KR100499647B1 - 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법 - Google Patents

박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균 유래의 ftsA 유전자와 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 박테리아에서 동시발현시킴으로써, 재조합 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 대장균 유래의 ftsA 및 ftsZ 유전자를 재조합 박테리아 내에서 외래단백질 유전자와 함께 동시발현시킴으로써, 종래기술의 주요한 문제점 중의 하나인 섬유질화 현상을 억제하고, 박테리아 세포의 분열속도를 증가시킬 수 있으며, 따라서, 재조합 박테리아의 세포성장 및 외래단백질의 생산성을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 특히, 고농도 배양을 수행할 경우, 빠른 성장속도로 인하여 배양 시간을 단축시키면서도 외래단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있으므로, 유용한 외래단백질의 생산 및 이와 관련된 생물산업 전반에 걸쳐 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법{A Method for Increasing Productivity of Exogeneous Protein in Bacteria}
본 발명은 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대장균 유래의 ftsA 유전자와 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 박테리아에서 동시발현시킴으로써, 재조합 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
최근 유전자조작 기술이 발전하면서, 박테리아 또는 여러 동식물들을 숙주세포로 이용하여, 유용한 외래단백질을 대량생산하려는 연구가 많이 이루어지고 있다. 박테리아 중에서 대장균은 빠른 성장속도와 축적된 발효 및 유전공학 기술로 인하여, 다양한 유용 단백질의 대량생산을 위하여 현재 가장 널리 이용되고 있는 숙주세포이며, 대장균을 이용한 유용 단백질의 생산은 주로 고농도 배양기술을 통하여 이루어진다(참조: Hodgson, J., Bio/Technology, 11:887-8932, 1993 및 Lee, S.Y., Trends Biotechnol., 14:98-105, 1996). 주로 사용되는 고농도 배양기술에는 유가식 배양(fed-batch)방법이 있으며, 이를 위한 다양한 기질 공급방법들이 개발되어 적용되고 있다.
대장균에서의 유용한 외래단백질의 생산을 위하여, 대장균 세포내에 축적되는 불용성 봉입체(inclusion body)를 이용하는 세포질내 생산방법이 주로 이용되고 있으며, 이 경우 외래 단백질의 생산량은 세포농도에 비례하게 된다. 따라서, 유가식 배양방법에 의한 대량생산을 위하여 가장 경제적이고 효율적인 방법으로서, 세포의 고농도 배양을 통해 배양액 내의 세포농도를 최대 수준으로 유지하여, 단위 부피당 단백질 생산량을 극대화하는 방법이 전략적으로 수행되고 있다. 그러나, 실질적으로는 배양시간이 경과함에 따라 대장균의 세포성장 속도가 저하되고, 대장균의 최대 세포농도가 감소되며, 결과적으로 단백질의 생산성이 감소되는 문제점을 안고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 현재까지는 주로 배양방법에 관한 연구가 많이 진행되어 왔고, 기질의 공급방법 등의 변화를 통하여 소기의 목적을 달성한 예도 있으나, 이것은 근본적인 문제의 해결책이 될 수 없었다.
