KR100467778B1 - Detection method of nucleic acid hybridization - Google Patents
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- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Abstract
본 발명은 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것으로, (a) 작업 전극 위에 포획 프로브를 고정시켜 올리고 플레이트(oligo plate)를 제조하는 단계, (b) 상기 포획 프로브에 목적 프로브를 반응시켜 혼성화 핵산을 제조하는 단계, (c) 핵산에 결합하여 전하를 변화시키는 핵산 결합물질을 혼성화 핵산 또는 포획 프로브에 반응시키는 단계 및 (d) 전해질중에서 작업 전극의 전류 또는 전하량을 전기화학적 방법으로 측정하여 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함하는 핵산 혼성화 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting hybridization of nucleic acids, the method comprising: (a) fixing an capture probe on a working electrode to prepare an oligo plate, and (b) reacting a target probe with the capture probe to produce a hybridized nucleic acid. (C) reacting the nucleic acid binding material that binds to the nucleic acid to change the charge with the hybridizing nucleic acid or the capture probe, and (d) measuring the current or charge amount of the working electrode in the electrolyte by electrochemical method to confirm hybridization. It relates to a nucleic acid hybridization detection method comprising the step of.
Description
본 발명은 핵산 혼성화 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 혼성화 핵산 또는 단일가닥 핵산에 선택적으로 결합하는 핵산 결합물질에 의한 핵산의 음전하 변화를 전기화학적인 방법으로 측정하는 것을 포함하는 핵산 혼성화 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid hybridization detection method, and more particularly, to a nucleic acid hybridization detection method including measuring a negative charge change of a nucleic acid by a nucleic acid binding agent selectively binding to a hybridized nucleic acid or a single stranded nucleic acid by an electrochemical method. It is about.
DNA 칩 분야에서 DNA 혼성화의 검출은 가장 핵심적인 기술이다. 현재 일반적으로 사용되고 있는 방법은 DNA 분자에 형광표지 분자를 결합시킨 후 레이저를 조사하여 야기되는 빛을 검출하는 레이저 유발 형광법이다. 레이저 유발 형광법은 현재 DNA 칩 제작 회사인 미국의 어피메트릭사(Affymetrix), 나노젠사(Nanogen) 등에 의해 상품화되어 있다. 그러나 레이저 유발 형광법은 DNA 자체에 형광을 유발할 수 있는 다른 분자를 결합해야 하는 번거로움이 있으며, 과정이 복잡하고, 형광분자 사용에 따른 고가의 비용이 요구된다.Detection of DNA hybridization is a key technology in the field of DNA chips. Currently, a method commonly used is laser-induced fluorescence which detects light caused by irradiating a laser after binding a fluorescent label molecule to a DNA molecule. Laser-induced fluorescence is currently commercialized by DNA chip makers Affymetrix and Nanoogen. However, the laser-induced fluorescence method is cumbersome to bind other molecules capable of inducing fluorescence in the DNA itself, the process is complicated, and the expensive cost of using fluorescent molecules is required.
최근에는 별도의 표지 분자를 DNA에 직접 결합시키지 않고 DNA 혼성화를 검출할 수 있는 방법으로 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance)법, 수정체 미량 저울(quartz crystal microbalance)법, 질량 분석기를 이용한 방법, 및 전기화학을 이용한 방법 등이 이용되고 있다. 이러한 방법들은 DNA 자체에 직접 표지 분자를 결합시키지 않아도 검출이 가능하다는 장점을 지니고 있지만, 전기화학적인 방법을 제외한 나머지 방법들은 고가의 장비와 장비를 다룰수 있는 전문성이 요구되어 쉽게 이용하기 어렵다. 반면에 전기화학을 이용한 검출법은 검출을위해 사용되는 장비가 비교적 저가이며, 특별한 지식 없이 약간의 교육만으로도 검출이 가능하여 쉽게 사용할 수 있다.Recently, surface hybridization, surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, mass spectrometry, and the like can be used to detect DNA hybridization without directly binding a separate label molecule to DNA. Chemistry and the like are used. These methods have the advantage that they can be detected without binding label molecules directly to DNA itself, but other methods, except for electrochemical methods, are difficult to use because they require expertise in handling expensive equipment and equipment. On the other hand, the detection method using the electrochemistry is relatively inexpensive and the equipment used for the detection is relatively inexpensive, and can be easily used because it can be detected with a little education without special knowledge.
본 발명은 전기화학적 방법을 이용하여 혼성화된 핵산을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a method capable of detecting hybridized nucleic acids using an electrochemical method.
또한 본 발명은 조작이 간단하고 저가의 비용으로 실시할 수 있는 혼성화 핵산 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a hybridization nucleic acid detection method which is simple in operation and can be carried out at low cost.
