KR100457999B1

KR100457999B1 - 체세포배 유도법에 의한 리기테다소나무의 번식방법

Info

Publication number: KR100457999B1
Application number: KR10-2002-0023469A
Authority: KR
Inventors: 김용욱; 문흥규
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2002-04-29
Filing date: 2002-04-29
Publication date: 2004-11-18
Also published as: KR20030085263A

Abstract

본 발명은 리기테다소나무의 번식방법으로서,

미숙종자로부터 배발생조직을 유도하는 단계와, 배발생조직을 증식하여 체세포배를 유도하는 단계와, 체세포배를 발아시켜 식물체로 재분화하는 단계와, 재분화된 발아식물체의 환경순화단계 및 포지이식 단계를 포함하는 리기테다소나무의 번식방법을 개시한다.

본 발명에 의하면 향후 내충성 등 우수 침엽수종의 대량증식 및 보급뿐만 아니라 영양계 임업의 확립 및 임목품종화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

체세포배 유도법에 의한 리기테다소나무의 번식방법 {Propagation Method of Pinus rigida × P. taeda through Somatic Embryogenesis Technique}

본 발명은 리기테다소나무의 미숙종자를 재료로 배양하여 체세포배 유도법으로 묘목을 생산하고 포지로 이식하여 대량으로 번식시키는 방법에 관한 것이다.

체세포배 유도는 Steward 등(1958)이 당근에서 처음으로 연구한 이래로 시험관내에서 인위적으로 체세포배를 유도하여 그로부터 발아시킨 다음 식물체를 만드는 일종의 식물체 대량복제 기술로 이용되고 있는데 특히 침엽수종의 대량생산을 위해 가장 널리 이용되는 기술이다.

침엽수종의 체세포배 연구는 Hakman(1985)이 독일가문비나무의 미숙 종자배로부터 체세포배를 유도한 것이 최초이며 지금까지 연구된 침엽수종은 전나무속(Schuller, A., G. Reuther & T. geier, 1989. Somatic embryogenesis from seed explants ofAbies alba. Plant Cell Tissue & Organ Culture 17: 53-58.), 독일가문비나무속(Dunstan et al. 1991. Racemic abscissic acid and abscisyl alcohol promote maturation of white spruce(Picea gluca) somatic embryos. Plant Sci 76:219-228. ; Lele and Bornman. 1990. Somatic embryogenesis in cotyledons ofPicea abiesis enhanced by an adventitious bud-inducing treatment. New Forests 4:125-135. ; Roberts et al. 1991. Interaction between maturation and high relative humidity treatments and their effects on germination of Sitca spruce somatic embryos. J Plant Physiol 138: 1-6), 소나무속(Jones N.B. & van Staden J, 1995. Plantlet production from somatic embryos ofPinus patula. Journal of Plant Physiology 145: 519-525. ;Klimaszewska and Smith. 1997. Maturation of somatic embryos ofPinus strobusis promoted by a high concentration of gellan gum. Physiol Plant 100: 949-957.) 및 세콰이아속(Bourgkard and Favre. 1988. Somatic embryos from callus ofSequoia sempervirens. Plant Cell Rep 7:445-448) 등의 수종에서 많은 연구가 이루어졌고 현재 에는 가문비나무속의 수종, 라디아타소나무 및 테다소나무 등의 수종에서 가장 진보된 체세포배 유도 기술이 이루어져 거의 산업화 수준까지 도달해 있다. 또한 미국(Westvaco Co.), 캐나다(Silvagenic Co. Laurentian Forestry Centre) 및 뉴질랜드(Forest Research Institute, Carter Holt Harvey Ltd.)와 같은 선진임업국가에서는 이러한 체세포배 유도기술을 이용하여 새로운 우수 침엽수의 품종을 산업적인 규모로 대량생산하고 있다. 그러나 리기테다소나무의 연구는 미국 Westvaco 연구소에서 일부 연구가 수행되었으나 자세한 연구보고는 국내·외를 통틀어 발표된 바 없고 테다소나무에 관한 연구만 국외에서만 소수 이루어졌다.

체세포배의 장점은 줄기와 뿌리형성이 동시에 발생되어 기존방법인 액아배양 및 엽속배양과 같이 줄기 및 뿌리 등의 각 기관을 유도시 별도의 식물생장조절물질 처리가 필요치 않아서 기존의 증식방법보다 월등히 높은 생산효율을 지니는 큰 장점을 지닌다. 특히 침엽수종의 경우 기존의 증식법인 종자배 배양이나 침엽배양과 같은 배양기술로도 어느 정도까지는 줄기분화가 가능하나 그 후의 줄기신장 및 뿌리유도는 상당히 힘들어 결국 식물체의 대량증식은 불가능하게 된다. 또한 체세포배 유도기술은 임목의 무성번식 기술에도 적용이 가능한데 특히 인공종자 기술과 결합되면 클론 임목의 대량생산 연구에 큰 잠재력을 가진다.

리기테다소나무를 생산하기 위한 종래기술은 먼저 우수한 형질을 지닌 나무를 선발한 후 그 나무끼리 교배하여 양친의 좋은 형질을 지닌 종자 생산이 되도록 채종원을 조성함으로써 다량의 개량종자를 생산하는 것이었다. 또한 접ㆍ삽목과 같은 영양번식 기술도 개발하여 왔는데 그 중 삽목방법이 현재 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 유전검정을 통하여 선발된 클론은 이미 상당한 수령에 도달해 있어 삽목 발근율은 현저히 감소하며, 또한 많은 양의 삽수조달이 힘들므로 단기간내 대량의 우량한 삽목묘를 얻기는 힘들다. 최근에는 종자에서 발아한 실생묘에서 삽수를 채취하여 증식하기도 하는데 이는 종자의 다양한 유전적 구성으로 인하여 클론간에 많은 발근율 차이를 보이기 때문에 일정한 양의 발근묘를 지속적으로 생산할 수가 없다. 그리고 엽속(needle fascicle)삽목은 하나의 모수에서 다량의 엽속채취가 가능하고 좁은 공간에서도 다량의 엽속삽목이 가능한 잇점을 지니지만 모수의 수령이 높아질수록 발근율은 현저히 감소하며, 또한 발근이 되더라도 새로운 줄기유도가 힘들다는 단점이 있다.

본 발명자는 상기와 같은 종래 기술들이 가지는 단점을 극복하기 위한 방안을 예의 연구하여 오던 중 리기테다소나무의 번식방법에 있어서 체세포배 유도를 적용한 결과 단시간내에 우수 침엽수종의 대량생산이 가능해져 생장 및 재질이 우수한 리기테다소나무를 번식시킬 수 있음을 알고서 본 발명을 완성하게 되었다.

이로부터 본 발명의 목적은 리기테다소나무의 번식에 있어서, 체세포배 유도방법을 도입함으로써 단시간내에 우수한 리기테다소나무를 번식시킬 수 있는 방법을 제공함에 있다.

도 1 은 본 발명에 사용한 리기테다소나무의 미숙구과 사진이다

도 2 는 미숙종자의 주공부위로부터 유도중인 배발생조직의 사진이다

도 3 은 배발생조직을 더욱 증식시킨 사진이다

도 4 는 고농도의 엡시식산 및 젤라이트가 첨가된 배지에서 유도한 체세포배 사진이다

도 5 는 유도된 체세포배중 발아처리에 사용될 자엽단계의 배만을 정선한 사진이다

도 6 은 발아배지에서 체세포배가 발아중인 소식물체의 사진이다

도 7 은 침엽, 하배축 및 뿌리형성이 이루어진 발아식물체 사진이다

도 8 은 발아묘를 인공토양으로 이식한 2개월된 체세포배 유래 폿트묘의 사진이다

도 9 는 온실에서 환경순화된 체세포배 유래 2년생의 리기테다소나무의 묘목이다

도 10 은 포지에서 생장중인 체세포배 유래 3년생의 리기테다소나무의 묘목사진이다

본 발명은 리기테다소나무의 번식방법에 있어서,

미숙종자로부터 배발생조직을 유도하는 단계와, 배발생조직을 증식하여 체세포배를 유도하는 단계와, 체세포배를 발아시켜 식물체로 재분화하는 단계와, 재분화된 발아식물체의 환경순화단계 및 포지이식 단계를 포함하는 리기테다소나무의 번식방법을 포함한다.

이하 상기 번식방법에 사용되는 배지의 구체적인 조성을 바람직한 실시예를 들어 설명하기로 한다.

(1) 배발생조직의 유도시 배지는 바람직하기로는 통상의 P6 또는 MSG 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.1∼5.0mg/L 2,4-D, 0.1∼5.0mg/L BAP, 100∼1,000mg/L L-글루타민 및 0.1∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지를 사용하는 것이 좋다.

(2) 배발생조직의 증식시 배지는 바람직하기로는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.1∼5.0mg/L 2,4-D, 0.1∼5.0mg/L BAP, 100∼1,000mg/L L-글루타민 및 0.1∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지를 사용하는 것이 좋다.

(3) 체세포 유도시 사용되는 배지는 바람직하기로는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 100∼1,000mg/L L-글루타민, 100∼2000mg/L 카제인, 60∼200μM 엡시식산 및 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지를 사용하는 것이 좋다.

(4) 체세포배를 발아하기 위한 배지로는 바람직하기로는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지를 사용하는 것이 좋다.

이때 바람직하기로는 체세포 배양시 소정기간 약 25℃ 정도하에서 암소 배양하는 단계와, 암소 배양 이후 300∼3,000룩스 범위내에서 광도를 증가시켜 배양하는 단계를 포함하도록 한다.

(5) 발아된 식물체의 재분화 단계에 사용되는 배지로는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하며 소정 경사 바람직하기로는 40도∼70도를 가지도록 굳힌 배지가 들어 있는 시험관에 이식하여 생장시키는 것이 좋다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 구체적인 실험 및 실시예를 통해 설명하기로 한다. 다만 본 발명의 공시재료와 유사한 소나무 속의 체세포 배 유도에 의한 식물체 대량생산의 권리범위는 하기에서 설명할 실시 예에만 국한되지 아니함은 당업자에게 자명할 것이다.

<실시예 1> 식물재료 채취 및 시료 살균

본 발명에서는 배양재료로 사용된 리기테다소나무의 미숙구과(도 1)를 충북 충주에 위치한 리기테다소나무 채종원에서 1998년 6월 25일부터 8월 5일까지 1주 간격으로 채취하였고 채취한 미숙종자는 사용시까지 4℃에서 냉장보관하였다.

구과로부터 종자분리는 구과의 인편을 수술용 칼(21호)을 이용하여 벌린 후 인편사이에 들어있는 미숙종자를 분리하였고 종자소독은 500㎖ 크기의 삼각프라스크에 미숙종자를 넣고 수돗물에 tween 20용액을 2∼3방울 첨가 후 흔들어 주면서 5분 정도 세척하였다. 그런 다음 무균하에서 70% 에탄올로 1분간 세척한 후 다시 1% 치아염소산나트륨(NaClO)용액을 미숙종자가 잠길 정도로 붓고 Triton X-100용액 2∼3방울 첨가하여 15분 정도 흔들어 주면서 소독하였다. 그 후 소독액은 버리고 멸균증류수로 5차례 깨끗이 종자를 세척한 다음 배양을 하였다.

<실시예 2> 배지조성 및 조제

본 발명에서는 미숙종자로부터 배발생조직을 유도하기 위한 배양배지는 P6(Teasdale R.D., Dawson P.A. & Woolhouse H.W. 1988. Mineral nutrient requirements of a loblolly pine (Pinus taeda) cell suspension. Plant Physiology 82:942-945.)와 MSG(Becwar, M.R., Nagmani, R. & Wann, S.R. 1990. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda). Canadian Journal of Forest Research 20:810-817)의 두 종류를 원래 성분조성과는 달리 약간 변형시켜 사용하였으며(표 1), 각 배지에는 30g/L 수크로즈, 2.0mg/L 2,4-D, 1.0mg/L BAP를 공통적으로 첨가하였다. 산도는 5.7로 조정하고 0.4중량%의 젤라이트를 첨가하여 고체배지로 조제하였고 1,000mg/L L-글루타민은 배지의 열소독이 끝난 후 배지의 온도가 50℃정도로 식었을때 따로 첨가하였고 배지분주는 87×15㎜ 크기의 플라스틱 페트리디쉬(녹십자)에 15㎖정도 분주하여 상온에서 하룻밤 정도 굳힌 후 사용하였다.

<표 1> 리기테다소나무 배양에 사용된 배지의 성분 조성표

배지 조성	P6	MSG
Inorganic salts (mg/L)
NH₄NO₃	603.8	-
MgCl₂·6H₂O	50	-
H₃BO₃	15.5	6.2
CaCl₂·2H₂O	-	440
Mg(NO₃)₄·6H₂O	256.5	-
KNO₃	909.9	100
Ca(NO₃)₂·4H₂O	236.2	-
C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O	9.33	37.3
FeSO₄·7H₂O	6.95	27.8
MgSO₄·7H₂O	246.5	370
MnSO₄·H₂O	10.5	16.9
ZnSO₄·7H₂O	14.4	8.6
KI	4.15	0.83
NaMoO₄·2H₂O	0.125	-
Na₂MoO₄·2H₂O	0.138	0.25
CoCl₂·6H₂O	0.125	0.025
CuSO₄·5H₂O	0.125	0.025
Vitamines (mg/L)
myo-inositol	1000	100
Glycine	2.0	-
Nicotinic acid	0.5	0.5
Pyridoxine·HCl	0.5	0.1
Thiamine·HCl	1.0	0.1

<실시예 3> 종자 채취시기에 따른 종자 및 배유 크기

채취시기에 따른 종자길이는 최고 6.2㎜에서 최저 5.4㎜를 보였으며 종자길이의 변화는 채취시기에 따라 변화가 많아 보였다. 배유길이는 최고 4.7㎜에서 최저 3.6㎜까지 보였으며 최초 채취시기 이후로 조금씩 길이가 증가하는 경향을 보였다(표 2).

<표 2> 채취시기별 리기테다소나무 종자의 크기 변화

종자채취일(월/일)	종자길이 (㎜)	배유길이 (㎜)
'98. 6/ 25	5.4	3.6
7/ 1	5.6	4.2
7/ 9	6.2	4.2
7/ 16	5.7	4.5
7/ 23	5.8	4.5
7/ 30	6.2	4.7
8/ 5	5.9	4.7

<실시예 4> 종자 채취시기에 따른 종자배 발달 단계 및 배발생조직 유도율

배발생조직 유도시 가장 고려할 대상은 배양할 시점의 종자배 발달 단계인데, 특히 소나무류에서 배발생조직 유도는 미숙종자배의 끝에 붙어있는 배병(suspensor)조직이 배지에 첨가된 식물생장조절물질의 영향으로 세포분열을 되풀이하여 배발생조직으로 분화되기 때문에 배병이 길게 존재하는 시기 때의 종자배 채취가 매우 중요하다. 따라서 종자 채취시기에 따른 종자배 발달단계를 살펴보면 7월 9일경에는 원배(proembryo)형성이 거의 완료되며 그 이후로는 총알(bullet)형의 배, 전자엽(precotyledon)배 및 자엽(cotyledon)형의 배가 점차 늘고 있다(표 3).

배발생조직 유도율의 경우 7월1일경에 채취한 종자에서 가장 높은 1.1%의 유도율을 보였고 그때의 최적적인 종자배 발달단계는 원배형이 85%를 차지한 시기인 것을 알 수 있다. 그러나 그 이후 시기의 종자배에서는 점차 유도율이 감소하였으며 종자의 자엽배 비율이 50%를 넘은 시기에서는 전혀 배발생조직이 유도되지 않았다(표3).

<표 3> 리기테다소나무 종자 채취시기에 따른 배 발달단계 및 배발생조직 유도율

종자채취일 (월/일)	종자배의 발달 단계 (%)	배발생조직 유도율 (%)
종자채취일 (월/일)	원배	배발생조직 유도율 (%)	bullet 배	전자엽배	자엽배
'98. 6/ 25	8	0	0	0	0.3
7/ 1	85	0	0	0	1.1
7/ 9	100	0	0	0	0.6
7/ 16	70	30	0	0	0.4
7/ 23	40	40	20	0	0.08
7/ 30	14.3	14.3	10.7	57.1	0
8/ 5	0	0	0	100	0

따라서 채취한 종자배의 발달단계에 따라 배발생조직율이 좌우됨을 알 수 있다. 배지에 미숙종자를 배양할때는 종자의 종피만 벗기고 종자배와 배유를 함께 배지의 표면에 길이방향으로 접하도록 수평으로 치상하였고 25℃, 암소의 배양조건하에서 4주마다 동일조성의 새로운 배지로 이식하였다. 암배양 2∼3주 후에는 종자의 주공(micropyle) 부위에서 점액성이 많고 반투명한 조직이 분출되는 것을 볼 수 있으며(도 2) 배양 4주 후에는 유도된 배발생조직이 더욱 증식이 되어 체세포배의 원배단계까지 관찰할 수 있다

<실시예 5> 종자 채취일과 배지종류에 따른 배발생조직 유도율

배발생조직 유도율은 미숙종자를 7월1일경에 채취하여 P6배지에 배양하였을 때 가장 높은 1.6%를 보였고 그 이후로는 점차 감소하였으며 MSG배지의 경우도 7월1일경에 채취한 종자에서 최고 0.4%의 유도율을 보였으나 P6배지에서 보다는 대체적으로 낮은 조직유도율을 보였다(표 4). 그리고 배지종류에 따른 유도율 비교에서 P6배지가 0.62%를, MSG배지에서 0.08%를 보여 P6배지가 리기테다소나무의 배발생조직 유도를 위한 적정배지로 나타났다.

<표 4> 종자채취일과 배지종류에 따른 리기테다소나무의 배발생조직 유도율

종자 채취일 (월/일)	배지종류 (%)
종자 채취일 (월/일)	P6	MSG
'98. 6/ 25	0.7	0
7/ 1	1.6	0.4
7/ 9	1.2	0
7/ 16	0.6	0.07
7/ 23	0.1	0
7/ 30	0	0
8/ 5	0	0
전체 평균	0.62	0.08

<실시예 6> 배발생조직의 증식 및 유지

총 11,388개의 종자를 배양하여 50개(0.44%)의 배발생 조직을 얻었지만 2개의 조직라인(RT-11, RT-28)만이 생존하였다. 유도한 조직은 염류의 양을 반으로 줄인 1/2LM배지에 20g/L 수크로즈, 2.0mg/L 2,4-D, 1.0mg/L BAP, 1,000mg/L L-글루타민, 0.4중량% 젤라이트가 첨가된 배지에서 1주마다 계대배양을 하여 증식시켰다(도 3).

<실시예 7> 엡시식산 농도 및 젤라이트 농도에 따른 체세포배 유도 및 발아

체세포배 유도에 사용한 배지의 조성은 1/2LM배지에 60g/L 수크로즈, 500mg/L L-글루타민, 1,000mg/L 카제인이 공통으로 첨가되었다. 배지RT-11 라인의 체세포배 유도는 100μM 엡시식산 및 1.2중량% 젤라이트가 첨가된 처리구에서 가장 많은 조직 1g당 95개의 체세포배가 유도되었으며 발아율은 120μM 엡시식산 및 1.0중량% 젤라이트의 처리구에서 유도한 체세포배가 93.1%로 가장 높았다(표 5). 그러나 엡시식산 농도와는 관계없이 젤라이트 농도가 1.0중량% 이상이 되어야만 다수의체세포배 유도가 가능함을 보여준다. RT-28 라인의 경우 100μM 엡시식산 및 1.2중량% 젤라이트의 처리구에서 조직 1g당 224개로 가장 높은 유도수를 보였으며 발아율 또한 96.3%로 가장 높았다(표 6)(도 4).

체세포배 유도수는 엡시식산의 농도보다는 젤라이트 농도에 더욱 영향을 받는 것으로 보이는데 젤라이트 농도가 최소 1.0%이상이 필요함을 알 수 있다. 그리고 발아율 또한 체세포배 유도시 사용했던 젤라이트 농도에 영향을 받는 것으로 보이는데 1.0% 이상의 고농도 젤라이트에서 유도된 체세포배가 그 이하의 농도에서 유도한 체세포배보다 발아율이 대체로 높음을 알 수 있다(표 6). RT-28라인의 경우 RT-11라인 보다는 전반적으로 훨씬 많은 체세포배가 유도되었는데 이는 조직 라인간의 유전자형 차이에 기인하는 것으로 추측된다.

<표 5> 엡시식산 농도 및 젤라이트 농도에 따른 리기테다소나무의 체세포배 유도(조직계통: RT-11)

엡시식산 농도(μM)	젤라이트 농도(%)	체세포배 유도수(/1g조직 당)	발아율(%)
0	0.4	0	0
120	0.4	0	0
60	0.8	3	0
120	0.8	3	0
60	1.0	0	0
100	1.0	6	12.5
120	1.0	85	93.1
60	1.2	53	59.6
100	1.2	95	84.7
120	1.2	24	12.5

<표 6> 엡시식산 농도 및 젤라이트 농도에 따른 리기테다소나무의 체세포배 유도(조직계통: RT-28)

엡시식산 농도(μM)	젤라이트 농도(%)	체세포배 유도수(/1g조직 당)	발아율(%)
100	0.8	122	71.4
150	0.8	115	87.6
200	0.8	129	86.4
100	1.0	202	93.8
150	1.0	198	92.3
200	1.0	193	95.7
100	1.2	224	96.3
150	1.2	135	92.4
200	1.2	209	93.6

<실시예 8> 체세포배의 발아

체세포배 발아는 배발생조직으로부터 유도한 체세포배중 자엽단계의 체세포배(도 5)만을 해부현미경하에서 선발하여 사용하였다. 발아배지는 1/2LM 배지에 20g/L 수크로즈 및 0.4중량% 젤라이트로 조제하였다. 체세포배 발아는 최초 2주는 암소에서 실시하였고 다음 2주는 약 300룩스 정도의 약한 광도하에서 그 이후에는 3,000룩스의 광도로 옮겼다. 발아 처리 1주 후에는 체세포배의 자엽과 하배축부분이 신장되고 색깔은 푸른색을 띄기 시작하지만 하배축 끝의 유근발달은 아직 이루어지지 않았다(도 6).

발아 2∼3주 후에는 자엽과 하배축은 더욱 길이 생장을 하며 그 말단에는 뿌리유도가 관찰되었다. 발아 4주가 넘으면 발아식물체의 말단에 있는 정아에서 새로운 신초가 발생되면서 더욱 길이생장이 가속되었다(도 7). 발아 2∼3주마다 새로운 배지로 교환해주었고 발아체의 길이가 4㎝이상이 되면 60°기울기로 굳힌 배지가 들어 있는 시험관으로 이식하였는데 이때 뿌리는 배지속으로 삽입이 되지 않게 그냥 배지위로 치상하였다.

<실시예 9> 순화과정을 통한 폿트묘 생산

발아 식물체의 길이가 5∼6㎝이상이 되면 시험관에서 식물체를 꺼내어 인공흙(펄라이트:피트모스:버미큘라이트, 1:1:1)이 담긴 플라스틱 폿트(φ5.5㎝×7㎝)로 이식하였다(도 8).

폿트묘의 순화환경은 배양실 조건(25℃, 3,000룩스, 16시간 광조명)하에서 8주간 실시하였고 환경순화는 매일 충분한 양의 물을 관수하여 내부 상대습도를 높게 유지시켰으며 활착율은 8주 후에 95% 이상을 보였다. 활착된 폿트묘는 φ11×20㎝의 비닐 폿트로 이식시킨 다음 온실에서 더욱 생장시켰다(도 9).

<실시예 10> 포지이식

온실에서 생장중인 묘목의 길이가 20cm 이상이 되면 포지로 이식하여 식재하였다. 이식 4주 후부터는 묘목의 정아부위에서 새로운 신초지가 3∼4개가 발생되어 더욱 생장이 왕성해졌으며 포지 활착율은 100%에 가까웠다(도 10). 아직 체세포배 유래 묘목과 종자로부터 양묘한 실생묘간의 외형적인 큰 차이는 보이지 않았다.

본 발명에 의하면 단시간내에 우수 침엽수종의 대량생산이 가능해져 생장 및 재질이 우수한 리기테다소나무 외에도 낙엽송 등의 무성대량 증식뿐만 아니라 솔잎혹파리 등과 같은 병충해에 강한 소나무의 신품종 육종에도 동일하게 적용시킬 수 있다. 아울러 이 기술의 개발로 유전자조작 등의 첨단 생물공학 기법을 임업에 적용하는 것이 가능해졌으며 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성 증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

리기테다소나무의 번식방법에 있어서,

미숙종자로부터 배발생조직을 유도하는 단계와, 배발생조직을 증식하여 체세포배를 유도하는 단계와, 체세포배를 발아시켜 식물체로 재분화하는 단계와, 재분화된 발아식물체의 환경순화단계 및 포지이식 단계를 포함함을 특징으로 하는 체세포배 유도에 의한 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

종자는 길이가 5.4∼6.2mm 정도의 것이며, 배유길이가 3.6∼4.7mm 정도인 것으로부터 선택됨을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

종자는 원배형이 85% 이상을 차지하는 것으로부터 선택되어짐을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

배발생조직의 유도시 배지는 통상의 P6 또는 MSG 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.1∼5.0mg/L 2,4-D, 0.1∼5.0mg/L BAP, 100∼1,000mg/L L-글루타민 및 0.1∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지임을특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

배발생조직의 증식시 배지는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.1∼5.0mg/L 2,4-D, 0.1∼5.0mg/L BAP, 100∼1,000mg/L L-글루타민 및 0.1∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지임을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,

배양환경은 약 25℃정도의 암소에서 배양함을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1항에 있어서,

체세포 유도시 사용되는 배지는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 100∼1,000mg/L L-글루타민, 100∼2000mg/L 카제인, 60∼200μM 엡시식산 및 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지임을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서

체세포배를 발아하기 위한 배지로는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도10∼80g/L 수크로즈, 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하는 고체배지임을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 8 항에 있어서, 체세포배의 배양은

소정기간 약 25℃ 정도하에서 암소 배양하는 단계와,

암소 배양 이후 300∼3,000룩스 범위내에서 광도를 증가시켜 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

발아된 식물체의 재분화 단계는 통상의 내지는 1/2LM 배지로서 적어도 10∼80g/L 수크로즈, 0.4∼1.2중량% 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0∼7.0의 범위를 만족하며 소정 경사를 가지도록 굳힌 배지가 들어 있는 시험관에 이식하여 생장시킴을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법
제 1 항에 있어서,

환경순화단계는 발아식물체의 길이가 5∼6cm인 것을 선별하여 인공흙에 이식하여 수행함을 특징으로 하는 리기테다소나무의 번식방법