따라서, 박테리아를 이용한 대량생산에 있어서, 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키기 위한 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 대장균 유래 ftsA 및 ftsZ 유전자를 목적하는 외래단백질을 암호화하는 유전자와 함께 박테리아에서 동시발현시키면, 박테리아의 섬유질화를 억제하여 세포성장을 향상시킴으로써, 외래단백질의 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 대장균 유래의 ftsA 유전자 및 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 플라스미드로 형질전환된 재조합 박테리아를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 재조합 플라스미드 및 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 박테리아를 동시-형질전환시키고, 배양하는 단계를 포함하는 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법은 대장균 유래의 ftsA 유전자 및 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 목적하는 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 박테리아를 동시-형질전환시켜, 재조합 박테리아를 생산하는 단계, 및, 전기 재조합 박테리아를 고농도 배양하여 목적하는 외래단백질을 수득하는 단계를 포함한다: 이때, ftsA 유전자 및 ftsZ 유전자를 포함하는 플라스미드는 pACfAZ2일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있으나, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 대장균 유래의 ftsA 및 ftsZ 유전자를 재조합 박테리아 내에서 외래단백질 유전자와 함께 동시발현시킴으로써, 종래기술의 주요한 문제점 중의 하나인 섬유질화 현상을 억제하고, 박테리아 세포의 분열속도를 증가시킬 수 있으므로, 재조합 박테리아의 세포성장 및 외래단백질의 생산성을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 특히, 고농도 배양을 수행할 경우, 빠른 성장속도로 인하여 배양 시간을 단축시키면서도 외래단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있으므로, 유용한 외래단백질의 생산 및 이와 관련된 생물산업 전반에 걸쳐 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
상술하였듯이, 박테리아를 이용한 외래단백질의 대량생산은 박테리아의 배양시간이 경과함에 따라 세포의 성장속도가 저하되고, 최대 세포농도가 감소되므로, 결과적으로 단백질의 생산성이 감소되는 문제점을 안고 있다. 이에, 본 발명자들은 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키기 위해서는 배양시간이 경과하여도 박테리아의 세포성장을 지속적으로 유지시킬 필요가 있다고 판단하였다.
박테리아를 이용한 발현시스템에서 가장 일반적으로 이용되고 있는 대장균의 성장속도를 감소시키는 요인에는 여러 가지가 있을 수 있으나, 가장 주요한 요인으로 세포분열의 저해를 들 수 있다. 대장균의 세포분열에는 다양한 단백질들이 매우 복잡한 방법으로 관여한다. 먼저, 세포분열에 관여하는 주요 단백질에는 FtsA, FtsI, FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ, FtsW, FtsZ 및 ZipA 등의 Fts군 단백질이 있고(참조: Donachie, W. D., Mol. Microbiol., 40:779-785, 2001), 이들을 암호화하는 유전자는 대부분 대장균 염색체 내에서 동일한 오페론에 포함되어 있다. FtsZ는 세포분열 지점에서 단백질들의 중합(polymerization)에 의해 격막고리(septum ring)를 형성함으로써, 세포분열에 제일 먼저 관여하는 단백질로 알려져 있다(참조: Lutkenhaus, J., Mol. Microbiol., 9:403-409, 1993). FtsZ에 의하여 격막고리가 형성되면, 여기에 ZipA와 FtsA 단백질이 결합하고, 이들의 결합은 다시 FtsI, FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ 및 FtsW의 결합을 연속적으로 유도하게 되면서 세포분열이 시작된다. 이와 같이, FtsZ는 세포분열에서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, FtsZ의 유전자를 제거한 대장균 돌연변이체에서는 세포분열이 일어나지 않아 세포가 계속 신장되는 섬유질화(filamentation) 현상이 나타나는 것으로 보고되어 있다.
한편, FtsA는 FtsZ에 의해 형성된 격막고리에 결합하여, 이후의 세포분열을 조절하며, 이를 위하여, FtsA 및 FtsZ 단백질의 함량은 세포내에서 1:100의 일정한 비율로 유지된다. 따라서, 두 단백질의 비율이 일정하게 유지되지 않는 경우에는 섬유질화 또는 세포분열이 너무 촉진되어 나타나는 미니셀(minicell) 현상이 나타나기도 한다(참조: Dai, K. and Lutkenhaus, J., J. Bacteriol., 174:6145-6151, 1992 및 Dewar et al., J. Bacteriol., 174:6314-6316, 1992).
