KR100467315B1 - 경쟁 결합을 이용하는 바이오센서와 이를 이용한 글루코스 검출 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

경쟁 결합을 이용한 간접적인 방법으로 글루코스를 검출 및 정량할 수 있는 바이오센서와, 이를 이용한 글루코스 검출 장치 및 방법에 관하여 개시한다. 본 발명에 따른 바이오센서는 기판과, 상기 기판 위에 형성된 금속 박막과, 상기 글루코스와 결합하는 물질인 ABM(Analyte-binding Material)이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질을 포함한다. 예를 들면, 글루코스에 선택적으로 결합되는 단백질과, 이 단백질이 선택적으로 결합 가능한 글루코스 유사 물질이 고정화된 표면을 가지는 바이오센서를 이용하여 글루코스의 양을 측정하는 글루코스 바이오센서 시스템으로 이용될 수 있다.

Description

경쟁 결합을 이용하는 바이오센서와 이를 이용한 글루코스 검출 장치 및 방법 {Biosensor using competitive binding, and kit and method for detecting glucose using the same}
본 발명은 바이오센서와 이를 이용한 신호 검출 장치 및 방법에 관한 것으로, 특히 생체 시료에 있는 특정 물질을 선택적으로 정량 분석할 수 있는 바이오센서와 이를 이용한 글루코스 검출 장치 및 방법에 관한 것이다.
최근, 의약 분야에서 혈액 등과 같은 생체 시료를 분석하기 위하여 바이오센서를 많이 사용하고 있다. 특히, 당뇨병 환자에게 있어서 여러 가지 합병증을 예방하기 위해서 혈당의 지속적인 감시와 유지가 필요하다. 통상적으로, 글루코스 측정용 바이오센서는 글루코스 옥시다제(Glucose Oxidase) 및 퍼옥시다제(Peroxidase)를 이용한 전기화학적 방법을 이용하는 것과, 분광학적 방법인 발색법을 이용하는 것으로 구분할 수 있다. 지금까지 개발된 종래의 바이오센서를 이용한 분석 방법에서는 일회용으로 모세혈관의 피를 채취하여 분석한다. 이러한 분석 방법은 혈당의 연속적인 분석이 어려울 뿐 만 아니라 당뇨병 환자에게 많은 고통을 준다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 최소침습적, 연속 측정용 전기화학적 바이오센서가 개발되었으나, 혈액과 같은 복잡한 물질을 분석하는 데 있어서 여전히 문제점이 남아 있다. 예를 들면, 혈액 내 용존 산소가 분석에 영향을 미치고, 글루코스 옥시다제 효소에 의해 생성되는 과산화수소수(H2O2)가 효소의 촉매 활성을 저해하는 등의 문제점이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 효소 반응이 아닌 글루코스와 선택적인 결합을 하는 단백질을 이용하여 형광, 팽창 압력 등의 측정 방법으로 글루코스의 양을 측정하는 방법이 제안되었다. 그러나, 이 방법에 의한 경우에도 단백질에 형광 물질을 붙이거나 센서 표면에 단백질을 고정화하여 사용하므로 센서를 재사용하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래 기술에서의 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 효소, 단백질 등과 같이 수용액 내에서 안정성이 낮은 물질을 센서 표면에 붙이지 않고, 또한 형광 물질을 사용하지 않음으로써 센서의 재사용이 용이하며, 간단한 구조에 의하여 글루코스를 감도 높게 검출 및 정량할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체 반응을 센서 구조의 광학적 특성을 이용하여 글루코스를 검출 및 정량하는 데 있어서 글루코스를 안정적으로 간편하게 측정할 수 있고 재사용이 가능한 글루코스 검출 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체 반응을 신호화하여 글루코스를 검출 및 정량하는 데 있어서 글루코스를 안정적으로 간편하게 측정할 수 있는 글루코스 검출 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오센서의 구성과, 이를 이용한 글루코스 측정 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 글루코스 검출 장치의 구성을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 글루코스 검출 방법을 설명하기 위한 플로차트이다.
도 4는 콘카나발린 A의 농도가 1.0 mg/mL일 때 글루코스의 양에 따른 표면 플라즈몬 공명각 변화를 본 발명에 따른 글루코스 검출 방법에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 콘카나발린 A의 농도가 2.0 mg/mL일 때 글루코스의 양에 따른 표면 플라즈몬 공명각 변화를 본 발명에 따른 글루코스 검출 방법에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10: 기판, 20: 금속 박막, 22: 크롬 박막, 24: 금 박막, 30: 자기조립 단분자막, 40: 글루코스 유사 물질, 42: 덱스트란, 50: ABM, 52: 콘카나발린 A, 60: 글루코스, 62: 글루코스, 100: 바이오센서, 110: 완충 용액, 120: 유전 매체, 130: 굴절율 매칭 오일, 140: 발광부, 150: 수광부, 200: 글루코스 검출 장치.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 바이오센서는 ABM(Analyte-binding Material)이 선택적으로 결합될 수 있는 글루코스를 검출 및 정량하기 위한 것으로, 기판과, 상기 기판 위에 형성된 금속 박막과, 상기 ABM이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질을 포함한다.
본 발명에 따른 바이오센서에서, 바람직하게는 상기 ABM은 콘카나발린 A (concanavalin A), 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제 (apo-glucose oxidase) 또는 글루코스 디하이드로게나제 (glucose dehydrogenase)로 될 수 있다. 또한, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란(dextran), 아미노페닐 만노우즈(aminophenyl mannose) 또는 아미노페닐 글루코스(aminophenyl glucose)로 될 수 있다. 예를 들면, 상기 ABM은 글루코스 디하이드로게나제이고, 상기 글루코스 유사 물질은 아미노페닐 글루코스로 구성될 수 있다. 다른 예로서, 상기 ABM은 콘카나발린 A (concanavalin A)이고, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스로 구성될 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 ABM은 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제이고, 상기 글루코스 유사 물질은 아미노페닐 글루코스로 구성될 수 있다.
상기 기판은 유리로 이루어지고, 상기 금속 박막은 금 박막을 포함한다. 바람직하게는, 상기 금속 박막은 상기 기판 위에 형성된 크롬 박막과, 상기 크롬 박막 위에 형성된 금 박막으로 이루어진다.
본 발명에 따른 바이오센서는 상기 금속 박막과 상기 글루코스 유사 물질 사이에 개재되어 있는 자기조립 단분자막을 더 포함할 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 생체 시료 검출 장치는 글루코스를 검출 및 정량하기 위하여 사용되는 것으로, 유리 기판의 일면 위에 형성된 금속 박막과, ABM이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질을 포함하는 바이오센서를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 생체 시료 검출 장치에서는 완충 용액이 사용되며, 상기 완충 용액에는 상기 글루코스 및 ABM이 용해된다. 상기 유리 기판의 일면과 반대측인 타면 위에는 유전 매체가 형성된다. 상기 유전 매체와 상기 유리 기판을 광학적으로 결합시키기 위하여 이들 사이에 굴절율 매칭 오일이 개재되어 있다. 발광부에서는 상기 금속 박막의 표면에서 플라즈몬을 여기시켜 공명을 일으키기 위하여 상기 유전 매체를 통하여 상기 유리 기판에 TM-편광된 광을 조사한다. 수광부에서는 상기 유리 기판으로부터 반사되는 광의 세기를 측정한다.
상기 유전 매체는 유리 재질의 반원형 또는 삼각 프리즘으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 발광부는 단색광 레이저, 발광 다이오드 또는 다중 파장 대역의 백색 광원으로 이루어질 수 있다. 그리고, 상기 수광부는 포토다이오드(photodiode),광증폭기(photomultiplier), 촬상 소자(charge coupled device, CCD) 또는 카메라로 이루어질 수 있다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 생체 시료 검출 방법에서는 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하여 액체 샘플중의 글루코스를 검출 및 정량한다. 이를 위하여, 먼저 검출 및 정량 대상의 글루코스와, 상기 글루코스에 선택적으로 결합될 수 있는 ABM이 용해된 완충 용액을 제조한다. 상기 ABM이 상기 글루코스 및 글루코스 유사 물질에 대해 경쟁적으로 결합되도록 유도하기 위하여 상기 글루코스 유사 물질이 고정화되어 있는 상기 금속 박막 위에 상기 완충 용액을 공급한다. 상기 금속 박막 위에서 상기 글루코스 유사 물질에 결합된 ABM의 양을 측정 신호로 변환시킨다. 상기 결합된 ABM의 양으로부터 얻어진 측정 신호로부터 상기 글루코스의 양을 산출한다.
상기 완충 용액을 제조하는 단계에서는 상기 완충 용액 내의 ABM 농도를 조절함으로써 상기 글루코스의 측정 범위를 조절할 수 있다.
또한, 상기 결합된 ABM의 양을 측정 신호로 변환시키는 수단은 표면 플라즈몬 공명 방법, 석영 결정판 미량 천칭(Quartz Crystal Microbalance, QCM), 표면 음파(Surface Acoustic) 또는 전기화학적 방법을 이용할 수 있다. 상기 결합된 ABM의 양을 표면 플라즈몬 공명 방법에 의하여 측정하는 데 있어서, 상기 결합된 ABM의 양은 표면 플라즈몬 공명각의 크기에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 바이오센서는 경쟁적인 결합을 이용한 간접적인 방법으로 글루코스의 양을 측정한다. 이를 이용하면 저분자량의 글루코스의 양을 측정하는 경우에도 그 신호 감도를 증가시킬 수 있으며, 센서 표면을 쉽게 세척하여 사용할 수 있어 바이오센서의 재사용성이 매우 우수하다. 또한, ABM의 양을 조절함으로써 측정 대상인 글루코스의 측정 범위를 간편하게 조절할 수 있다.
다음에, 본 발명의 바람직한 실시예들에 대하여 첨부 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 바이오센서(100)의 구성과, 상기 바이오센서(100)를 이용한 글루코스의 측정 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 바이오센서(100)는 측정 대상의 글루코스(60)와 결합하는 ABM(50)을 이용하여 상기 글루코스(60)를 검출 및 정량하기 위한 것으로, 기판(10)과, 상기 기판(10)의 일면 위에 형성된 금속 박막(20)과, 상기 ABM(50)이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스(60)와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막(20) 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질(40)을 포함한다. 상기 글루코스 유사 물질(40)과 상기 금속 박막(20) 사이에는 자기조립 단분자막(30)이 개재될 수 있다.
상기 ABM(50)은 글루코스와 선택적으로 결합 가능한 단백질로 구성되며, 예를 들면 콘카나발린 A (concanavalin A), 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제 (apo-glucose oxidase) 또는 글루코스 디하이드로게나제 (glucose dehydrogenase)로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 글루코스 유사 물질(40)은 글루코스와 유사한 구조를 가지는 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스로 이루어질 수 있다. 덱스트란은 글루코스가 단량체로 α-1,6 결합을 이룬 고분자로서 콘카나발린 A와 우수한 결합 특성을 나타내며 수용액 내에서 안정성이 높은 물질이다. 덱스트란은 상기 바이오센서(100)의 금속 박막(20) 예를 들면 금 박막 표면에 공유 결합으로 고정화될 수 있다.
상기 바이오센서(100)에 있어서, 상기 ABM(50)은 글루코스 디하이드로게나제이고, 상기 글루코스 유사 물질(40)은 아미노페닐 글루코스로 형성할 수 있다. 또는, 상기 ABM(50)은 콘카나발린 A이고, 상기 글루코스 유사 물질(40)은 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스로 형성할 수 있다. 또 다른 구성으로서, 상기 ABM(50)은 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제이고, 상기 글루코스 유사 물질(40)은 아미노페닐 글루코스로 형성할 수 있다.
상기 바이오센서(100)에 있어서, 상기 기판(10)은 유리로 이루어지며, 상기 금속 박막(20)은 크롬 박막(22)과 금 박막(24)으로 이루어진다. 상기 금속 박막(20)을 구성하는 상기 금 박막(24)은 약 40 ∼ 50 nm의 두께로 형성된다. 상기 크롬 박막(22)은 상기 기판(10)과 상기 금 박막(24)과의 접착력을 좋게 하기 위하여 사용되는 것으로 약 2 ∼ 5nm의 두께로 형성된다.
상기 바이오센서(100)를 사용하여 상기 글루코스(60)를 측정하는 원리를 설명하면 다음과 같다. 측정 대상인 상기 글루코스(60)와, 상기 글루코스(60)에 선택적으로 결합 가능한 ABM인 단백질(50)을 용해시킨 혼합 용액 즉 완충 용액을 상기 글루코스 유사 물질(40)이 고정화된 상기 바이오센서(100) 표면에 흘려주어 결쟁 결합을 유도한다. 그 후, 상기 바이오센서(100)의 표면에서 상기 글루코스 유사 물질(40)에 결합된 단백질(50)의 양을 적절한 방법에 의해 측정하여 변환시키고 이를 근거로 하여 상기 글루코스(60)의 양을 산출한다.
상기 바이오센서(100)는 직접 센서 표면에 결합하는 방법이 아닌 경쟁적인 결합을 이용한 간접적인 방법으로 글루코스의 양을 측정한다. 따라서, 글루코스는 분자량이 높지 않고, 이온성 물질이 아니기 때문에 센서 표면에 직접 결합할 때 신호 감도가 크지 않으므로 상기 바이오센서(100)를 이용하여 측정하는 것이 매우 유리하다. 또한, 상기 바이오센서(100)는 경쟁 결합 방식을 이용하는 것으로서, 센서 표면에 통상적인 바이오센서에서와 같이 단백질이 고정화되어 있는 것이 아니라 글루코스 유사 물질, 예를 들면 글루코스 유사 물질이 고정화되어 있다. 따라서, 세척이 용이하여 재사용성이 우수한 장점이 있다.
상기 바이오센서(100) 표면에서 상기 글루코스 유사 물질(40)과 결합된 단백질(50)의 양을 측정하기 위하여 통상의 바이오센서에 응용되는 다양한 원리들을 이용할 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 글루코스 검출 장치(200)의 구성을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2에는 측정 대상물인 글루코스(62)의 양을 측정하기 위하여, 상기 글루코스(62)와 경쟁하는 글루코스 유사 물질(40)로서 덱스트란(42)이 표면에 고정화되어 있고 상기 글루코스(62)와 선택적으로 결합 가능한 ABM(50)으로서 콘카나발린 A(52)를 사용한 바이오센서(100)를 채용한 글루코스 검출 장치(200)가 도시되어 있다. 상기 글루코스 검출 장치(200)에서는 상기 바이오센서(100) 표면에 고정화된 덱스트란(42)과 결합된 콘카나발린 A(52)의 양을 측정하기 위하여 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR) 방법을 이용한다.
보다 상세히 설명하면, 본 발명에 따른 글루코스 검출 장치(200)는 상기 바이오센서(100)와, 상기 글루코스(62) 및 상기 ABM(50)이 용해된 완충 용액(110)과, 상기 바이오센서(100)의 기판(10)중 상기 금속 박막(20)이 형성된 일면과 반대측인 타면 위에 형성된 유전 매체(dielectric medium)(120)를 포함한다. 상기 유전 매체(120)와 상기 기판(10)을 광학적으로 결합시키기 위하여 이들 사이에는 굴절률 매칭 오일(130)이 개재되어 있다.
또한, 상기 글루코스 검출 장치(200)는 상기 금속 박막(20)의 표면에서 플라즈몬을 여기시켜 공명을 일으키기 위하여 상기 유전 매체(120)를 통하여 상기 기판(10)에 광을 조사하기 위한 발광부(140)와, 상기 기판(10)으로부터 반사되는 광의 세기를 측정하기 위한 수광부(150)를 포함한다.
상기 유전 매체(120)는 상기 발광부(140)로부터의 입사광을 이용하여 상기 금속 박막(20)의 표면 플라즈몬을 여기시키는 역할을 한다. 상기 유전 매체(120)는 유리 재질의 반원형 또는 삼각 프리즘으로 이루어질 수 있다.
상기 발광부(140)는 단색광 레이저, 발광 다이오드(light emitting diode: LED) 또는 다중 파장 대역의 백색 광원으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 발광부(140)로서 830nm 단색광 레이저를 사용한다.
상기 수광부(150)는 상기 기판(10)으로부터 반사된 광의 세기를 측정하는 부분으로서, 예를 들면 포토다이오드(photodiode), 광증폭기(photomultiplier), 촬상 소자(charge coupled device, CCD) 또는 카메라와 같은 이미징 기구(imaging device)로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 수광부(150)는 포토다이오드로 이루어진다.
상기 글루코스 검출 장치(200)에서 이용되는 표면 플라즈몬 공명 방법은 금속 내에 존재하는 표면 플라즈몬의 입사광에 대한 공명 흡수를 이용하여 금속 표면의 굴절률 혹은 그의 변화를 측정하는 것이다. 여기서, 표면 플라즈몬이란 도체 표면을 따라 전파되는 자유 전자의 양자화된 진동을 말하며, 표면 플라즈몬 공명은 입사광이 프리즘과 같은 유전체를 지나 특정 각도로 금속 박막과의 계면과 만났을 때 내부 전반사(total internal reflection)가 일어나지 않고 금속 박막에 의해 흡수되어 금속 표면의 플라즈몬이 여기되는 현상을 일컫는다. 이러한 원리에 의하여 금속 표면에 고정화되어 있는 생체 시료 유사 물질, 예를 들면 덱스트란에 콘카나발린 A가 많이 결합할수록 표면 플라즈몬 공명각은 증가하게 되며, 측정 대상 시료인 글루코스 농도가 높을수록 콘카나발린 A의 결합량은 줄어들어 공명각 증가량은 감소하게 된다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 글루코스 검출 방법을 설명하기 위한 플로차트이다. 본 발명에 따른 글루코스 검출 방법에서는 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한 바와 같은 바이오센서(100) 및 이를 포함하는 글루코스 검출 장치(200)를 이용하여 액체 샘플중의 글루코스를 검출 및 정량한다.
도 3을 참조하면, 먼저 검출 및 정량 대상의 글루코스(60)와, 상기 글루코스(60)에 선택적으로 결합될 수 있는 ABM(50), 예를 들면 콘카나발린 A(52)가 용해된 완충 용액(110)을 제조한다 (단계 310). 상기 완충 용액(110)을 제조하는 데 있어서, 상기 완충 용액(110) 내의 ABM(50) 농도를 조절함으로써 상기 글루코스(60)의 측정 범위를 조절할 수 있다. 그 후, 상기 ABM(50)이 상기 글루코스(60) 및 글루코스 유사 물질(40), 예를 들면 덱스트란(42)에 대해 경쟁적으로 결합되도록 유도하기 위하여 상기 글루코스 유사 물질(40)이 고정화되어 있는 상기 금속 박막(20) 위에 상기 완충 용액(110)을 공급한다 (단계 320). 그 결과, 상기 금속 박막(20)의 표면에서는 상기 글루코스(60) 및 글루코스 유사 물질(40)에 대한 상기 ABM(50)의 경쟁 결합이 이루어진다. 이와 같이 상기 금속 박막(20)의 표면 위에서 상기 글루코스 유사 물질(40)에 결합된 ABM(50)의 양을 측정 신호로 변환시킨다 (단계 330). 상기 결합된 ABM(50)의 양을 측정 신호로 변환시키기 위하여 표면 플라즈몬 공명 방법, 석영 결정판 미량 천칭(Quartz Crystal Microbalance, QCM), 표면 음파(Surface Acoustic) 또는 전기화학적 방법을 이용할 수 있다. 이 때, 상기 결합된 ABM(50)의 양을 표면 플라즈몬 공명 방법에 의하여 측정하는 경우, 상기 결합된 ABM(50)의 양은 표면 플라즈몬 공명 각도의 크기에 따라 결정된다. 상기 결합된 ABM(50)의 양으로부터 얻어진 측정 신호로부터 상기 글루코스(60)의 양을 산출한다 (단계 340).
다음에, 본 발명에 따른 바이오센서 및 글루코스 검출 장치를 제조한 구체적인 실시예들에 의하여 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다음의 구체적인 실시예들은 본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해 제공되는 것으로서 본 발명의 기술적 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
바이오센서 제조
커버 글라스 유리 기판 위에 금속 박막을 전자빔(e-beam) 증착 방법으로 형성시켰다. 이를 위하여, 먼저 금의 접착력을 높이기 위해 상기 유리 기판 위에 2 nm 두께의 크롬 박막을 증착한 후, 그 위에 금 박막을 45 nm의 두께로 증착하였다. 얻어진 금 박막의 표면을 H2SO4/H2O2(3/1) 용액으로 50℃에서 30분 동안 세척한 후, 10 mM의 11-머캅토운데카놀(11-mercaptoundecanol)을 녹인 에탄올 용액에 담궜다. 그 후, 25℃에서 24시간 동안 두었다. 그 후, 금 박막 표면을 에탄올로 세척하고 에탄올 용액 내에서 5분 동안 초음파로 처리하였다. 초음파 처리된 금 박막 표면에 0.6 M의 에피클로로히드린(epichlorohydrin)을 녹인 1:1의 400 mM 수산화나트륨 수용액과 2-메톡시에틸 에테르(2-methoxyethyl ether) 용액을 첨가하여 4시간 동안 상온에 두었다. 얻어진 결과물을 물로 세척하고 에탄올로 세척한 후, 다시 물로 세척하고, 덱스트란을 0.3 g/mL의 농도로 100 mM 수산화나트륨 수용액에 녹인 용액을 세척한 표면에 첨가하여 20시간 동안 상온에 두어 덱스트란이 표면에 공유결합을 이루도록 하였다. 그 후, 물로 세척하고, 글루코스 측정용 바이오센서로 사용하였다.
실시예 2
표면 플라즈몬 공명 실험
도 2에 도시한 바와 같은 글루코스 검출 장치(200)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 실험을 행하였다. 회전판(Rotation Stage)을 이용하여 입사 각도를 변화시키며 발광부(140)로부터 p-편광(p-polarized) 830 nm 단색광 레이저를 유전 매체(120)인 반원형 BK7 프리즘을 통하여 비추고, 굴절률 매칭오일(130)에 의하여 상기 유전 매체(120)에 연결된 유리 기판(10)으로부터 반사된 광량을 수광부(150)인 포토다이오드에서 측정하여, 최소의 광량을 보이는 각도, 즉 표면 플라즈몬 공명각을 찾았다. 바이오센서(100) 표면 위로 일정 속도로 액체 샘플이 흐를 수 있도록 테플론(teflon)으로 제작된 유로를 고무 링으로 금속 박막(20) 표면과 접합되도록 하였으며, 액체 펌프를 이용하여 표면에 덱스트란이 고정화된 상기 금속 박막(20)의 표면에 완충 용액(110) (10 mM 인산, 0.16M 염화나트륨, 0.1% 트리톤(triton X-100), pH 7.3)과 이 완충 용액(110) 내에 소정의 농도로 용해되어 있는 콘카나발린 A 및 글루코스를 약 0.4 mL/min의 속도로 공급하였다.
실시예 3
콘카나발린 A의 센서 표면 흡착 조사
실시예 1에서 얻어진 바이오센서의 표면에 대해 콘카나발린 A의 흡착 특성을 조사하였다. 조사된 흡착용 표면으로서 초기의 금 박막 표면, 11-머캅토운데카놀 자기조립 단분자막 표면, 이 위에 분자량 10,000 Da의 덱스트란 및 분자량 513,000Da의 덱스트란이 각각 공유 결합으로 고정화된 표면을 이용하였다. 이들 표면에 대해 완충 용액을 흘리면서 평형을 잡은 후, 1.0 mg/mL의 콘카나발린 A를 녹인 완충 용액을 10분 동안 흘린 다음, 다시 완충 용액으로 교체하여 흘렸을 때 측정된 표면 플라즈몬 공명 각도의 변화를 측정하였다. 표 1은 각 표면에 대해 콘카나발린 A 용액을 흘린 후 콘카나발린 A가 바이오센서의 표면에 결합된 정도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명각의 증가된 값을 보여주고 있다.
실시예 4
덱스트란 (분자량 513,000 Da)이 고정화된 금 박막 표면에 대한 콘카나발린 A의 흡착 특성 평가
분자량 513,000 Da의 덱스트란이 고정화된 표면에 대하여 콘카나발린 A의 농도를 변화시키며 흡착되는 특성을 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 조사하였다. 실시예 2에서와 같이 얻어진 완충 용액에 다양한 농도의 콘카나발린 A가 용해된 각 용액을 10분 동안 흘린 후 콘카나발린 A가 결합하는 양에 비례하는 표면 플라즈몬 공명각의 증가값을 표 2에 나타내었다.
실시예 5
경쟁 결합에 의한 글루코스 측정 1
1.0 mg/mL의 농도로 콘카나발린 A가 용해된 완충 용액에 글루코스를 다양한 농도로 녹인 후, 덱스트란이 고정화된 바이오센서의 표면에 상기 완충 용액을 흘리면서 표면 플라즈몬 공명각을 측정하였다. 글루코스의 농도를 0 ∼ 12.5 mM의 범위에서 변화시키면서 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 여기서, 바이오센서의 표면은 각각의 측정에서 100mM의 수산화나트륨 수용액으로 세척하여 주었다.
실시예 6
경쟁 결합에 의한 글루코스 측정 2
2.0 mg/mL의 농도로 콘카나발린 A가 용해된 완충 용액에 글루코스를 다양한 농도로 녹인 후, 덱스트란이 고정화된 바이오센서의 표면에 상기 완충 용액을 흘리면서 표면 플라즈몬 공명각을 측정하였다. 글루코스의 농도를 0 ∼ 12.5 mM의 범위에서 변화시키면서 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 여기서, 바이오센서의 표면은 각각의 측정에서 100mM의 수산화나트륨 수용액으로 세척하여 주었다.
본 발명에 따른 바이오센서는 측정 대상의 글루코스와 유사한 물질이 금속 박막의 표면에 고정화되어 이루어진 센서 표면을 가지고 있다. 이와 같은 구성에 의하여 측정 대상의 글루코스와 선택적으로 결합 가능한 ABM을 측정 대상의 글루코스와 함께 센서 표면에 흘려주어 경쟁 반응을 유도하게 된다. 측정 대상의 글루코스로서 분자량이 비교적 높지 않고 이온성 물질이 아닌 글루코스를 측정하는 경우, 글루코스에 선택적으로 결합 가능한 ABM은 바이오센서의 표면에 고정화되어 있는 덱스트란과 같은 글루코스 유사 물질과, 측정 대상인 글루코스와 경쟁적인 결합을 하면서 바이오센서 표면에 결합하게 된다. 이렇게 결합된 ABM의 양을 적절한 방법에 의해 측정 신호로 변환하여 글루코스의 양을 측정하게 된다. 본 발명에 따른 글루코스 검출 방법에 의하여 글루코스의 양을 측정하면, 경쟁적인 결합을 이용한 간접적인 방법으로 글루코스의 양을 측정하게 되므로, 글루코스를 센서 표면에 직접 결합시키는 경우에 비하여 신호 감도를 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이오센서는 ABM으로 통상적으로 쓰이는 단백질을 센서 표면에 고정화하지 않는다. 따라서, 센서 표면을 쉽게 세척하여 사용할 수 있어 바이오센서의 재사용성이 매우 우수하며, 글루코스를 안정적으로 간편하게 측정할 수 있다. 또한, ABM의 양을 조절함으로써 측정 대상인 글루코스의 측정 범위를 간편하게 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 바이오센서를 광섬유 센서로서 구현할 경우 체내 이식용 연속 혈당 측정이 가능하다.
이상, 본 발명을 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러가지 변형이 가능하다.

Claims (21)

  1. ABM (Analyte-binding Material)이 선택적으로 결합될 수 있는 글루코스를 검출 및 정량하기 위한 바이오센서에 있어서,
    기판과,
    상기 기판 위에 형성된 금속 박막과,
    상기 ABM이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 ABM은 콘카나발린 A (concanavalin A), 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제 (apo-glucose oxidase) 또는 글루코스 디하이드로게나제 (glucose dehydrogenase)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 ABM은 글루코스 디하이드로게나제이고, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 제1항에 있어서, 상기 ABM은 콘카나발린 A이고, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  7. 제1항에 있어서, 상기 ABM은 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제이고, 상기 글루코스 유사 물질은 아미노페닐 글루코스인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  8. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  9. 제1항에 있어서, 상기 금속 박막은 금 박막을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  10. 제1항에 있어서, 상기 금속 박막은 상기 기판 위에 형성된 크롬 박막과, 상기 크롬 박막 위에 형성된 금 박막으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  11. 제1항에 있어서, 상기 금속 박막과 상기 글루코스 유사 물질 사이에 개재되어 있는 자기조립 단분자막을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. ABM (Analyte-binding Material)이 선택적으로 결합될 수 있는 글루코스를 검출 및 정량하기 위한 글루코스 검출 장치에 있어서,
    (a) 유리 기판의 일면 위에 형성된 금속 박막과, 상기 ABM이 선택적으로 결합할 수 있도록 상기 글루코스와 유사한 구조를 가지고 상기 금속 박막 위에 고정화되어 있는 글루코스 유사 물질을 포함하는 바이오센서와,
    (b) 상기 글루코스 및 ABM이 용해된 완충 용액과,
    (c) 상기 유리 기판의 일면과 반대측인 타면 위에 형성된 유전 매체와,
    (d) 상기 유전 매체와 상기 유리 기판을 광학적으로 결합시키기 위하여 이들 사이에 개재되어 있는 굴절율 매칭 오일과,
    (e) 상기 금속 박막의 표면에서 플라즈몬을 여기시켜 공명을 일으키기 위하여 상기 유전 매체를 통하여 상기 유리 기판에 광을 조사하기 위한 발광부와,
    (f) 상기 유리 기판으로부터 반사되는 광의 세기를 측정하기 위한 수광부를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 ABM은 콘카나발린 A, 조효소가 제거된 아포글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제인 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  14. 제12항에 있어서, 상기 글루코스 유사 물질은 덱스트란, 아미노페닐 만노우즈 또는 아미노페닐 글루코스인 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  15. 제12항에 있어서, 상기 유전 매체는 유리 재질의 반원형 또는 삼각 프리즘으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  16. 제12항에 있어서, 상기 발광부는 단색광 레이저, 발광 다이오드 또는 다중 파장 대역의 백색 광원으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  17. 제12항에 있어서, 상기 수광부는 포토다이오드(photodiode), 광증폭기(photomultiplier), 촬상 소자(charge coupled device, CCD) 또는 카메라로 이루어지는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 장치.
  18. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 이용하여 액체 샘플중의 글루코스를 검출 및 정량하기 위하여,
    (a) 검출 및 정량 대상의 글루코스와, 상기 글루코스에 선택적으로 결합될 수 있는 ABM이 용해된 완충 용액을 제조하는 단계와,
    (b) 상기 ABM이 상기 글루코스 및 글루코스 유사 물질에 대해 경쟁적으로 결합되도록 유도하기 위하여 상기 글루코스 유사 물질이 고정화되어 있는 상기 금속 박막 위에 상기 완충 용액을 공급하는 단계와,
    (c) 상기 금속 박막 위에서 상기 글루코스 유사 물질에 결합된 ABM의 양을 측정 신호로 변환시키는 단계와,
    (d) 상기 결합된 ABM의 양으로부터 얻어진 측정 신호로부터 상기 글루코스의 양을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 완충 용액을 제조하는 단계는
    상기 완충 용액 내의 ABM 농도를 조절함으로써 상기 글루코스의 측정 범위를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 결합된 ABM의 양을 측정 신호로 변환시키는 단계는 표면 플라즈몬 공명 방법, 석영 결정판 미량 천칭(Quartz Crystal Microbalance, QCM), 표면 음파(Surface Acoustic) 또는 전기화학적 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결합된 ABM의 양은 표면 플라즈몬 공명 방법에 의하여 측정되고, 상기 결합된 ABM의 양은 표면 플라즈몬 공명각의 크기에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 글루코스 검출 방법.
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