KR100489188B1 - A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin - Google Patents
A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin Download PDFInfo
- Publication number
- KR100489188B1 KR100489188B1 KR10-2000-0053342A KR20000053342A KR100489188B1 KR 100489188 B1 KR100489188 B1 KR 100489188B1 KR 20000053342 A KR20000053342 A KR 20000053342A KR 100489188 B1 KR100489188 B1 KR 100489188B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- aging
- inducing
- senescent
- caveolin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/119—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being proteinic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7042—Aging, e.g. cellular aging
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 노화 세포의 검출방법, 세포의 노화 유도용 조성물 및 노화 유도 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카베올린을 이용한 노화 세포의 검출방법, 카베올린 유전자가 삽입된 진핵세포용 발현벡터를 포함하는 노화 유도용 조성물 및 이를 이용한 노화 유도 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 노화에 직접적으로 관련된 단백질을 이용함으로써 노화 세포를 보다 정확히 확인할 수 있고, 본 발명의 노화 유도용 조성물은 생체내 노화 유도단백질을 직접적으로 이용하므로 효과적으로 세포를 노화 상태로 유도할 수 있고, 이에 노화 관련 연구, 노화 관련 물질의 연구 및 개발 등에 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for detecting senescent cells, a composition for inducing senescence of cells and a method for inducing senescence, and more particularly, to a method for detecting senescent cells using capeolin, and an expression vector for eukaryotic cells into which the capeolin gene is inserted. The present invention relates to a composition for inducing aging and a method for inducing senescence using the same, wherein the method for detecting senescent cells of the present invention can more accurately identify senescent cells by using a protein directly related to aging. Since the aging induction protein is directly used in vivo, cells can be effectively induced into an aging state, and thus, it can be usefully used for aging-related research and research and development of aging-related materials.
Description
본 발명은 노화 세포의 검출방법, 세포의 노화 유도용 조성물 및 노화 유도 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카베올린을 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 유도용 조성물 및 노화 유도 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting senescent cells, a composition for inducing senescence of cells and a method for aging induction, and more particularly, to a method for detecting senescent cells using capoline, a composition for aging induction, and a method for aging induction.
카베올레 (Caveolae)는 세포막과 골지에 존재하는 직경 50-100 ㎚의 작은 함입구이며 세포의 신호 전달체계에 아주 중요한 역할을 하는 구조로서 신호전달에 관여하는 많은 수용체들이 카베올레에 존재하는 것으로 알려져 있다 (Engelman, J.A. et al., FEBS Lett., 428:205(1998)).Caveolae is a small inlet of 50-100 nm in diameter in the cell membrane and Golgi. It is a structure that plays an important role in cell signal transduction system. Many receptors involved in signal transduction are known to exist in caveolae. (Engelman, JA et al., FEBS Lett. , 428: 205 (1998)).
카베올레의 구조를 형성하는 데 가장 중요한 단백질인 카베올린 (caveolin)은 분자량 21-24 kDa의 내재성 막단백질로서, 카베올린이 없는 세포에 이 단백질을 발현시키면 카베올레의 형성이 유도된다 (Lipardi, C. et al., J. Cell Biol., 140:617(1998). 카베올린은 스캐폴딩 단백질로서 기능하며, 그 세포질쪽 N-말단 부위를 통하여 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), G-단백질, Src-유사 키나아제, Ha-Ras, 단백질 키나아제 C, 내피 니트릭-옥시드 신타아제, 인테그린 등과 상호작용하여 상기 신호전달체의 활성을 억제한다 (Li, S. et al., J. Biol. Chem., 271:29182(1996); Okamoto, T. et al., J. Biol. Chem., 273:5419(1998)).Caveolin, the most important protein for the formation of the structure of caveole, is an endogenous membrane protein with a molecular weight of 21-24 kDa. C. et al., J. Cell Biol. , 140: 617 (1998) .Caveolin functions as a scaffolding protein, through its cytoplasmic N-terminal region, EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), G-protein, It interacts with Src-like kinases, Ha-Ras, protein kinase C, endothelial nitric-oxide synthase, integrins, and the like to inhibit the activity of these signaling agents (Li, S. et al., J. Biol. Chem. , 271: 29182 (1996); Okamoto, T. et al., J. Biol. Chem. , 273: 5419 (1998).
또한, 생체 내에서 카베올린 단백질은 여러 개의 서브타입으로 발견이 되고 있고, 그 중 카베올린-1이 카베올레 구조 형성에 있어서 가장 중요한 물질이다. 그리고, 카베올린-2는 모든 세포 타입에서 발현되는 서브타입으로서 카베올레의 후부측면에서 헤테로-올리고머를 형성하는 것으로 알려져 있다 (Scheiffele, P. et al., J. Cell Biol., 140:795(1998)). 카베올린-3는 그 발현이 횡문근 세포에서만 일어나는 것으로 보고되어 있다 (Tang, Z. et al., J. Biol. Chem., 271:2255(1996)).In vivo, the Caberoline protein has been found in several subtypes, of which Caberoline-1 is the most important substance in the formation of Caberole structure. Caberoline-2 is a subtype that is expressed in all cell types and is known to form hetero-oligomers on the posterior side of caboleole (Scheiffele, P. et al., J. Cell Biol. , 140: 795 ( 1998)). Cabolin-3 is reported to occur only in rhabdomyoblast cells (Tang, Z. et al., J. Biol. Chem. , 271: 2255 (1996)).
EGF (Epidiermal Growth Factor)에 의한 신호 전달 체계에 있어서, 중간 매개체인 Erk 키나아제 (extracellular signal-regulated kinase)는 MAP 키나아제 (mitogen-activated protein kinase)의 일종으로서, EGF, PDGF (platelet-derived growth factor), 포르볼 에스테르, 인슐린-유사 성장 인자 Ⅱ 등의 여러 유사분열물질의 자극에 의해 활성화되는 Mek 1, 2에 의해 인산화되어 활성화되는 단백질이다. Erk 키나아제는 세린-트레오닌 키나아제로서 Erk 1(44kDa) 및 Erk 2(42kDa)가 있다. 이는 앞서와 같이 Mek에 의해 인산화되어 활성화되며, Rsk, c-Fos, TCF등을 인산화시킴으로써, c-fos나 c-myc 등의 발현을 조절한다. 섬유아세포에서는 EGF의 자극에 의해 Erk가 활성화되며, 이를 통해 세포 성장이 촉진되는 것으로 보고되어 있다.In the signal transduction system by EGF (Epidiermal Growth Factor), the intermediate medium, Erk kinase (extracellular signal-regulated kinase) is a kind of MAP kinase (mitogen-activated protein kinase), EGF, platelet-derived growth factor (PDGF) It is a protein that is phosphorylated and activated by Mek 1, 2 which is activated by stimulation of various mitotic substances such as phorbol ester and insulin-like growth factor II. Erk kinases are Erk 1 (44 kDa) and Erk 2 (42 kDa) as serine-threonine kinases. It is activated by phosphorylation by Mek as described above, and by phosphorylating Rsk, c-Fos, TCF, etc., it regulates the expression of c-fos or c-myc . In fibroblasts, it is reported that Erk is activated by stimulation of EGF, thereby promoting cell growth.
한편, 정상 사람의 세포는 어느 순간이 되면 더 이상 성장하지 않고 멈추게 되는데 이를 세포의 노화라 한다 (Hayflick, L. 및 Moorehead, P.S., Exp. Cell Res., 25:585(1961)). 노화 세포는 대사 에너지를 유지할 수 있으나, 성장 인자에 대한 반응이 감소되어 분열능이 상실된다 (Matsuda, T. et al., J. Cell. Physiol., 150:510(1992)).On the other hand, the normal human cell stops growing at any moment, which is called aging of cells (Hayflick, L. and Moorehead, PS, Exp. Cell Res. , 25: 585 (1961)). Aging cells can maintain metabolic energy, but diminish their ability to respond to growth factors, resulting in a loss of dividing capacity (Matsuda, T. et al., J. Cell .
노화 연구에 가장 대표적인 세포인 사람의 섬유아세포의 경우, 노화 상태에 도달하면 성장 인자에 대한 반응이 감소되고, 이어 유전자의 발현에 관여하는 c-fos의 발현이 저하되며, 결국 DNA 합성이 감소되는 것으로 보고 되어 있다. 한편, 노화 세포의 경우에는 EGF와 같은 성장 인자가 세포 표면에 있는 그들의 수용체와 정상적으로 결합하지만, 그 다음으로 이어지는 성장 신호 전달 시스템에서는 성장 인자의 자극을 인지하지 못하는 것으로 보고되어 있다(Peacoke, M. 및 Campisi, J., J. Cell. Biochem., 45:147(1991)). 그러나, 성장 인자가 정상적으로 세포의 수용체와 결합함에도 불구하고 세포가 성장하지 못하는 이유는 지금까지 풀리지 않는 수수께끼로 남아있다.In human fibroblasts, the most representative cell for aging studies, reaching senescence results in a decrease in the response to growth factors, followed by a decrease in the expression of c-fos involved in gene expression, resulting in decreased DNA synthesis. It is reported. On the other hand, in senescent cells, growth factors such as EGF normally bind to their receptors on the cell surface, but subsequent growth signal transduction systems have been reported not to recognize stimulation of growth factors (Peacoke, M.). And Campisi, J., J. Cell.Biochem . , 45: 147 (1991). However, the reason why the cells fail to grow despite the fact that growth factors normally bind to the receptors of the cells remains a mystery that has not been solved until now.
이에, 세포 노화시에 발견되는 EGF와 같은 세포 성장 인자에 대한 반응성 저하의 원인 및 세포 노화에 대한 분자적 기작의 규명은 미진한 상태이고, 더욱이 노화된 세포를 정확하게 확인할 수 있는 특정 표지에 대한 요구도 대두되고 있는 실정이다.Therefore, the cause of the reactivity of the cell growth factors such as EGF found during cellular aging and the molecular mechanisms for cellular aging are insufficient, and there is a need for a specific label that can accurately identify the aged cells. It is emerging.
본 발명자들은 상술한 당업계의 요구를 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 세포 노화에 따라 신호 전달계를 조절하는 카베올린 단백질의 발현이 증가됨을 확인하고, 상기 단백질을 세포내에 과발현시키는 경우에는 세포의 노화를 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made diligent research efforts to solve the above-mentioned demands of the art, and as a result, the expression of the caveolin protein that regulates the signal transduction system is increased according to the cellular aging, and when the protein is overexpressed in the cell, aging of the cell By confirming that can be induced to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for detecting senescent cells in a mammal.
본 발명의 다른 목적은 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a composition for inducing aging of mammalian cells.
본 발명의 또 다른 목적은 포유동물 세포의 노화 유도방법을 제공하는 데 있다. It is another object of the present invention to provide a method for inducing aging of mammalian cells.
본 발명은 포유동물의 세포내에 존재하는 카베올린 (caveolin) 단백질의 발현 증가를 측정하여 실시되는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for detecting mammalian senescent cells, which is carried out by measuring the increase in expression of caveolin protein present in mammalian cells.
한편, 본 발명은 카베올린 유전자를 포함하는 진핵세포용 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 특징으로 한다.On the other hand, the present invention is characterized by the composition for inducing aging of mammalian cells using the expression vector for eukaryotic cells containing the caveolin gene as an active ingredient.
본 발명은 카베올린 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 젊은 동물세포내로 도입하는 단계를 포함하는 포유동물 세포의 노화 유도 방법을 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for inducing aging of mammalian cells, comprising introducing into a young animal cell an expression vector for a eukaryotic cell having a caveolin gene.
본 발명은 노화 세포의 확인용 표지로서의 카베올린 단백질을 특징으로 한다.The present invention features carveolin proteins as markers for identifying senescent cells.
이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:The present invention is described in detail as follows:
본 발명자들은 포유동물의 노화 세포에서 EGF (Epidiermal Growth Factor)와 같은 성장 자극 인자에 대한 반응성이 현저하게 감소되고, 이는 카베올린 단백질의 발현 증가에 따른 것임을 확인하였다.The inventors have found that responsiveness to growth stimulating factors such as EGF (Epidiermal Growth Factor) in mammalian senescent cells is significantly reduced, which is due to the increased expression of the caveolin protein.
따라서, 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 동물 세포내 카베올린 단백질 함량 증가의 측정을 통해 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 웨스턴 블롯팅에 의해 실시된다.Therefore, the detection method of the senescent cells of the present invention is preferably carried out by measuring the increase in the content of the caveolin protein in the animal cells, more preferably by Western blotting.
상기 카베올린 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅 방법은 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 한편, 상기 웨스턴 블롯팅 방법은 바람직하게는 (ⅰ) 포유동물의 세포 시료를 용해하는 단계;(ⅱ) 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; (ⅲ) 수득된 단백질을 변성시키는 단계; (ⅳ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; (ⅴ) SDS-PAGE가 완료된 겔 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅵ) NC 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항카베올린 항체를 반응시키는 단계; (ⅶ) 상기 1차 항체와의 결합능을 갖으며, 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; (ⅷ) 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅸ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.Western blotting method for detecting the kaveolin protein may be a conventionally performed method (see Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine , 108-121, CRC press) . On the other hand, the Western blotting method preferably comprises the steps of: (i) lysing a mammalian cell sample; (ii) obtaining a protein from the lysed cells; (Iii) denaturing the protein obtained; (Iii) SDS-PAGE the denatured protein; (Iii) transferring the denatured protein on the gel complete with SDS-PAGE to the NC membrane; (Iii) reacting the protein on the NC membrane with an anticarveolin antibody that is a primary antibody; (Iii) reacting the secondary antibody with the primary antibody, the secondary antibody having an ability to bind the primary antibody and having an enzyme catalyzing a color reaction; (Iii) inducing a color reaction by adding a substrate of an enzyme bound to the secondary antibody; And (iii) measuring the degree of color development developed by the color reaction.
상기 발색반응을 촉매하는 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀 등이 이용된다.Enzymes that catalyze the color reaction include, but are not limited to, alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase, and the like. In addition, when using alkaline phosphatase, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), ECF substrate, etc. are used as a substrate, and when using a horse radish peroxidase, Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, luminol and the like are used as the substrate.
한편, 본 발명자들은 포유동물의 세포가 노화 단계로 진입하게 되면, 세포내 카베올린 단백질의 양이 급격하게 증가된다는 것을 확인하였고, 이에 상기 본 발명의 방법은 정성적인 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 노화 세포를 대상으로 한 상기한 웨스턴 블롯팅에 의해 최종적으로 형성되는 겔 상의 밴드는 그 세기 및 두께가 육안으로도 용이하게 감지할 수 있을 정도로 현저하게 증가하게 된다. 따라서, 웨스턴 블롯팅에 의한 겔 상의 밴드 중, 노화 상태를 검출하고자 하는 세포 시료의 밴드의 세기 및 두께를 대조군인 정상 세포의 밴드의 세기 및 두께와 육안으로 관찰ㆍ비교하여 노화 여부를 확인할 수 있다.On the other hand, the inventors have confirmed that when the mammalian cell enters the aging stage, the amount of intracellular caveolin protein is rapidly increased, and thus the method of the present invention can be carried out in a qualitative manner. For example, the band on the gel finally formed by the above-described western blotting for senescent cells is markedly increased so that its intensity and thickness can be easily detected by the naked eye. Therefore, the intensity and thickness of the band of the cell sample to detect the aging state among the bands on the gel by Western blotting can be visually observed and compared with the intensity and thickness of the band of the normal cell as a control group to confirm the aging. .
더불어, 상기한 본 발명의 방법은 정량적인 방법으로도 실시할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 블롯팅을 실시한 다음, 발색된 밴드를 갖는 NC 멤브레인을 직접적으로 덴시토미터(densitometor)로 읽거나, 또는 발광 기질을 이용하는 경우 (예: 루미놀)에는 필름으로 현상하여 그 필름을 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 노화 여부를 확인한다.In addition, the above-described method of the present invention can also be carried out in a quantitative manner, in which case, after blotting, the NC membrane having the colored band is read directly by a densitometor. Alternatively, in the case of using a light emitting substrate (eg, luminol), the film is developed into a film and the film is read by a densitometer to quantify the difference to determine whether aging occurs.
본 발명의 노화 유도용 조성물에 있어서, 진핵세포용 발현벡터에 삽입된 카베올린 유전자는 바람직하게는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖고, 보다 바람직하게는, 서열 1에 기재된 염기 서열중 26번째 염기 서열부터 559번째 염기 서열을 갖는다.In the composition for inducing senescence of the present invention, the kaveolin gene inserted into the expression vector for eukaryotic cells preferably has a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and more preferably, the base of SEQ ID NO: 1 From the 26th base sequence to the 559th sequence.
한편, 카베올린 유전자를 동물 세포 내로 안전하게 운반하고, 이를 세포 내에서 발현시키는 진핵세포용 발현벡터는 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 발현벡터는 현재 일반적으로 사용되고 있는 pcDNA 3(Invitrogen사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pSI(Promega사; SV 40 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pCI(Promega사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pREP7(Invitrogen사; RSV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 포함) 등이 있다.On the other hand, the expression vector for eukaryotic cells that safely transports the caveolin gene into the animal cell and expresses it in the cell preferably includes a promoter and a polyadenylation signal of the virus as an animal host. Expression vectors that can be used in the present invention are currently commonly used pcDNA 3 (Invitrogen; including cytomegalo virus promoter and polyadenylation signal), pSI (Promega; SV 40 promoter and polyadenylation signal) , pCI (including Promega; cytomegalovirus promoter and polyadenylation signal), pREP7 (Invitrogen; including RSV promoter and SV40 polyadenylation signal).
본 발명의 포유동물 세포의 노화 유도방법에 있어서, 카베올린 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입은 미세 주입법(참조: Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법(참조: Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)) 및 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the method for inducing aging of mammalian cells of the present invention, the introduction of expression vectors containing a caveolin gene into animal cells is carried out by micro-injection (see Capecchi, MR, Cell , 22: 479 (1980)), calcium phosphate cavity Precipitation (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982)) and liposome use ( Wong, TK et al., Gene , 10:87 (1980)) and the like, but is not limited thereto.
상술한 바와 같이, 카베올린은 노화 세포의 표지로서 유용하게 이용할 수 있다.As described above, caveolin can be usefully used as a label for senescent cells.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it is to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. Will be self-evident.
실시예 1: 세포 배양Example 1: Cell Culture
Ⅰ. 표피 섬유아세포(foreskin fibroblasts)의 배양 I. Culture of Foreskin Fibroblasts
표피 섬유아세포의 분리 및 배양은 Boyce와 Ham의 방법 (Boyce ST. and Ham RG., J. Invest. Dermato., 81:33-40(1983))에 따라 다음과 같이 실시하였다: 먼저, 7세 된 남아로부터 표피를 얻고, 이를 얇게 벗겨내어 절편으로 한 다음, 표피 절편을 0.25%의 콜라겐나아제가 포함된 항크스 염 용액 (Hank's salt solution: Gibco BRL사) 10 ㎖에 넣고, 90분 동안 5% CO2, 37℃의 항온 배양기에서 배양시킨 후 상피와 진피를 서로 분리하였다.Isolation and culture of epidermal fibroblasts were performed according to Boyce and Ham's method (Boyce ST. And Ham RG., J. Invest. Dermato., 81: 33-40 (1983)). The epidermis is obtained from the boy, thinly peeled into sections, and the epidermal sections are placed in 10 ml of Hank's salt solution (Gibco BRL) containing 0.25% collagenase and 5% for 90 minutes. After incubation in a constant temperature incubator of CO 2, 37 ℃ epithelium and dermis were separated from each other.
이어, 분리해 낸 진피에 0.25%의 트립신 용액 1 ㎖을 첨가하고, 항생제인 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖과 페닐실린 (Gibco BRL사) 100 유니트/㎖, 그리고 태아 소혈청 (fetal bovine serum: FBS, Gibco BRL사)을 10% 넣은 DMEM 세포 배양배지 (Dulbecco's modified Eagle medium: Sigma사) 10 ㎖에 넣은 다음, 37℃ 항온 배양기에서 10분동안 배양하였다.Then, 1 ml of 0.25% trypsin solution was added to the isolated dermis, 100 µg / ml of antibiotics streptomycin, 100 units / ml of phenylsilin (Gibco BRL), and fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL) was added to 10 ml of DMEM cell culture medium (Dulbecco's modified Eagle medium, Sigma) containing 10%, and incubated for 10 minutes in a 37 ° C incubator.
상기 과정에 의해 얻은 표피 섬유아세포를 10 ㎖의 PBS로 세척한 후, 상기의 DMEM (10% FBS, 항생제 포함) 세포 배양 배지에서 계대 배양을 다음과 같이 계속하여 실시하였다: 항온 배양기는 5% CO2 농도 및 37℃를 항시 유지하도록 하였고, DMEM 배지는 매 3일 마다 교환하였으며, 세포 배양 접시 표면적의 80-90%가 채워졌을 때 1:4로 계대 배양을 실시하였다. 세포를 계대 배양할 때마다 1:4로 배양한 것을 두 번 군락 더블링 (population doubling)한 것으로 하여 군락 더블링 수준 (population doubling level: PDL)의 수를 2씩 증가시켜 기록하였다.The epidermal fibroblasts obtained by the above procedure were washed with 10 ml of PBS, followed by passage in DMEM (10% FBS, including antibiotics) cell culture medium as follows: The incubator was continued with 5% CO 2 concentrations and 37 ° C. were maintained at all times, DMEM medium was changed every 3 days and passaged at 1: 4 when 80-90% of the cell culture dish surface area was filled. Each time the cells were passaged, the cells were cultured at 1: 4 twice, and the population doubling level was recorded by increasing the number of population doubling level (PDL) by two.
Ⅱ. 폐 섬유아세포(fetal lung fibroblast)의 배양 Ⅱ. Culture of lung lung fibroblast
폐 섬유아세포인 IMR-90 세포는 PDL이 25된 것을 상업적으로 구입하여 사용하였다 (ATCC, #CCL186). 배양은 상기한 피부 섬유아세포와 동일한 방법으로 실시하였다.Pulmonary fibroblasts, IMR-90 cells, were commercially available from PDL 25 (ATCC, # CCL186). The culture was carried out in the same manner as the skin fibroblasts described above.
상기 배양된 세포 중 PDL이 30 이하인 세포를 젊은 세포, PDL이 35-45인 세포를 중간 세포 그리고 PDL이 60 이상인 세포를 노화 세포로서 이용하였다.Among the cultured cells, cells having a PDL of 30 or less were young cells, cells having a PDL of 35-45, intermediate cells, and cells having a PDL of 60 or more were used as senescent cells.
실시예 2: 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색Example 2: Aging Related β-galactosidase Activity Staining
본 발명에서 이용되는 세포의 노화 여부는 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색을 실시하여 확인하였고, 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri GP. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:9363-9367(1995))에 따라 다음과 같이 수행하였다: 우선, 세포를 PBS 10 ㎖로 2번 세척한 후, 2% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS 10 ㎖로 다시 한번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 ㎎/㎖의 X-Gal, 40 mM 시트르산/소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl2) 5 ㎖을 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16 시간 동안 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양 접시를 싸서 배양하였다. 최종적으로, 위상차 현미경 (Olympus사, CK40)으로 발색 정도를 확인하였다.Aging of the cells used in the present invention was confirmed by carrying out aging-related β-galactosidase activity staining, and the staining was performed by Dimri et al. (Dimri GP. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 92: 9363-9367 (1995)): First, cells were washed twice with 10 mL of PBS and then fixed for 3-5 minutes at 2% formaldehyde at room temperature. The immobilized cells were washed once again with 10 ml of PBS, β-galactosidase active staining solution (1 mg / ml X-Gal, 40 mM citrate / sodium phosphate, pH 6.0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 ml of 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl and 2 mM MgCl 2 ) were added and reacted in a 37 ° C. incubator for 12-16 hours. The plate was incubated with silver foil so that light did not enter during the reaction. Finally, the degree of color development was confirmed by a phase contrast microscope (Olympus, CK40).
실시예 3: 웨스턴 블롯을 이용한 Erk-1/2의 활성 조사Example 3: Activity Study of Erk-1 / 2 by Western Blot
사람 섬유아세포 또는 IMR-90의 젊은 세포 (PDL이 30 이하), 중간 세포 (PDL이 35-45) 및 노화 세포 (PDL이 60 이상) 각각에 EGF (Gibco-BRL사, # 13247-051, human, recombinant) 100 ng/㎖를 일정 시간동안 처리하여 자극시켰다.EGF (Gibco-BRL, # 13247-051, human) on human fibroblasts or young cells of IMR-90 (PDL is below 30), intermediate cells (PDL is 35-45) and senescent cells (PDL is above 60) , recombinant) Stimulated by treatment for 100 ng / ㎖ for a period of time.
이어, 각각의 세포 시료를 세포 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF, 2 ㎍/㎖ 아프로티닌, 2 ㎍/㎖ 루펩틴, 50 mM NaF 및 0.2 mM Na3VO4)을 이용하여 용해하고, 짧게 음파 파쇄한 후, 이를 4℃에서 14000×g로 10분 동안 원심분리한 다음, 그 상층액을 취하였다. 이렇게 얻은 세포 추출액을 브래드포드법 (Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976))을 이용하여 단백질 정량한 다음, 동량의 단백질을 취하여 5X SDS 시료 완충액 (60 mM Tris-Cl(pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머르캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)을 첨가하고 5 분간 끓여 변성시켰다.Each cell sample was then subjected to cell lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinin, 2 μg / After dissolving with ml lupetin, 50 mM NaF and 0.2 mM Na 3 VO 4 ), short sonication was followed by centrifugation at 14000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was taken. The cell extracts thus obtained were protein quantified using the Bradford method (Bradford, M., Anal. Biochem . 72: 248-254 (1976)), and then the same amount of protein was taken to obtain 5X SDS sample buffer (60 mM Tris-Cl). (pH6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) was added and boiled for 5 minutes to denature.
변성된 단백질을 포함하는 추출액을 전기영동 키트 (Biorad사)를 이용하여 8% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 전기영동을 하여 분리시키고, 분리된 단백질을 트랜스퍼 키트 (Biorad사)를 이용하여 전기블롯팅 완충용액 (20 mM Tris/150 mM 글리세린)내에서 겔로부터 NC 멤브레인 (Protran사)으로 전이시켰다. 이 블롯을 5% 탈지분유 (Difco사)를 포함하는 TTBS (Tris buffered saline with Tween 20)로 1시간 동안 블롯킹시킨 후 희석된 검출하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체와 1시간 동안 반응시켰다.The extract containing the denatured protein was separated by electrophoresis on 8% polyacrylamide gel using an electrophoresis kit (Biorad), and the separated protein was subjected to electroblotting buffer using a transfer kit (Biorad). Transfer from gel to NC membrane (Protran) in (20 mM Tris / 150 mM glycerin). This blot was blocked with Tri buffered saline with Tween 20 (TTBS) containing 5% skim milk powder (Difco) for 1 hour and then reacted with the primary antibody against the protein to be diluted for 1 hour.
상기 1차 항체로 사용된 항체 가운데, 모노클로날 항 포스포-Erk-1/2 항체, 폴리클로날 항 Erk-1/2 항체 및 폴리클로날 항 EGFR 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.로부터 구입한 것이다.Among the antibodies used as the primary antibody, monoclonal anti phospho-Erk-1 / 2 antibody, polyclonal anti-Erk-1 / 2 antibody and polyclonal anti EGFR antibody were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. It is.
상기 과정에 의해 형성된 면역 복합체의 존재는 호스 래디쉬 페록시다아제가 연결된 항토끼 항체 (Jackson Immunochemicals사)와 페록시다아제의 기질을 포함하는 ECL (enhanced chemiluminiscence) 키트 (Amersham사, #RPN2108)를 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 1a 및 도 1b와 같다.The presence of the immune complex formed by the above procedure was carried out using an ECL (enhanced chemiluminiscence) kit (Amersham, # RPN2108) containing an anti-rabbit antibody (Jackson Immunochemicals) to which horse radish peroxidase was linked and a substrate of peroxidase It was confirmed using, and the results are the same as in Figures 1a and 1b.
첨부한 도 1a에서 확인할 수 있듯이, 젊은 세포 및 중간 세포는 EGF 자극 후 5 분 이내에 Erk-1/2 키나아제가 인산화 (활성화) 되고, 15 분동안 지속됨을 알 수 있고, 노화 세포의 경우에는 Erk-1/2 키나아제의 인산화가 젊은 세포처럼 효과적으로 이루어지지 않는다. 한편, 도 1b는 상기한 노화에 따른 Erk-1/2 키나아제의 인산화 감소가 Erk-1/2 키나아제 또는 EGFR의 발현 감소에 따른 것인지, 아니면 인산화 자체의 감소에 따른 것인지를 나타낸다. 즉, 도 1b에서 확인할 수 있듯이, 세포의 노화가 진행되어도 Erk-1/2 키나아제 및 EGFR의 발현도는 거의 변화가 없다.As can be seen in FIG. 1A, young and intermediate cells are phosphorylated (activated) by Erk-1 / 2 kinase within 5 minutes after EGF stimulation, and persist for 15 minutes. Phosphorylation of 1/2 kinases is not as effective as young cells. On the other hand, Figure 1b shows whether the reduction of phosphorylation of Erk-1 / 2 kinase according to the aging is due to a decrease in expression of Erk-1 / 2 kinase or EGFR or a decrease in phosphorylation itself. That is, as can be seen in Figure 1b, the expression of Erk-1 / 2 kinase and EGFR is almost unchanged even as the aging of the cell progresses.
따라서, 노화 세포에서 전형적으로 나타나는 성장 자극 인자에 대한 반응의 감소는 Erk-1/2 키나아제의 활성화, 즉 인산화의 감소에 따른 것임을 알 수 있다.Thus, it can be seen that the decrease in the response to the growth stimulating factor typically seen in senescent cells is due to the activation of Erk-1 / 2 kinase, ie, reduction of phosphorylation.
실시예 4: 웨스턴 블롯을 이용한 카베올린 발현의 분석Example 4: Analysis of Caberoline Expression Using Western Blot
사람 섬유아세포 또는 IMR-90의 젊은 세포 (PDL이 30 이하), 중간 세포 (PDL이 35-45) 및 노화 세포 (PDL이 60 이상) 각각에 대하여 상기 실시예 3과 동일하게 웨스턴 블롯을 실시하였고, 그 결과는 도 2와 같다.Western blots were performed on human fibroblasts or IMR-90 young cells (PDL below 30), intermediate cells (PDL between 35-45) and senescent cells (PDL above 60) in the same manner as in Example 3. , And the results are shown in FIG.
1차 항체로 사용된 항체 가운데, 단일클론 항카베올린-1 항체, 단일클론 항카베올린-2 항체 및 단일클론 항카베올린-3 항체는 Transduction Laboratories사로부터 구입한 것이다.Among the antibodies used as primary antibodies, monoclonal anticabolinol-1 antibodies, monoclonal anticabolinol-2 antibodies and monoclonal anticabolinol-3 antibodies were purchased from Transduction Laboratories.
첨부 도 2에서 확인할 수 있듯이, 노화가 진행됨에 따라 사람 섬유아세포 또는 IMR-90에서 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3 전부가 그 발현이 증가됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 2, it can be seen that as aging progresses, expression of all of caveolin-1, caveolin-2 and caveolin-3 in human fibroblasts or IMR-90 is increased.
실시예 5: 면역 침전 (Immunoprecipitation)에 의한 EGFR 및 카베올린의 상호 작용의 분석Example 5 Analysis of the Interaction of EGFR and Cabolin by Immunoprecipitation
사람 섬유아세포의 젊은 세포 (PDL이 30 이하) 및 노화 세포 (PDL이 60 이상) 각각의 세포 시료를 IP 용해 완충용액 (10 mM 포스페이트 완충용액, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 ㎍/㎖ 아프로티닌, 2 ㎍/㎖ 루펩틴, 50 mM NaF 및 0.2 mM Na3VO4)로 용출하고, 짧게 음파 파쇄한 후 9000 rpm으로 5 분동안 원심분리하여 그 상층액을 취하였다.Cell samples of each of the young cells of human fibroblasts (PDL below 30) and senescent cells (PDL above 60) were prepared by IP lysis buffer (10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinin, 2 μg / ml lupetin, 50 mM NaF and 0.2 mM Na 3 VO 4 ), brief sonication and centrifugation at 9000 rpm for 5 minutes. The supernatant was taken.
이어, 상층액을 정상 마우스 혈청, 항EGFR 항체 또는 항카베올린-1 항체와 반응시킨 다음 단백질 A-세파로스 비드 (Amersham사)로 면역 복합체를 침전시키고, SDS-PAGE를 실시한 다음, 상기 실시예 4와 동일하게 웨스턴 블롯을 실시하였고, 그 결과는 도 3과 같다. 1차 항체로서는 항EGFR 항체 또는 항카베올린-1 항체를 사용하였다.Subsequently, the supernatant was reacted with normal mouse serum, anti-EGFR antibody or anti-caberoline-1 antibody, followed by precipitation of immune complexes with protein A-Sepharose beads (Amersham), followed by SDS-PAGE. Western blot was performed in the same manner as 4, and the result is shown in FIG. 3. As the primary antibody, an anti-EGFR antibody or an anticaberoline-1 antibody was used.
첨부 도 3에서 확인할 수 있듯이, 사람 섬유아세포의 노화 세포에서 카베올린-1의 발현이 크게 증가되었고, 항EGFR 항체로 면역침전한 시료에서 항카베올린-1 항체에 대한 웨스턴 블롯 밴드가 관찰되어 카베올린-1 단백질이 EGFR과 서로 상호작용함을 알 수 있다.As shown in FIG. 3, the expression of caveolin-1 was significantly increased in senescent cells of human fibroblasts, and Western blot bands for anti-caberoline-1 antibodies were observed in samples immunoprecipitated with anti-EGFR antibodies. It can be seen that the Olin-1 protein interacts with EGFR.
따라서, 노화가 진행됨에 따라 카베올린-1 단백질이 발현이 증가되고, 증가된 카베올린-1은 EGFR과 서로 상호작용하여 EGFR에 의한 Erk-1/2 키나아제의 활성화 작용을 억제함을 알 수 있다.Therefore, as aging progresses, the expression of caveolin-1 protein increases, and the increased caveolin-1 interacts with EGFR to inhibit the activation of Erk-1 / 2 kinase by EGFR. .
실시예 7: 전자 현미경 관찰 (Electron microscopic analysis)Example 7: Electron microscopic analysis
사람 섬유아세포의 젊은 세포 (PDL 20)와 노화 세포 (PDL 65)를 1000 rpm에서 원심분리하여 세포들을 침전시키고, 3% 글루타르알데히드/PBS (pH 7.4)로 고정시킨 다음, 0.2 M 소듐 카코딜레이트 완충용액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 이어, 세포 침전물을 카코딜레이트 완충용액내의 1% 오스뮴 테트록시드로 1 시간동안 처리한 다음, 프로필렌 옥시드를 통한 등급의 에탄올 처리에 의해 탈수시키고, Embed812 (Electron Microscope Sciences사)내에 세포 시료들은 묻었다.Young cells (PDL 20) and senescent cells (PDL 65) of human fibroblasts were centrifuged at 1000 rpm to precipitate cells, fixed with 3% glutaraldehyde / PBS (pH 7.4), and then 0.2 M sodium cacodylate Washed with fresh buffer (pH 7.4). The cell precipitate was then treated with 1% osmium tetroxide in cacodylate buffer for 1 hour, then dehydrated by grade ethanol treatment with propylene oxide, and the cell samples embedded in Embed812 (Electron Microscope Sciences). .
그런 다음, 묻힌 세포 시료를 마이크로톰 (Leichert-JUNG사)를 이용하여 200 ㎚로 절단하고, 절단편들을 메틸렌 블루 및 아주레 Ⅱ를 이용하여 염색시킨 다음, 광학 현미경으로 관찰하여, 전자 현미경에서 관찰할 부위를 선택하였다. 그리고 나서, 선택된 부위를 다시 마이크로톰을 이용하여 60 ㎚ 두께로 초박 (ultrathin) 절단하고, 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 염색한 다음, JEM-1200 EX II 투과 전자 현미경으로 관찰하였다. 도 4는 촬영된 전자 현미경 사진으로서, 노화 세포의 세포막에서 카베올레 구조의 수가 크게 증가됨을 알 수 있다.The embedded cell sample was then cut to 200 nm using a microtome (Leichert-JUNG Co., Ltd.), the sections were stained using methylene blue and azure II, and then observed under an optical microscope and observed under an electron microscope. The site was selected. The selected sites were then ultrathin cut to 60 nm thick using a microtome, stained with uranyl acetate and lead citrate, and observed with a JEM-1200 EX II transmission electron microscope. Figure 4 is an electron micrograph taken, it can be seen that the number of kaveole structure significantly increased in the cell membrane of senescent cells.
실시예 8: 형질 전환용 벡터의 제작Example 8 Preparation of Transformation Vector
사람 섬유아세포의 노화 세포로부터 TRIzol (Gibco-BRL사, # 15596-026)을 이용하여 총 RNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 실시하여, 카베올린-1의 cDNA를 얻었다. 이때 사용한 프라이머의 염시서열은 전방향 프라이머인 경우에는 5' atccaagcttccaccatgtctgggggcaaatacgt 3'이고, 역방향 프라이머인 경우에는 5' gcaggatccctatatttctttctgcaagttgat 3'이었으며, 코자크 (kozak) 서열을 포함하는 코딩 부위가 증폭되도록 제작된 것이다. 역전사 효소는 Promega사의 AMV RTase를 사용하였고, taq 폴리머라아제는 Takara사의 Ex Taq을 사용하였다. PCR은 변성 반응을 92℃에서 30초, 어닐링 반응을 60℃에서 30초간 수행하고, 연장 반응을 72℃에서 50초간 실시하여 총 40 사이클을 수행하였다.Total RNA was isolated from senescent cells of human fibroblasts using TRIzol (Gibco-BRL Co., # 15596-026) and subjected to reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) as a template. CDNA of 1 was obtained. At this time, the salt sequence of the primer used was 5 'atccaagcttccaccatgtctgggggcaaatacgt 3' for the forward primer, and 5 'gcaggatccctatatttctttctgcaagttgat 3' for the reverse primer, and the coding region including the kozak sequence was amplified. Reverse transcriptase was used for Promega's AMV RTase and taq polymerase was used for Takara's Ex Taq. PCR performed a denaturation reaction at 92 ° C. for 30 seconds, annealing reaction at 60 ° C. for 30 seconds, and extended reaction at 72 ° C. for 50 seconds to perform a total of 40 cycles.
이어, 카베올린-1의 cDNA를 확인하기 위하여 cDNA를 사슬 종결 방법 (생거 방법: Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463(1977))으로 시퀀싱하였고, 그 염기서열은 첨부한 서열 1과 같다. 그런 다음, 카베올린-1의 cDNA를 진핵세포 발현벡터인 pcDNA 3 (Invitrogen사; 시토메갈로바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함) 벡터에 PCR 프라이머에 포함되어 있는 Hind Ⅲ, Bam HI 절단 자리를 이용하여 서브 클로닝하였다. 최종적으로 제작된 카베올린-1의 cDNA가 삽입된 pcDNA 3의 제한효소 지도는 도 5와 같다.The cDNA was then sequenced by chain termination method (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 74: 5463 (1977)) to identify the cDNA of Cabolin-1. The base sequence is as shown in SEQ ID NO: 1. Then, the cDNA of caveolin-1 was used for Hind III and Bam HI cleavage sites contained in PCR primers in the eukaryotic expression vector pcDNA 3 (Invitrogen; including cytomegalovirus promoter and polyadenylation signal). Subcloning. Finally, the restriction map of pcDNA 3 into which the cDNA of Cabolin-1 was inserted is shown in FIG. 5.
실시예 9: 사람 섬유아세포의 형질 전환Example 9: Transformation of Human Fibroblasts
상기 실시예 8에서 제작된 벡터를 이용하여 사람 섬유아세포의 젊은 세포 (PDL 25)에 다음과 같이 형질 전환을 실시하였다: 세포를 형질 전환하기 18시간 전에 35 ㎜ 디쉬에 깔고 형질 전환시 약 70-80%의 융합도 (confluency)가 되도록 하였다. 우선 상기 실시예 8에서 제조한 발현벡터 2 ㎍과 플러스 시약 8 ㎕를 혼합한 후, 따로 혼합하여 두었던 리포펙타민 (Gibco-BRL사) 12 ㎕와 DMEM 배지 238 ㎕ 혼합액과 잘 혼합한 다음, 실온에서 15분간 방치하였다. 이어, 다시 DMEM 배지 2 ㎖을 가한 뒤 이를 세포에 처리하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 뒤 20%의 FBS를 포함하는 DMEM 배지 2.5 ㎖을 가하고, 24시간 동안 배양하였다.Using the vector produced in Example 8, the young cells (PDL 25) of human fibroblasts were transformed as follows: 18 hours before transforming the cells, placed in a 35 mm dish and transformed to about 70- 80% confluency was achieved. First, 2 μg of the expression vector prepared in Example 8 and 8 μl of the positive reagent were mixed, followed by mixing well with 12 μl of lipofectamine (Gibco-BRL) and 238 μl of DMEM medium mixed separately, followed by room temperature. It was left for 15 minutes at. Then, 2 ml of DMEM medium was added again, and the cells were treated with the cells and incubated for 3 hours at 37 ° C. After 3 hours, 2.5 ml of DMEM medium containing 20% of FBS was added and incubated for 24 hours.
형질 전환 후 30시간이 경과한 다음, 100 ㎍/㎖의 EGF를 형질 전환된 세포에 일정 시간동안 처리하였다. 이어, 상기 실시예 4와 동일하게 웨스턴 블롯을 실시하여 Erk-1/2의 활성화를 조사하였고, 그 결과는 도 6과 같다.After 30 hours after transformation, 100 μg / ml of EGF was treated with the transformed cells for a certain time. Subsequently, Western blot was performed in the same manner as in Example 4 to investigate the activation of Erk-1 / 2, and the results are shown in FIG. 6.
첨부 도 6에서 A 패널의 1번째 레인은 pcDNA 3만을 형질 전환한 것이고, 2번째 레인은 카베올린-1 cDNA가 삽입된 pcDNA 3로 형질 전환한 것이다. 도면에서 확인할 수 있듯이, 세포가 카베올린-1 cDNA가 삽입된 pcDNA 3로 형질 전환되어 카베올린이 발현되고 있음을 알 수 있다. 첨부 도 6에서 B 패널의 1-3번째 레인은 pcDNA 3로 형질 전환된 세포에 EGF를 각각 0분, 5분 및 20분 동안 처리한 것이고, 4-6레인은 카베올린-1 cDNA가 삽입된 pcDNA 3로 형질 전환된 세포에 EGF를 각각 0분, 5분 및 20분 동안 처리한 것이다.In FIG. 6, the first lane of panel A is transformed with only pcDNA 3, and the second lane is transformed with pcDNA 3 into which caveolin-1 cDNA is inserted. As can be seen from the figure, it can be seen that the cells are transformed with pcDNA 3 into which the caveolin-1 cDNA is inserted, and the caveolin is expressed. In FIG. 6, lanes 1 to 3 of panel B are cells treated with pcDNA 3 transformed with EGF for 0 minutes, 5 minutes, and 20 minutes, respectively. Cells transformed with pcDNA 3 were treated with EGF for 0, 5 and 20 minutes, respectively.
첨부 도 6에서 볼 수 있듯이, 카베올린-1이 과발현되는 세포에서는 Erk-1/2 키나아제의 세포내 발현은 변화가 없지만, 모크 (mock)로 형질 전환된 세포와 비교하여 그 인산화가 크게 억제됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, intracellular expression of Erk-1 / 2 kinase is not changed in cells overexpressing caveolin-1, but its phosphorylation is significantly inhibited compared to cells transformed with mock. Able to know.
따라서, 카베올린-1의 DNA를 세포 내로 형질 전환시키는 경우에는, EGF에 의한 Erk 키나아제의 활성화가 차단되고, 세포의 외부 자극에 대한 반응성이 감소되어 세포가 노화 상태로 유도됨을 알 수 있다. 이는 노화된 세포에서 EGF에 의한 Erk 키나아제의 활성화가 저하되는 것이 카베올린-1 단백질의 발현 증가에 기인함을 나타낸다.Therefore, when transforming the DNA of Caberoline-1 into the cell, it can be seen that the activation of Erk kinase by EGF is blocked, the reactivity to the external stimulation of the cell is reduced, leading to the aging state of the cell. This indicates that decreased activation of Erk kinase by EGF in aged cells is due to increased expression of Cabolin-1 protein.
본 발명은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공하고, 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물 세포의 노화 유도방법을 제공하고, 노화 세포의 확인용 표지로서의 카베올린 단백질을 제공한다. 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 노화에 직접적으로 관련된 단백질을 이용함으로써 노화 세포를 보다 정확히 확인할 수 있고, 본 발명의 노화 유도용 조성물은 생체내 노화 유도 단백질을 직접적으로 이용하므로 효과적으로 세포를 노화 상태로 유도할 수 있고, 이에 노화 관련 연구, 노화 관련 물질의 연구 및 개발 등에 유용하게 이용할 수 있다. The present invention provides a method for detecting senescent cells of a mammal, and provides a composition for inducing aging of mammalian cells. The present invention also provides a method for inducing aging of mammalian cells, and provides a caveolin protein as a label for identifying senescent cells. The method for detecting senescent cells of the present invention can more accurately identify senescent cells by using a protein directly related to aging, and the senescence inducing composition of the present invention uses aging-inducing proteins in vivo directly, thus effectively aging cells. It can be derived from, and can be usefully used for research on aging, research and development of aging-related materials.
도 1a는 Erk 키나아제의 활성 조사를 위한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진,Figure 1a is a photograph showing the results of Western blotting for the investigation of the activity of Erk kinase,
도 1b는 EGFR 및 Erk 키나아제의 발현 정도를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진,Figure 1b is a photograph showing the results of Western blotting to confirm the expression level of EGFR and Erk kinase,
도 2는 카베올린의 발현 정도를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진,2 is a photograph showing the result of Western blotting to confirm the expression level of the caveolin,
도 3은 EGFR 및 카베올린의 상호작용을 확인하기 위한 면역 침전의 결과를 나타내는 사진, 3 is a photograph showing the results of immunoprecipitation to confirm the interaction of EGFR and caveolin,
도 4는 카베올레 구조를 확인하기 위한 전자현미경 사진, 4 is an electron micrograph for confirming the Cabeole structure,
도 5는 카베올린-1의 cDNA가 삽입된 pcDNA 3의 제한효소 지도,5 is a restriction map of pcDNA 3 into which the cDNA of carveolin-1 is inserted,
도 6은 형질 전환된 세포에서의 카베올린의 발현 및 Erk 키나아제의 활성화를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진.FIG. 6 is a photograph showing the results of western blotting to confirm expression of carveolin and activation of Erk kinase in transformed cells. FIG.
<110> Metabolic Engineering Laboratories Co., LTD. <120> A Method for Detecting Senescent Cells, a Composition for Inducin g a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescen t State of Cells Using Caveolin <130> 00-0002 <160> 1 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (26)..(559) <400> 1 agttttcatc cagccacggg ccagc atg tct ggg ggc aaa tac gta gac 49 Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp 1 5 tcg gag gga cat ctc tac acc gtt ccc atc cgg gaa cag ggc aac atc 97 Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile 10 15 20 tac aag ccc aac aac aag gcc atg gca gac gag ctg agc gag aag caa 145 Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln 25 30 35 40 gtg tac gac gcg cac acc aag gag atc gac ctg gtc aac cgc gac cct 193 Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro 45 50 55 aaa cac ctc aac gat gac gtg gtc aag att gac ttt gaa gat gtg att 241 Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile 60 65 70 gca gaa cca gaa ggg aca cac agt ttt cac ggc att tgg aag gcc agc 289 Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser Phe His Gly Ile Trp Lys Ala Ser 75 80 85 ttc acc acc ttc act gtg acg aaa tac tgg ttt tac cgc ttg ctg tct 337 Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser 90 95 100 gcc ctc ttt ggc atc ccg atg gca ctc atc tgg ggc att tac ttc gcc 385 Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala 105 110 115 120 att ctc tct ttc ctg cac atc tgg gca gtt gta cca tgc att aag agc 433 Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser 125 130 135 ttc ctg att gag att cag tgc acc agc cgt gtc tat tcc atc tac gtc 481 Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Thr Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val 140 145 150 cac acc gtc tgt gac cca ctc ttt gaa gct gtt ggg aaa ata ttc agc 529 His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser 155 160 165 aat gtc cgc atc aac ttg cag aaa gaa ata t aaatgacatt tcaaggatag 580 Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys Glu Ile 170 175 aagtatacct gatttttttt ccttttaatt ttcctggtgc caatttcaag ttccaagttg 640 ctaatacagc aacgaattta tgaattgaat tatcttggtt gaaaataaaa agatcacttt 700 ctcagttttc ataagtatta tgtctcttct gagctatttc atctattttt ggcagtctga 760 atttttaaaa cccatttata tttctttcct taccttttta tttgcatgtg gatcaaccat 820 cgctttatt 829 <210> 2 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met 20 25 30 Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu 35 40 45 Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val 50 55 60 Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser 65 70 75 80 Phe His Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 85 90 95 Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala 100 105 110 Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp 115 120 125 Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Thr 130 135 140 Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe 145 150 155 160 Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys 165 170 175 Glu Ile<110> Metabolic Engineering Laboratories Co., LTD. <120> A Method for Detecting Senescent Cells, a Composition for Inducin g a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescen t State of Cells Using Caveolin <130> 00-0002 <160> 1 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (26) .. (559) <400> 1 agttttcatc cagccacggg ccagc atg tct ggg ggc aaa tac gta gac 49 Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp 1 5 tcg gag gga cat ctc tac acc gtt ccc atc cgg gaa cag ggc aac atc 97 Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile 10 15 20 tac aag ccc aac aac aag gcc atg gca gac gag ctg agc gag aag caa 145 Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln 25 30 35 40 gtg tac gac gcg cac acc aag gag atc gac ctg gtc aac cgc gac cct 193 Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro 45 50 55 aaa cac ctc aac gat gac gtg gtc aag att gac ttt gaa gat gtg att 241 Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile 60 65 70 gca gaa cca gaa ggg aca cac agt ttt cac ggc att tgg aag gcc agc 289 Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser Phe His Gly Ile Trp Lys Ala Ser 75 80 85 ttc acc acc ttc act gtg acg aaa tac tgg ttt tac cgc ttg ctg tct 337 Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser 90 95 100 gcc ctc ttt ggc atc ccg atg gca ctc atc tgg ggc att tac ttc gcc 385 Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala 105 110 115 120 att ctc tct ttc ctg cac atc tgg gca gtt gta cca tgc att aag agc 433 Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser 125 130 135 ttc ctg att gag att cag tgc acc agc cgt gtc tat tcc atc tac gtc 481 Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Thr Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val 140 145 150 cac acc gtc tgt gac cca ctc ttt gaa gct gtt ggg aaa ata ttc agc 529 His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser 155 160 165 aat gtc cgc atc aac ttg cag aaa gaa ata t aaatgacatt tcaaggatag 580 Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys Glu Ile 170 175 aagtatacct gatttttttt ccttttaatt ttcctggtgc caatttcaag ttccaagttg 640 ctaatacagc aacgaattta tgaattgaat tatcttggtt gaaaataaaa agatcacttt 700 ctcagttttc ataagtatta tgtctcttct gagctatttc atctattttt ggcagtctga 760 atttttaaaa cccatttata tttctttcct taccttttta tttgcatgtg gatcaaccat 820 cgctttatt 829 <210> 2 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met 20 25 30 Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu 35 40 45 Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val 50 55 60 Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser 65 70 75 80 Phe His Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 85 90 95 Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala 100 105 110 Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp 115 120 125 Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Thr 130 135 140 Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe 145 150 155 160 Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys 165 170 175 Glu ile
Claims (11)
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0053342A KR100489188B1 (en) | 2000-09-08 | 2000-09-08 | A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin |
| AU2001269575A AU2001269575A1 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Nucleic acid sequences and proteins involved in cellular senescence |
| EP01948093A EP1315970B1 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Nucleic acid sequence and protein involved in cellular senescence |
| PCT/KR2001/001159 WO2002021140A1 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Nucleic acid sequences and proteins involved in cellular senescence |
| AT01948093T ATE461453T1 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | NUCLEIC ACID SEQUENCE AND PROTEIN PLAYING A ROLE IN CELLULAR AGING |
| DE60141588T DE60141588D1 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | NUCLEIC ACID SEQUENCE AND PROTEIN THAT PLAYS A ROLE IN CELLULAR AGING |
| US10/363,924 US7001769B2 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Nucleic acid sequences and proteins involved in cellular senescence |
| JP2002524708A JP3771218B2 (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Cell senescence-related nucleic acid sequences and proteins |
| CN01815293A CN1460181A (en) | 2000-09-08 | 2001-07-06 | Nucleic acid sequences and protein involved in cellular senescence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0053342A KR100489188B1 (en) | 2000-09-08 | 2000-09-08 | A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020020296A KR20020020296A (en) | 2002-03-15 |
| KR100489188B1 true KR100489188B1 (en) | 2005-05-17 |
Family
ID=19688134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0053342A KR100489188B1 (en) | 2000-09-08 | 2000-09-08 | A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100489188B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102306096B1 (en) * | 2020-03-03 | 2021-09-29 | 이화여자대학교 산학협력단 | Composition for diagnosing aging inflammation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996013610A2 (en) * | 1994-10-31 | 1996-05-09 | Geron Corporation | Methods and reagents for the identification and regulation of senescence-related genes |
| WO1999022773A2 (en) * | 1997-11-05 | 1999-05-14 | Baylor College Of Medicine | Sequences for targeting metastatic cells |
| WO1999052929A1 (en) * | 1998-04-15 | 1999-10-21 | Lifespan Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequences and proteins associated with aging |
| WO2002021140A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Metabolic Engineering Laboratories Co., Ltd. | Nucleic acid sequences and proteins involved in cellular senescence |
-
2000
- 2000-09-08 KR KR10-2000-0053342A patent/KR100489188B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996013610A2 (en) * | 1994-10-31 | 1996-05-09 | Geron Corporation | Methods and reagents for the identification and regulation of senescence-related genes |
| WO1999022773A2 (en) * | 1997-11-05 | 1999-05-14 | Baylor College Of Medicine | Sequences for targeting metastatic cells |
| WO1999052929A1 (en) * | 1998-04-15 | 1999-10-21 | Lifespan Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequences and proteins associated with aging |
| WO2002021140A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Metabolic Engineering Laboratories Co., Ltd. | Nucleic acid sequences and proteins involved in cellular senescence |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20717-25 * |
| J. Neurosci. 17(24) : 9520-9535 (1997. 12. 15) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20020020296A (en) | 2002-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kwon et al. | Cloning of the cDNa for a Na+/myo-inositol cotransporter, a hypertonicity stress protein. | |
| JP3039802B2 (en) | Receptor for fibroblast growth factor | |
| Winslow et al. | Cloning of AL-1, a ligand for an Eph-related tyrosine kinase receptor involved in axon bundle formation | |
| Hansen et al. | Transcription properties of a cell type–specific TATA-binding protein, TRF | |
| Heisterkamp et al. | Identification of a human gamma-glutamyl cleaving enzyme related to, but distinct from, gamma-glutamyl transpeptidase. | |
| Okazaki et al. | Immunological and structural conservation of mammalian skeletal muscle glycosylphosphatidylinositol-linked ADP-ribosyltransferases | |
| Hasler et al. | cDNA cloning, structural features, and eucaryotic expression of human TAG‐1/axonin‐1 | |
| SCHWARTZ et al. | Molecular cloning and expression of a chloride channel-associated protein pICln in human young red blood cells: association with actin | |
| Benjamin | The hr-t gene of polyoma virus | |
| Verjans et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of a dog thyroid cDNA encoding a novel inositol 1, 4, 5-trisphosphate 5-phosphatase | |
| JP5773872B2 (en) | Compositions and methods | |
| AU736316B2 (en) | Mitogen-activated protein kinase p38-2 and methods of use therefor | |
| US20030036174A1 (en) | Hair follicle growth factor proteins | |
| US5972674A (en) | Stimulus-inducible protein kinase complex and methods of use therefor | |
| US7202049B2 (en) | Mitogen-activated protein kinase p38-2 and methods of use therefor | |
| JP2004508031A (en) | Cell aging related nucleic acid sequences and proteins | |
| MACEWAN et al. | Agonist regulation of adenylate cyclase activity in neuroblastoma× glioma hybrid NG108-15 cells transfected to co-express adenylate cyclase type II and the β 2-adrenoceptor. Evidence that adenylate cyclase is the limiting component for receptor-mediated stimulation of adenylate cyclase activity | |
| KATO et al. | Cloning and expression of a cDNA encoding a new neurocalcin isoform (neurocalcin α) from bovine brain | |
| CZ292538B6 (en) | Polypeptide capable of interacting with the GAP protein SH3 domain, antibody directed against the polypeptide, nucleotide sequence encoding such polypeptide, pharmaceutical composition containing the polypeptide and use of the above antibody, polypeptide and the nucleotide | |
| KR100489188B1 (en) | A Method for Detecting Senescent Cells, a Compostion for Inducing a Senescent State of Cells and a Method for Inducing a Senescent State of Cells Using Caveolin | |
| Tosh et al. | Plasmodium falciparum: stage-related expression of topoisomerase I | |
| KNOTT et al. | The peroxisomal targeting sequence type 1 receptor, Pex5p, and the peroxisomal import efficiency of alanine: glyoxylate aminotransferase | |
| Cook et al. | Immunocytochemical localization of ubiquitin-activating enzyme in the cell nucleus | |
| Zeindl‐Eberhart et al. | Further Characterization of a Rat Hepatoma‐Derived Aldose‐Reductase‐Like Protein: Organ Distribution and Modulation In Vitro | |
| Gacon et al. | Identification of a 58,000 daltons phosphoprotein with tyrosine protein kinase activity in a murine lymphoma cell line |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20120430 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130503 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |