KR100529254B1 - Method for construction of a library in Hansenula polymorpha using HARS36 sequence and the library constructed by the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 라이브러리에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 DNA의 5' 또는 3' 말단에 노출되어 있으며 다양성을 가지는 표적발현유전자를 포함하는 삽입(insert)절편을 제조하는 단계; 2) 선택표지 유전자 및 이들을 발현시키기 위한 프로모터를 포함하며, 5' 또는 3' 말단에 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 노출되어 있는 수용(acceptor)절편을 제조하는 단계; 3) 단계 1의 삽입절편과 단계 2의 수용절편을 동시에 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및 4) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 유전자 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명의 라이브러리 제작 방법은 높은 형질전환효율 및 균일한 카피수를 가지므로 유전자 라이브러리의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method for preparing a library in a yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and more specifically, to a library prepared by the above method. Preparing an insert fragment comprising a target expression gene having a diversity in which all or a portion of the HARS36 sequence having the nucleotide sequence is exposed at the 5 'or 3' end of the DNA; 2) a receptor fragment comprising a selectable gene and a promoter for expressing the same, wherein all or part of an HARS36 sequence having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 at its 5 'or 3' end is exposed; step; 3) preparing a transformant transformed into the yeast Hansenula polymorpha strain at the same time the insertion fragment of step 1 and the receptor fragment of step 2; And 4) relates to a method for producing a gene library in yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence comprising culturing the transformant and to a library prepared by the method. Since the library production method of the present invention has high transformation efficiency and uniform copy number, it can be usefully used for preparing a gene library.

Description

ＨＡＲＳ36서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 라이브러리{Method for construction of a library in Hansenula polymorpha using HARS36 sequence and the library constructed by the same} Method for construction of a library in the yeast Hanshenula polymorpha strain using the HASRS36 sequence and the library prepared by the method {Hmethod for construction of a library in Hansenula polymorpha using HARS36 sequence and the library constructed by the same}

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 라이브러리에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 DNA의 5' 또는 3' 말단에 노출되어 있으며 다양성을 가지는 표적발현유전자를 포함하는 삽입(insert)절편을 제조하는 단계; 2) 선택표지 유전자 및 이들을 발현시키기 위한 프로모터를 포함하며, 5' 또는 3' 말단에 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 노출되어 있는 수용(acceptor)절편을 제조하는 단계; 3) 단계 1의 삽입 DNA 절편과 단계 2의 수용 DNA 절편을 동시에 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및 4) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 유전자 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 라이브러리에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a library in a yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and more specifically, to a library prepared by the above method. Preparing an insert fragment comprising a target expression gene having a diversity in which all or a portion of the HARS36 sequence having the nucleotide sequence is exposed at the 5 'or 3' end of the DNA; 2) a receptor fragment comprising a selectable gene and a promoter for expressing the same, wherein all or part of an HARS36 sequence having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 at its 5 'or 3' end is exposed; step; 3) preparing a transformant transformed into the yeast Hanshenula polymorpha strain at the same time the insertion DNA fragment of step 1 and the receiving DNA fragment of step 2; And 4) relates to a method for producing a gene library in yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence comprising culturing the transformant and to a library prepared by the method.

근래에 이르러 재조합 단백질의 생산기술이 발전하면서 다양한 용도와 조건에서 사용 가능한 효소의 저비용, 대량 생산이 가능해졌다. 과거 수년간 극한 조건(극한의 온도, pH, 압력, 이온농도 등)에서 생육하는 생물(초고온성 미생물, 해양미생물, 저온성 미생물 등)로부터 극한조건에서 활용 가능한 효소를 분리하고 생산하기 위한 많은 연구가 이루어 졌고, 산업적 이용 사례도 증가하고 있다. 한편, 자연적 환경과 다른 조건에서 활성을 갖거나, 두 가지 이상의 효소활성을 갖는, 또는 보다 높은 활성을 갖는 효소의 이용을 위해 자연적 진화의 기작을 실험실 내에서 모방하여 변이의 시간과 방향성을 인위적으로 조절한 효소개량 방법도 이용되고 있다.In recent years, with the development of recombinant protein production technology, it is possible to produce a low-cost, mass-produced enzyme that can be used in various applications and conditions. Many studies have been conducted to isolate and produce enzymes that can be used in extreme conditions from organisms that grow in extreme conditions (extreme temperature, pH, pressure, ion concentration, etc.) over the past few years. And industrial use cases are increasing. On the other hand, artificially mimic the mechanism of natural evolution in the laboratory for the use of enzymes that are active in conditions different from the natural environment, have two or more enzymatic activities, or have higher activity, thereby artificially Regulated enzyme improvement methods are also used.

효소의 개량 방법은 두 가지로 구분되는데, 단백질의 3차 구조 및 그 기능에 대한 사전 정보가 있을 경우 인위적으로 활성 부위의 유전자에 변이를 주어 효소의 특성을 개량하는 방법과 단백질의 구조적 정보가 부족한 경우 무작위적 변이를 유도한 후 획득한 라이브러리로부터 원하는 활성을 가진 효소를 선별하는 방법이 있다. 기존의 연구는 주로 인위적 변이에 의해 이루어져 왔으나 근래에 이르러 유전자에 무작위적 변이 제조 방법 및 이에 대한 스크리닝 기술이 진보하면서 무작위적 변이가 크게 주목을 받고 있다. There are two ways to improve the enzyme. If there is prior information on the tertiary structure and function of the protein, there is a lack of information on how to improve the characteristics of the enzyme by artificially altering the gene of the active site and lacking the structural information of the protein. In this case, there is a method of selecting an enzyme having a desired activity from a library obtained after inducing random mutation. Previous studies have been mainly conducted by artificial mutations, but in recent years, random mutations have attracted much attention as advances have been made in the method of manufacturing random mutations in genes and screening techniques thereof.

무작위적 변이의 경우 많은 수의 단백질에 대한 특성을 조사해야 하지만, 그에 비례하여 원하는 특이성을 가진 단백질을 선별할 수 있는 가능성도 배가되는 특징이 있다. 무작위적 변이는 주로 중합효소연쇄 반응을 이용하여 이루어지는데 가장 전통적인 방법으로 변이유도 중합효소연쇄 반응을 들 수 있다. 변이유도 중합효소연쇄 반응은 중합효소가 반응을 진행하면서 잘못된 염기를 삽입하도록 유도하는 반응으로 주로 과량의 GTP, MnSO₄ 등을 첨가하거나, 변이 비율이 높은 중합효소를 이용하여 변이를 유도한다.In the case of random variation, the characterization of a large number of proteins should be investigated, but the possibility of selecting a protein having a specific specificity is proportionately increased. Random mutations are mainly carried out using polymerase chain reaction. The most traditional method is mutation-induced polymerase chain reaction. Mutation-induced polymerase chain reaction is a reaction that induces polymerase to insert an incorrect base as the reaction proceeds, and mainly induces mutation by adding an excessive amount of GTP, MnSO ₄ , or a polymerase having a high mutation rate.

1994년 스테머 등(Stemmer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91, 10747)은 DNA 셔플링(shuffling)의 방법을 고안하였는데, 이 방법은 선택된 유전자를 무작위로 절단하고 중합효소연쇄 반응에 의하여 재결합시키는 과정을 반복함으로써 변이를 유발하는 방법으로서 스테머는 이 방법으로 β-락타메이즈(β-lactamase) 유전자를 개량하여 3,200배의 효율을 증가시킨 바 있다(1994, Nature, 370, 389). 1998년 크라메리 등(Crameri 등., Nature 391, 288)은 포유류 면역계의 항체가 다양성을 갖는 방법인 수천 염기서열간의 재조합과 부분 변이에 의한 친화 성숙(affinity maturation) 과정을 모방하여 4가지 다른 균주 유래의 β-락타메이즈 유전자를 이용하여 서로 다른 유전자의 융합을 유도한 패밀리 셔플링(family shuffling)으로 원래 효소의 활성을 변형시킨 바 있다. 이 과정에서, 크렙시엘라(Klebsiella), 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter)와 여시니어(Yersinia) 유래의 β-락타메이즈 유전자를 이용하여 얻은 변이 유전자는 가장 비슷한 유전자에 비해 102 개의 아미노산의 변이가 일어나 27%의 부분에서 차이를 보였고, 많게는 196 개의 아미노산의 변이로 50%의 차이를 보여 270 배의 활성이 증가된 변이 유전자를 얻을 수 있었다. 또한 1999년 네스 등(Ness 등, Nat. Biotechnol. 17, 893)은 26종의 단백질 분해효소 유전자를 이용하여 패밀리 셔플링을 통하여 23℃에서의 활성, 열안정성, 유기용매안정성, pH 의존성(pH 5.5, pH7.5 및 pH10)면에서 활성이 증가된 유전자를 선별하였다. 상기한 바와 같이 최근에 유전자의 무작위적 변이를 통하여 원하는 성질을 가진 효소를 선별하는 방법은 많은 진보를 보이고 있다.In 1994, Stemer et al. ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747) devised a method of DNA shuffling, which randomly cuts selected genes and performs a polymerase chain reaction. As a method of causing mutation by repeating the recombination process, Stemer has improved the β-lactamase gene in this way and increased the efficiency by 3,200 times (1994, Nature , 370, 389). In 1998, Kramery et al., Nature 391, 288 described four different strains that mimic the process of affinity maturation by recombination and partial variation between thousands of sequences, a method in which the antibodies of the mammalian immune system are diverse. Using the derived β-lactamase gene, family shuffling that induces the fusion of different genes was modified by the original enzyme activity. In this process, when keurep Ella (Klebsiella), a sheet bakteo (Citrobacter), Enterobacter bakteo mutant gene obtained by using β- lactase gene of maize (Enterobacter) and W Sr (Yersinia) derived is compared with the most similar gene 102 The variation of amino acids occurred in 27% of the cases, and the variation of 196 amino acids was 50%, resulting in 270-fold increase in the mutant gene. Also, in 1999, Ness et al. ( Nat. Biotechnol. 17, 893) used 26 protease genes to perform activity, thermal stability, organic solvent stability, pH dependence (pH) at 23 ° C through family shuffling. Genes with increased activity in terms of 5.5, pH7.5 and pH10) were selected. As described above, a method of selecting an enzyme having a desired property through random variation of a gene has been progressing in recent years.

그러나 유전자의 무작위적 변이 유도 및 선별과정을 통해 성공적으로 원하는 변이를 용이하게 획득하기 위해서는 다양성이 보장되는 효율적인 라이브러리의 구축 방법이 절대적으로 필요하다. 현재 라이브러리에서 높은 다양성을 획득하기 위해 주로 파아지(phage)가 이용되고 있으나, 이 경우 분자량이 크거나 복잡한 구조의 단백질은 발현할 수 없는 단점을 가지고 있다. 이에 반해, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모를 이용할 경우 세포외 분비시스템을 이용하여 분자량이 크거나 구조가 복잡한 외래 단백질도 활성형으로 배지로 분비시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 진핵세포 유래의 변이 단백질 발현 라이브러리 제조를 위한 숙주세포로 매우 적합하다. 또한 최근 효모에서 외래단백질의 표면 발현 방법과 유세포분석기(FACS, fluorescence activated cell sorter)를 이용한 미세한 차이를 구분할 수 있는 방법의 개발은 세포를 단시간에 높은 효율로 구별하고 분리하는 것이 가능하게 되었다. 현재까지 효모의 표면에 항체 및 항원, T 세포 수용체 등을 발현하여 친화도가 증진된 균주를 유세포분석기를 이용하여 선별한 경우는 많이 보고되었다(Schreuder 등, Vaccine., 1996, 14, 383; Kieke 등, Protein. Eng., 1997, 10, 1303; Kieke 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1999, 96, 5651). 그러나 효모의 경우 파아지에 비해 형질전환 효율이 낮아 라이브러리 다양성을 확보하기 어려운 단점이 있으며, 또한 라이브러리를 대장균에서 미리 제조한 후에 회수하여 다시 효모 균주에 형질전환해야 하기 때문에 라이브러리 제조의 효율이 낮고 대장균에서 발현 시 숙주세포에 유독(toxic)한 경우 발현율이 낮아 라이브러리의 대표성이 저하(under-representation)되는 문제가 있다.However, in order to successfully obtain desired mutations through the random mutation induction and selection process of genes, there is an absolute need for an efficient library construction method that guarantees diversity. Currently, phage is mainly used to obtain high diversity in the library, but in this case, a protein having a large molecular weight or a complex structure cannot be expressed. On the other hand, when using yeasts such as Saccharomyces cerevisiae , the extracellular secretion system can be used to secrete foreign proteins with large molecular weight or complex structure into active medium. It is very suitable as a host cell for the production of mutant protein expression libraries derived from eukaryotic cells. In recent years, the development of a method for distinguishing microscopic differences by using a surface expression method of foreign proteins and a fluorescence activated cell sorter (FACS) in yeast has made it possible to distinguish and isolate cells with high efficiency in a short time. To date, many cases of strains that express antibodies, antigens and T cell receptors on the surface of yeast to enhance affinity were selected using flow cytometry (Schreuder et al., Vaccine ., 1996, 14, 383; Kieke). Et al., Protein. Eng ., 1997, 10, 1303; Kieke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ., 1999, 96, 5651). However, yeast has a disadvantage in that it is difficult to secure library diversity due to the lower transformation efficiency than phage.In addition, the production efficiency of the library is low and the production of E. coli in When expression is toxic to the host cell (toxic), there is a problem that the expression rate is lowered (under-representation) of the library.