먼저, 본 발명자들은 전기 FtsA 또는 FtsZ를 암호화하는 유전자인 ftsA 또는 ftsZ 유전자 각각을 외래단백질을 생산하는 재조합 박테리아에 도입하여 보았으나, 전기 재조합 박테리아는 섬유질화 현상을 나타내었고, 결과적으로 외래단백질의 생산성은 변화가 없었다. 따라서, 대장균의 세포분열에 필수적인 단백질 상기의 두 단백질인 FtsA와 FtsZ를 외래단백질을 발현하는 재조합 박테리아에서 동시발현시키고자 하였다. ftsA 및 ftsZ 유전자와 그의 자체 프로모터는 대장균 염색체에 오페론으로 존재한다. 따라서, ftsA 및 ftsZ 유전자와 각각의 자체 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 대장균 W3110의 염색체로부터 PCR 방법으로 수득하고, 이를 플라스미드 pACYC177에 삽입하여 대장균 유래의 ftsA 및 ftsZ 유전자, 전기 각 유전자의 전사를 위한 자체 프로모터 및 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pACfAZ2를 작제하였다. 그런 다음, 전기 재조합 플라스미드 pACfAZ2의 발현이 재조합 대장균의 세포성장과 외래단백질의 생산성에 어떠한 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 전기 플라스미드 pACfAZ2를 인간 유래의 렙틴 단백질을 생산하는 재조합 플라스미드 pTrpAObT 또는 인간 유래의 IGF-I를 생산하는 재조합 플라스미드 pYKM-I1과 함께 대장균에 도입시키고 배양하여, 각 형질전환 대장균의 세포성장, 단백질 생산량 및 세포형태를 분석하였다. 분석 결과, 재조합 플라스미드 pACfAZ2로 동시-형질전환된 대장균은 전기 재조합 플라스미드 pACfAZ2로 형질전환되지 않는 대장균에 비하여, 세포성장과 랩틴 단백질 또는 IGF-I 단백질의 생산량이 증가하였고, 세포가 길어지는 섬유질화 현상이 관찰되지 않았다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 플라스미드 pACfAZ2의 작제
대장균의 세포분열에 관여하는 주요 단백질을 암호화하는 ftsA와 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pACfAZ2를 작제하였다: 대장균 W3110로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기의 두 프라이머를 이용하는 PCR을 수행하여, ftsA(서열번호 1)및 ftsZ(서열번호 2) 유전자를 증폭하였다.
프라이머 1: 5'-GGCGGGGATCCTTTTCCTGCTG-3'(서열번호 3); 및,
프라이머 2: 5'-GGGACTGCAGATATTCGATATCACGC-3'(서열번호 4)
PCR은 PCR 시스템(High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim Co., Germany)에서 첫 번째 변성을 94℃에서 7분간 실시한 후, 94℃에서 50초, 52℃에서 50초, 72℃에서 4분의 순환을 30회 반복한 다음, 마지막 연장을 72℃에서 7분간 실시하여 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동법으로 분석하여, 3930bp 길이의 DNA 단편을 확인하고, 아가로스 겔로부터 분리정제하여 BamHI과 PstI으로 처리하였다. 그런 다음, 전기 제한효소 처리된 DNA 단편을 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pACYC177(New England Biolabs, USA)에 삽입하여, 재조합 플라스미드 pACfAZ2를 작제하였다(참조: 도 1).
실시예 2: 재조합 플라스미드 pTrpAObT의 작제
인간 유래의 비만 단백질인 렙틴(leptin)을 암호화하는 obese 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTrpAObT를 작제하였다: obese 유전자를 포함하는 플라스미드 pEDOb5(참조: Jeong and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 65:3027-3032, 1999)를 XbaI과 EcoRI으로 처리하여, obese 유전자와 RBS 부분을 포함하는 약 500bp의 DNA 단편을 수득하였다. 전기 DNA 단편을 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pUC18(New England Biolabs, USA)에 삽입하여, 재조합 플라스미드 p18Ob5를 작제하였다(참조: 도 2).
전기 작제한 재조합 플라스미드 p18Ob5를 BamHI과 HindIII로 처리하여, obese 유전자와 RBS 부분을 포함하는 DNA 단편을 수득하고, 트립토판 프로모터(Ptrp)를 포함하는 플라스미드 pRL22(참조: Matsumura et al., J. Bacteriol., 160:36-41, 1984)를 동일한 제한효소로 처리한 다음, 서로 연결하여 재조합 플라스미드 pRLOb5를 수득하였다(참조: 도 3).
전기 작제한 재조합 플라스미드 pRLOb5를 SspI과 BamHI으로 처리하여, 트립토판 프로모터, obese 유전자 및 RBS 부분을 포함하는 DNA 단편을 수득하였다. 그런 다음, PvuII와 BamHI으로 처리한 플라스미드 pTrc99A(참조: Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)에 트립토판 프로모터, obese 유전자 및 RBS 부분을 포함하는 DNA 단편을 삽입하여, 재조합 플라스미드 pTrpAObT를 작제하였다(참조: 도 4). 전기 작제한 재조합 플라스미드 pTrpAObT는 obese 유전자의 효율적인 전사를 위한 강력한 종결자(terminator)인 rrnBT1T2를 obese 유전자의 하류(downdtream)에 포함한다.
실시예 3: 렙틴을 생산하는 재조합 대장균의 세포성장 및 렙틴 생산성 분석
전기 실시예 1과 2에서 작제한 재조합 플라스미드로 대장균을 형질전환시키고, 전기 균주를 고농도 배양하여 성장속도와 발현된 전체 단백질 중의 렙틴 함량을 조사하였다: 전기 실시예 2에서 작제한 재조합 플라스미드 pTrpAObT로 대장균 TG1(F' traD36 lacIqΔ(lacZ)M15 proA+B+/supEΔ(hsdM-mcrB)5(rK-mK- McrB-) thi Δ(lac-proAB))을 형질전환시켜, 형질전환 균주인 "대장균 TG1(pTrpAObT)"를 생산하였다. 또한, 전기 실시예 1 및 2에서 작제한 두 재조합 플라스미드 pTrpAObT와 pACfAZ2로 대장균 TG1을 형질전환시켜, 형질전환 균주인 "대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2)"를 생산하였다. 그런 다음, 두 형질전환 균주를 하기의 표 1에 개시된 성분으로 제조된 1.8L의 배지를 이용하여, 바이오플로 3000 발효조(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에서 유가식 배양(fed-batch)방법으로 고농도 배양하였다. 단, 각 재조합 대장균을 위한 배지에 있어서, 대장균 TG1(pTrpAObT)의 배양배지는 암피실린을 포함하고, 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2)의 배양배지는 암피실린과 카나마이신을 모두 포함한다.
배지의 성분 및 조성
성분 조성비(L당)
기본배지 (NH4)2HPO4 KH2PO4 MgSO4·7H2O시트르산(citric acid)미량금속 용액(trace metal solution)* 2.0g6.75g0.7g0.85g 5mL
첨가물 효모 추출물(yeast extract)포도당(glucose) 2.0g20g
항생제 암피실린(ampicillin)카나마이신(kanamycin) 50mg25mg
미량금속 용액(trace metal solution)* (L당)
: FeSO4·7H2O 10.0g; ZnSO4·7H2O 2.25g; CuSO4·5H 2O 1.0g; MnSO4·4(5)H2O 0.5g; CaCl2·2H2O 2.9g; Na2B4O7·10H2 O 0.23g; (NH4)6Mo7O24 0.1g; 및, 35% HCl 10mL
상기 형질전환 균주의 고농도 배양에 있어서, 기질공급 방식으로는 pH의 변화에 따라 기질이 공급되는 pH-스탯 방식을 이용하고, 기질로는 700g/L의 포도당과 20g/L의 MgSO4·7H2O의 혼합액을 사용하였으며, 발효 온도는 37℃, pH는 6.8, 용존산소량(DO)은 40%(v/v)를 유지하였다. pH 6.8의 유지를 위하여, pH 6.78 이하에서는 암모니아수가, pH 6.88 이상에서는 기질이 발효조로 자동공급되었고, 대장균의 배양에 따른 용존산소량을 40%(v/v)로 유지하기 위하여, 200rpm이었던 초기 임펠러 속도를 점차적으로 1,000rpm까지 증가시켰으나, 이후로는 순수한 산소(pure oxygen)을 공급하였다.
