모나스 플로레슨스 B16균주로 옮겼다. 그 외 다른 기본적인 분자생물학적 기술은 샘 브룩 등의 방법(Sambrook, J.,E.F. fritsch, andd T.Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York, U.S.A.)을 사용하였다. 하기 표 7에서 본 발명에서 사용된 균주 또는 플라스미드의 특징을 나타내었다.The chromosomal DNA of Pseudomonas florences B16 according to the present invention was analyzed by Sambrook et al. (Sambrook, J., EF fritsch, andd T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York, USA). To make a genomic library of the B16 strain of the present invention, the whole chromosome was partially cut into Sau3AI and the DNA fragments were pLAFR3 (Tra-, Mob +, RK2 replicon, Tetr: [26] Staskawicz, B., D. Dahlbeck Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of Pseudomonas syringae pv.glycinea.J.Bateriol.169: 5789-5794) Ligation at the BamH I position of the plasmid ). After ligated DNA fragments were inserted into bacteriophage λ and transfected into E. coli HB101, pLAFR3 derivatives prepared in the above procedure were subjected to trialrental mating (Fiurski, DH and DR Helinski. 1979. Replication. of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1684-1652). Other basic molecular biological techniques are described in Sambrook et al. (Sambrook, J., EF fritsch, andd T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York, USA). Table 7 shows the characteristics of the strain or plasmid used in the present invention.

전이인자 돌연변이유발(Transposon mutagenesis)Transposon mutagenesis

본 발명의 B16 균주의 염색체에서 전이인자(transposon)를 만들어내기 위해 자살 플라스미드(suicide plasmid) pJFF350(Fellay, R., H. Kresch, P.Prentki, and J.Frey.1989. Omegon-Km: A transposable element designed for in vivo insertional muragenesis and cloning of genes in Gram negative bacteria. Gene 76:215-226)이 사용된다. Omegon-Km은 하나의 복제 기점(origin)을 갖고, EcoRⅠ 위치(site)를 갖지 않는 전이 인자이기 때문에, 돌연변이체의 전체 염색체 DNA 1μg에 EcoRⅠ 제한효소를 처리하면 자가 연결(self-ligation)이 일어나고 E.coli DH5α에 형질전환이 일어났다. 카나마이신을 포함하는 LB 배지(Luria-Bertani(LB) medium)상에서의 선택과정(selection)에 의해 플랭킹 DNA(flanking DNA)를 분리해냈다. 이 플랭킹 DNA(flanking DNA)는 HR 프라이머(5’-TGCTTCAATCAATCACCGG- 5')를 사용하여 시퀀싱하였다.Suicide plasmid pJFF350 (Fellay, R., H. Kresch, P. Prentki, and J. Frey. 1989. Omegon-Km: A to produce transposons in the chromosome of strain B16 of the present invention. transposable element designed for in vivo insertional muragenesis and cloning of genes in Gram negative bacteria.Gene 76: 215-226). Omegon-Km is a transfer factor with one origin of replication and no EcoRI site, so self-ligation occurs when the EcoRI restriction enzyme is applied to 1 μg of the chromosomal DNA of the mutant. E. coli DH5α was transformed. The flanking DNA was isolated by selection on LB medium containing kanamycin (Luria-Bertani (LB) medium). This flanking DNA was sequenced using HR primer (5'-TGCTTCAATCAATCACCGG-5 ').

pJWB4 플라스미드는 길항 물질의 생합성에 필수적인 유전자를 모두 포함하는 플라스미드로, 이를 Tn3-gus로 처리하여 돌연변이를 유발했다(Bonas, U., R. e. Stall, and B. J. Staskawicz. 1989, Genetic and Structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Mol. Gen. Genet. 218:127-136). 각 돌연변이체의 Tn3-gus의 삽입부위 및 방향(orientation)은 제한효소처리 분석 및 Tn3-gus의 시퀀싱을 가능하게 하는 Tn3-gus 프라이머(5'-CCGGTCATCTGAGACCATTAAAAGA-3')를 사용한 플라스미드의 직접적인 시퀀싱의 방법으로 유전자 지도화 하였다(도 5A 및 5B). Tn3-gus 부위를 갖고 있는 돌연변이 플라스미드는 각각 접합(conjugation) 및 마커교환(marker-exchange) 방법을 이용하여 B16균주에 도입하였다. 모든 마커 교환은 소던 혼성화 분석법(southern hybridization analysis)에 의해 확인되었다. The pJWB4 plasmid is a plasmid containing all the genes essential for the biosynthesis of antagonists, which were treated with Tn3-gus to induce mutations (Bonas, U., R. e. Stall, and BJ Staskawicz. 1989, Genetic and Structural characterization of the avirulence gene avr Bs3 from Xanthomonas campestris pv.vesicatoria.Mol.Gen.Genet.218: 127-136). The insertion site and orientation of Tn3-gus of each mutant was determined by direct sequencing of the plasmid using Tn3-gus primer (5'-CCGGTCATCTGAGACCATTAAAAGA-3 '), which allows restriction enzyme analysis and sequencing of Tn3-gus. Gene mapping was done by the method (FIGS. 5A and 5B). Mutant plasmids with Tn3-gus sites were introduced into B16 strain using conjugation and marker-exchange methods, respectively. All marker exchanges were confirmed by southern hybridization analysis.

DNA 시퀀싱(sequencing) 및 결과 분석DNA sequencing and results analysis

pJWB1(B16 균주로부터 pLAFR3로 클론된 20.6kb DNA 조각)을 시퀀싱하기 전에 적당한 제한효소로 자르고 pBluescript ⅡSK(+)에 서브클로닝했다. 제 1차 반응에서 통상의 역 프라이머(reverse primer)가 사용됐고, 양 DNA 가닥(strand)을 시퀀싱하기 위해서는 합성 프라이머가 사용되었다. 상기한 바와 같이 전이 인자 Omegon-Km 삽입 부위를 확인하기 위해 사용된 모든 DNA 시퀀싱 반응은 HR 프라이머를 이용하여 진행되었다. 상기 DNA 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Institute)에서 BLAST 프로그램, MEGALING 소프트웨어(DNASTAR, U.S.A.) 및 GENETYX-WIN 소프트웨어(Sofware Development INC., Japan)을 사용하여 분석된 것이다.pJWB1 (20.6 kb DNA fragment cloned into pLAFR3 from B16 strain) was cut with appropriate restriction enzyme and subcloned into pBluescript IISK (+). Conventional reverse primers were used in the first reaction, and synthetic primers were used to sequence both DNA strands. As described above, all DNA sequencing reactions used to identify the transfer factor Omegon-Km insertion site were carried out using HR primers. The DNA sequence was analyzed using the BLAST program, MEGALING software (DNASTAR, U.S.A.) and GENETYX-WIN software (Sofware Development INC., Japan) at the National Center for Biotechnology Institute (NCBI).

길항물질 생산의 확인Confirmation of Antagonist Production

45℃를 유지하면서 0.6g의 녹인 아가를 포함하는 50ml의 AB 배지에 랄스토니아 솔라나세아륨의 밤새 배양한 배양액 500㎕를 첨가했다. 배지를 저어준 후, 컬쳐 플레이트(culture plate)에 붓고 아가(agar)가 고형화된 후에 길항물질 생산을 시험할 균주를 플레이트 표면에 직접 스폿팅(spotting)하여 28℃에서 16시간 배양함으로써 저지원(inhibition zone)의 크기를 확인했다. 500 µl of overnight culture of Ralstonia solanacerium was added to 50 ml of AB medium containing 0.6 g of dissolved agar while maintaining 45 ° C. After stirring the medium, poured into a culture plate, and after the agar solidified, the strain to be tested for antagonist production was spotted directly on the surface of the plate and incubated for 16 hours at 28 ° C. The size of the inhibition zone was checked.