한편, 본 발명자들은 산업적으로 유용하게 사용되는 메탄올 자화 효모의 일종인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주를 대상으로 신규한 세포벽 부착 매개 단백질을 분리하고 이를 이용하여 목표 단백질을 세포 표면에 발현시키는 신규한 표면 발현 시스템을 개발한 바 있다(PCT/KR00/00819). 상기 한세눌라 폴리모르파는 강력한 발현 프로모터를 가진 재조합 단백질 발현용 산업 균주로서 외래 단백질 생산 능력이 매우 뛰어나며, 균주의 생육이 빠르고 고온 및 유기 용매에서의 안정성을 가지고 있어 리파제 등의 효소 생산 및 생물 반응계에 매우 적합한 균주이다. 한세눌라 폴리모르파에서 외래유전자의 고효율 형질전환을 위해서는 서열 번호 1의 HARS36이라는 자기복제서열을 이용하는데, 이는 한세눌라 폴리모르파의 염색체 말단에서 유래된 자기복제서열로 세 개의 특징적인 도메인으로 구성되어 있다(Sohn 등, 1996, J. Bacteriol. 178, 4420). 첫번째 도메인으로 다른 자기복제서열에서도 흔히 발견되는 벤트 DNA 도메인(bent DNA, BD)이 있고, 두 번째는 자기복제에 필수적인 ARS 도메인(ARS)이며, 세 번째 도메인은 염색체 말단 반복서열(telomeric repeat, 5'-GGGTGGCG-3')을 포함하는 도메인이다. 이 중, ARS 도메인은 HARS36 서열을 함유한 원형(circular) 플라스미드의 자기 복제를 가능하게 하여 세포 내에서 염색체와 독립적으로 유지되게 한다. 또한, 말단 반복 서열 도메인은 한세눌라 폴리모르파의 모든 염색체 말단에 18-23 번 반복되어 존재하는 서열과 동일하기 때문에 염색체와 높은 효율의 상동성 재조합을 일으키는 것으로 보고되었다(Sohn 등, 1999. J. Bacteriol. 181, 1005). HARS36 서열을 포함하는 벡터가 한세눌라 폴리모르파에 도입될 경우, 벡터는 일시적으로는 자기복제를 하나, 궁극적으로는 HARS36 부위와 상동성을 가지는 5 종의 염색체 말단으로 삽입되어 안정된 구조를 가지게 된다. 이 경우 벡터가 염색체 외부에서 독립적으로 존재하면서 지속적으로 여러 카피가 일렬로 한 염색체의 말단에 삽입되므로 선별하는 방법에 따라서 다중카피(multicopy) 선별 방법을 이용할 경우 약 50-100 카피 이상이 말단에 삽입될 수 있다(Sohn 등, 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 800). 그러나 단순한 영양 요구성 선별을 할 경우에는 일반적으로 5 카피 이하로 염색체 말단에 삽입되어 발현 카세트를 유지한다(Agaphonov 등, 1999, Yeast, 15, 541).On the other hand, the present inventors isolate a novel cell wall attachment mediator protein using Hansenula polymorpha strain, a type of methanol magnetizing yeast that is industrially useful, and expresses a target protein on the cell surface using the same. Novel surface expression systems have been developed (PCT / KR00 / 00819). The Hansenula polymorpha is an industrial strain for expressing recombinant proteins with a strong expression promoter, and has excellent foreign protein production ability, rapid growth of strains, and stability in high temperature and organic solvents, and thus for enzyme production and bioreaction systems such as lipases. It is a very suitable strain. For high-efficiency transformation of foreign genes in Hanshenula polymorpha, a self-replicating sequence called HARS36 of SEQ ID NO: 1 is used. It is a self-replicating sequence derived from the chromosome end of Hanshenula polymorpha and consists of three distinct domains. (Sohn et al., 1996, J. Bacteriol . 178, 4420). The first domain is the bent DNA domain (Bent DNA, BD), which is commonly found in other self-replicating sequences, the second is the ARS domain (ARS), which is essential for self-replicating, and the third domain is the telomeric repeat (5). '-GGGTGGCG-3'). Of these, the ARS domain allows for self-replication of circular plasmids containing HARS36 sequences, allowing them to remain independent of chromosomes in cells. In addition, the terminal repeat sequence domain has been reported to cause high efficiency homologous recombination with chromosomes since it is identical to the sequence present at all chromosomal ends of Hanshenula polymorphs 18-23 times (Sohn et al. 1999. J). Bacteriol . 181, 1005). When a vector containing HARS36 sequence is introduced into Hanshenula polymorpha , the vector is temporarily self-replicating but ultimately inserted into five chromosomal ends homologous to the HARS36 site, resulting in a stable structure. . In this case, since the vector is independently located outside the chromosome and several copies are continuously inserted at the ends of the chromosomes in a line, more than about 50-100 copies are inserted at the ends when using the multicopy selection method according to the selection method. (Sohn et al. , 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol . 51, 800). However, for simple nutritional requirement screening, it is generally inserted at the end of a chromosome in less than 5 copies to maintain an expression cassette (Agaphonov et al., 1999, Yeast , 15, 541).

상기한 바와 같이 HARS36 서열을 포함하는 한세눌라 폴리모르파 벡터는 형질전환 효율이 우수하고 도입된 외래유전자가 염색체에 다중카피로 안정적으로 삽입될 수 있는 장점이 있으나, 도입유전자 수가 균일해야 하는 라이브러리의 제조에는 적합하지 못하다. 즉, 도입유전자가 염색체 내로 다양한 카피 수로 삽입되기 때문에 균일한 발현량을 보이는 라이브러리를 제조할 수 없는 단점이 있다.As described above, the Hansenula polymorpha vector including the HARS36 sequence has the advantage of excellent transformation efficiency and stable introduction of foreign genes into the chromosome into multiple copies, but the number of transgenes must be uniform. Not suitable for manufacture That is, since the transgene is inserted into the chromosome in various copy numbers, there is a disadvantage in that a library showing a uniform expression amount cannot be prepared.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 높은 형질전환 효율 및 균일한 카피수를 가지는 유전자 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 라이브러리를 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for producing a gene library having high transformation efficiency and uniform copy number in a yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and a library prepared by the method. To provide.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a library in yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence described in SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 라이브러리를 제공한다.The present invention also provides a library prepared by the above method.

본 명세서에 있어서, "라이브러리"라 함은 다양성을 지닌 유전자를 포함하고 있는 균주의 집합체로서 다양성은 한개 또는 다수의 유전자의 무작위적 변이 유도에 의하여 생성되거나 또는 유전체(genome)로부터 유래된 유전자의 집합체로부터 생성된다.As used herein, the term "library" is a collection of strains containing genes with diversity, wherein the diversity is a collection of genes generated by inducing random mutations of one or more genes or derived from genomes. Is generated from

또한, "분자진화"라 함은 한 개 또는 다수의 유전자의 무작위적 변이 유도에 의하여 생성된 라이브러리로부터 특이적 성질을 보이는 단백질을 선별함으로서 원하는 성질을 가지는 유전자를 찾아내는 방법을 나타낸다.In addition, the term "molecular evolution" refers to a method of finding a gene having a desired property by selecting a protein having specific properties from a library generated by inducing random mutation of one or more genes.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은The present invention

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 DNA의 5' 또는 3' 말단에 노출되어 있으며 다양성을 가지는 표적발현유전자를 포함하는 삽입(insert)절편을 제조하는 단계;1) preparing an insert fragment comprising all or a portion of the HARS36 sequence having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, which is exposed at the 5 'or 3' end of the DNA and has a diversity of target expression genes;

2) 선택표지 유전자 및 이들을 발현시키기 위한 프로모터를 포함하며, 5' 또는 3' 말단에 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 노출되어 있는 수용(acceptor)절편을 제조하는 단계;2) a receptor fragment comprising a selectable gene and a promoter for expressing the same, wherein all or part of an HARS36 sequence having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 at its 5 'or 3' end is exposed; step;

3) 단계 1의 삽입절편과 단계 2의 수용절편을 동시에 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및 3) preparing a transformant transformed into the yeast Hansenula polymorpha strain at the same time the insertion fragment of step 1 and the receptor fragment of step 2; And

4) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 유전자 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.4) provides a method for producing a gene library in yeast Hanshenula polymorpha strain using the HARS36 sequence, comprising culturing the transformant.

상기에서, 단계 1 또는 단계 2의 삽입절편 및 수용절편의 말단에 각각 위치하는 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열은 형질전환체 내에서의 상동성 재조합이 고효율로 일어나기 위하여 필요한 서열로서, 반드시 서열번호 1의 염기서열 전체가 사용되어야만 하는 것은 아니며, 상동성 재조합이 일어나기에 충분한 정도의 염기서열만 포함되어 있어도 무방하다. 상기 HARS36 서열은 한세눌라 폴리모르파의 염색체 말단에서 유래된 자기복제서열로 세 개의 특징적인 도메인; 즉, 벤트 DNA 도메인(bent DNA, BD), 자기복제에 필수적인 ARS 도메인(ARS) 및 염색체 말단 반복서열(telomeric repeat, 5'-GGGTGGCG-3')을 포함한다. 상동성 재조합이 일어나기 위해서는 삽입절편에서 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열의 5'-말단 부분의 1 bp로부터 120 bp 부분이 포함되어 있는 것이 바람직하며, 1 bp로부터 150 bp 부분이 포함되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상동성 재조합이 일어나기 위해서는 수용절편에서 서열번호 1로 기재되는 HARS36 서열의 5'-말단 부분의 151 bp로부터 600 bp까지의 부분이 포함되어 있는 것이 바람직하다.In the above, the HARS36 sequence described by SEQ ID NO: 1 positioned at the ends of the insertion fragment and the receptive fragment of Step 1 or Step 2, respectively, is a sequence required for high efficiency of homologous recombination in the transformant, The entire base sequence of 1 should not be used, and only enough base sequences to allow homologous recombination to occur may be included. The HARS36 sequence is a self-replicating sequence derived from the chromosomal end of Hanshenula polymorpha ; That is, it includes a bent DNA domain (bent DNA, BD), an ARS domain (ARS) essential for self-replication, and a chromosome repeat (5'-GGGTGGCG-3 '). In order for homologous recombination to occur, it is preferable that 1 bp to 120 bp portions of the 5'-terminal portion of the HARS36 sequence described in SEQ ID NO: 1 are included in the insertion fragment, and more preferably 150 to bp portions are included from 1 bp. desirable. In addition, in order for homologous recombination to occur, it is preferable that the 151 bp to 600 bp portion of the 5'-terminal portion of the HARS36 sequence described in SEQ ID NO: 1 is included in the receptor fragment.

단계 1의 삽입절편과 단계 2의 수용절편은 숙주세포인 한세눌라 폴리모르파 내에서 상동성 재조합이 일어남으로써 염색체 내로 삽입되며, 따라서 각각의 삽입절편 및 수용절편에 포함되어야 하는 요소들은 특정하게 한정되어 있는 것은 아니다. 일 예로서, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 각각 다른 제한효소 절단부위를 포함하는 두 가지 종류의 삽입절편 및 수용절편을 사용하여 형질전환체를 제조하였다(표 1 참조).The insertion fragment of step 1 and the receptor fragment of step 2 are inserted into the chromosome by homologous recombination in the host cell Hanshenula polymorpha, and thus the elements that must be included in each insertion fragment and the receptor fragment are specifically defined. It is not. As an example, in a preferred embodiment of the present invention, a transformant was prepared using two kinds of insertion fragments and receptor fragments, each containing different restriction enzyme cleavage sites (see Table 1).

단계 1에 있어서, 삽입절편은 변이가 도입된 표적발현유전자, 분비신호서열을 코딩하는 유전자, 터미네이터 유전자 및 HARS36 서열의 전체 또는 일부분을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 표적발현유전자에 다양성을 부여하기 위하여 변이를 도입 시 이용한 변이유도 중합효소연쇄반응은 그 제조 방법이 당업자에 있어서 자명한 공지의 사실인 것은 당연하다. 또한, 상기 분비신호서열은 킬러톡신(Killer Toxin, KT), MFa, PH05, SUC2, AMY 및 SED로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 분비신호서열인 것이 바람직하며, 킬러톡신의 분비신호서열인 것이 더욱 바람직하다.In step 1, the insertion fragment preferably contains all or a portion of the target expression gene, the gene encoding the secretion signal sequence, the terminator gene, and the HARS36 sequence into which the mutation is introduced. It is natural that the mutation-induced polymerase chain reaction used at the time of introducing a mutation in order to give diversity to the target expression gene is well known to those skilled in the art. In addition, the secretion signal sequence is preferably a secretion signal sequence of a gene selected from the group consisting of killer toxin (KT), MFa, PH05, SUC2, AMY and SED, more preferably the secretion signal sequence of killer toxin. desirable.

