KR100502473B1 - Method for separation of plasmid DNA - Google Patents
Method for separation of plasmid DNA Download PDFInfo
- Publication number
- KR100502473B1 KR100502473B1 KR10-2001-0069476A KR20010069476A KR100502473B1 KR 100502473 B1 KR100502473 B1 KR 100502473B1 KR 20010069476 A KR20010069476 A KR 20010069476A KR 100502473 B1 KR100502473 B1 KR 100502473B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- plasmid dna
- plasmid
- dna
- host
- edta
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 플라스미드 DNA의 분리방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 1) 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 세포를 알칼린 용해 후 단백질과 지질 등의 불순물을 제거하는 단계; 2) 숙주 유래의 DNA를 제거하는 단계; 3) 박테리아 내독소 제거완충액과 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 숙주 유래의 RNA, 이형 플라스미드 및 박테리아 내독소를 제거하는 단계; 및 4) 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 유전자치료용 플라스미드 DNA의 분리방법에 관한 것이다. 본 발명의 플라스미드 DNA의 분리방법은 독성 유기용매 및 동물기원 효소를 사용하지 않음으로서 고품질의 플라스미드 DNA 생산을 가능하게 한다.The present invention relates to a method for isolating plasmid DNA, and more particularly, 1) removing impurities such as proteins and lipids after alkaline lysis of cells containing plasmid DNA; 2) removing the DNA from the host; 3) removing RNA, heterologous plasmids and bacterial endotoxins from the host using bacterial endotoxin removal buffer and anion exchange chromatography; And 4) relates to a method for separating plasmid DNA for gene therapy comprising the step of purification using gel filtration chromatography. The method for separating plasmid DNA of the present invention enables the production of high quality plasmid DNA by not using toxic organic solvents and animal origin enzymes.
Description
본 발명은 플라스미드 DNA의 분리방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 1) 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 세포를 알칼린 용해 후 단백질과 지질 등의 불순물을 제거하는 단계; 2) 숙주 유래의 DNA를 제거하는 단계; 3) 박테리아 내독소 제거완충액과 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 숙주 유래의 RNA, 이형 플라스미드 및 박테리아 내독소를 제거하는 단계; 및 4) 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 유전자치료용 플라스미드 DNA의 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating plasmid DNA, and more particularly, 1) removing impurities such as proteins and lipids after alkaline lysis of cells containing plasmid DNA; 2) removing the DNA from the host; 3) removing RNA, heterologous plasmids and bacterial endotoxins from the host using bacterial endotoxin removal buffer and anion exchange chromatography; And 4) relates to a method for separating plasmid DNA for gene therapy comprising the step of purification using gel filtration chromatography.
21세기 게놈의학시대를 맞아 유전자치료(gene therapy)가 현대의학으로 완치가 불가능한 난치병을 치료할 수 있는 유일한 대안으로 인식되면서 활발히 연구되고 있다(Mark, A. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 12744; Anderson, W. F., Science, 1992, 256, 808; Meager, A., et al., Trends Biotechnol., 1994 , 12, 108). 유전자치료란 정상유전자 및 치료유전자를 병소에 전달하여 결손유전자를 교정하거나 세포에 새로운 기능을 제공하여 질병을 치료하는 기술을 말하며 질병치료 등을 목적으로 인체에 투여하기 위해 제조된 유전물질 또는 유전물질을 이입한 세포로 구성된 의약품을 유전자치료제라 한다. 기존의 약물들이 질환의 증상치료에 초점을 맞췄다면 유전자치료는 질환의 원인을 제거하는 것으로 혁신적인 신개념의 치료법이라고 할 수 있다.In the 21st century genome medicine era, gene therapy is being actively studied as it is recognized as the only alternative to the treatment of incurable diseases that cannot be cured by modern medicine (Mark, AK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1997). , 94, 12744; Anderson, WF, Science , 1992 , 256, 808; Meager, A., et al., Trends Biotechnol. , 1994 , 12, 108). Gene therapy refers to a technology for treating diseases by correcting defective genes by providing normal genes and therapeutic genes to lesions or by providing new functions to cells. Genetic materials or genetic materials manufactured for administration to the human body for the purpose of treating diseases. Drugs composed of the cells into which is introduced is called gene therapy. While existing drugs focus on treating symptoms of the disease, gene therapy is an innovative new concept of treatment that eliminates the cause of the disease.
유전자치료제를 구성하는 핵심요소에는 치료유전자와 그 유전자를 전달하는 벡터가 있다. 치료유전자는 실제 치료효과를 나타내는 물질로 대상질환에 따라 그 종류가 다양하다. 현재 가장 활발히 연구가 진행 중인 암유전자치료제의 경우 암세포의 증식을 억제하는 종양억제 유전자 (예 : p53 유전자, Fujiwara, T., et al., J. Natl. Cancer Inst., 1994, 86, 1458; Liu, T. J., et al., Cancer Res., 1994, 54, 3662), 직접적인 암세포의 사멸을 유도하는 자살유전자 (예 : HSV-tk 유전자, Culver, K. W., et al., 1992, Science, 256, 1550; Vile, R. G., et al., 1994, Cancer Res., 54, 6228), 그리고 면역반응을 통해 암세포를 제거하는 사이토카인 유전자(예 : IL2 유전자, Sobol, R. E., et al., Gene Ther., 1995, 2, 164; Golumbek, P. T., et al., Science, 1991, 254, 713; Gansbacher, B., et al., J. Exp. Med., 1990, 172, 1217) 등이 치료유전자에 속한다. 유전자치료제의 또 다른 핵심요소인 벡터는 치료유전자를 생체 내로 전달하는 물질로, 이는 유전자치료제의 효력을 결정하는데 매우 중요한 역할을 담당한다.Key components of gene therapy products include therapeutic genes and vectors that deliver the genes. Therapeutic gene is a substance that shows the actual therapeutic effect and its types vary according to the target disease. Currently, the most actively studied cancer gene therapy products are tumor suppressor genes that inhibit the proliferation of cancer cells (eg, p53 gene, Fujiwara, T., et al., J. Natl. Cancer Inst. , 1994 , 86, 1458; Liu, TJ, et al., Cancer Res. , 1994 , 54, 3662), suicide genes that induce direct cancer cell death (e.g. HSV-tk gene, Culver, KW, et al., 1992 , Science , 256) , 1550; Vile, RG, et al., 1994 , Cancer Res. , 54, 6228), and cytokine genes that remove cancer cells through an immune response (e.g. IL2 gene, Sobol, RE, et al., Gene Ther ., 1995, 2, 164; . Golumbek, PT, et al, Science, 1991, 254, 713; Gansbacher, B., et al., J. Exp. Med. , 1990 , 172, 1217) and the like are among the therapeutic genes. Vectors, another key component of gene therapy products, are substances that deliver therapeutic genes in vivo, which play an important role in determining the efficacy of gene therapy products.
유전자치료제에 사용되는 벡터는 크게 바이러스성과 비바이러스성 벡터로 나뉜다. 바이러스성 벡터는 효율성면에서 우수한 장점을 갖고 있어 널리 사용되고 있으나, 벡터가 병원체인 바이러스로부터 유래되었다는 점과 레트로바이러스의 경우 숙주세포의 염색체내에 삽입되어서 작용하는 점으로 인해 안전성의 문제를 가지고 있다. 그로 인해 최근 유전자치료 연구는 비바이러스성 벡터를 이용한 방법으로 전환되어가고 있다. 비바이러스성 벡터는 크게 네이키드(naked) 플라스미드 DNA 방법과 리포좀(liposome)을 이용한 방법으로 나누어지며 그중 네이키드 플라스미드 DNA 방법이 최근 각광을 받고 있다. 이는 치료유전자를 플라스미드 DNA라는 유전자 운반체에 삽입한 후 리포좀같은 유전자 이입을 도와주는 물질을 사용하지 않고 직접 체내에 주사하는 것을 말한다. 유전자의 발현이 일시적이고 근육세포 등 일부 세포에서만 유전자의 발현이 일어난다는 단점이 있으나 삽입 가능한 치료유전자 크기의 제한이 거의 없다는 점과 바이러스성 벡터나 다른 비바이러스성 벡터에 비해 월등한 안전성이 이 방법의 큰 장점이다. Vectors used in gene therapy products are largely divided into viral and nonviral vectors. Viral vectors have been widely used because they have excellent advantages in efficiency, but have a safety problem due to the fact that the vector is derived from a virus, which is a pathogen, and the retrovirus is inserted into the chromosome of the host cell. As a result, recent gene therapy research has shifted to nonviral vectors. Non-viral vectors are largely divided into naked plasmid DNA method and liposome method, and among them, naked plasmid DNA method has been in the spotlight recently. This means that the therapeutic gene is inserted into a gene carrier called plasmid DNA and injected directly into the body without the use of a substance that aids in transduction such as liposomes. Although the gene expression is transient and gene expression occurs only in some cells such as muscle cells, there are few limitations on the size of the insertable therapeutic gene and superior safety compared to viral or other nonviral vectors. It's a big advantage.
네이키드 플라스미드 DNA가 유전자치료제로 사용되기 위해서는 의약품 품질규격에 적합하여야 한다. 유전자치료에 대한 연구와 임상시험이 활발히 진행됨에 따라 세계 각국에서는 유전자치료제에 대한 엄격한 품질규격을 설정하여 그 품질규격을 통과해야만 의약품으로 허가를 받고 사용할 수가 있다. 유전자치료제로 사용되는 플라스미드 DNA는 대장균을 생산용 숙주세포로 이용하여 제조되기 때문에 숙주유래 불순물들, 예를 들어 E.coli 염색체 DNA, E.coli 단백질, E.coli RNA, 그리고 박테리아 내독소 등의 함량 등을 중요한 품질평가 기준으로 삼고 있다 (표 1 참조).Naked plasmid DNA must comply with drug quality standards in order to be used as a gene therapy product. As research and clinical trials on gene therapy are actively conducted, countries around the world have to set strict quality standards for gene therapy products and pass the quality standards before they can be approved and used as pharmaceuticals. Plasmid DNA, which is used as a gene therapy product, is produced using Escherichia coli as a host cell for production, so that host-derived impurities such as E. coli chromosomal DNA, E. coli protein, E. coli RNA, and bacterial endotoxin Content is an important quality criterion (see Table 1 ).
