KR100496938B1 - 나노 바이오어레이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 STM팁에 표적물질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계; 시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시킨 후, 상기 표적물질과 반대되는 극성의 샘플 바이어스를 인가하여, 터널링 전류를 발생시켜 팁을 기판에 접근시키는 단계; 및 상기 팁 바이어스 전압을 제거하여 상기 팁에 부착된 시료를 기판 상으로 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

나노 바이오어레이의 제조방법{Method for manufacturing nano bio-array}

본 발명은 바이오어레이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나노수준의 고집적도로 바아오어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

흔히 바이오칩으로 불리우는 바이오칩은 작은 기판 위에 DNA, 단백질 등의 생물학적 분자들을 결합시켜 유전자 결합, 단백질 분포, 반응양상 등을 분석할 수 있는 생물학적 마이크로 칩이다. 바이오칩은 프로티오믹스 (proteomics)와 게노믹스 (genomics) 분야에서 필수적으로 이용될 수 있으며, 특히 유전적 혹은 병원성 질병의 진단, 단백질의 발현 및 기능연구, 단백질의 상호작용 연구, 신약개발 등 다양한 응용분야를 가지고 있어 의학, 약학, 생명과학분야에서 광범위하게 이용될 수 있다.

단백질 칩은 검출하고자 하는 물질(표적단백질)과 반응하는 단백질의 마이크로 어레이가 형성되어 있어, 이를 이용하여 시료 중의 표적단백질의 유무를 확인할 수 있다. DNA 칩은 특정 단백질의 발현에 관여하는 DNA의 염기서열을 확인함으로써 유전적 질병의 유무를 알아낼 수 있다. 이를 위해 DNA칩은 표적DNA에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드를 프로브로 이용하며, 시료 중의 표적DNA와 프로브의 하이브리드 결합의 유무를 검출함으로써 시료 중의 표적DNA 유무를 확인한다. 그러나 DNA 프로브와 표적DNA의 하이브리드 결합이나 항체와 항원의 반응성은 인비보(in vivo) 상태에 있을 때와는 달리 인비트로(in vitro) 상태에선 현저하게 떨어진다. 따라서 바이오칩의 검출 감도를 높이고 더 나아가 렙온어칩 (Lab on a chip) 등의 다검출 바이오칩을 제조하는 상위 기술로 발전하기 위해선 시료 중의 표적물질의 농도를 높이는 방법과 마이크로 어레이를 고집적화하는 방법이 있다. 예를 들어 DNA칩의 경우, PCR을 이용하여 시료중의 표적 DNA를 증폭시켜 사용한다. 단백질 칩의 경우에는 롤링서클증폭기술 (Rolling-circle-amplification technique)이라는 방법을 이용하여 단백질을 증폭시킬 수 있다.

한편, 마이크로 어레이의 고집적화 방법의 하나로 스폿의 크기를 최소화하는 방법이 있다. 마이크로 어레이의 스폿 형성 방법으로는 분사방식과 팁 방식 등이 있다. 그러나, 이러한 종래의 방법으로는 스폿의 크기를 줄이는데 한계가 있었다. 예를 들어, 단백질 칩의 경우 스폿 크기가 보통 수백 마이크로이며, DNA 칩은 수십 마크로 단위의 스폿 크기를 갖는다. 최근에는 원자현미경 (AFM: atomic force microscopy) 기술을 이용하여 나노크기의 프로브를 제조하는 방법이 알려졌다. 구체적으로는 기판 상에 금박막과 유기 단분자층을 형성한 다음 AFM을 이용하여 유기 단분자층을 소정의 패턴으로 에칭하여 금박막을 노출시킨 후, 노출된 금박막 영역에 DNA 프로브를 부착시킨다. AFM 팁의 스캐닝 트랙을 따라 기판 상의 선택된 영역들이 깍여, 유기단분자층이 제거되고 곧바로 DNA 분자들이 이러한 영역으로 흡착된다 (Production of Nano Structures of DNA on Surfaces," Nano Letters, August 14, 2002). 그러나, 이 방법도 시료를 고농도로 농축하는 정도에는 이르지 못하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 시료의 고농도화 및 마이크로 어레이의 고집적화를 가능하게 하는 나노 바이오어레이의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 STM팁에 표적물질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계; 시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시킨 후, 상기 표적물질과 반대되는 극성의 샘플 바이어스를 인가하여, 터널링 전류를 발생시켜 팁을 기판에 접근시키는 단계; 및 상기 팁 바이어스 전압을 제거하여 상기 팁에 부착된 시료를 기판 상으로 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 표적물질은 생물학적 분자인 것이 바람직하고, 단백질, 핵산, 또는 지질인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 표적물질에 티올기를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 기판에 금속박막을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있고, 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 금속박막 형성 단계 후 상기 기판을 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 STM을 이용하여 기판 상에 어레이를 제작하는 방법을 보다 상세히 설명한다.

