KR100492541B1 - Circular nucleic acid chip, electrochemiluminescence nucleic acid detector and method for detecting hybridization of nucleic acid using them - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기존의 슬라이드 글라스와 같은 사각형의 기판과는 달리 원판형 기판에 핵산을 고정시키고, 원판형 기판을 회전시켜 위치를 제어한 후, 근접하여 전류를 흐르게 함으로써, 단 시간 내에 단순화된 장치에서 기판에 올려진 여러 종류의 핵산을 전기화학발광(Electrochemiluminescence)으로 검출하는 장치 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것이다.The present invention, unlike the rectangular substrate such as slide glass, fixed the nucleic acid on the disk-shaped substrate, and rotates the disk-shaped substrate to control the position, and then flow the current in close proximity, in a simplified device in a short time The present invention relates to an apparatus for detecting various kinds of nucleic acids loaded on a substrate by electrochemiluminescence and a method for detecting hybridization of nucleic acids using the same.
Description
본 발명은 기존의 슬라이드 글라스와 같은 사각형의 기판과는 달리 원판형 기판에 핵산을 고정시키고, 원판형 기판을 회전시켜 위치를 제어한 후, 근접하여 전류를 흐르게 함으로써, 단 시간 내에 단순화된 장치에서 기판에 올려진 여러 종류의 핵산을 전기화학발광(Electrochemiluminescence)으로 검출하는 장치 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것이다.The present invention, unlike the rectangular substrate such as slide glass, fixed the nucleic acid on the disk-shaped substrate, and rotates the disk-shaped substrate to control the position, and then flow the current in close proximity, in a simplified device in a short time The present invention relates to an apparatus for detecting various kinds of nucleic acids loaded on a substrate by electrochemiluminescence and a method for detecting hybridization of nucleic acids using the same.
DNA의 분자인지 능력을 이용하여 특정한 염기서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법인 서던 블라팅(Southern blotting)법이 1975년 Edwin Southern에 의하여 개발되었다. 서던 블라팅법에 따르면, 전기영동에 의하여 크기에 따라 분리된 DNA 조각을 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 또는 나일론 멤브레인(nylon membrane)과 같은 고체 기판 상에 이동시켜, DNA 조각들의 상대적인 위치를 유지시킨다. 그리고 나서, 고체 상에 고정된 DNA 조각에 방사선 동위원소로 표지된 관찰하고자 하는 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA 조각을 탐침(probe)으로서 넣어주면, 혼성화(hybridization)를 통하여 상보적 염기서열을 갖는 DNA 조각에 탐침이 결합하여 찾고자 하는 염기서열을 가진 DNA의 위치, 즉, 전기영동으로 분리된 DNA 조각의 크기를 알 수 있게 된다. 이 방법을 응용하여 RNA를 분석하는 노던 블라팅(Northern blotting), 단백질을 분석하는 웨스턴 블라팅(Western blotting)이 개발되었는데 그 원리는 크게 다르지 않다. Southern blotting was developed in 1975 by Edwin Southern, a method that uses DNA's molecular cognition to find DNA with specific sequences. According to the Southern blotting method, DNA fragments separated by size by electrophoresis are moved on a solid substrate such as nitrocellulose or nylon membrane to maintain relative positions of the DNA fragments. Then, a DNA or RNA fragment having a sequence complementary to the nucleotide sequence to be observed, labeled with a radioisotope, is immobilized onto a piece of DNA immobilized on a solid as a probe, and the base is complementary through hybridization. By combining the probe with the DNA fragment having the sequence, the position of the DNA having the sequence to be found, that is, the size of the DNA fragment separated by electrophoresis can be known. Northern blotting to analyze RNA and western blotting to analyze proteins have been developed using this method.
이와 같은 리셉터와 리간드의 결합을 이용하는 많은 분석방법들은 생물학 연구나 의료진단, 신약탐색, 법의학 등 많은 분야에 사용되고 있는데, 대부분의 경우 리셉터와 리간드의 수에 있어서 제한이 따른다. DNA의 예를 들면, 4 가지 염기를 가지고 10개 염기의 순차적 서열로 구성된 DNA를 만들 경우, 가능한 분자의 종류가 1,000,000개 이상이 될 정도로 매우 다양한 구조를 갖고 있다. 그러므로, DNA와 DNA 또는 DNA와 RNA의 결합반응에 대한 실험은 매우 반복적인 실험과정이 필요하고 이에 따라 많은 노동력과 시간 및 막대한 자원을 필요로 하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 염기서열을 아는 DNA를 기판 상의 기지(旣知)의 위치에 이차원으로 배열시키는 DNA 마이크로 어레이 기술이 개발되었다. Many analytical methods using the binding of receptors and ligands are used in many fields, such as biological research, medical diagnosis, drug discovery, and forensic science. In most cases, the number of receptors and ligands is limited. For example, in the case of DNA, which consists of four bases and a sequence consisting of ten bases, DNA has a variety of structures such as 1,000,000 or more kinds of possible molecules. Therefore, the experiment on the DNA-to-DNA or DNA-RNA binding reaction requires a very repetitive process, which requires a lot of labor, time and resources. In order to solve this problem, a DNA microarray technology has been developed in which a DNA having a base sequence is two-dimensionally arranged at a known position on a substrate.
DNA 마이크로 어레이는 좁은 기판 표면 상에 매우 다양한 염기서열을 가지는 DNA 조각을 고밀도로 배열시킨 것으로, 고정화된 DNA와 미지의 DNA 시료와의 혼성화를 통하여 미지 시료 내의 DNA에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 여기서, 혼성화( hybridization)란 DNA 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine) 사이에서 수소결합에 의하여 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중 나선(double-stranded) DNA를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 미지의 DNA 시료 중에서 기판에 고정된 탐침 DNA와 상보적 염기 서열을 갖는 DNA 조각은 탐침 DNA와 결합(혼성화)하여 기판 표면에 위치하게 되므로, 탐침 DNA, DNA 시료 또는 혼성화 후의 이중 나선 DNA를 적당히 표지(label)하면 시료 내의 DNA 염기서열에 대한 정보를 알 수 있다. A DNA microarray is a high density arrangement of DNA fragments having a wide variety of sequences on a narrow substrate surface. The DNA microarray is used to find information about DNA in an unknown sample through hybridization between immobilized DNA and an unknown DNA sample. Herein, hybridization refers to gene regions having complementary base sequences by hydrogen bonding between adenine-thymine and guanine-cytosine constituting DNA bases. To bind to form double-stranded DNA. Therefore, among the unknown DNA samples, DNA fragments having a base sequence complementary to the probe DNA immobilized on the substrate are placed on the surface of the substrate by binding (hybridizing) with the probe DNA. Appropriate labeling provides information about DNA sequences in the sample.
DNA 마이크로어레이 제조 방법은 기판 상에서 직접 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)를 합성하여 탐침을 만드는 합성법과 이미 합성된 핵산 [예컨대, 올리고뉴클레오타이드; cDNA (complementary DNA); PNA (peptide nucleic acids); LNA (locked nucleic acids) 등]을 기판 상에 올리는 방법과 같이 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 우선, 기판 상에서 직접 올리고뉴크레오타이드를 합성하는 방법에 있어서, 반도체 공정에서 많이 사용되는 포토리토그래피(photolithography) 기술을 이용한 방법으로 미리 기판 상에 빛에 민감한(photolabile) 화학물질로 보호(protect)된 개개의 염기를 합성할 수 있는 작용기를 도입하고, 포토마스크(photomask)를 이용하여 특정한 위치에만 빛을 쬐어주어 염기와 반응할 수 있는 작용기가 생성되도록 한다(미국특허 제5,143,854호). 반응에 참여하는 각각의 염기들도 그 말단에 빛에 민감한 화학물질로 보호되어 있어 빛이 쪼여진 위치에 염기가 한 개씩 결합하게 된다. 그리고 나서, 반응이 안된 염기들을 제거해주고 다시 반복하여 다른 패턴의 포토마스크를 이용하여 기판 위에 선택적으로 합성하는 작업을 계속하게 되면, 결과적으로 기판 위의 특정한 위치에 원하는 염기서열의 올리고뉴클레오타이드가 만들어진다. 또 다른 방법으로서, 잉크젯 프린터의 경우와 같이 압전 인쇄 (piezoelectric printing) 방식에 의하여 4 가지 염기중 하나를 전기적으로 방출시켜 기판 표면 위에 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 방법이 있다(미국특허 제5,474,796호). DNA microarray production methods include synthetic methods for making probes by synthesizing oligonucleotides directly on a substrate and nucleic acids already synthesized (eg, oligonucleotides; complementary DNA (cDNA); Peptide nucleic acids (PNA); LNA (locked nucleic acids, etc.)] can be largely divided into two methods, such as the method on the substrate. First, in the method of synthesizing oligonucleotides directly on a substrate, a method using photolithography technology, which is widely used in a semiconductor process, is protected with photolabile chemicals on a substrate in advance. A functional group capable of synthesizing the individual bases is introduced, and light is emitted only at a specific position using a photomask to generate functional groups capable of reacting with the base (US Pat. No. 5,143,854). Each base participating in the reaction is also protected by light-sensitive chemicals at its ends, which binds one base at the point where the light is split. Then, by removing the unreacted bases and repeating the process of selectively synthesizing on the substrate using a different pattern of photomask, the result is that oligonucleotides of the desired base sequence are formed at specific positions on the substrate. As another method, as in the case of an inkjet printer, there is a method of electrically releasing one of four bases by a piezoelectric printing method to form oligonucleotides on the surface of a substrate (US Patent No. 5,474, 796).