현재 고품질의 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 여러 가지 방법들이 사용되고 있는 데, 그 중 전통적인 방법은 하기와 같다 (Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989). 미생물세포를 알칼린 용해시키고 아세테이트 중화에 의해 숙주세포의 염색체 DNA, 단백질 및 세포막 등을 침전시킨 다음 원심분리로 이들 침전물을 제거한다. 이 과정에서 숙주 RNA를 제거하기 위해 RNase를 처리하기도 한다. 여기서 얻어진 상등액은 플라스미드 DNA를 함유하는데, 이를 알코올로 침전시킨 후 에티듐 브로마이드/세슘 클로라이드의 존재 하에서 농도구배 초원심분리를 실시한 후 원하는 DNA를 분리한다. 잔존하는 에티듐 브로마이드를 제거하기 위해 부탄올로 추출한 다음 알코올을 사용하여 DNA를 침전시킨다. 이후 숙주유래 단백질을 제거하기 위해 페놀 또는 페놀-클로로포름의 혼합물을 사용하여 반복 추출한다. 여기서 얻어진 플라스미드 DNA를 알코올로 침전시킨 후 이소아밀 알콜-클로로포름 추출을 반복하여 잔존 페놀을 제거한다. 최종적으로 알코올로 플라스미드 DNA를 침전시킨다.Various methods are currently used to prepare high quality plasmid DNA, of which traditional methods are as follows (Sambrook, et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989 ). The microbial cells are alkaline lysed and the chromosomal DNA, protein and cell membrane of the host cell are precipitated by acetate neutralization, and these precipitates are removed by centrifugation. In the process, RNase is also treated to remove host RNA. The supernatant obtained here contains plasmid DNA, which is precipitated with alcohol, followed by concentration gradient ultracentrifugation in the presence of ethidium bromide / cesium chloride, followed by separation of the desired DNA. Extract with butanol to remove remaining ethidium bromide and then precipitate the DNA with alcohol. This is followed by repeated extraction using a mixture of phenol or phenol-chloroform to remove host-derived protein. The plasmid DNA obtained here is precipitated with alcohol and then isoamyl alcohol-chloroform extraction is repeated to remove residual phenol. Finally plasmid DNA is precipitated with alcohol.
상기 방법은 소규모 또는 실험실 규모에서 플라스미드 DNA를 얻는데는 적합하지만 대량 생산에 적용하는 데는 여러 가지 단점을 갖고 있다. 첫째, 라이소자임, RNase 등의 동물유래 효소들을 이용하기 때문에 바이러스 오염물이 최종 산물에 존재하게 될 위험성이 있다. 둘째, 정제과정에 이용되는 페놀과 클로로포름 같은 용매들은 독성이 있으므로 최종산물을 의약품으로 사용하기 위해서는 이 물질들을 완전히 제거해주는 공정이 필요하고 이 용매들의 저장과 폐기물 처리에 많은 비용이 들게 되므로 시간적, 금전적 낭비가 불가피하다. 셋째, 세슘클로라이드는 고가의 화합물로 산업 공정에 사용되기에는 부적합하다. 마지막으로 에티듐 브로마이드의 경우 독성이 있고 돌연변이 유발물질이며 플라스미드 DNA의 니킹(nicking)을 유발하는 것으로 알려져 있으며 그 제거정도를 확인할 정확한 분석방법도 없기 때문에 의약품제조공정에 사용하기에는 적합하지 않다. The method is suitable for obtaining plasmid DNA on a small scale or on a laboratory scale, but has several disadvantages in application in mass production. First, the use of animal-derived enzymes such as lysozyme, RNase, there is a risk that viral contaminants will be present in the final product. Second, solvents such as phenol and chloroform used in the refining process are toxic, so in order to use the final product as a medicine, a process that completely removes these substances is required, and the storage and waste disposal of these solvents are expensive, so that time and money are required. Waste is inevitable. Third, cesium chloride is an expensive compound and is not suitable for use in industrial processes. Finally, ethidium bromide is toxic, mutagenic, known to cause nicking of plasmid DNA, and is not suitable for use in pharmaceutical manufacturing because there is no accurate assay to confirm its removal.
