KR100523701B1 - The Method of Preparation of Porous Gel Sponge Using Hyaluronan and Anhydrides - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자연계에 널리 존재하는, 더욱 바람직하게는 생체내에 널리 존재하는 저분자 유기산의 안히드리드와 히알루론산을 이용하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의해 다공성 스폰지의 형태를 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 향상되며, 세포나 조직배양의 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액 또는 세포배양 배지에서 용해되지 않고, 생분해 속도가 늦추어지며, 세포독성이 없고 생체친화성이 높은 히알루론산 다공성 스폰지를 제공할 수 있다.The present invention relates to a method for producing a hyaluronic acid porous sponge using anhydride and hyaluronic acid of a low molecular organic acid which is widely present in nature, more preferably widely in vivo, and in the form of a porous sponge according to the present invention. Can be maintained for a long time, the mechanical strength is improved, it is not dissolved in an aqueous solution or cell culture medium of pH 4.0 to 7.4, which is the condition of the cell or tissue culture, the biodegradation rate is slowed down, the cytotoxicity and the biocompatibility are high Lonic acid porous sponge can be provided.
Description
히알루론산은, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자로 분자량이 50,000 ~ 10,000,000Da 또는 그 이상인 다당류이다. 히알루론산은 생체 결합조직의 기본물질로, 주로 포유동물의 피부, 관절의 활액(synovial fluid), 눈의 초자체액(vitreous humor), 탯줄(umbilical cord), 혈청(serum), 닭 벼슬(cock's comb) 등에 분포해 있으며, 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과, 연쇄구균, 간균을 배양한 후 이것으로부터 추출 정제하는 방법 등이 있다. Hyaluronic acid is a linear polymer in which β-D-N-acetylglucosamine and β-D-glucuronic acid are bonded alternately and is a polysaccharide having a molecular weight of 50,000 to 10,000,000 Da or more. Hyaluronic acid is the basic material of bio connective tissue, mainly the skin of mammals, synovial fluid, vitreous humor of the eyes, umbilical cord, serum, and chicken's comb. It is known to exist in streptococcus, bacillus capillaries and the like. As a general method for obtaining hyaluronic acid, there is a method of extracting from chicken crust, umbilical cord, and the like, a method of culturing streptococci and bacilli, and then extracting and purifying them from them.
천연 히알루론산은 분자량에 비례한 다분(polydisperse) 산성이지만, 종간 특이성을 갖지 않으며 또한 조직이나 장기특이성을 갖지 않아, 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주입한 경우에 우수한 생체적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 생체에 히알루론산을 천연 그대로 적용하는 경우에는, 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되므로 생체조직 내에서의 반감기가 0.5 내지 3일 정도로 체내 체류시간이 비교적 짧아, 의용재료로 이용하기에는 한계가 있다. 이의 용도를 의용재료로 확장하기 위해서, 히알루론산을 여러종류의 화학수식제(chemical modifier)를 이용하여 가교결합(cross-linking)을 하거나 작용기를 붙이는 방법으로 변성하여 체내 지속성을 향상시키는 것이 시도되어 왔다. Although natural hyaluronic acid is polydisperse acid in proportion to molecular weight, it does not have species specificity and does not have tissue or organ specificity, and thus it is known to exhibit excellent biocompatibility when implanted or injected into a living body regardless of its origin. . However, when hyaluronic acid is naturally applied to a living body, since it is easily degraded by an enzyme called hyaluronidase present in the body, the half-life in the biological tissue is relatively short, with a half-life of 0.5 to 3 days. There is a limit to use. In order to extend its use to medical materials, hyaluronic acid is modified by cross-linking using various chemical modifiers or by attaching functional groups to improve the sustainability of the body. come.
여러 방법으로 히알루론산의 물리 화학적 또 생물학적 특성을 변성하여 다양한 용도로 사용하려는 시도들 중, 특히 여러 방법으로 제조된 다공성 스폰지(porous sponge)는 세포나 조직의 배양과 이식을 목적으로 하는 다공성 지지체나 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등과 같은 의용재료, 약물전달 시스템의 담체 등과 같은 의약용 재료에 이용될 수 있다.Among various attempts to modify the physicochemical and biological properties of hyaluronic acid in various ways, in particular, porous sponges made by various methods are known as porous supports for the cultivation and transplantation of cells or tissues. Medical materials such as wound coating materials, dental matrices and the like, carriers of drug delivery systems and the like can be used.