돌연변이체의 분리 및 동정Isolation and Identification of Mutants

본 발명에 의한 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16을 Omegon Km으로 돌연변이 유발시킨 후, 200개의 원영양체 균주(prototrophic colonies)를 분리하고 AB 아가 배지 상에서 랄스토니아 솔라나세아륨에 대한 길항 여부를 시험하였다. 6개의 길항력이 상실된 돌연변이체(K4, K5, K6, K7, K14 및 K18; 표 7) 및 하나의 길항력이 향상된 돌연변이체(K2-31)가 분리되었다. Omegon-Km의 삽입 부위를 결정하기 위해 트랜스포존의 플랭킹 DNA부위를 클로닝하고 시퀀싱하였다. 표 8에 그 결과를 나타내었다. 제한된 DNA 서열 데이터를 이용한 BLAST 조사 분석으로부터, 돌연변이체 K4 및 K7은 에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix)의 시스타티오닌 감마 라이에이즈와 상동인 유전자에서 돌연변이를 나타내었고, K5, K6 및 K18은 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)의 피루브산 포름산염-라이에이즈 활성화 효소에 상동인 유전자에 삽입돌연변이를 나타냈으며, K14는 미지의 유전자에서 돌연변이를 나타냈고, K2-31은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 질산염/아질산염 조절 단백질과 상동(36%일치, 59%양성)인 유전자에 돌연변이를 나타내었음을 확인하였다.After mutating strain Pseudomonas florences B16 according to the present invention to Omegon Km, 200 prototrophic colonies were isolated and tested for antagonism against Ralstonia solanacerium on AB agar medium. . Six antagonistic mutants (K4, K5, K6, K7, K14 and K18; Table 7) and one antagonistic mutant (K2-31) were isolated. The flanking DNA region of the transposon was cloned and sequenced to determine the insertion site of Omegon-Km. Table 8 shows the result. From BLAST survey analysis using limited DNA sequence data, mutants K4 and K7 showed mutations in genes homologous to cystathionine gamma lyase of Aeropyrum pernix, K5, K6 and K18 Mutated to a gene homologous to the pyruvate formate-lyase activating enzyme of Thermotoga maritima, K14 mutated to an unknown gene, and K2-31 to Pseudomonas aeruginosa. Mutation was confirmed in a gene homologous (36% consensus, 59% positive) to the nitrate / nitrite regulatory protein.

길항물질 생합성에 관계하는 유전자를 포함하는 코스미드 클론의 분리Isolation of Cosmid Clones Containing Genes Related to Antagonist Biosynthesis

길항물질의 생합성에 관계하는 유전자를 포함하는 코스미드 클론의 분리해내기 위해 3.2-kb의 pOK5(K5 돌연변이주로부터 나온 7.0-kb의 자가 연결된(self-ligated) EcoRⅠ클론, 표 7)의 HindⅢ 처리하여 얻어진 단편이 콜로니 혼성화의 프로브(probe)로 사용되었다. 이 때 두개의 부분적으로 중복되는 클론이 분리되었는 바, pJWB1 및 pB03이다. 이 두 클론 중 어느 것이 길항물질의 생합성에 필요한 필수적인 유전자인지를 확인하기 위해 각각을 길항력이 없는 숙주인 슈도모나스 플로레슨스 1855.344에 도입하였다. 랄스토니아 솔라나세아륨에 대한 상기 두 경우의 길항력을 테스트하였을 때, pJWB1이 도입된 경우만 상기 1855.344 균주가 길항력을 나타냈고, 이는 pJWB1이 길항물질의 생합성에 필수적인 유전자를 포함한다는 것을 입증하는 것이다. HindIII treatment of 3.2-kb pOK5 (7.0-kb self-ligated EcoR1 clone from K5 mutant, Table 7) to isolate cosmid clones containing genes involved in the biosynthesis of antagonists The fragment obtained was used as a probe for colony hybridization. At this time, two partially overlapping clones were isolated, pJWB1 and pB03. To identify which of these two clones is an essential gene for the biosynthesis of antagonists, each was introduced into Pseudomonas florences 1855.344, an antagonistic host. When testing the antagonism of these two cases against Ralstonia solanacerium, the 1855.344 strain showed antagonism only when pJWB1 was introduced, indicating that pJWB1 contains genes essential for biosynthesis of antagonists. To prove.

상보화(complementation) 및 DNA 서열 분석Complementation and DNA Sequence Analysis

pB03 및 pJWB1을 돌연변이체 K4, K5, K6, K7, K14 및 K18에 도입하였을 때, 길항물질 생성력이 회복되었다. 즉, pB03은 JWB 100, JWB 118 및 JWB 354는 상보화하고 JWB 388을 상보화하지 않은 반면, pJWB1은 JWB 100, JWB 118, JWB 354 및 JWB 388를 상보화하였다. 도 5A 및 5B의 유전자 지도는 pJWB1 및 pB03이 16.9-kb이상의 부분이 중복되고, pJWB1의 오른쪽 말단의 약 3.5-kb 부분이 pB03에 존재하지 않는 것을 보여주는데 이는 3.5-kb 부분이 항생물질 생산에 필수적인 부분임을 제시하는 것이다. 따라서 상기 3.5-kb 부분을 포함하는 9.0-kb의 PstⅠ-EcoRⅠ을 시퀀싱하기 위해 pBluescript Ⅱ SK(+)에 서브클로닝하였다. 이 부분에 상기 Orf 1 내지 4(도 5B)가 포함되며 분자량은 차례대로 42.4, 55.9, 26.7 및 15.6 kDa이다.When pB03 and pJWB1 were introduced into the mutants K4, K5, K6, K7, K14 and K18, antagonist production was restored. That is, pB03 complemented JWB 100, JWB 118 and JWB 354 and did not complement JWB 388, whereas pJWB1 complemented JWB 100, JWB 118, JWB 354 and JWB 388. The genetic maps of FIGS. 5A and 5B show that pJWB1 and pB03 overlap more than 16.9-kb and that about 3.5-kb of the right end of pJWB1 is not present in pB03, which is necessary for antibiotic production. It is to suggest that part. Therefore, subcloning into pBluescript II SK (+) for sequencing 9.0-kb of PstI-EcoRI comprising the 3.5-kb portion. This section contains the Orf 1-4 (FIG. 5B) and molecular weights in turn are 42.4, 55.9, 26.7 and 15.6 kDa.

상기 ORF들로부터 나온 생산물들은 길항 물질의 합성에 포함되는 것으로 알려진 단백질들과 어떠한 유사성도 나타내지 않는다. ORF 1 및 ORF 2의 서열 1~4319)은 네 부분으로 구성되는데, 각각은 시스타티오닌 감마-라이에이즈 유사 단백질(cystathionine gamma lyase-like protein; 176~1321), 피루브산 포름산염-라이에이즈 활성화 효소 유사 단백질(pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein; 1318~2802)과 상당한 유사성을 나타냈고, ORF 4가 전사조절 인자 유사 단백질(transcription regulator-like protein; 2903~3622)을 코딩하는 유전자와 유사했다. 반면에 ORF 3은 데이타베이스(unknown gene; 3823~4254) 상의 어떤 알려진 단백질과도 유사성이 없었다. The products from the ORFs show no similarity to the proteins known to be involved in the synthesis of antagonists. SEQ ID NOs 1 to 4319 of ORF 1 and ORF 2 are composed of four parts, each of cystathionine gamma lyase-like protein (176-1132) and pyruvate formate-lyase activating enzyme. It showed significant similarity with the pyruvate formate-lyase activating enzyme-like protein (1318-2280), and ORF 4 was similar to the gene encoding transcription regulator-like protein (2903-3622). . ORF 3, on the other hand, had no similarity to any known protein on the unknown genes (3823-4254).