단계 2에 있어서, 수용절편은 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제한효소로 절단함으로써 제조될 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 발현벡터는 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로서 본 발명의 바람직한 실시예에서는 리파제를 표면발현하는 벡터인 pGK-CALB-CwpF를 이용하여 다양한 세포내 재조합 방법에 대한 실험을 수행하였다. 또한, 상기 선택표지유전자는 한세눌라 폴리모르파 LEU2(HLEU2) 유전자, 한세눌라 폴리모르파 URA3(HURA3) 유전자 및 항생물질 내성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PH05, GAL1, GAL10, SED1, TEF 및 TPI로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터인 것이 바람직하고, GAPDH의 프로모터인 것이 더욱 바람직하다.In step 2, the receptor fragment may be prepared by cleaving a conventionally used expression vector with a restriction enzyme, but is not necessarily limited thereto. The expression vector is a vector capable of expressing a foreign protein, and in a preferred embodiment of the present invention, experiments on various intracellular recombination methods were performed using pGK-CALB-CwpF, which is a vector expressing a lipase. In addition, the selection marker gene is preferably selected from the group consisting of Hanshenula polymorpha LEU2 (HLEU2) gene, Hanshenula polymorpha URA3 ( HURA3 ) gene and antibiotic resistance gene, but is not necessarily limited thereto. In addition, the promoter is preferably a promoter of a gene selected from the group consisting of GAPDH, PGK, ADH, PH05, GAL1, GAL10, SED1, TEF and TPI, more preferably a promoter of GAPDH.

단계 3에 있어서, 변이 도입으로 다양성을 가지는 표적발현유전자를 포함하고 있는 삽입절편과 수용절편을 이용하여 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 제조함으로써 원하는 유전자 라이브러리의 제조가 가능하다.In step 3, a desired gene library can be prepared by preparing a transformed Hansenula polymorpha using an insertion fragment and a receptor fragment containing a variety of target expression genes by introducing a mutation.

본 발명자들은 라이브러리 제조에 있어서의 종래 기술의 단점을 극복하기 위하여 다양한 시스템을 실험하던 중, 세포내 재조합 방법을 이용한 시스템을 개발하였다. 세포내 재조합 방법은 초기에는 사카로마이세스 세레비시애에서 벡터에 외래 유전자를 클로닝하거나 염색체상의 원하는 유전자를 결손시키기 위하여 개발되었는데 최근에 이르러서는 라이브러리 제조 방법으로도 응용되고 있다(Oldenburg 등, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 451; Abecassis 등, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e88). 세포내 재조합이란 삽입절편 단독으로 혹은 삽입절편과 수용절편을 함께 형질 전환에 이용하는 것이며, 각 삽입절편은 양 말단에 염색체, 혹은 수용절편과 상동성을 갖는 서열을 포함하고 있어, 삽입절편이 세포 내로 형질전환된 후에 세포내 재조합에 의하여 염색체 혹은 수용절편으로 삽입되는 방법을 말한다. 이 방법을 이용하여 라이브러리를 제조할 경우, 다양한 삽입절편의 양 말단에 상동성 서열을 삽입하면 원하는 위치로 유전자의 삽입이 가능하게 되어 대장균을 이용하지 않고도 라이브러리를 용이하게 만들 수 있다는 장점이 있다. 또한, 최근 분자진화 변이 유도 방법은 대부분 중합효소연쇄 반응을 이용하고 있기 때문에 프라이머로 사용되는 부위에 30 bp 이상의 상동성 서열을 첨가할 경우 충분한 세포내 재조합을 일으킬 수 있어 더욱 이용 가능성이 높아지고 있다.The present inventors developed a system using an intracellular recombination method while experimenting with various systems to overcome the disadvantages of the prior art in preparing a library. Intracellular recombination methods were initially developed in Saccharomyces cerevisiae to clone a foreign gene into a vector or to delete a desired gene on a chromosome. Recently, it has also been applied as a library preparation method (Oldenburg et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 451; Abecassis et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28, e88). Intracellular recombination refers to the use of an insertion fragment alone or an insertion fragment and a receptor fragment together for transformation. Each insertion fragment contains a sequence having homology with a chromosome or a receptor fragment at both ends, and the insertion fragment is inserted into a cell. Refers to a method of insertion into a chromosome or a receptor fragment by intracellular recombination after transformation. When the library is prepared using this method, the insertion of homologous sequences at both ends of various insertion fragments enables the insertion of genes into desired positions, thereby making the library easier to use without using E. coli. In addition, in recent years, since the method of inducing molecular evolution mutations mostly uses a polymerase chain reaction, adding more than 30 bp of homology to the site used as a primer may cause sufficient intracellular recombination, thereby increasing its availability.

본 발명자들은 높은 형질전환 효율 및 균일한 카피수를 가지는 라이브러리 제조방법을 개발하기 위하여, 한세눌라 폴리모르파의 발현벡터를 다양하게 절단하여 형질전환한 결과 HARS36 서열이 말단에 노출된 DNA 절편을 제조하여 형질전환할 경우 원형 벡터를 이용한 경우보다 7 내지 10배 더 높은 형질전환 효율을 보인다는 것을 확인하였고(표 1 참조), 또한 HARS36 서열을 순차적으로 절단하여 실험한 결과 삽입절편에서 100 bp의 HARS36 서열(5' 말단으로부터 1 bp 내지 100 bp의 부분)만을 이용할 경우 HARS36 전체를 이용한 경우와 동일한 효율의 형질전환율을 보이는 반면 유전자 도입은 염색체 내에 단일카피로 균일하게 도입된다는 사실을 발견하였다(도 4 및 도 5 참조). 따라서, 이 방법을 이용하여 리파제 변이 라이브러리를 제조하고 그 특성을 분석함으로써 충분한 변이 다양성을 지닌 라이브러리가 제조됨을 확인하였으며, 여러 개의 삽입절편을 사용할 경우 다양한 유전자를 복합시키는 추가 변이 유도가 가능하다는 것을 확인하였다.In order to develop a method for producing a library having high transformation efficiency and uniform copy number, the present inventors prepared DNA fragments in which the HARS36 sequence was exposed at the end as a result of various cleavage of the expression vectors of Hanshenula polymorpha. By transforming to a 7 to 10 times higher transformation efficiency than when using a circular vector (see Table 1). Also, the HARS36 sequence was sequentially cut and tested as a result of 100 bp HARS36 insertion fragment. It was found that using only the sequence (parts from 1 bp to 100 bp from the 5 'end) showed the same efficiency of transformation as when using the entire HARS36, whereas the gene introduction was uniformly introduced in a single copy into the chromosome (FIG. 4). And FIG. 5). Therefore, by using this method to prepare and characterize the lipase mutation library, it was confirmed that a library with sufficient variation diversity was produced, and that the use of multiple insertion fragments could induce additional mutations incorporating various genes. It was.

최근 사카로마이세스 세레비시애에서는 세포내 재조합을 이용하여 클로닝하는 방법 및 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 특허가 출원된 바 있으나(US6410271, FR2810339, US5783385), 효모 한세눌라 폴리모르파에서는 세포내 재조합을 이용한 예가 보고된 바 없다. 또한, 본 발명과 사카로마이세스 세레비시애를 이용하는 상기 특허의 방법을 비교하였을 때 삽입절편의 한쪽 혹은 양쪽 말단에 상동성 서열이 요구되는 공통점을 가지지만, 본 발명에서는 한세눌라 폴리모르파의 특정 염기 서열인 HARS36을 상동성 서열로 사용하고 있다는 점에서 상기 특허와 차이점을 가지고 있다. 또한, 상기 종래 발명에서는 일반적으로 수용절편과 재조합을 하여 원형벡터를 구성하는데 반하여, 본 발명에서는 도입된 DNA 절편이 세포 내 염색체로 직접 삽입된다는 점에서 상기 특허와 차별화된다. 더 나아가, 본 발명의 경우에는 삽입절편과 수용절편이 한쪽 말단에서만 상동성을 가지고 있어 원형 프라스미드가 생성되지 않으며, 염색체의 단일 위치에 단일 카피로 삽입되어 보다 균일하고 응용 가능성이 높은 라이브러리를 구축할 수 있다는 면에서 종래의 특허에 비하여 장점을 가진다.Recently, a patent for a method of cloning using intracellular recombination and a method for preparing a library has been filed in Saccharomyces cerevisiae (US6410271, FR2810339, US5783385), but in intracellular recombination in yeast Hanshenula polymorpha No examples have been reported. In addition, when comparing the present invention with the method of the patent using Saccharomyces cerevisiae, the homologous sequence is required at one or both ends of the insertion fragment, but in the present invention, HARS36 which is a specific nucleotide sequence It is different from the above patent in that it is used as a homologous sequence. In addition, in the above-mentioned conventional invention, in general, the recombinant fragment and the recombination construct a circular vector, whereas in the present invention, the introduced DNA fragment is differentiated from the patent in that it is directly inserted into the intracellular chromosome. Furthermore, in the case of the present invention, the insertion fragment and the receptor fragment have homology only at one end thereof, so that a circular plasmid is not generated, and a single copy is inserted into a single position on a chromosome to construct a more uniform and highly applicable library. It has an advantage over the conventional patent in that it can be.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 유전자 라이브러리를 제공한다.The present invention also provides a gene library prepared by the above method.

본 발명의 유전자 라이브러리는 상기 방법에 의해 제조될 수 있으며, 유전체(genome) DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리 혹은 분자진화를 통한 변이 유전자의 라이브러리의 형태로 제조될 수 있다. 통상의 라이브러리가 대장균을 숙주세포로 제조되고 그 이후에 효모로 형질전환 되어 라이브러리의 다양성이 감소하는데 반해, 본 발명의 라이브러리는 효모인 한세눌라 폴리모르파에서 직접 제조되기 때문에 그 다양성이 훨씬 높다는 데 그 특징이 있다. 상기 숙주세포는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 또는 한세눌라 폴리모르파 A16 균주를 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.The gene library of the present invention may be prepared by the above method, and may be prepared in the form of a genome DNA library or a cDNA library or a library of variant genes through molecular evolution. Whereas conventional libraries are produced from E. coli as host cells and subsequently transformed into yeast, the diversity of the library is reduced, while the library of the present invention is produced directly from the yeast Hanshenula polymorpha, so the diversity is much higher. It has its features. The host cell is preferably used Hansenula polymorpha DL1-L or Hansenula polymorpha A16 strain, but is not necessarily limited thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 형질전환벡터의 제조 및 형질전환체의 선별Example 1 Preparation of Transformation Vector and Selection of Transformant

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파에서 세포내 재조합 실험을 위해 pGK-CALB*및 pGK-CALB-CwpF를 사용하였다(도 1, 대한민국 특허출원 제2002-55575호 참조). pGK-CALB* 벡터는 GAPDH 프로모터 하에서 리파제를 세포 외로 분비, 발현시키는 벡터이며, pGK-CALB-CwpF 벡터는 동일한 프로모터 하에서 리파제를 세포표면에 발현시키는 벡터이다(도 1). 상기 발현 벡터는 AMIpL1를 주형으로 하여 제조되었으며, 형질전환의 지표로 사용하기 위한 선택표지유전자인 HLEU2 유전자, 대장균에서 벡터를 이용하기 위한 대장균의 ori 및 암피실린 내성 유전자, 한세눌라 폴리모르파에서 벡터의 유지 및 염색체로의 삽입을 위한 HARS36 서열을 포함하고 있다(Agaphonov 등, Yeast, 1999, 15, 541).We used pGK-CALB * and pGK-CALB-CwpF for intracellular recombination experiments in Hanshenula polymorpha (see FIG. 1, Korean Patent Application No. 2002-55575). The pGK-CALB * vector is a vector that secretes and expresses lipases out of the cell under the GAPDH promoter, and the pGK-CALB-CwpF vector is a vector which expresses lipase on the cell surface under the same promoter (FIG. 1). The expression vector was prepared using AMIpL1 as a template, the HLEU2 gene, which is a selection marker gene for use as an indicator of transformation, E. coli ori and ampicillin resistance gene for use of the vector in E. coli, and HARS36 sequences for maintenance and insertion into chromosomes (Agaphonov et al., Yeast , 1999, 15, 541).

상기한 각각의 벡터를 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환(Hill 등, Nucl. Acids. Res., 1991, 19, 5971)한 후 최소배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질 및 2% 포도당)에서 형질전환체를 선별하였다. 이어서 1% 트리뷰티린을 포함한 YPD 평판 배지(1% 효모 추출액, 2% 펩톤 및 2% 포도당)에 옮겨 균주 주변의 환의 크기를 측정함으로써 형질전환체의 리파제 활성을 확인하였다.Each vector described above was transformed to Hanshenula polymorpha DL1-L strain using the Li / TE method (Hill et al. , Nucl. Acids. Res ., 1991, 19, 5971) and minimal medium (0.67% amino acid). Transformants were selected from this deficient yeast substrate and 2% glucose). The lipase activity of the transformants was then confirmed by transferring the YPD plate medium (1% yeast extract, 2% peptone and 2% glucose) containing 1% tributyrin to measure the size of the ring around the strain.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 pGK-CALB* 벡터를 가진 균주는 리파제가 세포 주위로 분비되어 주위에 큰 활성환을 보이는 반면, pGK-CALB-CwpF 벡터를 가지는 균주는 리파제가 세포의 표면에 발현되기 때문에 작고 강한 활성환을 나타내었다. 상기의 결과로부터 리파제가 표면 발현 벡터에 의해 분비가 억제되고 세포의 표면에 존재함을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 2, the strain having the pGK-CALB * vector secreted lipase around the cell and exhibited a large active ring around the cell, whereas the strain having the pGK-CALB-CwpF vector had a lipase on the surface of the cell. Because it is expressed, it showed a small and strong active ring. From the above results, it was confirmed that the lipase was inhibited by the surface expression vector and present on the surface of the cell.