도 1은 본 발명의 올리고 플레이트 제조과정을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the oligo plate manufacturing process of the present invention,
도 2 및 3은 올리고 플레이트가 여러 개 있는 다중어레이를 나타낸 것이고,2 and 3 show multiple arrays with multiple oligo plates,
도 4a는 혼성화 핵산이 고정된 올리고 플레이트를 나타낸 것이고, 도 4b는 핵산 결합물질을 반응시켜 핵산의 음전하가 상쇄된 것을 나타낸 것이고,Figure 4a shows the oligo plate is immobilized hybridization nucleic acid, Figure 4b shows that the negative charge of the nucleic acid was canceled by reacting the nucleic acid binding material,
도 5a는 음전하가 상쇄된 작업 전극 표면에서 발생되는 산화/환원반응을 나타낸 것이고, 도 5b는 음전하를 나타내는 작업 전극 표면에서 정전기적 반발력을 나타낸 것이고,FIG. 5A illustrates the oxidation / reduction reaction occurring at the work electrode surface in which the negative charge is canceled, FIG. 5B shows the electrostatic repulsive force at the work electrode surface showing the negative charge,
도 6a는 인터칼레이터 반응전의 작업 전극에서 측정한 순환 전압전류그래프이고, 도 6b는 단일 가닥 상태의 DNA가 붙어있는 전극에 인터칼레이터를 반응시킨 후, 작업전극에서 측정한 순환 전압전류그래프이고, 도 6c는 혼성화된 이중 가닥 상태의 DNA가 붙어있는 전극에 인터칼레이터를 반응시킨 후, 작업 전극에서 측정한 순환 전압전류그래프이고,6A is a cyclic voltammogram measured at the working electrode before the intercalator reaction, and FIG. 6B is a cyclic voltammogram measured at the working electrode after the intercalator is reacted with an electrode having DNA attached to a single strand. 6C is a cyclic voltammogram measured at the working electrode after the intercalator is reacted with the hybridized double-stranded DNA.
도 7은 아크리딘계 화합물로 인터칼레이션하였을 때 순환 전압전류 그래프를 나타낸 것이다.Figure 7 shows a cyclic voltammogram graph when intercalated with an acridine-based compound.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 작업 전극 위에 포획 프로브를 고정시켜 올리고 플레이트(oligo plate)를 제조하는 단계, (b) 상기 포획 프로브에 목적 프로브를 반응시켜 혼성화 핵산을 제조하는 단계, (c) 핵산에 결합하여 전하를 변화시키는 핵산 결합물질을 혼성화 핵산 또는 포획 프로브에 반응시키는 단계 및 (d) 전해질중에서 작업 전극의 전류 또는 전하량을 전기화학적 방법으로 측정하여 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함하는 핵산 혼성화 검출방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing an oligo plate by (a) fixing a capture probe on a working electrode, and (b) preparing a hybridized nucleic acid by reacting a target probe with the capture probe. (c) reacting the nucleic acid binding material that binds to the nucleic acid to change the charge with the hybridizing nucleic acid or the capture probe, and (d) measuring the current or charge amount of the working electrode in the electrolyte by electrochemical method to confirm hybridization. It provides a nucleic acid hybridization detection method comprising a.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 혼성화 핵산 또는 단일가닥 핵산에 핵산 결합물질을 선택적으로 반응시켜, 핵산 결합물질의 결합에 따른 혼성화 핵산 또는 단일가닥 핵산의 전하변화를 측정하는 것이다.The present invention selectively reacts a nucleic acid binding material with a hybridizing nucleic acid or a single stranded nucleic acid to measure the charge change of the hybridizing nucleic acid or the single stranded nucleic acid according to the binding of the nucleic acid binding material.
상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.The nucleic acid may be DNA or RNA.
본 발명에서 언급된 혼성화는 핵산간의 상보적 결합(complementary bind)이 형성됨을 의미하는 것이다.Hybridization as referred to in the present invention means that a complementary bind between nucleic acids is formed.
핵산 결합물질은 혼성화 핵산 또는 단일가닥 포획 프로브에 선택적으로 공유 또는 비공유 결합하여 하는 화합물을 의미한다. 핵산 결합물질은 혼성화 핵산의 그루브(groove)에 삽입되는 화합물, DNA 염기 사이에 삽입되는 물질, 또는 단일가닥 핵산에 특이적으로 결합하는 화합물일 수 있으며, 양전하를 띄며 단일가닥 핵산과 혼성화 핵산에 대하여 결합도 차이가 큰 화합물이 바람직하다.By nucleic acid binding agent is meant a compound which is selectively covalently or non-covalently bound to a hybridizing nucleic acid or a single stranded capture probe. The nucleic acid binding material may be a compound inserted into a groove of a hybridizing nucleic acid, a material inserted between DNA bases, or a compound specifically binding to a single-stranded nucleic acid. Compounds having a large difference in binding degree are preferable.
핵산 결합물질은 인터칼레이터, 인터칼레이팅 형광 염료, 아크리딘계 화합물(acridines), 클로로퀴닌(chloroquine), 퀴닌(quinine), 노바나트론(novanatrone), 독소루비신(doxorubicin), 단일가닥 결합단백질(single strand binding protein) 및 렉 A 단백질(Rec A protein)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.Nucleic acid binding agents include intercalators, intercalating fluorescent dyes, acridine compounds, chloroquine, quinine, novanatrone, doxorubicin, and single-stranded binding proteins. single strand binding protein) and Rec A protein.
상기 인터칼레이터는 혼성화 핵산에 삽입되는 통상의 물질로, 인터칼레이팅 형광 염료, 아크리딘계 화합물, 클로로퀴닌, 퀴닌, 노바나트론, 독소루비신이 이에 속한다.The intercalator is a common substance inserted into the hybridizing nucleic acid, and intercalating fluorescent dyes, acridine-based compounds, chloroquinine, quinine, novanatrone, and doxorubicin belong to it.
상기 인터칼레이팅 형광 염료로는 1,1'-[1,3-propanediylbis[(dimethyliminio) -3,1-propanediyl]]bis[4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene) methyl]]-, tetraiodide(YOYO -1), 1,1'-[1,3-propanediylbis[(dimethyliminio) -3,1-propanediyl]]bis[4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene) -1-propenyl]]-,tetraiodide(YOYO -3), 4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene) methyl]-1-[3-(trimethylammonio) propyl]-, diiodide(YO-PRO -1), 4-[3-(3-methyl-2(3H) -benzoxazolylidene) -1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio) propyl]-, diiodide(YO-PRO -3), 2,2'-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) -3,1-propanediyl-1(4H)-pyridinyl-4-ylidenemethylidyne]]bis[3- methyl]-,tetraiodide(POPOTM-1), 2,2'-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio)-3,1-propanediyl-1(4H)-pyridinyl-4- ylidene-1-propen-1-yl-3- ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide(POPOTM-3), EtBr(3,8-diamino-5-ethyl-6-phenyl-bromide), 3-methyl-2-[[1-[3-(trimethylammonio) propyl]-4(1H)-pyridinylidene]methyl]- , diiodide(PO-PRO™-1), 3-methyl-2-[3-[1-[3-(trimethylammonio) propyl]-4(1H)-pyridinylidene]- 1-propenyl]-, diiodide(PO-PRO™-3), SYBR 그린(Molecular Probes사의 등록상표) 등이 있으며, 아크리딘계 화합물로는 3,6-디아미노아크리딘(3,6-diaminoacridine), 3,6-디아미노-10-메틸아크리디니움 클로라이드(3,6-diamino-10-methylacridinium chloride), 아크리딘 오렌지(acridine orange), 아크리딘 옐로(acridine yellow) 등이 있다.As the intercalating fluorescent dye, 1,1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) -3,1-propanediyl]] bis [4-[(3-methyl-2 (3H) -benzoxazolylidene) methyl] ]-, tetraiodide (YOYO -1), 1,1 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) -3,1-propanediyl]] bis [4- [3- (3-methyl-2 (3H) -benzoxazolylidene) -1-propenyl ]]-, tetraiodide (YOYO -3), 4-[(3-methyl-2 (3H) -benzoxazolylidene) methyl] -1- [3- (trimethylammonio) propyl]-, diiodide (YO-PRO -1), 4- [3- (3-methyl-2 (3H) -benzoxazolylidene) -1-propenyl] -1- [3- (trimethylammonio) propyl]-, diiodide (YO-PRO -3), 2,2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) -3,1-propanediyl-1 (4H) -pyridinyl-4-ylidenemethylidyne]] bis [3-methyl]-, tetraiodide (POPOTM-1), 2,2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) -3,1-propanediyl-1 (4H) -pyridinyl-4- ylidene-1-propen-1-yl-3- ylidene]] bis [3-methyl]-, tetraiodide (POPOTM-3), EtBr (3,8-diamino-5-ethyl-6-phenyl-bromide), 3-methyl-2-[[1- [3- (trimethylammonio) propyl] -4 (1H) -pyridinylidene] methyl]-, diiodide (PO-PRO ™ -1), 3-methyl-2- [3- [ 1- [3- (trimethylammonio) propyl] -4 (1H) -pyridinylidene] -1-propenyl]-, diiodide (PO-PRO ™ -3), SYBR Green (registered trademark of Molecular Probes, Inc.), and the like, and acridine-based compounds include 3,6-diaminoacridine, 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride (3 , 6-diamino-10-methylacridinium chloride, acridine orange, and acridine yellow.
바람직한 핵산 혼성화 검출방법은 (a) 작업 전극 위에 포획 프로브를 고정시켜 올리고 플레이트(oligo plate)를 제조하는 단계, (b) 상기 포획 프로브에 목적 프로브를 반응시켜 혼성화 핵산을 제조하는 단계, (c) 핵산의 전하를 변화시키는 핵산 결합물질을 혼성화 핵산 또는 포획 프로브에 반응시키는 단계 및 (d) 전해질에서의 작업 전극의 전류 또는 전하량을 전기화학적 방법으로 측정하여 혼성화 여부를 확인하는 단계를 포함한다.Preferred nucleic acid hybridization detection method comprises the steps of (a) fixing the capture probe on the working electrode to produce an oligo plate, (b) reacting the target probe with the capture probe to produce hybridized nucleic acid, (c) Reacting the nucleic acid binding agent that changes the charge of the nucleic acid with the hybridizing nucleic acid or the capture probe, and (d) measuring the current or charge amount of the working electrode in the electrolyte by an electrochemical method to determine whether the hybridization is performed.
