KR100464831B1

KR100464831B1 - 트레할룰로오스함유당조성물,그제조방법및용도

Info

Publication number: KR100464831B1
Application number: KR1019970007144A
Authority: KR
Inventors: 도오유키 니시모토; 히로토 차엔; 시게하루 후쿠다; 도시오 미야케
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2005-05-19
Also published as: DE69731016T2; US6294360B1; DE69731016D1; KR970065725A; EP0794259B1; TW482656B; EP0794259A2; US5824521A; EP0794259A3

Abstract

말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시켜 트레할룰로오스를 생성시키고, 수득한 트레할룰로오스 함유 혼합물을 채취하여 수득되는 트레할룰로오스 함유 당조성물. 이 효소는 수크로오스를 트레할룰로오스로 비교적 높은 수율로 변환시키며 그 변환율은 조절할 수 있기 때문에 트레할룰로오스 고함유 당조성물을 공업적 규모로 쉽사리 제조할 수 있다.

Description

트레할룰로오스 함유 당 조성물, 그 제조방법 및 용도

본 발명은 트레할룰로오스(trehalulose)를 함유한 당조성물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시켜 수득한 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물과, 말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시켜 트레할룰로오스를 생성시키는 단계를 포함하는 당조성물의 제조방법 및 이 당조성물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

글루코오스와 프룩토오스로 구성된 이당인 트레할룰로오스는 화학식 1-O-α-D-글루코피라노실-D-프룩토오스로 나타내어지는 환원당이다. 자연계에서는 꿀에 극소량의 트레할룰로오스가 함유되어 있을 뿐이다. 트레할룰로오스는 물에 쉽사리 용해하고, 실질적으로 충치 유발성이 없으며, 수크로오스의 약 40%의 감미력을 가지고 있는 비결정질 당질이므로 음식물, 특히 잼, "안<an>"(팥잼) 및 단맛의 팥잴리 등의 감미료로 강화된 식품에 사용되는 것이 크게 기대되고 있다.

문헌 [Seito-Gijutsu-kenkyu-kaishi, Vol, 34, PP. 37∼44 (1985)]에 기재된 바에 의하면 당 전이 활성을 가진 프로타미노박터 루브룸(Protaminobacter rubrum)유래의 α -글루코시다아제를 사용하는 방법에 의해 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 제조하는 것이 공지되어 있다.

이러한 효소반응에 있어서 트레할룰로오스는 결정질 팔라티노오스를 부생물로서 또는 6-O-α -D-글루코피라노실-D-프룩토오스를 주생성물로서 산생한다.

일본국 특허공개 제169,190/92호에 개시된 슈우도모나스 메소아시도필라(Pseudomonas mesoacidophilla) MX-45의 고정화 균체 또는 일본국 특허공개 제 130,886/93호에 개시된 아그로박테륨 라디오박터(Agrobacterium radiobacter)MX-232의 고정화 균체를 사용하여 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 생성하는 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물의 제조방법이 제안되어 있기는 하지만 이들의 효소활성과 열적 안정성이 불충분하므로 공업적 규모로 실제로 사용되지 않고 있다.

본 발명은 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 공업적 규모로 고수율로 용이하게 제조할 수 있는 트레할룰로오스의 제조방법과, 이 방법으로 제조한 트레할룰로오스를 함유한 당조성물 및 그 용도를 제공한다.

본 발명자들은 트레할룰로오스의 제조방법에 대해 예의 연구를 한 결과, 본 발명자들이 출원한 일본국 특허공개 제 170,977/95호에 개시된 말토오스/트레할로오스 변환효소가 말토오스를 트레할로오스로 변환시키며 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 고수율로 용이하게 산생함을 뜻밖에 발견하여, 말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물의 제조방법을 확립함과 아울러 이 방법으로 수득한 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물과, 이 당조성물을 함유하는 식품, 화장품 또는 의약품 형태의 조성물을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 말토오스/트레할로오스 변환효소는 일본국 특허 공개 제170,977/95호 공보에 개시된 피멜로박터(Pimelobacter) sp. R48(FERM BP-4315) 및 슈우도모나스 푸티다(Pseudomonas Putida) H262 (FERM BP-4579)에 속하는 미생물과 테르무스(Thermus)속에 속하는 미생물에 의해 생성되는 분자내 당전이 효소인데 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 변환시킨다. 예컨대 이들 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가지고 있다.

(1) 작용

말토오스를 트레할로오스로, 트레할로오스를 말토오스로 변환함.

(2) 분자량

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 약 57,000∼120,000 달톤.

(3) 등전점 (pI)

앰폴라이트를 사용한 등전점 전기영동에서 약 3.8∼5.1

(4) 활성저해

1 mM의 Cu^＋＋, Hg^＋＋ 및 Tris-HCl 완충액에 의해 억제됨.

(5) 기원

미생물 유래

말토오스/트레할로오스 변환효소의 반응계의 평형점은 트레할로오스 생성쪽으로 기울어지며, 트레할로오스 수율은 말토오스를 기질로 사용하면 약 80 w/w%(이하, 별달리 명시하지 않는한 "w/w%"를 간단히 "%"로 표시함)까지 증가한다.

상기한 미생물외에 말토오스/트레할로오스 변환효소를 산생하며 피멜로박터, 슈우도모나스 및 테르무스속의 미생물에 속하는 기타 균주와 돌연변이체를 선택적으로 사용할 수 있다.

테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) ATCC 25104, 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 27634, 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 33923, 테르무스 필리포르미스(Thermus filiformis) ATCC 43280, 테르무스 루버(Thermus ruber) ATCC 35948, 테르무스 sp. ATCC 43814 및 테르무스 sp. ATCC 43815 등의 테르무스속 미생물을 임의로 사용할 수 있다.

미생물이 생장할 수 있고 말토오스/트레할로오스 변환효소를 생성할 수 있는 것이면 위에 나온 미생물 배양용의 합성 및 천연 영양배지의 어떠한 배지라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 탄소원은 미생물이 이용할 수 있는 것이면 모두 포함되는데, 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 당밀, 트레할로오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨 및 전분 부분 분해물 등의 당류와, 시트르산, 숙신산 등의 유기산 및 이들의 염을 사용할 수 있다. 영양 배지중의 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택되는데, 글루코오스를 탄소원으로 사용할 경우에는 바람직한 농도는 40 w/w% 이하이고, 특히 10 w/w% 이하의 농도이면 미생물의 생육의 관점에서 적절히 사용할 수 있다. 암모늄염 및 질산염 등의 무기질소 화합물 및 우레아, 코온 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스 및 육 엑스 등의 유기질소 함유 물질을 본 발명에서 질소원으로서 사용할 수 있다.

칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 코발트염 등을 무기 성분으로서 선택적으로 사용할 수 있다.

미생물 배양조건은 미생물이 생육하여 말토오스/트레할로오스 변환효소를 생성하는 조건을 이용한다. 통상적으로 미생물을 약 4∼80℃, 바람직하게는 20∼75℃의 온도 및 pH 5∼9, 바람직하게는 pH 6∼8.5 에서 호기성 조건하에서 배양한다. 바람직한 배양시간은 미생물이 생육할 수 있는 시간, 바람직하게는 약 10∼100 시간 정도로 설정한다. 용존 산소(DO)의 농도는 특히 한정되는 것은 아니나 통상적으로 약 0.5∼20 ppm 으로 설정하는 것이 좋다 DO 는 통기 및 교반비를 조절하고 산소를 공급하며, 발효조의 내압을 증가시킴으로써 상기 범위내로 유지한다. 본 발명에서는 뱃치식(bath-wise) 배양방법 및 연속식 배양방법을 사용할 수 있다.

미생물의 배양을 완료한 후 소요의 효소를 배양물로 부터 채취한다. 말토오스/트레할로오스 변환효소의 활성은 균체내 및 균체외에서 발견되므로 균체외 배양물과 이들 균체를 조효소(crude enzyme)로서 회수한다. 배양물을 그대로 조효소로서 사용할 수도 있다. 배양물을 균체와 균체외 배양물로 분리하는 방법의 예로서는 종래의 고액상(固液相) 분리법이 포함된다. 예컨대 미정제 배양물을 분리하는 원심분리법, 배양물에 여과조제를 첨가하거나 미정제 배양물을 프리코우트 필터로써 처리하는 단계를 포함하는 여과법 및 평필터 및 중공사(hollow fiber)를 사용하는 막여과법 등이 있다. 균체외 배양물을 조효소로 사용할 수 있는데, 바람직하게는 이들을 종래의 방법으로 농축한후 사용한다. 예컨대 황산 암모늄을 사용하는 염석법, 아세톤과 알코올을 사용하는 침전법 및 평필터 및 중공사 등의 막필터를 사용하는 농축법을 이러한 목적으로 사용할 수 있다.

종래방법으로 균체로 부터 추출한 후 균체내 효소를 조효소로서 사용할 수 있다. 예컨대 초음파 또는 프렌치 프레스를 사용하는 파쇄법 또는 유리 비이드와 알루미나를 사용하는 기계적 파쇄법으로 균체로 부터 효소를 추출하여 이 추출물을 원심분리법이나 막여과법으로 처리함으로써 투명한 조효소를 얻을 수 있다.

균체외 배양물, 이들의 농축물 및 균체로 부터의 추출물을 종래 방식으로 고정화한다. 예컨대 이온교환 수지에의 결합법, 이들 수지와 막에의 공유결합 및 흡착법 및 고분자량 물질을 사용하는 포괄법을 사용할 수 있다. 배양물로 부터 분리된 균체를 조효소로 사용할 수 있다 하더라도 이들 균체를 고정화하여, 예컨대 이들 균체에 알긴산 나트륨을 혼합하고, 이 혼합물을 염화 칼슘 용액중에 적하하여 겔화함으로써 균체과립을 형성한 후 이들 과립을 폴리(에틸렌이민) 및 글루타르알데히드로 처리하여 고정화 효소를 얻을 수 있다.

이 조효소를 더 처리함이 없이 그대로 사용하거나 종래방법으로 정제할 수 있다. 예컨대 파쇄된 균체로 부터 추출물을 황산 암모늄으로 염석하고, 수득물을 농축한 다음 농축물을 투석한 후, "DEAE-TOYOPEARL"을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "BUTYL-TOYOPEARL"을 사용하는 소수 칼럼 크로마토그래피, "MONO Q HR5/5" 수지를 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 "TOYOPEARL HW-55"을 사용하는 겔 여과 칼럼 크로마토그래피의 순서로 계속하여 처리함으로써 전기 영동적으로 만일의 효소를 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용되는 말토오스/트레할로오스 변환효소의 활성을 다음과 같이 측정한다. 즉, 기질인 말토오스를 20 w/v% 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0) 1 ml에 효소액 1 ml을 가하고, 이 혼합물을 25℃, 35℃ 또는 60℃에서 60분간 반응시킨 후, 이 반응 혼합물을 100℃에서 10분간 가열하여 효소반응을 정지시킨다. 이 반응 혼합물을 50 mM 인산 완충액 (pH 7.5)으로 정확히 11배로 희석하고, 이 회석액 0.4 ml에 트레할라아제를 1 단위/ml 함유한 용액 0.1 ml을 가하고 45℃에서 120분간 인큐베이트한 다음, 반응물중의 글루코오스 함유량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량한다. 대조로서 100℃에서 10분간 가열하여 미리 실활해 둔 효소액과 트레할라아제를 사용하여 위와 마찬가지로 글루코오스 함유량을 측정한다. 상기 분석에서 글루코오스 증가량에 대해 말토오스/트레할로오스 변환효소에 의해 생성된 트레할로오스의 함유량을 측정한다. 말토오스/트레할로오스 변환효소 활성 1 단위는 1분당 1 μ mole의 트레할로오스를 생성하는 양으로 정의된다. 피멜로박터, 슈우도모나스 및 테르무스속에 속하는 미생물 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소의 반응온도는 각각 25℃, 35℃ 및 60℃이었다.

본 발명에서 사용되는 말토오스/트레할로오스 변환효소의 기질농도는 특히 한정되는 것은 아니다. 이들 효소는 기질인 0.1 w/v% 또는 50 w/v%의 수크로오스 용액에 작용시킬 경우에도 반응하여 트레할룰로오스를 생성한다. 기질농도가 상당히 높거나 미용해 기질이 있는 용액도 본 발명에서 사용할 수 있다. 예컨대 바람직한 반응온도는 효소를 실활하지 않는 온도, 특히 약 80℃ 이하의 온도, 바람직하게는 약 0∼70℃의 범위내의 온도이다. 보다 상세하게는 테르무스속 미생물 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소는 약 30∼50℃의 온도에서 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 다량 생성한다. 반응 pH를 통상적으로 약 5.5∼9.0으로 설정하는데, 바람직하게는 pH 약 6.0∼8.5로 설정한다. 반응시간은 효소반응 조건을 관찰하면서 선택되는데, 통상적으로 고형물당 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물 기준으로 기질 1 g 당 약 10∼1,000단위 사용할 경우에는 약 0.1∼200시간에서 선택된다.

이렇게 하여 수득한 반응 혼합물중의 트레할룰로오스 함유량은 통상적으로 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상이고, 최고의 함유량은 약 80% 이다.

이렇게 하여 수득한 반응 혼합물을 여과 및 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 활성탄으로 탈색하여 H형 및 OH형 이온 교환수지로 발염한 후 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 필요에 따라 이 농축물을 다시 건조하여 분말상 제품으로 할 수 있다.

필요한 경우에는 시럽상 제품과 분말상 제품을 더욱 정제한다. 예컨대 이들 제품을 이온교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄을 사용하는 칼럼 크로마토그래피 및/또는 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 고순도 트레할룰로오스 함유의 제품으로 쉽사리 정제할 수 있다. 이들 칼럼 크로마토그래피로 분리된 수크로오스를 말토오스/트레할로오스 변환효소용 기질로 다시 사용하여 트레할룰로오스를 생성시킬 수 있다.

필요한 경우, 트레할룰로오스를 함유하는 본 발명의 당조성물을 인베르타아제로 가수분해하거나 이들에 대해 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라아제 또는 글루코실트란스페라아제를 작용시켜 당 전이 반응을 시킴으로써 그 감미도와 점도를 조절할 수 있다. 이 당조성물을 효모로 더 처리하여 발효성 당질을 제거할 수 있다. 수득한 생성물을 이온교환 칼럼 크로마토그래피 등의 상기한 정제법으로 처리하여 글루코오스와 프룩토오스를 제거함으로써 트레할룰로오스 고함유 제품을 얻은 다음, 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 필요에 따라 이 시럽상 제품을 건조하여 분말상 제품으로 하는 것도 마음데로이다.

본 발명에서 사용하는 이온교환 칼럼 크로마토그래피로서는 일본국 특허공개 제23,799/83호 및 제72,598/83호 공보에 개시된 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피가 포함되는데, 이들 방법에 의해 협잡 당류를 제거하여 트레할룰로오스 고함유 획분을 얻는다. 이러한 칼럼 크로마토그래피에 있어서 고정상(fixed-bed)방법, 이동상(moving-bed)방법 및 의사 이동상(quasi-moving-bed)방법을 선택적으로 사용할 수 있다.

이렇게 하여 수득한 본 발명의 트레할룰로오스 함유 당질은 비교적 물에 대한 용해도가 높고 높은 품질 및 맛있는 감미를 가지고 있다. 트레할룰로오스는 장내 히드롤라아제(intestinal hydrolase)에 의해 가수분해되어 글루코오스와 프룩토오스를 생성하므로 경구투여하면 생체에 용이하게 동화, 흡수되어 에너지원으로 이용된다. 트레할룰로오스는 충치 유발균에 의해 실질적으로 발효되지 않고 이러한 미생물에 의해 수크로오스로 부터의 불용성 글루칸 합성에 저해효과를 나타내므로 비(非)충치유발성 감미료로 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 당조성물은 음식물, 기호물, 사료, 이료, 화장품 및 의약품 등의 각종 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 품질 개선제 또는 안정제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 당조성물을 그대로 감미용 조미료로 사용할 수 있고, 필요한 경우에는 이 당조성물을 기타 감미제, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α -글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알리닌 등의 1종 이상의 감미료 적당량 및/또는 덱스트린, 전분 및 락토오스 등의 증량제와 더불어 사용할 수 있다.

본 발명의 당조성물의 맛은 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 단맛, 쓴맛 등의 다른 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 비교적 높은 내산성과 열적 안정성을 가지므로 일반 음식물에 있어서 감미료, 맛 개량제 및 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 당조성물은 예컨대 간장, 분말 간장, 미소 (된장), 훈마츠 미소 (분말 된장), 모로미 (정제술), 히시오 (정제 간장), 후리카케 (어육 조미품), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주 (설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 훈마츠 스시수 (초밥용 분말 식초), 츄가 노 모토 (중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유 (일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유 (일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 타쿠앙 즈케 노 모토(일본 무우의 인스탄트 믹스), 하쿠사이 즈케 노 모토 (배추 겉절임용 인스탄트 믹스), 야구니쿠 노 타레 (일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토 (인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린 (감미나는 술), 신미린 (합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등에 대한 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 당조성물은 예컨대 센베이 (쌀 크래커), 아라레 (입방체의 쌀떡), 오코시 (기장과 쌀로 된 케이크), 모치(쌀풀), 만주 (팥 잼 넣은 만두), 우이로 (단맛의 젤리), 안 (팥 잼), 요캉 (단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉 (연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠 )요캉의 일종), 젤리, 파오 드 카스텔라, 아메다마 (일본식 토피) 등의 각종 일본식 과자; 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉검, 카라멜, 캔디 등의 양과자; 아이스 크리임, 셔어벳 등의 빙과류; 카지츠 노 시럽 츠케 (과실의 시럽 절임), 코리미츠 (빙수용 설탕 시럽) 등의 시럽류; 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류; 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케 (과실 피클류), 토카 (당과) 등의 과실과 야채의 가공 식품류; 푸쿠진 즈케 (적색의 무우 피클), 베타라 즈케 (통무우 피클의 일종), 센마이 즈케 (갖썰은 무우 절임의 일종), 라쿄 즈케 (파 절임) 등의 절임 및 절임 제품류 ; 햄, 소오세지 등의 축육 제품류; 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와 (어묵의 일종), 튀김 등의 어육제품류; 성게 내장젓, 오징어전, 가공된 다시마, 말린 오징어 채, 미린으로 조미된 말린 복어 등의 각종 진미류; 김, 산채, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개 등으로 제조되는 츠쿠다니류 (간장에 끓인 음식), 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시마 말이 등의 평상시 식품; 우유 제품, 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림; 술, 합성주, 와인, 양주, 소주 등의 주류; 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수; 푸딩 믹스, 핫 케이크 믹스, 즉석 시루코 (아즈키팥 수우프에 떡을 혼합한 안스탄트 믹스), 즉석 수우프 믹스 등의 즉석 식품; 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제 등의 각종 음식물에의 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.

그리고 본 발명의 당조성물은 가축, 가금, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성의 향상 혹은 비육향상의 목적으로 사용할 수도 있다.

그 외에 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복약, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제 등의 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로서 기호물, 화장품, 의약품 등, 각종 조성물에의 감미제, 맛 개량제, 교미제로서, 더욱이 는 품질 개량로서 유리하게 사용할 수 있다.

그리고 상기한 조성물에 본 발명의 당조성물을 함유시키는 방법은, 예를 들자면 혼합, 반죽, 용해, 용융, 침지, 침투, 살포, 도포, 분무, 주입, 결정화 및 고화 등의 공지의 방법을 포함한다. 본 발명의 당조성물을 상기한 조성물들에 함유시키는 양은 일반적으로 트레할룰로오스로서 고형물 기준으로 0.1％ 이상, 바람직하게는 1％ 이상이다. 이어서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

실험 1 : 효소제조

폴리펩톤 0.5 w/v%, 효모엑스 0.1 w/v%, 질산 나트륨 0.07 w/v%, 인산수소 2 나트륨 0.01 w/v%, 황산 마그네슘 0.01 w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지를 pH 7.5 로 조정하고, 이 배지를 100 ml 씩을 취하여 500 ml 삼각 플라스크에 넣은 다음 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리하여 냉각하고 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 33923 모배양액을 접종한 후 60℃에서 24시간 동안 200 rpm의 진탕조건하에 배양하여 종배양액을 얻었다.

위에서 사용한 것과 동일한 신선한 액상의 영양배지 약 20 리터씩을 취해 30 리터 발효조 두개에 넣고 가열멸균한 후 60℃로 냉각하고 종배양액 1 v/v%로 접종한 다음 60℃ 및 pH 6.5∼8.0에서 교반 통기조건하에 약 20시간 배양하였다.

실험 2 : 효소정제

실험 1에서 얻은 배양액을 원심분리하여 습균체 약 0.28 kg을 얻고, 이 균체를 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)중에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 1.9 리터를 "MODEL US300" (일본국의 Nihonseiki kaisha 판매의 초음파 파쇄기)로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 혼합물을 15,000 G에서 30분간 원심분리하여 상청액 약 1.8 리터를 얻은 후, 여기에 포화도 0.7이 되도록 황산 암모늄을 가하여 용해한 다음 4℃에서 하룻밤 방치하여 침전을 생성시키고, 원심분리하여 이 침전물을 채취 하였다. 이 침전물을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)중에 용해하고 신선한 동일 완충액에 대해 24시간 투석한 후, 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 투석액 1,560 ml을 3부분으로 나눈 다음 "DEAE-TOYOPEARL 650" (일본국의 Tosoh사 판매의 겔) 530 ml을 사용하는 이온교환 칼럼 크로마토그래피로 각각 처리하였다.

겔에 흡착된 말토오스/트레할로오스 변환효소를 식염을 함유한 동일한 신선한 완충액으로 칼럼으로 부터 용출하였다. 효소활성을 가진 이 용출액을 회수하여 한데 모아 "BUTYL-TOYOPEARL 650" (일본국의 Tosoh사 판매의 겔) 380 ml 충전 칼럼을 사용하여 소수 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 겔에 흡착된 말토오스/트레할로오스 변환효소를 1 M로 부터 0 M로 감소하는 황산 암모늄 함유의 직선 기울기 용액으로 칼럼으로 부터 용출한 다음 효소활성 획분을 회수하였다.

이들 획분을 한데모아 "TOYOPEARL HW-55S" (일본국의 Tosoh사 판매의 겔)380 ml을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피 처리한 다음 효소활성 획분을 회수하였다.

이들 획분을 한데 모아 "MONO Q HR5/5" (스웨덴국의 Pharmacia LKB Technology AB 판매의 겔) 1.0 ml을 사용하여 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리한 다음 0.1 M로 부터 0.35 M로 증가하는 직선 기울기의 식염용액을 컬럼에 공급하여 효소활성 획분을 회수하였다. 따라서 전기영동적으로 단일 단백질 밴드를 가진 말토오스/트레할로오스 변환효소를 얻었다. 이 효소의 비활성(比活性)은 135 단위/mg 단백질이었다.

실험 3 : 당류에 대한 작용

고형물 기준으로 당 1 g에 대해 말토오스/트레할로오스 변환효소 50단위를 당류에 작용시켜 이들 당류를 효소의 기질로 사용할 수 있는가의 여부를 점검하였다. 이러한 목적으로 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 트레할로오스, 네오트레할로오스, 코지비오스, 이소말토오스, 말티톨, 셀로비오스, 겐티오비오스, 수크로오스, 트레할룰로오스, 투라노오스, 말툴로오스, 팔라티오노오스 또는 락토오스를 최종농도 5 w/v%의 용액으로 제조하였다.

각 용액에 실험 2의 방법으로 제조한 효소를 고형물당 기질 1 g에 대해 50 단위 가하고 50℃ 및 pH 7,0에서 48시간 동안 효소반응시켰다. 효소반응 전후의 반응 혼합물을 샘플링하여 "KIESEL GEL 60" (미합중국의 Merck사 판매의 20× 20 cm 알루미늄판)을 사용하는 박층 크로마토그래피 (이하, 간단히 "TLC"라 함)용의 판위에 각 샘플을 채취함으로써 당류에 대한 효소의 작용여부를 점검하였다.

이 TLC에 있어서 1-부탄올, 피리딘 및 물로 된 용매계 (체적비로 6 : 4 : 1)를 사용하였고, 각 샘플을 1회 전개하였다. 메탄올중의 20 v/v% 황산을 판에 분무하고 이들 판을 110℃에서 10분간 가열함으로써 발색시켰다. 효소반응 생성물을 검출한 반응 혼합물에 대해 가스 크로마토그래피 (이하, 간단히 "GLC"라 함)로 당조성을 분석하였다. 반응 혼합물을 샘플링하여 건조하고, 피리딘에 용해하여 옥심으로 한 후 트리메틸실릴화한 것을 사용하여 분석하였다. 이 실험에 사용된 가스 크로마토그래피 및 조건은 일본국의 Shimadzu사 판매의 "GC-16A"를 사용하여 아래의 조건에 따라 하였다.

스테인레스 스틸 칼럼 : 직경 3 mm, 길이 2 m, "OV-17/CHROMOSOLVE W" 2% 충전, (일본국의 GL Sciences사 판매의 칼럼);

운반가스인 질소가스의 유속 : 40 ml/min;

칼럼 오븐 온도 : 160∼320 ℃;

승온 속도 : 7.5 ℃/min;

검출기 : 수소염 이온화 검출기.

그 결과는 표 1에 나와 있다.

[표 1]

주 : "효소의 작용"란에서 "-"는 효소 반응 전후에 변화 없음, "+'은 기질이 감소하고 생성물 수득율이 25% 미만, "++"는 기질이 감소하고 생성물 수득율이 25% 이상∼75% 미만, "+++"는 기질이 감소하고 생성물 수득율이 75% 이상인 것을 각각 나타냄.

표 1의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 말토오스/트레할로오스 변환효소가 말토오스와 트레할로오스 뿐만아니라 시험에 사용된 당류중에서도 네오트레할로오스, 수크로오스, 트레할룰로오스, 투라노오스, 말툴로오스 및 팔라티노오스, 특히 수크로오스에 작용한다는 뜻밖의 사실을 판명하였다.

실험 4: 효소반응 생성물

실험 4-1: 수크로오스부터의 생성물

기질 고형물 1 g당 실험 2에서 얻은 말토오스/트레할로오스 변환효소 100단위를 최종농도 10w/v%의 수크로오스 수용액에 가하고, 이 혼합물을 50℃ 및 pH 6.5에서 48시간 동안 효소 반응시켰다. 이 반응 혼합물의 조성을 실험 3에서와 마찬가지로 GLC로 분석하였다. 그 실체를 확인하고자 옥심으로 변환되지 아니한 트리메틸실릴화 유도체를 분석용 샘플로 사용하였다. 그 결과는 표 2에 나와 있다.

[표 2]

(주) : 표에서 "A" 및 "B"는 각각 "반응 혼합물" 및 "표준당"을 나타냄.

표 2의 결과로 부터 명백한 바와 같이 미지의 물질 "X"가 수크로오스로 부터 상당량 생성되었고, 옥심으로의 변환전후의 물질 "X"의 트리메틸실릴화 유도체의 체류시간은 트레할룰로오스의 경우와 일치함을 알 수 있다. 물질 "X"을 확인하고자 실험 8에서 제조한 트레할룰로오스 함유의 고순도 분말을 사용하여 아래의 확인 시험을 하였다.

(1) 구성당

0.5 N 황산에 의한 물질 "X"의 가수분해후에 생성된 생성물을 GLC 분석하여 원래의 물질 "X"이외에 글루코오스와 프룩토오스가 1 : 0.83의 몰비로 검출되었음.

산에 대한 헥소오스와 케토오스의 안정성을 고려하여 물질 "X"는 글루코오스와 프룩토오스가 등몰량으로 구성되어 있음을 판명할 수 있음.

(2) 효소에 의한 가수분해

효모로 부터의 인베르타아제에 의해 가수분해되지 않음.

효모로 부터의 α -글루코시다아제에 의해 가수분해되어 글루코오스와 프룩토오스를 1 : 1의 등몰비로 생성함.

(3) 질량

FD-MS 분석에서 342

(4) 비선광도

[α ]D²⁰+57.7˚ (H₂O, c = 5)

표준 트레할룰로오스의 경우 :

[α ]D²⁰+57.1˚ (H₂O, c = 5)

물질 "X"가 글루코오스와 프룩토오스로 구성된 이당이고 기타의 성질은 표준 트레할룰로오스의 경우와 일치한다는 사실에 근거하여 이 물질은 트레할룰로오스, 즉 1-O-α -D-글루코피라노실-D-프룩토오스임을 판명할 수 있다. GLC 분석시의 체류시간과 표준제제의 체류시간의 비교에서 말토오스/트레할로오스 변환효소에 의한 가수분해후의 수크로오스로 부터 생성된 기타 부성분들은 팔라티노오스와 투라노오스임이 확인되었다. 이들 결과로 부터 명백한 바와 같이 말토오스/트레할로오스 변환 효소에 의해 말토오스가 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스가 말토오스로 변환되고, 또한 수크로오스가 트레할룰로오스로 변환된다. 이 효소는 실질적으로 트레할룰로오스를 수크로오스 변환하지 않았다.

실험 4-2 : 수크로오스로 부터의 생성물중의 당조성

실험 2의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환효소 약 330단위/g을 최종농도 10 w/v%의 수크로오스 수용액에 가하고, 이 혼합물을 40∼70℃ 및 pH 6.5에서 30분간 효소반응시켰다. 이어서, 이 반응 혼합물의 당조성을 실험 3에서와 마찬가지로 GLC로 분석하였다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.

[표 3]

표 3의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명에서 사용된 말토오스/트레할로오스 변환효소는 고형물당 트레할룰로오스를 약 45∼80% 함유하는 당조성물을 생성하였다. 트레할룰로오스 수율은 온도 감소에 따라 증가한 반면 온도증가에 따라 감소하였다. 이 효소의 특징은 트레할로오스 : 팔라티노오스의 비가 높고, 즉 트레할룰로오스/팔라티노오스의 비가 14 이상이고, 고형물당 팔라티노오스 함유량이 불과 4% 이하인 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물을 생성한다는데 있다. 이 효소를 사용하여 생성시킨 트레할룰로오스를 함유한 본 발명의 당조성물은 종래의 효소를 사용하여 생성시킨 트레할룰로오스를 함유한 종래의 당조성물과는 트레할룰로오스/팔라티노오스의 비율과 팔라티노오스 함유량에 있어서 분명히 다르다.

실험 5 : 효소량이 트레할룰로오스 생성에 미치는 영향

10% 수크로오스 용액에 실험 2의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 2, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200단위가하고, 이 혼합물을 40℃ 및 pH 6.5에서 효소반응시키면서 일정한 시간 간격마다 반응 혼합물을 샘플링하였다. 각 샘플을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존효소를 실활시키고 실험 3과 마찬가지로 GLC로 분석하였다. 각 체류시간에서의 효소 사용량과 반응 혼합물 중의 트레할룰로오스 함량은 표 4에 나와 있다.

[표 4]

표 4로 부터 명백한 바와 같이 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 효소를 10단위의 양으로 가하면 트레할룰로오스를 10% 이상의 수율로 생성하였고, 수크로오스 1 g당 효소를 100단위 이상 가하면 트레할룰로오스를 80% 이상의 수율로 생성하였다. 이 효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 10단위로 가하더라도 이 효소를 기질에 장시간 작용시킬 경우에는 트레할룰로오스를 30% 이상의 수율로 생성한다고 추정할 수 있다.

실험 6 : 수크로오스 농도가 트레할룰로오스 생성에 미치는 영향

실험 2의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 100단위의 양으로 하여 수크로오스를 2.5%, 5%, 10%, 20% 또는 40% 함유한 용액에 작용시키고, 이 혼합물을 40℃ 및 pH 6.5에서 96시간 효소 반응시킨 다음 100℃에서 10분간 가열하여 잔존효소를 실활시켰다. 각 반응 혼합물의 당조성을 실험 3과 마찬가지로 GLC로 분석하였다. 그 결과는 표 5에 나와 있다.

[표 5]

표 5의 결과로 부터 명백한 바와 같이 수크로오스로 부터의 트레할룰로오스의 수율은 2.5％ 수크로오스 용액의 경우이더라도 70％ 이상이었다. 수크로오스 농도가 높을수록 효소반응은 많이 진행한다. 효소를 10% 이상의 수크로오스 용액에 작용시킬 경우 트레할룰로오스 수율은 약 80%이었다.

실험 7 : 온도가 트레할룰로오스 생성에 미치는 영향

10% 수크로오스 용액을 pH 6.5로 조정하고, 여기에 실험 2의 방법으로 제조한 정제 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 100 단위의 양으로 가하고, 이 혼합물을 20˚ , 30˚ , 40˚ , 50˚ 또는 60℃에서 효소반응시키면서 일정시간 간격마다 샘플링하였다. 각 샘플을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존효소를 실활하고, 각 반응 혼합물중의 당조성을 실험 3과 마찬가지로 GLC로 분석하였다. 각기 상이한 반응 시간과 온도에서의 각 반응 혼합물중의 트레할룰로오스 함량은 표 6에 나와 있다.

[표 6]

표 6의 결과로 부터 명백한 바와 같이 이 효소는 약 30∼50℃에서 반응시킬 경우 트레할룰로오스를 약 70% 이상의 고수율로 생성하였다.

실험 8 : 수크로오스로 부터 트레할룰로오스의 제조

수크로오스 10 중량부를 물 40 중량부에 용해하고, 여기에 실험 2의 방법으로 제조한 정제 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 100 단위의 양으로 가한 다음, 40℃ 및 pH 6.5에서 90시간 효소반응시켰다.

이어서, 이 반응 혼합물을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 40℃로 냉각하였다. 잔존 수크로오스를 분해하기 위해 반응 혼합물을 pH 4.0으로 조정하고, 여기에 효모 유래의 인베르타아제를 고형물당 당류 1 g에 대해 20단위의 양으로 혼합한 다음 40℃에서 24시간 효소반응시키고 100℃에서 10분간 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이렇게 하여 수득한 혼합물중에는 고형물당 트레할룰로오스를 약 80% 함유하고 있었다. 이 혼합물을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제한 후 약 50% 농도의 당용액으로 농축하여 이것을 원료 당액으로 하였다.

트레할룰로오스 함량을 크게 하기 위해 이 당액을 "DOWEX 50WX4(Ca^＋＋형), (미합중국의 Dow Chemical사 판매의 강산성 양이온 교환 수지)를 충전한 직경 5.4 cm의 자켓부 스테인레스 스틸제 칼럼 4개를 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이를 20 m되게 한 칼럼을 이용하여 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다.

칼럼 내부 온도를 40℃로 유지하면서 이 수지에 당용액 5 v/v%을 가한 다음, 칼럼에 40℃의 뜨거운 물을 SV(공간속도) 0.2로 공급하고 트레할룰로오스 고함유 획분을 회수함으로써 당액을 분획처리하여 프룩토오스와 글루코오스 등의 공존하는 당류를 제거하였다. 획분을 한데 모아 정제하고 농축한 후 감압건조하여 분쇄 함으로써 순도 98%의 트레할룰오로스 고함유 당 분말을 고형물당 약 70%의 수율로 얻었다.

실험 9 : 기타 미생물 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소에 의한 수크로오스로 부터의 트레할룰로오스의 제조

실험 1 및 2의 방법에 따라 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4312) 및 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579) 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소와 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 27634, 테르무스 루베르 ATCC 35948, 테르무스 sp. ATCC 43815 및 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 33923 유래의 말토오스/트레할로오스 변환효소를 "DEAE-TOYOPEARL 650"을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 부분 정제하였다.

표 7의 조건하에서 각 효소를 20% 수크로오스 용액에 96시간 동안 반응시킨 후 반응 혼합물의 당조성을 GLC로 분석하였다. 그 결과는 표 7에 나와 있다.

[표 7]

위에 나온 미생물 유래의 효소 모두가 수크로오스로 부터 트레할룰로오스를 70% 이상의 높은 수율로 생성하였음이 판명되었다.

실험 10 : 생체내 이용시험

문헌 [H. Atsuji et al. in "Journal of Clinical Nutrition", Vol.41, No. 2, pp.200∼208 (1972)]에 보고된 방법에 따라 실험 8에서의 고형물당 순도 98%의 트레할룰로오스 고함유 당 분말 30 g을 20 w/v% 수용액으로 한 다음, 25세, 27세 및 30세의 건강한 남성 지원자 3명에게 경구 투여 한 후 일정시간마다 혈액을 채취하여 혈당치와 인슐린치를 측정하였다. 대조로서 글루코오스를 사용하였다.

그 결과, 트레할룰로오스를 투여한 지원자에 있어서의 혈당치와 인슐린치는 글루코오스치의 약 절반 정도이었으며, 이것은 투여후의 약 0.5∼1시간에서 최고치를 나타낸 것이다. 트레할룰로오스는 글루코오스와 프룩토오스가 1 : 1의 몰비로 구성되어 있다는 사실에 근거하여 시험에 사용된 당은 쉽사리 동화, 흡수되어 에너지원으로 이용됨이 판명되었다.

실험 11 : 급성독성 시험

7주령의 dd계 마우스를 사용하여 실험 8에서 제조한 고형물당 순도 98%의 트레할룰로오스 고함유 당 분말을 마우스에게 경구투여하여 급성독성 시험을 하였다.

마우스 체중 1 kg당 15 g의 투여량까지에서는 사망예가 없었고 그 이상의 양의 투여량의 시험은 불가능하였다. 따라서 이 당질의 독성은 극히 낮다.

참고예, 실시예 A 및 실시예 B 에서는 본 발명에서 사용되는 말토오스/트레할로오스 변환효소의 제조방법, 이 효소로 제조된 트레할룰로오스 함유의 당조성물 및 이 당조성물을 함유한 조성물을 각각 설명한다.

참고예 1

피멜로박터 sp. R48(FERM BP-4315)의 종배양물을 글루코오스 4.0 w/v%, 폴리펩톤 0.5 w/v%, 효모 엑스 0.1 w/v%, 인산수소 2칼륨 0.1 w/v%, 인산 2수소 나트륨 0.06 w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.05 w/v%, 탄산칼슘 0.5 w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지에 접종하고 배양온도를 27℃로 설정한 이외는 실험 1에서와 마찬가지로 발효조중에서 통기교반 조건하에 약 60시간 배양하였다.

수득한 배양액 약 18리터를 "MINI-RABO"(일본국의 Dainippon Pharmaceutical 사 판매의 초고압 균체 파쇄장치)로 처리하여 균체를 파쇄하고, 이 혼합물을 원심 분리하여 상청액을 얻었다. 이어서 이 상청액을 UF막으로 농축하여 말토오스/트레할로오스 변환효소를 약 30단위/ml 함유한 효소 농축액 300 ml을 얻었다.

참고예 2

슈우도모나스 푸티다 H262(FERM BP-4579)의 종배양물을 글루코오스 2.0 w/v%, 황산 암모늄 1.0 w/v%, 인산수소 2칼륨 0.1 w/v%, 인산2수소 나트륨 0.06 w/v％, 황산 마그네슘 7수화물 0.05 w/v%, 탄산칼슘 0.3 w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지에 접종하고 배양온도를 27℃로 설정한 이외는 실험 1에서와 마찬가지로 발효조중에서 통기교반 조건하에 약 20시간 배양하였다. 수득한 배양물 약 18 리터를 원심분리하여 습균체 약 0.4 kg을 얻은 다음, 이것을 10 mM 인산 완충액 4리터중에 현탁하고 초음파 파쇄기로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 균체 현탁액을 원심분리하여 상청액을 얻고, 이것을 UF막으로 농축하여 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 약 15단위/ml 함유한 효소 농축액 약 100 ml을 얻었다.

참고예 3

실험 1의 방법에 따라 테르무스 아쿠아티쿠스 ATCC 33923을 통기교반 조건하에 약 20시간 배양하고, 이 배양물 약 18 리터로 부터 습균체 0.18 kg을 회수하여 10 mM 인산 완충액(PH 7.0)중에 현탁한 후 초음파 파쇄기로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 혼합물을 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 이것을 UF막으로 농축하여 말토오스/트레할로오스 변환효소를 약 50 단위/ml 함유한 효소 농축액 약 100 ml을 얻었다.

실시예 A-1

수크로오스를 최종농도 30 w/v%의 용액으로 하고 참고예 1의 방법으로 제조한 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물 1 g당 25단위 가한 다음, 이 혼합물을 10℃ 및 pH 7.0에서 150시간 배양하였다. 이 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하여 회수한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제한후 농축하여 약 75% 농도의 트레할룰로오스 시럽을 고형물 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다. 이 시럽은 고형물 기준으로 트레할룰로오스를 약 75% 함유하고 있었다. 이 시럽은 고품질의 감미, 적당한 점도 및 양호한 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품 및 의약품 등에 있어서 감미료, 품질 개선제 또는 안정제로서 사용할 수 있다. 이 시럽은 시럽중의 환원성 트레할룰로오스와 기타 당류를 수소첨가하여 각기 상응한 당 알코올로 한 후 사용할 수 있다.

실시예 A-2

수크로오스를 최종농도 20 w/v%의 용액으로 하고 참고예 2의 방법으로 제조한 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물당 1 g당 20단위 가한 다음, 이 혼합물을 25℃및 pH 7.0에서 120시간 배양하였다. 이 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하여 회수한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제한후 감압하에 건조하고 분쇄하여 트레할룰로오스 시럽을 고형물당 약 90%의 수율로 얻었다. 이 시럽은 고형물당 트레할룰로오스를 약 70% 함유하고 있었다. 이 시럽은 고품질의 감미를 가지고 있으므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 품질 개선제 또는 안정제, 증량제 또는 부형제로서 사용할 수 있다.

실시예 A-3

실시예 A-1의 방법으로 제조한 말토오스/트레할로오스 변환효소를 사용한 효소반응에 의해 수득한 반응 혼합물을 pH 4.5로 조정하고, 여기에 고형물 1 g당 인베르타아제를 5단위 혼합한 다음, 40℃에서 24시간 동안 효소반응시켰다. 수득한 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 인큐베이트하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과한 후 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제한 다음 농도 약 55% 당용액으로 농축하였다. 원료당액으로서의 이 당액을 "DOWEX 99(Ca^＋＋형, 중합도 6%)"(미합중국 Dow Chemical사 판매의 강산성 양이온 교환수지)를 사용하여 실험 8에서와 마찬가지로 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 트레할룰로오스 고함유 획분을 채취하였다. 이 획분을 모아 정제하고 농축하여 고형물당 트레할룰로오스를 약 75% 함유하는 트레할로오스 고함유 시럽을 약 60%의 수율로 얻었다.

이 시럽은 고형물당 트레할룰로오스를 약 95％함유하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 양호한 보습성을 가지므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 품질 개선제 또는 안정제로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 A-4

수크로오스를 최종농도 40 w/v%의 용액으로 하고, 여기에 참고예 3의 방법으로 제조한 말토오스/트레할로오스 변환효소를 고형물 1 g당 50단위 혼합하여 40℃ 및 pH 6.5에서 96시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 pH 4.5로 조정하고, 여기에 인베르타아제를 고형물 1 g당 5단위 혼합한 후 40℃에서 24시간 효소반응 시켰다. 95℃에서 10분간 유지한 후 이 반응 혼합물을 냉각하고 활성탄으로 탈색, 여과하여 U형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제한 다음, 농도 약 55% 의 당용액으로 농축하였다. 원료 당용액으로서의 이 당용액을 "DOWEX 99(Ca^＋＋형, 중합도 6%)"(미합중국 Dow Chemical사 판매의 강산성 양이온 교환수지)를 사용하여 실험 8에서와 마찬가지로 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 트레할룰로오스 고함유 획분을 채취하였다. 이 획분을 모아 정제하고 농축한 후 분무건조하여 트레할룰로오스 고함유 분말을 고형물당 약 60%의 수율로 얻었다. 이 시럽은 고형물당 트레할룰로오스를 약 95% 함유하고 있었고, 고품질의 감미, 적당한 점도 및 양호한 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품 및 의약품에 있어서 감미료, 품질 개선제 또는 안정제로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-1 : 감미료

실시예 A-4의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 분말 1 중량부에 "a-G Sweet"(일본국의 東洋精糖(주) 판매의 a -글리코실스테비오시드) 0.05 중량부를 균일히 혼합하고, 이 혼합물을 조립기(遣粒機)에 가하여 과립상 감미료를 제조하였다.

이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스보다 약 2배 높은 감미도를 가지며 감미도당 칼로리값은 수크로오스의 약 1/2 이다. 이 제품은 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 이 감미료는 체내에 흡수되면 충치 유발균에 의한 산의 생성이 적고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 만족스럽게 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 하아드 캔디

농도 55%의 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 함유 시럽 30 중량부를 가열 혼합한 다음, 감압하에 수분 2% 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 적당량의 레몬향료 및 착색료를혼합하여 통상의 방법에 따라 성형하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화를 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.

실시예 B-3 : 딸기 잼

신선한 딸기 150 중량부, 말토오스 20 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 시럽 40 중량부, 펙틴 5중량부 및 시트르산 1 중량부를 혼합하고, 이 혼합물을 평평한 용기중에서 바짝 졸여 병에 넣음으로써 맛이 좋고 색갈이 좋은 딸기 잼인 소요의 제품을 얻었다.

실시예 B-4 : 유산 음료

탈지 분유 10 중량부를 80℃에서 20분간 가열하여 살균하고 40℃로 냉각한 후 스타아터 (starter) 0.3 중량부를 접종하고 약 37℃에서 10시간 발효시킨 다음, 발효 혼합물을 호모지나이즈한후 실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 함유 당 분말 4 중량부, 수크로오스 1 중량부 및 이성화당 시럽 2 중량부를 혼합하여 균질화하고 70℃에서 가열하여 살균하였다. 이렇게 하여 수득한 혼합물을 냉각하고, 여기에 적당량의 향료를 가한 다음 병에 넣어 포장함으로써 소요의 제품을 제조하였다. 이 제품은 맛과 감미가 잘 조화된 신맛을 가지고 있는 고품질의 유산 음료이다.

실시예 B-5 : 가당 연유

원유 100 중량부에 실시예 A-3의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 시럽 3 중량부와 수크로오스 1 중량부를 가하고 이 혼합물을 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 약 70% 농도의 시럽으로 농축하고 무균 상태에서 병조림하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미와 맛을 가지고 있어서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 음식물의 감미용으로 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-6 : 츄잉 검

검 베이스 3 중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 수크로오스 6 중량부와 실시예 A-4의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 당 분말 1 중량부를 가하고, 다시 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스쳐와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.

실시예 B-7 : 커스타드 크리임

옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 시럽 100 중량부, 말토오스 80 중량부, 수크로오스 20 중량부 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하고 계란 280 중량부를 가하여 혼합하였다, 여기에 끓인 우유 1000 중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 내용물이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 평활한 광택, 온화한 감미 및 양호한 맛을 가지고 있다.

실시예 B-8 : 우이로-노-모토 (Uiro-no-moto: 단맛의 쌀 젤리 프리믹스)

쌀가루 90 중량부에 옥수수 전분 20 중량부, 실시예 A-4의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 당질 분말 120 중량부 및 풀룰란 4 중량부를 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 분말차 및 물과 혼합, 반죽하여 용기에 넣고 60분간 증기찜하여 우이로를 얻었다. 이 우이로는 깨물기가 좋고 맛이 양호하며 전분의 노화가 잘 억제되므로 저장기간이 비교적 길다.

실시예 B-9 : 경관 영양제용 고형 조성물

실시예 A-4의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 당질 분말 500 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화칼륨 1.85 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부를 혼합하여 고형 조성물을 제조하였다. 이 조성물 25 g씩을 취하여 방습성 소형의 라미네이트 봉지에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다. 이 조성물은 봉지 하나를 약 150∼300 ml의 물에 용해하여 환자에게 경구적으로 투여하거나, 또는 비강 (鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 투여한다.

실시예 B-10 : 외상 치료용 연고

실시예 A-4의 방법으로 제조한 트레할룰로오스 고함유 당질 분말 500 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10% 풀룰란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 외상 치료용 연고를 제조하였다. 이 연고는 치유 기간을 단축하고 상처난 표면도 깨끗이 아물게 한다.

이상으로 부터 명백한 바와 같이 말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 수용액에 작용시켜 수득한 트레할룰로오스를 함유하는 당조성물을 수크로오스로 부터 비교적 높은 트레할룰로오스 수율로 제조하고, 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

트레할룰로오스는 글루코오스와 프룩토오스로 구성된 환원성 2당이며 고품질로서 맛이 온화하다. 이 당조성물을 인간에게 경구 및 비경구 투여할 수 있고 독성과 부작용의 우려없이 생체에서 용이하게 대사된다.

본 발명의 액상 또는 분말상 트레할룰로오스 함유의 당조성물은 취급이 용이하고, 삼투압 조절성, 증량 부여성, 광택 부여성, 보습성, 점도 부여성, 결정화 방지성 및 난발효성 등의 성질을 가지고 있다. 이들 성질을 각종 조성물에 있어서 감미료, 맛 개선제, 품질 개선제 또는 안정제로서 유리하게 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 당조성물, 그 제조방법 및 용도의 확립은 식품, 화장품 및 의약품 공업에 있어서 큰 의의를 가지고 있다.

Claims

말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시켜 트레할룰로오스를 생성시켜 수득되고, 팔라티노오스에 대한 트레할룰로오스의 비율(트레할룰로오스/팔라티노오스)이 14 이상이며, 팔라티노오스의 함유량이 고형물당 4 w/w% 이하인 것을 특징으로 하는 당조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 말토오스/트레할로오스 변환효소가 미생물 유래의 것인 당조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 미생물은 피멜로박터속, 슈우도모나스속 및 테르무스속에 속하는 미생물로 부터 선택되는 당조성물.
청구항 1에 있어서, 고형물당 트레할로오스를 10 w/w% 이상 함유하는 당조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 수크로오스 용액의 농도가 0.1 w/v% 이상인 당조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 약 10∼1,000단위의 양으로 약 80℃ 이하의 온도 및 약 5.5∼9.0의 pH에서 약 0.1-200시간 동안 수크로오스 용액에 작용시키는 당조성물.
청구항 1에 있어서, 프룩토오스, 글루코오스, 수크로오스 및 투라노오스로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당과 트레할룰로오스 및 팔라티노오스로 되어있는 당조성물.
말토오스/트레할로오스 변환효소를 수크로오스 용액에 작용시켜 상기한 트레할룰로오스를 생성시키고, 수득한 트레할룰로오스 함유 혼합물을 채취하는 트레할룰로오스 함유 당조성물의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 고형물 1 g당 말토오스/트레할로오스 변환효소 10 단위 이상을 상기 수크로오스 용액에 작용시키는 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 수크로오스 용액의 농도가 0.1 w/w% 이상인 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 효소를 고형물당 수크로오스 1 g에 대해 약 10∼1,000단위의 양으로 약 80℃이하의 온도 및 약 5.5-9.0의 pH에서 약 0.1∼200시간 동안 수크로오스 용액에 작용시키는 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 말토오스/트레할로오스 변환효소가 미생물 유래의 것인 제조방법.
청구항 12에 있어서, 상기 미생물은 피멜로박터속, 슈우도모나스속 및 테르무스속에 속하는 미생물로 부터 선택되는 당조성물 제조방법.
청구항 8에 있어서, 채취한 트레할룰로오스 함유 혼합물에 인베르타아제를 작용시키고, 수득한 혼합물을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리하여 트레할룰로오스 함량을 추가로 높이는 단계를 포함하는 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 달질은 프룩토오스, 글루코오스, 수크로오스, 투라노오스 및 팔라티노오스로 된 군으로 부터 선택되는 1종 이상의 당과 트레할룰로오스로 되어 있는 제조방법.
청구항 15에 있어서, 트레할룰로오스의 함량은 고형물 기준으로 10 w/w% 이상이고, 상기 1종 이상의 당의 함량은 고형물 기준으로 최고 90 w/w %인 제조방법.