<실시예 2><Example 2> 효소절단으로 얻은 삽입절편을 이용한 세포내 재조합Intracellular Recombination Using Insertion Section Obtained by Enzyme Cleavage

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파에서 높은 형질전환 효율을 가지는 라이브러리 구축방법을 개발하기 위하여, 리파제를 표면발현하는 벡터인 pGK-CALB-CwpF를 이용하여 다양한 세포내 재조합 방법을 실험하였다. pGK-CALB-CwpF는 도 3에서 보는 바와 같이 다양한 효소 조합으로 절단하고 젤에서 정제 회수한 후 각각 100 ng 씩 형질전환에 이용하였다.The present inventors experimented with various intracellular recombination methods using pGK-CALB-CwpF, a vector expressing lipase, to develop a library construction method having high transformation efficiency in Hanshenula polymorpha. pGK-CALB-CwpF was digested with various enzyme combinations as shown in FIG. 3, purified and recovered from gels, and then used for transformation by 100 ng each.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 자기복제서열 HARS36을 포함한 원형벡터의 한 부위가 절단된 선형벡터(SphI)를 이용한 경우, 원래의 원형벡터를 그냥 이용한 경우(pGK-CALB-CwpF)보다 오히려 형질전환 효율이 조금 증가한 것을 확인하였다(도 3의 A 및 표 1의 1, 2). 상기 결과는 일반적으로 효모에서 선형벡터를 이용할 경우에는 원형벡터를 이용한 경우보다 형질전환효율이 현저히 낮은 것을 고려할 때 매우 특이한 결과이다. 특히 HARS36 서열 부위가 말단에 노출되어 있는 두개의 DNA 절편을 동시에 형질전환할 경우(도 3의 C, 표 1의 4.), 원형 벡터를 이용한 경우에 비하여 7배 이상 높은 형질전환 효율을 보였다. 그러나 HARS36 서열이 말단에 노출되지 않은 수용절편과 HARS36 서열을 포함하지 않는 삽입절편을 형질전환한 경우에는 오히려 형질전환효율이 감소하였는데(도 3의 B, 표 1의 3), 이는 HARS36 서열이 말단에 노출될 경우 원형벡터보다 용이하게 염색체에 삽입될 수 있기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 각 형질전환체의 리파제 활성을 조사한 결과 표 1의 4와 같이 HARS36 서열 부위가 말단에 노출되어 있는 두개의 DNA 절편을 동시에 형질전환한 경우 모든 형질전환체에서 리파제 활성이 나타나므로, 두 개의 DNA 절편이 세포 내에서 제대로 재조합되고 염색체로 삽입되어 단백질을 발현할 수 있는 구조를 형성함을 확인할 수 있었다. 상기의 결과로부터 한세눌라 폴리모르파 균주에서 세포내 재조합이 효율적으로 일어남을 확인하였으며, 또한 각 절편의 말단에 존재하는 HARS36 서열 부위를 이용할 경우 특이적으로 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Table 1, when a portion of the circular vector including the self-replicating sequence HARS36 was used as the cut linear vector ( Sph I), rather than using the original circular vector (pGK-CALB-CwpF), It was confirmed that the transformation efficiency slightly increased (A of FIG. 3 and 1, 2 of Table 1). In general, the result is a very unusual result considering that the use of a linear vector in yeast significantly lower transformation efficiency than when using a circular vector. In particular the HARS36 sequence When two DNA fragments exposed at the ends of the site were simultaneously transformed (C of FIG. 3, 4. in Table 1), the transformation efficiency was 7 times higher than that of the circular vector. However HARS36 sequence in this case a transformation of insertion that does not include the receiving segment and HARS36 sequence that is not exposed to the distal fragment has a rather transfection efficiency were reduced (three of B, Table 1 in Fig. 3), which HARS36 sequence is terminated It is believed that this is because it can be inserted into the chromosome more easily than the circular vector when exposed to. In addition, as a result of examining the lipase activity of each transformant, as shown in Table 4, when two DNA fragments exposed at the ends of the HARS36 sequence site were simultaneously transformed, the lipase activity was observed in all transformants. DNA fragments were properly recombined within the cell and inserted into the chromosome to form a structure that can express the protein was confirmed. From the above results, it was confirmed that intracellular recombination occurred efficiently in Hanshenula polymorpha strain, and also HARS36 sequence present at the end of each fragment. When using the site it was confirmed that a particularly high transformation efficiency can be obtained.

다양한 DNA 절편을 이용한 세포내 재조합 형질전환 효율Intracellular Recombinant Transformation Efficiency Using Various DNA Segments 구조rescue 형질전환체 수/㎍ DNATransformant Count / μg DNA 활성을 보이는 균주(%)Strains showing activity (%) 1. 원형 pGK-CALB-CwpF (6.5kb)  1.round pGK-CALB-CwpF (6.5kb) 29202920 94.494.4 2.SphI (6.5kb)2. Sph I (6.5kb) 38603860 95.295.2 3. ClaI/XhoI(3.1kb) +BamHI/SmaI(5.0kb) Cla I / Xho I (3.1 kb) + Bam HI / Sma I (5.0 kb) 24802480 85.785.7 4. SmaI/PstI(3.5kb) + SphI/XhoI (4.0kb)4.SmaI / Pst I (3.5kb) + Sph I / Xho I (4.0kb) 2104021040 100100

<실시예 3> 중합효소연쇄반응을 통해 얻은 삽입절편을 이용한 세포내 재조합Example 3 Intracellular Recombination Using Insertion Sections Obtained by Polymerase Chain Reaction

본 발명자들은 중합효소연쇄반응을 통해 분자진화한 유전자 라이브러리를 대장균을 거치지 않고 직접 효모 세포 내에서 효율적으로 구축할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 중합효소연쇄반응을 통해 얻은 삽입절편을 이용하여 세포내 재조합 방법을 실험하였다. 상기 실험에 사용할 삽입절편을 획득하기 위하여, pGK-CALB-CwpF 벡터를 주형으로 하고, 리파제 유전자, 세포벽 부착단백질인 CwpF 및 HARS36 부위를 포함하도록 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 두 개의 프라이머 GPD-err과 HARS-err를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 상기 중합효소연쇄반응은 PCR 프리믹스 키트(바이오니어사, 한국)를 이용하여 수행하였으며, 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 수행하여 삽입절편을 획득하였다(도 4의 B). 상기 획득한 삽입절편과 함께 세포내 재조합 실험에 이용할 수용절편으로는 ClaI/PstI로 처리된 pBSK(+)(Stratagene, 미국) 벡터 내에 pGK-CALB*의 PstI/ClaI 절편을 삽입하여 제조된 pHARS-CALB-SK(도 4의 A)를 다시 EcoRI/BamHI으로 절단한 후 약 5 kb 절편을 회수하여 사용하였다(도 4의 B).In order to develop a method for efficiently constructing a gene library that has been molecularly evolved through a polymerase chain reaction directly in yeast cells without passing through Escherichia coli, the present inventors have introduced intracellular intracellular cells using insertion fragments obtained through polymerase chain reaction. Recombinant methods were tested. In order to obtain the insert for use in the experiment, two primers GPD described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 with the pGK-CALB-CwpF vector as a template and containing the lipase gene, CwpF and HARS36 sites, which are cell wall attachment proteins Polymerase chain reaction was performed using -err and HARS-err. The polymerase chain reaction was performed using a PCR premix kit (Bioneer, Korea), and reacted at 94 ° C. for 3 minutes, 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C., and 1 minute at 72 ° C. After performing a round, it was carried out under the conditions of reacting for 7 minutes at 72 ℃ to obtain an insertion section (B of Figure 4). Receptor fragments to be used for intracellular recombination experiments with the obtained inserts were inserted into the Pst I / Cla I fragment of pGK-CALB * in pBSK (+) (Stratagene, USA) vector treated with Cla I / Pst I The prepared pHARS-CALB-SK (A of FIG. 4) was again cut into Eco RI / Bam HI, and about 5 kb fragments were recovered and used (B of FIG. 4).

상기 삽입절편과 수용절편을 각각 100 ng씩 섞어 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환한 결과, ㎍ DNA당 약 3.4×10⁴ 개의 형질전환체를 용이하게 획득할 수 있었다. 또한, 상기 실험에서 획득된 형질전환체 중에서 무작위로 선별된 모든 형질전환체에서 리파제 활성이 확인되므로 중합효소연쇄반응을 통하여 얻은 삽입절편이 수용절편과 효과적으로 재조합되어 리파제 유전자가 발현되었음을 알 수 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 방법을 이용할 경우 중합효소연쇄반응을 통해 분자진화한 유전자 라이브러리를 대장균을 거치지 않고 직접 효모 세포 내에서 효율적으로 구축가능하다는 것을 확인하였다.As a result of mixing 100 ng of each of the inserted fragments and the receptor fragments and transforming them into Hanshenula polymorpha strain, about 3.4 × 10 ⁴ transformants per μg DNA could be easily obtained. In addition, since the lipase activity was confirmed in all transformants randomly selected from the transformants obtained in the above experiment, it was found that the insertion fragment obtained through the polymerase chain reaction was effectively recombined with the receptor fragment to express the lipase gene. From the above results, it was confirmed that when the method of the present invention is used, the gene library molecularly evolved through polymerase chain reaction can be efficiently constructed directly in yeast cells without passing through E. coli.

<실시예 4> <Example 4> HARS36HARS36 서열을 포함하는 삽입절편의 최적화 Optimization of Insertion Segments Containing Sequences

상기한 결과에서 한세눌라 폴리모르파에서 HARS36 서열의 상동성을 이용할 경우 높은 효율로 세포내 재조합이 가능함을 확인하였으나 HARS36서열이 세포 내에서 원형벡터로 존재할 경우 비교적 안정하여 유전체 말단으로 다수의 카피로 도입되는 특성이 있기 때문에(Sohn 등, Appl. Envrion. Microbiol. 51, 800, 1999), 상기 방법을 사용할 경우에도 세포내 재조합에 의해 원형 벡터가 만들어질 경우 다수 카피가 도입될 가능성이 높다. 이는 단백질 고발현 균주개발을 위해서는 바람직하나 단백질 변이 라이브러리 제조와 스크리닝을 위해서는 각 형질전환체간의 유전자 카피 수 편차가 없어야 한다는 점에서는 문제점으로 작용할 수 있다. 또한, 세포내 재조합에 이용되는 삽입절편의 길이가 길어질 경우 중합효소연쇄반응을 이용한 변이 도입에도 문제가 유발될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 삽입절편에 포함시키는 HARS36의 서열의 크기를 최적화하여 높은 효율로 형질전환됨과 동시에 형질전환에 사용한 외래 유전자가 대부분 단일 카피로 숙주세포의 염색체에 도입되어 발현 단백질의 활성을 이용한 스크리닝이 가능한 균질한 형태의 라이브러리를 구축할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.In the above results, it was confirmed that intracellular recombination is possible with high efficiency when using the homology of HARS36 sequence in Hanshenula polymorpha . Since there is a property to be introduced (Sohn et al. , Appl. Envrion. Microbiol. 51, 800, 1999), even when the above method is used, a large number of copies are likely to be introduced when a circular vector is produced by intracellular recombination. This is desirable for the development of high protein expression strains, but may be a problem in that there should be no variation in the number of gene copies between each transformant for the production and screening of protein mutant libraries. In addition, when the length of the insertion fragment used for intracellular recombination is prolonged, problems may also arise in introducing mutations using polymerase chain reaction. Therefore, the present inventors have optimized the size of the HARS36 sequence to be included in the insertion fragment and transformed it with high efficiency, and at the same time, the foreign genes used for transformation were introduced into the chromosome of the host cell in a single copy and screened using the activity of the expressed protein. We wanted to develop a way to build this possible homogeneous library.

HARS36 서열은 한세눌라 염색체의 말단에서 유래되며 자기복제를 위해서 세 개의 중요 부위로 구성되어 있는데, 앞쪽에 존재하는 벤트 DNA(BD)는 자기복제를 위해 필요한 효소의 인식과 결합을 용이하게 하는 것으로 추정되고, 두 번째 부위에 존재하는 ARS 도메인(ARS)은 자기복제능력이 있어 원형벡터에 존재할 경우 원형 벡터를 염색체 외부에 독립적으로 존재하도록 할 수 있으며, 세 번째 부위의 말단 반복 서열 도메인(Rep)은 서열(5'-GGGTGGCG-3')이 18-23번 반복되어 있어 염색체 말단과 높은 효율의 상동성 재조합을 일으키는 것으로 보고되었다. 이러한 HARS36 서열 각각의 부위를 다양한 길이로 포함하는 삽입절편을 합성하기 위하여 표 2와 같은 프라이머를 제작하였다. The HARS36 sequence is derived from the end of the Hansenula chromosome and consists of three important sites for self-replication. The vent DNA (BD) in the front is believed to facilitate the recognition and binding of the enzyme required for self-replication. In addition, the ARS domain (ARS) present in the second site is capable of self-replicating so that when present in the circular vector, the circular vector can exist independently of the chromosome, and the terminal repeat sequence domain (Rep) of the third site is The sequence (5'-GGGTGGCG-3 ') has been reported to be repeated 18-23 times, resulting in high efficiency homologous recombination with the chromosome ends. Primers as shown in Table 2 were prepared in order to synthesize the insertion fragments each containing a region of each HARS36 sequence in various lengths.