또한 (c) 단계이전에 올리고 플레이트에 계면활성제를 반응시키는 단계를 더욱 실시할 수 있다. 계면활성제는 핵산 결합물질 반응시 사용하는 용액과 같은 구성을 갖는 완충용액을 사용한다. 계면활성제의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 10 mM 전후가 바람직하다. 계면활성제는 그 종류에 관계없이 사용가능하나, 바람직하게는 소듐도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate) 또는 트리톤 X (triton x)계 화합물이다.In addition, the step of reacting the surfactant to the oligo plate prior to step (c) may be further carried out. The surfactant uses a buffer solution having the same composition as the solution used for the nucleic acid binder reaction. The concentration of the surfactant is not particularly limited, but is preferably around 10 mM. Surfactants can be used regardless of their kind, but are preferably sodium dodecyl sulfate or triton x-based compounds.
본 발명의 올리고 플레이트를 구체적인 예를들어 설명하면 도 1과 같다. 올리고 플레이트는 작업 전극(①)에 포획 프로브(②)를 고정시켜 제조할 수 있으며, 포획 프로브의 5 말단이나 3 말단에 티올기(thiol group; ③) 또는 아민기(amine group)를 연결하여 고정시킬 수 있다. 또한 포획 프로브와 작업 전극간의 직접적인 접촉을 방지하기 위하여 티올기(또는 아민기)와 포획 프로브 사이에 카본 체인링커(carbon chain linker; ④)를 더욱 연결시킬 수 있다. 이때 상기 카본 체인은 카본수에 제한이 없으나, 6 내지 12개의 카본을 포함하는 것이 바람직하다.Referring to the oligo plate of the present invention with a specific example as shown in FIG. Oligo plate can be prepared by fixing the capture probe (②) to the working electrode (①), and fixed by connecting a thiol group (thi) group or an amine group at the 5 or 3 ends of the capture probe You can. In addition, a carbon chain linker (④) may be further connected between the thiol group (or the amine group) and the capture probe to prevent direct contact between the capture probe and the working electrode. At this time, the carbon chain is not limited to the number of carbon, but preferably contains 6 to 12 carbons.
본 발명에서 언급하는 포획 프로브 및 목적 프로브는 핵산이고, 상기 작업 전극은 금, 백금, 은, 탄소, 구리, 니켈, 크롬 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터선택된 금속으로, 전도성이 큰 금속이 바람직하다. 금속은 금속성형물인 박막 또는 막대기 형태로 사용할 수 있으며, 바이오칩의 기판으로 사용되는 물질에 금속으로 코팅하여 사용할 수 있다.The capture probe and the target probe mentioned in the present invention are nucleic acids, and the working electrode is a metal selected from the group consisting of gold, platinum, silver, carbon, copper, nickel, chromium and palladium, and a metal having high conductivity is preferable. The metal may be used in the form of a thin metal or rod as a metal molding, and may be coated with a metal on a material used as a substrate of a biochip.
본 발명의 작업 전극은 작업 전극 당 하나의 포획 프로브를 고정시킬 수 있으므로, 다수의 포획 프로브를 고정시키기 위하여 다중어레이(도 2 및 도 3)로 제조할 수 있다. 다중어레이는 작업 전극으로부터 일정 간격을 두고 보조전극(⑤)을 둘 수 있다. 보조전극은 포획 프로브를 고정하지 않은 블랭크 전극으로, 금 또는 백금을 사용할 수 있다. 보조전극은 용액상에서 화학적 반응이 일어남에 따라 생길 수 있는 기준 전극과 작업전극간의 전압 강하를 방지해 주는 역할을 하고, 작업전극에 정확하고 일정한 전압을 가할 수 있도록 도와준다. 기준 전극은 작업 전극에 일정 전압을 걸어주거나 순환 전압을 걸어줄 경우 전압의 크기를 판단할 수 있는 기준으로 사용되는 것으로, 은에 염화은을 도핑한 Ag/AgCl 기준 전극을 사용할 수 있으며, 용액 중에 다른 곳에 위치시킬 수 있다. 기준 전극은 주위 전기적 반응에 상관없이 일정전압을 유지시키는 역할을 한다. Since the working electrode of the present invention can fix one capture probe per working electrode, it can be manufactured with multiple arrays (FIGS. 2 and 3) to fix multiple capture probes. The multiple array may have an auxiliary electrode ⑤ at a predetermined distance from the working electrode. The auxiliary electrode is a blank electrode which does not fix the capture probe, and may use gold or platinum. The auxiliary electrode prevents the voltage drop between the reference electrode and the working electrode which may occur as a chemical reaction occurs in the solution phase, and helps to apply a precise and constant voltage to the working electrode. The reference electrode is used as a reference for judging the magnitude of the voltage when a constant voltage or a circulating voltage is applied to the working electrode. An Ag / AgCl reference electrode doped with silver chloride in silver may be used. It can be located somewhere. The reference electrode serves to maintain a constant voltage regardless of the ambient electrical response.
