KR100494764B1 - Biological methods for producing indigo and indirubin by the recombinant E. coli cells harboring a novel oxygenase - Google Patents
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Abstract
본 발명은 메틸로파가 탈라시카(Methylophaga thalassica) SK1(기탁번호 : KCTC-10323BP)에서 분리된 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지니는 옥시게네이즈 유전자 및 상기 옥시게네이즈 유전자에 의해 발현되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 옥시게네이즈 효소를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 상기 서열번호 1의 옥시게네이즈 유전자를 분리 증폭시킨후 벡터에 삽입하고 대장균에 삽입 형질전환시킨 재조합 대장균을 트립토판을 함유하는 배지에서 배양하여 트립토판에서 유래된 인돌을 옥시게네이즈 활성을 이용하여 인돌옥사이드로 전환시켜 인디고 및/또는 인디루빈으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention is methylopapha thalassica ( Methylophaga thalassica ) Providing an oxygenase gene having a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from SK1 (Accession Number: KCTC-10323BP) and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 expressed by the oxygenase gene. will be. In another aspect, the present invention is isolated and amplified oxygenase gene of SEQ ID NO: 1 and inserted into the vector and cultured recombinant E. coli transformed into E. coli in a medium containing tryptophan to induce the indole derived from tryptophan oxygenase activity It is to provide a method for producing indigo and / or indirubin by converting to indole oxide using.
Description
본 발명은 신규한 옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 재조합 대장균 및 이를 이용한 인디고 및 인디루빈의 생물학적 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 메틸로파가 탈라시카(Methylophaga thalassica) SK1(기탁번호 : KCTC-10323BP)에서 분리된 신규한 옥시게네이즈 유전자를 증폭시킨후 벡터에 삽입하고, 대장균에 삽입 형질전환시킨 재조합 대장균 및 이 형질전환 대장균을 트립토판을 함유한 배지에서 배양하여 발현되는 옥시게네이즈 활성을 이용하여 트립토판을 인디고 및/또는 인디루빈으로 전환시켜 제조하는 생물학적 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant Escherichia coli containing a novel oxygenase gene and a method for biological production of indigo and indirubin using the same. More specifically, methylophaga thalassica Amplified a novel oxygenase gene isolated from SK1 (Accession No .: KCTC-10323BP), inserted into a vector, inserted into E. coli and transformed E. coli and transformed E. coli and cultured in a medium containing tryptophan The present invention relates to a biological manufacturing method of preparing tryptophan by converting it to indigo and / or indirubin using an oxygenase activity.
인디고(indigo)는 세계적으로 가장 잘 알려진 직물염색제 중의 하나로 면이나 모직물의 생산에 응용되고 있다. 남녀노소를 불문하고 전 세계적으로 애용하는 청바지는 옷감인 데님(denim)을 인디고 염료로 염색하여 생산한다. 인디고는 청바지뿐만 아니라 일반적으로 면이나 모를 청색으로 염색하는데 사용된다. 이 염료는 원래 인디고 식물체인 폴리코눔 틴크토리움(Polygonum tinctorium) 등으로부터 분리하였으나 1882년 Bayer에 의해 화학적으로 합성된 후 지금처럼 대량 생산되고 있다.Indigo is one of the world's best known textile dyes and is used in the production of cotton or wool. Jeans, worn by men and women around the world, are produced by dyeing fabric denim with indigo dyes. Indigo is commonly used to dye cotton or wool blue as well as jeans. The dye was originally isolated from Polygonum tinctorium , an indigo plant, but has been chemically synthesized by Bayer in 1882 and is now in mass production.
이러한 합성염료는 그 생산에서 마지막 과정인 폐기처분까지 잠재적 독성물질을 배출함으로써 환경을 오염시키며 그 처리에 있어서도 많은 비용이 소요되고 있다. 독성이 강한 화학약품을 원료로 사용하며 또한 부산물을 생성시켜 생산자와 환경을 위협하는 여러 단계의 과정을 거쳐야 한다. 그러나 미생물에 의한 천연 인디고의 생산은 이러한 문제점을 보완할 수 있으며 자연 그대로의 색을 표현할 수 있다. 후자의 경우 발효, 세포분리, 정제 등의 간단한 과정이 요구될 뿐이며, 그 과정에서 유독한 유기용매 대신 물과 무해한 원료를 사용하며, 독성이 강한 산업 폐기물 대신 천연의 바이오매스와 이산화탄소를 남긴다.These synthetic dyes pollute the environment by releasing potential toxic substances from the production to the final disposal, which is expensive. Highly toxic chemicals are used as raw materials, and byproducts have to go through several stages of threat to producers and the environment. However, the production of natural indigo by microorganisms can compensate for this problem and can express the color as it is. In the latter case, simple processes such as fermentation, cell separation, and purification are required. In the process, water and harmless raw materials are used instead of toxic organic solvents, and natural biomass and carbon dioxide are left in place of highly toxic industrial wastes.
미생물에 의한 인디고의 생산은 1928년 Gray에 의해 보고되었다. 그 후 많은 발명자들에 의해 미생물에서 인디고가 생산된다는 것이 보고되었다(Yen et al. 1991, Eaton and Champman 1995, O′Connor et al. 1997, O′Connor and Hartmans 1998, Doukyu et al. 1998, 2002). 인디고 생산에 관련된 효소는 일반적으로 하나 또는 그 이상으로 구성되어있다. 대체로 이와 관련된 효소는 모노옥시게네이즈(monooxygenase)와 다이옥시게네이즈(dioxygenase) 등이 있으며, 각각의 효소가 포함된 유전자를 대장균(Escherichia coli) 에 도입하여 글루코스 또는 영양 배지(nutrient medium)에서 인디고를 생산하였다(Ensley et al. 1983, Hart et al. 1992, Murdock et al. 1993, Kim et al. 1997, Bhushan et al. 2000, Drewlo et al. 2001).The production of indigo by microorganisms was reported by Gray in 1928. It has since been reported by many inventors that indigo is produced in microorganisms (Yen et al . 1991, Eaton and Champman 1995, O'Connor et al . 1997, O'Connor and Hartmans 1998, Doukyu et al . 1998, 2002 ). Enzymes involved in indigo production generally consist of one or more. Generally, related enzymes include monooxygenase and dioxygenase, and the gene containing each enzyme is introduced into Escherichia coli to indigo in glucose or nutrient medium. Production (Ensley et al . 1983, Hart et al . 1992, Murdock et al . 1993, Kim et al . 1997, Bhushan et al . 2000, Drewlo et al . 2001).
미생물 및 동물유래의 모노옥시게네이즈 및 다이옥시게네이즈 유전자를 대장균 및 슈도모나스(Pseudomonas)에서 발현시켜 인디고 생성 실험을 하였지만, 이들 실험 중 가장 많은 인디고를 생성하는 것은 나프탈렌 다이옥시게네이즈(dinaphthalene dioxygenase)(9개 유전자)을 이용하는 것으로, 포도당으로부터 인디고가 135mg/l의 농도로 전환되었다. 그러나 미생물에 의한 인디고의 생산은 아직 화학합성을 대체할만한 양을 생산하지 못하고 있다. 현재 화학합성 색소를 대체하기 위한 실험을 주도하고 있는 연구팀은 Genencor International Co. 이지만, 이 그룹 역시 화학합성 색소를 대체하기 위한 충분한 양의 인디고를 미생물에서 얻지는 못하고 있다. 그러나 유전자를 조작한 박테리아에서 세계적으로 인기있는 진청색의 색소를 대량으로 생산하고 있고 또한, 염색시 붉은 색을 포함하는 불순물을 제거하기 위한 여러 가지 실험을 진행하여 상당한 성과를 나타내고 있다.It was to mono-oxy of microbial and animal origin express tyrosinase and dioxane Shigeru tyrosinase gene in E. coli and Pseudomonas (Pseudomonas) Although the indigo produced experiment, generating the largest number of indigo of these experiments naphthalene dioxane Shigeru tyrosinase (dinaphthalene dioxygenase) (9 Dog gene), indigo was converted from glucose to a concentration of 135 mg / l. However, the production of indigo by microorganisms has not yet produced an amount that can replace chemical synthesis. The team currently leading the experiment to replace chemical synthetic pigments is Genencor International Co. However, this group also does not get enough indigo from microorganisms to replace chemical synthetic pigments. However, genetically engineered bacteria produce a large amount of the world's popular dark blue pigments, and have also performed various experiments to remove impurities including red color during dyeing.
메틸로트로픽 박테리아(methylotrophic bacteria)는 에너지원과 탄소원으로 메탄이나 메탄올과 같은 환원형 단일 탄소를 이용하는 세균집단을 일컫는다. 본 실험실에서 분리한 기생성 해양 메틸로트로픽 박테리아인 Methylophaga sp. SK1에서 청색소를 생산하는 유전자를 E. coli에 도입하였다. 인디고 생성에 있어서 높은 활성과 다량의 인디고를 획득할 수 있었던 플라빈-함유 모노옥시게네이즈(flavin-containing monooxygenase) (FMO)는 플라보 단백질의 일종으로서 헤테로원자를 포함하는 물질 또는 아민을 산화시킨다.Methyltrophic bacteria refer to a group of bacteria that use a reduced single carbon such as methane or methanol as an energy and carbon source. The parasitic marine methyltropic bacteria Methylophaga sp. The gene producing blue pigment in SK1 was introduced into E. coli . Flavin-containing monooxygenase (FMO), which was able to obtain high activity and a large amount of indigo in indigo production, is a type of flavo protein that oxidizes substances or amines containing heteroatoms .
인디고의 생성은 대장균 숙주세포가 원래 갖고 있는 트립토파나제(tryptophanase)에 의하여 배지내의 트립토판이 인돌(indole)로 전환된다. 트립토판은 인디고로 전환하는데 있어 매우 이상적이다. 이것은 트립토판이 이미 인디고 분자의 중심에 있는 고리 구조를 가지고 있기 때문이다. 약간의 화학적 변화를 주면 트립토판은 인돌로 전환된다. 이렇게 전환된 인돌은 클로닝된 DNA에 의해 발현된 FMO에 의하여 인돌옥사이드(indole oxide)로 전환된다. 이후 인돌옥사이드는 자연적인 반응에 의해 인독실(indoxyl)이 생성되며, 인디고 생성은 최종적으로 산화적 이량화(dimerizaton)를 거쳐 생성된다. The production of indigo converts tryptophan in the medium into indole by tryptophanase originally possessed by E. coli host cells. Tryptophan is ideal for converting to indigo. This is because tryptophan already has a ring structure in the center of the indigo molecule. After a slight chemical change, tryptophan is converted to indole. The indole thus converted is converted to indole oxide by FMO expressed by the cloned DNA. After the indole oxide is produced indokyl (indoxyl) by a natural reaction, indigo production is finally produced through oxidative dimerizaton (dimerizaton).
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 산업화가 가능한 인디고 및 인디루빈 생성유전자를 클로닝하여 대장균에 도입시켜 형질전환 대장균을 제조하고, 이 형질전환 대장균을 트립토판 함유 배지에서 배양시켜 트립토판 전환을 통한 다량의 인디고 및 인디루빈을 생물학적으로 제조할 수 있는 최적조건을 수립하고 수율을 극대화 할 수 있는 방법을 개발한 것이다. The technical problem to be achieved in the present invention is to clone the indigo and indirubin generating genes that can be industrialized into E. coli to produce transformed Escherichia coli, and to culture the transformed Escherichia coli in tryptophan-containing medium through a large amount of indigo and tryptophan conversion It is to develop the optimal condition for the production of indirubin biologically and to develop the method to maximize the yield.
본 발명의 목적은 메틸로파가 탈라시카(Methylophaga thalassica) SK1(기탁번호 : KCTC-10323BP)에서 분리된 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지니는 옥시게네이즈 유전자를 제공하는 것이다.An object of the present invention is Methylophaga thalassica To provide an oxygenase gene having a DNA sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from SK1 (Accession Number: KCTC-10323BP).
또한 본 발명은 상기 옥시게네이즈 유전자에 의해 발현되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 옥시게네이즈 효소를 제공하는 것이다. The present invention also provides an oxygenase enzyme having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 expressed by the oxygenase gene.
한편 본 발명은 상기 서열번호 1의 옥시게네이즈 유전자를 분리 증폭시킨후 벡터에 삽입하고 대장균에 삽입 형질전환시킨 재조합 대장균을 트립토판을 함유하는 배지에서 배양하여 트립토판에서 유래된 인돌을 옥시게네이즈 활성을 이용하여 인돌옥사이드로 전환시켜 인디고 및/또는 인디루빈으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. Meanwhile, the present invention isolates and amplifies the oxygenase gene of SEQ ID NO: 1, inserts it into a vector, and inserts and transforms the recombinant E. coli transformed into E. coli in a medium containing tryptophan, thereby inducing indole derived from tryptophan to oxygenase activity. It is to provide a method for producing indigo and / or indirubin by converting to indole oxide using.
또한 상기 재조합 대장균을 배양하여 트립토판에서 유래된 인돌을 옥시게네이즈 활성을 이용하여 인돌옥사이드를 제조한후, 제조된 인독실이 이량화되면 인디고가 제조되고, 인독실이 대사과정 중에 생성된 이사틴과 결합하면 인디루빈으로 제조됨을 특징으로 한다.In addition, after culturing the recombinant Escherichia coli, indole derived from tryptophan is prepared using oxygenase activity, and the indole is prepared when the indole is dimerized. When combined, it is characterized in that it is made of indirubin.
또한 상기 배양은 5∼15mM 트립토판, 0.5∼1.5% NaCl 및 0.2∼0.8% 효모 추출물이 함유된 배지에서 통기량 0.5∼2.0 vvm으로 산소를 주입하여 배양함을 특징으로 한다.In addition, the culture is characterized in that the culture by injecting oxygen with aeration of 0.5 to 2.0 vvm in a medium containing 5-15 mM tryptophan, 0.5-1.5% NaCl and 0.2-0.8% yeast extract.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
옥시게네이즈 유전자 클론의 분리Isolation of Oxygenase Gene Clones
전체적인 재조합 DNA 기술은 Sambrook et al.(1989) 방법을 이용하여 실험하였다. 시약 및 제한효소의 사용 등은 제조회사에서 추천하는 방법에 따라 수행하였다.Holistic recombinant DNA techniques are described in Sambrook et al. (1989) using the method. The use of reagents and restriction enzymes was carried out according to the method recommended by the manufacturer.
Methylophaga sp. SK1의 염색체 DNA 분리방법은 Goldberg와 Ohman (1984) 방법을 이용하여 준비하였다. 50㎖의 기본염류배지에 1% 메탄올이 첨가된 액체백지에서 Methylophaga sp. SK1 균주(기탁번호 : KCTC-10323BP)를 지수성장기까지 배양한 후 균체를 원심분리하여(10,000 ×g, 15분, 4℃) 모은 뒤, 균체를 멸균수로 두 번 씻고 10㎖의 용액 Ⅰ(50mM 글루코스, 10mM, EDTA, 25mM Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁하였다. 여기에 1㎖의 리소자임 용액(50㎎/㎖)과 0.5㎖ RNase(2㎎/㎖) 및 0.1㎖ 단백질분해효소 K (50㎎/㎖)를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치한 다음 0.6㎖의 10% SDS 용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 방치하였다. 반응액에 1㎖의 멀캅토에탄올(mercaptoethanol)을 가한 후 반응액의 0.5배에 해당하는 3M 아세트산나트륨 용액(pH 5.2)을 가한 후 반응액에 동일양의 클로로포름을 처리하였다. 이후 15,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였고, 이렇게 얻은 상등액의 0.6배에 해당하는 이소프로판올을 가한 후 엉기는 염색체 DNA를 회수하여 70% 에탄올로 세척한 다음 건조하였다. 건조된 염색체 DNA는 3㎖의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 녹여 실험에 사용하였다. Methylophaga sp. The chromosomal DNA isolation of SK1 was prepared using Goldberg and Ohman (1984). Methylophaga sp. Was added to 50 ml of basic salt medium in 1% methanol solution . After incubating the SK1 strain (Accession No .: KCTC-10323BP) to the exponential growth phase, the cells were collected by centrifugation (10,000 × g, 15 minutes, 4 ° C), and the cells were washed twice with sterile water and 10 ml of solution I ( 50 mM glucose, 10 mM, EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0). 1 ml of lysozyme solution (50 mg / ml), 0.5 ml RNase (2 mg / ml) and 0.1 ml protease K (50 mg / ml) were added and left at 37 ° C. for 1 hour, followed by 0.6 ml of 10% SDS solution was added and left at 37 ° C for 1 hour. After adding 1 ml of mercaptoethanol to the reaction solution, 3M sodium acetate solution (pH 5.2) corresponding to 0.5 times of the reaction solution was added thereto, and the reaction solution was treated with the same amount of chloroform. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation at 15,000 × g for 30 minutes. After adding isopropanol corresponding to 0.6 times of the supernatant thus obtained, the coagulated chromosomal DNA was recovered, washed with 70% ethanol, and dried. The dried chromosomal DNA was dissolved in 3 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) and used for the experiment.
게놈 라이브러리 제작Genome Library Fabrication
게놈 DNA 라이브러리는 pUC19 벡터를 이용하여 구성하였다. 염색체 DNA를 제한효소 HindⅢ로 완전히 분해한 후 HindⅢ로 자른 pUC19에 3 : 1의 DNA농도로 16℃에서 하룻밤 라이게이션을 실시하였다. 라이게이트된 혼합물을 숙주인 E. coli DH5α에 도입하였다.Genomic DNA libraries were constructed using the pUC19 vector. After chromosomal DNA was completely digested with restriction enzyme Hind III, pUC19 cut with Hind III was ligated overnight at 16 ° C with a DNA concentration of 3: 1. The ligated mixture was introduced into host E. coli DH5α.
형질전환Transformation
재조합 DNA 적당량을 E. coli DH5α컴피턴트 세포(competent cell)와 섞고 얼음에서 30분간 방치한 후 42℃에서 45초간 열 충격을 준 뒤 얼음 속에서 2분간 방치하였다. 여기에 900㎕ LB 액체배지를 넣어준 후 37℃에서 1시간 배양한 다음 원심분리 하여 상층액 900㎕를 제거하였다. 재현탁 과정을 거쳐 암피실린 항생제가 포함되어 있는 LB 배지에 평판도말 하고 37℃에서 배양하였다.Appropriate amount of recombinant DNA was mixed with E. coli DH5α competent cells and left for 30 minutes on ice, then subjected to heat shock at 42 ° C. for 45 seconds, and then left for 2 minutes in ice. 900 μl LB liquid medium was added thereto, followed by incubation at 37 ° C. for 1 hour, and then centrifuged to remove 900 μl of supernatant. After resuspension, the plate was plated in LB medium containing ampicillin antibiotics and incubated at 37 ° C.
플라스미드 분리Plasmid Isolation
알칼리성 분해(alkaline lysis) 방법으로 대장균으로부터 플라스미드를 분리하였다. 세균배양액 1㎖를 에펜도르프 튜브에 넣고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물을 2㎎/㎖ 라이소자임이 녹아있는 100㎕의 용액 Ⅰ에 현탁하였다. 용액 Ⅰ은 50mM 포도당과 10mM EDTA가 들어 있는 25mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0)을 사용하였다. 현탁액을 37℃에서 20분간 방치한 후 새로 만든 용액 Ⅱ(0.2N NaOH와 1% SDS 혼합액)를 200㎕첨가하여 서너번 조심스럽게 흔들어 혼합시킨 다음 얼음에 5분간 방치하였다. 반응이 끝난 용액에 150㎕의 용액 Ⅲ(5M 아세트산칼륨 60㎖, 빙초산 11.5㎖, 증류수 28.5㎖)을 첨가한 후 혼합, 얼음 속에서 5분간 방치하였다. 이후 50㎕의 클로로포름을 가한 후 교반하였다. 혼합된 액을 15,000 ×g 에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액의 2배에 해당하는 에탄올을 가한 후 15,000 ×g 에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 상등액을 제거한 후 70% 에탄올을 가하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 65℃에서 5분간 침전물을 건조시켰다. DNase가 제거된 췌장 RNase (20㎍/㎖) 1㎕와 TE 완충액 50㎕를 가하여 침전물을 녹인 후 실험에 사용하였다.Plasmids were isolated from Escherichia coli by alkaline lysis. 1 ml of the bacterial culture solution was placed in an Eppendorf tube and centrifuged to remove the supernatant. The precipitate was suspended in 100 μl of Solution I with 2 mg / ml lysozyme dissolved. Solution I used 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 50 mM glucose and 10 mM EDTA. After the suspension was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes, 200 μl of freshly prepared solution II (0.2N NaOH and 1% SDS mixed solution) was added thereto, and the mixture was shaken three or four times and mixed for 5 minutes. 150 μl of Solution III (60 mL of 5M potassium acetate, 11.5 mL of glacial acetic acid, 28.5 mL of distilled water) was added to the reaction solution, followed by mixing and standing for 5 minutes in ice. Then 50 μl of chloroform was added and stirred. The mixed solution was centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant. After adding ethanol corresponding to 2 times of the supernatant, the supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C. for 5 minutes at 15,000 × g , and 70% ethanol was added thereto. The supernatant was removed by centrifugation and the precipitate was dried at 65 ° C. for 5 minutes. 1 μl of DNase-free pancreatic RNase (20 μg / ml) and 50 μl of TE buffer were added to dissolve the precipitate and used for the experiment.
청색소 분리 및 특성 분석Blue pigment separation and characterization
청색소를 생산하는 유전자를 포함하고 있는 E. coli DH5α를 100㎖ LB에서 37℃로 16시간동안 배양하였다. 배양액을 10,000 ×g로 1분간 원심분리하여 군청색의 펠렛을 획득하였다. 군청색의 펠렛을 증류수로 두 번에 걸쳐 씻은 후 10㎖의 N, N-다이메틸포름아마이드(dimethylformamide)(DMF, Sigma)로 재현탁하였다. 그 후 마이크로프로브(microprobe)를 이용하여 초음파분해하였다. 10,000 ×g 로 1분간 원심분리한 후 상층액을 얻어 인디고 분석에 사용하였다. Ultrospec 2000 스펙트로포토미터(Amersham Bioscience)를 이용하여 인디고의 흡수파장을 측정하였다. 이때 파장범위는 300에서 700nm로 하여 측정하였다. 박층크로마토그래피는 DMF에 녹인 색소와 대조군으로 사용한 화학합성 인디고를 실리카겔l TLC 플레이트(Merck)에 스팟(spot)한 후 메탄올-아세톤의 혼합비율이 50 : 50 (v/v)인 용액을 용매로 사용하여 분석하였다. E. coli DH5α containing the gene producing blue pigment was incubated for 16 hours at 37 ° C. in 100 ml LB. The culture solution was centrifuged at 10,000 x g for 1 minute to obtain ultramarine pellets. The ultramarine blue pellet was washed twice with distilled water and then resuspended with 10 ml of N, N-dimethylformamide (DMF, Sigma). Thereafter, sonication was performed using a microprobe. After centrifugation at 10,000 x g for 1 minute, the supernatant was obtained and used for indigo analysis. The absorption wavelength of indigo was measured using an Ultrospec 2000 spectrophotometer (Amersham Bioscience). At this time, the wavelength range was measured as 300 to 700nm. In thin layer chromatography, a dye dissolved in DMF and a chemical synthetic indigo used as a control were spotted on a silica gel TLC plate (Merck), and then a solution having a methanol-acetone mixing ratio of 50:50 (v / v) was used as a solvent. Analyzed using.
HPLC를 이용한 청색소 정제 및 분석Purification and Analysis of Blue Pigments by HPLC
청색소를 prep-nova-pak HR C18 컬럼(25 ×100mm)을 이용하여 HPLC(delta prep 4000, Waters)로 분리하였다. 30%의 H2O와 70% 메탄올의 혼합용액을 이동상으로 하여 15㎖/min 속도로 흘려 보내면서 분리하였다. 이렇게 분리된 물질은 HPLC의 포토다이오드 분석(PDI)를 이용하여 최대흡수 파장을 구하여 분석하였다. 인디고 및 인디루빈의 대량 분리 정제는 Merck사의 LiChroprep RP-18 수지를 이용한 오픈 컬럼으로 실험을 수행하였다. 30%의 H2O와 70% 에탄올을 혼합한 용액을 이동상으로 하여 3㎖/min 속도로 흘려보낸 후 각각을 분리 정제하여 MALDI-TOF 및 NMR측정에 사용하였다.The blue pigment was separated by HPLC (delta prep 4000, Waters) using a prep-nova-pak HR C18 column (25 × 100 mm). A mixed solution of 30% H 2 O and 70% methanol was separated as a mobile phase by flowing at a rate of 15 mL / min. The separated material was analyzed by obtaining the maximum absorption wavelength using photodiode analysis (PDI) of HPLC. Mass separation purification of indigo and indirubin was performed on an open column using Merck's LiChroprep RP-18 resin. A solution of 30% H 2 O and 70% ethanol was flowed at a rate of 3 ml / min as a mobile phase, and each was separated and purified to be used for MALDI-TOF and NMR measurements.
발효 조건Fermentation condition
모든 인디고 발효실험은 KoBioTech(Model : KF-5L)사의 5ℓ발효조를 사용하여 회분식 배양으로 수행하였다. 10mM 트립토판, 1% NaCl, 0.5% 효모 추출물이 포함된 배지에서 균주별 인디고 생성량을 비교하기 위하여 인디고 생성 유전자가 포함된 E. coli DH5α, JM109 그리고 BL21(DE3) 종균량를 각각 5% 접종한 후 각각의 인디고 생성능을 측정하였다. 이때 용존산소의 양을 최대로 하여 인디고 생성이 잘 되도록 하였으며, pH는 7.0으로 고정 후 37℃에서 배양하였다.All indigo fermentation experiments were carried out in batch culture using a 5 L fermentation bath of KoBioTech (Model: KF-5L). To compare indigo production by strain in medium containing 10 mM tryptophan, 1% NaCl, and 0.5% yeast extract, inoculated with E. coli DH5α, JM109 and BL21 (DE3) spawns containing 5% of indigo genes, respectively. Indigo production capacity of was measured. At this time, the amount of dissolved oxygen was maximized to produce indigo well, and the pH was fixed at 7.0 and then cultured at 37 ° C.
인디고 생성량 측정Indigo production measurement
시간에 따른 인디고 생성량을 측정하기 위해서 시간별로 시료 1㎖를 10,000 ×g로 원심분리하여 상등액을 제거한 후 DMF 1㎖을 가하여 재현탁하였다. DMF에 현탁된 표본을 마이크로프로브를 이용하여 초음파 처리하였다. 10,000 ×g 로 원심분리하여 세포 잔해를 제거한 후 흡수파장이 최대가 되는 610nm에서 상등액을 측정하여 인디고 생성량을 측정하였다. 인디고 표준 곡선은 화학 합성 인디고를 DMF에 녹인 후 측정하였다.In order to measure the amount of indigo produced over time, 1 ml of the sample was centrifuged at 10,000 x g for each hour to remove the supernatant, and then 1 ml of DMF was added to resuspend. Samples suspended in DMF were sonicated using a microprobe. After removing the cell debris by centrifugation at 10,000 × g , the amount of indigo was measured by measuring the supernatant at 610 nm, the maximum absorption wavelength. Indigo standard curves were measured after the chemical synthetic indigo was dissolved in DMF.
발효 조건Fermentation condition
모든 인디고 발효실험은 KoBioTech(Model : KF-5L)사의 5ℓ발효조를 사용하여 회분식 배양으로 수행하였다. 10mM 트립토판, 1% NaCl, 0.5% 효모 추출물이 함된 배지에서 균주별 인디고 생성량을 비교하기 위하여 인디고 생성 유전자가 포함된 E. coli DH5α, JM109 그리고 BL21(DE3) 종균량를 각각 5% 접종한 후 각각의 인디고 생성능을 측정하였다. 이때 용존산소의 양을 최대로 하여 인디고 생성이 잘 되도록 하였으며, pH는 7.0으로 고정 후 37℃에서 배양하였다.All indigo fermentation experiments were carried out in batch culture using a 5 L fermentation bath of KoBioTech (Model: KF-5L). In order to compare the indigo production by strain in a medium containing 10 mM tryptophan, 1% NaCl, and 0.5% yeast extract, 5% of E. coli DH5α, JM109 and BL21 (DE3) spawns containing indigo-generating genes were inoculated, respectively. Indigo production capacity was measured. At this time, the amount of dissolved oxygen was maximized to produce indigo well, and the pH was fixed at 7.0 and then cultured at 37 ° C.
이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
(실시예 1) FMO 유전자의 클로닝 및 발현 Example 1 Cloning and Expression of FMO Gene
청색소 생산 클론의 분석Analysis of Blue Pigment Clones
Methylophaga sp. SK1(기탁번호 : KCTC-10323BP)의 게놈 라이브러리로부터 청색소를 생산하는 클론을 분리하였다. 다량의 청색소를 생성하는 블루 콜로니를 LB배지에서 호기적으로 24시간동안 배양하며 관찰하였다. 블루 콜로니로부터 2.2 kb 크기의 HindⅢ 단편조각과 혼성화된 플라스미드인 pBlue 2.2를 얻을 수 있었다(도 1). Methylophaga sp. Clones producing blue pigments were isolated from the genomic library of SK1 (Accession No .: KCTC-10323BP). Blue colonies producing a large amount of blue pigment were observed by aerobic incubation for 24 hours in LB medium. From the blue colony, pBlue 2.2, a plasmid hybridized with a 2.2 kb Hind III fragment, was obtained (FIG. 1).
pBlue에 SacⅠ과 HindⅢ 제한효소를 처리하여 자른 후 1.8kb의 단편조각을 얻었고, 이것을 pUC19 벡터가 가지고 있는 SacⅠ과 HindⅢ자리에 서브클로닝하였다. 1.8kb의 SacⅠ/HindⅢ 단편조각은 청색소를 생성하였다. 그러나 HindⅢ/EcoRⅠ과 SacⅠ/SalⅠ단편조각은 청색소를 생성하지 않았다. 이러한 청색소를 생성하는 서브클로닝 실험을 통해 신뢰할 수 있는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 발견할 수 있었다. Methylophaga sp. SK1 DNA를 클로닝한 단편조각의 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 1의 서열을 확인하였다. 염기서열을 결정한 총 2215 bp 중에서 1371 bp가 청색소를 형성하는 유전자의 ORF를 구성하고 있었다. 염기서열을 NCBI의 Blast 검색 프로그램(Altschul et al., 1990)과 Gene runner를 통해 분석한 결과 이 ORF가 플라빈-함유 모노옥시게네이즈(FMO)를 암호화하고 있었다.pBlue was cut and treated with Sac I and Hind III restriction enzymes to obtain 1.8 kb fragments, which were subcloned into the Sac I and Hind III sites of the pUC19 vector. A 1.8 kb Sac I / Hind III fragment produced blue pigment. However, Hind III / EcoR I and Sac I / Sal I fragments did not produce blue pigment . Subcloning experiments that produce these blue pigments have found a reliable open reading frame (ORF). Methylophaga s p. The sequence of SEQ ID NO: 1, which is a nucleotide sequence of a fragment of SK1 DNA cloned, was confirmed. Of the total 2215 bp of nucleotide sequences, 1371 bp constituted the ORF of the gene forming blue pigment. The sequence was analyzed by NCBI's Blast search program (Altschul et al ., 1990) and Gene runner, and the ORF encoded flavin-containing monooxygenase (FMO).
FMO 유전자의 발현Expression of the FMO Gene
FMO 유전자는 fmo 프로모터 부위를 포함하고 있으며, plac에 의해서 FMO 유전자가 발현된다. 본 실험에서는 클로닝한 DNA에 암호화 되어있는 FMO 유전자를 이용하여 인디고가 생성되도록 하였다. 이 방법은 포도당으로부터 인디고를 생성하는 것 보다 간편하게 다량의 인디고를 획득할 수 있으며, 인듀서로 고가의 IPTG를 필요로 하지 않는다(도 2).The FMO gene contains the fmo promoter region, and the FMO gene is expressed by plac . In this experiment, indigo was generated by using the FMO gene encoded in the cloned DNA. This method can more easily obtain a large amount of indigo than producing indigo from glucose, and does not require expensive IPTG as an inducer (FIG. 2).
(실시예 2) 청색소의 특성 분석Example 2 Characterization of Blue Pigment
청색소의 추출Extraction of Blue Pigments
배양액에서 대장균과 혼합되어 있는 청색소를 포어(pore) 크기 5㎛ Gelman 필터를 이용하여 배지성분 및 불순물을 제거하였다. 증류수를 가한 후 초음파 처리를 하여 배지성분 및 기타 수용성 물질과 남아 있는 잔존 물질을 완전히 제거한 후 건조시켜 다음 실험에 사용하였다. 메탄올 용매에서는 청색소 물질로부터 붉은색의 물질이 소량 추출되었으며, 황산, DMF 그리고 DMSO에서는 다량의 청색 물질이 추출되었다. 물기를 완전히 제거한 청색소에 DMF와 DMSO를 가한 후 스펙트로포토미터(Ultrospec 2000, Amersham Biosciences)를 이용하여 청색소를 분석하였다. 분석결과 합성 인디고 및 재조합 DNA 분자에서 생성된 청색소 모두 610nm에서 흡광도가 가장 높았다. The blue pigment mixed with E. coli was removed from the culture medium using a pore size 5 μm Gelman filter to remove the media components and impurities. After adding distilled water, ultrasonication was performed to completely remove the medium component, other water-soluble substances, and remaining substances, and dried the same to be used in the next experiment. A small amount of red color was extracted from the blue pigment in methanol solvent, and a large amount of blue substance was extracted from sulfuric acid, DMF and DMSO. DMF and DMSO were added to the blue pigment, which was completely drained, and the blue pigment was analyzed using a spectrophotometer (Ultrospec 2000, Amersham Biosciences). As a result, blue pigments produced from synthetic indigo and recombinant DNA molecules showed the highest absorbance at 610 nm.
청색소의 특성Characteristics of blue pigment
화학합성 인디고(Fluka)를 대조군으로 하여 청색소를 실리카겔 박층 크로마토그래피로 분석하였다. E. coli로부터 생성된 색소는 주요부분인 블루 스팟(Rf = 0.88)과 소수 스팟(Rf = 0.80)인 핑크로 분리되었다(도 3). 그 결과 재조합 DNA 분자로부터 생성된 주요 색소인 청색소는 인디고이며 적색소는 인디고의 이성질체인 인디루빈으로 추측되었다.Blue pigment was analyzed by silica gel thin layer chromatography using chemical synthetic indigo (Fluka) as a control. Pigments produced from E. coli were separated into pink, which is a major spot (R f = 0.88) and a minor spot (R f = 0.80) (FIG. 3). As a result, blue pigment, the main pigment produced from recombinant DNA molecules, was assumed to be indigo, and red pigment was indirubin, an isomer of indigo.
따라서 이 물질들에 대한 좀 더 자세한 특성조사를 위하여 다음 실험을 수행하였다. 추출된 청색소 2g을 DMSO 5㎖에 녹인 후 C-18 컬럼을 통하여 각각의 물질을 분리 정제하였다. 이때 메탄올과 증류수의 비율이 7:3으로 한 후 유속을 1㎖/분 속도로 흘려 보내면서 청색과 적색 분획을 각각 분리 정제하여 분자량을 측정하였다. MALDI-TOF로 분자량을 측정한 결과 화학합성 인디고와 대장균에서 생성된 인디고 모두 분자량이 262로 측정되었으며, 적색 부분 또한 분자량이 262로 측정되었다. NMR 측정결과와 분자량 측정결과 청색은 인디고로, 적색 부분은 인디루빈으로 판명되었다. Therefore, the following experiment was carried out for more detailed characterization of these materials. 2 g of the extracted blue pigment was dissolved in 5 ml of DMSO, and each material was separated and purified through a C-18 column. At this time, the ratio of methanol and distilled water was 7: 3, and the flow rate was flowed at a rate of 1 ml / min, and the blue and red fractions were separated and purified, respectively, to measure the molecular weight. As a result of measuring the molecular weight by MALDI-TOF, the indigo produced from the chemical synthesis indigo and Escherichia coli was measured to have a molecular weight of 262, and the red portion also measured a molecular weight of 262. NMR and molecular weight measurements showed blue as indigo and red as indirubin.
플라빈-함유 모노옥시게네이즈(FMO)는 사람을 포함한 대부분의 포유류에서 발견되고 있으며 멤브레인에 결합하여 생체이물 대사에 관여하는 효소이다. FMO들은 부드러운 구핵 원자인 질소, 황 그리고 인을 함유하는 화합물 등 다양한 물질의 산화를 촉매하는 것으로 알려져 있다. 최근에 효모에서 발견된 FMO는 소포체에서 단백질 폴딩에 관여하며, 식물에서의 FMO는 옥신 생합성에 관여한다고 보고되고 있다(Jung-Keun Suh, et al). 본 실험에서 클로닝한 DNA에 암호화되어 있는 FMO는 인돌을 인돌옥사이드로 산화시키며 최종적으로 인디고 형성에 관여하고 있다는 것으로 판단된다.Flavin-containing monooxygenase (FMO) is found in most mammals, including humans, and is an enzyme that binds to membranes and participates in bioforeign metabolism. FMOs are known to catalyze the oxidation of a variety of substances, including compounds containing nitrogen, sulfur and phosphorus, which are soft nucleophiles. Recently, FMOs found in yeast are involved in protein folding in endoplasmic reticulum, and FMOs in plants are reported to be involved in auxin biosynthesis (Jung-Keun Suh, et al ). In this experiment, the FMO encoded in the cloned DNA oxidizes indole into indole oxide and finally seems to be involved in indigo formation.
(실시예 3) 재조합 대장균을 이용한 인디고와 인디루빈 생산Example 3 Indigo and Indirubin Production Using Recombinant Escherichia Coli
인디고 생산Indigo production
모든 생성된 인디고는 UV-가시광선 스펙트로포토미터를 이용하여 610nm에서 생성량을 측정하였다. 물기를 완전히 제거한 인디고에 DMF를 가한 후 소니케이터를 이용, 수회에 걸쳐 인디고가 완전히 용해될 수 있도록 파쇄하였다. 준비된 시료를 610nm에서 측정하여 인디고 양을 정량하였다.All produced indigo was measured at 610 nm using a UV-Visible Spectrophotometer. DMF was added to the indigo, which had been completely drained, and crushed so that the indigo was completely dissolved several times using a sonicator. The prepared sample was measured at 610 nm to quantify the indigo amount.
본 실험에서는 대장균의 대사과정을 이용하여 인디고 생성 실험을 수행하였다. 대장균이 가지고 있는 트립토파나제를 이용하여 트립토판으로부터 인돌로 전환시킨 후 클로닝한 DNA에 암호화 되어있는 FMO에 의하여 인디고가 생성되도록 하였다. 이 방법은 포도당으로부터 인디고를 생성하는 것 보다 간편하게 다량의 인디고를 획득할 수 있으며, 인듀서로 고가의 IPTG를 필요로 하지 않는다. In this experiment, indigo production experiments were performed using the E. coli metabolism. E. coli tryptopanase was used to convert from tryptophan to indole, and the indigo was generated by the FMO encoded in the cloned DNA. This method makes it easier to obtain large amounts of indigo than to produce indigo from glucose and does not require expensive IPTG as an inducer.
① 배지조성① Composition of medium
인디고 형성에 적합한 배지를 찾기 위하여 고리구조를 가지고 있는 몇 개의 아미노산을 배지에 포함하여 인디고 생성량을 측정하였다. 트립신, 페닐알라닌, 트립토판을 각각 0.1%, 효모 추출물 0.5%, 그리고 NaCl 1%가 포함되어 있는 배지에 첨가하여 인디고 형성 실험을 하였다. 트립신 배지와 페닐알라닌 배지에서는 인디고가 생성되었으나 그 양이 미미하였고 트립토판 배지에서는 진한 청색의 인디고가 생성되어 이후 실험에서는 트립토판 배지를 이용하여 수행하였다. 트립토판이 과량으로 첨가된 배지에서는 인디고 생성효율이 저하되는 것을 관찰 할 수 있었다. 이것은 일정농도의 인디고가 생성된 후에는 대장균의 대사작용에 영향을 주어 인디고 형성이 더디게 진행되는 것으로 판단된다. 인디고 형성에 있어서 효율이 높은 트립토판의 농도는 10mM로써 그 이상의 농도에서는 인디고 형성효율이 저하되었다. NaCl 또는 효모 추출물의 농도는 인디고 형성에 그리 큰 영향을 주지는 못했지만 농도를 낮추어 실험하였을 때 인디고 형성이 지체되었다. 10mM 트립토판, 1% NaCl, 0.5% 효모 추출물이 포함된 배지를 이용하여 인디고 생성시 LB배지를 이용하는 것 보다 4배 이상의 인디고를 생성할 수 있었다. In order to find a medium suitable for indigo formation, a few amino acids having a ring structure were included in the medium, and indigo production was measured. Indigo formation experiments were performed by adding trypsin, phenylalanine, and tryptophan to a medium containing 0.1%, yeast extract 0.5%, and 1% NaCl, respectively. Indigo was produced in trypsin medium and phenylalanine medium, but the amount was insignificant, and dark blue indigo was produced in tryptophan medium, which was then carried out using tryptophan medium. It was observed that the indigo production efficiency was lowered in the medium to which tryptophan was added in excess. It is believed that after a certain concentration of indigo is produced, indigo formation is slowed due to the metabolic action of E. coli. The concentration of tryptophan with high efficiency in indigo formation was 10 mM and indigo formation efficiency was lowered at higher concentrations. The concentration of NaCl or yeast extract did not significantly affect indigo formation, but indigo formation was delayed when tested at lower concentrations. Using incubation medium containing 10 mM tryptophan, 1% NaCl, 0.5% yeast extract was able to produce more than four times more indigo than using LB medium when producing indigo.
② pH② pH
인디고가 생성되면서 배지내의 pH는 점차 염기성으로 변화하였다. pH는 12시간이 지난 후 최대 8.4까지 변화하였으며, 그 이상에서는 인디고가 형성되지 않았다. 또한 배지의 pH가 낮아질 경우 인디고가 무색으로 변화하여 정확한 생성량을 측정할 수 없었다. 따라서 모든 실험에서는 발효조를 이용하여 pH를 7.0으로 고정하여 실험을 수행하였다. As indigo was produced, the pH in the medium gradually changed to basic. The pH changed to a maximum of 8.4 after 12 hours and no indigo formed above that. In addition, when the pH of the medium was lowered, the indigo was changed to colorless, so that the exact amount of production could not be measured. Therefore, in all experiments, the experiment was performed by fixing the pH to 7.0 using a fermentor.
③ 온도③ temperature
프로모터 부위의 길이가 400bp 이상인 균주에서는 37℃에서 가장 짧은 시간에 다량의 인디고를 획득할 수 있었다. 한편 같은 온도에서 300bp이하의 프로모터 길이를 가지고 있는 균주에서는 인디고가 생성되지 않았으나, 30℃로 배양시에는 인디고가 생성되었다. 이것은 인디고를 생성하는 데 필요한 FMO가 다량 발현시 온도에 매우 불안정하여 인디고가 생성되지 않은 것으로 판단된다.In a strain having a promoter region of 400bp or more, a large amount of indigo could be obtained at the shortest time at 37 ° C. On the other hand, indigo was not produced in the strain having a promoter length of less than 300bp at the same temperature, but indigo was produced when incubated at 30 ° C. It is judged that indigo was not produced because the FMO required to produce indigo was very unstable at temperature upon expression of a large amount.
④ 숙주 대장균의 선택④ Selection of host E. coli
숙주에 따른 인디고 생성량을 확인하기 위하여 E. coli DH5α, JM101, JM109, BL21(DE3) 대장균을 이용하여 인디고 생성실험을 하였다. 프로모터 부위의 길이가 400 bp 이상인 pBlue 2.2, pBlue 2.0, pBlue 1.9 의 경우 다른 숙주에 비해 BL21(DE3)에서 많은 인디고를 생성하였다(도 4). 그러나 프로모터 부위가 300 bp 이하인 pBlue 1.8, pBlue 1.7, pBlue 1.6의 경우는 DH5α에서 더 많은 인디고가 생성되었으며 BL21(DE3)의 경우 인디고가 생성되지 않았다.Indigo production experiments were performed using E. coli DH5α, JM101, JM109, BL21 (DE3) Escherichia coli to confirm the indigo production according to the host. In the case of pBlue 2.2, pBlue 2.0, and pBlue 1.9 having a promoter region of 400 bp or more, BL21 (DE3) produced more indigo compared to other hosts (FIG. 4). However, more indigo was produced in DH5α for pBlue 1.8, pBlue 1.7, and pBlue 1.6 with a promoter region of less than 300 bp, and no indigo was produced for BL21 (DE3).
⑤ 용존산소의 영향⑤ Effect of dissolved oxygen
인디고 생성시 산소를 강제적으로 주입하지 않는 경우 인디고 생성량은 트립토판 배지를 사용하는 경우나 LB 배지를 사용하는 경우 둘 모두에서 인디고가 비슷하게 생성되었다. 그러나 강제적으로 산소를 폭기하여 배지내의 산소 농도를 높인 경우 인디고 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.Indigo production was not compulsorily injected with indigo when indigo was produced similarly in both tryptophan medium and LB medium. However, it was confirmed that indigo production was increased when the oxygen was forced to aeration to increase the oxygen concentration in the medium.
⑥ 프로모터 길이의 영향⑥ Effect of promoter length
인디고 생성에 영향을 주는 프로모터 구역의 길이를 결정하기 위해서 프로모터 삭제 방법을 이용하여 여러 가지 상위 염기서열을 실험에 사용하였다. 프로모터 구역의 길이를 100bp씩 줄여가면서 인디고 생성량을 측정하였다. pBlue 2.2를 주형으로 하여 각각의 프로모터 길이에 따른 프라이머를 제작하였으며 PCR을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 표 1과 같다. 이후 형성된 PCR 생성물은 pBluescript SK(+)에 서브클로닝하여 인디고 생성 실험을 수행하였다(도 5). 프로모터 구역이 작아 질수록 인디고 생성량은 증가하였으며 최대 생성량은 300bp 프로모터 부위를 가지는 pBlue 1.7 이었다(도 6). 인디고 발효실험은 KoBioTech (Model : KF-5L)사의 5ℓ발효조를 사용하여 회분식 배양으로 수행하였다. 10mM 트립토판, 1% NaCl, 0.5% 효모 추출물이 포함된 배지에서 인디고 생성능을 측정하였다. 이때 용존산소의 양을 최대로 하여 인디고 생성이 잘 되도록 하였으며, pH는 7.0으로 고정 후 37℃에서 배양하였다(도 7).In order to determine the length of the promoter region that influences indigo production, several higher nucleotide sequences were used in the experiment using the promoter deletion method. Indigo production was measured by decreasing the length of the promoter region by 100 bp. Primers according to the length of each promoter were prepared using pBlue 2.2 as a template and subjected to PCR. The primers used are shown in Table 1. The formed PCR product was then subcloned into pBluescript SK (+) to perform indigo production experiments (FIG. 5). Indigo production increased as the promoter region became smaller and the maximum production was pBlue 1.7 with a 300bp promoter region (FIG. 6). Indigo fermentation experiments were carried out in batch culture using a 5 L fermentation bath manufactured by KoBioTech (Model: KF-5L). Indigo production was measured in a medium containing 10 mM tryptophan, 1% NaCl, 0.5% yeast extract. At this time, the amount of dissolved oxygen was maximized to produce indigo well, and the pH was fixed at 7.0 and then cultured at 37 ° C. (FIG. 7).
세계적으로 많은 인기를 얻고 있는 진청색의 청색소 생산을 위하여 많은 그룹이 연구하고 있다. 화학적으로 생산시 발생하는 환경 오염물질 대신 인간에게 무해한 물질을 배출하는 세균을 이용하여 친환경적이며 자연 그대로의 색을 표현할 수 있도록 하고 있다. 이상의 결과를 토대로 본 실험에서는 가장 많은 인디고를 생성한 pBlue 1.7를 이용하여 트립토판 배지에서 30℃로 배양하면서 강제적으로 공기를 주입하는 방식으로 인디고 생성실험을 하였다. 인디고 생산을 주도하고 있는 그룹 중 하나인 일본의 Doukyu 연구팀은 Acinetobacter sp. ST-550 균주를 이용하여 2상 발효 공법을 통한 인디고 생산을 하고 있다. 2상 발효 공법을 이용한 연구에서는 최대 292mg/l 인디고를 생산하였다. 청색소 생산을 주도하는 또 다른 Murdock 연구팀은 재조합 균주를 이용하여 글로코스 배지로부터 130mg/l의 인디고를 생산하였다(표 2). 글루코스 배지로부터 인디고를 생산하는 방법은 글로코스라는 값싼 기질을 이용하여 고부가가치의 인디고를 생산한다는 매력을 가지고 있지만, 생산과정에 있어서 여러 단계를 거쳐야 한다는 단점과 인듀서로서 IPTG를 필요로 한다는 단점으로 인하여 트립토판을 이용하여 생산하는 방법에 비해 인디고 생산에 있어서 비효율적이다. 본 실험에서는 5ℓ의 발효조를 이용하여 회분식 배양 방법으로 인디고를 생산하고 있다. 클로닝된 FMO에 의하여 트립토판으로부터 여러 단계를 거치지 않고 간단하게 인디고로 전환시킬 수 있었다. 가장 많은 인디고를 생산하는 균주는 pBlue 1.7로써 30℃에서 호기적으로 배양한 결과 820mg/l 인디고를 생산하였다. 트립토판을 과량(20mM)으로 하여 인디고 생성시 인디고는 최대 1.2g/l를 생성하였으나 전환 효율은 현저히 저하하는 것을 확인할 수 있었다.Many groups are working on the production of dark blue blue pigment, which is gaining popularity worldwide. Instead of environmental pollutants produced during chemical production, bacteria that emit harmless substances to humans are used to express eco-friendly and natural colors. Based on the above results, in this experiment, the indigo production experiment was performed by injecting air by incubating at 30 ° C. in tryptophan medium using pBlue 1.7 which produced the most indigo. Doukyu's team in Japan, one of the leading groups in indigo production, reported that Acinetobacter sp. ST-550 strain is used to produce indigo through a two-phase fermentation process. Studies using the two-phase fermentation method produced up to 292 mg / l indigo. Another Murdock team leading the production of blue pigments produced 130 mg / l of indigo from Glocos medium using recombinant strains (Table 2). The method of producing indigo from glucose medium has the attractiveness of producing high value-added indigo using a cheap substrate called glocos, but the disadvantage of having to go through several steps in the production process and the need of IPTG as an inducer. This is inefficient in indigo production compared to the production using tryptophan. In this experiment, 5l fermenter is used to produce indigo by batch culture method. Cloned FMO allowed simple conversion from tryptophan to indigo without going through several steps. The most indigo-producing strain was pBlue 1.7, which produced 820 mg / l indigo when aerobicly cultured at 30 ° C. Indigo produced up to 1.2 g / l when tryptophan was in excess (20 mM), but conversion efficiency was remarkably decreased.
인디루빈 생산Indirubin production
최근의 연구에 따르면 지난 4000년 동안 이용되어 왔던 중국 전통 의약인 당귀에서 추출한 인디루빈이라는 성분이 백혈병에 대해서 치료효과가 있다고 하였다(Ralph Hoessel et al, 1999). 인디루빈과 그 유도체가 세포 분열에 관여하는 효소인 사이클린-의존적(cyclin-dependent) 키나제(CDK)의 활성을 억제한다는 것을 보여주었다. 암은 세포 분열을 조절하는 기작이 약해져서 비정상적인 성장을 나타내는 경우에 발생하기 때문에 세포 분열을 중단하는 물질은 항암제로 이용될 가능성이 있으며, 알츠하이머병이나 퇴행성 신경 질환을 치료하는 데에도 이용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 수행중인 인디고 생성 실험에서 TLC 및 HPLC를 이용한 추출액 분리 실험 중 붉은 색 색소를 정제할 수 있었으며, 분석 결과 인디고의 이성질체인 인디루빈으로 판명되었다. 인디루빈 생성 실험은 인디고 생성 방법과 동일하게 수행하였으며, E. coli로부터 인디루빈 생성은 도 1에 나타나 있는 바와 같이, 이사틴과 인독실의 결합으로 생성된다. 인디고와 인디루빈 및 기타화합물이 포함된 물질을 prep-nova-pak HR C18 컬럼(25 ×100mm)으로 분리하였다. 30%의 H2O와 70% 메탄올의 혼합용액을 이동상으로 하여 15㎖/분 속도로 흘려보내 분리하였다. 분리된 인디루빈생성량은 540nm에서 흡광도를 측정하여 정량 하였다(도 8). 인디루빈의 생성량은 인디고 생성량이 증가할수록 동시에 증가하는 것으로 나타났다. 인디루빈은 pBlue 1.9을 사용하여 실험하였을 때 35mg/l 이 생성되었다.Recent studies have shown that indirubin, a component of the Chinese traditional medicine tangui, which has been used for over 4000 years, has a therapeutic effect on leukemia (Ralph Hoessel et al, 1999). Indirubin and its derivatives have been shown to inhibit the activity of cyclin-dependent kinase (CDK), an enzyme involved in cell division. Because cancer occurs when the mechanism of regulating cell division weakens and shows abnormal growth, a substance that stops cell division may be used as an anticancer agent, and may be used to treat Alzheimer's disease or neurodegenerative disease. Known. In the indigo production experiment carried out in the present invention was able to purify the red pigment in the extract separation experiment using TLC and HPLC, the analysis results proved to be indirubin isomer of indigo. Indirubin production experiments were performed in the same manner as the indigo production method, and indirubin production from E. coli is generated by the combination of isatin and a doxyl chamber, as shown in FIG. 1. Materials containing indigo, indirubin and other compounds were separated on a prep-nova-pak HR C18 column (25 × 100 mm). A mixed solution of 30% H 2 O and 70% methanol was flowed at a rate of 15 ml / min as a mobile phase and separated. Separated indirubin production was quantified by measuring the absorbance at 540nm (Fig. 8). Indirubin production increased with increasing indigo production. Indirubin produced 35 mg / l when tested using pBlue 1.9.
본 발명의 효과는 산업화가 가능한 인디고 및 인디루빈 생성유전자를 클로닝하여 대장균에 도입시켜 형질전환 대장균을 제조하고, 이 형질전환 대장균을 트립토판 함유 배지에서 배양시켜 트립토판 전환을 통한 다량의 인디고 및 인디루빈을 생물학적으로 제조할 수 있는 최적조건을 수립하고 수율을 극대화 할 수 있는 방법을 개발한 것이다. The effect of the present invention is to clone the indigo and indirubin generating genes that can be industrialized into Escherichia coli to produce transformed Escherichia coli, and to culture the transformed Escherichia coli in tryptophan-containing medium, a large amount of indigo and indirubin through tryptophan conversion It was to develop the optimal conditions for biological production and to maximize the yield.
도 1은 본 발명의 플라스미드 pBlue 2.2의 조립방법을 나타낸 것이다. Figure 1 shows the assembly method of the plasmid pBlue 2.2 of the present invention.
도 2는 (A) pBlue 1.7 상의 플라빈-함유 모노옥시게네이즈 유전자가 pUC19 내 lacZ (plac)의 다운스트림에 위치하였다. (B) 대장균으로부터 발현된 박테리아성 플라빈-함유 모노옥시게네이즈의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 나타낸 것이다.2 shows (A) the flavin-containing monooxygenase gene on pBlue 1.7 was located downstream of lacZ (p lac ) in pUC19. (B) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of bacterial flavin-containing monooxygenase expressed from E. coli.
도 3은 본 발명의 플라빈-함유 모노옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 대장균에 의해 생성된 청색소의 UV-가시광선 스펙트럼을 나타낸 것이다. Figure 3 shows the UV-visible light spectrum of blue pigment produced by E. coli containing the flavin-containing monooxygenase gene of the present invention.
도 4는 본 발명의 대형 플라스미드를 함유한 재조합 E. coli DH5α균주에 의한 인디고의 생성을 나타낸 것이다. 배양액 유동체의 1ml가 다양한 시간 간격으로 수득되었고, DMF로 추출되었다. 610nm의 파장에서 DMF 용액의 흡광도가 측정되었다. 발효동안 다양한 양의 인디고가 각각 LB-암피실린 배지 내 pBlue 2.2(▼), 트립토판 배지 내 pBlue 2.0(●) 및 트립토판 배지 내 pBlue 1.9(■) 내포 세포로부터 생성되었다.Figure 4 shows the production of indigo by recombinant E. coli DH5α strain containing a large plasmid of the present invention. 1 ml of culture fluid was obtained at various time intervals and extracted with DMF. The absorbance of the DMF solution was measured at a wavelength of 610 nm. During fermentation, various amounts of indigo were generated from pBlue 2.2 (▼) in LB-ampicillin medium, pBlue 2.0 (•) in tryptophan medium and pBlue 1.9 (■) contained cells in tryptophan medium, respectively.
도 5는 본 발명의 2.0 kb의 PCR 생성물의 서브클로닝 개략도를 나타낸 것이다. Figure 5 shows a subcloning schematic of the 2.0 kb PCR product of the present invention.
도 6은 본 발명의 재조합 E. coli DH5α 균주 내 fmo 유전자의 프로모터 구역의 유리에 의한 인디고 형성의 비교를 나타낸 것이다.Figure 6 shows a comparison of indigo formation by the release of the promoter region of the fmo gene in the recombinant E. coli DH5α strain of the present invention.
도 7은 본 발명의 재조합 E. coli DH5α균주 내 fmo 유전자의 프로모터 구역의 유리에 의한 인디고의 생성을 나타낸 것이다. 각각 트립토판 배지 내 pBlue 1.7 (●), pBlue 1.8 (○) 및 pBlue 1.6 (▼) 내포 세포로부터 다른 양의 인디고가 생성되었다.Figure 7 shows the production of indigo by the release of the promoter region of the fmo gene in the recombinant E. coli DH5α strain of the present invention. Different amounts of indigo were generated from pBlue 1.7 (•), pBlue 1.8 (○) and pBlue 1.6 (▼) inclusion cells in tryptophan medium, respectively.
도 8은 본 발명의 pBlue 1.9. 내포 재조합 E. coli DH5α균주의 인디루빈의 생성을 나타낸 것이다.8 is pBlue 1.9. The production of indirubin of the recombinant recombinant E. coli DH5α strain is shown.
<110> CHOSUN UNIVERSITY KIM, Si Wouk <120> Biological methods for producing indigo and indirubin by the recombinant E. coli cells harboring a novel oxygenase <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1329 <212> DNA <213> Methylophaga thalassica <400> 1 atggcacaac tcagagcatt ccaatccgcc caggaaaaag gtgctgagat ccctgaactc 60 gtttgttttg aaaaacaagc tgattggggc ggccagtgga attacacatg gcgcactggt 120 ttagatgaaa atggcgaacc tgttcatagc agtatgtatc gctatctgtg gtcaaacggc 180 ccgaaagaat gtcttgaatt tgctgattac acgtttgacg aacactttgg taagcccatc 240 gcctcttatc caccccgtga agtcttatgg gactatatta aaggccgtgt tgaaaaagcc 300 ggcgtcagaa aatatatccg ttttaatacc gctgttcgtc atgttgaatt caacgaagac 360 agccaaactt ttaccgttac cgtgcaggac catactactg acacaattta ctctgaagag 420 tttgactatg ttgtctgttg taccggtcac ttctcaacac cttacgtgcc tgaatttgaa 480 ggctttgaaa aatttggtgg ccgcattctg catgcccatg acttccgtga cgcattagaa 540 tttaaagaca aaactgtatt actggtcggc agcagttact cagctgaaga tatcggctca 600 caatgttata aatacggcgc gaaaaaactg atcagctgct 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Asp Trp Gly Gly Gln 20 25 30 Trp Asn Tyr Thr Trp Arg Thr Gly Leu Asp Glu Asn Gly Glu Pro Val 35 40 45 His Ser Ser Met Tyr Arg Tyr Leu Trp Ser Asn Gly Pro Lys Glu Cys 50 55 60 Leu Glu Phe Ala Asp Tyr Thr Phe Asp Glu His Phe Gly Lys Pro Ile 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Pro Pro Arg Glu Val Leu Trp Asp Tyr Ile Lys Gly Arg 85 90 95 Val Glu Lys Ala Gly Val Arg Lys Tyr Ile Arg Phe Asn Thr Ala Val 100 105 110 Arg His Val Glu Phe Asn Glu Asp Ser Gln Thr Phe Thr Val Thr Val 115 120 125 Gln Asp His Thr Thr Asp Thr Ile Tyr Ser Glu Glu Phe Asp Tyr Val 130 135 140 Val Cys Cys Thr Gly His Phe Ser Thr Pro Tyr Val Pro Glu Phe Glu 145 150 155 160 Gly Phe Glu Lys Phe Gly Gly Arg Ile Leu His Ala His Asp Phe Arg 165 170 175 Asp Ala Leu Glu Phe Lys Asp Lys Thr Val Leu Leu Val Gly Ser Ser 180 185 190 Tyr Ser Ala Glu Asp Ile Gly Ser Gln Cys Tyr Lys Tyr Gly Ala Lys 195 200 205 Lys Leu Ile Ser Cys Tyr Arg Thr Ala Pro Met Gly Tyr Lys Trp Pro 210 215 220 Glu Asn Trp Asp Glu Arg Pro Asn Leu Val Arg Val Asp Thr Glu Asn 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