두 번째로, 이미 합성된 핵산을 기판 상에 올리는 방법에 있어서, 이미 합성된 DNA를 기계적 마이크로스파팅(microspotting) 방식으로 기판 위에 올리는 방법이 있는데(Science 270:467-470, 1995), 고밀도로 DNA 마이크로 어레이를 제조할 수 없다는 단점과 대량생산에 제약이 되는 단점이 있어 연구용 목적의 DNA 마이크로 어레이 제작에 주로 응용되고 있다. Secondly, in the method of loading the synthesized nucleic acid on the substrate, there is a method of loading the synthesized DNA on the substrate by mechanical microspotting (Science 270: 467-470, 1995). The drawback of not being able to manufacture a DNA microarray and a limitation of mass production has been mainly applied to the production of a DNA microarray for research purposes.
지금까지 개발된 DNA 마이크로 어레이의 경우, 제조방식은 달라도 서로 다른 DNA 분자들이 일정한 크기를 갖는 사각형의 기판 위에 바둑판 식으로 배열된 것이 특징이다. 혼성화 반응결과를 측정하기 위해서는 일반적으로 형광 이미지 스캐너를 사용하여 DNA 마이크로 어레이 기판면을 스캔하여 측정한다(미국특허 제5,091,652호). In the case of the DNA microarray developed so far, different DNA molecules are tiled on a rectangular substrate having a predetermined size, although the manufacturing method is different. In order to measure the hybridization result, a DNA microarray substrate surface is generally measured by using a fluorescence image scanner (US Pat. No. 5,091,652).
일반적으로, DNA 마이크로어레이(microarray)는 적게는 수 백 개부터 많게는 수 십만 개의 매우 다양한 염기서열을 갖는 DNA를 작은 공간에 배열시켜, 고정화된 기지(旣知)의 DNA와 미지(未知)의 DNA 시료와의 결합(hybridization)을 통하여 미지 시료 내의 DNA에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 즉, 미지의 DNA 시료가 기판에 고정된 탐침핵산과 상보적 결합을 하게 되면 기판 표면의 일정 위치에 놓이게 되는데, 이 때, 탐침핵산, DNA 시료 또는 결합 후의 이중 나선 핵산을 적당히 표지(labeling)하면, 표지가 검출되는 평면상의 배열 내의 위치로부터 시료내의 DNA 염기서열에 대한 정보를 알 수 있다. DNA 마이크로 어레이는 기존의 서텅 블라트, 노던 블라트, 돌연변이 검색 등을 대체하여 동시에 최소한 수 백 개 이상의 염기서열 부위를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점을 가지고 있다. In general, DNA microarrays arrange DNA with a wide variety of DNA sequences from as few as hundreds to as many as hundreds of thousands in a small space, thereby immobilizing known and unknown DNA. It is used to find information about DNA in an unknown sample through hybridization with the sample. In other words, when an unknown DNA sample complementarily binds to a probe nucleic acid immobilized on a substrate, it is placed at a predetermined position on the surface of the substrate. At this time, when appropriately labeling the probe nucleic acid, the DNA sample or the double-stranded nucleic acid after binding The position of the DNA sequence in the sample can be known from the position in the planar array where the label is detected. DNA microarrays have the advantage of being able to search for at least hundreds of nucleotide sequences at the same time, replacing conventional tungsten, northern, and mutation detection.
DNA 칩 제조는 상기한 바와 같은 DNA 마이크로 어레이의 제조에서와 같이, 기판 상에서 직접 올리고뉴클레어타이드를 합성하여 탐침을 만드는 합성법과 올리고뉴클레오타이드나 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid : PNA), cDNA(complementary DNA) 등을 미리 합성하여 칩 상에 올리는 방법으로 크게 두 가지로 나눌 수 있다.DNA chip preparation can be performed by synthesizing oligonucleotides directly on a substrate to make probes, as in the preparation of DNA microarrays as described above, and by using oligonucleotides or peptide nucleic acids (PNAs) and cDNAs (complementary DNA). It can be divided into two ways by pre-synthesizing and putting them on the chip.
그 중에서 반도체 공정에 많이 사용되는 포토리소그래피(photolithography) 방식을 이용하여 폴리뉴클레오타이드를 실리콘 기판 상에서 인-시투(in-situ) 합성하는 방법 (미국 특허 제5,143,854호)이 있고, 이와 유사한 방법으로 미국의 Affymetrix사는 올리고 핵산을 인-시투로 합성한 DNA 마이크로 어레이를 제조, 판매하고 있다. 이 방법은 앞서 설명한 바와 같이, 미리 기판상에 개개의 염기가 합성될 수 있는 작용기를 도입하고 작용기 말단에는 빛에 민감한 화학물질에 의해 보호된 상태로 만든다. 그리고, 포토마스크를 이용하여 특정한 일정 부위에만 빛을 쬐어주게 되면 빛에 민감한 화학물질이 제거되고 염기와 반응할 수 있는 작용기만 노출이 된다. 이때, 반응에 참여하는 각각의 염기들도 그 말단 부위에 빛에 민감한 화학물질이 붙어 있기 때문에 빛이 쪼여져 작용기가 활성화된 부위에만 염기가 한 개씩 합성될 수 있게 된다. 이어, 반응이 안된 염기들을 제거해준 다음, 다시 반복해서 다른 패턴을 갖는 포토마스크를 이용하여 특정부위에 특정 염기를 선택적으로 합성하는 작업을 계속하게 되면, 결과적으로 일정한 면적의 각 스팟(spot)상에 15 ∼ 25 mer 의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다.Among them, there is a method of in-situ synthesis of polynucleotides on a silicon substrate using photolithography, which is widely used in semiconductor processes (US Pat. No. 5,143,854). Affymetrix manufactures and sells DNA microarrays that synthesize oligonucleotides in-situ. This method introduces a functional group capable of synthesizing individual bases on a substrate in advance, as described above, and makes the functional groups protected by light-sensitive chemicals at their ends. In addition, when light is exposed to a specific part using a photomask, light-sensitive chemicals are removed and only functional groups capable of reacting with a base are exposed. At this time, each base participating in the reaction also has light-sensitive chemicals attached to its terminal sites, so that light is split so that only one base can be synthesized at the site where the functional group is activated. Subsequently, after removing the unreacted bases and repeating the process of selectively synthesizing a specific base at a specific site using a photomask having a different pattern, the result is that each spot of a certain area has a constant area. Oligonucleotides having a nucleotide sequence of 15 to 25 mer can be synthesized.
Affymetrix 칩의 단점으로 꼽히는 고가의 포토마스크를 사용하지 않고도 포토리소그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드 합성을 방법이 개발되었다. 미국의 위스콘신 대학에서 개발한 디지털 마이크로미러 어레이(Digital Micromirror Array)로 포토마스크의 역할을 대신하여 76,000개의 올리고뉴클레오타이드를 직접 칩의 표면 위에서 합성하는데 성공하였다.(Nature Biotechnology 17 : 974 ~ 978, 1999)Oligonucleotide synthesis using photolithography has been developed without the use of expensive photomasks, a disadvantage of Affymetrix chips. The Digital Micromirror Array, developed by the University of Wisconsin, USA, succeeded in synthesizing 76,000 oligonucleotides directly on the surface of the chip instead of acting as a photomask. (Nature Biotechnology 17: 974 to 978, 1999)
이 외에도 상기한 바와 같은 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방식으로 4가지 베이스(base) 중 어느 하나를 전기적으로 방출시킴으로써, 칩 표면 위에 올리고핵산을 형성하는 방법이 있다(미국 특허 제5,474,796호). 이 방법은 40 ∼ 50 mer의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)도 형성할 수는 있지만, 배열(aligning) 공정이 쉽지 않으며, 패턴의 최소 크기가 약 100 ㎛ 정도이므로 집적화에는 한계가 있다. 이 외에도, 고전적인 방법이라 할 수 있는 마이크로피펫팅(micropipetting) 방식과 스폿팅(spotting) 방식이 있다(Science 270 : 467 ∼ 470, 1995). In addition, there is a method of forming oligonucleic acid on a chip surface by electrically releasing any one of four bases by piezoelectric printing as described above (US Pat. No. 5,474,796). This method can form 40-50 mer oligonucleotides, but the alignment process is not easy, and since the minimum size of the pattern is about 100 μm, integration is limited. In addition to this, there are a micropipetting method and a spotting method, which are classic methods (Science 270: 467 to 470, 1995).
본 발명은 위치 제어가 가능한 원판형 핵산칩 및 광픽업장치를 이용하여 여러 종류의 샘플을 한 번에 측정할 수 있는 핵산 검출기 및 핵산 혼성화 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 전기화학발광 반응에 의하여 핵산의 혼성화 여부를 측정함으로써, 별도의 표지 단계 및 고가의 검출장비가 필요없는 경제적이고 간편한 핵산 검출기 및 핵산 혼성화 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a nucleic acid detector and a nucleic acid hybridization detection method capable of measuring several types of samples at once using a disc-shaped nucleic acid chip and an optical pickup device capable of position control. In addition, an object of the present invention is to provide an economical and convenient nucleic acid detector and nucleic acid hybridization detection method that does not require a separate labeling step and expensive detection equipment by measuring the hybridization of nucleic acids by an electrochemiluminescence reaction.
본 발명은 기존의 슬라이드 글라스와 같은 사각형의 기판과는 달리 원판형 기판에 핵산을 고정시키고, 원판형 기판을 회전시켜 위치를 제어한 후, 근접하여 전류를 흐르게 함으로써, 단 시간 내에 단순화된 장치에서 기판에 올려진 여러 종류의 핵산을 전기화학발광(Electrochemiluminescence)을 이용하여 검출하는 장치 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 핵산의 혼성화(Hybridization) 여부를 전기화학발광법에 의하여 검출하는 기술을 제공하는 것이다. The present invention, unlike the rectangular substrate such as slide glass, fixed the nucleic acid on the disk-shaped substrate, and rotates the disk-shaped substrate to control the position, and then flow the current in close proximity, in a simplified device in a short time The present invention relates to an apparatus for detecting various kinds of nucleic acids loaded on a substrate using electrochemiluminescence, and a method for detecting hybridization of nucleic acids using the same. That is, the present invention provides a technique for detecting whether hybridization of nucleic acids by hybridization.
본 발명의 핵심은 원판형 기판을 사용함으로 원판형 기판의 회전을 통한 위치 제어와 이동식 광측정 장치 또는 광섬유에 연결된 광측정 장치를 이용하여 단순화된 측정 방법으로 여러 종류의 스팟(spot)을 연속적으로 측정 가능하게 한다는데 있다. 원판형 기판을 사용한 핵산칩은 도 3과 같은 구조가 된다. 이러한 구조는 또한 핵산을 직접 전극 위에 올리지 않고 자기조립(Self-assembly)법에 의하여 원판형 기판에 고정시킨 후, 근접하여 전류를 흘려줌으로써 안정적인 전기화학발광을 유도하고 표면에 부착된 핵산의 전기적 손상을 최소화시킬 수 있다는 장점을 갖는다. 본 발명의 핵산 검출기는 이동식 또는 광섬유에 연결된 광픽업장치에 연결된 광측정장치를 포함함으로써, 하나의 광측정 장치만을 이용하여 주변의 전기화학발광에 간섭받지 않고 여러 개의 핵산 스팟을 검출 할 수 있다.The core of the present invention is the use of a disk-shaped substrate, the position control through the rotation of the disk-shaped substrate and a mobile optical measuring device or a light measuring device connected to the optical fiber by using a simple measuring method to continuously spot several kinds of spots To make it measurable. The nucleic acid chip using the disk-shaped substrate has a structure as shown in FIG. This structure also induces stable electrochemical luminescence by immobilizing the nucleic acid onto a disc-shaped substrate by self-assembly method without directly placing the nucleic acid on the electrode, and then by flowing a current in close proximity, and electrical damage of the nucleic acid attached to the surface. This has the advantage of minimizing. Since the nucleic acid detector of the present invention includes an optical measuring device connected to an optical pickup device connected to a mobile or optical fiber, it is possible to detect a plurality of nucleic acid spots without being disturbed by surrounding electrochemical emission using only one optical measuring device.
우선, 본 발명은 원판형 기판 상에 여러 종류의 서로 다른 탐침핵산이 고정화되어 있고, 상기 기판 상의 탐침핵산이 이미 배열되어 있는 전극 위치에 정확하게 대응하여 위치하도록 기판의 위치를 조절하는 위치제어장치를 포함하는 원판형 핵산칩을 제공한다. First, the present invention provides a position control apparatus for adjusting a position of a substrate such that various kinds of different probe nucleic acids are immobilized on a disc-shaped substrate, and the positions of the probe nucleic acids on the substrate are accurately corresponded to the positions of the electrodes. It provides a disc-shaped nucleic acid chip comprising.
상기 탐침핵산은 분석하고자 하는 타겟핵산과 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산을 의미하며, 탐침핵산의 5' 포스페이트 말단이 티올(thiol)기 또는 아민기(amine)를 포함하도록 하여, 자기-조립법(self-assembly)에 의하여 기판에 부착시킬 수 있다. 본 발명에서 검출하고자 하는 핵산(nucleic acid)은 올리고뉴클레오타이드(oligo-nucleotide), DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), cDNA(complementary DNA) 등을 총칭한다. The probe nucleic acid refers to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the target nucleic acid to be analyzed, so that the 5 'phosphate terminal of the probe nucleic acid includes a thiol group or an amine group, and is a self-assembly method. It can be attached to the substrate by self-assembly. Nucleic acid (nucleic acid) to be detected in the present invention refers to oligonucleotide (nucleotide), DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), cDNA (complementary DNA) and the like.
상기 기판으로 유리, 실리콘, PCB (printed circuit board), 플라스틱 또는 폴리머를 사용할 수 있으며, 탐침핵산이 고정화되는 부분을 아민, 알데히드, 폴리-L-라이신, 금 박막 또는 폴리머 겔 등으로 표면처리하여 사용할 수 있다.Glass, silicon, printed circuit board (PCB), plastic or polymer may be used as the substrate, and the surface where the probe nucleic acid is immobilized may be used by surface treatment with amine, aldehyde, poly-L-lysine, gold thin film or polymer gel. Can be.
또한, 상기 원판형 기판은 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 격자 구조물(16)로 구획화되거나, 도 5와 같이 구획화된 격자 구조물 내에 구멍이 뚫려있는 형태일 수 있다. 이와 같이 기판이 구멍을 포함하는 경우, 상기 구멍은 기판의 양면에 뚫린 구멍의 크기가 다른 경사각이 형성된 구멍일 수 있으며, 이와 같은 구멍의 내부 경사면에 상기와 같은 표면처리를 하여 여기에 핵산을 고정화시켜 사용할 수 있다.In addition, the disc-shaped substrate may be partitioned into the lattice structure 16 as shown in FIG. 4, or may have a shape in which holes are formed in the partitioned lattice structure as shown in FIG. 5. As described above, when the substrate includes a hole, the hole may be a hole having an inclined angle having a different size of the hole drilled on both sides of the substrate. Can be used.
본 발명의 구체예에 있어서, 원판형 기판의 표면을 금 박막으로 코팅하여 5'포스페이트 말단이 티올기로 유도된 핵산을 자기조립법을 이용하여 고정화시킬 수 있다. 또 다른 구체에에 있어서, 알데히드로 처리한 유리 기판에 5'포스페이트 말단이 아민기로 유도된 핵산을 부착시켜 사용할 수 있다. 또한, 비오틴(biotin)과 스트렙토아비딘(streptoabidin) 또는 아비딘의 생물학적 친화성을 이용하여 핵산을 기판 표면에 결합시킬 수 있다. 본 발명에 따른 핵산칩의 기판에는 여러 가지 종류의 서로 다른 탐침핵산이 기판상의 서로 다른 위치에 고정화되어 여러 개의 스팟(spot)을 이루며, 이에 의하여 여러 종류의 핵산을 연속적으로 검출할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the surface of the disc-shaped substrate may be coated with a thin film of gold to immobilize the nucleic acid induced by the thiol group at the 5 'phosphate end using a self-assembly method. In another embodiment, a 5 'phosphate terminal can be used by attaching an amine group-derived nucleic acid to an aldehyde-treated glass substrate. In addition, the biological affinity of biotin and streptoabidin or avidin may be used to bind the nucleic acid to the substrate surface. In the substrate of the nucleic acid chip according to the present invention, various kinds of different probe nucleic acids are immobilized at different positions on the substrate to form several spots, whereby various kinds of nucleic acids can be continuously detected.
상기 기판 위치 제어 장치는 기판 상의 탐침핵산이 고정화된 여러 개의 스팟이 이미 배열되어 있는 작업전극 위치에 정확하게 대응하여 위치하도록 기판의 위치를 조절하는 역할을 한다. 상기 위치제어장치는 마이크로미터 단위로 회전 조절되는 모터 구동장치를 이용하며, 기판 상의 스팟의 수와 크기가 상이한 여러 가지 원판형 기판의 종류를 자동으로 인식하여, 원판형 기판의 초기 설정 위치로 이동한 후, 정밀 위치조절을 하게 된다. The substrate position control device serves to adjust the position of the substrate so as to accurately correspond to the position of the working electrode where several spots on which the probe nucleic acid is immobilized are already arranged. The position control device uses a motor driving device that is rotated and adjusted in units of micrometers, and automatically recognizes a variety of disc-shaped substrates having different numbers and sizes of spots on the substrate, and moves to the initial setting position of the disc-shaped substrate. After that, precise positioning is performed.
또한, 본 발명의 상기와 같은 핵산칩을 포함하는 핵산 검출기를 제공한다. 본 발명의 핵산 검출기는,In addition, the present invention provides a nucleic acid detector comprising the nucleic acid chip as described above. The nucleic acid detector of the present invention,
- 원판형 기판 상에 여러 종류의 서로 다른 탐침핵산이 고정화되어 있고, 상기 기판 상의 탐침핵산이 이미 배열되어 있는 전극 위치에 정확하게 대응하여 위치하도록 기판의 위치를 조절하는 기판 위치 제어 장치를 포함하는 원판형 핵산칩;A circle comprising a substrate position control device having a plurality of different probe nucleic acids immobilized on the disc-shaped substrate and adjusting the position of the substrate so as to correspond precisely to an electrode position in which the probe nucleic acids on the substrate are already arranged; Plate-type nucleic acid chips;
- 상기 핵산칩 상의 탐침핵산이 위치하는 스팟에 대응하는 수와 위치의 기준전극을 포함하는 전기화학장치 및 여기에 일정한 전압을 인가하기 위한 전기공급장치;An electrochemical device comprising a reference electrode of a number and a position corresponding to a spot at which the probe nucleic acid on the nucleic acid chip is located, and an electrical supply device for applying a constant voltage thereto;
- 전기화학발광을 위한 전기화학발광물질 용액을 포함하는 용액; 및 A solution comprising an electrochemiluminescent solution for electrochemiluminescence; And
- 기판 상의 여러 개의 스팟에서 발생하는 전기화학발광을 연속적으로 측정하기 위한 광픽업장치 및 발광정도를 측정하는 광측정 장치를 포함하여 이루어진다. An optical pickup device for continuously measuring electrochemiluminescence occurring at several spots on the substrate and an optical measuring device for measuring the degree of emission.
상기 탐침핵산은 분석하고자 하는 타겟핵산과 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산을 의미하며, 탐침핵산의 5' 포스페이트 말단이 티올기 또는 아민기를 포함하도록 하여, 자기-조립법에 의하여 기판에 부착시킬 수 있다. 본 발명에서 검출하고자 하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, PNA, cDNA 등을 총칭한다. The probe nucleic acid refers to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the target nucleic acid to be analyzed, so that the 5 'phosphate terminal of the probe nucleic acid includes a thiol group or an amine group, and can be attached to the substrate by self-assembly. have. Nucleic acid to be detected in the present invention are generically oligonucleotide, DNA, RNA, PNA, cDNA and the like.
상기 기판으로 유리, 실리콘, PCB, 플라스틱 또는 폴리머를 사용할 수 있으며, 탐침핵산이 고정화되는 부분을 아민, 알데히드, 폴리-L-라이신, 금 박막 또는 폴리머 겔 등으로 표면처리하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 원판형 기판은 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 격자 구조물(16)로 구획화되거나, 도 5와 같이 구획화된 격자 구조물 내에 구멍이 뚫려있는 형태일 수 있다. 이와 같이 기판이 구멍을 포함하는 경우, 상기 구멍은 기판의 양면에 뚫린 입구의 크기가 다른 경사각이 형성된 구멍일 수 있으며, 이와 같은 구멍의 내부 경사면에 상기와 같은 표면처리를 하여 여기에 핵산을 고정화시켜 사용할 수 있다. 이와 같이 경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산칩을 사용하는 경우에는, 구멍의 넓게 뚫린 부분이 작업전극을 향하게 하고, 구멍의 좁게 뚫린 부분이 광측정장치 쪽을 향하게 하여 여기서 발생한 빛을 모아줌으로써, 다른 구멍에서 발생한 빛의 간섭없이 각각의 구멍에서 발생하는 빛을 측정할 수 있다.Glass, silicon, PCB, plastic or polymer may be used as the substrate, and the part where the probe nucleic acid is immobilized may be used by surface treatment with amine, aldehyde, poly-L-lysine, gold thin film or polymer gel. In addition, the disc-shaped substrate may be partitioned into the lattice structure 16 as shown in FIG. 4, or may have a shape in which holes are formed in the partitioned lattice structure as shown in FIG. 5. As described above, when the substrate includes a hole, the hole may be a hole having an inclined angle having different sizes of the openings formed on both sides of the substrate, and the nucleic acid is immobilized thereto by subjecting the surface to the inner slope of the hole as described above. Can be used. In the case of using a nucleic acid chip having a hole having an inclination angle in this manner, the wide hole of the hole is directed toward the working electrode, and the narrow hole of the hole is toward the optical measuring device, and the light generated here is collected to collect the other hole. It is possible to measure the light emitted from each hole without interference of light from
상기 기판 위치 제어 장치는 기판 상의 탐침핵산이 고정화된 여러 개의 스팟이 이미 배열되어 있는 작업전극 위치에 정확하게 대응하여 위치하도록 기판의 위치를 조절하는 역할을 한다. 상기 위치제어장치는 마이크로미터 단위로 회전 조절되는 모터 구동장치를 이용하며, 기판 상의 스팟의 수와 크기가 상이한 여러 가지 원판형 기판의 종류를 자동으로 인식하여, 원판형 기판의 초기 설정 위치로 이동한 후, 정밀 위치조절을 하게 된다. The substrate position control device serves to adjust the position of the substrate so as to accurately correspond to the position of the working electrode where several spots on which the probe nucleic acid is immobilized are already arranged. The position control device uses a motor driving device that is rotated and adjusted in units of micrometers, and automatically recognizes a variety of disc-shaped substrates having different numbers and sizes of spots on the substrate, and moves to the initial setting position of the disc-shaped substrate. After that, precise positioning is performed.
전기화학발광반응을 일으키는 전기화학발광물질로서 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄 이가이온 {Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) [Ru(bpy)3 2+]}과 같은 루체늄 이온 유도체 또는 트리스(2,2'-바이피리딜)오스뮴 이가이온 {Tris(2,2'-bipyridyl)osmium (II)[Os(bpy)3 2+]}과 같은 오스뮴 이온 유도체등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 인터컬레이터는 혼성화된 이중나선 구조의 핵산에만 선택적으로 결합하며, 적정한 인가전압이 주어지면 루테늄 이온과 같은 전기화학발광물질의 전기화학발광을 유도함으로써, 특별한 표지 없이도 핵산의 혼성화 여부 및 정도를 측정 가능하게 한다. 이와 같은 인터컬레이터로서 DAPI(4`, 6-diamidino-2-phenylindol), 독소루비신(doxorubicine), 다우노루비신 하이드로크로라이드(daunorubicin hydrochloride) 등을 사용할 수 있다.As electrochemical luminescent material that causes electrochemical luminescence reaction, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium igaion {Tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) [Ru (bpy) 3 2+ ]} Rucenium ion derivatives or osmium ion derivatives such as tris (2,2'-bipyridyl) osmium igaion {Tris (2,2'-bipyridyl) osmium (II) [Os (bpy) 3 2+ ]} Can be used. In addition, the intercalator selectively binds only to a hybridized double-stranded nucleic acid, and, given an appropriate applied voltage, induces electrochemiluminescence of an electrochemiluminescent material such as ruthenium ion, thereby allowing hybridization of nucleic acid without special labeling. Make it possible to measure the degree. As such an intercalator, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol), doxorubicine, daunorubicin hydrochloride, and the like can be used.
또한, 본 발명의 핵산 검출기는 기판 상의 다수의 스팟에 고정된 서로 다른 핵산 샘플에서의 발광반응을 한 번에 순차적으로 측정하기 위하여 이동식 광픽업장치 또는 다수의 광섬유에 연결된 광픽업장치를 포함한다. 이동식 광픽업장치는 이동축이 연결되어 있어서 원판형 기판 상에 배열된 다수의 스팟 위를 이동한다. 이 때, 포텐시오스탯에 의하여 스팟과 대응적 위치에 배열되어 있는 작업전극 어레이에 순차적으로 전원이 공급되고, 이 때 순차적으로 발생하는 빛을 광픽업장치가 전원공급 순서와 동일한 순서로 이동하면서 순차적으로 측정한다(도 6 참조). 이 과정을 반복하여 다종의 스팟을 측정할 수 있다. 광섬유를 이용하여 측정하도록 하는 광 픽업장치의 경우에는, 전원을 동시에 공급하며, 원판형 기판 상의 스팟이 정밀 조절된 위치에 다수의 광섬유를 연결하고 이를 제어장치로 제어하여, 각각의 스팟에서 동시에 발행하는 빛을 시간 분할 측정할 수 있다(도 7 참조).In addition, the nucleic acid detector of the present invention includes a mobile optical pickup device or an optical pickup device connected to a plurality of optical fibers to sequentially measure the luminescence reactions at different nucleic acid samples fixed to a plurality of spots on a substrate at a time. The mobile optical pickup apparatus is connected to a moving shaft to move over a plurality of spots arranged on a disc-shaped substrate. At this time, the power is sequentially supplied to the working electrode array arranged at the spot and the corresponding position by the potentiostat, and the light generated sequentially is moved while the optical pickup device moves in the same order as the power supply sequence. Measured with (see FIG. 6). This process can be repeated to measure multiple spots. In the case of an optical pick-up device for measuring by using an optical fiber, power is supplied at the same time, and a plurality of optical fibers are connected to a spot where a spot on a disc-shaped substrate is precisely adjusted and controlled by a controller to be issued simultaneously at each spot. Light can be measured in time division (see FIG. 7).
상기 광측정장치부분으로서 포토멀티플라이어 튜브(Photomultiplier Tube: PMT), 아바란체 포토다이오드(Avalanche photodiode), 냉각 시시디 카메라(Cooled CCD camera)등의 증폭 능력을 가진 광검출기를 사용할 수 있다. As the optical measuring device, a photodetector having an amplifying capability such as a photomultiplier tube (PMT), an avalanche photodiode, a cooled CCD camera, or the like may be used.
상기 전기화학장치는 삼전극계 또는 이전극계로 구성될 수 있다. 이전극계 전기화학장치는 핵산이 고정화된 기판과 대응하여 위치하는 작업전극(working electrode), Ag/AgCl전극 등을 사용하는 기준전극(reference electrode)으로 이루어지며, 삼전극계는 상기 이전극계에 백금선 등을 사용하는 대전극(counter electrode)을 추가적으로 포함하여 구성될 수 있다. 이러한 전기화학장치에 기준전극과 작업전극 간의 적정 전압을 인가하는 전원공급장치(포탠시오스탯)가 연결되어 있다.The electrochemical device may be composed of a three-electrode system or a two-electrode system. The two-electrode electrochemical device is composed of a reference electrode using a working electrode, an Ag / AgCl electrode, etc., which is located in correspondence with a substrate on which a nucleic acid is immobilized, and a three-electrode system includes a platinum wire or the like. It can be configured to further include a counter electrode (counter electrode) using. A power supply device (potentiometer) for applying an appropriate voltage between the reference electrode and the working electrode is connected to the electrochemical device.
전기화학발광물질로서 트리스(2.2'-바이피리딜)루테늄 이가이온 [Ru(bpy)3 2+] 유도체 또는 트리스(2,2'-바이피리딜)오스뮴 이가이온 [Os(bpy)3 3+] 유도체를 사용하는 경우는 +1.19V의 인가전압을 사용한다. 이와 같이 인가전압을 사용하면 상기 전기화학발광물질이 +3가 상태로 산화되고, 산화된 Ru(bpy)3 3+ 유도체 또는 Os(bpy)3 3+유도체가 핵산 이중나선에 인터컬레이팅된 인터컬레이터와 산화-환원 반응하여, 여기상태의 Ru(bpy)3 2+* 또는 Os(bpy)3 2+* 유도체를 만들며, 이 유도체가 기저상태로 되돌아올 때 약 610nm의 빛을 발생시킨다. 이 때, 상기 전기화학발광물질은 다시 +2가 상태의 원래 산화상태로 되돌아오며, 이는 다시 전극에 인가된 산화전압에 의해 +3가의 산화상태로 변하고 다시 인터컬레이터와 반응하여 빛을 발생하는 사이클을 가지게 된다.Tris (2.2'-bipyridyl) ruthenium divalent [Ru (bpy) 3 2+ ] derivative or tris (2,2'-bipyridyl) osmium divalent [Os (bpy) 3 3+ as electrochemiluminescent material ] In case of using a derivative, the voltage of + 1.19V is used. In this way, when the applied voltage is used, the electrochemiluminescent material is oxidized to a + trivalent state, and an intercalated interlayer of oxidized Ru (bpy) 3 3+ derivative or Os (bpy) 3 3+ derivative to nucleic acid double helix Oxidation-reduction reaction with the collector produces an excited Ru (bpy) 3 2 + * or Os (bpy) 3 2 + * derivative, which generates about 610 nm of light when the derivative returns to the ground state. At this time, the electrochemiluminescent material is returned to the original oxidation state of the +2 valence, which is converted to the + trivalent oxidation state by the oxidation voltage applied to the electrode and reacts with the intercalator to generate light. You have a cycle.
또한, 본 발명은 상기와 같은 핵산 검출기를 사용하여 핵산의 혼성화 여부를 검출하는 핵산 검출방법을 제공한다. 즉, 원판형 기판을 사용하여 핵산을 고정화시킨 후 근접하여 전류를 흘려주는 방식으로 인터컬레이터와 전기화학발광물질의 전기화학발광을 유도하여, 핵산을 안정적이고 경제적으로 검출할 수 있는 방법이다. 본 발명의 핵산 검출방법은,In addition, the present invention provides a nucleic acid detection method for detecting whether the nucleic acid hybridization using the nucleic acid detector as described above. That is, a method of stably and economically detecting nucleic acids by inducing electrochemical luminescence of an intercalator and an electrochemical luminescent material by immobilizing a nucleic acid using a disc-shaped substrate and then flowing a current in close proximity. Nucleic acid detection method of the present invention,
- 원판형 기판 상에 여러 종류의 서로 다른 탐침핵산을 고정화시키고, 여기에 상기 기판 상의 탐침핵산이 고정화된 부위(스팟)가 이미 배열되어 있는 작업전극 위치에 정확하게 대응하여 위치하도록 기판의 위치를 조절하는 기판 위치제어장치를 연결시켜 원판형 핵산칩을 제작하는 단계;-Immobilizes several different types of probe nucleic acid on a disc-shaped substrate, and adjusts the position of the substrate so as to correspond precisely to the working electrode position in which the sites (spots) on which the probe nucleic acid is immobilized on the substrate are already arranged. Connecting a substrate position control device to produce a disc-shaped nucleic acid chip;
- 전기화학발광물질을 포함하는 용액 내에 작업전극을 포함하는 전기화학장치를 배치시키고 여기에 전기공급장치를 연결시킨 후, 위치제어장치를 이용하여 핵산칩 상의 탐침핵산이 위치하는 스팟을 배열된 작업전극과 대응하는 위치에 위치하도록 핵산칩을 상기 용액 내에 설치하는 단계;-Place the electrochemical device including the working electrode in the solution containing the electrochemiluminescent material and connect the electric supply device to it, and then arrange the spot where the probe nucleic acid on the nucleic acid chip is located by using the position control device. Installing a nucleic acid chip in the solution so as to be positioned at a position corresponding to the electrode;
- 상기 전기발광물질, 핵산칩 및 전기화학장치를 포함하는 용액에 검출하고자 하는 타겟핵산과 인터컬레이터를 포함하는 시료를 첨가하는 단계; 및 Adding a sample comprising a target nucleic acid and an intercalator to be detected to a solution comprising the electroluminescent material, nucleic acid chip and electrochemical device; And
- 전압을 인가하고, 인터컬레이터에 의한 전기화학발광물질의 산화-환원 반응을 유도하여, 다수의 스팟에서 발생하는 빛을 광픽업장치 및 광측정 장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하여 이루어진다. Applying a voltage, inducing an oxidation-reduction reaction of the electrochemiluminescent material by means of an intercalator, and measuring light generated in a plurality of spots using an optical pickup device and an optical measuring device.
상기의 기판, 인터컬레이터, 전기화학발광물질, 광픽업장치 및 광측정장치는 상기한 바와 같다.The substrate, the intercalator, the electrochemical light emitting material, the optical pickup device, and the optical measurement device are as described above.
상기의 방법을 도면을 통하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.The above method will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
도 1 및 도 2는 기판에 탐침핵산(1)의 고정화하는 모습 및 인터컬레이터(7)에 의한 전기화학발광원리를 보여주는 것이다. 도 1은 유리 기판을 사용하여 탐침핵산(1)을 고정화시키는 경우로서, 유리 기판을 알데하이드(5) 처리한 후 사용 탐침핵산을 가하여 고정화시키는 것을 보여주며, 도 2는 탐침핵산을 금 박막으로 코팅된 표면 위에 고정화시키는 경우로서, 금 박막 위에 5'-포스페이트에 티올기(thiol)(9)로 유도된 탐침핵산(1)을 올려서 자기조립에 의한 모노레이어를 형성하게 하는 모습을 보여주는 것이다.1 and 2 show the immobilization of the probe nucleic acid 1 on the substrate and the electrochemical emission principle by the intercalator 7. 1 shows a case in which the probe nucleic acid 1 is immobilized by using a glass substrate, and the glass substrate is treated with aldehyde (5) and then immobilized by adding a used probe nucleic acid. FIG. 2 shows that the probe nucleic acid is coated with a thin film of gold. In the case of immobilization on the surface, it is shown that the mononuclear layer by self-assembly is formed by raising the probe nucleic acid (1) induced by thiol (9) on 5'-phosphate on the gold thin film.
도 1에 있어서, 탐침핵산의 5'-포스페이트 말단을 아민(amine)(4)으로 유도시키고 6 개의 탄소고리(3)를 연결시킨 후, 10 개의 dT(thymine) 염기(2)를 연결시켜서 타겟핵산과의 혼성화시의 반응성을 개선하였다. 이러한 탐침핵산을 알데히드로 표면처리된 유리 기판 상에 고정화시킨 후 타겟핵산(미지의 시료, 6)을 첨가하여 혼성화시킨다. 그리고 나서, 탐침핵산과 비상보적인 염기서열을 가지고 탐침핵산과 혼성화되지 않는 시료내의 핵산들을 세척과정을 통해서 제거시킨다. 여기에 인터컬레이터를 투여하면, 인터컬레이터는 주로 탐침핵산과 타겟핵산이 혼성화된 이중나선 구조의 메이저- 또는 마이너-그루브(groove) 구조에 결합한다. 이와 같이 이중나선 핵산에 인터컬레이터가 결합된 상태를 전기화학발광물질인 루테늄 이온(8)이 용해된 용액 속에 넣고, 약 1.19 볼트 인가전압을 걸어주면 용액 속의 Ru(bpy)3 2+ 이 산화되어 Ru(bpy)3 3+ 유도체가 되고, 이는 인터컬레이터와의 산화환원 반응을 통하여 여기 상태의 Ru(bpy)3 2+* 유도체가 되며, 이 유도체가 기저상태인 Ru(bpy)3 2+ 로 되돌아올 때 약 620 nm의 빛을 발생하게 된다. 이 때 발생하는 빛을 광 검출기로 검출한다.In Fig. 1, the 5'-phosphate end of the probe nucleic acid is induced with an amine (4), and the six carbon rings (3) are linked to each other, followed by the connection of ten dT (thymine) bases (2) to the target. Improved reactivity upon hybridization with nucleic acids. This probe nucleic acid is immobilized on an aldehyde surface-treated glass substrate, and then hybridized by adding a target nucleic acid (an unknown sample, 6). Then, the nucleic acid in the sample that does not hybridize with the probe nucleic acid with the probe nucleic acid and the non-complementary sequence is removed by washing. When the intercalator is administered thereto, the intercalator binds to the major-or minor-groove structure of the double-helix structure mainly mixed with the probe nucleic acid and the target nucleic acid. As such, the state in which the intercalator is bound to the double-stranded nucleic acid is placed in a solution in which ruthenium ion (8), which is an electrochemical light emitting material, is applied, and a voltage of about 1.19 volts is applied to Ru (bpy) 3 2+ in the solution. is Ru (bpy) 3 3+, and the derivative, which is an intercalation through a redox reaction with the concentrator of the excited state Ru (bpy) 3 2 + * derivative, a derivative of Ru (bpy) 3 2 ground state When it returns to + , it produces light of about 620 nm. Light generated at this time is detected by a photo detector.
도 2에 있어서, 5'-포스페이트 말단을 티올기(thiol)(9)로 유도시키고, 6 개의 탄소고리(3)를 연결시킨 탐침핵산(1)을 금 박막이 코팅된 기판의 표면 위에 올려서 자기조립에 의한 모노레이어를 형성한다. 그 이후의 과정은 도 1에서의 방법 동일하다.In Fig. 2, the 5'-phosphate end is induced by a thiol (9), and the probe nucleic acid (1) having six carbon rings (3) is mounted on the surface of the gold-coated substrate. The monolayer is formed by assembly. The subsequent procedure is the same as the method in FIG.
도 3은 원판형 전기화학발광 핵산칩(11)의 개략도이다. 도 3에서 보는 바와 같이, 원판형의 기판 위에 구형으로 표시된 부위(13)에 탐침핵산을 올리고 원판형의 기판을 전극 위치로 이동하기 위한 위치제어 모터 및 제어기(14)를 포함한다.3 is a schematic diagram of a disc type electrochemiluminescent nucleic acid chip 11. As shown in FIG. 3, a position control motor and a controller 14 are provided for raising the probe nucleic acid in a spherical region 13 marked on a disc-shaped substrate and moving the disc-shaped substrate to an electrode position.
도 4 및 도 5는 각각 원판형의 기판 상에 구멍이 없는 형태와 뚫려 있는 형태를 보여 주고 있다. 도 4에 나타난 것과 같이 구멍이 없는 형태(15)는 유리와 같은 투명한 표면의 위치가 표시된 부위에 핵산을 고정시킨 후 사용하며, 위치표지(17)는 진공증착 장비인 스퍼터를 사용하였다. 도 5에 나타난 것과 같은 구멍이 뚫려있는 형태(18)는 구멍 내부에 핵산을 고정화시킨 후 사용되며, 구멍 내벽에는 보통 금(gold) 박막을 코팅하여 이용한다. 핵산 고정화 부위에는 높이 약 500~600 ㎛, 넓이 1000 ㎛의 불투명한 물질로 구획화된 격자 구조물(16)로 구획을 주어 발광검출 시 측정 효율을 높일 수 있게 하였다. 또한, 구획화된 격자 구조물 내에 원형 또는 사각형의 경사각이 형성된 구멍을 뚫어 발광되는 빛이 분산되지 않도록 하는 형태를 가지고 있다.4 and 5 show a form without a hole and a hole on the disk-shaped substrate, respectively. As shown in FIG. 4, the hole-free form 15 is used after fixing the nucleic acid at a site where a position of a transparent surface such as glass is indicated, and the position marker 17 uses a sputter which is a vacuum deposition equipment. Formed with holes 18 as shown in Figure 5 is used after fixing the nucleic acid in the hole, the inner wall of the hole (gold) is usually used to coat a thin film (gold). Nucleic acid immobilization sites were partitioned with a lattice structure 16 partitioned with an opaque material of about 500-600 μm in height and 1000 μm in width to enhance measurement efficiency during luminescence detection. In addition, a hole having a circular or rectangular inclination angle is formed in the partitioned lattice structure to prevent light emitted from being dispersed.
도 6은 원판형 전기화학발광 핵산칩 측정기의 예시도로서, 원판형 핵산칩(11)을 칩홀더(14)에 결합시킨 후, 탐침핵산을 원판형의 기판 상의 초기 설정 위치로 이동시킨 후, 작업전극 위치에서의 발광을 측정하는 모습을 보여준다. 원판형 칩이 고정화된 전극(20) 위치로 정확히 위치하도록 하는 위치제어 장치(14)는 마이크로미터 단위로 회전 조절되는 모터 구동장치를 통해서 이루어지며, 스팟의 수와 크기에 따른 다종의 원판형 기판의 종류를 자동으로 인식하여 원판형 기판의 초기 설정 위치로 이동시킨 후 정밀 위치조절을 하게 된다. 포텐시오스텟(24)에서는 기준전극(23)과 작업전극(20) 간의 인가전압을 부여하는 전원공급장치이며, 핵산칩 내부 스팟에서 외부 스팟 작업전극으로 순차적인 전원공급이 이루어진다. 이 때, 전원 공급이 이루어지는 순서에 따라 광픽업장치(29)는 광픽업장치 이동축(27)을 따라 위치제어 구동모터(31)의 제어를 통하여 원판형 기판의 내부 스팟에서 외부 스팟으로 연동 이동이 이루어지며, 발광반응 위치에서 발광반응을 측정한다. 광픽업장치 앞부분에는 렌즈(28)가 부착되어 발광반응의 빛의 분산을 막음으로서 측정 효율을 높일 수 있다. 이러한 일련의 과정을 반복하여 다종의 스팟을 연속적으로 자동 측정할 수 있다.6 is an exemplary diagram of a disc type electrochemiluminescent nucleic acid chip measuring instrument. After the disc type nucleic acid chip 11 is coupled to the chip holder 14, the probe nucleic acid is moved to an initial setting position on the disc type substrate. The light emission at the working electrode is measured. Position control device 14 to accurately position the disk-shaped chip to the fixed electrode 20 is made through a motor drive that is rotated in micrometers, a variety of disk-shaped substrate according to the number and size of spots Automatically recognize the type of and move to the initial setting position of the disk-shaped substrate to adjust the precise position. In the potentist 24 is a power supply for applying an applied voltage between the reference electrode 23 and the working electrode 20, a sequential power supply from the spot inside the nucleic acid chip to the external spot working electrode. At this time, the optical pickup device 29 is interlocked from the internal spot of the disc-shaped substrate to the external spot by controlling the position control driving motor 31 along the optical pickup device moving shaft 27 in the order of power supply. This is done, and the luminescence reaction is measured at the luminescence reaction position. The lens 28 is attached to the front of the optical pickup device to prevent the dispersion of light in the light emission reaction, thereby increasing the measurement efficiency. This series of steps can be repeated to continuously and automatically measure multiple spots.
도 7은 원판형 전기화학발광 핵산칩 측정기의 또 다른 예시도로서, 원판형 핵산칩을 칩홀더에 결합시킨 후, 탐침핵산을 원판형의 기판 상의 초기 설정 위치로 이동시킨 후, 작업전극 위치에서 광섬유를 이용하여 발광을 측정하는 모습을 보여준다. 이 때, 작업전극 어레이에서는 포텐시오스텟을 통한 순차적인 전원공급이 아닌 동시적인 전원 공급이 이루어지며 어레이 작업전극 앞에 위치한 스팟에서는 발광이 동시에 이루어지게 된다. 여기에 연결된 다수의 광섬유 다발을 통하여 들어오는 동시적인 발광은 광제어장치(33)와 광측정장치(30)를 거치면서 시간 분할 측정된다.7 is another exemplary diagram of a disc type electrochemiluminescent nucleic acid chip measuring instrument. After the disc type nucleic acid chip is coupled to the chip holder, the probe nucleic acid is moved to the initial setting position on the disc shaped substrate, Shows the measurement of luminescence using optical fiber. At this time, the working electrode array is not a sequential power supply through the potentiostat, but a simultaneous power supply is performed, and the light emitting is simultaneously performed in the spot located in front of the array working electrode. Simultaneous emission through multiple optical fiber bundles connected thereto is time-divided through the light control device 33 and the light measuring device 30.
도 8은 원판형 유리기판 전기화학발광 칩의 핵산 고정화 부분(34)과 작업전극(20) 간의 발광 측정 모습의 일례를 확대하여 보여주는 것이다. 작업전극은 전극홀더(21)에 압입되어 어레이 형태로 배열되어 있으며, 작업전극과 원판형 유리기판 칩은 약 500 ~ 700 ㎛ 떨어진 채로 일정한 간격을 유지시키며 발광반응을 측정한다. (A)는 이동식 광픽업장치를 사용하는 모습으로서, 발광반응의 빛의 분산을 막음으로 측정효율을 높일 수 있는 렌즈(28)가 부착되어 있는 모습과, 광픽업장치 내부의 이동 경로인 이동축의 모습을 보여주고 있다. (B)는 광섬유 다발을 사용한 예시로서, 광섬유는 광차단 보호막(37)으로 싸여있으며, 광섬유 말단은 유리 창문(view window)(35)과 밀착되어 있는 형태를 보여준다.FIG. 8 is an enlarged view of an example of a light emission measurement between the nucleic acid immobilization portion 34 and the working electrode 20 of the disk-shaped glass substrate electrochemiluminescence chip. The working electrodes are pressed into the electrode holder 21 and arranged in an array form. The working electrodes and the disc-shaped glass substrate chips are spaced at about 500 to 700 μm apart and measure the luminescence reaction. (A) shows the use of a mobile optical pick-up device, in which a lens 28 is attached to increase the measurement efficiency by preventing light scattering in the light emission reaction, and a moving shaft which is a moving path inside the optical pickup device. It is showing. (B) is an example using the optical fiber bundle, the optical fiber is wrapped in a light shielding protective film 37, the optical fiber end is shown in close contact with the glass window (view window) 35.
도 9는 구멍을 갖는 전기화학발광 칩의 핵산 고정화 부분(38)과 작업전극(20) 간의 발광 측정 모습의 일례를 확대하여 나타낸 것이다. 도 8과 마찬가지로, 작업전극은 전극홀더에 압입되어 어레이 형태로 배열되어 있으며 작업전극과 원판형 홀타입 칩은 약 200 ~ 500 ㎛ 떨어진 채로 일정한 간격을 유지시키며 발광반응을 측정한다. (A)는 이동식 광픽업장치(29)로서 렌즈(28)가 부착되어 발광반응의 빛의 분산을 막음으로 측정효율을 높이는 모습과, 광픽업장치 내부의 이동경로인 이동축의 모습을 보여주고 있다. (B)는 광섬유 다발을 사용한 예시로서, 광섬유는 광차단 보호막으로 싸여있으며, 광섬유 말단은 유리 창문(36)과 밀착되어 있는 형태를 보인다.9 is an enlarged view of an example of the measurement of luminescence between the nucleic acid immobilized portion 38 and the working electrode 20 of the electrochemiluminescent chip having holes. As shown in FIG. 8, the working electrodes are pressed into the electrode holders and arranged in an array form. The working electrodes and the disc-shaped hole-type chips are spaced apart at about 200 μm to 500 μm to measure the luminescence reaction. (A) shows a mobile optical pickup device 29, which is attached with a lens 28 to increase the measurement efficiency by preventing light from being dispersed in the light emission reaction, and shows a moving axis which is a movement path inside the optical pickup device. . (B) is an example using the optical fiber bundle, the optical fiber is wrapped with a light shielding protective film, the optical fiber terminal is in close contact with the glass window 36.
본 발명의 핵산 검출기 및 핵산 검출방법에 따라서, 원판형 기판을 사용하여 핵산 마이크로 어레이를 측정함으로 다종의 스팟이 고정된 칩의 샘플처리 시간을 단축하여, 단시간 내에 다종의 핵산 스팟을 측정 할 수 있다. 또한, 원판형 기판을 사용하여 핵산 마이크로 어레이 내부에 불투명한 물질로 구획화된 격자 구조물로 구획을 주어 발광검출 시 빛의 확산을 막음으로 측정 효율을 높일 수 있다. 또한, 편리에 따라, 핵산 마이크로 어레이 칩의 구획화된 격자 구조물내에 위치표지와 구멍을 뚫음으로 사용의 편리성과 발광검출 시 효율을 높일 수 있다. 또한, 전극과 별도의 기판 상에 핵산을 고정화시킴으로써, 원판형 기판의 재질과 구조에 따른 구애없이 칩을 제작함할 수 있어서, 칩 자체의 범용성을 넓힐 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 원판형 기판을 사용하는 핵산 마이크로 어레이 검출 장비는 제작 공정이 단순하고 저가로 장비를 제작할 수 있으며, 이동식 광픽업장치와 광섬유를 이용한 광픽업장치의 새로운 기술을 적용하여 보다 효율적이고 간편하게 다종의 스팟을 검출할 수 있다.According to the nucleic acid detector and the nucleic acid detection method of the present invention, by measuring the nucleic acid microarray using a disk-like substrate, it is possible to shorten the sample processing time of the chip on which the various kinds of spots are fixed, and to measure the various kinds of nucleic acid spots within a short time. . In addition, by using a disk-shaped substrate in the nucleic acid micro array inside partitioned with an opaque material partitioned by a structure to prevent the diffusion of light during the detection of light emission can increase the measurement efficiency. In addition, according to the convenience, it is possible to increase the ease of use and efficiency in the detection of light emission by drilling a location mark and a hole in the partitioned lattice structure of the nucleic acid micro array chip. In addition, by immobilizing the nucleic acid on a substrate separate from the electrode, the chip can be produced without regard to the material and structure of the disc-shaped substrate, thereby increasing the versatility of the chip itself. In addition, the nucleic acid micro array detection equipment using the disk-shaped substrate according to the present invention can be manufactured in a simple and low-cost manufacturing process, by applying a new technology of a mobile optical pickup device and an optical pickup device using an optical fiber more efficient It is possible to detect a variety of spots easily.
도 1은 유리 기판을 사용하는 칩에서의 탐침핵산의 고정화 및 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 보여주는 모식도이다.1 is a schematic diagram showing the principle of electrochemical emission by immobilization and intercalator of a probe nucleic acid in a chip using a glass substrate.
도 2는 기판에 금 박막이 코팅된 칩에서의 탐침핵산의 고정화 및 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 보여주는 모식도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing the principle of electrochemical light emission by the immobilization and intercalator of the probe nucleic acid in the chip coated with a gold thin film on the substrate.
도 3은 원판형 전기화학발광 핵산 어레이의 개략도이다.3 is a schematic of a discotic electrochemiluminescent nucleic acid array.
도 4는 평면 유리기판을 사용하는 원판형 전기화학발광 핵산 어레이의 확대도이다.4 is an enlarged view of a disc type electrochemiluminescent nucleic acid array using planar glass substrates.
도 5는 구멍이 있는 원판형 전기화학발광 핵산 어레이의 개략도이다.5 is a schematic of a perforated disc-shaped electrochemiluminescent nucleic acid array.
도 6은 원판형 전기화학발광 핵산 어레이와 이동식 광픽업장치를 포함하는 핵산 검출기의 개략도이다.6 is a schematic diagram of a nucleic acid detector comprising a disc-shaped electrochemiluminescent nucleic acid array and a mobile optical pickup device.
도 7은 원판형 전기화학발광 핵산 어레이와 광섬유 다발에 연결된 광픽업장치를 포함하는 핵산 검출기의 개략도이다.FIG. 7 is a schematic diagram of a nucleic acid detector including a disk-shaped electrochemiluminescent nucleic acid array and an optical pickup device connected to an optical fiber bundle.
도 8은 평면 유리기판을 사용하는 원판형 전기화학발광 핵산 어레이를 포함하는 핵산 검출기의 광측정 부위의 확대도로서, (A)는 이동식 광픽업장치를 포함하는 핵산 검출기의 광측정 부위를 확대한 것이고, (B)는 광섬유 다발에 연결된 광픽업장치를 포함하는 핵산검출기의 광측정 부위를 확대한 것이다.FIG. 8 is an enlarged view of a light measuring portion of a nucleic acid detector including a disc type electrochemiluminescent nucleic acid array using a flat glass substrate, and (A) is an enlarged view of the light measuring portion of a nucleic acid detector including a mobile optical pickup device. (B) is an enlarged photometric portion of the nucleic acid detector including the optical pickup device connected to the optical fiber bundle.
도 9는 구멍이 있는 원판형 핵산 어레이를 포함하는 핵산 검출기의 광측정 부위의 확대도로서, (A)는 이동식 광픽업장치를 포함하는 핵산 검출기의 광측정 부위를 확대한 것이고, (B)는 광섬유 다발에 연결된 광픽업장치를 포함하는 핵산검출기의 광측정 부위를 확대한 것이다.9 is an enlarged view of a photometric portion of a nucleic acid detector comprising a discoidal nucleic acid array with holes, (A) is an enlarged photometric portion of a nucleic acid detector including a mobile optical pickup device, (B) The optical measurement portion of the nucleic acid detector including the optical pickup device connected to the optical fiber bundle is enlarged.
*** 도면 주요부의 설명 ****** Description of the main parts of the drawing ***
1. 탐침핵산 2. 올리고 dT(10mer)1. Probe Nucleic Acid 2. Oligo dT (10mer)
3. 탄소 고리(carbon chain) 4. 아민(NH2)기3. carbon chain 4. amine (NH 2 ) group
5. 유리 기판(알데히드 글라스) 6. 타겟핵산5. Glass substrate (aldehyde glass) 6. Target nucleic acid
7. 인터컬레이터 8. 루테늄 이온7. Intercalator 8. Ruthenium Ion
9. 티올(SH)기 10. 금 박막9. Thiol (SH) group 10. Gold thin film
11. 원판형 핵산 어레이 12. 핵산 어레이 결합 부위11. Discular Nucleic Acid Arrays 12. Nucleic Acid Array Binding Sites
13. 핵산 고정화 부위 13. Nucleic Acid Immobilization Sites
14. 핵산 어레이 위치 제어 구동 모터 및 홀더14. Nucleic Acid Array Position Control Drive Motor and Holder
15. 평면 핵산칩의 핵산 고정화 부위 16. 구획화된 격자 구조물15. Nucleic Acid Immobilization Sites of Planar Nucleic Acid Chips 16. Partitioned Lattice Constructs
17. 위치표지 17. Location Mark
18. 구멍이 있는 핵산 어레이의 핵산 고정화 부위-금 박막 코팅된 구멍 내부18. Nucleic Acid Immobilization Sites of Porous Nucleic Acid Arrays—Gold Thin Film Coated Inside
19. 경사각이 형성된 구멍 20. 작업전극(working electrode)19. Hole with inclination angle 20. Working electrode
21. 전극 홀더 22. 대전극(counter electrode) 21. Electrode holder 22. Counter electrode
23. 기준전극(reference electrode) 24. 포텐시오스탯(potentiostat)23. reference electrode 24. potentiostat
25. 암상자 26. 루테늄 이온 용액25. Cancer box 26. Ruthenium ion solution
27. 광픽업장치의 이동축 28. 렌즈27. Moving axis of optical pickup device 28. Lens
29. 이동식 광픽업장치 30. 광측정 장치29. Optical pickup device 30. Optical measuring device
31. 광픽업장치 위치 제어 구동 모터 32. 광섬유 케이블31. Optical pickup device position control drive motor 32. Fiber optic cable
33. 광섬유에 연결된 광픽업 및 제어장치 33. Optical pickup and control device connected to optical fiber
34. 평면 원판형 핵산 어레이의 핵산이 고정화된 유리기판34. Glass Substrates with Immobilized Nucleic Acids in a Planar Discular Nucleic Acid Array
35. 유리창문 36. 광섬유35. Glass Window 36. Fiber Optic
37. 광차단 보호막 37. Light Blocking Shield
38. 구멍형 원판형 핵산 어레이의 핵산이 고정화된 구멍 38. Holes Immobilized with Nucleic Acids in a Circular Disc Nucleic Acid Array
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| KR10-2003-0012875A KR100492541B1 (en) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | Circular nucleic acid chip, electrochemiluminescence nucleic acid detector and method for detecting hybridization of nucleic acid using them |
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