KR100458362B1 - Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 유래된 단백질인 삭사틸린(saxatilin), 그의 제조방법과 혈소판 응집억제제 및 항암제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 삭사틸린을 한국산 칠점사의 독소에서 정제하고, cDNA를 클로닝하여 재조합 삭살틸린을 발현시키는 벡터 및 이것으로 형질전환된 형질전환체를 작제하였으며, 전기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 재조합 삭사틸린을 수득하였다. 본 발명의 삭사틸린은 효과적으로 혈소판 응집을 억제할 수 있음은 물론, 종양 혈관신생을 강력하게 저해하므로, 삭사틸린은 혈소판 응집억제제 및 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a saxatilin, a protein derived from the toxin of Agkistrodon saxatilis emelianov, and its preparation method and its use as a platelet aggregation inhibitor and an anticancer agent. The present inventors purified saxatilin from toxins from Korea's Seven Points, cloned cDNA, and constructed a vector expressing recombinant saxatilin and transformants transformed therewith, culturing the electric transformants, and recombining therefrom. Saxatilin was obtained. Since saxatilin of the present invention can effectively inhibit platelet aggregation, and strongly inhibit tumor angiogenesis, saxatilin may be usefully used as an active ingredient of platelet aggregation inhibitors and anticancer agents.

Description

한국산 칠점사로부터 유래된 단백질 및 그의 제조방법{Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same}Protein Derived from Korean Chilgoksa and its manufacturing method {Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same}

종양의 침윤(invasion)과 전이(metastasis)는 암세포가 신체 전반에 걸쳐 치사에 이르기까지 확산되는 과정을 의미한다. 먼저, 암세포가 최초의 위치(주로 내피조직)로부터 분리되어 나온 다음, 암세포와 다른 조직층을 분리하는 기저막(basement membrane)을 통과한다. 이러한 침윤세포들의 일부는 내피세포 층 뿐만 아니라 혈관을 둘러싸고 있는 기저막까지도 통과할 수 있으며, 따라서 혈관을 통하여 자유롭게 순환하다가 결국에는 모세혈관에 정착할 수도 있다. 또한, 이들 암세포가 또 다시 모세혈관을 통과한다면, 이차 종양을 생성할 수도 있는데, 이때,일차 종양으로부터 분리되어 나온 암세포가 생존하여 다른 조직에 정착함으로써 이차 종양을 생성하게 될 확률은 1/10,000 이하이다(참조: Erkki Ruoslahti, Scientific American, 72-77, Sep, 1996).Tumor invasion and metastasis refers to the process by which cancer cells spread throughout the body to death. First, cancer cells are separated from their original location (usually endothelial tissue) and then pass through a basement membrane that separates cancer cells from other tissue layers. Some of these infiltrating cells can pass not only to the endothelial cell layer but also to the basement membrane surrounding the blood vessels, so that they can circulate freely through the blood vessels and eventually settle in capillaries. In addition, if these cancer cells pass through capillaries again, they may produce secondary tumors, with the probability that cancer cells isolated from the primary tumor will survive and settle in other tissues to produce secondary tumors of less than 1 / 10,000. (Erkki Ruoslahti, Scientific American, 72-77, Sep, 1996).

종양전이와 침윤에는 세포와 세포간질(extracellular matrix, ECM)간의 유착성 상호작용이 요구된다. 종양전이의 과정에서, 암세포는 내피세포의 사멸을 초래하는데, 이는 결과적으로 기저세포막을 노출시킴으로써 암세포가 효과적으로 주변부 기질(surrounding stroma)의 세포간질(ECM) 단백질들에 유착할 수 있도록 한다(참조: Hynes, R. O., Cell, 48:549, 1987). 이러한 기질 단백질들은 인테그린(integrin) 패밀리를 포함한 특정한 세포표면 수용체와 결합함으로써 세포유착을 촉진시킨다.Tumor metastasis and invasion require adhesive interactions between cells and extracellular matrix (ECM). During the course of tumor metastasis, cancer cells cause endothelial cell death, which in turn exposes the basal cell membrane, allowing the cancer cells to effectively adhere to the intercellular stromal (ECM) proteins of the surrounding stroma. Hynes, RO, Cell, 48: 549, 1987). These matrix proteins promote cell adhesion by binding to specific cell surface receptors, including the integrin family.

구조적으로, 각각의 인테그린은 α,β 서브유닛이 비공유결합으로 연결된 헤테로다이머이다. β1 서브패밀리는 세포간질 유착의 주요 매개인자로 알려져 왔으며, 다른 기능들, 예를 들면 세포-세포 유착의 직접적인 매개와 같은 기능을 가지고 있을 지도 모른다는 연구보고가 있다(참조: Larjava, H. et al., J. Cell. Biol., 110:803-815, 1990). 백혈구에서 발견되는 β2 서브패밀리는 세포-세포 상호작용을 매개하는 수용체를 포함한다. β3 서브패밀리는 혈소판 당단백질인 IIb/IIIa 복합체와 비트로넥틴(vitronectin) 수용체를 포함하며, 종양의 침윤성과 악성종양으로의 발달에 있어 중요한 역할을 할 가능성을 내포하고 있다(참조: Albelda, S. M. et al., Cancer Res., 50:6757-6764, 1990).Structurally, each integrin is a heterodimer with α, β subunits linked non-covalently. The β1 subfamily has been known as a major mediator of interstitial adhesions and there are reports that it may have other functions, such as direct mediation of cell-cell adhesion (Larjava, H. et. al., J. Cell. Biol., 110: 803-815, 1990). The β2 subfamily found in leukocytes contains receptors that mediate cell-cell interactions. The β3 subfamily contains platelet glycoproteins IIb / IIIa complexes and vitronectin receptors, and has the potential to play an important role in tumor invasion and development into malignancies (Albelda, SM et. al., Cancer Res., 50: 6757-6764, 1990).

세포막을 가로지르는 인테그린 수용체 복합체는 세포내세포골격(cytoskeletal) 네트워크와 세포외 환경을 연결시켜 주는 역할을 한다. 피브리노겐(fibrinogen), 비트로넥틴 및 라미닌(laminin)과 같은 세포유착 분자들에서 나타나는 특징적인 핵심 서열들은 세포유착과 세포의 전파(spread) 또는 통합(integration)에 기여하는 것으로 알려져 왔다. 한편, 종양의 생성과 전이는 인테그린의 역할과 밀접한 연관이 있음이 제시되어 왔다(참조: Giancotti, F. G. and Rouslahti, E., Cell, 60:849-859, 1990; Hynes, R. O., Cell, 69:11-25, 1992; Nip, J. et al., J. Clin. Invest., 96:2096-2103, 1995). 피브로넥틴(fibronectin) 수용체 α5β1의 과다발현은 CHO(Chinese hamster ovary) 세포의 형질전이된 표현형을 억제하며, ras로 형질전이된 설치류 세포에서는 인테그린 α5β1의 발현이 감소하는 것이 확인된 바 있다(참조: Plantefaben, L. C. and Hynes, R. O., Cell, 56:281-290, 1989). 피브로넥틴의 폴리머 형태인 수퍼피브로넥틴은 종양전이와 생성을 방지하는 것으로 보고된 바 있다(참조: Pasqualini, R. et al., Nature Medicine, 2:1197-1203, 1996).The integrin receptor complex across the cell membrane links the cytoskeletal network with the extracellular environment. Characteristic key sequences present in cytoadhesion molecules such as fibrinogen, vitronectin, and laminin have been known to contribute to cell adhesion and spread or integration of cells. On the other hand, it has been suggested that tumor formation and metastasis are closely related to the role of integrin (Giancotti, FG and Rouslahti, E., Cell, 60: 849-859, 1990; Hynes, RO, Cell, 69: 11-25, 1992; Nip, J. et al., J. Clin. Invest., 96: 2096-2103, 1995). Overexpression of the fibronectin receptor α5β1 inhibits the transgenic phenotype of Chinese hamster ovary (CHO) cells and has been shown to reduce the expression of integrin α5β1 in rodent cells transfected with ras (Plantefaben). , LC and Hynes, RO, Cell, 56: 281-290, 1989). Superfibronectin, a polymer form of fibronectin, has been reported to prevent tumor metastasis and production (Pasqualini, R. et al., Nature Medicine, 2: 1197-1203, 1996).

인테그린 αvβ3는 대부분의 악성종양세포의 표식인자이며, 이러한 사실은 악성 인체 멜라노마(melanoma)의 성장에 있어 전기 유착 수용체의 역할을 제시하는 것이다(참조: Albelda, S. M. et al., Cancer Res., 50:6757-6764, 1990). 인테그린 αv 유전자의 발현과 그에 따른 유착성 표현형은 생체내 조건에서 인체 멜라노마의 증식에 직접적으로 관여한다(참조: Felding-Habermann, J. Clin. Invest., 89:2018-2022, 1992).Integrin αvβ3 is a marker of most malignant tumor cells, suggesting the role of electroadhesive receptors in the growth of malignant human melanoma (Albelda, SM et al., Cancer Res., 50: 6757-6764, 1990). The expression of the integrin αv gene and hence the adherent phenotype is directly involved in the proliferation of human melanoma in vivo (Felding-Habermann, J. Clin. Invest., 89: 2018-2022, 1992).

한편, 혈관신생(angiogenesis)은 이미 존재하는 혈관이 성장함으로써 새로운혈관이 형성되는 과정을 의미한다(참조: Folkman, J. and D'Amore, P. A., Cell, 87:1153-1155, 1996). 혈관신생과정은 세포발달, 상처치유 및 염증에 있어서 중요한 역할을 하며, 종양의 발달에도 필수적이다. 혈관신생의 조절은 평활근과 내피세포에서 혈관세포 유착물질에 의하여 이루어진다(참조: Nguyen, M. et al., Nature, 365:267, 1993).Angiogenesis, on the other hand, refers to the process by which existing blood vessels grow to form new blood vessels (see Folkman, J. and D'Amore, P. A., Cell, 87: 1153-1155, 1996). Angiogenesis plays an important role in cell development, wound healing and inflammation and is essential for tumor development. Angiogenesis is regulated by vascular cell adhesion in smooth muscle and endothelial cells (Nguyen, M. et al., Nature, 365: 267, 1993).

종양의 혈관신생은 이에 관련된 양성 조절인자와 음성 조절인자 간의 균형의 변화에 기인할 수도 있다. 이와 관련하여, 최근에는 두 개의 싸이토카인(cytokine)-의존적 혈관신생 경로가 존재하는 것으로 보고된 바 있으며, 이들은 각기 두 가지 서로 다른 혈관세포 인테그린인 αvβ3와 αvβ5에 의하여 구별되는데, 전기 두 가지 인테그린은 신생된 혈관세포에서 발현되며, bFGF(basic fibroblast growth factor), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 인간 종양 단편(fragments of human tumors)에 의하여 유도되는 혈관신생에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(참조: Friedlander, M. et al., Science, 270:1500-1502, 1995). αvβ3 인테그린의 활성화는 혈관 성장과 분화를 촉진하는 생존 신호(survival signal)를 자극하며, 이러한 사실은 싸이토카인과 인테그린 수용체에 의한 신호전달이 새로운 혈관의 성장과 밀접하게 연관되어 있음을 보여준다(참조: Brooks, P. C. et al., Cell, 79:1157-1164, 1994).Angiogenesis of the tumor may be due to a change in the balance between the positive and negative regulators involved. In this regard, there have recently been reported two cytokine-dependent angiogenesis pathways, distinguished by two different vascular cell integrins, αvβ3 and αvβ5. In angiogenesis induced by basic fibroblast growth factor (bFGF), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), vascular endothelial growth factor (VEGF), and fragments of human tumors. Is known to play an important role (Friedlander, M. et al., Science, 270: 1500-1502, 1995). Activation of αvβ3 integrins stimulates survival signals that promote blood vessel growth and differentiation, suggesting that signaling by cytokine and integrin receptors is closely associated with the growth of new blood vessels (Brooks) , PC et al., Cell, 79: 1157-1164, 1994).

한편, αvβ3와 α5β1을 포함하는 몇몇 인테그린들의 강력한 길항제(antagonist)로 알려진 디스인테그린 패밀리는 주로 뱀독으로부터 유래되는작은 단백질류이다(참조: Niewiarowski, S. et al., Semin. Hematol., 31:289-300, 1994). 대부분의 디스인테그린은 혈소판 피브리노겐 수용체인 α2bβ3에 의하여 인식되는 구조 모티프인 Arg-Gly-Asp(RGD) 또는 Lys-Gly-Asp(KGD) 서열을 포함하고 있다. 종래의 연구보고에 의하면, 전기 RGD 서열을 포함하는 디스인테그린은 종양세포가 ECM에 유착되는 것을 방지함으로써 종양전이를 저해하는 것으로 알려져 있다(참조: Trikha, M. et al., Cancer Res., 54(8):4993-4998, 1994). 인테그린 αvβ3는 닭 배자와 사람에서 신생된 혈관의 표지로서 규명되었는데(참조: Brooks, P. C. et al., Science, 264:569-571, 1994), αvβ3에 대한 단일클론항체는 새로 형성된 혈관의 내피세포에서 세포유도사(apoptosis)를 유발함으로써 혈관신생을 저해한다. 인테그린 αvβ3에 리간드가 결합하는 것을 저해하는 것으로 알려진 RGD 서열을 포함하는 합성 펩티드는 CAM(chick chorioallantoic membrane)에서 종양에 의하여 유도되는(tumor-induced) 혈관신생을 억제한다(참조: Brooks, P. C. et al., Cell, 99:1157-1164, 1994). 또한, 내피세포의 유착과 확산을 돕는 비간접적 혈관신생의 인자로서 잘 알려져 있는 안지오제닌(angiogenin)의 기능은 합성된 RGD 펩티드에 의하여 저해받는다. 아울러, 최근에는 뱀 독소 유래의 디스인테그린인 트리플라빈(triflavin)이 TNF-α에 의하여 유도되는 혈관신생을 저해함이 보고된 바 있다. 이러한 연구보고들은 디스인테그린, 합성된 RGD 펩티드 및 항-αvβ3 단일클론항체가 항암제로서 개발될 수 있는 가능성을 제시하였다.On the other hand, the disintegrin family, known as a potent antagonist of several integrins, including αvβ3 and α5β1, is a small family of proteins primarily derived from snake venom (Niewiarowski, S. et al., Semin. Hematol., 31: 289 -300, 1994). Most disintegrins contain Arg-Gly-Asp (RGD) or Lys-Gly-Asp (KGD) sequences, structural motifs recognized by the platelet fibrinogen receptor α2bβ3. Previous studies have reported that disintegrins, which contain the foregoing RGD sequences, inhibit tumor metastasis by preventing tumor cells from adhering to ECM (Trikha, M. et al., Cancer Res., 54). (8): 4993-4998, 1994). Integrin αvβ3 has been identified as a marker of neovascularization in chicken embryos and humans (Brooks, PC et al., Science, 264: 569-571, 1994). Monoclonal antibodies against αvβ3 are known to form endothelial cells in newly formed blood vessels. Inhibits angiogenesis by inducing apoptosis. Synthetic peptides comprising RGD sequences known to inhibit ligand binding to integrin αvβ3 inhibit tumor-induced angiogenesis in chick chorioallantoic membranes (CAM) (Brooks, PC et al. , Cell, 99: 1157-1164, 1994). In addition, the function of angiogenin, which is well known as a factor of non-indirect angiogenesis that helps adhesion and proliferation of endothelial cells, is inhibited by the synthesized RGD peptide. Recently, triflavin, a disintegrin derived from snake toxin, has been reported to inhibit angiogenesis induced by TNF-α. These studies suggested the possibility that disintegrin, synthesized RGD peptide and anti-αvβ3 monoclonal antibodies could be developed as anticancer agents.

한편, 뱀 독소에는 혈전증(thrombosis)과 지혈(hemostasis)에 영향을 미치는 여러 가지 단백질들이 존재하고 있는 것을 알려져 있다. 그 중에서도 인체내에서혈소판의 비정상적인 응집으로 인한 혈전을 형성하는 경우 치명적인 혈전증을 야기할 수 있으므로, 각종 뱀독으로 부터 이러한 혈소판 응집을 억제하거나 촉진시키는 단백질들이 분리되었고 그들의 특성이 규명되었다. 혈소판 응집기작을 살펴보면, 혈소판에 존재하는 당단백질인 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 피브리노겐이 결합함으로써 혈소판 응집이 일어나는데, GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 대한 피브리노겐의 결합부에는 Arg-Gly-Asp(RGD) 아미노산 서열이 매우 중요한 것으로 알려져 있다(참조: Rouslagti and Pierschbacher, Science, 238:491-497, 1987). 따라서, 전기 아미노산 서열을 가진 단백질들은 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 피브리노겐이 결합하는 것을 경쟁적으로 방해함으로써, 혈소판 응집을 억제할 수 있는 것이다. 처음에 뱀독으로 부터 분리된 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 대한 억제제는 주로 5 내지 9kDa의 작은 단백질들이었으나(참조: Huanget al. J. Biol. Chem., 262:16157-16163, 1987), 이후 분자량이 큰 억제제를 포함한 여러 가지 혈소판 응집억제제들이 뱀독으로 부터 분리되었다. 이들 억제제는 모두 시스테인(Cys)잔기가 풍부하며, Arg-Gly-Asp 아미노산 서열에 의해GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 결합하는 공통적인 특징을 가지고 있다. 또한, 현재 키스트린(Kistrin)(참조: Alder et al., Science, 253:445-448, 1991; Alder et al., Biochemistry, 32:282-289, 1993), 플라보리딘(Flavoridin)(참조: Klaus et al., J. Mol. Biol., 232:897-906, 1993; Senn and Klaus, J. Mol. Biol., 232:907-925, 1993), 알보라브린(Albolabrin)(참조: Jaseja et al., Eur. J. Biochem., 218:853-860, 1993) 및 에키스타틴(Echistatin)(참조: Chen et al., Biochemistry, 30:11625-11636, 1991; Cooke et al., Eur. J. Biochemistry, 202:323-328, 1991;Cooke et al., Protein Eng., 5:473-477, 1992; Saudek et al., Biochemistry, 30:7369-7372, 1991; Dalvit et al., Eur. J. Biochem., 202:315-321, 1991) 등의 혈소판 응집 억제제들의 구조는 NMR을 통하여 밝혀졌으며, 이들 억제제들에 의한 GP Ⅱb-Ⅲa수용체에의 피브리노겐 결합방해는 동물모델을 통하여 명백히 규명되었다(참조: Collen, J. Clin. Invest., 76:101-108, 1985; Gold et al., Circulation, 77:670-677, 1988; Yasuda et al., J. Cln. Invest., 81:1284-1291, 1988; Collar et al., Blood, 68:783-786, 1986; Hanson et al., J. Clin. Invest., 81:149-158, 1988)).Snake toxins, on the other hand, are known to contain a variety of proteins that affect thrombosis and hemostasis. Among them, the formation of blood clots due to abnormal aggregation of platelets in the human body can cause fatal thrombosis. Therefore, proteins that inhibit or promote such platelet aggregation from various snake venom have been isolated and their characteristics have been identified. Looking at the platelet aggregation mechanism, platelet aggregation occurs by binding of fibrinogen to the GP IIb-IIIa receptor, a glycoprotein present in platelets, and the Arg-Gly-Asp (RGD) amino acid sequence at the binding portion of the fibrinogen to the GP IIb-IIIa receptor. This is known to be of great importance (see Rouslagti and Pierschbacher, Science, 238: 491-497, 1987). Thus, proteins with the above amino acid sequence can inhibit platelet aggregation by competitively inhibiting the binding of fibrinogen to the GP IIb-IIIa receptor. Initially, inhibitors for GP IIb-IIIa receptors isolated from snake venom were mainly small proteins of 5 to 9 kDa (Huange et al. J. Biol. Chem., 262: 16157-16163, 1987). Several platelet aggregation inhibitors, including large inhibitors, were isolated from snake venom. All of these inhibitors are rich in cysteine residues and have a common feature of binding to the GP IIb-IIIa receptor by the Arg-Gly-Asp amino acid sequence. In addition, Kistrin (Alder et al., Science, 253: 445-448, 1991; Alder et al., Biochemistry, 32: 282-289, 1993), Flavororidin (cf. : Klaus et al., J. Mol. Biol., 232: 897-906, 1993; Senn and Klaus, J. Mol. Biol., 232: 907-925, 1993), albolabrin (see: Jaseja et al., Eur. J. Biochem., 218: 853-860, 1993) and Echistatin (Chen et al., Biochemistry, 30: 11625-11636, 1991; Cooke et al., Eur J. Biochemistry, 202: 323-328, 1991; Cooke et al., Protein Eng., 5: 473-477, 1992; Saudek et al., Biochemistry, 30: 7369-7372, 1991; Dalvit et al., Eur. J. Biochem., 202: 315-321, 1991), the structure of platelet aggregation inhibitors, etc. have been revealed by NMR, and the inhibition of fibrinogen binding to GP IIb-IIIa receptors by these inhibitors is clearly shown in animal models. (Colen, J. Clin. Invest., 76: 101-108, 1985; Gold et al., Circulation, 77: 670-677, 1988; Yasuda et al., J. Cln. Invest., 81: 1284-1291, 1988; Collar et al., Blood, 68: 783-786, 1986; Hanson et al., J. Clin. Invest., 81: 149-158, 1988).

이와 관련하여, 한국에 서식하는 대표적인 독사 중에서 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)나 불독사(Caliginosus) 독의 경우에는 이미 많은 연구가 진행되어, 한국산 살모사의 독소로부터 유래된 살모신(Salmosin)은 분자량 약 7.5kDa의 단백질로서 강력한 혈소판 응집억제 펩티드로 알려졌으나(참조: 대한민국 특허 제 142606호), 칠점사의 독에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 그 이유는 칠점사가 다른 독사에 비해 한국에 서식하는 숫자가 극히 적어, 쉽게 구할 수 없기 때문이다. 그러나, 칠점사는 매우 독성이 강하여 치사율이 높다는 사실이 알려져 있으므로, 아마도 출혈과 관련이 있을 것이라는 가정하에 본 발명을 수행하게 되었다.In this regard, many studies have already been conducted in the case of Agkistrodon halys brevicaudus or Caliginosus venom among representative venomous snakes in Korea, and Salmosin derived from the toxins of Korean Salmonosa has a molecular weight of about 7.5. Although it is known as a potent platelet aggregation inhibitory peptide as a protein of kDa (refer to Republic of Korea Patent No. 142606), little research has been conducted on the poison of seven points. The reason is that the number of seven inhabitants in Korea is very small compared to other poisonous snakes. However, since it is known that the pilgrims are very toxic and have a high mortality rate, the present invention has been performed under the assumption that they are probably related to bleeding.

본 발명자들은 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 혈소판 응집억제활성을 갖는 단백질의 존재를 확인한 결과, 신규한 단백질인 삭사틸린을 발견하고, 전기 단백질에 대한 cDNA를 클로닝한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 재조합 삭사틸린을 효모 내에서 대량생산할 수 있음을 확인하고, 혈소판의 응집을 저해하는 효과를 보이며, 암세포의 성장 및 전이에 필수적인 종양 혈관신생을 정상 내피세포의 증식에 영향을 미치지 않으면서 강력하게 저해함으로써 암세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention confirmed the presence of a protein having platelet aggregation inhibitory activity from the toxin of the Korean Chilgapsa (Agkistrodon saxatilis emelianov), and discovered a novel protein, saxatilin, and transformed it with an expression vector that cloned the cDNA for the electric protein. It was confirmed that recombinant saxatilin can be mass-produced in yeast by using the microorganisms, and it has an effect of inhibiting platelet aggregation, and tumor angiogenesis essential for cancer cell growth and metastasis does not affect the proliferation of normal endothelial cells. The present invention has been found to be able to effectively inhibit the growth of cancer cells by strongly inhibiting the growth of cancer cells.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 한국산 칠점사의 독소로부터 유래된 삭사틸린을 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide a saxatilin derived from the toxin of the Korean Chilgoksa.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 삭사틸린을 코딩하는 cDNA를 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide a cDNA encoding electric saxatilin.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 cDNA에서 유추된 삭사틸린의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.A third object of the present invention is to provide the amino acid sequence of saxatilin inferred from the cDNA.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 삭사틸린을 효모에서 발현시키는 발현벡터를 제공하는 것이다.It is a fourth object of the present invention to provide an expression vector expressing saxatilin in yeast.

본 발명의 다섯번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.A fifth object of the present invention is to provide a microorganism transformed with the electric expression vector.

본 발명의 여섯번째 목적은 전기 형질전환체를 이용하여 재조합 삭사틸린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.A sixth object of the present invention is to provide a method for preparing recombinant saxatilin using an electric transformant.

본 발명의 일곱번째 목적은 전기 삭사틸린을 유효성분으로 함유하는 혈소판응집 억제제를 제공하는 것이다.It is a seventh object of the present invention to provide a platelet aggregation inhibitor containing an electric saxatilin as an active ingredient.

본 발명의 여덟번째 목적은 전기 삭사틸린을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.An eighth object of the present invention is to provide an anticancer agent containing an electric saxatilin as an active ingredient.

발명은 한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)로부터 유래된 단백질인 삭사틸린(Saxatilin), 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 칠점사의 독소로부터 유래된 단백질인 삭사틸린, 그의 제조방법과 혈소판 응집억제제 및 항암제로서의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to saxatilin, which is a protein derived from Korean Akkistrodon saxatilis emelianov, and a preparation method and use thereof. More specifically, the present invention relates to saxatilin, a protein derived from the toxin of Korean Chilgapsa, a method for preparing the same, and its use as a platelet aggregation inhibitor and an anticancer agent.

상술한 본 발명의 목적 및 구성은 하기 첨부도면 및 설명에 의하여 더욱 명확해 진다.The object and construction of the present invention described above will become more apparent from the accompanying drawings and description.

도 1은 본 발명의 혈소판 응집억제 단백질의 활성을 공지된 혈소판 응집억제제와 비교한 그래프이다.1 is a graph comparing the activity of platelet aggregation inhibitors of the present invention with known platelet aggregation inhibitors.

도 2는 삭사틸린의 발현벡터인 pPSAX의 유전자지도이다.2 is a genetic map of pPSAX, an expression vector of saxatilin.

도 3은 HUVEC의 성장에 대한 재조합 삭사틸린 및 살모신의 효과를 비교하여 나타내는 그래프이다.Figure 3 is a graph comparing the effect of recombinant saxatilin and salmosin on the growth of HUVEC.

도 4a는 비트로넥틴과 HUVEC의 유착에 대한 항-αvβ3 단일클론항체, GRGDSP, GRGETP 및 재조합 삭사틸린의 효과를 나타내는 그래프이다.4A is a graph showing the effect of anti-αvβ3 monoclonal antibodies, GRGDSP, GRGETP and recombinant saxatilin on the adhesion of Vitronectin with HUVEC.

도 4b는 삭사틸린과 HUVEC의 유착에 대한 항-αvβ3 단일클론항체, GRGDSP, GRGETP 및 재조합 삭사틸린의 효과를 나타내는 그래프이다.4B is a graph showing the effect of anti-αvβ3 monoclonal antibodies, GRGDSP, GRGETP and recombinant saxatilin on the adhesion of saxatilin to HUVEC.

도 5a는 bFGF로 유도된 CAM(chick chorioallantoic membrane) 혈관신생을 보여주는 사진이다.Figure 5a is a picture showing chick chorioallantoic membrane (CAM) angiogenesis induced by bFGF.

도 5b는 bFGF로 유도된 CAM 혈관신생에 재조합 삭사틸린이 미치는 영향을 보여주는 사진이다.Figure 5b is a photograph showing the effect of recombinant saxatilin on bFGF-induced CAM angiogenesis.

도 6a는 루이스(Lewis) 폐 종양이 감염되지 않은 건강한 폐의 조직사진이다.6A is a histology picture of healthy lungs that did not infect Lewis lung tumors.

도 6b는 PBS를 처리한 전이성 루이스 폐 종양 조직의 사진이다.6B is a photograph of metastatic Lewis lung tumor tissue treated with PBS.

도 6c는 재조합 삭사틸린을 처리한 전이성 루이스 폐 종양 조직의 사진이다.6C is a photograph of metastatic Lewis lung tumor tissue treated with recombinant saxatilin.

본 발명자들은 삭사틸린을 한국산 칠점사의 독소에서 정제하고, cDNA를 클로닝하여 재조합 삭사틸린을 발현시키는 벡터 및 이것으로 형질전환된 형질전환체를 작제하였으며, 전기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 재조합 삭사틸린을 수득하였다.The present inventors purified saxatilin from toxins from Korea's Seven Points, cloned cDNA, and constructed a vector expressing recombinant saxatilin and transformants transformed therewith, culturing the electric transformants, and recombining therefrom. Saxatilin was obtained.

이하, 한국산 칠점사로부터 삭사틸린을 정제하는 방법 및 재조합 삭사틸린을 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, a method for purifying saxatilin and a method for preparing a recombinant saxatilin from Korean Chilgapsa will be described in more detail.

한국산 칠점사의 독소를 채취한 다음, 독소를 젤 여과 및 HPLC 역상 크로마토그래피하는 2단계 정제과정을 통하여, 혈소판 응집을 억제하는 단백질를 정제하고, 그의 아미노산 서열을 분석한 결과, 신규한 단백질임을 확인하고 삭사틸린(Saxatilin)이라 명명하였다. 한국산 칠점사의 독소분비선에서 유래한 cDNA 라이브러리로부터 찾아낸 삭사틸린 cDNA의 N-말단에 제한효소(XhoI) 염기서열과 단백질 분해효소인 KEX2로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 첨가한 다음, 8.0kbp크기의 발현벡터인 pPIC9의 α-factor 분비신호단백질 C-말단부위의 XhoI-EcoRI 좌위에 삽입하여 발현벡터 pPSAX을 작제하였다. 작제된 발현벡터는 피키아 속(Pichia sp.), 한세눌라 속(Hansenula sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 등의 효모에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있으나, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115, SMD 1168, KM71 등의 피키아 파스토리스종 효모에 도입함이 바람직하다.After collecting toxins from Korean Chilgoksa, the purified protein that inhibits platelet aggregation through a two-step purification process by gel filtration and HPLC reverse phase chromatography, and analyzed the amino acid sequence of the toxin, confirming that it is a novel protein. It was named saxatilin. At the N-terminus of the saxatilin cDNA, which is derived from the cDNA library derived from the toxin gland of Korean Chilgoksa, the base sequence encoding the restriction enzyme (XhoI) sequence and the amino acid sequence which can be cleaved by the protease KEX2 was added. , The expression vector pPSAX was constructed by inserting the α-factor secretion signaling protein C-terminus of pPIC9, an 8.0 kbp size expression vector, into the XhoI-EcoRI locus. The constructed expression vector can be introduced into yeasts such as Pichia sp ., Hansenula sp ., Saccharomyces sp . Pichia pastoris It is preferable to introduce into Pichia pastoris yeast, such as GS115, SMD 1168, KM71.

피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 전기 벡터 pPSAX을 도입하여, 형질전환체를 제조하고, 제조된 형질전환체를 "피키아 파스토리스 Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)"라 명명하였으며, 이를 2000년 7월 21일 대한민국 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM-10201로 기탁하였다.A transformant was prepared by introducing an electric vector pPSAX into Pichia pastoris GS115, and the resulting transformant was named "Pichia pastoris Y / pPSAX". It was deposited on July 21, 2000 with the deposit number KCCM-10201 at the Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository institution located at 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea.

재조합 삭사틸린을 제조하는 방법은 전기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 재조합 삭사틸린을 수득하는 공정을 포함한다: 이때, 형질전환체는 형질전환체를 최소 글리세롤 배지에 접종하여 O.D₆₀₀1.0이 될 때까지 배양하고, 원심분리하여 배양액을 제거한 세포를 수득한 다음, 메탄올이 함유된 최소 메탄올 배지에 전기 세포를 현탁한 후, 유가식으로 배양한다. 여기에 사용되는 최소 글리세롤 배지는 질소원으로서 효모추출물 또는 펩톤 등을 0.5 내지 1.5%정도 포함하고, 탄소원으로서글리세롤, 덱스트로스 또는 글루코스 등을 0.5 내지 2.5%정도 포함하며, 그 외 극미량의 바이오틴 등을 포함하고, pH는 6.0의 배지이고, 최소 메탄올 배지는 최소 글리세롤 배지에 탄소원으로서 배지에 대하여 0.1 내지 1.0%(v/v), 바람직하게는 0.3 내지 0.8%(v/v), 가장 바람직하게는 0.5%(v/v)의 메탄올을 함유한 배지이다. 또한, 최소 글리세롤 배지에서 배양할 때, 배양 조건은 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃, 가장 바람직하게는 30℃에서 12 내지 24시간, 바람직하게는 16 내지 20시간, 가장 바람직하게는 18시간동안 배양하는 것이고, 최소 메탄올 배지에서 배양할 때는 전기 동일한 배양온도에서 72 내지 120시간, 바람직하게는 84 내지 108시간, 가장 바람직하게는 96시간동안 배양한다.Methods of preparing recombinant saxatilin include culturing the electrical transformants and obtaining recombinant saxatilins therefrom, wherein the transformants are inoculated with minimal glycerol medium to obtain an OD ₆₀₀ 1.0. The cells are cultured until centrifugation to obtain cells from which the culture solution is removed, and then the cells are suspended in minimal methanol medium containing methanol and then cultured by fed-batch. The minimum glycerol medium used herein includes about 0.5 to 1.5% of yeast extract or peptone as a nitrogen source, about 0.5 to 2.5% of glycerol, dextrose or glucose as a carbon source, and other trace amounts of biotin. The pH is 6.0 medium, the minimum methanol medium is 0.1 to 1.0% (v / v), preferably 0.3 to 0.8% (v / v), most preferably 0.5 to the medium as the carbon source in the minimum glycerol medium medium containing% (v / v) methanol. In addition, when incubated in a minimal glycerol medium, the culture conditions are 12 to 24 hours, preferably 16 to 20 hours, most preferably 25 to 35 ℃, preferably 28 to 32 ℃, most preferably 30 ℃ Incubate for 18 hours, and when incubated in a minimum of methanol medium at 72 to 120 hours, preferably 84 to 108 hours, most preferably 96 hours at the same incubation temperature.

한편, 전기 형질전환체를 배양한 배양액을 소수성컬럼과 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)에 적용하여 재조합 삭사틸린을 순수분리하는 데, 이때 소수성컬럼에 충진되는 레진으로는 페닐-세파로스를 사용하고, 이동상으로는 0.5 내지 2M 암모늄 설페이트 용액을 사용함이 바람직하다. 또한, HPLC컬럼으로는 소스 30 컬럼(source 30 RPC column)을 사용하고, 이동상으로는 0.01 내지 0.2%(v/v) TFA(trifluoroacetic acid)가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용함이 바람직하다.Meanwhile, the recombinant saxatilin is purified by applying the culture medium in which the transformant is cultured to a hydrophobic column and high performance liquid chromatography (HPLC). In this case, phenyl-sepharose is used as the resin filled in the hydrophobic column. Preference is given to using 0.5-2 M ammonium sulphate solution as the mobile phase. In addition, it is preferable to use a source 30 RPC column as an HPLC column, and to use acetonitrile containing 0.01 to 0.2% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA) as a mobile phase.

상기 제조된 재조합 삭사틸린과 공지의 혈소판 응집억제 펩타이드인 재조합 살모신의 혈소판 응집억제활성을 비교한 결과, 본 발명의 재조합 삭사틸린이 재조합 살모신과 유사한 정도로 혈소판 응집을 억제함을 알 수 있었으나, 삭사틸린을 효모에서 발현시킬 경우, 수율면에서 재조합 살모신보다 우수함을 알 수 있었다.이에, 효모에서 동일한 발현벡터를 이용하여 발현된 두 재조합 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과, 49번째 아미노산의 차이로 인하여 발현양상 및 효율의 차이가 발생함을 확인하였다: 즉, 재조합 살모신은 48번째 및 49번째 아르기닌으로 인하여, 리신, 아르기닌의 아미노산 서열을 인식하는 효모자체의 시그날 펩티드 분해효소로 인하여 절단될 확률이 높은 반면, 재조합 삭사틸린의 49번 아미노산인 메티오닌으로 인하여 동일한 단백질 분해효소에 의하여 절단될 확률이 낮으므로, 재조합 효모에서 재조합 삭사틸린을 발현시킬 때, 49번째 아미노산은 재조합 삭사틸린의 발현효율 및 안정성의 향상에 큰 역할을 담당하는 것을 알 수 있다.As a result of comparing the platelet aggregation inhibitory activity of the prepared recombinant saxatilin and the known platelet aggregation inhibitory peptide, the recombinant salmosin, it was found that the recombinant saxatilin of the present invention inhibits platelet aggregation to a degree similar to that of the recombinant salmosin. When saxatilin was expressed in yeast, it was found that the yield was higher than that of recombinant salicycin. Thus, the amino acid sequence of two recombinant proteins expressed using the same expression vector in yeast was compared. It is confirmed that the difference in expression pattern and efficiency occurs due to the recombinant salmosin, which is cleaved by the signal peptide degrading enzyme of the yeast itself that recognizes the amino acid sequence of lysine and arginine due to the 48th and 49th arginine. High probability, but due to the methionine amino acid amino acid 49 of the recombinant saxatilin Since the probability of cleavage by the protease is low, when the recombinant saxatilin is expressed in the recombinant yeast, it can be seen that the 49th amino acid plays a big role in improving the expression efficiency and stability of the recombinant saxatilin.

아울러, 삭사틸린이 종양세포의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 종양 혈관신생에 관한 연구 시스템으로 개발된 인간의 태반정맥 내피세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell) 증식검사 시스템과 혈관신생 CAM(chick chorioallantoic membrane) 시험방법을 이용하여, 삭사틸린이 혈관신생에 미치는 영향을 조사한 결과, 삭사틸린은 종양에 의하여 유도된 혈관신생을 저해함이 확인되었다. 또한, 전기 HUVEC 증식검사에서 관찰된 삭사틸린에 의한 HUVEC의 증식저해 효과는 삭사틸린이 HUVEC 표면의 비트로넥틴 수용체인 αvβ3 인테그린에 직접적으로 결합한 결과임을 확인하였다. 한편, 디스인테그린이 종양세포가 내피에 부착되는 것을 저해함으로써 전이성 종양의 콜로니 형성을 억제한다는 사실은 이미 밝혀졌지만, 이미 형성된 전이성 종양의 성장을 저해할 수 있는지 여부에 관한 보고는 없었으므로, 삭사틸린이 전이성 종양의 성장에 미치는 영향을 조사한 결과, 삭사틸린이 세포독성 없이 매우 효과적으로 전이성 종양의 성장을 억제함을 확인하였다.In addition, to determine whether saxatilin can inhibit the metastasis of tumor cells, human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) proliferation and blood vessels developed as a research system for tumor angiogenesis. Using the new chick chorioallantoic membrane (CAM) test method, the effect of saxatilin on angiogenesis was confirmed. Saxatilin inhibited tumor-induced angiogenesis. In addition, the inhibition of HUVEC proliferation by saxatilin observed in the HUVEC proliferation test was confirmed that saxatilin was directly bound to αvβ3 integrin, a vitronectin receptor on the surface of HUVEC. On the other hand, although it has already been found that disintegrin inhibits colon cell formation of metastatic tumors by inhibiting tumor cells from adhering to the endothelium, there has been no report on whether it can inhibit the growth of already formed metastatic tumors. Investigation of the effect of lean on the growth of metastatic tumors revealed that saxatilin inhibited the growth of metastatic tumors very effectively without cytotoxicity.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예 1: 삭사틸린의 정제 Example 1 Purification of Saxatilin

한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)로부터 삭사틸린을 정제하기 위하여, 한국산 칠점사로부터 채취한 조(crude)독소 1ml(302.4mg)을 PBS로 평형화시킨 세파덱스 젤 여과 컬럼(Sephadex G-75 gel-filtration column, 1.8 x 100cm)에 주입시킨 다음, 20ml/hour의 유속으로 용출시키며 삭사틸린의 활성분획을 수득하였다. 이때, 삭사틸린의 활성은 혈소판 응집저해 평가법(platelet aggregation inhibition assay)으로 측정하였다: 즉, 인간의 과혈소판 혈장(human platelet rich plasma, PRP)을 사용하여, 인간 혈액 400ml로부터 얻어진 혈소판 농축액을 ㎕ 당 300,000개의 혈소판이 되도록 희석한 다음, 이 PRP 희석액 450㎕와 PBS 50㎕을 혼합하고, 크로노로그 어그리고미터(Aggregometer, Chromo-Log,U.S.A.)에서 37℃의 온도로 3분간 배양하였다. 다음으로, 콜라겐(2nM)을 첨가하여 혈소판 응집을 야기시킨 다음, 빛 투과도(light transmittance)의 차이를 측정하였다.In order to purify saxatilin from Agkistrodon saxatilis emelianov, 1 ml (302.4 mg) of crude toxin collected from Korean Chiljesa was equilibrated with PBS (Sephadex G-75 gel-filtration). column, 1.8 × 100 cm), eluting at a flow rate of 20 ml / hour to obtain an active fraction of saxatilin. At this time, the activity of saxatilin was measured by platelet aggregation inhibition assay: ie, platelet concentrate obtained from 400 ml of human blood per μL using human platelet rich plasma (PRP). After diluting to 300,000 platelets, 450 μl of this PRP dilution and 50 μl of PBS were mixed and incubated for 3 minutes at a temperature of 37 ° C. in a chronolog agometer (Aggregometer, Chromo-Log, USA). Next, collagen (2 nM) was added to cause platelet aggregation, and then the difference in light transmittance was measured.

이어, 혈소판 응집을 저해하는 활성분획 중 가장 주요한 분획이, Native-PAGE 젤 상에서 7,000 내지 10,000달톤(dalton)의 분자량으로 나타나는 단백질을 포함하는 분획임을 확인한 다음, 이 분획을 모아 0.1%(v/v) TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 증류수로 평형화시킨 역상 HPLC 컬럼(reverse-phase C18 HPLC column, 7.8 x 300mm)에 주입시키고, 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile)로 5 내지 45%까지 선형구배(linear gradient)를 걸어 단백질을 용출시킨 결과, 삭사틸린은 아세토니트릴의 농도가 21% 되는 지점에서 용출되었다. 정제된 삭사틸린의 농도를 BCA 정량법을 통해 확인하고, 이를 전체 정제공정의 효율과 비교하였을 때, 전체 뱀독으로부터 얻어진 삭사틸린의 최종 정제효율은 0.2%임을 알 수 있었다.Subsequently, it was confirmed that the most important fraction of the active fractions that inhibited platelet aggregation was a fraction containing a protein expressed in a molecular weight of 7,000 to 10,000 daltons on the Native-PAGE gel, and then the fractions were collected and collected at 0.1% (v / v). ) Injected into a reverse-phase C18 HPLC column (7.8 x 300 mm) equilibrated with distilled water containing trifluoroacetic acid (TFA) and 5 with acetonitrile containing 0.1% (v / v) TFA. As a result of eluting the protein by linear gradient from 45%, saxatilin was eluted at the point where the concentration of acetonitrile was 21%. When the concentration of the purified saxatilin was confirmed by BCA quantification method and compared with the efficiency of the entire purification process, it was found that the final purification efficiency of the saxatilin obtained from the total snake venom was 0.2%.

실시예 2: 삭사틸린의 아미노산 서열 분석 Example 2 Amino Acid Sequence Analysis of Saxatilin

삭사틸린의 아미노산 서열을 분석하기 위하여, 정제된 삭사틸린을 환원조건 하에서 전기영동한 다음, PVDF(Bio-Rad, U.S.A.) 맴브레인으로 일렉트로블라팅(electroblotting)하였으며, 자동 아미노산 서열분석기를 이용하여 N-말단 아미노산의 서열을 분석한 결과, GEECDCGAPANP(서열번호 9)의 서열인 것으로 확인되었다.To analyze the amino acid sequence of saxatilin, purified saxatilin was electrophoresed under reducing conditions, followed by electroblotting with PVDF (Bio-Rad, USA) membranes, and N- using an automatic amino acid sequencer. The sequence of the terminal amino acid was confirmed to be the sequence of GEECDCGAPANP (SEQ ID NO: 9).

실시예 3: 질량 분석기를 이용한 삭사틸린의 분자량 측정 Example 3 Determination of Molecular Weight of Saxatilin by Mass Spectrometry

삭사틸린의 분자량을 질량 분석기(mass spectrometer; Kratos Kompact Mold II, Kratos Analytical, Manchester, U.K.)를 이용하여 Matrix Laser Desorption Ionization 방법으로 측정한 결과, 7,444, 7,515 및 7647Da의 3가지 다른 분자량이 측정되었다. 이렇게 서로 다른 분자량이 존재하는 이유는, N-말단 아미노산이 "GEE"로 시작하는 것 이외에, "EAGEE" 및 "AGEE"로 시작하는 삭사틸린의 상동형(isoform)이 존재하는 때문으로 유추되었다.The molecular weight of saxatilin was measured by the Matrix Laser Desorption Ionization method using a mass spectrometer (Krastos Kompact Mold II, Kratos Analytical, Manchester, U.K.). Three different molecular weights of 7,444, 7,515 and 7647 Da were measured. These different molecular weights are inferred due to the presence of isoforms of saxatilin starting with "EAGEE" and "AGEE" in addition to the N-terminal amino acid starting with "GEE".

실시예 4: 삭사틸린을 암호화하는 유전자 서열분석 Example 4 Gene Sequencing Encoding Saxatilin

삭사틸린을 코딩하는 cDNA를 얻기 위하여, 우선 한국산 칠점사의 독소분비선(venom gland)으로부터 Oligo-dT 셀룰로오스를 이용하여 mRNA를 분리하였으며, 전기 mRNA를 주형으로 Oligo-dT 프라이머와 역전사효소를 이용하여 cDNA 라이브러리를 작제하였다. 다음으로, 삭사틸린의 N-말단 서열을 바탕으로 제조한 5'-프라이머로서, 프라이머 1: 5'-GGNGARGARTGYGAYTGYGG-3'(서열번호 3) 및 서브클로닝 과정으로 확인된 C-말단의 서열을 근거로 제작한 3'-프라이머로서, 프라이머 2: 5'-GGCATGGAAGGGATTTCTGG-3'(서열번호 4)를 이용하여, cDNA 라이브러리를 주형으로 하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행한 결과, 220bp에 해당하는 유전자 산물을 수득하였다. PCR을 수행하여 얻은 절편을 아가로오스 젤로 분리정제하고, pGEM-T(Promega, U.S.A.) 벡터로 서브클로닝하여 삭사틸린의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 수득하였으며, 이를 이용하여 삭사틸린의 cDNA의 유전자 서열을 분석하고(서열번호 2), 분석된 DNA서열로부터 삭사틸린의 전체 아미노산 서열을 유추하였다(서열번호 1).To obtain cDNA encoding saxatilin, mRNA was first isolated from the venom gland of Korean Chilgoksa by Oligo-dT cellulose, and cDNA using Oligo-dT primer and reverse transcriptase as the template. A library was constructed. Next, a 5'-primer prepared based on the N-terminal sequence of saxatilin, based on primer 1: 5'-GGNGARGARTGYGAYTGYGG-3 '(SEQ ID NO: 3) and the C-terminal sequence identified by the subcloning process. As a 3'-primer prepared by using primer 2: 5'-GGCATGGAAGGGATTTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 4), a polymerase chain reaction (PCR) using a cDNA library as a template was performed, corresponding to 220 bp. Gene product was obtained. The fragments obtained by PCR were isolated and purified by agarose gel and subcloned with pGEM-T (Promega, USA) vector to obtain a plasmid containing saxatilin cDNA, using the gene sequence of saxatilin cDNA. Was analyzed (SEQ ID NO: 2), and the total amino acid sequence of saxatilin was inferred from the analyzed DNA sequence (SEQ ID NO: 1).

실시예 5: 삭사틸린과 공지의 혈소판 응집억제 펩타이드와의 활성 비교 Example 5 : Comparison of activity of saxatilin with known platelet aggregation inhibitory peptides

삭사틸린과 공지의 혈소판 응집억제 펩타이드인 살모신(Salmosin)(참조: 대한민국 특허 제 142606호, 서열번호 10) 및 GRGDSP(서열번호 7) 펩타이드와의 활성을 비교하기 위하여, 혈소판이 풍부한 인간 혈장(혈장 1L당 3 x 10⁵개의 혈소판 존재) 225㎕와 PBS에 용해된 혈소판 응집억제 펩타이드 용액(0.1g/ml) 25㎕를 혼합하여 5분간 25℃의 조건으로 어그리고미터에서 반응시킨 다음, 응집제인 ADP를 첨가하고 혼탁도를 측정하는 인간 혈소판의 응집분석법을 실시하였다(참조: 도 1). 도 1에서 보듯이, (n)는 삭사틸린; (O)는 살모신; 및, (g)는 GRGDSP(서열번호 7) 펩타이드의 혈소판 응집 저해효과를 나타낸 것이다. 도 1에서 보듯이, 삭사틸린의 IC₅₀값이 약 179nM로 확인되었는 바, 이는 살모신의 IC₅₀값인 173nM과 비교할 때, 거의 비슷한 활성을 가지는 것으로 평가되었으며, GRGDSP(서열번호 7) 펩타이드보다는약 1,000배 이상 우수한 활성이었다.To compare the activity of saxatilin with the known platelet aggregation inhibitory peptide Salmosin (see Korean Patent No. 142606, SEQ ID NO: 10) and GRGDSP (SEQ ID NO: 7) peptides, platelet-rich human plasma ( 225 μl of 3 × 10 ⁵ platelets per 1 L of plasma and 25 μl of platelet aggregation inhibitor peptide solution (0.1 g / ml) dissolved in PBS were mixed and reacted at 25 ° C. for 5 minutes at an agometer. Agglutination assay of human platelets was carried out by adding phosphorus ADP and measuring turbidity (see FIG. 1). As shown in Figure 1, (n) is saxatilin; (O) is Salmonine; And, (g) shows the platelet aggregation inhibitory effect of the GRGDSP (SEQ ID NO: 7) peptide. As shown in FIG. 1, the IC ₅₀ value of saxatilin was found to be about 179 nM, which was evaluated to have almost similar activity when compared with the IC ₅₀ value of Salmonine, 173 nM, and was approximately less than GRGDSP (SEQ ID NO: 7) peptide. It was 1,000 times better activity.

실시예 6: 삭사틸린 유전자의 클로닝 Example 6 Cloning of the Saxatilin Gene

제한효소(XhoI) 염기서열과 단백질 분해효소인 KEX2로 절단될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 N-말단 프라이머인 5-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCCGGAGAAGAATGT-3(서열번호 5), 두 개의 번역 종결 코돈(stop codon)과 EcoRI 제한효소 부위를 포함하는 C-말단 프라이머인 5-CGGAATTCTCATTAGGCATGGAAGGGA-3(서열번호 6) 및 주형으로서 실시예 4에서 수득한 삭사틸린cDNA를 갖는 플라스미드를 사용하고, 로보싸이클러(Robocycler^TM, Stratagene, U.S.A.)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR반응은 열변성(denaturation) 94℃ 1분, 주형과 프라이머 결합(annealing) 55℃ 1분 및 프라이머 연장반응(polymerization) 72℃ 1분을 1주기(cycle)로하여 30주기를 실시하였다. 이 반응으로부터 증폭된 약 250bp의 DNA절편을 PCR 산물 전용 클로닝 플라스미드인 pBluescriptKS(2.9kbp, Stratagene, U.S.A.)에 T4 DNA 연결효소(ligase)와 반응시켜 재조합 플라스미드를 작제하고, 이를 대장균 XL-1Blue에 도입하여 형질전환체를 작제하였다. 작제된 형질전환체를 앰피실린100㎍/㎖가 첨가된 루리아 보타니(LB: Luria Botani) 평판배지에서 배양하여, 흰색 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균 균주를 선별한 다음, 이로부터 플라스미드를 추출하여 이를 제한효소 지도분석과 DNA 염기서열 분석(ALF시스템, Amersham Phamacia Biotech, U.S.A.)을 실시한 결과, PCR반응으로 증폭된 250bp의 절편이 삭사틸린의 cDNA 임을 확인하였다. 전기 추출된 플라스미드를 XhoI과 EcoRI으로 절단하여 수득한 DNA절편을 발현벡터 pPIC9(8.0kbp)의 α-factor 분비신호단백질 C-말단부위에 삽입하여 삭사틸린의 발현벡터 pPSAX(8.3kbp)를 작제하였다(참조: 도 2).5-CCGCTCGAGAAAGAGAGAGGCCGGAGAAGAATGT-3 (SEQ ID NO: 5), two translation termination codons (N-terminal primer) containing a restriction enzyme (XhoI) sequence and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that can be cleaved with the protease KEX2 C-terminal primer 5-CGGAATTCTCATTAGGCATGGAAGGGA-3 (SEQ ID NO: 6) containing the stop codon) and the EcoRI restriction enzyme site, and the plasmid having saxatilin cDNA obtained in Example 4 as a template, were used, and a Robocycler Polymerase chain reaction (PCR) was performed using ^TM , Stratagene, USA. The PCR reaction was carried out for 30 cycles with 1 cycle of 94 ° C of denaturation, 1 minute of 55 ° C of primer and primer annealing, and 1 minute of 72 ° C of primer extension. The 250 bp DNA fragment amplified from the reaction was reacted with T4 DNA ligase to pBluescriptKS (2.9 kbp, Stratagene, USA), a cloning plasmid dedicated to PCR products, to construct a recombinant plasmid and introduced into E. coli XL-1Blue. Transformants were constructed. Constructed transformants were cultured in a Luria Botani (LB) plate medium to which 100 μg / ml of ampicillin was added to select a transformant Escherichia coli strain that forms white colonies, and then extracted plasmid from the strain. As a result of restriction enzyme mapping and DNA sequencing (ALF system, Amersham Phamacia Biotech, USA), it was confirmed that the 250bp fragment amplified by the PCR reaction was saxatilin cDNA. DNA fragment obtained by cutting the extracted plasmid with XhoI and EcoRI was inserted into α-factor secretion signal protein C-terminus of expression vector pPIC9 (8.0kbp) to construct saxatilin expression vector pPSAX (8.3kbp). See Figure 2).

작제된 pPSAX를 SalI으로 절단하여 선형의 DNA를 수득한 다음, 전기 선형의 DNA를 0.5㎍/㎕농도로 함유하는 TE 완충용액에Pichia pastorisGS115 컴피턴트 세포(competent cell)(Invitrogen, U.S.A.) 80㎕를 혼합하고, 엘렉트로포레이터(electroporator, Bio-Rad Gene Pulser, U.S.A.)를 사용하여 1.5 KV의 전압조건 하에 형질전환을 수행하였다. 이어, 형질전환된 균주를 히스티딘 결손 아가로스 평판배지에 도말하고, 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 배지에서 성장한 콜로니를 선별하여 최소 글리세롤 배지(100mM sodium phosphate pH 6.0, Yeast Nitrogen Base 1.34%, biotin 4 x 10^-5%, glycerol 1%) 1L에 접종한 다음, 30℃에서 세포농도가 O.D₆₀₀1.0이 될 때 까지 배양하고, 배양물을 3,000 xg 에서 원심분리하여 배지가 제거된 세포만을 수득하며, 수득한 세포를 최소 메탄올 배지(100mM sodium phosphate pH 6.0, Yeast Nitrogen Base 1.34%, biotin 4 x 10^-5%, methanol 0.5%)에 현탁시키고, 30℃에서 배양하여 재조합 삭사틸린의 발현을 유도하였다. 이어, 24시간 간격으로 메탄올을 0.5%의 농도로 첨가하며 96시간 동안 배양한 결과, 배지내에 삭사틸린이 축적됨을 확인하고, 전기 형질전환 균주를 "피키아 파스토리스 Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)"라 명명하였다. 또한, 전기 균주를 2000년 7월 21일 대한민국 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM-10201로 기탁하였다.The prepared pPSAX was digested with SalI to obtain linear DNA, followed by 80 µl of Pichia pastoris GS115 competent cells (Invitrogen, USA) in a TE buffer containing 0.5 µg / µl of the linear DNA. Were mixed and transformed under an electric voltage of 1.5 KV using an electroporator (Bio-Rad Gene Pulser, USA). The transformed strains were then plated in histidine deficient agarose plate media and incubated at 30 ° C. for 3 days. After incubation, colonies grown in the medium were screened and inoculated into 1 L of minimal glycerol medium (100 mM sodium phosphate pH 6.0, Yeast Nitrogen Base 1.34%, biotin 4 x 10 ^-5 %, glycerol 1%), and then the cell concentration at 30 ° C. Incubate until OD ₆₀₀ 1.0, culture is centrifuged at 3,000 xg to obtain only the cells from which the medium has been removed, and the obtained cells are obtained with a minimum of methanol medium (100 mM sodium phosphate pH 6.0, 1.34% of Yeast Nitrogen Base, biotin 4). x 10 ^-5 %, methanol 0.5%) and incubated at 30 ° C to induce the expression of recombinant saxatilin. Subsequently, after 96 hours of incubation with methanol at a concentration of 0.5% at 24 hour intervals, it was confirmed that saxatilin was accumulated in the medium, and the electric transformation strain was "Phichia pastoris Y / pPSAX (Pichia pastoris Y /). pPSAX) ". In addition, KCCM-10201 was deposited with the Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository institution located at 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, on July 21, 2000. Was deposited.

전기 배양물을 5000 xg 에서 원심분리하여 배양액을 수득하고, 이를 1.5M 암모늄 설페이트 용액으로 평형화시킨 페닐-세파로스(Phenyl-sepharose, Bio-Rad, U.S.A.)가 충진된 컬럼(1.3 x 20cm)에 주입한 다음, 1M 암모늄 설페이트 용액을 20ml/hour의 유속으로 용출시켜 삭사틸린 활성분획을 수득하였다. 이때, 삭사틸린의 활성은 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다. 이어, 활성분획을 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 증류수로 평형화시킨 HPLC 컬럼(source 30 RPC column, 7.8 x 300mm)에 주입시키고, 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 0 내지 50%(v/v)의 아세토니트릴 선형구배(linear gradient)를 걸어 단백질을 용출시켜서, 순수분리된 삭사틸린을 수득하였다. 이때, 제조수율은 배양액 1L당 107mg임을 알 수 있었다.The culture was centrifuged at 5000 xg to obtain a culture, which was injected into a column (1.3 x 20 cm) filled with phenyl-sepharose (Phenyl-sepharose, Bio-Rad, USA) equilibrated with 1.5 M ammonium sulfate solution. Then, 1 M ammonium sulfate solution was eluted at a flow rate of 20 ml / hour to obtain saxatilin active fraction. At this time, the activity of saxatilin was measured in the same manner as in Example 1. Then, the active fraction was injected into an HPLC column (source 30 RPC column, 7.8 × 300 mm) equilibrated with distilled water containing 0.1% (v / v) TFA, and 0 to 50 containing 0.1% (v / v) TFA. Protein was eluted with acetonitrile linear gradient of% (v / v) to obtain purely isolated saxatilin. At this time, the production yield was found to be 107mg per 1L of culture.

실시예 7: 재조합 삭사틸린의 혈소판 응집저해 Example 7 : Platelet aggregation inhibition of recombinant saxatilin

실시예 6에서 수득한 삭사틸린을 실시예 1의 혈소판 응집저해 평가법을 통해 특성을 분석하고, 실시예 1에서 수득한 야생형 삭사틸린 및 GRGDSP(서열번호 7)의 결과와 비교하였다(참조: 표 1).The saxatilin obtained in Example 6 was characterized by the platelet aggregation inhibition assay of Example 1 and compared with the results of wild-type saxatilin and GRGDSP (SEQ ID NO: 7) obtained in Example 1 (see Table 1 ).

하기 표 1에서 보듯이, 재조합 삭사틸린은 야생형 삭사틸린과 유사한 정도의 혈소판 응집저해 활성을 보였다.As shown in Table 1 below, recombinant saxatilin showed a similar level of platelet aggregation inhibitory activity as wild-type saxatilin.

혈소판 응집저해 평가법의 IC₅₀ IC ₅₀ of Platelet Inhibition Assay 검색시료Search sample IC₅₀(nM)IC ₅₀ (nM) 야생형 삭사틸린Wild-type saxatilin 136136 재조합 삭사틸린Recombinant saxatilin 139139 GRGDSP(서열번호 7)GRGDSP (SEQ ID NO: 7) 270 x 10³ 270 x 10 ³

실시예 8: 삭사틸린에 의한 항 혈전작용 Example 8 Antithrombotic Action by Saxatilin

마우스에 콜라겐과 에피네프린(epinephrine)을 정맥주사할 때, 폐동맥내에 혈전이 형성되고, 이에 의하여 폐동맥이 폐쇄되어 1분 이내에 대부분의 마우스가 마비, 동공확장, 호흡곤란 및 경련의 증상을 보이며, 5분 이내에 70%의 마우스가 사망한다. 따라서, 실시예 6에서 수득한 재조합 삭사틸린을 정맥주사하여, 전기 혈전증상을 감소시킬 수 있는지 확인하였다.When intravenous injection of collagen and epinephrine into mice, blood clots form in the pulmonary artery, which causes the pulmonary artery to close, causing most mice to experience paralysis, dilated pupils, dyspnea and convulsions within 5 minutes. 70% of mice die within a few minutes. Therefore, the recombinant saxatilin obtained in Example 6 was injected intravenously to confirm whether the electrical thrombosis symptoms could be reduced.

ICR마우스 꼬리 정맥에 각각 0, 0.1, 0.25 및 0.5mg/kg의 삭사틸린을 함유하는 0.1ml PBS를 주사하고, 10분이 경과한 후, 각각의 마우스에 콜라겐과 에피네프린 혼합액(120㎍ 콜라겐 + 12㎍ 에피네프린/0.1ml PBS)을 ICR마우스 꼬리 정맥에 다시 주사한 다음, 마우스의 생존률을 측정하였다(참조: 표 2).Inject 0.1 ml PBS containing 0, 0.1, 0.25 and 0.5 mg / kg saxatilin to the tail vein of the ICR mouse, respectively, and after 10 minutes, each mouse was given a mixture of collagen and epinephrine (120 μg collagen + 12 μg). Epinephrine / 0.1 ml PBS) was injected again into the ICR mouse tail vein and the survival rate of the mice was measured (see Table 2).

삭사틸린(mg/kg)시험Saxatilin (mg / kg) test 00 0.10.1 0.250.25 0.50.5 사망군/시험군Death / test group 18/2018/20 16/2016/20 11/2011/20 3/203/20 생존률(%)Survival rate (%) 1010 2020 5555 8585

상기 표 2에서 보듯이, 삭사틸린을 처리한 경우, 생존률이 급격히 증가된 결과로 미루어 볼 때, 콜라겐과 에피네프린 혼합용액으로 인한 혈전의 발생을 삭사틸린이 억제하였다고 추측되며, 삭사틸린을 미리 처리한 경우는 이를 나중에 처리할 때보다 향상된 효과를 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 2, when treated with saxatilin, surviving rate is rapidly increased, it is assumed that the saxatilin inhibited the generation of blood clots due to the collagen and epinephrine mixed solution, and treated with saxatilin in advance The case was found to have an improved effect than the later processing.

실시예 9: 인간의 태반정맥 내피세포(HUVEC)에 대한 재조합 삭사틸린의 효과 Example 9 Effect of Recombinant Saxatilin on Human Placental Venous Endothelial Cells (HUVEC)

재조합 삭사틸린의 아미노산 서열의 49 내지 51번은 RGD 서열을 갖고 있는데, 전기 서열을 가지는 디스인테그린은 bFGF에 의해 유도되는 내피세포의 성장을 억제함이 밝혀져 있는 바, 전기 서열을 포함하는 재조합 삭사틸린이 내피세포의 성장을 억제하는지 알아보기 위하여, 인간의 태반정맥 내피세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)를 대상으로 성장억제 평가법을 수행하고, bFGF에 의해 유도되는 내피세포의 성장을 억제하는 것으로 알려진 살모신(서열번호 10)의 효과와 비교하였다.49 to 51 of the amino acid sequence of the recombinant saxatilin have an RGD sequence, and disintegrin having the above sequence has been found to inhibit the growth of endothelial cells induced by bFGF. To determine whether they inhibit the growth of endothelial cells, we performed growth inhibition assays on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and are known to inhibit the growth of bFGF-induced endothelial cells. It was compared with the effect of Salmonine (SEQ ID NO: 10).

전기 HUVEC를 젤라틴으로 코팅된 24-웰 마이크로플레이트에 깔고, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 직후, 배지를 5% 우태아혈청을 포함하는 0.25ml DMEM으로 교체하고, 상기 실시예 6에서 수득한 재조합 삭사틸린과 살모신을 각각 0, 20 및 30㎍/ml의 농도로 처리한 다음, 20분간 배양하였다. 이어, 세포를 전기 배지에 1ng/ml의 농도로 용해된 bFGF로 처리하고, 72시간 동안 더 배양한 다음, 세포를 트립신으로 단세포화시키고 세포수를 측정하여 생존률을 계산하였다(참조: 도 3). 도 3에서 보듯이, 살모신과 유사한 양상으로 삭사틸린의 농도가 증가함에 따라, HUVEC의 증식이 억제됨을 알 수 있었으므로, 살모신과 삭사틸린은 유사한 활성을 보임을 알 수 있었다.Electric HUVECs were laid on gelatin-coated 24-well microplates and incubated for 24 hours at 37 ° C., 5% CO ₂ . Immediately after incubation, the medium was replaced with 0.25 ml DMEM containing 5% fetal bovine serum, and the recombinant saxatilin and salmosin obtained in Example 6 were treated at concentrations of 0, 20 and 30 μg / ml, respectively. Incubate for 20 minutes. Cells were then treated with bFGF lysed at a concentration of 1 ng / ml in an electrical medium, further incubated for 72 hours, and then cells were unicellularized with trypsin and cell number was counted for survival (see Figure 3). . As shown in Figure 3, as the concentration of saxatilin in a similar manner to the salmosin, it can be seen that the proliferation of HUVEC is inhibited, salmosin and saxatilin showed a similar activity.

실시예 10: 삭사틸린에 의한 HUVEC 유착의 저해 Example 10 Inhibition of HUVEC Adhesion by Saxatilin

삭사틸린에 의한 HUVEC의 증식저해가 삭사틸린이 HUVEC표면의 비트로넥틴 수용체인 αvβ3 인테그린에 직접적으로 결합한 결과인지를 확인하기 위하여, 삭사틸린이 HUVEC가 96-웰 플레이트에 코팅된 비트로넥틴에 유착하는 것을 저해할 수 있는지 여부를 조사하였다.Saxatilin adheres to HUVEC-coated vitronectin coated on 96-well plate to determine whether the inhibition of HUVEC proliferation by saxatilin is the result of Saxatilin binding directly to αvβ3 integrin, a vitronectin receptor on HUVEC surface It was investigated whether it could be inhibited.

96-웰 플레이트를 인산염완충용액(PBS)에 용해시킨 상기 실시예 6에서 수득한 재조합 삭사틸린(1㎍/웰) 및 비트로넥틴(0.5㎍/웰)으로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 전기 플레이트를 세척한 다음, 플레이트 상의 남겨진 단백질 결합부위를 봉쇄시키기 위하여, 10mg/ml의 열변성된 우혈청알부민(BSA)을 처리하여 1시간 동안 배양하고, 플레이트를 사용하기 전에 PBS로 세척하였다. HUVEC를 트립신-EDTA로 처리하여 단세포화시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 무혈청 DMEM에 재현탁시켰다. 5X10⁴세포를 항-αvβ3 단일클론항체, 합성된 RGD 펩티드인 GRGDSP(서열번호 7), 합성된 RGE 펩티드인 GRGETP(서열번호 8) 및 삭사틸린과 각각 혼합하여 37℃에서 20분 동안 전배양한 다음, 전기 세포를 전기 96웰-플레이트의 각 웰에 가하고, 37℃에서 5% CO₂및 95% 공기의 조건으로 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 다음, 미부착된 세포들을 PBS로 세척하여 제거하고, 부착된 세포는 고정하여 쿠마씨 블루(Coomassie blue)로 염색하였다. 각 웰의 540nm에서의 흡광도를 측정하여 상대세포수(relative cell number)를 결정하였다(참조: 도 4a, 도 4b).96-well plates were coated for 16 hours at 4 ° C. with the recombinant saxatilin (1 μg / well) and Vitronectin (0.5 μg / well) obtained in Example 6 above dissolved in phosphate buffer solution (PBS). The plates were washed and then incubated for 1 hour with 10 mg / ml of heat denatured bovine serum albumin (BSA) in order to contain the remaining protein binding sites on the plates, and washed with PBS before using the plates. HUVECs were treated with trypsin-EDTA to single cell, washed three times with PBS and then resuspended in serum free DMEM. 5X10 ⁴ cells were mixed with anti-αvβ3 monoclonal antibody, synthesized RGD peptide GRGDSP (SEQ ID NO: 7), synthesized RGE peptide GRGETP (SEQ ID NO: 8), and saxatilin, respectively, and pre-incubated for 20 minutes at 37 ° C. Electric cells were then added to each well of an 96-well electric plate and incubated for 1 hour at 37 ° C. with 5% CO ₂ and 95% air. After incubation, unattached cells were removed by washing with PBS, and the attached cells were fixed and stained with Coomassie blue. The absorbance at 540 nm of each well was measured to determine the relative cell number (see FIGS. 4A and 4B).

도 4a 및 도 4b에서 보듯이, bFGF로 자극된 HUVEC를 GRGDSP(서열번호 7), 삭사틸린 및 항-αvβ3 단일클론항체와 함께 미리 배양함으로써 HUVEC가 비트로넥틴에 유착하는 것을 크게 저해할 수 있음을 확인하고(참조: 도 4a), HUVEC가 삭사틸린에 유착하는 것을 저해함을 확인하였다(참조: 도 4b). 이러한 결과들은 삭사틸린이 HUVEC표면의 αvβ3 인테그린에 결합하여, 인테그린-매개의 세포유착을 억제함을 시사한다.As shown in FIGS. 4A and 4B, pre-culture of bUVF-stimulated HUVECs with GRGDSP (SEQ ID NO: 7), saxatilin, and anti-αvβ3 monoclonal antibodies can significantly inhibit HUVEC adhesion to vitronectin. (FIG. 4A), it was confirmed that HUVEC inhibited adhesion to saxatilin (FIG. 4B). These results suggest that saxatilin binds to αvβ3 integrins on the surface of HUVECs and inhibits integrin-mediated cell adhesion.

실시예 11: 삭사틸린에 의한 혈관신생 CAM(chick chorioallantoic membrane) 검사 Example 11 Angiogenesis CAM (chick chorioallantoic membrane) test by saxatilin

생체 내 모델인 CAM(chick chorioallantoic membrane)을 이용하여, bFGF에 의하여 유도되는 혈관신생에 대한 삭사틸린의 효과를 조사하였다. 3일령의 닭의수정란의 껍질 일부를 조심스럽게 깨고 투명테이프로 밀봉한 다음, 전기 수정란을 37℃, 60% 습도의 조건에서 10일간 배양하여 배자로 발생시킨 후, bFGF를 6ng/배자의 농도로 배자의 CAM 위로 주입하여 혈관신생을 유도하였다. 전기 수정란을 24시간동안 더 배양한 후, (-)대조군으로서 PBS 및 실시예 6에서 수득한 재조합 삭사틸린 5ug을 CAM에 각각 처리하고, 72시간 후 전기 수정란의 혈관을 관찰하였다(참조: 도 5a, 5b). 도 5a, 5b에서 보듯이, PBS를 처리한 경우에는 정상적인 혈관신생이 이루어졌으나(참조: 도 5a), 삭사틸린을 처리한 경우에는 혈관신생이 저해되었다(참조: 도 5b).In vivo model chick chorioallantoic membrane (CAM) was used to investigate the effect of saxatilin on angiogenesis induced by bFGF. After carefully breaking a part of the shell of the fertilized egg of 3 days old chickens and sealed with a transparent tape, the embryos were incubated for 10 days at 37 ℃, 60% humidity conditions to generate embryos, bFGF to 6ng / embryo concentration Angiogenesis was induced by injecting onto the CAM of the embryo. After 24 hours of further incubation, the embryos were treated with 5 μg of recombinant saxatilin obtained in Example 6 and PBS as a (-) control, and after 72 hours, the blood vessels of the embryo were observed (see FIG. 5A). , 5b). As shown in FIGS. 5A and 5B, normal angiogenesis was performed when PBS was treated (see FIG. 5A), but angiogenesis was inhibited when saxatilin was treated (see FIG. 5B).

실시예 12: 삭사틸린에 의한 전이성 종양성장의 억제 Example 12 Inhibition of Metastatic Tumor Growth by Saxatilin

디스인테그린은 종양세포가 내피에 부착되는 것을 저해함으로써 폐 종양의 콜로니형성을 억제한다. 그러나, 디스인테그린이 전이성 폐 종양의 성장을 저해한다는 보고는 없었는 바, 삭사틸린이 전이성 종양성장에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다.Disintegrin inhibits colony formation of lung tumors by inhibiting tumor cells from adhering to the endothelium. However, there has been no report that disintegrin inhibits the growth of metastatic lung tumors, and it was investigated whether saxatilin affected metastatic tumor growth.

미합중국종균협회(ATCC, Rockville, Md., U.S.A.)로부터 입수한 루이스 폐 종양 세포(Lewis lung carcinoma cell) 1X10⁶개를 8주령의 웅성 C57BL/6마우스(Charles river, Japan)의 꼬리정맥에 주사하였다. 4일 경과 후, 실시예 6에서 수득한 재조합 삭사틸린을 1.25mg/kg/day의 용량으로 1일 1회 마우스에정맥주사하였다. 그로부터 4주 경과후, 마우스를 죽여 폐를 수득하고, 폐 종양 콜로니의 개수를 해부현미경으로 측정하였다. 그 결과, 삭사틸린이 전이성 종양성장을 효과적으로 저해되는 것이 확인되었다(참조: 표 3). ^Six 1X10 Lewis lung carcinoma cells from the United States spawn association (ATCC, Rockville, Md., USA) were injected into the tail vein of 8-week-old male C57BL / 6 mice (Charles river, Japan). . After 4 days, the recombinant saxatilin obtained in Example 6 was intravenously injected into mice once daily at a dose of 1.25 mg / kg / day. Four weeks later, mice were killed to obtain lungs, and the number of lung tumor colonies was measured by an anatomical microscope. As a result, it was confirmed that saxatilin effectively inhibited metastatic tumor growth (see Table 3).

삭사틸린에 의한 전이성 루이스 폐 종양의 성장저해Inhibition of growth of metastatic Lewis lung tumors by saxatilin 삭사틸린(mg/kg 마우스)Saxatilin (mg / kg mouse) 마우스 마리수Mouse numbers 평균 폐 종양 콜로니 수Average lung tumor colony count 저해율(%)% Inhibition 00 44 15 ±615 ± 6 00 1.251.25 44 0.7 ±0.60.7 ± 0.6 9595

상기와 같은 삭사틸린에 의한 전이성 종양의 성장저해는 종양 혈관신생에 필수적인 αvβ3 인테그린의 작용을 억제함으로써 bFGF에 의하여 유도되는 BCE 세포의 증식을 강력하게 저해하는 삭사틸린의 항-혈관신생 작용에 의하여 설명될 수 있다. 한편, 실험에 사용된 어떤 마우스에서도 삭사틸린 처리에 따른 독성은 관찰되지 않았다.The inhibition of growth of metastatic tumors by saxatilin is explained by the anti-angiogenic action of saxatilin, which strongly inhibits the proliferation of BCE cells induced by bFGF by inhibiting the action of αvβ3 integrin, which is essential for tumor angiogenesis. Can be. On the other hand, no toxicity was observed for saxatilin treatment in any mice used in the experiment.

또한, 폐의 전이성 종양에 삭사틸린이 미치는 직접적인 효과를 관찰하고자, 전기 폐조직에 대하여 조직화학검사를 수행하였다. 즉, 전기 폐조직을 4시간 동안 보우인 용액(Bouin's solution)에 고정시키고, 표준방법에 따라 파라핀으로 고정하였다. 4um 두께의 절단면에 트립신을 37℃에서 10분간 스며들게 하고, PBS로 세척한 다음, 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하고 마운트하였다(참조: 도 6a, 도 6b, 도 6c). 도 6a는 루이스 폐 종양세포로 감염되지 않은 폐의 조직사진이고, 도 6b는 루이스 종양세포로 감염된 폐조직에 PBS를 처리한 폐의 조직사진이며, 도 6c는 루이스 종양세포로 감염된 폐조직에 삭사틸린을 처리한 폐의 조직사진이다. 도 6b 및 도 6c에서 보듯이, PBS를 주입한 대조구에서는 전이성 종양이 뚜렷하게 관찰되었으나(참조: 도6b), 삭사틸린을 주입한 실험구에서는 종양 콜로니가 관찰되지 않았다(참조: 도 6c). 전술한 바와 같이, 삭사틸린을 주입한 마우스에서 전이성 종양성장이 저해되는 현상은 삭사틸린이 이차 종양의 성장에 필수적인 혈관신생을 저해하기 때문인 것으로 추측된다.In addition, histochemistry was performed on the electrical lung tissue to observe the direct effect of saxatilin on metastatic tumors of the lung. That is, the electric lung tissue was fixed in Bowin's solution (Bouin's solution) for 4 hours, and fixed in paraffin according to standard methods. Trypsin was infiltrated at 4 μm for 10 minutes at 37 ° C., washed with PBS, stained with hematoxylin and eosin, and mounted (see FIGS. 6A, 6B and 6C). Figure 6a is a tissue picture of the lung not infected with Lewis lung tumor cells, Figure 6b is a tissue picture of the lungs treated with PBS to lung tissue infected with Lewis tumor cells, Figure 6c is cut to lung tissue infected with Lewis tumor cells Histogram of lungs treated with tilin. 6b and 6c, metastatic tumors were clearly observed in the control group injected with PBS (see FIG. 6b), but no tumor colonies were observed in the experimental group injected with saxatilin (see FIG. 6c). As mentioned above, the metastatic tumor growth inhibition in mice injected with saxatilin is presumed to be because saxatilin inhibits angiogenesis essential for the growth of secondary tumors.

투여방법 및 효과량Dosing method and effective amount

본 발명의 삭사틸린을 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 첨가한 약제학적 조성물은 주사 형태로 투여할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.Pharmaceutical compositions containing the saxatilin of the present invention as an active ingredient and added with a pharmaceutically acceptable carrier can be administered in the form of injections. Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and / or contain auxiliaries (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifier solution promoters, salts for controlling osmotic pressure and / or buffers). do. In addition, they may contain other therapeutically valuable substances.

삭사틸린의 투여량은 환자의 연령, 체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 혈전증 치료제로 사용되는 경우, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 20mg 내지 52mg으로 투여하는 것이 바람직하고, 항암제로 사용되는 경우, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우 비경구로 1일 1회 30mg 내지 120mg으로 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 적절히 결정될 수도 있다.The dose of saxatilin varies depending on the age, weight, and degree of disease of the patient. However, when used as a thrombosis treatment agent, it is usually parenterally administered 20 mg to 52 mg once a day for adults (based on 60 kg body weight). Preferably, when used as an anticancer agent, it is preferable to administer 30 mg to 120 mg once daily parenterally for adults (based on 60 kg body weight), and may be appropriately determined by the experience of a person of ordinary skill in the art. It may be.

급성독성 시험Acute Toxicity Test

본 발명에서 혈전증 치료제 및 항암제로서 사용되는 삭사틸린의 급성독성을 알아보기 위하여, 삭사틸린을 웅성 C57BL/6 마우스에 피하주사하고, 투여후 7일간에 걸쳐 마우스의 사망수를 관찰하여 LD₅₀값을 결정하였는 바, LD₅₀값은 약 1100mg/kg이었다. 따라서, 상기 표시하는 유효량의 범위에서, 본 발명의 삭사틸린을 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료제 및 항암제는 충분히 안전한 약물임을 알 수 있었다.In order to examine the acute toxicity of saxatilin used as a thrombosis treatment agent and an anticancer agent in the present invention, saxatilin was injected subcutaneously in male C57BL / 6 mice, and the number of deaths of the mice was observed over 7 days after the administration to determine the LD ₅₀ value. As determined, the LD ₅₀ value was about 1100 mg / kg. Therefore, it was found that the thrombosis therapeutic agent and the anticancer agent containing the saxatilin of the present invention as an active ingredient in the range of the effective amount indicated above were sufficiently safe drugs.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 칠점사의 독소로부터 유래된 삭사틸린, 그의 제조방법과 그를 유효성분으로 하는 혈소판 응집억제제 및 항암제를 제공한다. 본 발명자들은 삭사틸린을 한국산 칠점사의 독소에서 정제하고, cDNA를 클로닝하여 재조합 삭살틸린을 발현시키는 벡터 및 이것으로 형질전환된 형질전환체를 작제하였으며, 전기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 재조합 삭사틸린을 수득하였다. 본 발명의 삭사틸린은 효과적으로 혈소판 응집을 억제할 수 있음은 물론, 종양 혈관신생을 강력하게 저해하므로, 삭사틸린은 혈소판 응집억제제 및 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.As described and demonstrated in detail in the above, the present invention provides a saxatilin derived from the toxin of Korean Chilgaesa, a method for preparing the same and a platelet aggregation inhibitor and an anticancer agent using the same as an active ingredient. The present inventors purified saxatilin from toxins from Korea's Seven Points, cloned cDNA, and constructed a vector expressing recombinant saxatilin and transformants transformed therewith, culturing the electric transformants, and recombining therefrom. Saxatilin was obtained. Since saxatilin of the present invention can effectively inhibit platelet aggregation, and strongly inhibit tumor angiogenesis, saxatilin may be usefully used as an active ingredient of platelet aggregation inhibitors and anticancer agents.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail the specific parts of the present invention, for those skilled in the art, these specific descriptions are only preferred embodiments, which are not intended to limit the scope of the present invention. Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> CHUNG, KWANG-HOE KIM, DOO-SIK <120> Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 1 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70 <210> 2 <211> 213 <212> DNA <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 2 ggagaagaat gtgactgtgg cgctcctgca aatccgtgct gcgatgctgc aacctgtaaa 60 ctgagaccag gggcgcagtg tgcagaagga ctgtgttgtg accagtgcag atttatgaaa 120 gaaggaacaa tatgccggat ggcaaggggt gatgacatgg atgattactg caatggcata 180 tctgctggct gtcccagaaa tcccttccat gcc 213 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggngargart gygaytgygg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcatggaag ggatttctgg 20 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgctcgaga aaagagaggc cggagaagaa tgt 33 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cggaattctc attaggcatg gaaggga 27 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 7 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 8 Gly Arg Gly Glu Thr Pro 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 9 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 73 <212> PRT <213> Agkistrodon halys brevicaudus <400> 10 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70<110> CHUNG, KWANG-HOE KIM, DOO-SIK <120> Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 1 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70 <210 > 2 <211> 213 <212> DNA <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 2 ggagaagaat gtgactgtgg cgctcctgca aatccgtgct gcgatgctgc aacctgtaaa 60 c tgagaccag gggcgcagtg tgcagaagga ctgtgttgtg accagtgcag atttatgaaa 120 gaaggaacaa tatgccggat ggcaaggggt gatgacatgg atgattactg caatggcata 180 tctgctggct gtcccag <a> <cc> cctc 213 <210> 3 c DNA <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcatggaag ggatttctgg 20 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> primer <400> 5 ccgctcgaga aaagagaggc cggagaagaa tgt 33 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cggaattctc attaggcatg gaaggga 27 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 7 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptide <400> 8 Gly Arg Gly Glu Thr Pro 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Agkistrodon saxatilis emelianov <400> 9 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 73 <212> PRT <213> Agkistrodon halys brevicaudus <400> 10 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70

Claims (12)

한국산 칠점사(Agkistrodon saxatilis emelianov)의 독소로부터 유래되고, RGD 루프내의 49번과 55번 아미노산이 메티오닌인 단백질 삭사틸린(Saxatilin)을 코딩하며, 서열번호 2의 염기서열로 나타내어지는 cDNA.CDNA derived from the toxin of the Korean Chilguksa (Agkistrodon saxatilis emelianov), encoding the protein saxatilin wherein amino acids 49 and 55 in the RGD loop are methionine. 삭제delete 삭제delete 제 1항의 cDNA 염기서열을 포함하는 발현벡터 pPSAX.An expression vector pPSAX comprising the cDNA base sequence of claim 1. 제 4항의 발현벡터 pPSAX를 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 도입하여 제조된 형질전환체 피키아 파스토리스 Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX, KCCM-10201).The blood of 4 of the expression vector pPSAX Escherichia Pas pastoris (Pichia pastoris) was introduced into the prepared GS115 transformants Pichia pastoris Y / pPSAX (Pichia pastoris Y / pPSAX, KCCM-10201). 제 1항의 cDNA를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 이로부터 재조합 삭사틸린을 수득하는 공정을 포함하는 재조합 삭사틸린의 제조방법.A method for producing recombinant saxatilin, comprising the step of culturing the microorganism transformed with the expression vector comprising the cDNA of claim 1, and obtaining a recombinant saxatilin therefrom. 제 6항에 있어서,The method of claim 6, 발현벡터는 pPSAX인 것을 특징으로 하는Expression vector is characterized in that the pPSAX 재조합 삭사틸린의 제조방법.Method for preparing recombinant saxatilin. 제 6항에 있어서,The method of claim 6, 형질전환된 미생물은 피키아 파스토리스 Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX, KCCM-10201)인 것을 특징으로 하는The transformed microorganism is Pichia pastoris Y / pPSAX (KCCM-10201), characterized in that 재조합 삭사틸린의 제조방법.Method for preparing recombinant saxatilin. 제 8항에 있어서,The method of claim 8, 형질전환된 미생물을 pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃에서 12 내지 24 시간동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하여 수득한 세포를 0.5 내 지 1.5%(v/v)의 메탄올을 포함하는 pH 5.5 내지 6.5, 25 내지 35℃에 서 72 내지 120시간동안 다시 배양하는 것을 특징으로 하는The transformed microorganisms were incubated at pH 5.5 to 6.5 at 25 to 35 ° C. for 12 to 24 hours, and then the cells obtained by centrifugation of the culture were prepared at pH containing 0.5 to 1.5% (v / v) of methanol. Incubate again for 72 to 120 hours at 5.5 to 6.5, 25 to 35 ℃ 재조합 삭사틸린의 제조방법.Method for preparing recombinant saxatilin. 제 8항에 있어서,The method of claim 8, 형질전환된 미생물을 배양한 배양액을 소수성컬럼과 고성능 액체 크로 마토그래피에 적용하여 삭사틸린을 정제하는 공정을 포함하는 것을 특 징으로 하는A method for purifying saxatilin by applying a culture medium in which the transformed microorganism is cultured is applied to a hydrophobic column and a high performance liquid chromatography. 재조합 삭사틸린의 제조방법.Method for preparing recombinant saxatilin. 삭제delete 삭제delete