KR100459240B1 - Method for biological processing of fermented soybean peptides by Aspergillus oryzae GB-107 in feeds - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어린 가축용 사료에 이용되는 대두단백질을 가공함에 있어서, 대두박에 아밀라제(amylase) 생성능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 균주를 발효하여 대두박에 포함된 탄수화물을 미생물의 성장에 필요한 에너지원으로 이용하게 함으로서 대두박 속의 상대적 단백질 함량을 농축하고 항영양인자로 알려진 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose)등의 올리고당과 트립신저해인자(trypsin inhibitor)를 제거하는 생물학적 발효 대두펩티드 가공방법으로서 상기 발효 대두펩티드 제조방법에 의해 제조된 발효 대두펩티드는 단백질의 용해도가 매우 높고 가축이 소화 흡수하기 용이한 작은 크기의 펩티드로 구성되어 있으므로 어린 가축의 설사를 예방하고 성장을 촉진하는 뛰어난 효과가 있다.In the present invention, in processing soy protein used in feed for young livestock, Aspergillus duck material having excellent amylase (amylase) production ability in soybean meal (Aspergillus oryzae) Fermentation of GB-107 (KCTC 10258BP) strain to use carbohydrates contained in soybean meal as an energy source for the growth of microorganisms, enriching the relative protein content of soybean meal and raffinose and stachyose, known as anti-nutritive factors. As a biological fermented soybean peptide processing method to remove oligosaccharides and trypsin inhibitor, etc., the fermented soybean peptide prepared by the fermented soybean peptide production method has a small solubility of protein and easy to digest and absorb by livestock. Since it is composed of peptides, it has an excellent effect of preventing diarrhea and promoting growth of young livestock.
Description
본 발명은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258)균주를 분리·선발하고 대두박에 발효하여 사료용 발효 대두펩티드를 생산하는 생물학적 가공방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 아밀라제(amylase) 생성능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258) 균주를 분리·선발하고 이를 저온 침지한 대두박 배지에 접종·발효하여 대두박의 단백질을 농축하고 트립신저해인자(trypsin inhibitor)와 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose)등의 올리고당을 제거할 수 있는 발효 대두펩티드 제조방법과 상기 발효 대두펩티드를 함유하는 사료조성물에 관한 것이다.The present invention is aspergillus duck material (Aspergillus oryzae) The present invention relates to a biological processing method for producing fermented soybean peptide for feed by separating and selecting strain GB-107 (KCTC 10258) and fermenting in soybean meal. In more detail, Aspergillus duckwood excellent in amylase production ability (Aspergillus oryzae) Isolate and select GB-107 (KCTC 10258) strain, inoculate and ferment it in cold soaked soybean meal medium to concentrate protein of soybean meal, trypsin inhibitor, raffinose, stachyose, etc. The present invention relates to a fermented soybean peptide production method capable of removing oligosaccharides and a feed composition containing the fermented soybean peptide.
축산분야에서 단백질을 공급하는 사료원료 중 가장 경제적이고 고품질의 식물성 단백질로 대두박을 많이 이용하고 있지만 어린 가축의 사료에는 사용량을 제한하고 있다. 특히 대두박을 어린 돼지에 사용하면 대두박에 포함된 항영양인자들에 의해 소화가 잘 안되기 때문에 소화를 저해한다[Li 등, Transient hypersensitivity to soybean meal in early-weaned pig. J. Anim. Sci. 68:1790, 1990). 대두박의 항영양인자로는 단백질 소화를 방해하는 트립신저해인자, 혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin), 가축의 설사·복통을 유발하는 라피노스, 스타키오스 등의 올리고당이 있다(Ratner 등, Soybean : anaphpylacogenic properties. Ann. Allergy. 13:289, 1955). 이들 중 일부는 열처리에 의해서 파괴되지만 이 과정에서 대두단백질이 변성되어 용해도가 감소하고 라이신(lysine)등의 필수 아미노산이 소실될 수 있다. 따라서 대두의 단백질을 보다 효율적으로 이용하기 위하여 항영양인자를 제거하여 효율성을 증대시키는 가공법들이 개발되고 있다.Soybean meal is widely used as the most economical and high-quality vegetable protein among the feedstocks that provides protein in the livestock industry, but the use of the feed for young livestock is limited. In particular, when soybean meal is used in young pigs, it is difficult to digest by the anti-nutritive factors included in soybean meal and thus inhibits digestion. J. Anim. Sci. 68: 1790, 1990). Anti-nutritional factors of soybean meal include trypsin inhibitors that interfere with protein digestion, hemagglutinin, a hemagglutinin, raffinose, and starchios, which cause diarrhea and abdominal pain in livestock (Ratner et al., Soybean: anaphpylacogenic) properties.ann.Allergy. 13: 289, 1955). Some of them are destroyed by heat treatment, but in this process, soy protein is denatured, solubility may be reduced and essential amino acids such as lysine may be lost. Therefore, in order to use the protein of soybeans more efficiently, methods for increasing efficiency by removing anti-nutritional factors have been developed.
대두박은 건물을 기준으로 하였을 때 단백질이 55∼56%, 가용성탄수화물이 13∼14%, 불용성탄수화물 21∼22%이며 이밖에 1%정도의 조지방과 4∼6% 정도의 회분으로 구성되어 있다(한인규, 식물성 단백질사료, 사료가공학, 선진문화사, 67-107, 1998). 기존 대두박 가공제품 중 농축대두단백질(soy protein concentrates, SPC)은 가용성 비단백질 구성성분을 약 78℃의 65% 에탄올로 추출하여 제거한 다음 특수 열처리를 하여 제조하고, 분리정제 대두단백질(isolated soy proteins, ISP)은 알칼리 조건에서 단백질성분을 용해하여 수확한 후 산성 조건에서 단백질을 침전하는 방법으로 대두박의 비단백질 성분을 제거하고 분무건조(spray drying) 공법으로 건조하여 제조하였다(Protein technology institute, Composition of ISP and SPC, 1991). 상기의 방법으로 제조된 농축 대두단백질과 분리정제 대두단백질을 사료로 사용하면 가축의 성장을 촉진하는 것으로 보고되었다(Hancock 등, Effect of ethanol extraction and duration of heat treatment of soybean flakes on the utilization of soy protein by growing rats and pigs. J. Anim. Sci. 78:3233, 1990).Soybean meal contains 55-56% protein, 13-14% soluble carbohydrates, 21-22% insoluble carbohydrates, and 1% crude fat and 4-6% ash based on dry matter. In-Kyu Han, Vegetable Protein Feed, Feed Processing, Advanced Culture History, 67-107, 1998). Soy protein concentrates (SPC) in conventional soybean meal products are prepared by extracting soluble nonprotein components with 65% ethanol at about 78 ° C, removing them, followed by special heat treatment, and using isolated soy proteins, ISP) was prepared by dissolving and harvesting protein components in alkaline conditions and then precipitating proteins in acidic conditions to remove the nonprotein components of soybean meal and drying them by spray drying (Protein technology institute, Composition of ISP and SPC, 1991). It has been reported that the use of concentrated soy protein and purified soy protein prepared by the above method promotes livestock growth (Hancock et al., Effect of ethanol extraction and duration of heat treatment of soybean flakes on the utilization of soy protein by growing rats and pigs.J. Anim. Sci. 78: 3233, 1990).
그러나 종래의 대두단백질 가공 방법은 생산 단가가 매우 높기 때문에 저렴한 생산비용이 요구되는 생산재인 사료에 충분한 양을 공급할 수 없는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 이들 방법은 제조과정 중 열처리, 화학적 처리, 열건조 등으로 인하여 단백질 변성, 수용성 아미노산의 소실 등이 일어나 실제 단백질의 용해도는 낮다. 따라서, 종래의 방법은 단백질의 극심한 변성이 일어나지 않을 정도에서 열처리를 하기 때문에 항영양인자인 트립신저해인자도 상당량 존재하는 문제점이 있다.However, the conventional soy protein processing method has a problem that it is not possible to supply a sufficient amount of feed, which is a production material that requires a low production cost because the production cost is very high. In addition, these methods cause protein denaturation and loss of water-soluble amino acids due to heat treatment, chemical treatment, and heat drying during the manufacturing process, resulting in low solubility of the protein. Therefore, the conventional method has a problem that a significant amount of trypsin inhibitory factor, which is an anti-nutritive factor, is also present because the heat treatment is performed to the extent that no extreme denaturation of the protein occurs.
본 발명은 대두박의 사료가공에서 생산단가가 매우 저렴하며 상기의 문제점을 해결할 수 있는 신규한 생물학적 가공 방법으로서, 아밀라제 활성이 매우 높은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258) 균주를 저온 침지한 대두박에 접종하여 대두박 속에 탄수화물을 미생물 성장에 필요한 에너지원으로 소진시킴으로서 대두박 속에 단백질을 상대적으로 농축하여 약 55%의 조단백질을 포함하고, 트립신저해인자와 라피노스, 스타키오스등의 올리고당을 감소시킬 뿐만 아니라 대두단백질의 용해도를 증가시키는 본 발명 대두펩티드의 제조방법을 확립하고, 상기 제조방법에 의해 제조된 발효 대두펩티드는 대두박의 단백질이 작은 크기의 펩티드로 가수분해되었음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.The present invention is a novel biological processing method that can solve the above problems, the production cost is very low in feed processing of soybean meal, Aspergillus duck material very high amylase activity (Aspergillus oryzae) By inoculating GB-107 (KCTC 10258) strain into soybean meal soaked in low temperature, carbohydrates in soybean meal are consumed as an energy source for microbial growth. The method for preparing soybean peptide of the present invention not only reduces oligosaccharides such as raffinose and stachyose, but also increases solubility of soy protein. The present invention was completed by identifying hydrolysis.
따라서, 본 발명의 목적은 아밀라제 생성능이 매우 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 사료용 대두단백질 가공에 있어서 상기 본 발명 균주를 이용한 발효 대두펩티드 가공 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 발효 대두펩티드를 유효성분으로 함유하는 사료조성물을 제공함에 있다.Therefore, an object of the present invention is very excellent amylase production ability Aspergillus duckAspergillus oryzae) To provide GB-107 (KCTC 10258BP) strain. Another object of the present invention is to provide a fermented soybean peptide processing method using the strain of the present invention in soy protein processing for feed. Another object of the present invention to provide a feed composition containing the fermented soybean peptide prepared by the method as an active ingredient.
본 발명의 상기 목적은 아밀라제 생성능이 매우 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 균주를 분리·선발하고, 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 균주 발효에 의한 효소 활성 및 조단백질 함량을 극대화하는 원료배지의 대두박 수분 함량과 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 균주 발효에 의한 항영양인자가 낮고 단백질의 용해도가 높은 대두박 열처리 조건을 조사한 후, 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 균주를 이용하여 발효 대두펩티드를 제조한 다음, 본 발명에 의해 제조된 발효 대두펩티드의 대두 단백질의 가수분해 정도를 비교함으로써 달성하였다.The above object of the present invention is to isolate and select strains of Aspergillus orysis GB-107 (KCTC 10258BP), which has excellent amylase production ability, and the present invention, Aspergillus orysis ( Aspergillus oryzae ) GB-107 (KCTC). 10258BP) Soybean meal water content of raw material medium to maximize enzyme activity and crude protein content by strain fermentation, and anti-nutritional factor by fermentation of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) strain of the present invention and protein solubility After the high soybean meal heat treatment conditions were investigated, fermented soybean peptides were prepared using the Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) strain of the present invention, and then the soybeans of the fermented soybean peptide prepared according to the present invention. This was achieved by comparing the degree of hydrolysis of the proteins.
도 1은 아스퍼질러스 오리재 친주와 본 발명 아스퍼질러스 오리재 GB-107의 콜로니 형태 및 포자색상을 비교한 사진이다.Figure 1 is a photograph comparing the colony form and spore color of Aspergillus duck stock and the present invention Aspergillus duck stock GB-107.
도 2는 종래의 농축 대두단백질 생산방법과 본 발병 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)을 이용한 발효 대두펩티드 생산방법의 비교를 나타낸 도식이다.Figure 2 is a conventional concentrated soy protein production method and the present aspergillus duck material (Aspergillus oryzae) A diagram showing a comparison of fermented soybean peptide production methods using GB-107 (KCTC 10258BP).
도 3은 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)이 대두박에 발효된 사진이다.3 is the present invention Aspergillus duck material (Aspergillus oryzae) GB-107 (KCTC 10258BP) is a fermented soybean meal.
도 4는 대두박과 본 발명 발효 대두펩티드 및 타제품의 가수분해 정도를 나타내는 단백질 전기영동 사진이다.Figure 4 is a protein electrophoresis picture showing the degree of hydrolysis of soybean meal and the fermented soybean peptide and other products of the present invention.
도 5는 대두박과 본 발명 발효 대두펩티드 및 타제품의 단백질 전기영동 젤에서 25,000 Da 이하 크기로 가수분해된 펩티드의 밀도분포를 나타낸다.Figure 5 shows the density distribution of peptides hydrolyzed to less than 25,000 Da in soybean meal and the protein electrophoresis gel of the fermented soybean peptide and other products of the present invention.
본 발명은 아밀라제 생성능이 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)를 전통메주로부터 분리·선발하는 단계; 대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효에 의한 효소 생성 및 조단백 함량의 변화를 조사하는 단계; 대두박의 열처리 조건에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효 후 항영양인자 및 단백질의 용해도 변화를 조사하는 단계; 상기 조사된 발효 최적의 조건에서 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)을 이용하여 발효 대두펩티드를 제조하는 단계; 본발명에 의해 제조된 발효 대두펩티드의 가수분해 정도를 대두박과 종래의 수입 대두 단백질의 가수분해 정도와 비교하여 본 발명 발효 대두펩티드의 가수분해화 정도를 확인하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of separating and selecting Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) excellent in amylase production from traditional meju; Investigating changes of enzyme production and crude protein content by fermentation of Aspergillus orysis GB-107 (KCTC 10258BP) according to the moisture content of soybean meal; Investigating changes in solubility of anti-nutritive factors and proteins after fermentation of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) according to the heat treatment conditions of soybean meal; Preparing fermented soybean peptides using the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) at the optimum fermentation conditions investigated; The degree of hydrolysis of the fermented soybean peptide prepared by the present invention is compared with the degree of hydrolysis of soybean meal and conventional imported soybean protein.
본 발명 아밀라제 생성능이 뛰어난 변이균주를 분리·선발하기 위하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 전통메주에서 분리한다. 전통메주를 멸균 생리식염수에 현탁하고 희석한 후 희석액을 클로람페니콜(chloramphenicol) 100μg/mL을 포함하는 포테이토 덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar)에 도말하고 30℃에서 48-56시간 배양한 후 황색 포자를 형성하는 콜로니(colony)를 수집한 다음 현미경으로 균사의 형태, 분생포자경(conidiophore), 경자(phialide), 분생포자의 모양을 관찰하여 아스퍼질러스 오리재 친주를 1차 선발한다. 분리된 균주를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 배양하여 분생포자를 수집한 후 셀렌산나트륨(Sodium selanate, Na2SeO4)을 0.5%(w/v) 및 불용성 전분 5%(w/v)를 포함하는 한천배지에 1×106의 상기 균주 분생포자를 도말한 다음 30℃에서 48시간 배양하여 전분 분해환이 큰 변이균주를 2차 선발하였다. 상기균주의 포자를 수분함량 40%로 침지하여 살균한 대두박에 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 다음 아밀라제 역가가 높으며 대두박의 조단백질 함량을 가장 많이 변화시키는 균주를 최종 선발한다. 상기 본 발명 균주를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107로 명명하고, 생명공학연구소 유전자센터에 2002년 5월 16일에 기탁번호 KCTC 10258BP로 기탁하였다.In order to isolate and select a mutant strain having excellent amylase-producing ability of the present invention, Aspergillus duck strain is isolated from traditional meju. After suspending and diluting traditional meju in sterile saline solution, the diluted solution is plated in potato dextrose agar containing 100 μg / mL of chloramphenicol and incubated at 30 ° C. for 48-56 hours, followed by yellow spores. Collecting colonies (colony) is collected and then aspergillus duck column primary selection by observing the shape of the hyphae, conidiophore, phialide, conidia spores under a microscope. The isolated strains were cultured in potato dextrose agar medium to collect conidia, and sodium selanate (Na 2 SeO 4 ) contained 0.5% (w / v) and insoluble starch 5% (w / v). The strain conidia spores of 1 × 10 6 were plated on an agar medium and then incubated at 30 ° C. for 48 hours to select a second strain of a large starch degradation ring. The spores of the strain were immersed in 40% moisture content, inoculated in sterilized soybean meal, incubated at 30 ° C. for 48 hours, and finally selected for strains having high amylase titer and changing crude protein content of soybean meal. The strain of the present invention was named aspergillus oryzae GB-107, and deposited on May 16, 2002 with the accession number KCTC 10258BP in the Biotechnology Research Institute Gene Center.
본 발병의 발효 대두펩티드를 제조함에 있어서, 최적의 수분함량을 알기 위해 대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 효소 생성 및 조단백질 함량의 변화를 조사한다. 아밀라제 활성은 가용성 전분(20mM 인산나트륨 버퍼 내 1%, pH 7.0)을 기질로 하여 생성된 총 환원당을 DNS(dinitrosalicylic acid)법[Miller, Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428, 1959]으로 측정하고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정한다. 프로테아제 활성은 카세인(20mM Tris-HCl 버퍼 내 0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(tyrosine)을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4: 101, 1978]으로 측정하고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정한다. 조단백질 함량은 킬달장치(Kjeldahl system)로 측정한다. 그 결과 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107의 생균수 및 프로테아제 역가는 대두박의 초기수분함량이 40%일 때 가장 높았지만 아밀라제 역가 및 발효 대두박의 조단백질 함량은 초기 수분함량이 50%일 때 가장 높게 나타난다. 따라서, 발효 대두펩티드를 제조하기 위한 대두의 최적 수분함량은 40~50%임을 알 수 있다. 또한 표 2에서 발효 대두박의 조단백질 함량은 아밀라제 역가에 따라 변화하고 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 생균수와는 일치하지 않는 것으로 나타난다. 이는 아밀라제가 대두박의 탄수화물을 가수분해하여 미생물이 성장에 필요한 에너지로 소진하는데 중요한 역할을 하고 있음을 보여준다.In preparing the fermented soybean peptide of the present invention, in order to know the optimum water content, the enzyme production and crude protein content of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) according to the moisture content of soybean meal Investigate. The amylase activity was determined by using the DNS (dinitrosalicylic acid) method (Miller, Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar.) Based on total soluble starch (1% in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0). Anal. Chem. 31: 426-428, 1959, and 1 U (unit) of enzyme is determined by the amount of enzyme that liberates 1 μmol of product per minute. The protease activity was determined by the Folin method [Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4:], after tyrosine produced after the enzyme reaction using casein (0.7% in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0) as a substrate. 101, 1978, and enzyme 1 U (unit) is determined by the amount of enzyme that liberates 1 μmol of product per minute. Crude protein content is determined by the Kjeldahl system. As a result, the viable cell number and protease titer of Aspergillus oryzae GB-107 was the highest when the initial moisture content of soybean meal was 40%, but the crude protein content of amylase titer and fermented soybean meal was 50%. Appears highest when Therefore, it can be seen that the optimum moisture content of soybean for preparing the fermented soybean peptide is 40 to 50%. In addition, the crude protein content of the fermented soybean meal in Table 2 is shown to vary according to the amylase titer and does not match the viable count of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP). This shows that amylase plays an important role in hydrolysing the carbohydrates of soybean meal, thus consuming microorganisms with the energy needed for growth.
대두박의 항영향인자인 트립신저해인자는 단백질이기 때문에 이를 제거하기위하여 전통적으로 열처리 방법을 이용해왔다. 그러나 대두박을 열처리 가공했을 때 트립신저해인자 뿐만 아니라 대두단백질의 변성이 동시에 일어나므로 과열 처리될 경우 가축의 영양소 이용율이 현저히 떨어진다. 따라서, 발효 대두펩티드를 제조함에 있어서 최적의 대두박 열처리 조건를 알기 위해 대두박의 열처리 온도에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효 후 대두박의 항영양인자인 트립신저해인자 및 라피노스, 스타키오스 함량과 단백질의 용해도를 알 수 있는 단백질확산지수(protein dispersibility index PDI) 및 KOH 용해도를 조사한다. 트립신저해인자 역가는 AACC-71-10(American association of cereal chemists, 1995)의 방법에 따라 측정하고, 라피노스 및 스타키오스는 액상 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)로 정량하며, 단백질확산지수는 시료 0.5g을 물 150mL에 넣어 8,500rpm으로 10분간 섞은 다음 여과하여 여액에 대한 질소함량을 킬달장치로 측정하여 용해도를 환산하고(Batal 등, Protein dispersibility index as an indicator of adequately processed soybean meal. Poult Sci. 79:1592-6, 2000), KOH 용해도는 시료 0.1g을 0.2% KOH수용액에 넣어 20분간 혼합한 다음 여과하여 여액에 대한 질소함량을 킬달장치로 측정하여 용해도를 환산한다(Parsons 등, Soybean protein solubility in potassium hydroxide: an in vitro test of in vivo protein quality. J Anim Sci. 69:2918-24, 1991). 그 측정 결과, 열처리 온도가 올라갈수록 트립신저해인자 역가와 단백질 용해도가 연속적으로 떨어지지만 열처리하지 않은 대두박을 발효한 것과 발효하지 않은 것을 비교해 보면 트립신저해인자는 43%로 감소하고 단백질확산지수는 오히려 증가하며 KOH 용해도는 조금 감소함을 알 수 있다. 이 것은 대두박의 본 발명 균주의 발효가 단백질의 용해도에 영향을 미치지 않으면서 트립신저해인자를 현저히 감소시키는 사실을 설명한다. 또한 대두박의 다른 항영향인자인 스타키오스와 라피노스도 본 발명 균주의 발효에 의하여 현저히 감소한다. 본 발명의 발효 대두펩티드 제조를 위한 균주 발효에 의한 생물학적 가공에서 트립신저해인자와 KOH 용해도를 고려한다면 대두박을 60℃~80℃에서 1시간 열처리하여 발효하는 것이 효율적이며, 특히 70℃에서 1시간 열처리하여 발효하는 것이 가장 효율적이다.Since soybean meal is a protein, trypsin inhibitors have traditionally been used to remove them. However, when soybean meal is heat-treated, soy protein is denatured at the same time as trypsin inhibitory factor, so the nutrient utilization rate of livestock is significantly lowered when overheated. Therefore, in the preparation of fermented soybean peptide, trypsin inhibition, which is an anti-nutritive factor of soybean meal, after fermentation of the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) according to the heat treatment temperature of soybean meal, The protein dispersibility index (PDI) and KOH solubility of factor, raffinose, starchiose content and protein solubility are investigated. Trypsin inhibitor titers were determined according to the method of AACC-71-10 (American association of cereal chemists, 1995), and raffinose and starchiose were quantified by liquid chromatography (LC). g was added to 150 mL of water and mixed at 8,500 rpm for 10 minutes, and then filtered. The nitrogen content of the filtrate was measured using a Kjeldahl device to determine the solubility (Batal et al., Protein dispersibility index as an indicator of adequately processed soybean meal.Poult Sci. 79 (1592-6, 2000), KOH solubility is measured by adding 0.1g of sample to 0.2% KOH solution for 20 minutes, filtering, and measuring the nitrogen content of the filtrate by Kjeldahl device (Parsons et al., Soybean protein solubility). in potassium hydroxide: an in vitro test of in vivo protein quality.J Anim Sci. 69: 2918-24, 1991). As a result, as the heat treatment temperature increases, trypsin inhibitor factor and protein solubility are continuously decreased, but the trypsin inhibitor factor decreases to 43% and the protein diffusion index increases rather than fermented soybean meal without fermentation. KOH solubility is slightly reduced. This explains the fact that the fermentation of the strain of the invention of soybean meal significantly reduces trypsin inhibitors without affecting the solubility of the protein. In addition, other anti-affecting factors of soybean meal, Stachyose and Raffinose, are also significantly reduced by fermentation of the strain of the present invention. Considering trypsin inhibitor and KOH solubility in biological processing by strain fermentation for the production of fermented soybean peptide of the present invention, it is efficient to ferment soybean meal by heat treatment at 60 ℃ ~ 80 ℃ for 1 hour, especially at 70 ℃ for 1 hour Fermentation is most efficient.
본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)를 이용한 본 발명 발효대두펩티드 제조과정은 이하와 같다. 조단백질 함량 45~48%를 포함하는 대두박을 수분함량 40~50% 로 맞추어 30분 동안 침지한 후 70℃에서 1시간 열처리하고 품온이 35℃가 될 때까지 식힌다. 대두박 원료가 식으면 본 발명 균주 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 종 배양한 종국을 대두박 원료 kg당 2g 넣어 골고루 섞은 후 베드-펙키드(bed-packed) 고체발효기에서 대두원료의 두께를 약 10㎝로 하여 평평하게 고른 다음 30℃로 유지시키면서 12시간 동안 분생포자를 발아시킨다. 분생포자의 발아가 완료되면 상기의 대두박 원료를 배지 품온이 30~33℃로 유지시키면서 24시간 배양한 후 품온을 35~37℃로 유지시켜 12시간 더 배양한다. 배양이 완료된 대두박은 50℃에서 열풍 건조한 후 분쇄하여 본 발명 발효 대두펩티드를 제조한다. 본 발명에 의한 대두 펩티드 가공은 종래의 화학적 가공 방법보다 생산비가 매우 저렴할 뿐만 아니라 본 발명에 의하여 제조된 발효 대두펩티드는 트립신저해제 역가가 현저히 낮고, 단백질의 용해도가 종래의 대두단백질보다 높으며, 특히 단백질 확산지수는 약 2~5배 높다.Fermented soybean peptide production process of the present invention using the Aspergillus duck material ( Aspergillus oryzae ) GB-107 (KCTC 10258BP) is as follows. Soybean meal containing 45 ~ 48% crude protein content is immersed for 30 minutes to 40 ~ 50% moisture content, then heat treated at 70 ℃ for 1 hour and cooled until the temperature reaches 35 ℃. When the soybean meal raw material is cooled, 2g per kg of soybean meal raw material is mixed evenly after seed culture of the strain of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) of the present invention is mixed, and then the bed-packed solid fermenter In order to make the soybean raw material at about 10cm in thickness and flatten it, germinate the conidia for 12 hours while maintaining it at 30 ℃. When the germination of the conidia is completed, the soybean meal raw material is incubated for 24 hours while maintaining the medium temperature at 30-33 ° C., followed by incubation for 12 hours by maintaining the temperature at 35-37 ° C. The cultured soybean meal is pulverized after drying with hot air at 50 ° C. to prepare the fermented soybean peptide of the present invention. The soybean peptide processing according to the present invention not only has a much lower production cost than the conventional chemical processing method, but the fermented soybean peptide prepared according to the present invention has a significantly lower trypsin inhibitor titer, and a higher solubility of the protein than the conventional soy protein. The diffusion index is about 2 to 5 times higher.
가축에 급여된 대두단백질은 위와 장에서 소화효소에 의하여 가수분해되어 펩티드 혹은 아미노산 형태로 흡수된다. 따라서 단백질의 소화 흡수율을 높이기 위해서는 가수분해된 펩티드 형태의 단백질사료를 급여하는 것이 매우 유리하다. 본 발명 발효 대두펩티드는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효과정에서 미생물이 분비하는 프로테아제의 의하여 대두단백질이 가수분해 되어있다. 따라서, 본 발명 발효 대두펩티드의 가수분해화 정도를 알기 위하여 대두박, 본 발명 발효대두펩티드, 종래의 수입 대두단백질 가공제품을 증류수에 용해하여 단백질을 추출한 다음, 12.5% 단백질 전기영동 젤에 전기영동하고, 전기영동 젤을 밀도계(Densitometer)를 이용하여 분자량 25,000 Da 이상 및 이하의 밀도분포로 정량화한다. 전기영동의 결과를 도 4에 나타내고, 밀도분포 정량의 결과를 밀도계 도 5에 나타내었다. 도 4의 전기영동 결과를 살펴보면, 본 발명의 발효 대두펩티드를 대두박과 비교하였을 때 대두박의 단백질이 작은 크기의 펩티드 형태로 전환되었음을 알 수 있다. 또한 본 발명의 발효 대두펩티드는 기존의 제품에 비해서도 크기가 작은 분자 쪽으로 단백질의 밀도가 치우쳐져 있다. 도 5에서도 본 발명 발효대두펩티드의 분자량 25,000 Da 이하 크기의 펩티드가 전체 단백질의 70%이며 대두박 및 타제품보다 25~30% 높게 분포하고 있음을 보여준다.Soy protein fed to livestock is hydrolysed by digestive enzymes in the stomach and intestines and absorbed in the form of peptides or amino acids. Therefore, it is very advantageous to feed the protein feed in the form of hydrolyzed peptides to increase the digestion absorption rate of the protein. The fermented soybean peptide of the present invention is hydrolyzed soybean protein by a protease secreted by microorganisms during fermentation of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP). Therefore, in order to know the degree of hydrolysis of the fermented soybean peptide of the present invention, the soybean meal, the fermented soybean peptide of the present invention, and the conventional imported soy protein processed product were dissolved in distilled water to extract proteins, followed by electrophoresis on 12.5% protein electrophoresis gel. , The electrophoretic gel is quantified using a densitometer (densitometer) with a density distribution of molecular weight 25,000 Da or more. The results of electrophoresis are shown in FIG. 4, and the results of density distribution quantification are shown in FIG. 5. Referring to the electrophoresis result of Figure 4, when comparing the fermented soybean peptide of the present invention with soybean meal it can be seen that the protein of soybean meal was converted to the peptide of the small size. In addition, the fermented soybean peptide of the present invention has a density of protein toward the smaller molecule compared to the conventional product. 5 also shows that the peptide having a molecular weight of 25,000 Da or less of the fermented soybean peptide of the present invention is 70% of the total protein and 25-30% higher than soybean meal and other products.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예와 도면을 들어 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific configuration of the present invention will be described with reference to examples and drawings, but the scope of the present invention is not limited only to the following examples.
실시예 1 : 변이균주의 분리 및 선발Example 1 Isolation and Selection of Mutant Strains
미생물 발효에 의한 방법으로 대두박의 탄수화물을 제거하기 위하여 사료용 미생물로 사용가능하며 전분 당화력이 뛰어난 아스퍼질러스 오리재 균주를 전통메주에서 분리하였다. 전통메주 1g을 10mL의 멸균 생리식염수에 현탁하여 10-1∼10-5의 비율로 희석하여 희석액 100μL를 클로람페니콜(chloramphenicol) 100μg/mL을 포함하는 포테이토 덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar)에 도말하고 30℃에서 48-56시간 배양한 후 황색 포자를 형성하는 콜로니(colony)를 수집한 다음 현미경으로 균사의 형태, 분생포자경(conidiophore), 경자(phialide), 분생포자의 모양을 관찰하여 아스퍼질러스 오리재 친주를 1차 선발하였다. 분리된 균주를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 5일간 배양하여 분생포자를 수집한 후 0.5%(w/v)의 셀렌산나트륨(Sodium selanate, Na2SeO4) 및 5%(w/v)의 불용성 전분을 포함하는 한천배지에 1×106의 상기 균주 분생포자를 도말한 다음 30℃에서 48시간 배양하여 전분 분해환이 큰 변이균주를 2차 선발하였다. 상기균주의 포자를 수분함량 40%로 침지하고 살균한 대두박에 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 다음 아밀라제 역가가 높고 대두박의 조단백질 함량을 가장 많이 변화시키는 균주를 최종 선발하였다. 상기 본 발명 균주를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107로 명명하고, 생명공학연구소 유전자센터에 2002년 5월 16일에 기탁번호 KCTC 10258BP로 기탁하였다.Aspergillus duck strain, which can be used as a microorganism for feed and removes carbohydrate from soybean meal by microbial fermentation, has been isolated from traditional meju. And smeared on a traditional suspended Meju 1g into a sterile saline solution of 10mL 10 -1 ~10 potato dextrose agar medium (potato dextrose agar) containing chloramphenicol (chloramphenicol) 100μg / mL the dilution 100μL diluted at a ratio of -5 After 48-56 hours of incubation at 30 ° C, colonies forming yellow spores were collected, and then aspergillus observed under the microscope for the form of hyphae, conidiophore, phialide, and conidia. The first parent stock was selected. The isolated strains were cultured in potato dextrose agar medium for 5 days to collect conidia and then 0.5% (w / v) sodium selanate (Na 2 SeO 4 ) and 5% (w / v) insoluble. Strain the conidia of spores of 1 × 10 6 in agar medium containing starch and then incubated for 48 hours at 30 ℃ to select a second strain strain with a large starch degradation ring. The spores of the strain were immersed in 40% water content, inoculated in sterilized soybean meal, incubated at 30 ° C. for 48 hours, and finally selected strains having a high amylase titer and changing crude protein content of soybean meal most. The strain of the present invention was named aspergillus oryzae GB-107, and deposited on May 16, 2002 with the accession number KCTC 10258BP in the Biotechnology Research Institute Gene Center.
본 발명 균주의 균학적 성질을 표 1에 나타내었고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 친주와 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillusoryzae) GB-107의 콜로니 형태 및 포자색상을 비교한 사진을 도 1에 나타내었다.The bacteriological properties of the strains of the present invention are shown in Table 1, and a photograph comparing the colony form and spore color of Aspergillus oryzae strains and Aspergillusoryzae GB-107 of the present invention is shown. 1 is shown.
실시예 2 : 대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재 GB-107(KCTC 10258BP) 발효에 의한 효소 생성 및 조단백 함량의 변화Example 2 Change of Enzyme Production and Crude Protein Content by Fermentation of Aspergillus Duck Material GB-107 (KCTC 10258BP) of the Present Invention According to Water Content of Soybean Meal
대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 효소 생성 및 조단백질 함량의 변화를 조사하기 위하여 조단백질 함량이 45.9%인 대두박을 수분함량 30%, 40%, 50%, 60%로 하여 각각의 수분함량별 대두박 200g을 스테인레스 스틸(stainless steel)로 된 체에 담아서 알루미늄 포일(aluminum foil)을 덮어씌우고 100℃에서 30분간 멸균한 후 30℃로 식혔다. 그 다음 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP) 분생포자 현탁액(5×108/mL) 5mL를 상기 수분함량 30%, 40%,50%, 60%로 하여 제조된 대두박 배지에 분사하여 골고루 섞은 후 30℃ 배양기에서 48시간 배양 후 50℃ 건조기에서 수분함량 8%가 될 때까지 건조하여 각 샘플의 아밀라제, 프로테아제 활성도 및 조단백질 함량을 조사하였다. 이때, 상기 효소 활성도를 측정하기 위하여 상기 수분함량 30%, 40%, 50%, 60%로 하여 제조된 대두박 배지 시료 10g을 막자사발에 갈아 매스 플라스크에 담은 후 증류수를 100mL까지 채우고 30분간 교반하고 2시간 정치한 후 10분간 원심분리(10,000×g, 4℃)하여 얻은 상등액을 사용하였다. 아밀라제 활성은 가용성 전분(20mM 인산나트륨 버퍼 내 1%, pH 7.0)을 기질로 하여 생성된 총 환원당을 DNS(dinitrosalicylic acid)법[Miller, Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428, 1959]으로 측정하였고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 프로테아제 활성은 카세인(20mM Tris-HCl 버퍼 내 0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(tyrosine)을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4: 101, 1978]으로 측정하였고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 조단백질 함량은 킬달장치(Kjeldahl system)로 측정하였다. 상기 방법에 의한 결과를 표 2에 나타내었다.Soybean meal containing 45.9% crude protein in water content of 30%, 40 to investigate the enzyme production and crude protein content of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) according to the moisture content of soybean meal %, 50%, 60% of each soybean meal 200g soaked in a stainless steel (stainless steel) sieve covered with aluminum foil (aluminum foil), sterilized for 30 minutes at 100 ℃ and cooled to 30 ℃. Subsequently, 5 mL of the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) conidia spore suspension (5 × 10 8 / mL) was prepared as the water content of 30%, 40%, 50%, 60%. After spraying the soybean meal medium evenly mixed and incubated for 48 hours in a 30 ℃ incubator and dried until the water content of 8% in a 50 ℃ dryer to investigate the amylase, protease activity and crude protein content of each sample. At this time, in order to measure the enzyme activity 10g of soybean meal medium samples prepared by the water content of 30%, 40%, 50%, 60% in a mortar and grind in a flask, filled with distilled water up to 100mL and stirred for 30 minutes After standing for 2 hours, the supernatant obtained by centrifugation (10,000 × g, 4 ° C.) for 10 minutes was used. The amylase activity was determined by using the DNS (dinitrosalicylic acid) method (Miller, Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar.) Based on total soluble starch (1% in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0). Anal. Chem. 31: 426-428, 1959], enzyme 1 U (unit) was determined by the amount of enzyme that liberates 1 μmol of product per minute. The protease activity was determined by the Folin method [Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4:], after tyrosine produced after the enzyme reaction using casein (0.7% in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0) as a substrate. 101, 1978], enzyme 1 U (unit) was determined by the amount of enzyme that liberates 1 μmol of product per minute. Crude protein content was measured by Kjeldahl system. The results by the above method are shown in Table 2.
아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 생균수 및 프로테아제 역가는 대두박의 초기수분함량이 40%일 때 가장 높고, 아밀라제 역가 및 발효 대두박의 조단백질 함량은 초기 수분함량이 50%일 때 가장 높게 나타났다. 따라서, 발효 대두펩티드를 제조하기 위한 대두의 최적 수분함량은 40~50%임을 알 수 있다. 또한 표 2에서 발효 대두박의 조단백질 함량은 아밀라제 역가에 따라 변화하고 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 생균수와는 일치하지 않는 것으로 나타났다. 이것은 아밀라제가 대두박의 탄수화물을 가수분해하여 미생물이 성장에 필요한 에너지로 소진하는데 중요한 역할을 하고 있음을 보여준다.The viable cell count and protease titer of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) were highest when the initial moisture content of soybean meal was 40%, and the crude protein content of amylase titer and fermented soybean meal was 50 It was highest when it was%. Therefore, it can be seen that the optimum moisture content of soybean for preparing the fermented soybean peptide is 40 to 50%. In addition, in Table 2, the crude protein content of fermented soybean meal was changed according to the amylase titer and did not coincide with the viable cell count of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP). This suggests that amylase plays an important role in hydrolyzing the carbohydrates of soybean meal, thus consuming microorganisms with the energy needed for growth.
실시예 3 : 대두박의 열처리 조건에 따라서 본 발명 아스퍼질러스 오리재 (Example 3 Aspergillus duck material of the present invention according to the heat treatment conditions of soybean meal ( Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae ) GB-107(KCTC 10258BP) 발효 후 항영양인자 및 단백질의 용해도 변화Changes in Solubility of Antinutrients and Proteins after Fermentation of GB-107 (KCTC 10258BP)
대두박의 열처리 조건에 따라서 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효 후 대두박의 항영양인자로 알려진 트립신저해인자 및 라피노스, 스타키오스 함량과 단백질의 용해도를 알 수 있는 단백질확산지수(protein dispersibility index PDI) 및 KOH 용해도를 조사하였다. 본 실시예에서는 대두박을 수분함량 40~50%로 침지하여 열 처리를 하지 않은 것과 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 100℃에서 1시간 열처리한 후 각각의 샘플을 실시예 2의 방법에 따라 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효하여 55℃ 건조기에서 수분함량 8%로 건조하였다.According to the heat treatment conditions of soybean meal, trypsin inhibitor factor, raffinose, starchiose content and solubility of protein known as anti-nutritive factors of soybean meal after fermentation of the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) Protein dispersibility index (PDI) and KOH solubility were investigated. In this example, the soybean meal was immersed in a water content of 40 to 50% and not heat-treated, and each sample was heat-treated at 60 ° C., 70 ° C., 80 ° C., 90 ° C., and 100 ° C. for 1 hour. According to the present invention, Aspergillus oryzae ( Aspergillus oryzae ) GB-107 (KCTC 10258BP) was fermented and dried in a 55 ℃ drier with a water content of 8%.
트립신저해인자 역가는 AACC-71-10(American association of cereal chemists, 1995)의 방법에 따라 측정하였고, 라피노스 및 스타키오스는 액상 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)로 정량하였으며, 단백질확산지수는 시료 0.5g을 물 150mL에 넣어 8,500rpm으로 10분간 섞은 다음 여과하여 여액에 대한 질소함량을 킬달장치로 측정하여 용해도를 환산하였고(Batal 등, Protein dispersibility index as an indicator of adequately processed soybean meal. Poult Sci. 79:1592-6, 2000), KOH 용해도는 시료 0.1g을 0.2% KOH수용액에 넣어 20분간 혼합한 다음 여과하여 여액에 대한 질소함량을 킬달장치로 측정하여 용해도를 환산하였으며(Parsons 등, Soybean protein solubility in potassiumhydroxide: an in vitro test of in vivo protein quality. J Anim Sci. 69:2918-24, 1991), 그 결과를 표 3에 나타내었다.Trypsin inhibitor titers were determined according to the method of AACC-71-10 (American association of cereal chemists, 1995), raffinose and starchiose were quantified by liquid chromatography (LC), and the protein diffusion index was 0.5. g was added to 150 mL of water and mixed at 8,500 rpm for 10 minutes, followed by filtration to determine the solubility by measuring the nitrogen content of the filtrate with a Kjeldahl device (Batal et al., Protein dispersibility index as an indicator of adequately processed soybean meal.Poult Sci. 79 (1592-6, 2000), KOH solubility was measured by adding 0.1 g of sample to 0.2% KOH solution for 20 minutes, and then filtering and measuring the nitrogen content of the filtrate by Kjeldahl device (Parsons et al. in potassium hydroxide: an in vitro test of in vivo protein quality.J Anim Sci. 69: 2918-24, 1991), and the results are shown in Table 3.
대두박의 항영향인자인 트립신저해인자는 단백질이기 때문에 이를 제거하기 위하여 전통적으로 열처리 방법을 이용해왔다. 그러나 대두박을 열처리 가공했을 때 트립신저해인자 뿐만 아니라 대두단백질의 변성이 동시에 일어나므로 과열 처리될 경우 가축의 영양소 이용율이 현저히 떨어진다. 따라서 대두박 가공에서 과열처리에 대한 지표로 단백질확산지수와 KOH 용해도를 이용한다. 표 3에서 열처리 온도가 올라갈수록 트립신저해인자 역가와 단백질 확산지수가 연속적으로 떨어지지만 열처리하지 않은 대두박을 발효한 것과 발효하지 않은 것을 비교해 보았을 때 트립신저해인자는 43%로 감소하였지만 단백질확산지수는 오히려 증가하였고 KOH 용해도는 조금 감소하였다. 상기는 대두박의 본 발명 균주의 발효가 단백질의 용해도에영향을 미치지 않으면서 트립신저해인자를 현저히 감소시키는 사실을 설명한다. 또한 표 3에서 대두박의 다른 항영향인자인 스타키오스와 라피노스도 본 발명 균주의 발효에 의하여 현저히 감소하였다. 본 발명의 발효 대두펩티드 제조를 위한 균주 발효에 의한 생물학적 가공에서 트립신저해인자와 KOH 용해도를 고려한다면 대두박을 60℃~80℃에서 1시간 열처리하여 발효하는 것이 효율적이며, 특히 70℃에서 1시간 열처리하여 발효하는 것이 가장 효율적이다.Since soybean meal is a protein, trypsin inhibitor is traditionally used to remove it. However, when soybean meal is heat-treated, soy protein is denatured at the same time as trypsin inhibitory factor, so the nutrient utilization rate of livestock is significantly lowered when overheated. Therefore, protein diffusion index and KOH solubility are used as indicators for overheating in soybean meal processing. In Table 3, the tryptic inhibitor titer and protein diffusion index decreased continuously as the heat treatment temperature increased, but the trypsin inhibitor factor decreased to 43% when compared with the fermentation of untreated soybean meal and no fermentation. KOH solubility was slightly decreased. This demonstrates that the fermentation of the strain of the invention of soybean meal significantly reduces trypsin inhibitors without affecting the solubility of the protein. In addition, in Table 3, the other anti-affecting factors of soybean meal, Stachyose and Raffinose, were also significantly reduced by the fermentation of the strain of the present invention. Considering trypsin inhibitor and KOH solubility in biological processing by strain fermentation for the production of fermented soybean peptide of the present invention, it is efficient to ferment soybean meal by heat treatment at 60 ℃ ~ 80 ℃ for 1 hour, especially at 70 ℃ for 1 hour Fermentation is most efficient.
실시예 4 : 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Example 4 Aspergillus duck material of the present invention ( Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae ) GB-107(KCTC 10258BP) 이용한 본 발명 발효 대두펩티드 제조) Fermented Soybean Peptide of the Present Invention Using GB-107 (KCTC 10258BP)
조단백질 함량 45~48%를 포함하는 대두박을 수분함량 40~50% 로 맞추어 30분 동안 침지한 후 70℃에서 1시간 열처리하고 품온이 35℃가 될 때까지 식혔다. 대두박 원료가 식으면 본 발명 균주 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 종 배양한 종국을 대두박 원료 kg당 2g 넣어 골고루 섞은 후 베드-펙키드(bed-packed) 고체발효기에서 대두원료의 두께를 약 10㎝로 하여 평평하게 고른 다음 30℃로 유지시키면서 12시간동안 분생포자를 발아시켰다. 분생포자의 발아가 완료되면 상기의 대두박 원료를 배지 품온이 30-33℃로 유지시키면서 24시간 배양한 후 품온을 35~37℃로 유지시켜 12시간 더 배양하였다. 배양이 완료된 대두박은 50℃에서 열풍 건조한 후 분쇄하여 본 발명 발효 대두펩티드를 제조하였다. 본 발명에 의한 대두 펩티드 가공은 종래의 화학적 가공 방법보다 생산비가 매우 저렴할 뿐만 아니라 본 발명에 의하여 제조된 발효 대두펩티드는 트립신저해제역가가 현저히 낮고, 단백질의 용해도가 종래의 대두단백질보다 높으며, 특히 단백질 확산지수는 약 2~5배 높은 것으로 나타났다. 본 발명 발효대두펩티드와 국외에서 수입된 기존 대두단백질 견품들을 구입하여 대두단백질의 특성을 나타내는 조단백질 함량, 트립신저해인자, 단백질확산지수, KOH 용해도를 조사하여 표 4에 나타내었다.Soybean meal containing a crude protein content of 45 ~ 48% was immersed for 30 minutes after adjusting to a water content of 40 ~ 50%, heat-treated at 70 ℃ for 1 hour and cooled until the temperature reaches 35 ℃. When the soybean meal raw material is cooled, 2g per kg of soybean meal raw material is mixed evenly after seed culture of the strain of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) of the present invention is mixed, and then the bed-packed solid fermenter The soybean raw material at about 10cm thickness was evenly flattened and then condensed spores for 12 hours while maintaining at 30 ℃. When the germination of conidia was completed, the soybean meal raw material was incubated for 24 hours while the medium temperature was maintained at 30-33 ° C., and then the product temperature was maintained at 35 to 37 ° C. for 12 hours. Cultured soybean meal was pulverized after hot air drying at 50 ℃ to prepare the fermented soybean peptide of the present invention. The soybean peptide processing according to the present invention not only has a much lower production cost than the conventional chemical processing method, but the fermented soybean peptide prepared according to the present invention has a significantly lower trypsin inhibitor titer, and the solubility of the protein is higher than that of the conventional soy protein. The diffusion index was about 2 to 5 times higher. The fermented soybean peptides of the present invention and the conventional soy protein products imported from abroad were purchased and the crude protein content, trypsin inhibitor, protein diffusion index, and KOH solubility were shown in Table 4.
실시예 5 : 본 발명 발효 대두펩티드의 가수분해화 정도Example 5 Degree of Hydrolysis of the Fermented Soy Peptides of the Present Invention
가축에 급여된 대두단백질은 위와 장에서 소화효소에 의하여 가수분해되어 펩티드 혹은 아미노산 형태로 흡수된다. 따라서 단백질의 소화 흡수율을 높이기 위해서는 가수분해된 펩티드 형태의 단백질사료를 급여하는 것이 매우 유리하다. 본 발명 발효 대두펩티드는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)의 발효과정에서 미생물이 분비하는 프로테아제의 의하여 대두단백질이 가수분해되어 있다. 대두박과 본 발명 발효대두펩티드 및 종래의 수입 대두단백질 가공제품들을 증류수에 용해하여 단백질을 추출한 다음, 12.5% 단백질 전기영동 젤에전기영동하여 그 결과를 도 4에 나타내었고, 전기영동 젤을 밀도계(Densitometer)로 분자량 25,000 Da 이상 및 이하의 밀도분포를 정량화하여 도 5에 나타내었다. 도 4에서 살펴보면, 본 발명의 발효 대두단백을 대두박과 비교하였을 때 대두박의 단백질이 작은 크기의 펩티드 형태로 전환되었음을 알 수 있다. 또한 기존의 제품에 비해서도 단백질의 밀도가 크기가 작은 분자 쪽으로 치우쳐져 있다. 도 5에서도 본 발명 발효대두펩티드의 분자량 25,000 Da 이하 크기의 펩티드가 전체 단백질의 70%이며 대두박 및 타제품보다 25∼30% 높게 분포하고 있음을 보여준다.Soy protein fed to livestock is hydrolysed by digestive enzymes in the stomach and intestines and absorbed in the form of peptides or amino acids. Therefore, it is very advantageous to feed the protein feed in the form of hydrolyzed peptides to increase the digestion absorption rate of the protein. The fermented soybean peptide of the present invention is hydrolyzed soybean protein by protease secreted by microorganisms during fermentation of Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP). Soybean meal and the fermented soybean peptide of the present invention and conventional imported soy protein processed products were dissolved in distilled water to extract the protein, and then electrophoresed in 12.5% protein electrophoresis gel and the results are shown in Figure 4, the electrophoresis gel density meter The density distribution of molecular weight 25,000 Da and below was quantified by (Densitometer), and is shown in FIG. 5. Looking at Figure 4, it can be seen that the protein of soybean meal is converted into a peptide of small size when compared with the soybean meal fermented soy protein of the present invention. In addition, compared to conventional products, the density of proteins is biased toward smaller molecules. 5 also shows that the peptide having a molecular weight of 25,000 Da or less of the present invention fermented soybean peptide is 70% of the total protein and 25-30% higher than soybean meal and other products.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)은 매우 높은 아밀라제 활성을 갖고 있으므로 대두박의 상대적인 조단백질 함량을 농축시키는 효과가 있고 대두박의 항영양인자인 라피노스와 스타키오스를 제거하는 효과가 있으며, 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-107(KCTC 10258BP)을 이용한 발효 대두펩티드 제조방법은 생산비가 절감하고 대두단백의 트립신저해인자를 현저하게 제거하며 단백질의 용해도를 높일 뿐만 아니라 대두단백질이 미생물의 프로테아제에 의하여 가수분해되어 작은 크기의 펩티드화되는 뛰어난 효과가 있어 본 발명에 의해 제조된 발효대두펩티드를 어린 돼지 사료 또는 가축사료에 배합되어 사용되었을 때 가축의 설사를 방지하고 성장을 촉진시켜 생산성을 증대시킬 수 있는 고품질의 단백질 사료를 제공하므로 사료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) has a very high amylase activity, so it has the effect of concentrating the relative crude protein content of soybean meal and anti-nutritive factors of raffinose and soybean meal. There is an effect of removing the starchios, fermented soybean peptide production method using the present invention Aspergillus oryzae GB-107 (KCTC 10258BP) reduces the production cost and significantly removes trypsin inhibitors of soy protein In addition to increasing the solubility of the protein, soy protein is hydrolyzed by the microbial protease and has an excellent effect of small peptides. When the fermented soybean peptide prepared according to the present invention is used in combination with young pig feed or livestock feed, Increase productivity by preventing livestock diarrhea and promoting growth It is a very useful invention in the feed industry because it provides a high quality protein feed.
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