히알루론산을 이용하여 다공성 스폰지를 만드는 일반적인 방법들을 살펴보면, 순수한 히알루론산만으로 제조된 다공성 스폰지는 물에 쉽게 녹아 그 형태를 잃게 되므로, 히알루론산의 물에서의 불용성을 향상시키기 위해 여러 가지 가교제를 사용하고 있다. 이 중 대표적인 것은, 디비닐 술폰, 비스에폭시드 또는 포름알데히드와 같은 이작용성 가교제를 사용하여 수득한 고팽윤성의 가교된 히알루론산 겔이다 (USP 4,582,865, JP-B-6-37575, JP-A-7-97401 및 JP-A-60-130601).In general methods of making porous sponges using hyaluronic acid, porous sponges made only of pure hyaluronic acid are easily dissolved in water and lose their form. have. Typical of these are highly swellable crosslinked hyaluronic acid gels obtained using bifunctional crosslinkers such as divinyl sulfone, bisepoxide or formaldehyde (USP 4,582,865, JP-B-6-37575, JP-A- 7-97401 and JP-A-60-130601.
히알루론산의 테트라부틸암모늄염이 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 유기 용매에 용해하는 특징을 이용한 히알루론산의 화학적 변성 방법도 제안되고 있다 (JP-A-3-105003). 히알루론산의 테트라부틸암모늄염을 디메틸 술폭시드 중에서, 트리에틸아민과 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드로 처리하여, 히알루론산의 카르복실기와 히드록실기 사이에서 에스테르 결합을 형성시키는 방법도 제안되어 있다 (EP-A-0341745A1).A chemical modification method of hyaluronic acid using a feature in which the tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid is dissolved in an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) has also been proposed (JP-A-3-105003). A method of forming an ester bond between a carboxyl group and a hydroxyl group of hyaluronic acid by treating the tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid with triethylamine and 2-chloro-1-methylpyridinium iodine in dimethyl sulfoxide has also been proposed. (EP-A-0341745A1).
또한, 공유 결합하는 화학 약품을 사용하지 않고, 히알루론산을 물에 불용화하는 접근으로서, 아미노기 또는 이미노기를 가지는 고분자와 히알루론산을, 히알루론산의 카르복실기와 고분자의 아미노기 또는 이미노기를 통해 이온 결합시켜 히알루론산-고분자 착물을 제조하는 방법도 제안되어 있다 (JP-A-6-73103).Also, as an approach to insolubilize hyaluronic acid to water without using a covalent chemical, ionic bonds between a polymer having an amino group or an imino group and hyaluronic acid are carried out through a carboxyl group of the hyaluronic acid and an amino group or an imino group of the polymer. Is also proposed to produce a hyaluronic acid-polymer complex (JP-A-6-73103).
또 가교제로 카보디이미드 또는 숙신이미딜활성에스테르를 사용한 방법이 제안되어 있다 (WO94/2517, USP 4,970,298). Moreover, the method using the carbodiimide or succinimidyl active ester as a crosslinking agent is proposed (WO94 / 2517, USP 4,970,298).
히알루론산 수용액이 산성화, 예를 들어 pH 2.0 내지 2.7 의 범위로 되는 경우, 젤리화에 의해 이른바 퍼티겔(putty gel)을 형성하는 것은 알려져 있지만, pH 2.0 미만에서는 퍼티겔이 형성되지 않을 뿐 아니라 퍼티겔은 중성 수용액 중에 빠르게 용해하기 때문에, 본 발명에 따른 다공성 스폰지와는 차별화된다.When the aqueous hyaluronic acid solution is acidified, for example, in the range of pH 2.0 to 2.7, it is known to form a so-called putty gel by gelling, but below pH 2.0, not only does the putty gel form but also the putty Since the gel dissolves rapidly in neutral aqueous solution, it differs from the porous sponge according to the invention.
그러나, 디비닐 술폰이나 비스에폭시드, 알데히드 등을 가교제로 사용할 경우 미 반응한 잔류물에 의한 세포독성이 문제가 될 수 있어 사용농도나 처리 조건 등에 많은 제한이 있다. 또한 아미노기 성분을 갖는 생체재료 특히 콜라겐 기반 재료의 가교에 사용되고 있는 수용성의 카보디이미드는 체내에서 세포독성을 보이지 않으나 과량 사용되어야 가교효과를 나타낼 수 있으며 비싸다는 단점이 있다. However, when divinyl sulfone, bisepoxide, aldehyde, or the like is used as a crosslinking agent, cytotoxicity due to unreacted residues may be a problem, and thus there are many limitations on use concentration and treatment conditions. In addition, the water-soluble carbodiimide used in the crosslinking of biomaterials having amino group components, especially collagen-based materials, does not show cytotoxicity in the body but may exhibit crosslinking effects only when used excessively and is expensive.