세포내 재조합 반응에 사용되는 삽입절편의 합성을 위한 프라이머Primers for the synthesis of insertion fragments used for intracellular recombination reactions 프라이머primer 염기서열Sequence 부착부위*Attachment area * 비고Remarks GPD-errGPD-err 5'-GCAGAGCTAACCAATAAGG-3'5'-GCAGAGCTAACCAATAAGG-3 ' 서열번호 2SEQ ID NO: 2 HARS-errHARS-err 5'-GTTGGCAATGTTGTACCCGATGATC-3'5'-GTTGGCAATGTTGTACCCGATGATC-3 ' 601-625601-625 서열번호 3SEQ ID NO: 3 A-0A-0 5'-TCAGACCGCATCCTAAAACC-3'5'-TCAGACCGCATCCTAAAACC-3 ' 446-454446-454 서열번호 4SEQ ID NO: 4 A-1A-1 5'-CGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3'5'-CGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3 ' 446-462446-462 서열번호 5SEQ ID NO: 5 A-2A-2 5'-CGCCACCCCGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3'5'-CGCCACCCCGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3 ' 446-470446-470 서열번호 6SEQ ID NO: 6 A-3A-3 5'-CGCCACCCCGCCACCCCGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3'5'-CGCCACCCCGCCACCCCGCCACCCTCAGACCGCATCCTAAAACC-3 ' 446-478446-478 서열번호 7SEQ ID NO: 7 T-0T-0 5'-TGCAGTTGAACACAACCAC-3'5'-TGCAGTTGAACACAACCAC-3 ' 132-150132-150 서열번호 8SEQ ID NO: 8 T-1T-1 5'-CGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3'5'-CGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3 ' 132-150132-150 서열번호 9SEQ ID NO: 9 T-2T-2 5'-CGCCACCCCGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3'5'-CGCCACCCCGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3 ' 132-150132-150 서열번호 10SEQ ID NO: 10 T-3T-3 5'-CGCCACCCCGCCACCCCGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3'5'-CGCCACCCCGCCACCCCGCCACCCTGCAGTTGAACACAACCAC-3 ' 132-150132-150 서열번호 11SEQ ID NO: 11 HARS100HARS100 5'-GCCTTCGTACACCTTGCTG-3'5'-GCCTTCGTACACCTTGCTG-3 ' 80-9880-98 서열번호 12SEQ ID NO: 12 HARS40HARS40 5'-CGTCTCCACAGCACCAGGG-3'5'-CGTCTCCACAGCACCAGGG-3 ' 22-3922-39 서열번호 13SEQ ID NO: 13 Term2Term2 5'-GAGGTCGATCTAAGGAGTC-3'5'-GAGGTCGATCTAAGGAGTC-3 ' -1 - -19-1--19 서열번호 14SEQ ID NO: 14 Term1Term1 5'-AATCAGAGGCGGTGTGTGC-3'5'-AATCAGAGGCGGTGTGTGC-3 ' -164 - -182-164--182 서열번호 15SEQ ID NO: 15

* 부착 부위는 HARS36 서열 시작 부위로부터의 거리를 나타낸다.* Attachment site represents distance from HARS36 sequence start site.

서열번호 3으로 기재되는 HARS-err의 경우 전체 HARS36 서열 부위를 모두 포함하도록 되어 있으며, 서열번호 4 내지 7의 A-0, 1, 2, 3의 경우에는 HARS36 서열의 말단반복서열을 제외한 부분을 포함하고 추가로 말단 반복서열을 0, 1, 2, 3 개 더 포함하는 구조로 되어있다. 서열번호 8 내지 11의 T-0, 1, 2, 3의 경우 말단 반복 서열, ARS core 및 벤트 DNA를 모두 제거한 부분(C)만이 포함되어 있는데 여기에 추가로 말단 반복 서열을 0, 1, 2, 3개 더 포함시킨 T-0, 1, 2, 3을 제조하였다. 상기 (C)부위는 염색체 말단주변에 존재하는 서열로 특별한 기능이 알려지지 않은 부위이다.HARS-err described in SEQ ID NO: 3 is to include all HARS36 sequence sites, and in the case of A-0, 1, 2, and 3 of SEQ ID NOs: 4 to 7, except for the terminal repeating sequence of HARS36 sequence And further comprising 0, 1, 2, 3 further terminal repeat sequences. T-0, 1, 2, and 3 of SEQ ID NOS: 8 to 11 include only the terminal (C) from which all of the terminal repeating sequence, ARS core, and vent DNA were removed. , T-0, 1, 2, 3 containing three more were prepared. The (C) region is a sequence existing around the chromosome end and is a region whose special function is unknown.

각 프라이머와 GPD-err 프라이머를 이용하여 pGK-CALB-CwpF 벡터를 주형으로 하고, PCR 프리믹스 키트(바이오니아, 한국)를 사용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 삽입절편을 획득하였다. 수용절편은 pHARS-CALB-SK 벡터를 BamHI/EcoRI으로 절단한 후 5 kb의 절편을 회수하여 획득하였으며, 상기에서 획득한 다양한 크기의 삽입절편과 수용절편을 100 ng씩 섞어 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환하고 그 효율을 비교하였다(도 5 참조).PGK-CALB-CwpF vector as a template using each primer and GPD-err primers, and reacted for 3 minutes at 94 ℃ using a PCR premix kit (Bionia, Korea), 30 seconds at 94 ℃, 30 at 55 ℃ For 1 second, the reaction was performed 25 times for 1 minute at 72 ° C., and polymerase chain reaction was performed under the condition of reacting at 72 ° C. for 7 minutes to obtain an insertion fragment. Receptor fragments were obtained by cutting the pHARS-CALB-SK vector with Bam HI / Eco RI and recovering 5 kb fragments. The wave strain was transformed and its efficiency was compared (see FIG. 5).

그 결과, A-절편과 T-절편을 이용한 모든 경우에 있어서 HARS36 서열의 전체부위를 이용한 경우와 비교하였을 때 형질전환 효율에서 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 각각 말단 반복 서열이 있는 경우와 없는 경우 약간의 효율 증가를 나타냈으나 큰 차이를 보이지 않음을 확인하였다(도 5).As a result, in all cases using the A- and T-fragments, there was no significant difference in the transformation efficiency when compared to the case using the entire region of the HARS36 sequence. In addition, there was a slight increase in efficiency with and without the terminal repeat sequence, respectively, but did not show a big difference (Fig. 5).

따라서, 본 발명자들은 서열을 추가적으로 줄이기 위해서 5 개의 프라이머를 제조하였다(표 2 참조). HARS36 서열에서 말단 반복 서열, ARS core 및 벤트 DNA를 모두 제거한 부분인 (C)부위의 일부를 100 bp 포함하는 HARS100과 40 bp 포함하는 HARS40 외에도 터미네이터 서열 부위를 전부 포함한 Term2 및, 터미테이터 서열 부위 중 100 bp만을 포함한 Term1 프라이머, 리파제 유전자의 카르복시말단까지만을 포함한 CalBF 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 중합효소연쇄반응 조건을 이용하여 삽입절편을 제조하고, 제조된 상기 삽입절편을 이용하여 형질전환 효율을 조사하였다.Thus, we added the sequence Five primers were prepared to reduce (see Table 2). Term2 including all terminator sequence sites in addition to HARS100 including 40 bp and 100 bp of part of part (C) which is a portion from which the terminal repeat sequence, ARS core and vent DNA were removed from the HARS36 sequence, and among terminator sequence sites Using the Term1 primer containing only 100 bp and CalBF primer containing only the carboxy terminus of the lipase gene, an insertion fragment was prepared using the same polymerase chain reaction conditions as above, and the transformation efficiency was investigated using the prepared fragment. It was.

그 결과, HARS100의 경우에는 HARS-err이나 A-절편 및 T-절편과 큰 차이가 없지만, HARS40을 이용한 삽입절편에서는 효율이 급격히 감소하였고, 그 외의 절편의 경우 삽입 절편 없이 수용 절편만을 이용하여 형질전환한 경우와 큰 차이가 없었다(도 5). 상기 결과로부터 세포내 재조합이 효율적으로 일어나기 위해서는 수용절편의 한쪽 말단에는 HARS36 3'-말단 중 벤트 DNA 부분(151 bp-600 bp)이 포함되는 것이 바람직하며, 삽입절편의 한쪽 말단에는 적어도 100 bp 이상의 HARS36 서열(1 bp-100 bp)이 필요함을 알 수 있으며, 이 경우 원형벡터에 비하여 약 10배 이상 높은 형질전환 효율이 있음을 확인하였다.As a result, in the case of HARS100, there is no significant difference between HARS-err, A-fragment, and T-fragment, but in the insertion fragment using HARS40, the efficiency was drastically reduced. There was no significant difference from the switched case (FIG. 5). In order to efficiently perform intracellular recombination from the above results, it is preferable that a vent DNA portion (151 bp-600 bp) of the HARS36 3'-end is included at one end of the receptor fragment, and at least 100 bp or more at one end of the insertion fragment. It can be seen that HARS36 sequence (1 bp-100 bp) is required, in this case it was confirmed that the transformation efficiency is about 10 times higher than the circular vector.

상기의 방법으로 획득한 형질전환 균주, 특히 삽입절편 T-0를 이용한 형질전환체를 무작위로 선별하여 리파제 활성과 유전자 도입 카피수를 조사하였다. 형질 전환균주를 1% 트리뷰티린을 포함한 YPD 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 활성환을 관찰한 결과, 삽입절편 T-0를 이용한 경우 원형벡터를 형질전환한 경우에 비하여 상당히 균일한 활성환을 나타냄을 확인하였다(도 6의 B). 또한 유전자 도입 카피수를 조사하기 위하여 서던 블롯을 시행하였다. 구체적으로, 형질 전환 균주를 YPD 배지를 이용하여 37℃에서 18시간 배양한 후 회수하여 염색체를 수득하였다. 상기 수득한 염색체를 EcoRⅠ 혹은 SacⅡ 제한 효소를 이용하여 절단한 후 0.8% 아가로스 젤에 전기영동하고 이를 니트란(Nytran) 멤브레인에 블롯팅하였다. 프로브(probe)로는 DIG-표지 키트(DIG-labelling kit)(Roche, 미국)를 이용하여 표지한 CALB 유전자를 사용하였다. 상기 멤브레인을 50% 포름아마이드 솔루션을 42℃에서 하룻밤 동안 처리하고, 이어 알카라인 포스파타제가 융합된 항-DIG 항체를 반응시킨 후 NBT 및 BCIP를 이용하여 발색한 결과, 확인한 EcoRⅠ으로 절단된 모든 염색체에서 단일 밴드가 나타남을 확인하였다. 상기 결과로부터 대부분의 균주에서 리파제 유전자가 단일카피로 도입되었음을 확인하였다. 또한, SacⅡ를 이용하여 절단한 경우에는 두개의 밴드가 나타나는 것을 확인하였는데, 이는 리파제 유전자가 한가운데 SacⅡ 절단 부위가 있어 두 개의 밴드로 나타남을 알 수 있으며, 상기 밴드들의 크기가 모두 1 kb 미만인 것으로 보아 리파제 유전자가 모두 염색체 말단 부위로 도입되었음을 확인하였다(도 6의 A). 상기 결과들로부터 한쪽 말단에 포함되는 HARS36 길이를 최적화시킨 삽입절편을 이용한 세포내 조합 방법을 통하여 대장균을 이용하지 않고도 용이하게 라이브러리를 구성할 수 있으며, 오히려 원형벡터를 이용한 경우보다 약 10배 이상 높은 효율로 형질전환이 가능하고, 형질전환에 사용한 외래 유전자가 대부분 단일 카피로 염색체에 도입되어 발현 단백질의 활성을 이용한 스크리닝이 가능한 균질한 형태의 라이브러리를 구축할 수 있음을 확인하였다.Transgenic strains obtained by the above method, in particular, transformants using the insert T-0 were randomly selected to investigate the lipase activity and transgenic copy number. Transgenic strains were inoculated in YPD medium containing 1% tributyrin and incubated for 24 hours at 37 ° C. After activating the cells, the insertion fragment T-0 was considerably more uniform than the transgenic vector. It was confirmed that one active ring was shown (B of FIG. 6). In addition, Southern blot was performed to examine the transgenic copy number. Specifically, the transformed strain was recovered after incubating at 37 ° C. for 18 hours using YPD medium to obtain a chromosome. The obtained chromosome was digested with EcoRl or SacII restriction enzymes, followed by electrophoresis on 0.8% agarose gel and blotted onto a Nitran membrane. As a probe, a CALB gene labeled using a DIG-labelling kit (Roche, USA) was used. Single the membrane in a 50% formamide solution was treated overnight at 42 ℃ and, after alkaline phosphatase reaction is an anti-antibody fusion -DIG After color development using NBT and BCIP, check all the chromosomes cut EcoRⅠ It was confirmed that the band appeared. From the above results, it was confirmed that the lipase gene was introduced in a single copy in most strains. In addition, it was confirmed that two bands appeared in the case of cleavage using SacII , which indicates that the lipase gene is present in two bands because there is a SacII cleavage site in the middle. It was confirmed that all of the lipase genes were introduced into the chromosomal end region (FIG. 6A). From the above results, the library can be easily constructed without using E. coli through an intracellular combination method using an optimized insertion length of HARS36 included at one end, and is about 10 times higher than using a circular vector. Efficient transformation was possible, and the foreign genes used for transformation were mostly introduced into the chromosome in a single copy to construct a homogeneous library capable of screening using the activity of the expressed protein.