상기 서열 분석으로부터 pB03 플라스미드는 orf 4의 정지 코돈으로부터 72bp가 상실된 절단된 ORF 4를 갖는 것을 밝혀냈는데 이는 본 발명의 B16균주의 길항물질 생산에 전사 조절 유전자가 중요한 역할을 하는 것을 제시하는 것이다. 이를 증명하기 위해 몇 개의 클론을 구성하였다(도 5A). ORF 1 내지 4를 포함하는 4.3-kb의 NarⅠ-SalⅠ단편을 pLAFR3에 서브클로닝하여 pJWB40을 구성했다. 또한 pJWB40에서 455-bp의 PshAⅠ- NarⅠ단편을 제거하여 ORF 1 내지 3을 포함하는 pJWB42를 만들었다. 748-bp의 pJWB40의 NurⅠ-NarⅠ단편을 pLAFR3에 서브클로닝하여 pJWB44를 구성했는데, 이는 ORF 4를 포함한다. 그리고 나서 이들 플라스미드를 몇몇의 길항력을 상실한 돌연변이 균주에 도입하고 트랜스접합개체(transconjugants)들에 대해 길항력을 시험하였다. pJWB40은 모든 돌연변이체에서 길항물질 생산 능력을 회복시켰고, pJWB42는 JWB388을 제외한 JWB100, JWB118 및 JWB354에서 길항물질 생산능력을 회복시켰으며, pJWB44는 단지 JWB388에서만 길항물질 생산 능력을 회복시켰다. 또한 JWB45 및 JWB108 돌연변이체는 본래의 길항력을 유지하였다(도 5B). 이것은 ORF 1의 상류(upstream) 및 ORF 4의 하류(downstream)는 길항물질의 생산에 중요하지 않다는 것을 의미한다. 또한 pJWB40이 이형숙주(heterogous host)인 슈도모나스 플로레슨스 1855.344에 도입되었을 때, 그 트랜스접합개체는 길항력을 나타내었다(도 5A). 결론적으로 B16 균주의 길항물질 생합성에 필수적인 모든 유전자는 4.3-kb의 NarⅠ-SalⅠ단편내에 있는 것이다.The sequencing analysis revealed that the pB03 plasmid had a truncated ORF 4 which lost 72 bp from the stop codon of orf 4, suggesting that the transcriptional regulator gene plays an important role in the production of antagonists of the B16 strain of the present invention. Several clones were constructed to demonstrate this (FIG. 5A). PJWB40 was constructed by subcloning the 4.3-kb NarI-SalI fragments containing ORFs 1-4 into pLAFR3. In addition, pJWB42 including ORF 1 to 3 was removed by removing the 455-bp PshAI-NarI fragment from pJWB40. NurI-NarI fragment of pJWB40 of 748-bp was subcloned into pLAFR3 to construct pJWB44, which includes ORF 4. These plasmids were then introduced into several antagonistic mutant strains and tested for antagonism against transconjugants. pJWB40 restored antagonist production in all mutants, pJWB42 restored antagonist production in JWB100, JWB118 and JWB354 except JWB388, and pJWB44 restored antagonist production only in JWB388. JWB45 and JWB108 mutants also retained their original antagonism (FIG. 5B). This means that upstream of ORF 1 and downstream of ORF 4 are not critical for the production of antagonists. Also, when pJWB40 was introduced into Pseudomonas florences 1855.344, a heterogous host, the transconjugate exhibited antagonism (FIG. 5A). In conclusion, all genes essential for antagonist biosynthesis of the B16 strain are in the NarI-SalI fragment of 4.3-kb.

길항물질 생합성에 포함된 유전자들의 발현Expression of genes involved in antagonist biosynthesis

본 발명의 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16균주의 orf1-orf4 의 발현을 확인하기 위해, 야생형의 B16 균주를 포함하는 모든 전사 단위들의 발현 수준을 β-글루쿠로니다제 효소 방법(β-glucuronidase enzyme assay: Jefferson, R.A., T.A. Kavanagh, and M.W.Beven.1987.GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitivs and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J.6:3901-3907)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, AB 배지에서 B16 균주를 배양하여 원심분리하고 GUS 추출 완충액에 재현탁하고 VCX-400 소니케이터(Sonics&Materials Inc., CT, U.S.A)를 사용하여 라이시스(lysis) 시킨다. 기질로 4-메틸엄벨리페릴 글루쿠로나이드(4-methylumbelliferyl glucuronide)를 사용한 β-글루쿠로니다제 효소 방법을 상기 추출물에 적용한다. TKO100(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, U.S.A)를 사용하여 365-nm 여기(excitation) 및 460-nm 방출(emission)에서의 형광을 측정하였다. β-글루쿠로니다제 효소 한 단위는 분당 한 균주에서 1nmol의 4-메틸엄벨리페릴 글루쿠로나이드를 방출하는 것으로 정의하였다. 표 9에 그 결과를 나타내었다. 모든 ORF는 LB 배지에서 보다 AB 배지에서 더 잘 발현되었는데, 주어진 환경에서 orf1, orf2 및 orf4의 발현이 매우 낮은 반면, orf3의 발현 수준은 매우 높았다. 반대 방향으로 삽입이 된 균주는 동일한 배지에서 어떠한 검출될만한 β-글루쿠로니다제 활성을 나타내지 않았다. 결국 하기 표 9와 같은 결과는 모든 슈도모나스 플로레슨스 B16으로부터 나온 네 개의 ORF들이 정지기 이후의 후기 성장 단계에서 발현됨을 나타낸다.In order to confirm the expression of orf1-orf4 of the strain Pseudomonas florences B16 strain of the present invention, the expression level of all transcription units including the wild-type B16 strain was determined by the β-glucuronidase enzyme assay (β-glucuronidase enzyme assay). : Jefferson, RA, TA Kavanagh, and MWBeven.1987. GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitivs and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.6: 3901-3907). In other words, B16 strains were cultured in AB medium, centrifuged, resuspended in GUS extraction buffer, and lysed using VCX-400 SonyCator (Sonics & Materials Inc., CT, U.S.A). The β-glucuronidase enzyme method using 4-methylumbelliferyl glucuronide as a substrate is applied to the extract. Fluorescence at 365-nm excitation and 460-nm emission was measured using TKO100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, U.S.A.). One unit of β-glucuronidase enzyme was defined as releasing 1 nmol of 4-methylumbelliferyl glucuronide in one strain per minute. The results are shown in Table 9. All ORFs were better expressed in AB media than in LB media, with very low expression of orf1, orf2 and orf4 in a given environment, while very high expression levels of orf3. Strains inserted in the opposite direction did not show any detectable β-glucuronidase activity in the same medium. Eventually, the results as shown in Table 9 below show that four ORFs from all Pseudomonas florences B16 are expressed in the late growth stage after the stop phase.

길항력을 상실한 돌연변이체의 근권정착 능력Root-settlement ability of mutant that lost antagonism

길항력을 상실한 돌연변이체가 식물의 근권에 콜로니를 형성할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 오이 뿌리에서의 균주의 밀도를 DLF 방법으로 측정하였다. 그 결과 1cm의 뿌리 조각에 정착한 균주 B16, JWB100, JWB118, JWB354 및 JWB388의 밀도는 각각 2.6X103, 2.0X103, 3.4X103, 2.6X103 및 3.7X103 cfu/1cm-root tip으로 나타났으며, 이는 길항물질에 관련된 유전자에서의 돌연변이 유발이 B16 균주의 식물근권 정착 능력에 영향을 주지 않음을 보여주는 것이다.The density of strains in cucumber roots was measured by the DLF method to determine whether mutants that lost antagonism could form colonies in the root zone of the plant. As a result, the densities of strains B16, JWB100, JWB118, JWB354 and JWB388 settled in 1 cm root fragments were 2.6X10 3 , 2.0X10 3 , 3.4X10 3 , 2.6X10 3 and 3.7X10 3 cfu / 1cm-root tip, respectively. This suggests that mutagenesis in genes related to antagonists does not affect the plant rooting ability of the B16 strain.

본 발명은 상기에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 균주가 각종 작물의 근권에 정착하여 작물 생장을 촉진하며 유묘기의 병 발생을 억제하여 작물의 수량을 현저히 증가시킬 수 있다. 또한 본 균주는 토마토, 고추, 파프리카 등에 많이 발생하는 식물의 세균성 시들음병을 효과적으로 억제하며, 특히 집약재배가 이루어지는 토마토, 파프리카의 온실 수경재배에서 심각한 손실을 끼치는 세균성 풋마름병을 방제함과 동시에 생육을 촉진하는 효과를 제공한다. As the present invention is confirmed above, the strain of the present invention can be settled in the root zone of various crops to promote crop growth and inhibit the occurrence of seedlings, thereby significantly increasing the number of crops. In addition, the strain effectively suppresses bacterial wilting diseases of plants that occur frequently in tomatoes, peppers, and paprika, and promotes growth while simultaneously controlling bacterial foot blight, which causes serious losses in greenhouse hydroponic cultivation of intensively grown tomatoes and paprika. To provide the effect.