대부분의 단백질은 최적의 pI 값을 갖고 있다. 이 값을 완충용액을 이용하여 조절하면 단백질의 전체 전하(Net charge)를 양전하 혹은 음전하로 변화시킬 수 있다. 어레이하고자 하는 표적물질이 DNA인 경우에는 자체적으로 음의 전하를 갖고 있다. 그리고 STM팁 자체가 전극의 역할을 하기 때문에 대부분의 단백질 및 DNA를 농축하여 채취할 수 있다. 따라서 이와 같은 표적물질과 반대되는 극성의 전하의 팁 바이어스로 걸어주면 전기적 인력에 의해 STM팁에 시료가 고농도로 채취된다. 샘플 바이어스(sample bias)와 팁 바이어스 그리고 터널링 전류를 조절함으로써 어레이된 점의 크기 또한 조절할 수 있다. 어레이 된 점의 크기는 보통 500~800nm 정도 된다.

먼저, 본 발명에 사용되는 STM (Scanning Tunneling Microscopy)은 표면 분석장치이다. STM은 기존의 현미경과 달리 양자 역학적 전자 터널링 현상을 이용하여 표면의 기하학적 구조를 측정한다. 전도체인 시료 표면에 원자 한 두개의 크기의 간격(약0.5nm)으로 탐침을 접근시키고, 두 개의 도체 사이에 전압을 걸어주면 전자가 에너지 벽을 뚫고 지나가 전류가 흐르는 양자역학적 터널링 (tunneling) 현상이 일어난다. STM은 구동장치(scanner) 위에 시료를 넣고 일정하게 두 전극 사이의 터널링을 측정하여 그 변화 정도를 수치화시켜 컴퓨터 화면에 밝기로 나타냄으로써 시료의 지형을 나타내는 사진을 얻을 수 있는 장치이다. 시료의 표면구조 형상뿐만 아니라 각 부분의 굴곡도는 물론 단면도, 입체도 및 각종 통계자료도 얻을 수 있다.

도 1은 STM팁을 이용한 나노 바이오어레이의 제작 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1의 (b)에서 참조번호 1은 STM 팁이고, 2는 표적물질이고, 3은 STM이고, 4는 금속막이고, 5는 기판이다.

먼저, 텅스텐 와이어를 산화 용액에 넣어 식각 한 후에 증류수를 이용하여 세척하여 잔여 산화물을 제거하여 어레이어로 사용되는 STM팁(1)을 완성한다.

시료를 채취하기 전에 표적물질에 티올기를 결합시킬 수 있다. 기판이 그 표면에 금속박막(4)을 가지는 경우, 특히 금막이 형성된 기판을 사용하는 경우, 표적물질에 티올기를 결합시키는 것이 바람직하다. 티올기를 결합시키는 방법으로는 종래에 티올기 부착방법으로 당해 분야에서 이용되는 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다.

표적물질이 중성전하를 가지는 경우, 완충액으로 전체전하를 양전하 또는 음전하로 만드는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 기판(5)은 유리, 실리콘, 폴리머 등 종래에 당해 기술분야에서 이용되는 것이라면 어느 것이나 가능하고, 기판에 금막을 형성시킨 실리콘 또는 유리 기판이 바람직하다.

STM팁(1)을 현미경으로 관찰하여 시료에 팁의 끝 부분이 살짝 들어가도록 조절하여 담근다. 표적물질과 반대되는 극성으로 팁 바이어스의 전압을 인가하여 STM팁 끝 부분에 표적물질, 예를 들어 음의 전하를 띠는 DNA(2)가 농축된 상태로 부착되도록 3~5초간 팁을 시료에 담근다.

그 후 스폿팅 하고자하는 위치로 STM을 이동시킨 후 팁(1)을 기판(5)에 접근시킨다. 이때 팁 바이어스는 표적물질과 같은 극성의 전하로 인가하고, 샘플 바이어스를 표적물질과 반대 극성의 전하로 인가한다.

본 발명에서 "샘플바이어스를 인가한다"라고 함은, 기판에 바이어스를 인가하는 것을 의미한다.

팁과 기판사이의 터널링 전류를 0.2~0.3 nA로 준다. 터널링 전류는 이 기기의 간극제어에서 사용되는 것으로 팁을 샘플에 근접시킬 때 이용된다. 즉, 팁과 샘플 (즉, 기판) 사이에 전압이 걸리고 팁과 샘플간의 거리가 아주 가깝다면(수Å에서 수nm)비록 팁과 샘플이 하나의 회로로 연결되어 있지 않아도 팁과 샘플사이에는 전류가 흐르게 되는데 이것이 터널링 전류이다. 따라서 같은 바이어스를 걸어준다면 이를 작게 입력시켜준 경우에 팁과 샘플간의 거리가 더 멀어지게 된다. 이 기기의 간극제어는 기기와 연결된 컨트롤러와 컴퓨터에 의해 제어된다. 이 기기의 바이어스의 최대한계는 ±7V이다. 따라서 팁과 샘플간의 전압은 최대 14V정도 걸어줄 수 있고, 0.2~5nA사이에서만 자동적인 간극제어가 된다. 스폿의 크기를 줄이기 위해서는 팁과 샘플간의 간격을 가능한 한 넓혀야만 하므로, 전압은 기기의 한계인 ±7V(실제로 걸리는 전압은 14V) 그리고 터널링 전류의 세트 포인트는 가장 작은 값(0.2~0.3nA)으로 하면 팁과 샘플간의 거리는 기기가 인정하는 범위에서 가장 멀어지게 된다.

자동 어프로치를 하는 경우 팁이 멈출 때 약간의 진동으로 팁이 움직이기 때문에 이를 막아주기 위해서 터널링 전류를 확인하여 강제적으로 또는 수동으로 접근시키도록 하는 것이 바람직하다.

터널링 전류가 일정한 값에 오면 팁이 멈춘다. 이 때, 팁 바이어스를 0으로, 샘플 바이어스를 표적물질과 반대 전하로 인가하면 기판과 시료 물질간의 전기적 인력에 의해 시료에 있던 표적물질이 기판으로 적하된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

1. 팁의 제작

텅스텐 와이어를 산화 용액에 넣어 식각 한 후에 증류수를 이용하여 세척하여 잔여 산화물을 제거하여 어래이어로 사용되는 STM팁을 제작하였다.

2. 시료의 준비

티올기(-SH)가 표지된 외가닥 DNA(20μM)((주)제노텍)를 사용하였다.

3. 시료 채취 단계

본 실시예에서 이용된 STM은 PSI(Park Scientific Instruments)사 제품이었다. 시료를 채취하여 기판 위에 적하 하기 전에 STM 팁을 사용하여 기판 위에 표시를 했다. 이것은 AFM으로 어레이 된 점을 쉽게 찾기 위한 전처리과정이다. 프로브로서 이용될 외가닥 DNA를 보습효과를 위해 3% 글리세롤 용액에 용해햐였고, 그 용액 5ml에 팁을 담그어 시료를 채취한다. 이 때 STM의 표적물질과 반대되는 전하로 팁 바이어스를 약 +5V를 걸고 절하된 시료용액에 현미경을 이용하여 팁을 약 5초간 담지하여 시료(외가닥 DNA)가 충분히 팁에 붙게 하였다.

4. 팁 접근 단계

팁에 DNA가 부착된 후에 팁을 기판의 소정 위치로 이동시켰다. 이동이 끝나면 팁 바이어스를 +7V로 및 샘플 바이어스를 약 -7V로 인가하였다. 터널링 전류는 0.3nA를 주어서 팁과 기판사이의 근접이 최대한 원거리에서 이루어지게 하였다.

5. 적하 단계

근접이 완료된 후 팁 바이어스를 제거하고 샘플 바이어스를 +7V를 주었다. 이런 제어를 통해 음의 전하를 갖는 많은 양의 외가닥 DNA가 기판 위에 적하되었다. 상기과정의 반복 조작을 통해 어레이를 완성하였다.

6. 나노 어레이의 확인

AFM(PSI사, 모델명:CP)을 이용하여 스케닝(100μm 스케너를 사용함)하여 나노 어레이의 이미지를 얻었다 (도 3 참조). STM을 이용하여 어레이된 점의 모양은 적하될 때의 특징이 잘 나타나 있다. 즉 가운데 팁이 닿은 부분은 깊은 골이 파이고 양쪽으로 샘플이 밀린 형태를 띠고 있다. 이것은 적하 될 때 샘플 바이어스를 걸어줌으로서 팁의 시료가 기판으로 전기적인 힘에 의해 강하게 빨려오기 때문이다.

외가닥DNA가 표면에 고정되었는지를 확인하기 위해서 표면 플라즈몬 공명 장치(Optrel사, 모델명:multiscope)를 이용한 인시투 (in situ) 실험을 하였다(도 2 참조).

도 2에서 초기(0~약 900초)에는 물을 흘려보냈고, 이 때의 반사도 세기가 0.32을 나타내었다. 약 900초 정도 시간이 흐른 후 외가닥 DNA를 넣어 주었는데, 반사도 크기가 0.45로 크게 변하였다. 그러나 약 6000초가 경과한 후에 다시 물로 세척을 해주었으나 반사도 세기가 0.45에서 크게 변화지 않았다. 이 결과로 외가닥 DNA가 기판 위에 결합된 것을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 STM을 이용하여 시료 중의 표적물질의 고농도화 및 바이오어레이의 고집적화가 이루어질 수 있어서 간단한 방법과 저렴한 비용으로 고감도 센서 및 다검출 바이오칩의 제작 및 소형화를 가능하게 한다.

도 1은 STM팁을 이용한 나노 어레이의 제작 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2은 표면 플라즈몬 공명장치를 이용하여 고정화 시료 물질인 외가닥 DNA가 골드막이 형성된 기판표면에 고정됨을 확인하는 그래프이다.

도 3은 STM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후 AFM을 이용하여 얻은 도면이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1. 팁

2. 표적물질

3. STM

4. 금속막

5. 기판

Claims (8)

1. STM(Scanning Tunneling Microscopy)팁에 표적 핵산 또는 단백질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계;

   시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시킨 후, 상기 표적물질과 반대되는 극성의 샘플 바이어스를 인가하여, 터널링 전류를 발생시켜 팁을 기판에 접근시키는 단계: 및

   상기 팁 바이어스 전압을 제거하여 상기 팁에 부착된 시료를 기판 상으로 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취하는 단계 전에 표적물질에 티올기를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취 단계 전에 상기 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취 단계 전에 기판에 금속박막을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 금속박막 형성 단계 후 상기 기판을 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.