따라서, 최근에는 플라스미드 DNA의 제조에 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 방법들이 주로 사용되고 있으며 그중 대표적인 것은 미국의 바이칼(Vical)사 (Nancy, et al., Hum. Gene. Ther., 6, 565, 1995; Guilherme, et al., Biotechnol. Prog., 15, 725, 1999; Marquet, et al., USP 5,561,064, 1996)와 독일의 콰이아젠(QIAGEN)사 (Colpan, et al., USP 5,747,663, 1998)의 방법들이다. 바이칼사의 방법은 배양세포를 알칼린 용해법을 이용하여 파쇄한 후 파쇄액을 암모늄 아세테이트로 청징화한다. 청징물을 폴리에틸렌 글리콜을 이용, 플라스미드 DNA를 농축시킨 후 음이온 교환 크로마토그래피 그리고/또는 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드를 정제하는 방법이다. 콰이아젠사의 방법은 알칼린 용해법을 이용하여 세포를 파쇄한 후 박테리아 내독소 제거완충액과 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드를 정제하는 방법이다. 그러나 이들 두 방법들도 몇가지 단점들을 갖고 있다. 즉, 바이칼사 방법의 경우 숙주유래 단백질, 숙주유래 DNA 및 RNA 등을 제거하는 데에는 탁월한 방법이지만 박테리아 내독소를 제거하는 능력이 떨어지고 최종산물에서 단량체 함량이 90% 이상에 도달하지 못한다. 콰이아젠사의 방법은 박테리아 내독소를 제거하는 데에는 탁월하지만 숙주유래 DNA의 분리능력이 부족하며 숙주유래 RNA를 제거하기 위해 동물 기원 효소인 RNase를 이용한다는 점이 단점이다. 또한, 바이칼사의 방법과 마찬가지로 최종산물이 단량체 함량 90% 이상에 도달하지 못한다.Therefore, in recent years, methods using column chromatography are mainly used for the preparation of plasmid DNA, and representative examples thereof are those of Vical, USA (Nancy, et al., Hum. Gene. Ther. , 6, 565, 1995 ; Guilherme). , et al., Biotechnol.Prog., 15, 725, 1999 ; Marquet, et al., USP 5,561,064 , 1996 ) and QIAGEN, Germany (Colpan, et al., USP 5,747,663, 1998 ). admit. Baikal's method crushes the cultured cells using alkaline lysis and then clarifies the lysate with ammonium acetate. The clarifier is a method of concentrating plasmid DNA using polyethylene glycol and then purifying the plasmid using anion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography. Qiagen's method is a method of crushing cells using alkaline lysis and purifying plasmids using bacterial endotoxin removal buffer and anion exchange chromatography. However, these two methods also have some disadvantages. In other words, the Baikal method is an excellent method for removing host-derived protein, host-derived DNA and RNA, but the ability to remove bacterial endotoxins and monomer content in the final product does not reach more than 90%. Qiagen's method is excellent for removing bacterial endotoxins, but lacks the ability to separate host-derived DNA and uses animal-derived RNase to remove host-derived RNA. In addition, like the method of Baikal, the final product does not reach more than 90% monomer content.
이에, 본 발명자들은 유전자 치료용으로 사용할 수 있는 고품질의 플라스미드 DNA의 분리과정에서 발생하는 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 독성 유기용매 및 동물기원효소를 사용하지 않는 플라스미드 DNA의 분리방법을 개발하였으며 본 발명의 방법에 의해 플라스미드 DNA의 품질을 획기적으로 높일 수 있을 뿐 아니라 산업적 이용을 위한 대량생산(scale up)도 가능하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made diligent efforts to solve the above problems arising from the separation of high quality plasmid DNA that can be used for gene therapy. The present invention was completed by confirming that the method of the present invention not only drastically improves the quality of the plasmid DNA, but also enables mass production for industrial use.
본 발명의 목적은 유전자 치료용으로 사용할 수 있는 고품질의 플라스미드 DNA의 제조방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for producing high quality plasmid DNA that can be used for gene therapy.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 치료용으로 사용할 수 있는 고품질의 플라스미드 DNA의 분리방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for separating high quality plasmid DNA that can be used for gene therapy.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 유전자치료용으로 사용할 수 있는 플라스미드 DNA의 분리방법은 1) 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 세포를 알칼린 용해 후 단백질과 지질 등의 불순물을 제거하는 단계; 2) 숙주 유래의 DNA를 제거하는 단계; 3) 박테리아 내독소 제거완충액과 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 숙주 유래의 RNA, 이형 플라스미드 및 박테리아 내독소를 제거하는 단계; 및 4) 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계로 구성된다.Separation method of plasmid DNA that can be used for gene therapy of the present invention comprises the steps of 1) removing impurities such as proteins and lipids after alkaline lysis of cells containing plasmid DNA; 2) removing the DNA from the host; 3) removing RNA, heterologous plasmids and bacterial endotoxins from the host using bacterial endotoxin removal buffer and anion exchange chromatography; And 4) purifying using gel filtration chromatography.
본 발명자들은 상기의 과정을 거쳐 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다. The present inventors have isolated and purified plasmid DNA from E. coli through the above process.
단계 1에 있어서, 단백질과 지질 등의 불순물들은 암모늄 아세테이트 침전 또는 페놀-클로로포름 침전을 이용하여 제거될 수 있으나 암모늄 아세테이트 침전법을 사용하는 것이 바람직하다.In step 1, impurities such as proteins and lipids can be removed using ammonium acetate precipitation or phenol-chloroform precipitation, but ammonium acetate precipitation is preferred.
단계 2에 있어서, 숙주유래의 DNA는 폴리에틸렌 글리콜 침전 또는 니트로 셀룰로즈 막 흡착법 등을 이용하여 제거될 수 있으나 폴리에틸렌 글리콜 침전법을 사용하는 것이 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜 침전은 3% 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킨 후 상등액을 취해 다시 10% 폴리에틸렌 글리콜로 상등액내의 플라스미드를 침전시키는 것이 바람직하다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 침전단계는 유전자 치료제 플라스미드 DNA 내에 잔존하는 E.coli 염색체 DNA 제거에 효과적이다.In step 2, the host-derived DNA can be removed using polyethylene glycol precipitation or nitro cellulose membrane adsorption, but preferably polyethylene glycol precipitation is used. Polyethylene glycol precipitation is preferably precipitated with 3% polyethylene glycol, then the supernatant is taken and again precipitated plasmid in the supernatant with 10% polyethylene glycol. The polyethylene glycol precipitation step is effective to remove E. coli chromosomal DNA remaining in the gene therapeutic plasmid DNA.
단계 3의 음이온 교환크로마토그래피를 이용한 정제는 1부피의 박테리아 내독소 제거완충액과 반응시킨 후 단계별 농도구배를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 용출완충액은 0.5~1 M NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0)인 것이 바람직하고 음이온 교환수지로는 파마시아(Pharmacia)사의 Q-세파로즈가 바람직하지만 다른 유사한 성질의 음이온 교환수지도 사용 가능하다. Purification using the anion exchange chromatography of step 3 is preferably performed by using a concentration gradient after reacting with one volume of bacterial endotoxin removal buffer. At this time, the elution buffer is preferably 0.5 ~ 1 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8.0) and Q-sepharose of Pharmacia is preferred as an anion exchange resin, but other anions of similar properties Exchange resins are also available.
또한, 단계 4의 젤여과 크로마토그래피를 이용한 정제는 150 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 젤여과 수지로는 파마시아사의 세파크릴 S-1000이 바람직하지만 다른 유사한 성질의 젤여과 수지도 사용이 가능하다. In addition, it is preferable to use 150 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8.0) buffer for purification using the gel filtration chromatography of step 4. The gel filtration resin used here is preferably Sephacryl S-1000 from Pharmacia, but other similar filtration gel filtration resins may be used.
상기의 과정을 거쳐 분리ㆍ정제된 플라스미드 DNA의 각 분획(fraction)들을 아가로즈 젤 전기영동을 수행하여 확인한 결과, RNA, 중합체 플라스미드 및 단량체 플라스미드의 용출분획을 확인하였으며(도 1 참조), 플라스미드 DNA의 분리가 잘 이루어졌다는 것을 젤 상에서 확인할 수 있었다(도 2 참조). 이중 90% 이상의 단량체 함량을 가진 플라스미드 분획을 모아 에탄올로 플라스미드 DNA를 침전시켰다.As a result of agarose gel electrophoresis of each fraction of the plasmid DNA isolated and purified through the above procedure, the elution fractions of RNA, polymer plasmid and monomer plasmid were confirmed (see FIG. 1 ). It could be confirmed on the gel that the separation was well done (see FIG. 2 ). Of these, plasmid fractions having a monomer content of 90% or more were collected and plasmid DNA was precipitated with ethanol.
본 발명자들은 상기에서 수득한 플라스미드 DNA 침전물을 사용하여 젤 여과 크로마토그래피를 수행함으로써 정제하였다. 플라스미드의 용출분획을 받아 아가로즈 젤 전기영동법을 사용하여 플라스미드 DNA를 확인한 후 플라스미드 DNA 분획을 모아 에탄올로 침전하여 최종 정제된 플라스미드 DNA를 얻었다. 그 결과, 플라스미드 DNA의 용출곡선을 확인하였으며(도 3 참조), 플라스미드의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다는 것을 젤상에서 확인할 수 있었다(도 4 및 도 5 참조).The inventors have purified by performing gel filtration chromatography using the plasmid DNA precipitate obtained above. After receiving the elution fraction of the plasmid, the plasmid DNA was confirmed by agarose gel electrophoresis, and then the plasmid DNA fractions were collected and precipitated with ethanol to obtain the final purified plasmid DNA. As a result, the elution curve of the plasmid DNA was confirmed (see FIG. 3 ), and it was confirmed on the gel that the plasmid was separated and purified well (see FIGS . 4 and 5 ).
한편, 최종 정제된 플라스미드는 상기된 유전자 치료제 플라스미드 품질규격에 적합한 고순도의 플라스미드임을 확인하였으며(표 2 참조), 정제공정 각 단계의 플라스미드 수율과 이물질의 제거정도를 분석한 결과 최종 정제 수율은 35%로 나타났다(표 3 참조).On the other hand, it was confirmed that the final purified plasmid was a high purity plasmid suitable for the above-described gene therapeutic plasmid quality standard (see Table 2 ). As a result of analyzing the plasmid yield and the degree of removal of foreign substances at each step of the purification process, the final purification yield was 35%. (See Table 3 ).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 플라스미드 DNA의 분리 및 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제Example 1 Isolation of Plasmid DNA and Purification by Anion Exchange Chromatography
본 발명자들은 하기의 과정을 거쳐 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 인비트로젠(Invitrogen, California, USA)사의 발현벡터인 pcDNA4 플라스미드로 형질전환된 대장균 DH5α/pcDNA4 균주 배양액을 12,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 균체 약 180 g을 수득하였다. 분리된 균체를 PBS(phosphate buffered saline) 완충액으로 2회 세척한 후 세척된 균체 180 g에 1.4 ℓ의 용해완충액 1(lysis buffer 1, 61 mM 포도당, 10 mM 트리스, 50 mM EDTA)을 첨가하여 현탁시켰다. 상기 현탁액에 용해완충액 2(lysis buffer 2, 10 mM NaOH, 1% SDS) 2.8 ℓ를 넣고 조심스럽게 섞어준 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용해완충액 3(lysis buffer 3, 5 M 아세트산 칼륨:빙초산:증류수=120:23:57) 2.1 ℓ를 넣고 섞어준 후 빙조에서 30분 동안 반응시켰다. 상기의 과정을 통해 파쇄된 균체를 12,000 g로 30분간 원심분리하여 제거하고 상등액을 회수하였다. The present inventors have isolated and purified plasmid DNA from E. coli through the following process. Specifically, E. coli DH5α / pcDNA4 strain cultures transformed with the pcDNA4 plasmid, which is an expression vector of Invitrogen, California, USA, were centrifuged at 12,000 g for 30 minutes to obtain about 180 g of the cells. The isolated cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline) buffer, and then suspended in 180 g of the washed cells by adding 1.4 L of lysis buffer 1 (lysis buffer 1, 61 mM glucose, 10 mM Tris, 50 mM EDTA). I was. 2.8 L of lysis buffer 2 (lysis buffer 2, 10 mM NaOH, 1% SDS) was added to the suspension, mixed carefully, and allowed to react at room temperature for 5 minutes. After the reaction was completed, 2.1 L of lysis buffer 3 (lysis buffer 3, 5 M potassium acetate: glacial acetic acid: distilled water = 120: 23: 57) was mixed and reacted in an ice bath for 30 minutes. The cells crushed through the above process was removed by centrifugation at 12,000 g for 30 minutes and the supernatant was recovered.
상등액에 0.6부피의 이소프로필 알콜을 처리하여 상등액 내의 RNA, 플라스미드 DNA 등의 핵산을 침전시킨 후 침전물을 20 ㎖의 TE(10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0) 완충액에 재현탁시켰다. 현탁액에 10 M 암모늄 아세테이트를 최종 농도 2.5 M이 되도록 첨가하고 잘 섞은 후 빙조에서 15분 동안 반응시키고 12,000 g로 15분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액을 회수하였다. 상기 상등액에 30% 폴리에틸렌 글리콜/1.6 M NaCl 완충액을 최종 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 10% 되도록 첨가한 후 빙조에서 30분 동안 반응시키고 12,000 g로 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전물을 수득하였다. 침전물을 20 ㎖의 TE 완충액에 완전히 재현탁시킨 후 박테리아 내독소 제거 완충액(20% IGEPAL CA-630, 750 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0) 20 ㎖를 첨가하여 섞은 후 빙조에서 1시간 동안 반응시켰다.The supernatant was treated with 0.6 volume of isopropyl alcohol to precipitate nucleic acids such as RNA and plasmid DNA in the supernatant, and the precipitate was resuspended in 20 ml of TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) buffer. 10 M ammonium acetate was added to the suspension to a final concentration of 2.5 M, mixed well, reacted for 15 minutes in an ice bath, and centrifuged at 12,000 g for 15 minutes to remove the precipitate, and the supernatant was recovered. 30% polyethylene glycol / 1.6 M NaCl buffer was added to the supernatant so that the concentration of the final polyethylene glycol was 10%, reacted for 30 minutes in an ice bath, and centrifuged at 12,000 g for 15 minutes to remove the supernatant, thereby obtaining a precipitate. The precipitate was completely resuspended in 20 ml of TE buffer, mixed with 20 ml of bacterial endotoxin removal buffer (20% IGEPAL CA-630, 750 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) and mixed in an ice bath. The reaction was carried out for 1 hour.
