KR100482651B1 - 조직공학용 천연／합성 하이브리드 담체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조직공학용 천연/합성 생분해성 하이브리드 담체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소장점막하조직 또는 골분과 같은 생체조직을 재료로 사용하여 기존의 생분해성 고분자 담체보다 월등한 적심성을 가짐으로써 세포의 파종에 매우 유리한 조건을 가질 뿐만 아니라 소장점막하조직 또는 골분에 포함되어 있는 성장인자나 사이토카인류와 같은 생리활성물질의 서방화로 인해 조직재생을 촉진시킴으로써 생분해성 고분자 담체와 천연재료의 장점을 모두 가지며, 경제적인 조직공학용 천연/합성 생분해성 하이브리드 담체, 이의 제조방법 및 이 담체를 이용한 인공장기에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조직공학용 천연/합성 생분해성 하이브리드 담체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소장점막하조직 또는 골분과 같은 생체조직을 재료로 사용하여 기존의 생분해성 고분자 담체보다 월등한 적심성을 가짐으로써 세포의 파종에 매우 유리한 조건을 가질 뿐만 아니라 소장점막하조직 또는 골분에 포함되어 있는 성장인자나 사이토카인류와 같은 생리활성물질의 서방화로 인해 조직재생을 촉진시킴으로써 생분해성 고분자 담체와 천연재료의 장점을 모두 가지며, 경제적인 조직공학용 천연/합성 생분해성 하이브리드 담체, 이의 제조방법 및 이 담체를 이용한 인공장기에 관한 것이다.
현대에 와서 섬세하고 정교하며 높은 수준에 이른 의료공학 기술이 급속한 성장을 보이고 있음에도 불구하고 인체장기나 조직이 손상되는 질병은 각종사고, 보건의료수준의 고도화에 동반하여 자연적인 수명의 고령화와 함께 치료에 막대한 경비가 소요되며, 비교적 높은 빈도수로, 그리고 심각한 문제로 사회 전반적으로 걸쳐 대두되고 있다. 인체 중의 일부 장기 또는 신체의 일부분이 질병이나 사고에 의해서 손상을 입었을 경우에는 인공장기를 이용하여 환자들의 질병을 치료하고 있다. 1890년경 레인이 뼈의 골절에 대한 고정으로 금속제 나사와 뼈 고정용판 등이 사용된 이래로 약 100여 년이 지난 이들 인공장기의 개발역사를 살펴보면 다음과 같이 크게 4세대로 나뉠 수 있다.
제1세대는 1940년도 이전의 아주 초창기 이식으로서 원시적인 금속, 요업재료를 인체에 일부를 지지 또는 보철하는 것을 일컫는다. 이러한 연구 또는 시술 등은 의학, 화학, 재료학 등의 학문간의 큰 구별 없이 실용성이나 효과보다는 초보적인 호기심에서 시작하였다.
제2세대는 일반 연구자들이 고안한 일반화학재료를 의사들이 고장나고 손상된 장기의 일부분을 대체하는 것으로부터 시작되는데, 인체와 접촉하는 조직 등과의 이상현상 즉, 생체적합성이라는 정확한 정의 없이 우연적으로 그리고 돌발적으로 적용되었던 시기였다. 그 대표적인 예로는 챤리경이 폴리메틸메타아크릴레이트 뼈시멘트를 인공고관절로 이용, 부어리스가 한국전쟁시 나일론과 폴리아크릴로니트릴계 공중합체를 인공혈관으로 이용, 디에틸헥실프탈레이트로 가소화한 폴리염화비닐을 혈액백으로 이용, 베트남 전쟁시 폴리비닐피롤리돈을 인공혈액으로 이용한 예 등이다. 이러한 예들은 본격적으로 수술이 시행된 1950년 후반부터 수많은 사례들이 임상적으로 성공을 보임으로써 현재에도 많이 사용되고 있다.
제3세대는 상기한 제1세대 및 제2세대에서 강조되었던 생체와의 어떤 작용이 없는 "비활성" 상태보다는 인체와 "생체활성" 상태 즉, 아주 정교하게 디자인되고 응용된 고분자, 요업, 금속재료가 주위의 조직세포를 자극하여 이식이 더 빨리, 효과적으로 되게 하는 생체재료의 개발세대이다. 대표적인 것으로는 수산화아파타이트가 도포된 인공고관절, 알긴 및 콜라겐이 도포된 인공혈관 등을 예로 들 수 있다.
제4세대는 조직공학을 응용한 즉, 인체에서 추출된 조직세포와 합성재료가 동시에 사용되는 혼합형 인공장기의 개발이다. 이들은 인체의 장기를 재시술과 완전 교체하여 생체조직을 시술하기보다는 손상된 조직의 개선과 회복하는 데에 초점이 맞춰지고 있다. 이러한 제4세대의 조직공학이 가미된 인공장기 개발의 근본적인 원인은 일반 범용합성 고분자가 갖고 있는 근본적인 한계 즉, 생체적합성 및 어느 특정 부분의 손상된 장기나 조직의 생체기능성이 결국에는 결여되어 있기 때문이다. 이에 따라서 장기의 특정기능을 담당하는 세포 또는 단백질 등을 분해 또는 비분해성 고분자 재료에 결합, 고정화 및 배양하여 원하는 조직 또는 장기의 성능을 좀 더 고급화 및 기능화 하여 생체요소를 흉내내는 하이브리드를 추구하고 있다.
이러한 조직공학적 연구의 대표적인 예로서 인공연골을 예로 하여 개략적으로 설명하면 다음과 같다. 우선 인체내의 특정한 장기모양을 석고 등으로 조각한 후 동판과 실리콘을 이용하여 장기형 몰드 (mold)를 제조한다. 이 장기형태의 몰드에 연골세포가 지지하고 성장해야할 담체를 제조해야 되는데, 이러한 담체로서는 통상 미세다공성·생분해성 고분자가 사용된다. 최근 합성고분자로서의 생분해성 고분자는 락타이드와 글리콜라이드의 에스터류 단일중합체 및 이들의 공중합체가 사용되는데, 이들의 생분해기구는 가수분해작용인 것으로 기인된다.
폴리락타이드(PLA)는 부러진 뼈를 고정하는 뼈고정용판과 나사를 제조하는데 쓰이고 있고, 폴리글리콜라이드(PGA)는 흡수성 봉합사로 널리 쓰이고 있다. 이들 단일중합체의 생분해기간은 분자량에 따라 다소 차이가 있지만 통상 1년 이상인데 반하여, 이들의 공중합체인 락타이드-글리콜라이드 공중합체(PLGA)는 분자량에 따라서 수주∼수십주에 걸쳐 생분해가 일어난다. PLGA 생분해성 고분자를 이용하여 미세다공성ㆍ생분해성 담체 (예를 들면 스폰지와 같은 구조임)로 제조하기 위한 방법으로서는 PLGA를 용해하고 있는 용액에 일정한 크기의 단결정 소금과 혼합하여 건조한 후 소금을 물에 용해시켜내는 염추출법, 이산화탄소를 이용하여 PLGA를 팽창시키는 법, PGA 섬유를 부직포로 만들어 PGA 메쉬로 제조하는 법, PLGA 용액에 함유하고 있는 용매를 증발시키는 방법, PLGA 용액에 함유하고 있는 용매를 비용매속에 담구어 상분리시키는 상분리법 등이 적용되고 있다. 그런 다음, 토끼의 귀에서 분리되어 대량배양된 연골세포를 일련의 작업을 통하여 채취하고 이를 귀 및 코모양의 생분해성 담체에 파종한다. 그리고, 이를 실험용 동물에 이식하면 생분해성 고분자는 동물체내에 자연히 흡수되고 최종적으로 연골만이 남게되어 손실된 장기의 역할을 대신하게 된다. 이때, 분리되고 파종되는 조직세포로서 간세포, 소장세포, 요로세포, 혈관내피세포, 골수세포, 신경세포 등이 적용됨에 따라서 인공간(肝), 인공장, 인공요로, 인공혈관, 인공골수, 인공신경 및 여타 장기에 응용될 수 있다.
한편, 본 발명자들에 의하여 타 단점을 해결하는 고분자 용액과 물로 이루어진 유화동결건조방법에 의한 다공성·생분해성 인공장기 및 이의 제조방법이 제안된 바 있다[대한민국 특허 제 201,874호]. 그러나, 대한민국특허 제 201,874호에 따른 제조방법의 경우, 사용된 합성 생분해성 고분자의 표면 성질이 소수성이어서 생분해성 고분자 담체에 배양액과 세포들이 스며들지 않고 성장이 되지 않는 단점이 있었다. 또한, 상기한 생분해성 고분자 담체에 여러 가지 성장인자들의 사이토카인류를 함유시키게 되면 혈관형성, 신경세포형성 등의 제반 성질이 현저히 상승되는 효과는 얻을 수 있었으나 생리활성물질들이 변성하고 제조과정 중에 물 및 여타 용매가 미리 흘러나와 본연의 기능이 없어지는 등의 단점이 있었다. 더우기 성장인자나 사이토카인류의 가격이 매우 고가이기 때문에 이를 이용하게 될 경우 많은 경제적인 부담을 가져야 한다.
또한, 조직공학용 합성고분자 담체의 경우, 세포 파종시 가장 문제가 되는 것 중에 하나인 합성고분자 대부분의 표면 성질이 소수성 표면을 가지고 있기 때문에 세포현탁액이 담체 내로 스며들어가는 것을 방해하는 요인으로 작용한다. 이는 세포가 담체 내에 고루 분산되어 점착 및 성장이 이루어지기 어렵다는 것이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 에탄올에 합성고분자 담체를 미리 적신 후에 물로 치환하는 방법[A. G. Mikos, M. D. Lyman, L. E. Freed, and R. Langer, Biomaterials, 15, 55 (1994)]과 담체를 NaOH 용액으로 처리하여 표면개질하는 방법[J. Gao, L. Niklason, and R. Langer, J. Biomed. Mater. Res., 42, 417 (1998)], 염소산 혼합용액으로 처리하는 방법[S. J. Lee, G. Khang, Y. M. Lee, and H. B. Lee, J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 13, 197 (2002)] 등 많은 물리화학적 표면개질 방법 등이 사용되어졌으나, 이는 담체의 물성을 저하시키거나 잔존 용매의 독성이 문제점으로 지적되고 있다. 이러한 문제점 때문에 천연재료인 콜라겐이나 키토산, 키틴과 같은 재료들이 사용이 되고 있으나, 이 역시 분리하는 공정이 복잡할 뿐 아니라 합성고분자에 비해 가공성이 매우 떨어지고 물성이 약하다는 등의 문제점을 가지고 있다.
한편, 본 발명자들에 특허 출원된 바 있는 제 2000-13700호의 인공장기의 경우에는 생리활성물질과 함께 다공성·생분해성 고분자를 유화동결건조방법으로 제조된 것이나, 이러한 생리활성물질을 직접 사용함으로써 이의 가격이 매우 높고 용매에 대한 안정성이 매우 낮아 효율이 많이 떨어지며 그 기능에 대한 정확한 메커니즘이 증명되어 있지 못하고, 매우 적은 양이 함유되어 있기 때문에 합성고분자 자체의 문제점 역시 해결되지 못하고 있어 안정성이 높고 경제적이며 가공성이 우수한 다공성ㆍ생분해성 인공장기의 제조가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 대부분의 고분자 재료가 소수성을 가져 문제가 되었던 것을 해결하며, 세포의 성장, 분화 및 이동에 유리한 작용을 하는 재료를 개발하고자 하였다. 포유류의 소장점막하조직이나 골분은 대부분이 콜라겐으로 이루어져 있을 뿐만 아니라 생리활성물질을 과량 함유하고 있어 조직재생에 용이하기 때문에 이를 생분해성 고분자와 복합화하여 조직공학용 다공성ㆍ생분해성 담체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 포유류의 소장점막하조직 또는 골분을 생분해성 고분자와 복합화하여 제작된 다공성ㆍ생분해성 담체 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 상기 다공성ㆍ생분해성 담체를 이용하여 제조한 인공장기를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 포유류의 소장점막하조직 또는 골분을 생분해성 고분자와 복합화하여 제작된 다공성ㆍ생분해성 담체 및 이의 제조방법을 그 특징으로 한다.
또한, 상기 다공성ㆍ생분해성 담체를 이용하여 제조한 인공장기를 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 기존에 조직공학용 담체로서 사용되어 온 생분해성 합성고분자 담체를 대신하여 생분해성 고분자에 소장점막하조직 또는 골분과 같은 천연재료를 복합화함으로써 월등한 적심성을 가져 세포의 파종에 매우 유리한 조건을 가질 뿐만 아니라 천연재료의 대부분이 콜라겐 등의 단백질로 이루어져 세포의 점착이나 성장이 보다 우수하며, 소장점막하조직 또는 골분에 포함되어 있는 성장인자나 사이토카인류과 같은 생리활성물질의 서방화로 인해 조직재생이 보다 우수해지는 등의 개선된 효과를 가지게 되는 소장점막하조직 또는 골분을 생분해 고분자에 복합화한 다공성ㆍ생분해성 담체, 이의 제조방법 및 이 담체를 이용한 인공장기에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 소장점막하조직은 주성분이 콜라겐이며, 이외에도 전환성장인자(transforming growth factor, TGF), 인슐린성성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 섬유아세모성장인자(acidic and basic fibroblast growth factor, aFGF and bFGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF) 등의 성장인자들과 글리코사아미노글리칸(하이론산, 콘드로틴 설페이트, 헤파린 등), 파이브로넥틴 등을 함유하고 있다. 이러한 소장점막하조직은 수분을 90% 이상 흡수할 수 있으며, 세포가 거의 존재하지 않는 조직이므로 면역반응이 매우 적으며 생분해성을 가지고 있어서 이를 이용한 여러 가지 형태의 재료들은 우수한 생체재료로서 충분한 가치를 가지고 있다고 할 수 있다.
또한, 본 발명에 사용된 포유류의 뼈의 성분은 30 ∼ 35%의 유기성분과 65 ∼ 70%의 무기성분으로 이루어져 유기성분으로는 섬유형태의 단백질과 콜라겐 I형이 대부분이고 골형성단백질(bone morphogenic protein, BMP)이 포함되었으며, 무기성분은 칼슘 포스페이트를 주로 하여 구성되어져 있다. 본 발명에서 사용된 골분은 뼈의 성분 중 무기성분이 제거된 상태에서 사용되어 졌다.
조직공학적으로 사용되는 생분해성 합성고분자에는 폴리글리콜릭산(polyglycolide, PGA)와 폴리락트산(polylactide, PLA), 락트산-글리콜릭산 공중합체(poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리카프로락톤(poly(ε-caprolactone), PCL), 등이 사용되어 지며 이러한 합성고분자의 장점은 가공성이 우수하고 생분해기간을 조절할 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 합성고분자는 세포와의 친화력이 떨어지는 단점으로 여러 가지 개질방법이 선행되어지고 있다.
천연고분자로 사용되는 재료에는 콜라겐 (I, II, III, IV 형)과 피브린, 키토산, 키틴 등과 같은 것이 있으며 이는 천연재료이기 때문에 비교적 세포와의 친화력이 우수하다. 하지만, 조직에서 분리 공정이 매우 복잡하고 가공성이 떨어지며 물성이 약해서 많은 힘을 요구하는 장기로의 응용에는 문제점이 있다는 단점이 있다.
본 발명에서 제시된 천연/합성 하이브리드 담체는 이러한 합성고분자와 천연재료의 단점을 보강하여 장점을 극대화하도록 개발되어졌다. 일련의 복잡한 분리 공정이 없으며 생분해성 고분자와 복합화 되어 세포 친화력이 향상되었으며 가공성도 우수하고 우수한 생리활성물질을 포함하고 있고 가격이 매우 저렴하다.
포유류의 골분 또는 소장점막하조직을 분리한 후 이를 기계적으로 분쇄하여 함유되어 있는 생리활성물질이 녹아있는 용액으로 제조하고 분리된 추출물을 이용하여 섬유아세포를 배양한 결과, 골분 및 소장점막하조직의 성분 중에 세포의 점착과 성장에 주요한 영향을 끼치는 인자가 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 소장점막하조직 또는 골분을 사용함으로써 기존의 생리활성물질만을 직접 사용했을 때에 발생하는 안정성, 포접율, 매우 높은 비용 등의 문제점을 해결할 수 있어 조직공학적 인공연골이나 뼈, 이외에도 여러 가지 장기(신경유도관, 혈관, 간, 심장, 요도관 등 여타 장기)로 응용될 수 있는 우수한 생분해성 담체로 사용된다. 따라서, 본 발명은 포유류의 소장점막하조직 또는 골분을 생분해성 고분자와 복합화하여 이를 조직의 재생을 위한 대체물로 이용하는 것이다.
본 발명에서 사용하는 생분해성 고분자는 인체에 무해하고 원하는 일정기간 내에 생분해 될 수 있는 특성을 가져야한다. 상기와 같은 특성을 지닌 생분해성 고분자로는 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리히드록시뷰티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 및 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyano acrylate) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 사용한다. 이들 생분해성 고분자는 가수분해 및 인체내의 여러 효소에 의해 인체 내에서 일정기간이 경과하면 자연 생분해하는 것으로 밝혀져 있다[R. Langer and J. P. Vacanti, Science, 260, 920 (1993)].
일반적으로 다공성ㆍ생분해성 담체의 제조방법으로는 염추출법, 가스팽창법, 용매증발법, 상분리법 및 유화동결 건조법 등이 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 골분 또는 소장점막하조직의 생체재료로서의 우수한 성질을 극대화시키기 위해서 염추출법을 응용하여 제조하였다.
본 발명에 따른 인공장기의 제조과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
고분자 용액과 균일하게 혼합되는 것이 중요하기 때문에 골분 또는 소장점막하조직을 건조시킨 후 동결분쇄기로 미세분말화하였다. 미세분말화된 골분 또는 소장점막하조직 분말을 고분자 용액(메틸렌 클로라이드 (용매)로 1.5 ∼ 30 w/v%) 중의 고분자와 1 : 0.1 내지 1 : 1.6의 중량비로 혼합하였으며 염과 다시 1 : 4 내지 1 : 16의 중량비로 혼합하여 담체를 제조하였다. 이때, 염의 크기와 양에 의해서 담체의 다공크기와 다공도가 결정되기 때문에 염의 크기는 직경 180 ∼ 600 ㎛가 바람직하다. 또한, 상기 골분 또는 소장점막하조직 분말과 고분자 용액의 혼합비율이 1 : 0.1 미만이면 골분 및 소장점막하조직의 장점을 살릴 수 없는 문제점이 있으며, 1 : 1.6 초과하면 담체의 물성 저하 문제가 있으며, 상기 혼합용액과 염과의 혼합비가 1 : 4 미만일 경우에는 다공도가 40% 미만으로 떨어져 세포의 내부 침투가 어렵고, 1 : 16을 초과하면 담체의 물성히 급격히 떨어져 바람직하지 못하다. 한편, 제조하고자 하는 인공장기의 종류에 따라 다공의 크기, 다공 크기분포도, 다공도 등은 다양하게 변화시킬 수 있으며, 이는 사용된 생분해성 고분자 유기용매 및 염의 함량 등을 조절함으로써 가능하다.
본 발명에 따른 담체는 일정크기분포의 다공도를 가지고 있는 스폰지 형태의 생분해성 고분자로 이루어진 것으로 인체 내에 이식되어 배양액과 세포들이 생분해성 담체로 쉽게 스며들어 조직세포의 성장 및 회복이 가능하고, 또한 인공장기는 일정기간이 경과하면 가수분해에 의해 서서히 생분해되면서 인체에 흡수되어 이에 축적될 우려가 전혀 없으며, 인공장기 중에 포함된 생리활성물질들이 변성된다거나 또는 제조과정 중에 물 및 여타 용매가 흘러나올 염려가 전혀 없으며, 소장점막하조직의 생리활성물질은 서방화되어 세포성장속도가 일정하게 유지되는 우수성을 가지고 있다.
또한 상기와 같은 담체를 이용하여 제조된 인공장기는 인공혈관, 인공요도관, 인공소장, 인공기관지, 인공간, 인공신장, 인공연골, 인공뼈 및 인공신경 등 조직세포의 성장 및 회복이 가능한 신체장기라면 모두 적용된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
돼지의 소장점막하조직을 분리하여 식염수로 세척한 후 수분을 제거하기 위해 -55 ℃에서 30 mTorr 조건에서 2 일간 동결건조하였다. 다공성의 조직공학용 담체를 제조하기 위해서 건조된 소장점막하조직을 동결분쇄기[6700-115, Metuchem N.J., USA]를 사용하여 동결된 상태에서 분쇄시켜 미세분말화하였다. 미세분말화된 소장점막하조직과 생분해성 고분자인 PLGA[75:25 mole ratio, Mw; 110,000, Beringer Ingelheim, Germany] 용액 중 고분자와 1 : 1.0의 중량비로 혼합하고 상기 혼합용액에 염을 1 : 10의 중량비로 혼합한 후에 디스크 형태(직경 10 mm, 두께 3 mm)의 실리콘 몰드에 넣고 용매를 증발시켰다. 용매가 완전히 제거된 후, 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에 담가서 48시간 동안 녹였으며, 이온크로마토그래피를 이용하여 잔류염이 없음을 확인하였다. 제조된 다공성 담체를 동결건조한 후 진공오븐에서 보관하였다.
제조된 다공성 담체를 주사전자현미경으로 촬영하여 다공의 형태를 관찰하였다[도 1]. 다공의 크기는 균일하게 형성되었으며, 염의 크기와 양으로 다공의 크기와 다공도를 조절할 수 있었다. 또한, 이의 다공 크기의 분포와 비다공 면적, 평균 다공 직경, 다공도를 측정하기 위해 수은다공도계[Model AutoPore II 9220, Micromeritics Co., USA]를 이용하여 측정하였다. 특히, 합성고분자와 염의 중량비가 1 : 8 이상인 경우에서 다공도 90% 이상의 담체를 제조할 수 있었다.
실시예 2
기존의 생분해성 고분자 담체와 소장점막하조직이 복합화된 담체의 적심성을 평가하기 위하여 파란색 염색액을 떨어뜨려 적심 정도를 관찰하였다. 이는 세포 파종시 담체가 배양액에 젖지 않으면 세포의 내부까지의 침투가 이루어지지 않으므로 조직을 재생하는데 용이하지 않다. 소장점막하조직이 함유된 PLGA 담체와 비교하기 위해서 PLGA 자체로만 된 담체를 제조하여 비교하였다. 이때 제조방법은 염추출법을 이용하였고, 전체 매트릭스와 염의 중량비가 1 : 10이고 다공도는 90% 이상이었다. 도 3에서 보는 것과 같이 생분해성 고분자 담체는 염색액이 스며들지 못하고 표면에 맺혀있는 것을 관찰할 수 있으나, 소장점막하조직이 복합화된 담체의 경우에는 바로 스며들어 조직공학용 담체로서의 우수한 표면성질을 가지고 있음을 확인하였다. 도 4는 담체의 수분흡수율을 나타내었다. 20 ㎖의 증류수를 비이커에 넣고 소장점막하조직이 함량별로 담가서 최초담체의 무게와 함침 후 무게비로 수분흡수율(%)을 나타내었다. 결과적으로 소장점막하조직이 복합화된 담체의 경우에서 600% 이상의 수분흡수율을 보였으며 소장점막하조직의 함량이 증가할수록 수분흡수율도 증가되는 경향성을 보였다.
실시예 3
본 발명에서 사용한 소장점막하조직에 포함된 여러 가지 생리활성물질, 즉, 성장인자나 사이토카인류의 활성도를 관찰하기 위해 먼저 소장점막하조직을 균질기로 잘게 갈아서 추출물을 짜내어 이를 배양액에 첨가하였다. 이 배양액을 사용하여 NIH/3T3 섬유아세포를 배양하였으며 세포의 증식률을 관찰하였다. 도 5에서 보는 것과 같이, 기존 배양액으로 배양된 섬유아세포(a)에 비해 소장점막하조직 추출물이 첨가된 배양액에서 배양된 섬유아세포(b)의 증식이 월등히 우수함을 알 수 있다. 이는 소장점막하조직 내에 있는 세포의 증식에 도움을 주는 생리활성물질이 있음을 알 수 있는 단편적인 예라 할 수 있다.
실시예 4
소장점막하조직이 함유된 양에 따른 PLGA 생분해성 고분자 담체에서의 세포점착력을 측정하기 위해 MTT 분석을 실시하였다. PLGA 생분해성 고분자와 소장점막하조직이 1 : 0.4, 1 : 0.8, 1 : 1.2, 1 : 1.6 함유된 담체에 5 ×105/mL 밀도의 세포를 파종하여 1일간 배양한 후 10 μL MTT 용액을 배양액에 넣어 4시간 배양시킨 후 배양액을 제거하고 100 μL lysing 버퍼용액으로 일야 방치하였다. 용액을 수거하여 분광광도계로 590 nm에서 측정하였다. 도 6은 측정된 값을 그래프로 나타낸 것이다. 소장점막하조직이 함량이 증가함에 따라 세포의 점착력이 더 우수하다. 이는 소장점막하조직을 이루고 있는 세포외기질 (예로 콜라겐류와 프로테오글리칸, 점착성 단백질)에 기인하여 더 우수한 세포점착력을 가지는 것이라 사료된다.
실시예 5
소장점막하조직과 PLGA 생분해성 고분자로 복합화된 담체의 조직공학적 장기의 제조를 위해 여러 가지 세포를 파종하여 2시간 점착시킨 후 면역결핍성 누드쥐의 피하에 이식하였다. 이를 4주 후에 관찰한 결과 도 7에서 보는 것과 같이 PLGA 담체(소장점막하조직이 복합화 되지 않은)의 경우에서 이식된 담체의 크기가 현저하게 감소한 것을 가시적으로 확인할 수 있었다. 이는 담체내에 세포가 원활하게 점착하고 증식하여 세포외기질을 생산하고 있지 못하다는 것을 나타내는 것이다. 이를 확인하기 위해 이식되었던 두 담체를 H&E(헤마톡실린과 에오신) 염색을 하여 살펴보았다. 도 8은 PLGA 고분자 담체의 염색결과(a)와 소장점막하조직이 복합화된 담체의 결과(b)를 나타낸 것으로, PLGA 고분자 담체의 경우 내부 깊숙이 세포가 들어가지 못하고 세포의 밀도도 현저하게 낮았고, 소장점막하조직이 복합화된 담체는 세포의 밀도가 높으며 내부 깊숙이 세포가 들어 있었다. 이는 본 발명에서 제시된 담체가 조직공학적으로 우수함을 나타내는 것이다.
실시예 6
소장점막하조직이 복합화된 담체를 이용하여 여러 가지 장기의 제조가 제시될 수 있는데, 본 실시예에서는 연골세포를 파종하여 조직공학적 인공 연골을 제조하는 방법은 다음과 같다.
사람의 연골세포를 분리하여 이를 세포배양기내에서 배양하였다. 배양된 세포의 수가 5 ×105/mL의 농도가 되도록 하여 소장점막하조직이 복합화된 담체에 파종하였다. 이를 세포배양기내에서 2시간 배양한 후, 면역결핍성 누드쥐의 피하에 이식하였다. 도 9는 연골조직의 글리코사아미노글리칸을 확인하기 위한 사프라닌-O 염색을 하여 본 발명에서 제시된 소장점막하조직과 PLGA 고분자가 복합된 담체에서 연골조직이 생성되고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 7
본 실시예에서는 뼈세포를 파종하여 조직공학적 인공 뼈를 제조하는 방법은 다음과 같다.
사람의 골수간엽세포를 분리하여 이를 세포배양기내에서 배양하였다. 배양된 세포를 뼈세포로 분화시켰고 이를 확인하였다. 배양된 세포의 수가 5 ×105/mL의 농도가 되도록 하여 소장점막하조직이 복합화된 담체에 파종하였다. 이를 세포배양기 내에서 2시간 배양한 후, 면역결핍성 누드쥐의 피하에 이식하였다. 도 10은 뼈조직을 확인하기 위한 본-쿠사 염색으로, 본 발명에서 제시된 소장점막하조직과 PLGA 고분자 담체에서 파종된 세포가 칼슘화되어 신생 뼈를 형성해 가는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 8
본 실시예에서는 골분의 제조, 골분과 생분해성 고분자가 복합화된 담체의 제조방법 및 이를 이용한 조직공학적 골재생에 관한 것이다. 이에 대한 구체적인 방법은 다음과 같다.
포유류에서 분리된 골조직을 강산에 처리하여 무기성분을 제거한 후 분말화 하였다. 무기물이 제거된 골분을 생분해성 고분자인 PLGA 용액과 염화나트륨을 중량비 1 : 0.4 와 0.8, 1.2, 1.6의 비로 혼합한 후에 디스크 형태(직경 10 mm, 두께 3 mm)의 몰드에 넣고 용매를 증발시켰다. 염화나트륨의 크기로 다공의 크기를, 그 양으로 다공도를 조절하였다. 용매가 완전히 제거된 후, 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수에 담가서 48시간 동안 녹여냈으며, 이온크로마토그래피를 이용하여 잔류염이 없음을 확인하였다. 제조된 다공성 담체를 동결건조한 후 진공오븐에서 보관하였다.
제조된 다공성 담체를 주사전자현미경으로 촬영하여 다공의 형태를 관찰하였다[도 2]. 다공의 크기는 균일하게 형성되었으며, 염의 크기와 양으로 다공의 크기와 다공도를 조절할 수 있었다. 또한, 이의 다공 크기의 분포와 비다공 면적, 평균 다공 직경, 다공도를 측정하기 위해 수은다공도계[Model AutoPore II 9220, Micromeritics Co., USA]를 이용하였다.
실시예 9
골분이 복합화된 PLGA 담체를 이용하여 여러 가지 장기의 제조가 제시될 수 있다. 본 실시예에서는 뼈 세포를 파종하여 조직공학적 인공 뼈를 제조하는 방법은 다음과 같다.
포유류의 골분이 복합화된 PLGA 담체에 사람의 골수간엽세포를 분리하여 뼈세포로 분화시킨 세포를 5 ×105/mL의 농도가 되도록 하여 파종하였다. 이를 세포배양기 내에서 2시간 배양한 후, 면역결핍성 누드쥐의 피하에 이식하였다. 도 11은 골분이 복합화된 PLGA 담체에서 파종된 세포가 기질을 분비하고 신생 뼈조직이 형성하는 것을 확인하였다.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 천연/합성고분자 하이브리드 담체는 적당한 다공크기를 갖고 있어서 혈액과 피부간에 영양액, 산소, 이산화탄소 등의 물질전달이 효과적으로 이루어지고, 또한 이 다공간의 연결이 생분해성 고분자로 되어 있어서 인체 내의 혈관내피세포 또는 피부조직세포 등의 부착 및 성장이 용이하며, 이러한 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해되어 몸에 흡수되기 때문에 기존의 인공장기 재료보다 월등히 우수한 장점을 가지고 있다.
또한, 상기 담체는 수분흡수력이 우수하고 유연성이 증가되며 가공성이 매우 좋고 조직 자체가 함유한 여러 가지 성장인자와 사이토카인에 의해 세포의 점착과 성장, 분화가 촉진되는 장점을 가진다는 점에서 종래의 조직공학적 인공장기 개발에서 필수불가결한 생분해성 고분자 담체의 기능화를 할 수 있으며 종래의 방법보다 훨씬 용이하고 월등한 경제적인 장점을 가지고 있다.
도 1은 본 발명에 따른 소장점막하조직/생분해성 고분자가 복합화된 다공성·생분해성 담체 표면(a) 및 단면(b)을 나타낸 주사전자현미경 사진이고,
도 2는 본 발명에 따른 골분/생분해성 고분자가 복합화된 다공성·생분해성 인공장기 표면(a) 및 단면(b)을 나타낸 주사전자현미경 사진이고,
도 3은 기존의 합성고분자 담체와 본 발명에 따른 소장점막하조직/생분해성 고분자가 복합화된 다공성ㆍ생분해성 담체의 적심성 평가 실험이고,
도 4는 기존의 합성고분자 담체와 본 발명에 따른 소장점막하조직/생분해성 고분자가 복합화된 다공성ㆍ생분해성 담체의 수분흡수율을 나타낸 것이고,
도 5는 기존의 합성고분자 담체와 본 발명에 따른 하이브리드 담체내 소장점막하조직의 함량에 따른 세포점착력 실험을 나타낸 것이고,
도 6는 기본 배양액으로 배양된 섬유아세포의 사진(a)이고, 소장점막하조직의 추출물이 첨가된 배양액으로 배양된 섬유아세포의 사진(b)이고,
도 7은 세포를 파종한 소장점막하조직/생분해성 고분자가 복합화된 다공성ㆍ생분해성 인공장기의 4주 후 사진이고,
도 8은 기존의 합성고분자 담체의 세포 파종 후 사진(a)이고, 소장점막하조직/생분해성 고분자가 복합화된 다공성ㆍ생분해성 인공장기의 사진(b)이고,
도 9는 본 발명에 따른 하이브리드 담체로 제조된 조직공학적 인공연골의 사프라닌-O 염색 사진이고,
도 10은 본 발명에 따른 하이브리드 담체로 제조된 조직공학적 인공뼈의 본-쿠사 염색 사진이고,
도 11은 본 발명에 따른 포유류의 골분/생분해성 고분자가 복합화된 담체로 제조된 조직공학적 인공뼈의 조직학적 염색 사진이다.
Claims (7)
- 인간을 제외한 포유류의 소장점막하조직을 생분해성 고분자와 복합화하여 제조된 것을 특징으로 하는 조직공학용 담체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 포유류는 소, 돼지, 토끼, 쥐 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조직공학용 담체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리히드록시뷰티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 및 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyano acrylate) 중에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로 하는 조직공학용 담체.
- 1) 인간을 제외한 포유류의 소장점막하조직 또는 골분을 동결건조하고 분쇄시켜 미세분말화하는 단계;2) 상기 미세분말화된 소장점막하조직 또는 골분을 생분해성 고분자용액과 1 : 0.4 내지 1 : 1.6의 중량비로 혼합하는 단계;3) 상기 혼합액에 염을 1 : 4 내지 1: 16의 중량비로 혼합 후, 용매를 증발시키는 단계; 및4) 상기 3)의 잔여물을 증류수에 녹여 염을 완전히 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직공학용 담체의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 포유류는 소, 돼지, 토끼, 쥐 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조직공학용 담체의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리히드록시뷰티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 및 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyano acrylate) 중에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로 하는 조직공학용 담체의 제조방법.
- 청구항 1의 담체를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 다공성ㆍ생분해성 인공장기.
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