배양하는 동안, 매 시간마다 각 배양액을 취하여, 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 세포농도를 측정하였고, 90℃에서 48시간 건조시킨 일정부피의 세포배양액으로부터 세포건조중량을 측정하였으며, 전체 단백질을 SDS-PAGE와 덴시토미터(densitometer)로 분석하여, 렙틴 단백질의 함량을 결정하였다(참조: 도 5 및 도 6). 도 5는 배양시간의 경과에 따른 대장균 TG1(pTrpAObT)의 세포농도(OD600), 세포건조중량(DCW, g/L) 및 전체 발현단백질 중 렙틴 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프로서, ●은 세포농도(OD600), ■은 세포 건조중량(DCW, g/L), □은 전체 단백질 중 렙틴 단백질 함량을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 대장균 TG1(pTrpAObT)의 최고 세포농도는 세포 건조중량으로 17.5g이고, 렙틴 단백질은 배양 후 21 시간이 경과하면서부터 생산되기 시작하여 배양 27 시간 후에는 전체 단백질의 12.5%까지 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 계산된 세포 성장속도는 0.10h-1이고, 단위부피당 단백질 생산량은 0.04g/L/h 이다.
다음으로, 도 6은 배양시간의 경과에 따른 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2)의 세포농도(OD600), 세포건조중량(DCW, g/L) 및 전체 발현단백질 중 렙틴 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프로서, ●은 세포농도(OD600), ■은 세포 건조중량(DCW, g/L), □은 전체 단백질 중 렙틴 단백질 함량을 나타낸다. 도 6에서 보듯이, 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2)의 최고 세포농도는 세포 건조중량으로 27.5g이고, 렙틴 단백질은 배양 후 16 시간이 경과하면서부터 생산되기 시작하여 배양 29 시간 후에는 전체 단백질의 17.3%까지 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 계산된 세포 성장속도는 0.13h-1이고, 단위부피당 단백질 생산량은 0.08g/L/h 이다. 상기 도 5 및 도 6을 통해 분석된 결과를 하기의 표 2에 정리하여 나타내었다.
렙틴생산 균주의 배양결과
균주 최고 세포건조중량(g/L) 최고단백질함량(%) 세포성장속도(h-1) 단위부피당 단백질생산량(g/L/hr)
대장균TG1(pTrpAObT) 17.5 12.5 0.1 0.04
대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2) 27.5 17.3 0.13 0.08
증가비율 157% 138% 130% 200%
상기의 표 2에서 보듯이, ftsA와 ftsZ 두 유전자로 동시에 형질전환된 대장균은 하나의 유전자만으로 형질전환된 대장균보다 세포건조 중량은 157%, 랩틴 단백질 함량은 138%, 세포성장 속도는 130%, 단위부피당 단백질 생산량은 200% 이상 증가된 결과를 나타냈다.
실시예 4: IGF-I을 생산하는 재조합 대장균의 세포성장 및 IGF-I 생산성 분석
IPTG에 의하여 유도되는 tac 프로모터 및 대장균의 베타-갈락토시다제 N-말단 163개 아미노산 부분의 C-말단에 IGF-I(insulin growth-like factor I, IGF-I)이 융합된 형태의 융합단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pYKM-I1으로 형질전환된 "대장균 W3110(pYKM-I1)"를 준비하였다(참조: Chung et al., J. Ind. Microbiol Biotechnol., 24:94-99, 2000). 또한, 대장균 W3110(pYKM-I1)을 전기 실시예 1에서 작제한 재조합 플라스미드 pACfAZ2로 형질전환시켜, "대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2)"를 생산하였다. 전기 두 형질전환 균주의 고농도 배양은 전기 실시예 3에서와 같이 실시하였는데, 각 재조합 대장균을 위한 배지에 있어서, 대장균 W3110(pYKM-I1)의 배양배지는 암피실린을 포함하고, 대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2)의 배양배지는 암피실린과 카나마이신을 모두 포함하는 배지를 사용하고, 기질로는 700g/L의 포도당과 20g/L의 MgSO4·7H2O 및 50g/L의 효모 추출액의 혼합액을 사용하였으며, 배양 후 세포농도(OD600) 30이 되었을 때, IPTG를 최종농도 1mM가 되도록 첨가하였다. 그런 다음, 전기 실시예 3에서와 같이, 배양하는 동안, 매 시간마다 각 배양액을 취하여, 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 세포농도를 측정하였고, 90℃에서 48시간 건조시킨 일정부피의 세포배양액으로부터 세포건조중량을 측정하였으며, 전체 단백질을 SDS-PAGE와 덴시토미터(densitometer)로 분석하여, IGF-I 단백질의 함량을 결정하였다(참조: 도 7 및 도 8).
도 7은 배양시간의 경과에 따른 대장균 W3110(pYKM-I1)의 세포농도(OD600), 세포건조중량(DCW, g/L) 및 전체 발현단백질 중 IGF-I 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프로서, ●은 세포농도(OD600), ■은 세포 건조중량(DCW, g/L), □은 전체 단백질 중 IGF-I 단백질 함량, 점선은 IPTG에 의한 유도발현 시점을 나타낸다. 도 7에서 보듯이, 대장균 W3110(pYKM-I1)의 최고 세포농도는 세포 건조중량으로 46.5g이고, IGF-I 단백질은 IPT에 의한 유도발현 후 생산되기 시작하여, 8 시간 후에는 전체 단백질의 10.5%까지 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 계산된 세포 성장속도는 0.18h-1이고, 단위부피당 단백질 생산량은 0.23g/L/h 이다.
다음으로, 도 8은 배양시간의 경과에 따른 대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2)의 세포농도(OD600), 세포건조중량(DCW, g/L) 및 전체 발현단백질 중 IGF-I 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프로서, ●은 세포농도(OD600), ■은 세포 건조중량(DCW, g/L), □은 전체 단백질 중 IGF-I 단백질 함량, 점선은 IPTG에 의한 유도발현 시점을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 대장균 W3110(pYKM-I1)의 최고 세포농도는 세포 건조중량으로 56.3g이고, IGF-I 단백질은 IPT에 의한 유도발현 후 생산되기 시작하여, 8 시간 후에는 전체 단백질의 13.5%까지 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 계산된 세포 성장속도는 0.23h-1이고, 단위부피당 단백질 생산량은 0.45g/L/h 이다. 상기 도 7 및 도 8을 통해 분석된 결과를 하기의 표 3에 정리하여 나타내었다.
IGF-1 생산균주의 배양결과 비교
균주 최고 세포건조중량(g/L) 최고단백질함량(%) 세포성장속도(h-1) 단위부피당 단백질생산량(g/L/hr)
대장균 W3110(pYKM-I1) 46.5 1.05 0.18 0.23
대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2) 56.3 13.5 0.23 0.45
증가비율 121% 129% 128% 196%
상기의 표 3에서 보듯이, ftsA와 ftsZ 두 유전자로 동시에 형질전환된 대장균은 하나의 유전자만으로 형질전환된 대장균보다 세포건조 중량은 121%, IGF-I 단백질 함량은 129%, 세포성장 속도는 128%, 단위부피당 단백질 생산량은 196% 이상 증가된 결과를 나타냈다.
실시예 5: 재조합 대장균의 형태 분석
전기 실시예 3 및 4에서 고농도 배양한 각 대장균의 형태(morphology)를 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 관찰하였다(참조: 도 9a, 도 9b, 도 10a 및 도 10b). 도 9a 및 9b는 고농도 배양한 대장균 TG1(pTrpAObT) 및 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2) 세포의 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이고, 도 10a 및 도 10b는 고농도 배양한 대장균 W3110(pYKM-I1) 및 대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2) 세포의 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이다. 도 9a와 9b 및 도 10a 및 10b에서 보듯이, 대장균 TG1(pTrpAObT) 및 대장균 W3110(pYKM-I1)에서는 세포가 길어지는 섬유질화 현상이 나타난 반면, ftsA 및 ftsZ 유전자를 동시발현시킨 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2) 및 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2)에서는 특별한 이상현상이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 대장균 유래의 ftsA 유전자와 ftsZ 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 박테리아에서 동시발현시킴으로써, 재조합 박테리아에서의 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 대장균 유래의 ftsA 및 ftsZ 유전자를 재조합 박테리아 내에서 외래단백질 유전자와 함께 동시발현시킴으로써, 종래기술의 주요한 문제점 중의 하나인 섬유질화 현상을 억제하고, 박테리아 세포의 분열속도를 증가시킬 수 있으며, 따라서, 재조합 박테리아의 세포성장 및 외래단백질의 생산성을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 특히, 고농도 배양을 수행할 경우, 빠른 성장속도로 인하여 배양 시간을 단축시키면서도 외래단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있으므로, 유용한 외래단백질의 생산 및 이와 관련된 생물산업 전반에 걸쳐 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 재조합 플라스미드 pACfAZ2의 작제과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 재조합 플라스미드 p18Ob5의 작제과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 재조합 플라스미드 pRLOb5의 작제과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 재조합 플라스미드 pTrpAObT의 작제과정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 배양시간의 경과에 따른 대장균 TG1(pTrpAObT)의 세포농도, 세포건조중량 및 전체 발현단백질 중 렙틴 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 배양시간의 경과에 따른 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2)의 세포농도, 세포건조중량 및 전체 발현단백질 중 렙틴 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 배양시간의 경과에 따른 대장균 W3110(pYKM-I1)의 세포농도, 세포건조중량 및 전체 발현단백질 중 IGF-I 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 배양시간의 경과에 따른 대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2)의 세포농도, 세포건조중량 및 전체 발현단백질 중 IGF-I 단백질의 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9a 및 9b는 고농도 배양한 대장균 TG1(pTrpAObT) 및 대장균 TG1(pTrpAObT+pACfAZ2) 세포의 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
도 10a 및 도 10b는 고농도 배양한 대장균 W3110(pYKM-I1) 및 대장균 W3110(pYKM-I1+pACfAZ2) 세포의 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A Method for Increasing Productivity of Exogeneous Protein in Bacteria <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> E. coli W3110 <400> 1 atgatcaagg cgacggacag aaaactggta gtaggactgg agattggtac cgcgaaggtt 60 gccgctttag taggggaagt tctgcccgac ggtatggtca atatcattgg cgtgggcagc 120 tgcccgtcgc gtggtatgga taaaggcggg gtgaacgacc tcgaatccgt ggtcaagtgc 180 gtacaacgcg ccattgacca ggcagaattg atggcagatt gtcagatctc ttcggtatat 240 ctggcgcttt ctggtaagca catcagctgc cagaatgaaa ttggtatggt gcctatttct 300 gaagaagaag tgacgcaaga agatgtggaa aacgtcgtcc ataccgcgaa atcggtgcgt 360 gtgcgcgatg agcatcgtgt gctgcatgtg atcccgcaag agtatgcgat tgactatcag 420 gaagggatca agaatccggt aggactttcg ggcgtgcgga tgcaggcaaa agtgcacctg 480 atcacatgtc acaacgatat ggcgaaaaac atcgtcaaag cggttgaacg ttgtgggctg 540 aaagttgacc aactgatatt tgccggactg gcatcaagtt attcggtatt gacggaagat 600 gaacgtgaac tgggtgtctg cgtcgtcgat atcggtggtg gtacaatgga tatcgccgtt 660 tataccggtg gggcattgcg ccacactaag gtaattcctt atgctggcaa tgtcgtgacc 720 agtgatatcg cttacgcctt tggcacgccg ccaagcgacg ccgaagcgat taaagttcgc 780 cacggttgtg cgctgggttc catcgttgga aaagatgaga gcgtggaagt gccgagcgta 840 ggtggtcgtc cgccacggag tctgcaacgt cagacactgg cagaggtgat cgagccgcgc 900 tataccgagc tgctcaacct ggtcaacgaa gagatattgc agttgcagga aaagcttcgc 960 caacaagggg ttaaacatca cctggcggca ggcattgtat taaccggtgg cgcagcgcag 1020 atcgaaggtc ttgcagcctg tgctcagcgc gtgtttcata cgcaagtgcg tatcggcgcg 1080 ccgctgaaca ttaccggttt aacggattat gctcaggagc cgtattattc gacggcggtg 1140 ggattgcttc actatgggaa agagtcacat cttaacggtg aagctgaagt agaaaaacgt 1200 gttacagcat cagttggctc gtggatcaag cgactcaata gttggctgcg aaaagagttt 1260 taa 1263 <210> 2 <211> 1152 <212> DNA <213> E. coli W3110 <400> 2 atgtttgaac caatggaact taccaatgac gcggtgatta aagtcatcgg cgtcggcggc 60 ggcggcggta atgctgttga acacatggtg cgcgagcgca ttgaaggtgt tgaattcttc 120 gcggtaaata ccgatgcaca agcgctgcgt aaaacagcgg ttggacagac gattcaaatc 180 ggtagcggta tcaccaaagg actgggcgct ggcgctaatc cagaagttgg ccgcaatgcg 240 gctgatgagg atcgcgatgc attgcgtgcg gcgctggaag gtgcagacat ggtctttatt 300 gctgcgggta tgggtggtgg taccggtaca ggtgcggcac cagtcgtcgc tgaagtggca 360 aaagatttgg gtatcctgac cgttgctgtc gtcactaagc ctttcaactt tgaaggcaag 420 aagcgtatgg cattcgcgga gcaggggatc actgaactgt ccaagcatgt gaactctctg 480 atcactatcc cgaacgacaa actgctgaaa gttctgggcc gcggtatctc cctgctggat 540 gcgtttggcg cagcgaacga tgtactgaaa ggcgctgtgc aaggtatcgc tgaactgatt 600 actcgtccgg gtttgatgaa cgtggacttt gcagacgtac gcaccgtaat gtctgagatg 660 ggccacgcaa tgatgggttc tggcgtggcg agcggtgaag accgtgcgga agaagctgct 720 gaaatggcta tctcttctcc gctgctggaa gatatcgacc tgtctggcgc gcgcggcgtg 780 ctggttaaca tcacggcggg cttcgacctg cgtctggatg agttcgaaac ggtaggtaac 840 accatccgtg catttgcttc cgacaacgcg actgtggtta tcggtacttc tcttgacccg 900 gatatgaatg acgagctgcg cgtaaccgtt gttgcgacag gtatcggcat ggacaaacgt 960 cctgaaatca ctctggtgac caataagcag gttcagcagc cagtgatgga tcgctaccag 1020 cagcatggga tggctccgct gacccaagag cagaagccgg ttgctaaagt cgtgaatgac 1080 aatgcgccgc aaactgcgaa agagccggat tatctggata tcccagcatt cctgcgtaag 1140 caagctgatt aa 1152 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 3 ggcggggatc cttttcctgc tg 22 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 4 gggactgcag atattcgata tcacgc 26

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 대장균 유래의 ftsA 유전자(서열번호 1) 및 ftsZ(서열번호 2)를 포함하고, 도 1의 유전자 지도를 갖는 재조합 플라스미드 pACfAZ2와 목적하는 외래단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 대장균을 동시-형질전환시켜, 재조합 대장균를 생산하는 단계, 전기 재조합 대장균을 유가식 배양방법을 이용하여, 고농도 배양하면서, 외래단백질의 발현을 유도시키는 단계; 및, 배양이 종료된 후, 재조합 대장균으로부터 목적하는 외래단백질을 수득하는 단계를 포함하는 외래단백질의 생산성을 증가시키는 방법.
  5. 삭제
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