이에 본 발명자는 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, 히알루론산 수용액을 동결건조하여 스폰지를 제조한 다음, 이를 저분자 유기산의 안히드리드 (anhydride) 액에 침지시켜 유지한 후 안히드리드를 제거하여 다공성 스폰지를 제조하면 기계적 강도도 항상되며, 통상의 조직배양 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액에 용해하지 않고, 다공성 스폰지의 생분해 속도도 감소되며, 세포독성이 적은 히알루론산 다공성 스폰지를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 저분자 유기산의 안히드리드는 물과 반응하면 쉽게 유기산으로 분해가 되므로 다공성 스폰지에 소량 남아있어도 세포독성이나 기타 독성을 갖지 않는다.Accordingly, the present inventors conducted a study in order to solve the above problems, as a result of lyophilizing a hyaluronic acid aqueous solution to prepare a sponge, and then immersed in an anhydride liquid of a low molecular weight organic acid and maintained after When the porous sponge is prepared by removing the mechanical strength, it is not dissolved in an aqueous solution of pH 4.0 to 7.4, which is a normal tissue culture condition, and the biodegradation rate of the porous sponge is reduced, and a hyaluronic acid porous sponge having low cytotoxicity is produced. It has been found that the present invention has been completed. Anhydrides of low molecular weight organic acids are easily decomposed into organic acids when reacted with water, so even small amounts in the porous sponge do not have cytotoxicity or other toxicity.
본 발명의 목적은 다공성 스폰지의 형태를 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 향상되며, 세포나 조직배양의 조건인 pH 4.0 내지 7.4 정도의 수용액 또는 배지에서 용해되지 않고, 생분해 속도가 늦어진 생체친화성이 높은 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to maintain the shape of the porous sponge for a long time, improve the mechanical strength, bioavailability is not dissolved in an aqueous solution or medium of pH 4.0 to 7.4, which is a condition of the cell or tissue culture, slow biodegradation rate It is to provide a method for producing a high hyaluronic acid porous sponge.
상기의 목적을 이루기 위해 본 발명에 따른 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법은 (1) 분자량 70,000 ~ 4,000,000 정도의 고분자 히알루론산의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0의 알칼리 용액에 녹여 0.5 ~ 5 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만든 후 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절하는 단계;In order to achieve the above object, the method for preparing a hyaluronic acid porous sponge according to the present invention comprises (1) dissolving an alkali salt of high molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of about 70,000 to 4,000,000 in an alkaline solution of pH 9.0 to 14.0 and a concentration of 0.5 to 5% by weight ( adjusting the pH of the aqueous solution to 5.5 to 7.5 after making an aqueous solution of w / v);
(2) 상기 (1)단계의 히알루론산 수용액을 동결건조기의 선반에 넣고 선반의 온도와 진공챔버(vacuum chamber)의 진공도를 적절히 조절하여 24시간 이상 동결건조(lyophilization)하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 단계;(2) The hyaluronic acid aqueous solution of step (1) is placed on the shelf of the freeze dryer, and the hyaluronic acid porous sponge is prepared by lyophilizing for more than 24 hours by appropriately adjusting the temperature of the shelf and the vacuum degree of the vacuum chamber. Doing;
(3) 상기 히알루론산 다공성 스폰지를 5 ~ 100부피% 농도(v/v)의 안히드리드 원액 또는 그 안히드리드를 구성하는 단위 유기산으로 희석한 안히드리드 용액에 침지하여 4℃ ~ 42℃의 온도에서 24시간 내지 72시간 또는 그 이상 유지하는 단계;(3) The hyaluronic acid porous sponge is immersed in an anhydride solution of 5-100% by volume (v / v) of anhydride stock solution or an anhydride solution diluted with the unit organic acid constituting the anhydride, and then 4 ° C to 42 ° C. Maintaining at a temperature of 24 to 72 hours or more;
(4) 다공성 스폰지를 안히드리드 용액에서 꺼낸 후 이를 진공오븐 (vacuum oven)에 넣고 적정한 온도와 진공도를 유지하여 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이며 잔류 안히드리드를 제거하여 백색의 다공성 스폰지를 얻는 단계로 이루어짐을 특징으로 한다. (4) removing the porous sponge from the anhydride solution and placing it in a vacuum oven to maintain the proper temperature and degree of vacuum to increase the mechanical strength of the porous sponge and remove residual anhydride to obtain a white porous sponge. Characterized in that made.
본 발명에 따른 히알루론산 다공성 스폰지는 조직공학의 지지체, 치과용 의용재료, 정형외과용 의용재료, 약물전달 시스템의 담체 등으로 이용될 수 있는 것으로 기대된다. 이는 생체 고분자로서 조직세포의 증식과 부착을 촉진하며, 효소나 기타 활성기(radical)에 의해 분해 되어도 유독한 물질을 생성하지 않고, 또한 세균의 침입에 대한 방어막(barrier)의 역할을 할 뿐 아니라, 세균 증식을 억제하며, 다른 약리활성 물질의 함유와 방출 조절이 용이한 특징을 갖는다. The hyaluronic acid porous sponge according to the present invention is expected to be used as a support for tissue engineering, dental medical materials, orthopedic medical materials, carriers for drug delivery systems and the like. It is a biopolymer that promotes the proliferation and adhesion of tissue cells, does not produce toxic substances even when degraded by enzymes or other radicals, and also acts as a barrier against bacterial invasion. It inhibits bacterial growth and has the characteristics of easily controlling the content and release of other pharmacologically active substances.
종래의 방법들은 생체 적합성이 없는 이 작용성 가교제들을 사용하기 때문에 미 반응한 가교제들에 의한 세포 독성이 문제와 생체적합성의 감소가 필연적이지만, 본 발명의 히알루론산 다공성 스폰지의 경우 생체 내에 다량 존재하는 저분자 유기산의 안히드리드를 이용하기 때문에 생체적합성의 감소가 거의 없을 것을 기대할 수 있다. Conventional methods use these functional crosslinkers that are not biocompatible, so cytotoxicity caused by unreacted crosslinkers is inevitable and a decrease in biocompatibility. However, the hyaluronic acid porous sponge of the present invention is present in large amounts in vivo. Because of the use of anhydrides of low molecular weight organic acids, it can be expected that there will be little loss of biocompatibility.
이하, 본 발명의 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the hyaluronic acid porous sponge of the present invention will be described in more detail step by step as follows.
(1) 분자량 70,000 ~ 4,000,000 정도의 고분자 히알루론산의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0의 알칼리 용액에 녹여 0.5 ~ 5 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만든 후 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절하는 단계;(1) After dissolving an alkali salt of high molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of about 70,000 to 4,000,000 in an alkaline solution of pH 9.0 to 14.0 to make an aqueous solution of 0.5 to 5% by weight (w / v), the pH of the aqueous solution is adjusted to 5.5 to 7.5. Doing;
히알루론산의 알칼리 염, 보다 일반적으로는 히알루론산의 나트륨 염이나 칼륨염이 물에 용해되기 위해서는 물과 히알루론산이 수소결합을 형성하여야 한다. 그러므로 물의 pH를 알칼리 상태로 하면 히알루론산과 결합하여 염을 이룬 나트륨이나 칼륨이 쉽게 해리되어 물과 히알루론산의 수소결합이 더 잘 일어나 히알루론산의 용해 속도가 빨라지게 된다. 녹이고자 하는 히알루론산의 농도와 비례하여 물의 알칼리도를 높이는 것이 좋으나 pH가 너무 높으면 히알루론산이 가수분해 될 염려가 있으므로 보통 pH 9.0 내지 12.0 정도가 되도록 하는 것이 좋다. 일반적으로 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨을 이용하여 물의 알칼리도를 높인다. 히알루론산이 완전히 녹으면 희박염산 용액을 이용하여 히알루론산 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절한다. 히알루론산 수용액의 pH를 중성으로 조절하지 않으면 다음 단계의 동결건조에 의해 수분이 줄면 히알루론산 수용액중의 수산화이온이 농축되어 pH가 급격히 높아져 히알루론산의 분해가 일어날 위험이 있으므로 동결건조 전에 pH를 중성으로 조절하는 것이 바람직하다. In order for the alkali salt of hyaluronic acid, more generally the sodium salt or potassium salt of hyaluronic acid to dissolve in water, water and hyaluronic acid must form a hydrogen bond. Therefore, when the pH of the water is in the alkaline state, sodium or potassium, which is formed by combining with hyaluronic acid, is easily dissociated, so that the hydrogen bond between water and hyaluronic acid is better, and the dissolution rate of hyaluronic acid is increased. It is good to increase the alkalinity of water in proportion to the concentration of hyaluronic acid to be dissolved. However, if the pH is too high, the hyaluronic acid may be hydrolyzed. Generally, sodium or potassium hydroxide is used to increase the alkalinity of water. When the hyaluronic acid is completely dissolved, the pH of the aqueous hyaluronic acid solution is adjusted to 5.5 to 7.5 using a dilute hydrochloric acid solution. If the pH of the aqueous hyaluronic acid solution is not adjusted to neutral, if the water decreases due to the next step of freeze-drying, the hydroxide ions in the aqueous hyaluronic acid solution will be concentrated and the pH will increase rapidly.Therefore, there is a risk of decomposition of hyaluronic acid. It is preferable to adjust to.
(2) 상기 (1)단계의 히알루론산 수용액을 동결건조기의 선반에 넣고 선반의 온도와 진공챔버의 진공도를 적절히 조절하여 24시간 이상 동결건조하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 단계;(2) preparing a hyaluronic acid porous sponge by lyophilizing the hyaluronic acid aqueous solution of step (1) on a shelf of a freeze dryer and appropriately adjusting the temperature of the shelf and the vacuum degree of the vacuum chamber for at least 24 hours;
히알루론산 다공성 스폰지의 공극의 크기는 히알루론산 수용액의 농도와 동결건조 조건에 의해 조절될 수 있다. 일반적으로 히알루론산의 농도가 높으면 공극의 크기가 작으며 더 조밀한 스폰지가 형성된다. 또한 동결건조시 동결 속도가 빠르면 작은 얼음 입자가 형성되므로 스폰지 공극의 크기가 작아지고 동결속도가 느리면 얼음입자가 커져 동결건조 후 공극의 크기가 큰 스폰지가 만들어 진다. 조직공학의 지지체로 사용 가능한 스폰지는 조직 세포가 스폰지 내부로 쉽게 침윤되고 부착되어야 하므로 공극의 크기가 직경 10 ~ 100마이크로미터 정도가 되는 것이 좋다. 히알루론산 0.5 ~ 2.0중량% 농도의 용액을 분당 1 ~ 2℃ 정도의 냉각속도로 동결하면 공극의 크기를 직경 10 ~ 100마이크로미터로 유지할 수 있다. The pore size of the hyaluronic acid porous sponge can be controlled by the concentration of the hyaluronic acid aqueous solution and lyophilization conditions. In general, the higher the concentration of hyaluronic acid, the smaller the pore size and the denser the sponge is formed. In addition, when the freezing speed is high during freeze-drying, small ice particles are formed, so the size of the sponge pores is small, and if the freezing speed is slow, the ice particles are large, and thus the sponges are made larger after freeze-drying. Sponges that can be used as a support for tissue engineering should have a pore size of about 10 to 100 micrometers because the tissue cells must be easily infiltrated and attached to the sponge. The solution of 0.5 to 2.0% by weight of hyaluronic acid can be frozen at a cooling rate of about 1 to 2 ° C. per minute to maintain the pore size at a diameter of 10 to 100 micrometers.
동결건조 중 건조 과정에서는 수분의 승화에 필요한 에너지는 선반을 가열함으로써 얻어질 수 있는데 과량의 열이 가해질 경우에는 스폰지의 재 융해나 콜랩스(collapse)가 일어날 수 있으므로 선반의 온도를 정밀하게 조절하여야 한다. During freeze-drying, the energy required for sublimation of moisture can be obtained by heating the shelf. If excess heat is applied, the temperature of the shelf must be precisely controlled since re-melting of sponges or collapsing may occur. do.
진공챔버의 진공도는 건조 중인 스폰지 온도의 얼음이 갖는 수증기 분압에 따라 설정되고 정밀하게 조절되어야 한다. 일반적으로 얼음의 수증기 분압보다 10 ~ 30 mTorr 정도 낮게 설정하여 동결건조를 수행하는 것이 바람직하다. The vacuum degree of the vacuum chamber must be set and precisely adjusted according to the partial pressure of water vapor of the ice at the sponge temperature being dried. In general, it is preferable to set the freeze-drying to 10 to 30 mTorr lower than the steam partial pressure of ice.
(3) 상기 히알루론산 다공성 스폰지를 5 ~ 100부피% 농도(v/v)의 안히드리드 원액 또는 그 안히드리드를 구성하는 단위 유기산으로 희석한 안히드리드 용액에 침지하여 4℃ ~ 42℃의 온도에서 24시간 내지 72시간 또는 그 이상 유지하는 단계;(3) The hyaluronic acid porous sponge is immersed in an anhydride solution of 5-100% by volume (v / v) of anhydride stock solution or an anhydride solution diluted with the unit organic acid constituting the anhydride, and then 4 ° C to 42 ° C. Maintaining at a temperature of 24 to 72 hours or more;
본 발명에 사용된 안히드리드는 저분자의 유기산의 안히드리드로, 이 저분자 유기산은 생물학적 시스템 중에 광범위하게 존재하는 것이 바람직하다. 그 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아세틱 안히드리드(acetic anhydride), 프로피오닉 안히드리드(propionic anhydride), 부티릭 안히드리드(butyric anhydride), 카프로익 안히드리드(caproic anhydride), 이소부티릭 안히드리드(isobutyric anhydride) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 안히드리드들은 일반적으로 축합반응을 촉진하는 역할을 하여 다공성 스폰지의 강도를 높인다. 이들 안히드리드들은 각 유기산에 섞어 부피%농도를 조정할 수 있다. 예건대, 아세틱 안히드리드는 아세트산, 프로피오닉 안히드리드는 프로피온산, 부티릭 안히드리드는 부티르산과 조합하여 5 ~ 100부피%농도로 사용하는 것이 바람직하다. Anhydrides used in the present invention are anhydrides of low molecular weight organic acids, which are preferably present in a wide range of biological systems. Although the kind is not specifically limited, For example, acetic anhydride, propionic anhydride, butyric anhydride, caproic anhydride ), Isobutyric anhydride and the like are preferably used. These anhydrides generally serve to promote condensation reactions, increasing the strength of the porous sponge. These anhydrides can be mixed with each organic acid to adjust the volume% concentration. For example, it is preferable to use acetic anhydride in acetic acid, propionic anhydride in propionic acid, and butyric anhydride in a concentration of 5 to 100% by volume in combination with butyric acid.
(4) 다공성 스폰지를 안히드리드 용액에서 꺼낸 후 이를 진공오븐 (vacuum oven)에 넣고 적정한 온도와 진공도를 유지하여 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이며 잔류 안히드리드를 제거하여 백색의 다공성 스폰지를 얻는 단계;(4) removing the porous sponge from the anhydride solution and placing it in a vacuum oven to maintain the proper temperature and degree of vacuum to increase the mechanical strength of the porous sponge and remove residual anhydride to obtain a white porous sponge. ;
다공성 스폰지에 남아있는 저분자 유기산과 그 유기산의 안히드리드를 완전히 제거하기 위해 진공오븐에 넣고 절대압력 기준으로 10Torr 이하로 진공을 유지한 체 온도를 80℃ ~ 160℃로 유지한 체 24시간 이상, 더 바람직하게는 48시간 이상 건조한다. 진공도가 충분하지 않은 상태에서 온도가 급격하게 올라가면 스폰지의 분해 일어날 수 있으므로, 진공이 10Torr 이하가 되었을 때 온도를 올리는 것이 바람직하다. 또한, 오븐의 온도가 높아지면 축합반응에 필요한 에너지를 쉽게 공급 받을 수 있어 다공성 스폰지의 기계적 강도를 더 높일 수 있다.In order to completely remove the low-molecular organic acid remaining in the porous sponge and the anhydride of the organic acid, the sieve is placed in a vacuum oven and maintained at a vacuum of 10 Torr or lower on an absolute pressure basis at a temperature of 80 ° C. to 160 ° C. for at least 24 hours. More preferably, it is dried for 48 hours or more. If the temperature rises rapidly in a state where the degree of vacuum is not sufficient, decomposition of the sponge may occur. Therefore, it is preferable to raise the temperature when the vacuum reaches 10 Torr or less. In addition, when the temperature of the oven increases, the energy required for the condensation reaction can be easily supplied, thereby further increasing the mechanical strength of the porous sponge.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예들을 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예들에만 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. However, the present invention is not limited only to these embodiments.
[실시예 1 ~ 4][Examples 1 to 4]
히알루론산 나트륨 (극한점도로부터의 환산 분자량 1 X 106 Da) 0.24g을 상온에서 0.05mol/l 농도의 수산화나트륨용액 20ml에 녹여 0.6중량% 농도의 수용액을 만든다. 이 히알루론산 수용액을 희박 염산용액을 이용하여 pH를 6.8로 조절하였다. 이것을 각각 5ml씩 취하여 4개의 직경 60㎜의 페트리디쉬에 부어 수용액의 두께가 약 2㎜ 정도가 되게 하였다. 이들 페드리디쉬들을 모두 동결건조기의 선반에 옮기고 분당 1.0℃의 냉각속도로 -40℃까지 동결하고 30분간 유지하였다. 동결건조기 진공챔버를 감압하여 챔버의 압력을 100mTorr로 설정하고 선반의 온도를 -38℃로 설정하여 600분 동안 유지하였다. 80분간 선반의 온도를 분당 0.1℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 2mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -30℃, 진공도 260mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -30℃, 진공도 260mTorr에서 360분간 유지하여 동결건조를 계속하였다. 다시 50분간 선반의 온도를 분당 0.2℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 10mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -20℃, 진공도 760mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -20℃, 진공도 760mTorr에서 120분간 유지하며 동결건조를 계속하였다. 다시 50분간 선반의 온도를 분당 0.2℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 23mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -10℃, 진공도 1910mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -10℃, 진공도 1910mTorr에서 120분간 유지하며 동결건조를 계속하였다. 다시 100분간 선반의 온도를 분당 0.4℃의 속도로 올리고, 챔버압력은 30mTorr로 설정하였다. 선반온도 30℃, 진공도 30mTorr에서 180분간 유지하여 동결건조를 완료하였으며, 두께 2㎜, 직경 60㎜를 갖는 미백색의 다공성 스폰지를 1차로 얻었다. 이것 들을 다음 표 1에 기재된 바와 같이 각각 5부피%, 20부피%, 50부피%, 100부피% 농도의 아세틱 안히드리드 (acetic anhydride) 용액에 24시간 동안 침지하여 상온에서 유지한 후, 이 스폰지를 진공오븐으로 옮기고 진공오븐을 감압하여 진공도 20mmHg가 되었을 때 진공오븐을 가열하기 시작하였다. 진공오븐의 온도는 90℃로 설정하여 유지하였으며, 24시간 경과 후 미백색의 다공성 스폰지들을 취하였다. 이렇게 취한 스폰지들을 모두 2등분 한 후 각각 pH 4.1과 7.4의 완충용액에 담가 72시간 동안 방치한 후 취하여 과량의 수분을 제거한 후 무게를 측정하여 스폰지겔 중의 수분함량을 계산한 후 평균하여 함수율로 다음 표 1에 기재하였다.0.24 g of sodium hyaluronate (molecular weight 1 X 10 6 Da converted from the intrinsic viscosity) is dissolved in 20 ml of sodium hydroxide solution at a concentration of 0.05 mol / l at room temperature to form an aqueous solution having a concentration of 0.6% by weight. This hyaluronic acid aqueous solution was adjusted to pH 6.8 using a dilute hydrochloric acid solution. 5 ml each of them was poured into four Petri dishes having a diameter of 60 mm so that the thickness of the aqueous solution was about 2 mm. All these peddishes were transferred to the lyophilizer rack and frozen to −40 ° C. at a cooling rate of 1.0 ° C. per minute and held for 30 minutes. The freeze dryer vacuum chamber was depressurized to set the chamber pressure to 100 mTorr and the shelf temperature to −38 ° C. for 600 minutes. The temperature of the shelf was gradually raised at a rate of 0.1 ° C. per minute for 80 minutes, and the chamber pressure was raised at a rate of 2 mTorr per minute to set the shelf temperature at −30 ° C. and the vacuum degree of 260 mTorr. Freeze drying was continued for 360 minutes at a shelf temperature of -30 ° C. and a vacuum of 260 mTorr. The temperature of the shelf was gradually raised again at a rate of 0.2 ° C. per minute for 50 minutes, and the chamber pressure was set at a rate of 10 mTorr per minute to set the shelf temperature at −20 ° C. and a vacuum of 760 mTorr. Freeze-drying was continued for 120 minutes at a shelf temperature of -20 ° C and a vacuum of 760 mTorr. Again, the temperature of the shelf was gradually raised at a rate of 0.2 ° C. per minute for 50 minutes, and the chamber pressure was set at a rate of 23 mTorr per minute to set the shelf temperature at −10 ° C. and the vacuum degree of 1910 mTorr. Freeze drying was continued for 120 minutes at a shelf temperature of -10 ° C and a vacuum degree of 1910 mTorr. The temperature of the shelf was further raised at a rate of 0.4 ° C. per minute for 100 minutes, and the chamber pressure was set at 30 mTorr. Freeze-drying was completed by maintaining the shelf temperature at 30 ° C. and the vacuum degree of 30 mTorr for 180 minutes to obtain a white, white porous sponge having a thickness of 2 mm and a diameter of 60 mm. These were immersed in an acetic anhydride solution of 5% by volume, 20% by volume, 50% by volume and 100% by volume for 24 hours, and then maintained at room temperature as shown in Table 1 below. The sponge was transferred to a vacuum oven, and the vacuum oven was decompressed to start heating the vacuum oven when the vacuum degree reached 20 mmHg. The temperature of the vacuum oven was set to 90 ° C and maintained, and after 24 hours, white white porous sponges were taken. After diluting the sponges in two parts, they were soaked in buffer solutions of pH 4.1 and 7.4, respectively, and left for 72 hours. Then, the excess moisture was removed, the weight was measured and the water content in the sponge gel was calculated and averaged. It is shown in Table 1.
또, 스폰지의 안정성을 확인하기 위해 완충용액에 침지된 스폰지의 형태를 면밀히 관찰하여 물에 용해되는지의 여부를 판단하였으며, 그 결과를 다음 표 1에 기재하였다.In addition, in order to confirm the stability of the sponge, the shape of the sponge immersed in the buffer solution was carefully observed to determine whether or not dissolved in water, the results are shown in Table 1 below.
또한, 세포독성 여부를 다음과 같이 확인하였다. 이들 다공성 스폰지 각각 50mg을 취한 후 기계적으로 분쇄하고, 이들을 각각 2ml의 세포배양 배지(10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM)에 혼합하여 냉장실(4℃)에 7일간 유지하여 다공성 스폰지 성분이 충분히 추출될 수 있게 하였다. 7일 후 원심분리를 하여 스폰지를 제거하고 상층액만 취하여 이를 각각 6-웰 디쉬의 웰에 넣었다. 각각의 웰에 1X104 세포를 접종하여 배양을 시작하였으며, 배양 시작 후 2일, 4일, 6일, 8일 후에 현미경 상에서 세포 밀도를 관찰하여 세포독성 여부를 확인하였다. 다공성 스폰지에 노출되지 않은 10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM에서 증식하는 세포군을 대조구로 하였다. 이렇게 측정한 세포독성 결과를 다음 표 1에 기재하였다.In addition, the cytotoxicity was confirmed as follows. Take 50 mg of each of these porous sponges and grind them mechanically, and mix them in 2 ml of cell culture medium (DMEM containing 10% by volume fetal calf serum) and keep them in the refrigerating chamber (4 ℃) for 7 days. Allowed to be extracted. After 7 days, the sponge was removed by centrifugation, and only the supernatant was taken and placed in each well of a 6-well dish. Cultivation was started by inoculating 1 × 10 4 cells in each well, and the cytotoxicity was confirmed by observing cell density on a microscope 2, 4, 6, 8 days after the start of the culture. A control group was used to control the cell populations proliferating in DMEM containing 10% by volume fetal calf serum not exposed to the porous sponge. The cytotoxicity results thus measured are shown in Table 1 below.
[실시예 5 ~ 8][Examples 5 to 8]
실시예 1 ~ 4에 있어서 히알루론산 농도가 1.2중량%가 되게 0.48g의 히알루론산 나트륨을 사용하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다. In Examples 1 to 4, 0.48 g of sodium hyaluronate was used so that the concentration of hyaluronic acid was 1.2% by weight. And the same operation as Example 1-4 was performed.
[실시예 9 ~ 12][Examples 9 to 12]
실시예 1 ~ 4에 있어서 5℃, 72시간의 조건으로 아세틱 안히드리드 용액에 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다.In Examples 1-4, it immersed in the acetic anhydride solution on condition of 5 degreeC and 72 hours. And the same operation as Example 1-4 was performed.
[실시예 13 ~ 16][Examples 13 to 16]
실시예 1 ~ 4에 있어서 프로피오닉 안히드리드 용액에 24시간 동안 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다. In Examples 1-4, it was immersed in propionic anhydride solution for 24 hours. And the same operation as Example 1-4 was performed.
[비교예 1]Comparative Example 1
실시예 1 ~ 4에 있어서 아세틱 안히드리드 용액에 침지하는 단계와, 진공오븐에서의 처리 단계를 생략하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하여 1차 스폰지만 취하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.In Examples 1 to 4, the immersion in the acetic anhydride solution and the treatment step in the vacuum oven were omitted. And the same operation as in Examples 1 to 4 was taken only the primary sponge, the cytotoxicity test was not performed.
[비교예 2]Comparative Example 2
실시예 1 ~ 4에 있어서 순수 아세트산에 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.In Examples 1-4, it was immersed in pure acetic acid. And the same operation as in Examples 1 to 4 was carried out, the cytotoxicity test was not performed.
[비교예 3]Comparative Example 3
실시예 5 ~ 8에 있어서 순수 아세트산에 침지하였다. 그리고 실시예 5 ~ 8과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.In Examples 5-8, it was immersed in pure acetic acid. And the same operation as in Examples 5 to 8 was carried out, the cytotoxicity test was not performed.
[비교예 4][Comparative Example 4]
실시예 13 ~ 16에 있어서 순수 프로피온산에 침지하였다. 그리고 실시예 13 ~ 16과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.In Examples 13-16, it was immersed in pure propionic acid. And the same operations as in Examples 13 to 16 were carried out, and no cytotoxicity test was performed.
[비교예 5][Comparative Example 5]
실시예 1 ~ 4에 있어서 100부피%의 아세틱 안히드리드 용액에 침지하였으나,진공오븐에서 강화, 건조하는 단계를 생략하고, 송풍건조 하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.In Examples 1 to 4, but immersed in 100% by volume of the acetic anhydride solution, the step of strengthening and drying in a vacuum oven was omitted, and air-dried. And the same operation as in Examples 1 to 4 was carried out, the cytotoxicity test was not performed.
이상에서 설명한 바와 같이, 히알루론산 용액을 동결건조하여 1차로 제조한 다공성 스폰지를 생체에 널리 분포되어 있는 저분자 유기산의 안히드리드 용액에 침지하고, 진공오븐에서 가온하며 진공건조하여 다공성 스폰지를 제조함으로써, 통상의 세포배양 중의 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액 상에서 스폰지의 형상을 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 강화되며, 세포독성이 거의 없어 생체 적합도가 높은 히알루론산 다공성 스폰지를 만들 수 있다. As described above, the porous sponge prepared by lyophilization of the hyaluronic acid solution is immersed in the anhydride solution of low molecular organic acid widely distributed in living bodies, heated in a vacuum oven, and vacuum dried to prepare the porous sponge. , It is possible to maintain the shape of the sponge for a long time on the aqueous solution of pH 4.0 to 7.4, which is a condition in normal cell culture, mechanical strength is enhanced, there is little cytotoxicity can make a hyaluronic acid porous sponge with high biocompatibility.
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