도 1은 본 발명에 의한 B16 균주의 생장 곡선 그래프이고,1 is a growth curve graph of the B16 strain according to the present invention,

도 2는 본 발명에 의한 B16 및 K2-31균주에 의한 토마토의 병원성 풋마름병의 억제효과를 비교한 사진이며,Figure 2 is a photograph comparing the inhibitory effect of pathogenic foot blight of tomato by B16 and K2-31 strain according to the present invention,

도 3은 무처리시, B16, K2-31, K1-36 처리시의 토마토의 풋마름병 발병율을 비교한 그래프이고,3 is a graph comparing the incidence of green blight of tomato at the time of no treatment, B16, K2-31, K1-36 treatment,

도 4는 풋마름병에 걸린 토마토, B16 처리한 토마토, K2-31 처리한 토마토 및 건강한 토마토를 비교한 사진이며,4 is a photograph comparing the tomato with foot blight, tomato treated with B16, tomato treated with K2-31 and healthy tomatoes,

도 5A는 이형 숙주 슈도모나스 플로레슨스 1855.344에서 길항력을 나타내는 코스미드 및 서브클론의 제한효소 처리 지도이고,5A is a restriction enzyme treatment map of cosmids and subclones showing antagonism in heterologous host Pseudomonas florences 1855.344,

도 5B는 pJWB40에 클론된 슈도모나스 플로레슨스 B16 균주의 길항물질 생합성 유전자의 구성 및 제한 효소 처리 지도이다.5B is a map of the construction and restriction enzyme treatment of antagonist biosynthesis genes of Pseudomonas florences B16 strain cloned into pJWB40.

<110> PARK, CHANG SEUK HWANG, IN GYU <120> Pseudomonas flourescens B16 and Method of enhancement of plant growth and Control of the bacterial wilt <130> CSPIGH <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4319 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens B16 <400> 1 tcgaccggac gccagagaga ttgcctctgg attttcactg gaaatggaat ttagaagatg 60 gataacgttc agagtagggt cttcgaatat cgttttttcg agtacgctgg gcaatctcgc 120 ttctccataa aaagcaacga gccattgaag gctcgttgct catgattaac atctgttacg 180 caggtttaag tgcacttttt tgattggcca tattttccat ggccacaaat gcctgaagca 240 gatcctcttt aagatcctca agggcctcta aaccaaaaca caatcgtacc aacccctttt 300 caatccccat atccgctttt tcctgctcag tcatcgaggc atggcttcca ctaaagggtt 360 gcgcaaccat tgacgtgaca caggccattc ccgtacccgt tccaaaccat ttgagggagc 420 tggtgaaggt tttgtaaaag gggaccagat cgggccgaat atcaacaaac acaatgccac 480 cgtagccggt caattgttta ccatcgactc gtggataata tacatgctca ataaagggca 540 gttcccgtag atagttgagc atgctggagg ttgtgttgct gtgtttctcc atgcgcaggt 600 taaatgtctg catgcttctg cggagcagcc atgcgctatt aggcgctaat attgagcctg 660 agtaaaagcg gccttcgagg aggcgcgtat aaatcatttc attgttgacg agtaccaggc 720 cgcccatgac atcgctatgc ccggagaaat acttcgttgc gctgtacaga gaaatatccg 780 cgccgaagtt cagaggcttt tgaaatatcg gagtggccca cgtgttgtca acgaccacca 840 gagcgtgtgg gttgttttgc ttaaccgcct tgctgaccgc atgaatatca atgtctttca 900 gaaagggatt ggtcggtgtt tcgaaaatga ccatgtccac gtccgacggc aactctttca 960 atccactttc cgtagtgaga tccagaatcg tcagtttcgc accgatacgt gccgcatatc 1020 gctgaaacag cttataagaa cagccataga tatatttgtt gatcaccagc gacccaccgg 1080 gtttcagcag ctccagcacc atgtagatgg cactcattcc ggtgctgtag gccaaggcgt 1140 attcgcttcc ttccagtgca gcgacaacct gttccagctc agtcacattg ggattggctt 1200 ttctcgagta gaagaaggcc gagtcagcgc taaaagcgct gcactgataa ataggcgtca 1260 cggatggatg ggcttctcgg tcatcgaccc tgatatggag aatttcagta gacacattca 1320 tgatttgctc accagtttga taacctgctc atacatgttc tgcttgccct catacccaat 1380 ggtcggcgtg atgtcgtttt gcgaaatacc aatctcttca atcgactcgg ttgggaagtg 1440 agccctgtcg aatacttcat gaagatttga gttcaccccc ttgggaagcc agacttcagg 1500 gcctgattca tcaattcgtg ccttggcaat aatgaatcga tagctttcat acggccgcaa 1560 tgtcagtgat ttccaatcac tgttgagccc gtcggtatag ttgcgccgca ggtagacggt 1620 ctgttcaaag tcttcagtat tcagtacttg ggcgtgcagc gatacgatat ccccatgcca 1680 ctcgaacttt cgcttctcgt aagaggtcaa tgcagcctct cgcagttcaa caggcgtgtt 1740 cgctttgtgt tcgcccagta acttgaagtg tgcgtcgtgc ccacaccggg tgcagcaacc 1800 gttgctatcc aatccgatca gttcagcatt caaaccgtag cgggtaacga gtagagcgtt 1860 acaattattg cagttggtat tggtgccctc tacatcattt acgttaccca gataaacatg 1920 ctcaaccccc atgctccggg caatgtcccg ggccttcagg agtctatcca cgggcgtcct 1980 gatgctatta ctcattttat aatcagggtg aaaccttaca aagtggagcg gtacattcgg 2040 gcccagttca tccagcaccc actggctaat tttcctggcg gtatcctcat cgtcactgat 2100 atcggtaacc atcaaggtgc tgacttcaac atatttacca gcatcgtata ctttcttgat 2160 gccagccaga acgggctcta cccagcctgt tgtgactttt cgatagtatt cgggggagat 2220 ggattttagc gaaatcgaga atatgtcgat gacgggcaat agttcgtcaa tggcttcttc 2280 actgataaaa aaagctgatt tatataaatt gattaagccc gcttcctttg ccagctttgc 2340 cgtatcgagg atgaattcat gccagacaac agggtcgtta tacgtccagg agataacgcg 2400 tataccatgc ttcaaggcag tttctacaac ctgttcaggc gtatagtagt aaacatcttt 2460 gtctgtcaca tacttggcct gagaggtctt ccaattgtgg cagtagccgc agttaagcat 2520 gcagccgata ttgcctaggg aaaggattcg ctctccggga gcaaagtgga ataccgcctc 2580 ggtttcgatg gtctcttcgg tgctgtgaac gcctttgcca taattcaatg taactaaccg 2640 gccgcctctg tttccgcgca ccttgcaaaa acctacttta ccctcctgaa tgacacagtt 2700 tcggggagaa agatgacact ttacaacgcc gttcgggagt atttcttcca actttgcagg 2760 cgtgctttcc aaggtccagt ttttattttt tgtagtgtcc atctctcact cctcatttca 2820 cggaagttgc tgtcaatatc atcggtttaa atagtcgagg cgaaacaatc ccgccgccac 2880 agtggcagca atcccctagt agttattgat aggcggaaga aacgctggtc aatccataat 2940 tcttaagtga aaaacgcctg gcgtttatat tcatgaatgg ctgtataaga gggcctatga 3000 ccaacaagaa tgcaatggtt cccataccga agggcccgcc tagaagccat ccggttgaaa 3060 agatgccaat ttcaattatc attttggctt tggtgaatga ccacgcccat ttggacacca 3120 tggtaagcac cacaaggtcc atgattctga taccaatacc gctcatgata atcagtgcag 3180 acgaataagc acacagcacc agacccatcg ccaatatcgt gtactcattc actctgacaa 3240 tcaaatactc tccaagcccc agcacggacc agaggtcaat caacagacct gtaagtgtgg 3300 ttgtaacaaa tgggcttatc ggaggatatt tcttgttcca gagcatccac cacagcagaa 3360 agaatagaga aacgataccc gaacaaacgc ccattccgag catgagtatt ttatttatcg 3420 agatgatcag gacatctaag gggtcagtcc ccagttgact gactatgaaa aacttggccc 3480 ccaccgagaa aagggcgacg ccagccagat acataaaaat ctgatccatc ttgaaatcac 3540 gaaaacttag gacttgcgtt ccaatataat tcgcgaatga tggataggat tttttttcac 3600 actttatttt ttcatcttcc atacgaacac catccctgga ggagaatatt ttattatgca 3660 gtgcgtaacg ctaaggattc ggagctattg attacccggg ttcttgttag gctttaccgg 3720 gctgcaaata gactagcact ctgctttatt ttggtgcatt attttttaat gaaaaccggg 3780 tgcttttcat taaaatttat actttttgct gtgggagctt acatggaccg tatagacatc 3840 aaaatcttgg ggaaggtgca ggactttggt cgcatttcca tcacggagct gtccaagcac 3900 gcaggtcttt ctattcccgc caccactgat cggttgcgaa agctcgaaga ttctggggtc 3960 atcaagggat atagcgctca gttagatcca accaaactag ggttcggcat atctgctgtc 4020 gtcggcatga ccaccctcaa gcctgcgaaa tccaaattga tagcgacgct caacgacata 4080 cccgaagtcg ttgagtgcct gcacgtcacg ggtaacgact cctacctgat caggatctat 4140 gccaggtcaa tggccgatat cgaaaatatc attgcgaaga tcaacgcgta cggtgagaca 4200 cgtacaagca ttgtcttgtc tgtccccatc gagagaagaa agcttgtccc ttgagcctgt 4260 acatagaaca gtcagctgtc agctatttca agggtgatca ttttgtttgc ccggaacgg 4319 <210> 2 <211> 1295 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens B16 <400> 2 Met Asn Val Ser Thr Glu Ile Leu His Ile Arg Val Asp Asp Arg Glu 1 5 10 15 Ala His Pro Ser Val Thr Pro Ile Tyr Gln Cys Ser Ala Phe Ser Ala 20 25 30 Asp Ser Ala Phe Phe Tyr Ser Arg Lys Ala Asn Pro Asn Val Thr Glu 35 40 45 Leu Glu Gln Val Val Ala Ala Leu Glu Gly Ser Glu Tyr Ala Leu Ala 50 55 60 Tyr Ser Thr Gly Met Ser Ala Ile Tyr Met Val Leu Glu Leu Leu Lys 65 70 75 80 Pro Gly Gly Ser Leu Val Ile Asn Lys Tyr Ile Tyr Gly Cys Ser Tyr 85 90 95 Lys Leu Phe Gln Arg Tyr Ala Ala Arg Ile Gly Ala Lys Leu Thr Ile 100 105 110 Leu Asp Leu Thr Thr Glu Ser Gly Leu Lys Glu Leu Pro Ser Asp Val 115 120 125 Asp Met Val Ile Phe Glu Thr Pro Thr Asn Pro Phe Leu Lys Asp Ile 130 135 140 Asp Ile His Ala Val Ser Lys Ala Val Lys Gln Asn Asn Pro His Ala 145 150 155 160 Leu Val Val Val Asp Asn Thr Trp Ala Thr Pro Ile Phe Gln Lys Pro 165 170 175 Leu Asn Phe Gly Ala Asp Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Phe 180 185 190 Ser Gly His Ser Asp Val Met Gly Gly Leu Val Leu Val Asn Asn Glu 195 200 205 Met Ile Tyr Thr Arg Leu Leu Glu Gly Arg Phe Tyr Ser Gly Ser Ile 210 215 220 Leu Ala Pro Asn Ser Ala Trp Leu Leu Arg Arg Ser Met Gln Thr Phe 225 230 235 240 Asn Leu Arg Met Glu Lys His Ser Asn Thr Thr Ser Ser Met Leu Asn 245 250 255 Tyr Leu Arg Glu Leu Pro Phe Ile Glu His Val Tyr Tyr Pro Arg Val 260 265 270 Asp Gly Lys Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gly Ile Val Phe Val Asp Ile 275 280 285 Arg Pro Asp Leu Val Pro Phe Tyr Lys Thr Phe Thr Ser Ser Leu Lys 290 295 300 Trp Phe Gly Thr Gly Thr Gly Met Ala Cys Val Thr Ser Met Val Ala 305 310 315 320 Gln Pro Phe Ser Gly Ser His Ala Ser Met Thr Glu Gln Glu Lys Ala 325 330 335 Asp Met Gly Ile Glu Lys Gly Leu Val Arg Leu Cys Phe Gly Leu Glu 340 345 350 Ala Leu Glu Asp Leu Lys Glu Asp Leu Leu Gln Ala Phe Val Ala Met 355 360 365 Glu Asn Met Ala Asn Gln Lys Ser Ala Leu Lys Pro Ala Met Asp Thr 370 375 380 Thr Lys Asn Lys Asn Trp Thr Leu Glu Ser Thr Pro Ala Lys Leu Glu 385 390 395 400 Glu Ile Leu Pro Asn Gly Val Val Lys Cys His Leu Ser Pro Arg Asn 405 410 415 Cys Val Ile Gln Glu Met Asp Thr Thr Lys Asn Lys Asn Trp Thr Leu 420 425 430 Glu Ser Thr Pro Ala Lys Leu Glu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Val Val 435 440 445 Lys Cys His Leu Ser Pro Arg Asn Cys Val Ile Gln Glu Gly Lys Val 450 455 460 Gly Phe Cys Lys Val Arg Gly Asn Arg Gly Gly Arg Leu Val Thr Leu 465 470 475 480 Asn Tyr Gly Gly Val His Ser Thr Glu Glu Thr Ile Glu Thr Glu Ala 485 490 495 Val Phe His Phe Ala Pro Gly Glu Arg Ile Leu Ser Leu Gly