핵산 혼성화 검출방법의 혼성화 반응단계에서는 작업 전극에 고정된 포획 프로브가 상보적인 목적 프로브와 결합하여 이중나선구조를 형성하는(도 4a) 반면에, 상보적이지 못한 포획 프로브는 단일가닥으로 유지된다. 혼성화 반응은 사용되는 프로브의 특성, 크기 등에 따라 반응조건을 달리할 수 있으며, 통상적인 혼성화 조건으로 실시하는 것이 좋다. 또한 포획 프로브와 목적 프로브간의 혼성화를 안정하게 유지시키기 위하여 염화나트륨을 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 혼성화반응 후 혼성화되지 않은 잔여 목적 프로브 또는 비특이적으로 결합된 목적 프로브는 세척하여 제거하는 것이 바람직하다.In the hybridization reaction step of the nucleic acid hybridization detection method, the capture probe fixed to the working electrode is combined with the complementary target probe to form a double helix structure (FIG. 4A), while the non-complementary capture probe is kept in a single strand. The hybridization reaction can vary the reaction conditions according to the characteristics, size, etc. of the probe used, it is preferable to carry out under the usual hybridization conditions. In addition, a buffer containing sodium chloride may be used to keep the hybridization between the capture probe and the target probe stable. After hybridization, it is preferable to wash and remove any remaining hybridized or unspecifically bound objective probes.
핵산 혼성화 검출방법의 (c) 단계에서는 혼성화 핵산 또는 단일가닥 핵산에 선택적으로 결합하는 핵산 결합물질이 혼성화 핵산 또는 단일가닥 핵산에 결합하여 작업 전극 표면의 전하상태를 변화시킨다(도 4b). 예를 들어, 양전하성 핵산 결합물질은 작업 전극에 고정된 핵산의 음전하를 상쇄시킨다.In step (c) of the nucleic acid hybridization detection method, a nucleic acid binding agent that selectively binds to a hybridized nucleic acid or a single stranded nucleic acid binds to the hybridized nucleic acid or a single stranded nucleic acid to change the charge state of the working electrode surface (FIG. 4B). For example, positively charged nucleic acid binders offset the negative charge of the nucleic acid immobilized on the working electrode.
또한 상기 (c) 단계 이후에 계면활성제, 열, 전압 또는 음파를 더욱 가하여 비특이적인 결합을 최소화시킬 수 있다. 일 예로, 혼성화 핵산에 특이적인 인터칼레이터는 핵산 이중 나선의 중첩된 염기쌍(stacked base pair)에 삽입하지만, 단일가닥 핵산에도 이온간 상호작용으로 결합하는 경향이 있다. 이러한 비특이성 결합(이온간 상호작용)을 감소시키기 위하여 계면활성제를 처리하거나 열, 음파 또는 전압의 형태로 에너지를 가해 약한 결합을 최소화시킬 수 있다. 열처리는 65 내지 95 ℃에서 실시하고, 음파는 통상적인 방법 또는 초음파처리(sonication)로 실시할 수 있으며, 전압은 전극에 가하여 비특이적으로 결합된 핵산 결합물질를 제거할 수 있다.In addition, after the step (c) it may further add a surfactant, heat, voltage or sound waves to minimize the non-specific binding. For example, intercalators specific for hybridizing nucleic acids insert into stacked base pairs of nucleic acid double helixes, but also tend to bind to single stranded nucleic acids by ionic interactions. To reduce these nonspecific bonds (interactions between ions), the surfactants can be treated or energized in the form of heat, sound waves or voltages to minimize weak bonds. Heat treatment may be carried out at 65 to 95 ℃, sound waves can be carried out by conventional methods or sonication (sonication), voltage can be applied to the electrode to remove the non-specifically bound nucleic acid binding material.
상기 (d) 단계에서는 올리고 플레이트의 작업 전극을 전해질에 두어 작업 전극표면 전하상태 변화를 전기화학적인 방법으로 측정한다. 이때 작업 전극표면에 고정된 핵산의 음전하가 핵산 결합물질에 의해 상쇄된 경우, 음전하를 띠는 전해질은 전극 표면에 근접하여 산화/환원 반응을 발생시킨다. 그러나, 작업 전극 표면이 음전하를 계속 유지할 경우 음전하성 전해질은 정전기적인 반발력에 의하여 근접하지 못하고, 결과적으로 산화/환원반응이 발생되지 않는다(도 5b).In the step (d), the working electrode of the oligo plate is placed in the electrolyte, and the change of the charge state of the working electrode surface is measured by an electrochemical method. In this case, when the negative charge of the nucleic acid immobilized on the working electrode surface is canceled by the nucleic acid binding material, the negatively charged electrolyte generates an oxidation / reduction reaction in proximity to the electrode surface. However, when the working electrode surface keeps the negative charge, the negatively charged electrolyte is not approached by the electrostatic repulsive force, and as a result, the oxidation / reduction reaction does not occur (FIG. 5B).
본 발명의 전해질은 음전하를 띠는 전해질로, 가장 바람직하게는 Fe(CN)6 3-을 포함하는 수용액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0, 3 mM K3Fe(CN)6)이다.The electrolyte of the present invention is a negatively charged electrolyte, most preferably an aqueous solution containing Fe (CN) 6 3- (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0, 3 mM K 3 Fe (CN) 6 ).
또한 본 발명에서 사용되는 전기화학적 방법의 예로는 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 암페로미터리(amperometry) 및 크로노쿨로미터리(chronocoulometry)가 있다. 순환 전압전류법이란 작업 전극(working electrode)에 기준 전극에 대해 일정 범위의 전압을 가감하며 순환하여 걸어주는 방법이다. 또한 상기 암페로미터리는 고정된 일정 전압상에서 전류를 측정하는 방법이고, 상기 크로노쿨로미터리는 고정된 전압에서 전하량을 측정하는 방법이다.In addition, examples of electrochemical methods used in the present invention include cyclic voltammetry, amperometry, and chronocoulometry. The cyclic voltammetry is a method of circulating a working electrode by applying a predetermined range of voltages to and from the reference electrode. In addition, the amperometer is a method of measuring the current at a fixed constant voltage, the chronometry is a method of measuring the amount of charge at a fixed voltage.
본 발명의 구체적인 일예로, 작업 전극의 전류변화를 순환전압전류법으로 측정하였을 때, 인터칼레이터를 반응시키기 전 작업 전극은 도 6a의 전압-전류 양상을 나타내고, 인터칼레이터에 무반응을 나타낸 작업 전극은 도 6b의 양상을, 인터칼레이터가 반응한 작업 전극은 도 6c의 양상을 나타낸다. 즉, 핵산 결합물질에 의해 음전하가 상쇄된 포획 프로브는 산화/환원반응으로 전압에 따른 전류량 차이를 나타낸다.As a specific example of the present invention, when the current change of the working electrode is measured by cyclic voltammetry, the working electrode exhibits the voltage-current pattern of FIG. 6A and shows no response to the intercalator when the intercalator is reacted. The working electrode shows the aspect of FIG. 6B, and the working electrode to which the intercalator reacts shows the aspect of FIG. 6C. In other words, the capture probe in which the negative charge is canceled by the nucleic acid binding material shows the difference in the amount of current according to the voltage by the oxidation / reduction reaction.
따라서, 혼성화 핵산에 특이적인 핵산 결합물질을 포획 프로브에 반응시켰을 때 작업 전극에서 도 6b의 순환전압전류가 측정되면 상기 포획 프로브는 목적 프로브에 대하여 상보적이지 않음을 의미한다. 반면에 도 6c의 전류변화가 측정되면포획 프로브가 혼성화 되었음을 의미하는 것이다.Therefore, if the cyclic voltammetry of FIG. 6B is measured at the working electrode when the nucleic acid binding material specific for the hybridized nucleic acid is reacted with the capture probe, it means that the capture probe is not complementary to the target probe. On the other hand, if the current change of FIG. 6c is measured, it means that the capture probe is hybridized.
본 발명의 핵산 혼성화 검출방법은 DNA 또는 RNA의 혼성화를 쉽게 구별할 수 있어, DNA 칩 또는 RNA 칩의 검출 방법으로 사용할 수 있다. 이를 이용한 DNA 칩 또는 RNA 칩의 검출은 질병 진단 분야, 의약품 개발 분야 및 연구분야 등에 폭 넓게 적용될 수 있다.The nucleic acid hybridization detection method of the present invention can easily distinguish the hybridization of DNA or RNA, and can be used as a detection method of a DNA chip or an RNA chip. Detection of DNA chips or RNA chips using the same can be widely applied to the field of disease diagnosis, drug development and research.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are provided only to more easily understand the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
[실시예 1] 올리고 플레이트 제조Example 1 Oligo Plate Preparation
금 전극으로 막대 형태의 금을 사용하였다. 막대 형태의 금 표면은 사포 1500 번과 2000번으로 차례로 갈아준 후, 입자가 5 ㎛, 1 ㎛, 0.05 ㎛인 알루미나 가루로 차례로 갈아주었다. 금 표면을 간 다음 금 전극은 3차 증류수상에서 약 5분간 초음파 세척을 하여 전극 표면에 붙어 있는 미세한 가루들을 제거하였다. 금 전극은 수산화칼륨 (KOH) 포화 수용액에 담가 약 1시간 동안 끓이고, 황산에 담구어 24시간 방치한 다음 3차 증류수로 세척하였다. 이 과정에서 황산에 담가두는 단계는 피란하(piranha) 용액에 담가 3-4 시간 방치하는 과정으로 대체 가능하다.Rod gold was used as the gold electrode. The gold surface in the form of a rod was sequentially changed to sandpaper 1500 and 2000, and then to alumina powder having particles of 5 µm, 1 µm and 0.05 µm. After the gold surface was crossed, the gold electrode was ultrasonically cleaned for about 5 minutes in tertiary distilled water to remove fine powders from the electrode surface. The gold electrode was immersed in saturated aqueous potassium hydroxide (KOH) solution, boiled for about 1 hour, immersed in sulfuric acid, left for 24 hours, and washed with distilled water. In this process, the step of soaking in sulfuric acid can be replaced by soaking in piranha solution for 3-4 hours.
금 전극 표면에 고정하는 포획 프로브(capture probe)는 서열번호 1의 서열을 갖는 핵산을 사용하였다. 포획 프로브는 5 말단에 티올기가 붙어 있으며, 시그마-알드리치(Sigma-aldrich)에서 구입하였다. 10 ng/mL의 포획 프로브를 포함하는 증류수 수용액(또는 포획 프로브를 포함하는 50 mM 염화나트륨, 10 mMphosphate pH 7.0 수용액)을 준비한 다음 세척한 금 전극의 표면을 상기 수용액에 담가 8시간 이상 방치하였다. 증류수 수용액에서 반응 후, 상기 수용액에 50 mM 염화나트륨, 10 mM 포스페이트(pH 7.0)을 첨가한 다음 다시 약 20시간 동안 방치하였다. 반응이 종결된 후에 금 전극을 꺼내어 완충용액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0)으로 세척하고, 동일 완충용액에 보관하여 올리고 플레이트를 준비하였다.As a capture probe fixed to the surface of the gold electrode, a nucleic acid having a sequence of SEQ ID NO: 1 was used. The capture probe had a thiol group attached to five terminals and was purchased from Sigma-aldrich. An aqueous distilled water solution containing 10 ng / mL capture probes (or 50 mM sodium chloride containing a capture probe, 10 mM phosphate pH 7.0 aqueous solution) was prepared, and the surface of the washed gold electrode was immersed in the aqueous solution and left to stand for at least 8 hours. After the reaction in an aqueous distilled water, 50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate (pH 7.0) was added to the aqueous solution and then left for about 20 hours. After the reaction was completed, the gold electrode was taken out, washed with a buffer solution (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0), and stored in the same buffer to prepare an oligo plate.
[실시예 2] 혼성화 반응Example 2 Hybridization Reaction
10 ug/mL의 목적 프로브(서열번호 2)를 완충용액(1x TE, 400 mM 염화나트륨 pH 7.0)에 혼합하여 목적 프로브 수용액을 준비하였다.A target probe aqueous solution was prepared by mixing 10 ug / mL of the target probe (SEQ ID NO: 2) with a buffer solution (1x TE, 400 mM sodium chloride pH 7.0).
상기 목적 프로브 수용액에 실시예 1의 올리고 플레이트를 담가 45 ℃ 항온실에서 약 15시간 이상 방치하였다. 온도를 상온으로 서서히 낮추고, 올리고 플레이트를 완충액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0)으로 세척하였다.The oligo plate of Example 1 was immersed in the target probe aqueous solution and left to stand at 45 ° C. for at least about 15 hours. The temperature was slowly lowered to room temperature and the oligo plates were washed with buffer (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0).
올리고 플레이트는 7 mM의 SDS를 포함하는 1x TBE(pH 7.0) 또는 7 mM의 SDS를 포함하는 50 mM 염화나트륨, 10 mM 포스페이트(pH 7.0) 완충용액에 약 10분간 담구었고, 1x TBE(pH 7.0) 완충액으로 세척하였다.Oligo plates were soaked in lx TBE (pH 7.0) containing 7 mM SDS or 50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer containing 7 mM SDS for about 10 minutes and lx TBE (pH 7.0). Wash with buffer.
올리고 플레이트는 10-7M의 SYBR 그린을 포함하는 1x TBE(pH 7.0) 완충액에 담가 10분 이상 방치한 다음 완충액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0)으로 세척하였다.Raise the plate was washed with a 1x TBE (pH 7.0) soaked in a buffer solution for longer than 10 minutes, and then buffer (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0), including SYBR Green in the 10 -7 M.
[실시예 3]Example 3
서열번호 3의 목적 프로브로 상기 실시예 2와 동일하게 실시하여 올리고 플레이트에 반응시켰다.The target probe of SEQ ID NO: 3 was carried out in the same manner as in Example 2 to react with the oligo plate.
[실시예 4]Example 4
Fe(CN)6 3-수용액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0, 3 mM K3Fe(CN)6)에 실시예 2에서 반응시킨 올리고 플레이트, 보조 전극 및 기준 전극을 함께 담가 전압을 순환시켜주며(전압: 0.6 ~ -0.5 V, 속도: 100 mV/sec), 각 전압에서의 전류값을 측정하였다.Immerse the oligo plate, auxiliary electrode and reference electrode together in Fe (CN) 6 3- aqueous solution (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0, 3 mM K 3 Fe (CN) 6 ) in Example 2 to circulate the voltage (Voltage: 0.6 ~ -0.5 V, speed: 100 mV / sec), the current value at each voltage was measured.
또한 실시예 3의 올리고 플레이트 역시 상기와 동일하게 순환 전압전류값을 측정하였다.In addition, the oligo plate of Example 3 also measured the cyclic voltammogram value in the same manner as above.
도 6은 순환 전압전류값을 나타낸 그래프로, 6a는 핵산 결합물질을 반응시키기 전의 올리고 플레이트에서 측정한 순환 전압전류이고, 6b는 실시예 3의 올리고 플레이트, 6c는 실시예 2의 올리고 플레이트에서 측정한 순환 전압전류이다.Figure 6 is a graph showing the cyclic voltammetry value, 6a is a cyclic voltammetry measured in the oligo plate before the reaction of the nucleic acid binding material, 6b is measured in the oligo plate of Example 3, 6c is measured in the oligo plate of Example 2 One is cyclic voltammetry.
따라서, 실시예 2의 올리고 플레이트는 핵산 결합물질 반응전(도 6a)에 비해 반응 후(도 6c)에 전류 값의 변화가 나타나 포획 프로브와 목적 프로브간에 혼성화가 나타났음을 알 수 있었고, 실시예 3의 올리고 플레이트에 고정된 포획 프로브는 목적 프로브와 혼성화가 이루어지지 않았음을 알 수 있었다.Accordingly, the oligo plate of Example 2 showed a change in current value after the reaction (FIG. 6C) compared to before the nucleic acid binder reaction (FIG. 6A), indicating that hybridization occurred between the capture probe and the target probe. It was found that the capture probes immobilized on the oligo plate were not hybridized with the target probes.
이러한 결과는 포획 프로브에 대하여 상보성을 가지는 실시예 2의 목적 프로브를 사용하고, 상보성이 없는 실시예 3의 목적 프로브를 사용하여 예측한 혼성화 여부와 동일하였다.These results were the same as the hybridization predicted using the target probe of Example 2 having complementarity to the capture probe and using the target probe of Example 3 without complementarity.
[실시예 5] 아크리딘계 화합물을 이용한 혼성화 검정Example 5 Hybridization Assay Using Acridine Compound
실시예 2와 동일한 방법으로 혼성화가 끝난 올리고 플레이트를 0.5 ~ 5 mM의 SDS, 50 mM 염화나트륨, 10 mM 포스페이트(pH 7.0)를 포함하는 완충용액에 담가 약 10분간 방치하였다. 이후 50 mM 염화나트륨 및 10 mM 포스페이트(pH 7.0) 완충용액으로 세척하고, 1 mg/mL의 3,6-디아미노아크리딘, 50 mM 염화나트륨 및 10 mM 포스페이트(pH 7.0)를 포함하는 용액에 10분간 담구었다.In the same manner as in Example 2, the hybridized oligo plate was immersed in a buffer solution containing 0.5-5 mM SDS, 50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate (pH 7.0) and left for about 10 minutes. Then washed with 50 mM sodium chloride and 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer, and 10 minutes in a solution containing 1 mg / mL of 3,6-diaminoacridine, 50 mM sodium chloride and 10 mM phosphate (pH 7.0) Dipped.
올리고 플레이트는 완충용액(50 mM 염화나트륨, 10 mM phosphate pH 7.0)으로 세척한 다음 순환 전압전류를 측정하였다.Oligo plates were washed with buffer (50 mM sodium chloride, 10 mM phosphate pH 7.0) and then circulating voltammetry was measured.
도 7은 아크리딘계 화합물을 인터칼레이터로 이용하였을 때 혼성화 핵산의 순환 전압전류를 나타낸 그래프이다. 혼성화 핵산에서는 ①의 양상을 나타내었고, 단일가닥 핵산에서는 ②의 양상을 나타내었다.7 is a graph showing the cyclic voltammograms of hybridized nucleic acids when an acridine-based compound is used as an intercalator. The hybridization nucleic acid showed the aspect of ① and the single stranded nucleic acid showed the aspect of ②.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 핵산의 혼성화 형성 유무를 전기화학적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하여 DNA 칩 또는 바이오 칩에서의 검출방법으로 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 간단하고 저가의 비용으로 핵산 혼성화 유무를 검출할 수 있다.As mentioned above, the present invention can be used as a detection method in a DNA chip or a biochip by providing a method capable of electrochemically detecting the presence or absence of hybridization of nucleic acid. In addition, the present invention can detect the presence or absence of nucleic acid hybridization at a simple and low cost.
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