<실시예 5> 변이유도된 리파제 유전자 라이브러리 제조 Example 5 Mutation-Induced Lipase Gene Library Preparation

상기의 세포내 재조합 방법을 이용한 리파제의 변이주 라이브러리를 제조하기 위하여 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법으로 유전자에 변이를 도입하고, 변이가 도입된 삽입절편을 이용하여 수용절편과 함께 형질전환시켜 라이브러리를 제조하였다(도 7 참조). 구체적으로, 리파제를 표면에 발현하는 벡터인 pGK-CALB-CwpF를 주형으로 하여 상기 GPD-err 및 T-0의 프라이머를 사용하여 변이유도 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이러한 변이유도 중합효소연쇄반응은 PCR 랜덤 변이유도 키트(클론텍 사, 미국)를 이용하여 제조사의 방침에 따라 1 kb 당 2 내지 5 개의 염기 변이를 유도하였으며, 얻어진 DNA 절편은 젤에서 해당 크기의 절편을 절단하여 회수한 후 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하여 동일한 프라이머로 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 증폭시켰다. 상기의 방법으로 얻어진 삽입절편과 pHARS-CALB-SK를 EcoRI/BamHI으로 절단하여 얻어진 약 5 kb 수용절편을 각각 100 ng씩 혼합하여 한세눌라 폴리모르파 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였다.In order to prepare a mutant library of lipase using the intracellular recombination method, mutations were introduced into the gene by an error-prone PCR method, and together with the acceptor fragments using the inserted insertion fragments. The library was prepared by transformation (see FIG. 7). Specifically, the mutation-induced polymerase chain reaction was performed using the primers of GPD-err and T-0 using pGK-CALB-CwpF, which is a vector expressing lipase, as a template. This mutagenesis polymerase chain reaction induced 2 to 5 base mutations per 1 kb according to the manufacturer's policy using a PCR random mutagenesis kit (Clontech, USA). After cutting and recovering the sections, using a PCR premix kit (Bionia, Korea) using the same primer for 3 minutes at 94 ℃, 30 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 55 ℃, 1 minute at 72 ℃ 25 It was amplified under the condition of performing twice and reacting for 7 minutes at 72 ° C. 100 ng of each of the inserted fragments obtained by the above method and the pHARS-CALB-SK obtained by cutting with Eco RI / Bam HI were mixed by 100 ng. Switched.

그 결과, ㎍ DNA 당 약 1×10⁴ 개의 형질전환 균주를 획득하였다. 상기 결과로부터 변이도입 중합효소연쇄중합반응으로 분자진화한 삽입절편을 효모 균주에 직접 형질전환시킴으로써, 높은 형질전환 효율을 가지는 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다.As a result, about 1 × 10 ⁴ transformation strains were obtained per μg DNA. From the above results, it was confirmed that by directly transforming the inserted fragments molecularly evolved by the mutagenic polymerase chain polymerization reaction into the yeast strain, it was possible to prepare a library having a high transformation efficiency.

<실시예 6><Example 6> 변이주 라이브러리의 변이다양성 분석 Variation Analysis of Mutant Libraries

상기에서 획득한 변이주 라이브러리의 변이다양성을 분석하기 위하여, 실시예 5에서 획득한 형질전환 균주 라이브러리로부터 무작위로 10균주를 선택하여 37℃ YPD 배지에서 18 시간 배양한 후 염색체를 분리하였다. 획득한 염색체를 주형으로 하여 GPD-err과 T-0 프라이머를 이용하여 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)로 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 시행하고 획득한 DNA 절편을 젤로부터 정제하여 염색체 내로 도입된 변이 유전자를 회수하고 염기서열 분석을 시행하였다.In order to analyze the variability of the obtained mutant strain library, 10 strains were randomly selected from the transformed strain library obtained in Example 5, incubated in 37 ° C. YPD medium for 18 hours, and chromosomes were isolated. Using the obtained chromosome as a template, the reaction was carried out at 94 ° C for 3 minutes using a PCR premix kit (Bionia, Korea) using GPD-err and T-0 primer, followed by 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 72 ° C. The reaction was carried out 25 times for 1 minute at and then subjected to polymerase chain reaction for 7 minutes at 72 ° C., and the obtained DNA fragments were purified from the gel to recover the mutated genes introduced into the chromosome and subjected to sequencing.

그 결과, 표 3에서 나타낸 바와 같이 분석된 4.7 kb의 염기서열 중 34 개의 염기가 치환된 것을 확인하였으며, 그 중 전이(transition) 변이가 22 개, 전환(transversion) 변이가 12 개로 나타났다. 또한 각 500 bp 당 5 개의 변이가 일어난 유전자가 3 개, 3개의 변이가 일어난 유전자가 2개, 0, 1, 4, 6, 7개의 변이가 일어난 유전자가 각각 1개로 매우 다양한 유전자 라이브러리가 만들어짐을 확인하였다. 또한 형질전환체를 무작위로 선별하여 리파제 평판활성을 측정한 결과 도 8에서 보는 바와 같이 균주간 리파제 활성이 매우 다양하였다. 이와 같이 세포내 재조합 방법을 통하여 쉽게 변이 다양성을 가진 유전자 라이브러리 제조가 가능하였으며, 각 유전자는 확인한 모든 형질 전환주에서 단일카피로 염색체 내로 도입되었음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that 34 bases of the 4.7 kb sequences analyzed as shown in Table 3 were substituted, and among them, 22 transition variants and 12 translation variants were found. In addition, three genes with five mutations in each 500 bp, two genes with three mutations, and one gene with 0, 1, 4, 6, and 7 mutations each make a very diverse gene library. Confirmed. In addition, as a result of measuring the lipase plate activity by randomly selecting the transformants, as shown in FIG. In this way, the intracellular recombination method was able to easily produce a gene library having a variety of mutations, it was confirmed that each gene was introduced into the chromosome in a single copy in all the transformants identified.

제조된 라이브러리의 리파제 유전자로부터 확인된 변이(4.7 kb)Mutations identified from lipase gene of the prepared library (4.7 kb) 변이transition 변이 형태Variation mode 야생형Wild type TT CC AA GG 전이transition 전환transform 합synthesis TT -- 1111 33 1One 1111 44 1515 CC 66 -- 22 22 66 44 1010 AA 22 -- -- 22 22 22 44 GG 22 -- 33 -- 44 22 55 합synthesis 3434 2222 1212 3434

실시예 7>Example 7 2단계 중합효소연쇄 반응을 이용한 삽입절편 제조 Preparation of Insertion Section Using Two-Step Polymerase Chain Reaction

상기 실시예 6에서 제시된 방법으로 실시예 5에서 획득한 라이브러리의 분석을 시행한 결과, 변이를 유도하고자 하였던 리파제 유전자 외에도 표면발현매개 유전자 부위와 터미네이터 부위까지 변이가 일어났음을 확인할 수 있었다. 라이브러리로부터 큰 활성환을 보인 균주들만을 선별하여 분석한 결과, 도 9에서와 같이 높은 활성을 보인 경우가 다수 있었으나 염기 서열 분석 결과 대부분 표면 발현 매개체 부위에 정지코돈(stop codon)이 생성되거나 프레임 쉬프트(frame shift) 변이의 생성으로 인하여 리파제가 분비되는 경우가 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 원하는 표적발현 유전자에만 변이를 유발하기 위해 2단계 중합효소연쇄반응을 이용하여 삽입절편을 제조하고 이를 이용하여 변이유전자 라이브러리 제조방법을 개발하였다(도 10).As a result of analyzing the library obtained in Example 5 by the method shown in Example 6, it was confirmed that the mutation occurred in the surface expression mediator gene region and the terminator region in addition to the lipase gene intended to induce the mutation. As a result of selecting and analyzing only strains showing a large active ring from the library, there were many cases showing high activity as shown in FIG. 9, but most of the sequencing analysis showed that a stop codon was generated or a frame shift was generated at the surface expression mediator. It was confirmed that lipase was secreted due to the generation of (frame shift) mutation. Therefore, the present inventors prepared an insertion fragment using a two-step polymerase chain reaction to induce mutations only in a target expression gene of interest and developed a method of preparing a mutant gene library using the same (Fig. 10).

표적발현 유전자인 리파제 유전자에만 변이를 유도하기 위하여, 상기한 변이유도 중합효소연쇄 반응을 pGK-CALB-CwpF 벡터를 주형으로 하여 표2의 GPD-err 프라이머 및, 서열번호 16으로 기재되는 Cwp-OL 프라이머를 이용하여 수행하고, 제조된 DNA 절편은 젤로부터 회수하였다. 리파제 DNA 유전자 이외에 남은 부위를 포함하는 절편은 CwpF 프라이머와 T-0 프라이머를 이용하여 동일한 주형을 바탕으로 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 획득한 DNA 절편을 젤로부터 회수하였다. 각각의 방법으로 획득한 두 개의 절편을 5 ㎕씩 혼합한 후 이를 주형으로 하고, GPD-err과 T-0 프라이머를 사용하여 Ex taq 중합효소(TAKARA 사, 일본)로 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 두 DNA절편이 연결된 DNA 절편을 획득하였다. 상기 획득한 DNA 절편은 pHARS-CALB-SK를 EcoRI/BamHI으로 절단하여 얻어진 약 5 kb의 수용절편과 함께 100 ng씩 혼합하여 한세눌라 폴리모르파 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였다.In order to induce mutations only in the lipase gene, which is a target expression gene, the above-described mutation-induced polymerase chain reaction was carried out using the pGK-CALB-CwpF vector as a template, and the GPD-err primer of Table 2 and Cwp-OL described in SEQ ID NO: 16. Performed using primers, the prepared DNA fragments were recovered from the gel. The fragment containing the remaining portion in addition to the lipase DNA gene gels a DNA fragment obtained by performing a polymerase chain reaction using a PCR premix kit (Bionia, Korea) based on the same template using a CwpF primer and a T-0 primer. Recovered from 5 μl of the two fragments obtained by each method was mixed and then used as a template, and reacted for three minutes at 94 ° C. with Ex taq polymerase (TAKARA, Japan) using GPD-err and T-0 primer. , 25 times at 94 ℃, 30 seconds at 55 ℃, 25 minutes for 1 minute at 72 ℃ to perform a polymerase chain reaction under the conditions to react for 7 minutes at 72 ℃ to obtain a DNA fragment connected to the two DNA fragments It was. The obtained DNA fragment was mixed with 100 ng of each of the 5AR fragments obtained by cutting pHARS-CALB-SK with Eco RI / Bam HI and transformed into Hanshenula polymorpho strains using the Li / TE method. It was.

이로부터 획득한 형질전환체를 리파제 평판활성 측정법으로 확인한 결과, 다양한 리파제 활성을 보이는 것을 확인하여 변이 라이브러리가 순조롭게 제조되었음을 확인하였다.As a result of confirming the transformants obtained from the lipase plate activity measurement method, it was confirmed that the lipase activity was shown to confirm that the mutant library was prepared smoothly.

또한, 라이브러리로부터 10 개의 균주를 무작위로 선별하여 염색체를 분리한 후 상기 실시예 6의 방법에 의하여 변이 유전자를 회수하고 염기서열을 분석하였다.In addition, ten strains were randomly selected from the library to separate chromosomes, and the mutated genes were recovered by the method of Example 6 and analyzed for nucleotide sequences.

그 결과, 예상한 바와 같이 리파제 유전자에서만 변이가 관찰되었으며, 그 외의 부분, 즉 표면발현 매개 단백질 유전자 부위와 터미네이터 부위에서는 거의 변이가 일어나지 않았음을 확인하였다(도 11). 따라서, 상기의 방법을 이용하여 얻은 삽입절편을 이용하여 세포내 재조합 방법을 통한 라이브러리를 구축할 경우 원하는 유전자 부위에만 변이가 유도된 라이브러리를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.As a result, mutations were observed only in the lipase gene as expected, and it was confirmed that almost no mutations occurred in other parts, that is, the surface expression mediator protein gene region and the terminator region (FIG. 11). Therefore, when constructing the library through the intracellular recombination method using the insert obtained using the above method was found that the mutation-induced library can be produced only in the desired gene region.

<실시예 8><Example 8> 세포내 다중 재조합 방법을 이용한 변이 라이브러리의 구축Construction of Mutation Library Using Intracellular Multiple Recombination Method

상기의 실시예들을 통하여 한세눌라 균주에서 세포내 재조합을 통하여 삽입절편과 수용절편을 동시에 형질전환하여 높은 형질전환효율 및 균일한 카피 수를 가지는 라이브러리를 제조하는 것이 가능함을 확인하였다. 이로부터 본 발명자들은 두개 이상의 삽입절편을 수용절편과 함께 형질전환에 이용하는 경우에도 세포내 재조합을 통하여 형질전환이 가능할 것으로 기대하고 여러 종류의 삽입절편을 제조하고 이들을 동시에 수용절편과 함께 형질전환하고 그 효율을 확인하였다. 이를 위하여 본 발명자들은 3개의 프라이머를 합성하였는데, 각각 리파제 유전자의 5' 말단에서 3' 말단 쪽으로 752 bp 떨어진 부위에서 역방향으로 진행하는 서열번호 17로 기재되는 LIP-reco 프라이머, 390 bp 부위에서 정방향으로 진행하며 서열번호 18로 기재되는 CalB1 프라이머, 670 bp 부위에서 정방향으로 진행하며 서열번호 19로 기재되는 CalB2 프라이머를 제조하였다. 중합효소연쇄반응은 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하고 pGK-CALB-CwpF를 주형으로 하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 수행하고, 이들을 각각 젤에서 분리하여 형질전환에 이용하였다. 도 12에서 보는 바와 같이 LIP1은 GPD-err 프라이머와 LIP-reco 프라이머를 이용하여 증폭된 952 bp의 절편이고, LIP2는 CalB1과 Cwp-OL프라이머를 이용하여 증폭된 690 bp의 절편이고, LIP3은 CalB2와 Cwp-OL을 이용하여 증폭된 410 bp의 절편이며, LIP4는 CwpF와 T-0 프라이머를 이용하여 증폭된 590 bp의 절편이다. 상기에서 획득한 DNA 절편을 이용하여, 다시 각각을 5 ㎕씩 혼합하고 이를 주형으로 하여 Ex Taq polymerase(TAKARA 사, 일본)를 이용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간의 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합연쇄반응을 수행하여 두 DNA절편을 연결하였는데, CALB1은 LIP2와 LIP4를 혼합하고 CalB1과 T-0 프라이머를 이용하여 제조하였으며, CALB2는 LIP3과 LIP4를 혼합하고 이를 주형으로 CalB2와 T-0 프라이머를 이용하여 제조하였다(도 12 참조). 또한, 상기 다양한 삽입절편들을 사용한 경우와 형질전환효율을 비교하기 위하여 GPD-err과 T-0 프라이머를 이용하여 합성한 삽입절편을 CALB3라 명명하고, 대조군으로 사용하였다. 상기와 같이 제조한 삽입절편 각각을 표 4에서와 같이 혼합한 후 형질전환에 이용하였다.Through the above examples, it was confirmed that it is possible to prepare a library having high transformation efficiency and uniform copy number by simultaneously transforming the insertion fragment and the receptor fragment through intracellular recombination in the Hansenula strain. From this, the present inventors expect that even if two or more insertion fragments are used for transformation with the receptor fragments, the present inventors expect that the transformation may be possible through intracellular recombination. Thus, various kinds of insertion fragments may be prepared and transformed together with the receptor fragments. The efficiency was confirmed. To this end, the present inventors synthesized three primers, each of which has a LIP-reco primer as set forth in SEQ ID NO: 17, which proceeds backward at a position 752 bp away from the 5 'end to the 3' end of the lipase gene, at a 390 bp region. Proceeding in the forward direction at the 670 bp site, CalB1 primer set forth in SEQ ID NO: 18, CalB2 primer set forth in SEQ ID NO: 19 was prepared. Polymerase chain reaction was carried out using a PCR premix kit (Bionia, Korea) as a template and reacted for 3 minutes at 94 ° C using pGK-CALB-CwpF as a template, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 1 at 72 ° C. The reaction was carried out for 25 minutes and the reaction was carried out at 72 ° C. for 7 minutes, and each of them was separated from the gel and used for transformation. As shown in FIG. 12, LIP1 is a fragment of 952 bp amplified using a GPD-err primer and a LIP-reco primer, LIP2 is a fragment of 690 bp amplified using a CalB1 and Cwp-OL primer, and LIP3 is CalB2. And 410 bp fragments amplified using Cwp-OL, and LIP4 is a 590 bp fragment amplified using CwpF and T-0 primers. Using the obtained DNA fragments, 5 μl of each was mixed again, and the resultant was reacted for 3 minutes at 94 ° C. using Ex Taq polymerase (TAKARA, Japan), and at 55 ° C. for 30 seconds at 94 ° C. At 30 ° C. for 30 minutes at 72 ° C. for 25 minutes and at 7 ° C. for 7 minutes to carry out a polymerase chain reaction to connect the two DNA fragments. CALB1 was mixed with LIP2 and LIP4 and CalB1 and T- It was prepared using 0 primer, CALB2 was mixed with LIP3 and LIP4 and prepared using CalB2 and T-0 primer as a template (see Figure 12). In addition, in order to compare the transfection efficiency with the case of using the various insertion fragments, the insertion fragment synthesized using GPD-err and T-0 primer was named CALB3 and used as a control. Each of the prepared inserts was mixed as shown in Table 4 and used for transformation.

그 결과, 각각의 말단이 서로 100 bp 이상의 상동성을 지닌 부분을 공유하고 있는 경우 2개 또는 3개의 삽입절편도 동시에 고효율로 형질전환되었음을 확인하였다(표 4). 표 4에서 보이는 바와 같이 각 DNA 절편간의 겹치는 부위가 더 클수록 형질전환 효율은 증가하였으며, 여러 개의 DNA 절편을 사용한 경우 한 개의 삽입절편을 사용하는 경우에 비하여 형질전환 효율은 낮아졌지만 여전히 원형벡터를 사용한 경우보다 월등히 높은 효율을 보였다. 또한, 라이브러리에서 무작위로 선별된 균주로부터 각각 유전자를 회수하여 서던 블롯으로 확인한 결과, 한 개의 삽입절편을 사용한 경우처럼 대부분 염색체 말단 부위로 단일 카피로 도입된 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that two or three insertion fragments were also transformed at the same time with high efficiency when each terminal shared a portion having a homology of 100 bp or more to each other (Table 4). As shown in Table 4, the larger the overlapping region between the DNA fragments, the higher the transformation efficiency was. The use of multiple DNA fragments resulted in lower transformation efficiency compared to the use of one insert fragment. The efficiency was much higher than that. In addition, when the genes were recovered from the randomly selected strains in the library and confirmed by Southern blot, it was confirmed that most of them were introduced into a single copy of the chromosomal end region as in the case of using one insertion fragment.

여러개의 DNA 절편을 이용한 세포내 다중 재조합 반응Intracellular Multiple Recombination Reaction Using Multiple DNA Fragments 구조rescue 형질전환체의 갯수 /㎍ 벡터 DNANumber of transformants / µg Vector DNA LIP1 +CALB1 + 수용절편LIP1 + CALB1 + Acceptance Intercept 26,50026,500 LIP1 + CALB2 + 수용절편LIP1 + CALB2 + Acceptance Intercept 16,00016,000 LIP1 + CALB2+ LIP2 + 수용절편LIP1 + CALB2 + LIP2 + Acceptance Intercept 29,50029,500 원형 vectorCircle vector 2,0002,000 CALB3+ 수용절편CALB3 + receiving intercept 33,00033,000

상기한 방법으로 여러 개의 삽입절편을 사용하여 변이주 라이브러리를 제조할 경우 각각의 다양한 리파제 유전자가 세포내 재조합을 통해서 서로 섞이는 효과(shuffling)가 있어, 유전자의 변이를 추가로 유도하는 경우에도 이용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 가능성을 확인하기 위하여 상기 실시예 5에서 확보된 리파제 고활성 60개 균주를 선별한 후 각 균주의 염색체를 분리하였다. 분리된 염색체는 각각 동량으로 혼합한 후 이를 주형으로 사용하여 상기와 동일한 방법으로 LIP1, 2, 3을 합성하였고, pGK-CALB CwpF를 주형으로 사용하여 LIP4를 합성한 후 각각을 젤로부터 분리하여 CALB1, 2를 다시 합성하였다. 위와 같이 획득한 DNA 절편을 각각 상기 표 4와 같이 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환하였다. 상기 방법으로 획득한 형질전환체 라이브러리로부터 무작위로 균주를 선별하여 리파제 평판 활성 측정법으로 활성을 측정하였다.In the case of preparing a mutant strain library using a plurality of insertion fragments by the above-described method, each of the various lipase genes is shuffling with each other through intracellular recombination, and thus can be used to further induce mutation of the gene. have. The present inventors screened 60 strains of lipase high activity secured in Example 5 to confirm the possibility and separated the chromosomes of each strain. The separated chromosomes were mixed in the same amount, and then, LIP1, 2, and 3 were synthesized by the same method as above, and LIP4 was synthesized using pGK-CALB CwpF as a template, and then each was separated from the gel, CALB1. , 2 was synthesized again. DNA fragments obtained as described above were transformed into Hanshenula polymorpha strains as shown in Table 4, respectively. Strains were randomly selected from the transformant library obtained by the above method, and activity was measured by lipase plate activity assay.

그 결과, 다양한 리파제 활성이 나타났으며, 리파제 고활성 균주로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용했음에도 불구하고, 리파제 활성이 없는 균주도 다수 포함되어 있었다(도 13). 상기의 결과로부터 상기 주형으로 사용한 60 개의 리파제 유전자간에 서로 변이가 혼합되어 새로운 라이브러리가 구축되었음을 추정할 수 있었으며, 이 방법을 이용할 경우 유전자 셔플링 방법을 보완할 수 있는 새로운 변이 제조 방법으로서 다양한 변이를 가진 유전자 집합체를 서로 혼합하여 세포내 다중 재조합을 통해서 새로운 변이의 유도가 가능함을 확인하였다.As a result, various lipase activity appeared, and even though the chromosome isolated from the lipase highly active strain was used as a template, a large number of lipase-free strains were included (FIG. 13). From the above results, it was estimated that 60 lipase genes used as the template were mixed with each other and a new library was constructed. When this method is used, a variety of mutations can be used as a new mutation manufacturing method that can complement the gene shuffling method. It was confirmed that new gene mutations can be induced by intracellular multiplexing by mixing the gene aggregates with each other.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포내 재조합 방법은 한세눌라 폴리모르파에서 유용 유전자 변이 라이브러리 구축에 용이하게 이용될 수 있으며 이를 이용하여 라이브러리를 제조할 경우 대장균을 거치지 않고 높은 형질전환효율로 유전자 라이브러리를 용이하게 제조할 수 있으며, 특히 도입유전자가 숙주세포의 염색체내의 균일한 위치에 단일 카피로 도입된 유전자 라이브러리를 제조할 수 있기 때문에 표적발현 단백질의 활성조사를 통해서 변이단백질을 스크리닝할 경우 매우 유용하다. 또한, 상기의 여러 개의 다양한 삽입절편을 수용절편과 함께 형질전환하는 방법을 이용할 경우, 유전자의 라이브러리를 서로 혼합하여 세포 내에서 새로운 변이를 유도할 수 있어 기존의 세포외 변이 제조법에서 얻을 수 없었던 변이의 유발이 가능할 것으로 판단되므로 기존방법의 획기적 보완이 가능하다.As described above, the intracellular recombination method of the present invention can be easily used for constructing a useful gene mutation library in Hanshenula polymorpha. Libraries can be easily prepared, especially when the transgene can be prepared with a single copy of a gene library introduced into a single copy at a uniform position in the chromosome of a host cell. useful. In addition, when using a method of transforming a plurality of the above-described insertion fragments with the receptor fragments, by mixing the library of genes with each other to induce new mutations in the cell mutations that could not be obtained in the conventional extracellular mutation manufacturing method It is expected that this will be possible, and it is possible to make a significant complement to the existing method.

도 1은 본 발명에 사용한 리파제를 분비 발현하도록 제조된 벡터 pGK-CALB*와 리파제를 세포의 표면에 부착 발현하도록 제조된 벡터 pGK-CALB-CwpF의 모식도이다.1 is a schematic diagram of a vector pGK-CALB * prepared to secrete and express lipase used in the present invention and a vector pGK-CALB-CwpF prepared to adhere and express lipase to the surface of a cell.

LEU2 : 류이신 발현 유전자,LEU2: leucine expression gene,

pGPD : GAPDH 프로모터, pGPD : GAPDH promoter,

KT : 킬러 톡신 분비신호서열,KT: killer toxin secretion signal sequence,

CALB : 리파제,CALB: lipase,

tUK : 터미네이터 및tUK: terminator and

CwpF : 표면 발현 매개 단백질 유전자CwpF: surface expression mediated protein gene

도 2는 분비형 CalB와 표면발현형 CalB의 리파제 효소 활성을 비교한 사진이다.Figure 2 is a photograph comparing the lipase enzyme activity of secreted CalB and surface-expressing CalB.

도 3은 세포내 재조합 방법의 효율을 비교하기 위하여 사용한 다양한 벡터 및 DNA 절편을 나타낸 모식도이다.3 is Schematic diagram showing various vectors and DNA fragments used to compare the efficiency of intracellular recombination methods.

도 4는 라이브러리 제조를 위하여 사용된 수용절편 및 삽입절편을 나타낸 모식도이다.4 is It is a schematic diagram showing the receiving fragment and the insertion fragment used for the library production.

(A)는 적절한 효소로 절단 후 수용 절편으로 이용되는 pHARS-CALB-SK 벡터의 개략도이며,(A) is a schematic of the pHARS-CALB-SK vector used as a receiving fragment after cleavage with an appropriate enzyme,

(B)는 pHARS-CALB-SK로부터 제조된 수용절편과 pGK-CALB -CwpF 벡터로부터 제조된 삽입절편이 세포내 재조합되는 형태를 보여주는 그림이다.(B) is a diagram showing the intracellular recombination of the receptor fragment prepared from pHARS-CALB-SK and the insert fragment prepared from the pGK-CALB -CwpF vector.

도 5는 세포내 재조합을 최적화하기 위하여 사용한, 해당 프라이머를 이용하여 합성된 삽입절편의 모식도이다.Figure 5 is a schematic diagram of the insertion fragment synthesized using the primers used to optimize intracellular recombination.

C : HARS36의 유전체 말단 부위,C: dielectric end region of HARS36 ,

BD : 벤트(bent) DNA 도메인,BD: bent DNA domain,

ARS : HARS36의 자기복제서열 및ARS: self-replicating sequence of HARS36

Rep : HARS36의 텔로머릭 반복서열Rep: Telomeric repetition sequence of HARS36

도 6은 세포내 재조합으로 구축된 라이브러리의 특징을 분석한 결과이다.6 shows the results of analyzing the characteristics of the library constructed by intracellular recombination.

(A)는 형질전환체로부터 분리한 크로모좀 유전자를 이용한 서던 블롯 결과이며, 무작위로 선별된 균주의 크로모좀 DNA를 회수한 뒤 EcoRI과 SacII로 절단하고 리파제 유전자를 프로브로 사용하였다.(A) is a result of Southern blot using the chromosomal gene isolated from the transformant, and after recovering the chromosomal DNA of a randomly selected strain, it was digested with Eco RI and Sac II and lipase gene was used as a probe.

(B)는 원형 pGK-CALB-CwpF 벡터(왼쪽)를 이용하여 제조된 라이브러리와, GPD-err과 T-0 프라이머를 이용하여 합성한 삽입절편과 수용절편을 이용하여 세포내 재조합 방법(오른쪽)을 이용하여 제조된 라이브러리의 리파제 효소 활성을 비교한 결과를 보여주는 사진이다.(B) shows the intracellular recombination method (right) using a library prepared using a circular pGK-CALB-CwpF vector (left), an insertion fragment and a receptor fragment synthesized using GPD-err and T-0 primers. Photo shows the results of comparing the lipase enzyme activity of the prepared library.

도 7은 리파제 변이 라이브러리의 제조를 위한 최적화된 세포내 재조합 방법을 나타내며, 수용절편과 삽입절편의 세포내 재조합에 의해 표적발현유전자가 크로모좀 말단으로 단일카피 도입된 경우의 모식도이다.FIG. 7 shows an optimized intracellular recombination method for the preparation of lipase mutant libraries, and is a schematic diagram where a single copy of the target expression gene is introduced into the chromosome end by intracellular recombination of the acceptor fragment and the insert fragment.

도 8은 세포내 재조합 방법을 이용하여 구축된 라이브러리로부터 무작위로 선별된 균주의 리파제 평판활성 측정한 결과를 보여주는 사진이다.Figure 8 is a photograph showing the results of measuring the lipase plate activity of a randomly selected strain from the library constructed using the intracellular recombination method.

도 9는 라이브러리로부터 선별된 균주들의 리파제 평판활성 비교한 사진이다.9 is a photograph comparing lipase plate activity of the strains selected from the library.

Wt: 숙주세포,Wt: host cell,

Lip*: 분비형 리파제 및Lip *: secretory lipase and

LipCwpF: 표면발현형 리파제LipCwpF: Surface Expression Lipase

도 10은 변이도입 중합효소연쇄반응(error-prone PCR)을 이용하여 원하는 부위에만 변이를 도입하기 위하여 2단계 중합효소연쇄 반응을 이용하여 제조한 삽입절편과 수용절편이 세포내 재조합되는 것을 나타내는 그림이다.10 is a diagram showing that the insertion fragment and the receptor fragment prepared by using a two-step polymerase chain reaction in order to introduce a mutation only in a desired region by using an error-prone PCR (recombination) polymerase chain reaction to be.

도 11은 무작위로 선별된 유전자의 염기서열을 비교한 결과이다.11 shows a result of comparing the nucleotide sequences of randomly selected genes.

도 12는 서로 다른 다양한 삽입절편과 수용절편이 세포내 재조합되는 것을 나타내는 모식도이다.Figure 12 is a schematic diagram showing that the different insertion fragments and the receiving fragments are recombined intracellularly.

도 13은 라이브러리로부터 무작위로 선별된 균주들의 리파제 평판활성 측정 결과를 보여주는 사진이다. Figure 13 is a photograph showing the results of lipase plate activity measurement of randomly selected strains from the library.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for construction of a library in Hansenula polymorpha using HARS36 sequence and the library constructed by the same <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 625 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 gatccgtgtg atggagattg accctggtgc tgtggagacg gagttctcgc tggtgcggtt 60 tggcggcgat gcacaaaagc cagcaaggtg tacgaaggct acgagccgct gagtgcgaag 120 gacatttcag acgtggttgt gttcaactgc agtcggcggg ccaacgtggt tgtggcggag 180 tcggtggtgt ttccaactgc gcaggcggga agctaccata gacataggag tgagccaagg 240 gagggaacag agaagaatta gagagggaat tagagaggaa ttagagcaag tagagctata 300 gaagagataa gctaagtcaa gaattagagc aagtaggggc aagtttaata tatgtggatt 360 aataaaggtg agaaattaga tgggaggagc ggcaggaaac ggtgtaggga tgcggtgagg 420 ggagcggacg cggttggttt taggatgcgg tctgagggtg gcggggtggc ggggtggcgg 480 ggtggtgggg tggcggggtg gcggggtggc ggggtggcgg ggtggcgggg tggcggggtg 540 gcggggtggc ggggtggcgg ggtggcgggg tggcggggtg gcggggtggc ggggtggcgt 600 gatcatcggg tacaacattg ccaac 625 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD-err <400> 2 gcagagctaa ccaataagg 19 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS-err <400> 3 gttggcaatg ttgtacccga tgatc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-0 <400> 4 tcagaccgca tcctaaaacc 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-1 <400> 5 cgccaccctc agaccgcatc ctaaaacc 28 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-2 <400> 6 cgccaccccg ccaccctcag accgcatcct aaaacc 36 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-3 <400> 7 cgccaccccg ccaccccgcc accctcagac cgcatcctaa aacc 44 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-0 <400> 8 tgcagttgaa cacaaccac 19 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-1 <400> 9 cgccaccctg cagttgaaca caaccac 27 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-2 <400> 10 cgccaccccg ccaccctgca gttgaacaca accac 35 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-3 <400> 11 cgccaccccg ccaccccgcc accctgcagt tgaacacaac cac 43 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS100 <400> 12 gccttcgtac accttgctg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS40 <400> 13 gccttcgtac accttgctg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Term2 <400> 14 gaggtcgatc taaggagtc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Term <400> 15 aatcagaggc ggtgtgtgc 19 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cwp-OL <400> 16 gcagcagttt tctcgtacag agcagagtag aaggatcc 38 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIP-reco <400> 17 acgaacagcg gcccacac 18 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1 <400> 18 agcttcccgt gcttac 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB2 <400> 19 agcttcccgt gcttac 16<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for construction of a library in Hansenula polymorpha using HARS36 sequence and the library constructed by the same <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 625 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 gatccgtgtg atggagattg accctggtgc tgtggagacg gagttctcgc tggtgcggtt 60 tggcggcgat gcacaaaagc cagcaaggtg tacgaaggct acgagccgct gagtgcgaag 120 gacatttcag acgtggttgt gttcaactgc agtcggcggg ccaacgtggt tgtggcggag 180 tcggtggtgt ttccaactgc gcaggcggga agctaccata gacataggag tgagccaagg 240 gagggaacag agaagaatta gagagggaat tagagaggaa ttagagcaag tagagctata 300 gaagagataa gctaagtcaa gaattagagc aagtaggggc aagtttaata tatgtggatt 360 aataaaggtg agaaattaga tgggaggagc ggcaggaaac ggtgtaggga tgcggtgagg 420 ggagcggacg cggttggttt taggatgcgg tctgagggtg gcggggtggc ggggtggcgg 480 ggtggtgggg tggcggggtg gcggggtggc ggggtggcgg ggtggcgggg tggcggggtg 540 gcggggtggc ggggtggcgg ggtggcgggg tggcggggtg gcggggtggc ggggtggcgt 600 gatcatcggg tacaacattg ccaac 625 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD-err <400> 2 gcagagctaa ccaataagg 19 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS-err <400> 3 gttggcaatg ttgtacccga tgatc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-0 <400> 4 tcagaccgca tcctaaaacc 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-1 <400> 5 cgccaccctc agaccgcatc ctaaaacc 28 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-2 <400> 6 cgccaccccg ccaccctcag accgcatcct aaaacc 36 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-3 <400> 7 cgccaccccg ccaccccgcc accctcagac cgcatcctaa aacc 44 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-0 <400> 8 tgcagttgaa cacaaccac 19 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-1 <400> 9 cgccaccctg cagttgaaca caaccac 27 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-2 <400> 10 cgccaccccg ccaccctgca gttgaacaca accac 35 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-3 <400> 11 cgccaccccg ccaccccgcc accctgcagt tgaacacaac cac 43 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS100 <400> 12 gccttcgtac accttgctg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HARS40 <400> 13 gccttcgtac accttgctg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Term2 <400> 14 gaggtcgatc taaggagtc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Term <400> 15 aatcagaggc ggtgtgtgc 19 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cwp-OL <400> 16 gcagcagttt tctcgtacag agcagagtag aaggatcc 38 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIP-reco <400> 17 acgaacagcg gcccacac 18 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1 <400> 18 agcttcccgt gcttac 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB2 <400> 19 agcttcccgt gcttac 16

Claims (8)

1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36 서열의 전체 또는 일부가 DNA의 5' 또는 3' 말단에 노출되어 있으며 다양성을 가지는 표적발현유전자를 포함하는 삽입절편을 제조하는 단계;1) preparing an insert comprising a target expression gene having a variety of all or part of the HARS36 sequence having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is exposed at the 5 'or 3' end of the DNA; 2) 선택표지 유전자 및 이들을 발현시키기 위한 프로모터를 포함하며, 5' 또는 3' 말단에 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 HARS36서열의 전체 또는 일부가 노출되어 있는 수용절편을 제조하는 단계;2) preparing an acceptor fragment including a selectable gene and a promoter for expressing the same, wherein all or part of an HARS36 sequence having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 at a 5 'or 3' end is exposed; 3) 단계 1의 삽입 DNA 절편과 단계 2의 수용 DNA 절편을 동시에 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환시킨 형질전환체를 제조하는 단계; 및 3) preparing a transformant transformed into the yeast Hanshenula polymorpha strain at the same time the insertion DNA fragment of step 1 and the receiving DNA fragment of step 2; And 4) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, HARS36 서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파 균주에서 유전자 라이브러리를 제조하는 방법.4) A method of preparing a gene library in a yeast Hanshenula polymorpho strain using HARS36 sequence, comprising culturing the transformant. 제 1항에 있어서, 단계 1의 삽입절편은 변이가 도입된 표적발현 유전자, 분비신호서열을 코딩하는 유전자, 터미네이터 유전자 및 HARS36 서열의 전체 또는 일부분을 포함하는 DNA 절편인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the insert of step 1 is a DNA fragment comprising all or a portion of a target expression gene, a gene encoding a secretion signal sequence, a terminator gene, and a HARS36 sequence into which a mutation is introduced. 제 1항에 있어서, 단계 1의 삽입절편은 유전체로부터 유래된 다양한 유전자 절편 및 HARS36 서열의 전체 또는 일부분을 포함하는 DNA 절편인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the insert of Step 1 is a DNA fragment comprising all or a portion of a variety of gene segments and HARS36 sequences derived from the genome. 제 2항에 있어서, 상기 분비신호서열은 킬러톡신(Killer Toxin, KT), MFα, PHO5, SUC2, AMY 및 SED로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 분비신호서열인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the secretory signal sequence is a secretory signal sequence of a gene selected from the group consisting of killer toxin (KT), MFα, PHO5, SUC2, AMY, and SED. 제 1항에 있어서, 단계 2의 선택표지유전자는 한세눌라 폴리모르파 LEU2(HLEU2) 유전자, 한세눌라 폴리모르파 URA3(HURA3) 유전자 및 항생물질 내성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the selection marker gene of step 2 is a gene selected from the group consisting of a Hansenula polymorpha LEU2 (HLEU2) gene, a Hansenula polymorpha URA3 ( HURA3 ) gene, and an antibiotic resistance gene. How to. 제 1항에 있어서, 단계 2의 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, GAL10, SED1, TEF 및 TPI로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the promoter of step 2 is a promoter of a gene selected from the group consisting of GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, GAL10, SED1, TEF, and TPI. 제 1항의 방법에 의해 제조된 유전자 라이브러리.Gene library prepared by the method of claim 1. 제 7항에 있어서, 상기 라이브러리는 한세눌라 폴리모르파를 숙주세포로 하는 것을 특징으로 하는 유전자 라이브러리.8. The gene library according to claim 7, wherein the library comprises Hanshenula polymorpha as a host cell.