Asn Ile 500 505 510 Gly Cys Met Leu Asn Cys Gly Tyr Cys His Asn Trp Lys Thr Ser Gln 515 520 525 Ala Lys Tyr Val Thr Asp Lys Asp Val Tyr Tyr Tyr Thr Pro Glu Gln 530 535 540 Val Val Glu Thr Ala Leu Lys His Gly Ile Arg Val Ile Ser Trp Thr 545 550 555 560 Tyr Asn Asp Pro Val Val Trp His Glu Phe Ile Leu Asp Thr Ala Lys 565 570 575 Leu Ala Lys Glu Ala Gly Leu Ile Asn Leu Tyr Lys Ser Ala Phe Phe 580 585 590 Ile Ser Glu Glu Ala Ile Asp Glu Leu Leu Pro Val Ile Asp Ile Phe 595 600 605 Ser Ile Ser Leu Lys Ser Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Arg Lys Val Thr 610 615 620 Thr Gly Trp Val Glu Pro Val Leu Ala Gly Ile Lys Lys Val Tyr Asp 625 630 635 640 Ala Gly Lys Tyr Val Glu Val Ser Thr Leu Met Val Thr Asp Ile Ser 645 650 655 Asp Asp Glu Asp Thr Ala Arg Lys Ile Ser Gln Trp Val Leu Asp Glu 660 665 670 Leu Gly Pro Asn Val Pro Leu His Phe Val Arg Phe His Pro Asp Tyr 675 680 685 Lys Met Ser Asn Ser Ile Arg Thr Pro Val Asp Arg Leu Leu Lys Ala 690 695 700 Arg Asp Ile Ala Arg Ser Met Gly Val Glu His Val Tyr Leu Gly Asn 705 710 715 720 Val Asn Asp Val Glu Gly Thr Asn Thr Asn Cys Asn Asn Cys Asn Ala 725 730 735 Leu Leu Val Thr Arg Tyr Gly Leu Asn Ala Glu Leu Ile Gly Leu Asp 740 745 750 Ser Asn Gly Cys Cys Thr Arg Cys Gly His Asp Ala His Phe Lys Leu 755 760 765 Leu Gly Glu His Lys Ala Asn Thr Pro Val Glu Leu Arg Glu Ala Ala 770 775 780 Leu Thr Ser Tyr Glu Lys Arg Lys Phe Glu Trp His Gly Asp Ile Val 785 790 795 800 Ser Leu His Ala Gln Val Leu Asn Thr Glu Asp Phe Glu Gln Thr Val 805 810 815 Tyr Leu Arg Arg Asn Tyr Thr Asp Gly Leu Asn Ser Asp Trp Lys Ser 820 825 830 Leu Thr Leu Arg Pro Tyr Glu Ser Tyr Arg Phe Ile Ile Ala Lys Ala 835 840 845 Arg Ile Asp Glu Ser Gly Pro Glu Val Trp Leu Pro Lys Gly Val Asn 850 855 860 Ser Asn Leu His Glu Val Phe Asp Arg Ala His Phe Pro Thr Glu Ser 865 870 875 880 Ile Glu Glu Ile Gly Ile Ser Gln Asn Asp Ile Thr Pro Thr Ile Gly 885 890 895 Tyr Glu Gly Lys Gln Asn Met Tyr Glu Gln Val Ile Lys Leu Val Ser 900 905 910 Lys Ser Met Glu Asp Glu Lys Ile Lys Cys Glu Lys Lys Ser Tyr Pro 915 920 925 Ser Phe Ala Asn Tyr Ile Gly Thr Gln Val Leu Ser Phe Arg Asp Phe 930 935 940 Lys Met Asp Gln Ile Phe Met Tyr Leu Ala Gly Val Ala Leu Phe Ser 945 950 955 960 Val Gly Ala Lys Phe Phe Ile Val Ser Gln Leu Gly Thr Asp Pro Leu 965 970 975 Asp Val Leu Ile Ile Ser Ile Asn Lys Ile Leu Met Leu Gly Met Gly 980 985 990 Val Cys Ser Gly Ile Val Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp Trp Met Leu 995 1000 1005 Trp Asn Lys Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Pro Phe Val Thr Thr Thr Leu 1010 1015 1020 Thr Gly Leu Leu Ile Asp Leu Trp Ser Val Leu Gly Leu Gly Glu Tyr 1025 1030 1035 1040 Leu Ile Val Arg Val Asn Glu Tyr Thr Ile Leu Ala Met Gly Leu Val 1045 1050 1055 Leu Cys Ala Tyr Ser Ser Ala Leu Ile Ile Met Ser Gly Ile Gly Ile 1060 1065 1070 Arg Ile Met Asp Leu Val Val Leu Thr Met Val Ser Lys Trp Ala Trp 1075 1080 1085 Ser Phe Thr Lys Ala Lys Met Ile Ile Glu Ile Gly Ile Phe Ser Thr 1090 1095 1100 Gly Trp Leu Leu Gly Gly Pro Phe Gly Met Gly Thr Ile Ala Phe Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Val Ile Gly Pro Leu Ile Gln Pro Phe Met Ile Asn Ala Arg Arg 1125 1130 1135 Phe Ser Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser Ala Tyr Gln 1140 1145 1150 Met Asp Arg Ile Asp Ile Lys Ile Leu Gly Lys Val Gln Asp Phe Gly 1155 1160 1165 Arg Ile Ser Ile Thr Glu Leu Ser Lys His Ala Gly Leu Ser Ile Pro 1170 1175 1180 Ala Thr Thr Asp Arg Leu Arg Lys Leu Glu Asp Ser Gly Val Ile Lys 1185 1190 1195 1200 Gly Tyr Ser Ala Gln Leu Asp Pro Thr Lys Leu Gly Phe Gly Ile Ser 1205 1210 1215 Ala Val Val Gly Met Thr Thr Leu Lys Pro Ala Lys Ser Lys Leu Ile 1220 1225 1230 Ala Thr Leu Asn Asp Ile Pro Glu Val Val Glu Cys Leu His Val Thr 1235 1240 1245 Gly Asn Asp Ser Tyr Leu Ile Arg Ile Tyr Ala Arg Ser Met Ala Asp 1250 1255 1260 Ile Glu Asn Ile Ile Ala Lys Ile Asn Ala Tyr Gly Glu Thr Arg Thr 1265 1270 1275 1280 Ser Ile Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Arg Lys Leu Val Pro 1285 1290 1295<110> PARK, CHANG SEUK HWANG, IN GYU <120> Pseudomonas flourescens B16 and Method of enhancement of plant growth and Control of the bacterial wilt <130> CSPIGH <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4319 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens B16 <400> 1 tcgaccggac gccagagaga ttgcctctgg attttcactg gaaatggaat ttagaagatg 60 gataacgttc agagtagggt cttcgaatat cgttttttcg agtacgctgg gcaatctcgc 120 ttctccataa aaagcaacga gccattgaag gctcgttgct catgattaac atctgttacg 180 caggtttaag tgcacttttt tgattggcca tattttccat ggccacaaat gcctgaagca 240 gatcctcttt aagatcctca agggcctcta aaccaaaaca caatcgtacc aacccctttt 300 caatccccat atccgctttt tcctgctcag tcatcgaggc atggcttcca ctaaagggtt 360 gcgcaaccat tgacgtgaca caggccattc ccgtacccgt tccaaaccat ttgagggagc 420 tggtgaaggt tttgtaaaag gggaccagat cgggccgaat atcaacaaac acaatgccac 480 cgtagccggt caattgttta ccatcgactc gtggataata tacatgctca ataaagggca 540 gttcccgtag atagttgagc atgctggagg ttgtgttgct gtgtttctcc atgcgcaggt 600 taaatgtctg catgcttctg cggagcagcc atgcgctatt aggcgctaat attgagcctg 660 agtaaaagcg gccttcgagg aggcgcgtat aaatcatttc attgttgacg agtaccaggc 720 cgcccatgac atcgctatgc ccggagaaat acttcgttgc gctgtacaga gaaatatccg 780 cgccgaagtt cagaggcttt tgaaatatcg gagtggccca cgtgttgtca acgaccacca 840 gagcgtgtgg gttgttttgc ttaaccgcct tgctgaccgc atgaatatca atgtctttca 900 gaaagggatt ggtcggtgtt tcgaaaatga ccatgtccac gtccgacggc aactctttca 960 atccactttc cgtagtgaga tccagaatcg tcagtttcgc accgatacgt gccgcatatc 1020 gctgaaacag cttataagaa cagccataga tatatttgtt gatcaccagc gacccaccgg 1080 gtttcagcag ctccagcacc atgtagatgg cactcattcc ggtgctgtag gccaaggcgt 1140 attcgcttcc ttccagtgca gcgacaacct gttccagctc agtcacattg ggattggctt 1200 ttctcgagta gaagaaggcc gagtcagcgc taaaagcgct gcactgataa ataggcgtca 1260 cggatggatg ggcttctcgg tcatcgaccc tgatatggag aatttcagta gacacattca 1320 tgatttgctc accagtttga taacctgctc atacatgttc tgcttgccct catacccaat 1380 ggtcggcgtg atgtcgtttt gcgaaatacc aatctcttca atcgactcgg ttgggaagtg 1440 agccctgtcg aatacttcat gaagatttga gttcaccccc ttgggaagcc agacttcagg 1500 gcctgattca tcaattcgtg ccttggcaat aatgaatcga tagctttcat acggccgcaa 1560 tgtcagtgat ttccaatcac tgttgagccc gtcggtatag ttgcgccgca ggtagacggt 1620 ctgttcaaag tcttcagtat tcagtacttg ggcgtgcagc gatacgatat ccccatgcca 1680 ctcgaacttt cgcttctcgt aagaggtcaa tgcagcctct cgcagttcaa caggcgtgtt 1740 cgctttgtgt tcgcccagta acttgaagtg tgcgtcgtgc ccacaccggg tgcagcaacc 1800 gttgctatcc aatccgatca gttcagcatt caaaccgtag cgggtaacga gtagagcgtt 1860 acaattattg cagttggtat tggtgccctc tacatcattt acgttaccca gataaacatg 1920 ctcaaccccc atgctccggg caatgtcccg ggccttcagg agtctatcca cgggcgtcct 1980 gatgctatta ctcattttat aatcagggtg aaaccttaca aagtggagcg gtacattcgg 2040 gcccagttca tccagcaccc actggctaat tttcctggcg gtatcctcat cgtcactgat 2100 atcggtaacc atcaaggtgc tgacttcaac atatttacca gcatcgtata ctttcttgat 2160 gccagccaga acgggctcta cccagcctgt tgtgactttt cgatagtatt cgggggagat 2220 ggattttagc gaaatcgaga atatgtcgat gacgggcaat agttcgtcaa tggcttcttc 2280 actgataaaa aaagctgatt tatataaatt gattaagccc gcttcctttg ccagctttgc 2340 cgtatcgagg atgaattcat gccagacaac agggtcgtta tacgtccagg agataacgcg 2400 tataccatgc ttcaaggcag tttctacaac ctgttcaggc gtatagtagt aaacatcttt 2460 gtctgtcaca tacttggcct gagaggtctt ccaattgtgg cagtagccgc agttaagcat 2520 gcagccgata ttgcctaggg aaaggattcg ctctccggga gcaaagtgga ataccgcctc 2580 ggtttcgatg gtctcttcgg tgctgtgaac gcctttgcca taattcaatg taactaaccg 2640 gccgcctctg tttccgcgca ccttgcaaaa acctacttta ccctcctgaa tgacacagtt 2700 tcggggagaa agatgacact ttacaacgcc gttcgggagt atttcttcca actttgcagg 2760 cgtgctttcc aaggtccagt ttttattttt tgtagtgtcc atctctcact cctcatttca 2820 cggaagttgc tgtcaatatc atcggtttaa atagtcgagg cgaaacaatc ccgccgccac 2880 agtggcagca atcccctagt agttattgat aggcggaaga aacgctggtc aatccataat 2940 tcttaagtga aaaacgcctg gcgtttatat tcatgaatgg ctgtataaga gggcctatga 3000 ccaacaagaa tgcaatggtt cccataccga agggcccgcc tagaagccat ccggttgaaa 3060 agatgccaat ttcaattatc attttggctt tggtgaatga ccacgcccat ttggacacca 3120 tggtaagcac cacaaggtcc atgattctga taccaatacc gctcatgata atcagtgcag 3180 acgaataagc acacagcacc agacccatcg ccaatatcgt gtactcattc actctgacaa 3240 tcaaatactc tccaagcccc agcacggacc agaggtcaat caacagacct gtaagtgtgg 3300 ttgtaacaaa tgggcttatc ggaggatatt tcttgttcca gagcatccac cacagcagaa 3360 agaatagaga aacgataccc gaacaaacgc ccattccgag catgagtatt ttatttatcg 3420 agatgatcag gacatctaag gggtcagtcc ccagttgact gactatgaaa aacttggccc 3480 ccaccgagaa aagggcgacg ccagccagat acataaaaat ctgatccatc ttgaaatcac 3540 gaaaacttag gacttgcgtt ccaatataat tcgcgaatga tggataggat tttttttcac 3600 actttatttt ttcatcttcc atacgaacac catccctgga ggagaatatt ttattatgca 3660 gtgcgtaacg ctaaggattc ggagctattg attacccggg ttcttgttag gctttaccgg 3720 gctgcaaata gactagcact ctgctttatt ttggtgcatt attttttaat gaaaaccggg 3780 tgcttttcat taaaatttat actttttgct gtgggagctt acatggaccg tatagacatc 3840 aaaatcttgg ggaaggtgca ggactttggt cgcatttcca tcacggagct gtccaagcac 3900 gcaggtcttt ctattcccgc caccactgat cggttgcgaa agctcgaaga ttctggggtc 3960 atcaagggat atagcgctca gttagatcca accaaactag ggttcggcat atctgctgtc 4020 gtcggcatga ccaccctcaa gcctgcgaaa tccaaattga tagcgacgct caacgacata 4080 cccgaagtcg ttgagtgcct gcacgtcacg ggtaacgact cctacctgat caggatctat 4140 gccaggtcaa tggccgatat cgaaaatatc attgcgaaga tcaacgcgta cggtgagaca 4200 cgtacaagca ttgtcttgtc tgtccccatc gagagaagaa agcttgtccc ttgagcctgt 4260 acatagaaca gtcagctgtc agctatttca agggtgatca ttttgtttgc ccggaacgg 4319 <210> 2 <211> 1295 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens B16 <400> 2 Met Asn Val Ser Thr Glu Ile Leu His Ile Arg Val Asp Asp Arg Glu 1 5 10 15 Ala His Pro Ser Val Thr Pro Ile Tyr Gln Cys Ser Ala Phe Ser Ala 20 25 30 Asp Ser Ala Phe Phe Tyr Ser Arg Lys Ala Asn Pro Asn Val Thr Glu 35 40 45 Leu Glu Gln Val Val Ala Ala Leu Glu Gly Ser Glu Tyr Ala Leu Ala 50 55 60 Tyr Ser Thr Gly Met Ser Ala Ile Tyr Met Val Leu Glu Leu Leu Lys 65 70 75 80 Pro Gly Gly Ser Leu Val Ile Asn Lys Tyr Ile Tyr Gly Cys Ser Tyr 85 90 95 Lys Leu Phe Gln Arg Tyr Ala Ala Arg Ile Gly Ala Lys Leu Thr Ile 100 105 110 Leu Asp Leu Thr Thr Glu Ser Gly Leu Lys Glu Leu Pro Ser Asp Val 115 120 125 Asp Met Val Ile Phe Glu Thr Pro Thr Asn Pro Phe Leu Lys Asp Ile 130 135 140 Asp Ile His Ala Val Ser Lys Ala Val Lys Gln Asn Asn Pro His Ala 145 150 155 160 Leu Val Val Val Asp Asn Thr Trp Ala Thr Pro Ile Phe Gln Lys Pro 165 170 175 Leu Asn Phe Gly Ala Asp Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Phe 180 185 190 Ser Gly His Ser Asp Val Met Gly Gly Leu Val Leu Val Asn Asn Glu 195 200 205 Met Ile Tyr Thr Arg Leu Leu Glu Gly Arg Phe Tyr Ser Gly Ser Ile 210 215 220 Leu Ala Pro Asn Ser Ala Trp Leu Leu Arg Arg Ser Met Gln Thr Phe 225 230 235 240 Asn Leu Arg Met Glu Lys His Ser Asn Thr Thr Ser Ser Met Leu Asn 245 250 255 Tyr Leu Arg Glu Leu Pro Phe Ile Glu His Val Tyr Tyr Pro Arg Val 260 265 270 Asp Gly Lys Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gly Ile Val Phe Val Asp Ile 275 280 285 Arg Pro Asp Leu Val Pro Phe Tyr Lys Thr Phe Thr Ser Ser Leu Lys 290 295 300 Trp Phe Gly Thr Gly Thr Gly Met Ala Cys Val Thr Ser Met Val Ala 305 310 315 320 Gln Pro Phe Ser Gly Ser His Ala Ser Met Thr Glu Gln Glu Lys Ala 325 330 335 Asp Met Gly Ile Glu Lys Gly Leu Val Arg Leu Cys Phe Gly Leu Glu 340 345 350 Ala Leu Glu Asp Leu Lys Glu Asp Leu Leu Gln Ala Phe Val Ala Met 355 360 365 Glu Asn Met Ala Asn Gln Lys Ser Ala Leu Lys Pro Ala Met Asp Thr 370 375 380 Thr Lys Asn Lys Asn Trp Thr Leu Glu Ser Thr Pro Ala Lys Leu Glu 385 390 395 400 Glu Ile Leu Pro Asn Gly Val Val Lys Cys His Leu Ser Pro Arg Asn 405 410 415 Cys Val Ile Gln Glu Met Asp Thr Thr Lys Asn Lys Asn Trp Thr Leu 420 425 430 Glu Ser Thr Pro Ala Lys Leu Glu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Val Val 435 440 445 Lys Cys His Leu Ser Pro Arg Asn Cys Val Ile Gln Glu Gly Lys Val 450 455 460 Gly Phe Cys Lys Val Arg Gly Asn Arg Gly Gly Arg Leu Val Thr Leu 465 470 475 480 Asn Tyr Gly Gly Val His Ser Thr Glu Glu Thr Ile Glu Thr Glu Ala 485 490 495 Val Phe His Phe Ala Pro Gly Glu Arg Ile Leu Ser Leu Gly Asn Ile 500 505 510 Gly Cys Met Leu Asn Cys Gly Tyr Cys His Asn Trp Lys Thr Ser Gln 515 520 525 Ala Lys Tyr Val Thr Asp Lys Asp Val Tyr Tyr Tyr Thr Pro Glu Gln 530 535 540 Val Val Glu Thr Ala Leu Lys His Gly Ile Arg Val Ile Ser Trp Thr 545 550 555 560 Tyr Asn Asp Pro Val Val Trp His Glu Phe Ile Leu Asp Thr Ala Lys 565 570 575 Leu Ala Lys Glu Ala Gly Leu Ile Asn Leu Tyr Lys Ser Ala Phe Phe 580 585 590 Ile Ser Glu Glu Ala Ile Asp Glu Leu Leu Pro Val Ile Asp Ile Phe 595 600 605 Ser Ile Ser Leu Lys Ser Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Arg Lys Val Thr 610 615 620 Thr Gly Trp Val Glu Pro Val Leu Ala Gly Ile Lys Lys Val Tyr Asp 625 630 635 640 Ala Gly Lys Tyr Val Glu Val Ser Thr Leu Met Val Thr Asp Ile Ser 645 650 655 Asp Asp Glu Asp Thr Ala Arg Lys Ile Ser Gln Trp Val Leu Asp Glu 660 665 670 Leu Gly Pro Asn Val Pro Leu His Phe Val Arg Phe His Pro Asp Tyr 675 680 685 Lys Met Ser Asn Ser Ile Arg Thr Pro Val Asp Arg Leu Leu Lys Ala 690 695 700 Arg Asp Ile Ala Arg Ser Met Gly Val Glu His Val Tyr Leu Gly Asn 705 710 715 720 Val Asn Asp Val Glu Gly Thr Asn Thr Asn Cys Asn Asn Cys Asn Ala 725 730 735 Leu Leu Val Thr Arg Tyr Gly Leu Asn Ala Glu Leu Ile Gly Leu Asp 740 745 750 Ser Asn Gly Cys Cys Thr Arg Cys Gly His Asp Ala His Phe Lys Leu 755 760 765 Leu Gly Glu His Lys Ala Asn Thr Pro Val Glu Leu Arg Glu Ala Ala 770 775 780 Leu Thr Ser Tyr Glu Lys Arg Lys Phe Glu Trp His Gly Asp Ile Val 785 790 795 800 Ser Leu His Ala Gln Val Leu Asn Thr Glu Asp Phe Glu Gln Thr Val 805 810 815 Tyr Leu Arg Arg Asn Tyr Thr Asp Gly Leu Asn Ser Asp Trp Lys Ser 820 825 830 Leu Thr Leu Arg Pro Tyr Glu Ser Tyr Arg Phe Ile Ila Ala Lys Ala 835 840 845 Arg Ile Asp Glu Ser Gly Pro Glu Val Trp Leu Pro Lys Gly Val Asn 850 855 860 Ser Asn Leu His Glu Val Phe Asp Arg Ala His Phe Pro Thr Glu Ser 865 870 875 880 Ile Glu Glu Ile Gly Ile Ser Gln Asn Asp Ile Thr Pro Thr Ile Gly 885 890 895 Tyr Glu Gly Lys Gln Asn Met Tyr Glu Gln Val Ile Lys Leu Val Ser 900 905 910 Lys Ser Met Glu Asp Glu Lys Ile Lys Cys Glu Lys Lys Ser Tyr Pro 915 920 925 Ser Phe Ala Asn Tyr Ile Gly Thr Gln Val Leu Ser Phe Arg Asp Phe 930 935 940 Lys Met Asp Gln Ile Phe Met Tyr Leu Ala Gly Val Ala Leu Phe Ser 945 950 955 960 Val Gly Ala Lys Phe Phe Ile Val Ser Gln Leu Gly Thr Asp Pro Leu 965 970 975 Asp Val Leu Ile Ile Ser Ile Asn Lys Ile Leu Met Leu Gly Met Gly 980 985 990 Val Cys Ser Gly Ile Val Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp Trp Met Leu 995 1000 1005 Trp Asn Lys Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Pro Phe Val Thr Thr Thr Leu 1010 1015 1020 Thr Gly Leu Leu Ile Asp Leu Trp Ser Val Leu Gly Leu Gly Glu Tyr 1025 1030 1035 1040 Leu Ile Val Arg Val Asn Glu Tyr Thr Ile Leu Ala Met Gly Leu Val 1045 1050 1055 Leu Cys Ala Tyr Ser Ser Ala Leu Ile Ile Met Ser Gly Ile Gly Ile 1060 1065 1070 Arg Ile Met Asp Leu Val Val Leu Thr Met Val Ser Lys Trp Ala Trp 1075 1080 1085 Ser Phe Thr Lys Ala Lys Met Ile Ile Glu Ile Gly Ile Phe Ser Thr 1090 1095 1100 Gly Trp Leu Leu Gly Gly Pro Phe Gly Met Gly Thr Ile Ala Phe Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Val Ile Gly Pro Leu Ile Gln Pro Phe Met Ile Asn Ala Arg Arg 1125 1130 1135 Phe Ser Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser Ala Tyr Gln 1140 1145 1150 Met Asp Arg Ile Asp Ile Lys Ile Leu Gly Lys Val Gln Asp Phe Gly 1155 1160 1165 Arg Ile Ser Ile Thr Glu Leu Ser Lys His Ala Gly Leu Ser Ile Pro 1170 1175 1180 Ala Thr Thr Asp Arg Leu Arg Lys Leu Glu Asp Ser Gly Val Ile Lys 1185 1190 1195 1200 Gly Tyr Ser Ala Gln Leu Asp Pro Thr Lys Leu Gly Phe Gly Ile Ser 1205 1210 1215 Ala Val Val Gly Met Thr Thr Leu Lys Pro Ala Lys Ser Lys Leu Ile 1220 1225 1230 Ala Thr Leu Asn Asp Ile Pro Glu Val Val Glu Cys Leu His Val Thr 1235 1240 1245 Gly Asn Asp Ser Tyr Leu Ile Arg Ile Tyr Ala Arg Ser Met Ala Asp 1250 1255 1260 Ile Glu Asn Ile Ile Ala Lys Ile Asn Ala Tyr Gly Glu Thr Arg Thr 1265 1270 1275 1280 Ser Ile Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Arg Lys Leu Val Pro 1285 1290 1295

Claims (12)

신규 균주 슈도모나스 플로레슨스 B16(Pseudomonas fluorescens B16; KCTC 0563BP).New strain Pseudomonas fluorescens B16 (KCTC 0563BP). 상기 제 1항의 균주에 전이인자 Omegon Km을 이용한 Tn 돌연변이 유발을 통해 만들어진 신규 균주 슈도모나스 플로레슨스 K2-31(Pseudomonas fluorescens K2-31; KACC 91065). A novel strain Pseudomonas fluorescens K2-31 (Pseudomonas fluorescens K2-31; KACC 91065) made by inducing Tn mutagenesis using the transfer factor Omegon Km to the strain of claim 1. 상기 제 1항 또는 제 2항의 균주를 파종전 침지 처리함을 특징으로 하는 생장 촉진 및 세균성 시들음병 방제 방법.A method for promoting growth and controlling bacterial wilt disease, wherein the strain of claim 1 or 2 is immersed before sowing. 상기 제 1항 또는 제 2항의 균주를 포함하는 식물생장 촉진용 및 세균성 시들음병 방제용 미생물 제제.Microbial agent for plant growth promotion and bacterial wilted disease control comprising the strain of claim 1 or 2. 제 1항의 균주로부터 분리된 서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA 분자; 및 A DNA molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from the strain of claim 1; And 상기 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 길항물질의 생합성에 관계하는 DNA.DNA related to biosynthesis of antagonist selected from the group consisting of DNA molecules complementary to said DNA molecule. 제 1항의 균주로부터 분리된 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 식물성 병원균에 대한 길항물질의 생합성에 관계되는 폴리펩티드.A polypeptide related to the biosynthesis of an antagonist against a plant pathogen having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 isolated from the strain of claim 1. 제 5항의 분리된 DNA 분자로 형질 전환된 발현 벡터.An expression vector transformed with the isolated DNA molecule of claim 5. 제 7항에 있어서, 상기 발현 벡터는 pUC18, pBluescript 또는 pLAFR3인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 발현 벡터.8. The transformed expression vector of claim 7, wherein said expression vector is pUC18, pBluescript or pLAFR3. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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