상기 반응이 끝난 후 Q-세파로스를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 플라스미드 DNA를 분리ㆍ정제하였다. 음이온 교환수지에 결합된 음이온성 물질 중 플라스미드 DNA를 용출시키는 방법으로 먼저 500 mM NaCl, 10mM 트리스, 1mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하여 음이온 수지를 충분히 세척해준 후 750 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하여 RNA를 용출시키고 775 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하여 이형의 플라스미드를 용출시킨 다음 780 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하여 플라스미드를 용출시키는 단계적 농도구배(density gradient) 방법을 사용하였다. 플라스미드 DNA는 각 분획(fraction)들을 아가로즈 젤 전기영동을 수행하여 확인하였다. After the reaction was completed, anion exchange chromatography was performed using Q-Sepharose to isolate and purify the plasmid DNA. As a method of eluting plasmid DNA among anionic substances bound to an anion exchange resin, the anionic resin was thoroughly washed with 500 mM NaCl, 10 mM Tris, and 1 mM EDTA (pH8.0) buffer, and then 750 mM NaCl, 10 mM Tris RNA was eluted using 1 mM EDTA (pH8.0) buffer and heterologous plasmid was eluted using 775 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH8.0) buffer and then 780 mM NaCl, 10 mM. Tris, 1 mM EDTA (pH 8.0) buffer was used to elute the plasmid using a density gradient method. Plasmid DNA was identified by performing agarose gel electrophoresis on each fraction.
그 결과, RNA, 중합체 플라스미드 및 단량체 플라스미드의 용출분획을 확인하였으며(도 1), 플라스미드 DNA의 분리가 잘 이루어졌다는 것을 젤 상에서 확인할 수 있었다(도 2). 이중 90% 이상의 단량체 함량을 가진 플라스미드 분획을 모아 에탄올로 플라스미드 DNA를 침전시켰다.As a result, the elution fraction of RNA, polymer plasmid and monomer plasmid was confirmed ( FIG. 1 ), and the separation of plasmid DNA was well confirmed on the gel ( FIG. 2 ). Of these, plasmid fractions having a monomer content of 90% or more were collected and plasmid DNA was precipitated with ethanol.
<실시예 2> 젤 여과 크로마토그래피를 통한 플라스미드 DNA 정제Example 2 Purification of Plasmid DNA by Gel Filtration Chromatography
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 수득한 플라스미드 DNA 침전물을 사용하여 젤 여과 크로마토그래피를 수행함으로써 정제하였다. 구체적으로, 플라스미드 침전물을 150 mM NaCl, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH8.0) 완충액을 사용하여 재현탁시킨 후 젤여과 수지인 세파크릴 S-1000에서 젤 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 플라스미드의 용출을 위해 사용한 완충액은 상기의 현탁액과 동일하고 용출물질들의 분획을 받아 아가로즈 젤 전기영동법을 사용하여 플라스미드 DNA를 확인한 후 플라스미드 DNA 분획을 모아 에탄올로 침전하여 최종 정제된 플라스미드 DNA를 얻었다.The present inventors purified by performing gel filtration chromatography using the plasmid DNA precipitate obtained in <Example 1>. Specifically, the plasmid precipitate was resuspended using 150 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8.0) buffer, and gel filtration chromatography was performed on Sephacryl S-1000, a gel filtration resin. The buffer used for elution of the plasmid was the same as the above suspension, the fractions of the eluents were obtained, and the plasmid DNA was identified using agarose gel electrophoresis. The plasmid DNA fractions were collected and precipitated with ethanol to obtain the final purified plasmid DNA.
그 결과, 플라스미드 DNA의 용출곡선을 확인하였으며(도 3), 플라스미드의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다는 것을 젤상에서 확인할 수 있었다(도 4 및 도 5).As a result, the elution curve of the plasmid DNA was confirmed ( FIG. 3 ), and it was confirmed on the gel that the plasmid was separated and purified well ( FIGS. 4 and 5 ).
한편, 최종 정제된 플라스미드는 상기된 유전자 치료제 플라스미드 품질규격에 적합한 고순도의 플라스미드임을 확인하였으며(표 2), 정제공정 각 단계의 플라스미드 수율과 이물질의 제거정도를 분석한 결과 최종 정제 수율은 35%로 나타났다(표 3).On the other hand, it was confirmed that the final purified plasmid was a high purity plasmid suitable for the above-described gene therapeutic plasmid quality standard ( Table 2 ). Appeared ( Table 3 ).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 플라스미드 DNA 분리방법은 독성 유기용매 및 동물기원효소를 사용하지 않음으로써 유전자 치료용으로 사용이 가능한 고품질의 안전한 플라스미드 DNA를 경제적으로 제조할 수 있으며, 플라스미드 DNA 유전자 치료제의 산업적 대량생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the plasmid DNA separation method of the present invention can economically prepare high-quality safe plasmid DNA that can be used for gene therapy by not using toxic organic solvents and animal origin enzymes, and plasmid DNA gene therapeutics. It can be very useful for industrial mass production.
도 1은 단계별 농도구배를 이용한 음이온 교환 트로마토그래피의 용출곡선을 보여주는 그래프이고, 1 is a graph showing the elution curve of anion exchange chromatography using the concentration gradient step by step,
∧ : 용출곡선, － : 농도구배,∧: dissolution curve, －: concentration gradient,
1 : RNA, 2 : 중합체 플라스미드, 3 : 단량체 플라스미드1: RNA, 2: polymer plasmid, 3: monomer plasmid
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피의 용출분획을 확인한 아가로스젤 전기영동 사진이고, 2 is agarose gel electrophoresis picture confirming the elution fraction of the anion exchange chromatography,
A : RNA, B : 중합체 플라스미드, C : 단량체 플라스미드A: RNA, B: polymer plasmid, C: monomer plasmid
도 3은 젤 여과 크로마토그래피의 용출곡선을 보여주는 그래프이고, 3 is a graph showing the dissolution curve of gel filtration chromatography,
도 4는 젤 여과 크로마토그래피의 용출곡선을 확인한 아가로스젤 전기영동 사진이고, 4 is an agarose gel electrophoresis picture confirming the dissolution curve of the gel filtration chromatography,
도 5는 최종 정제된 플라스미드 DNA를 확인한 아가로스젤 전기영동 사진이다. Figure 5 is agarose gel electrophoresis confirmed the final purified plasmid DNA.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0069476A KR100502473B1 (en) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | Method for separation of plasmid DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0069476A KR100502473B1 (en) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | Method for separation of plasmid DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030038063A KR20030038063A (en) | 2003-05-16 |
| KR100502473B1 true KR100502473B1 (en) | 2005-07-20 |
Family
ID=29568554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0069476A KR100502473B1 (en) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | Method for separation of plasmid DNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100502473B1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100850430B1 (en) * | 2006-12-11 | 2008-08-05 | (주)바이오니아 | Method for isolating a nucleic acid using particulate matter and a compositions therefor |
| KR100950160B1 (en) | 2009-07-15 | 2010-03-30 | 이영주 | Open and close apparatus of button sliding type for liquid instrument |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5561064A (en) * | 1994-02-01 | 1996-10-01 | Vical Incorporated | Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA |
| WO1998005767A1 (en) * | 1996-08-06 | 1998-02-12 | Vical Incorporated | Purification of plasmid dna by peg-precipitation and column chromatography |
-
2001
- 2001-11-08 KR KR10-2001-0069476A patent/KR100502473B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5561064A (en) * | 1994-02-01 | 1996-10-01 | Vical Incorporated | Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA |
| WO1998005767A1 (en) * | 1996-08-06 | 1998-02-12 | Vical Incorporated | Purification of plasmid dna by peg-precipitation and column chromatography |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Biochemistry. 1981 Jun 23;20(13):3748-56, Hillen W * |
| Biotechnol Prog. 1999 Jul-Aug;15(4):725-31, Ferreira GN, 본원에 언급된 논문 * |
| Hum Gene Ther. 1995 May;6(5):565-73, Horn NA, 본원에 언급된 논문 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20030038063A (en) | 2003-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tomcsányi et al. | Processing enzyme ribonuclease E specifically cleaves RNA I: an inhibitor of primer formation in plasmid DNA synthesis | |
| Horn et al. | Cancer gene therapy using plasmid DNA: purification of DNA for human clinical trials | |
| JP3847779B2 (en) | Method for producing nucleic acid and / or oligonucleotide free of endotoxin or reduced in endotoxin for gene therapy | |
| Rio et al. | Identification and purification of a Drosophila protein that binds to the terminal 31-base-pair inverted repeats of the P transposable element. | |
| KR19990014924A (en) | Large Scale Purification of Plasmids | |
| US20100074946A1 (en) | Process for preparing purified nucleic acid and the use thereof | |
| JPS62501470A (en) | Purification, production and use of tumor necrosis factor | |
| Ferreira et al. | A comparison of gel filtration chromatographic supports for plasmid purification | |
| EP3950940A1 (en) | Method for producing a preparation of highly-purified recombinant cas nuclease | |
| Yoon et al. | CRISPR-Cas9 gene editing protects from the A53T-SNCA overexpression-induced pathology of Parkinson's disease in vivo | |
| Silva-Santos et al. | A process for supercoiled plasmid DNA purification based on multimodal chromatography | |
| Sun et al. | Large-scale purification of pharmaceutical-grade plasmid DNA using tangential flow filtration and multi-step chromatography | |
| KR102117016B1 (en) | Method of CRISPR system enhancement and use thereof | |
| KR100502473B1 (en) | Method for separation of plasmid DNA | |
| JPS62501679A (en) | DNA molecules encoding lipocortin and transformed hosts | |
| Rodríguez | Nonviral DNA vectors for immunization and therapy: design and methods for their obtention | |
| Cooke et al. | Purification of essentially RNA free plasmid DNA using a modified Escherichia coli host strain expressing ribonuclease A | |
| US20070275920A1 (en) | Method for Chromatographic Separation of a Nucleic Acid Mixture | |
| Kelly | MINIREVIEW: Perspectives on plasmid‐based gene therapy: challenges for the product and the process | |
| Zhang et al. | Production of plasmid DNA encoding human hepatocyte growth factor for gene therapy | |
| Ferreira et al. | Purification of supercoiled plasmid DNA using chromatographic processes | |
| CN105884876B (en) | Earthworm polypeptide, its coding sequence and application | |
| Khatibi et al. | Genetic modification of cystic fibrosis with ΔF508 mutation of CFTR gene using the CRISPR system in peripheral blood mononuclear cells | |
| AU720911B2 (en) | Purification of DNA in a continuous flow centrifuge | |
| RU2026864C1 (en) | Method of dna isolation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20100104 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |