KR100449821B1 - A process for the purificaton of refolded recombinat hG-CSF - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 숙주세포에서 발현된 봉입체 형태의 hG-CSF를 가용화 변성제의 존재하에서 재생시킨 활성형의 hG-CSF를 흡착 크로마토그래피를 통과시키는 단계, 앙이온 및 음이온 교환 크로마토그래피를 연속적으로 수행하는 단계, 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 순차적으로 수행하는 활성형 hG-CSF의 정제방법에 관한 것이다.The present invention comprises the step of passing through the active chromatography hG-CSF in the form of inclusion bodies expressed in recombinant host cells regenerated in the presence of a solubilizing modifier, adsorption chromatography, anion and anion exchange chromatography It relates to a method for purifying active hG-CSF, which is performed sequentially, performing a step of performing gel filtration chromatography.
Description
인체과립성 백혁구 콜로니 자극인자(human Granulocyte-Colony Stimulating Factor, 이하 "hG-CSF"라 표시한다)는 조혈작용에 관여하는 콜로니 자극인자(Colony Stimulating Factor : CSF) 중 주로 과립 백혈구 형성에 관여하는 사이토카인(Cytokine)의 일종으로 골수 백혈구 세포의 분화를 유도하고 성숙한 과립성 백혈구의 기능을 증진시키는 작용을 가지고 있어 백혈병의 치료 및 예방, 항암요법 시 호중구 감소증의 예방 및 치료효과를 나타내므로 임상적으로 매우 유용한 물질로 알려져 있으며, 현재, 유전자 재조합 기술을 통해 제조하는 다수의 방법이 공지되어 있다(Shigetaka, A. & Am, J., Hematol. Oncol. Vol. 13, pp. 400 (1991) ; Steven, C.C. and Kamen, R., Science, Vol. 236, pp. 1229 (1987) ; 미국특허 제 4,810,643 호 ; 유럽특허 제 256,843 호 ; 대한민국 공개특허 제 96-14347 호 등).Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor (hereinafter referred to as "hG-CSF") is a cytokine that is mainly involved in the formation of granulocytes among colony stimulating factors (CSF) involved in hematopoietic action. It is a kind of cytokine, which induces differentiation of bone marrow leukocytes and enhances the function of mature granulocytes. It is clinically effective in treating and preventing leukemia and in preventing and treating neutropenia during chemotherapy. It is known to be a very useful substance, and at present, a number of methods for producing by genetic recombination techniques are known (Shigetaka, A. & Am, J., Hematol. Oncol. Vol. 13, pp. 400 (1991); Steven , CC and Kamen, R., Science, Vol. 236, pp. 1229 (1987); US Patent No. 4,810,643; European Patent No. 256,843; Korean Patent Publication No. 96-14347, etc.).
hG-CSF를 유전자 재조합 방법을 통하여 제조할 경우, 배양의 용이성 등의 장점을 가지고 있는 대장균을 숙주세포로 주로 사용하게 되는데, 이 방법은 세포질에서 발현되는 hG-CSF는 대부분이 생물학적 활성이 없는 불용성의 봉입체(insoluble inclusion body) 형태로 생산되기 때문에 활성형으로 전환시키는 과정 즉, 재생과정(refolding process)이 필수적으로 요구된다(Bernhard, F., et. al., Biotech. & Bioeng., Vol. 41, pp. 3, 1993 ; Anton, P. J. Middelberg, J. Mol. Biotech., Vol. 6, No. 4, pp. 225, 1996 ; Rainer, R and Hauke, L., FASEB J., Vol. 10, pp. 49, 1996).When the hG-CSF is manufactured through genetic recombination, Escherichia coli, which has the advantages of ease of culture, is mainly used as a host cell. In this method, most of the hG-CSF expressed in the cytoplasm is insoluble without biological activity. Since it is produced in the form of an insoluble inclusion body, a process for converting to an active form, that is, a refolding process, is essential (Bernhard, F., et. Al., Biotech. & Bioeng., Vol. 41, pp. 3, 1993; Anton, PJ Middelberg, J. Mol. Biotech., Vol. 6, No. 4, pp. 225, 1996; Rainer, R and Hauke, L., FASEB J., Vol. 10 , pp. 49, 1996).
이러한 재생과정을 통해 얻은 활성형의 hG-CSF를 정제하는 방법으로는 아세톤 침전, 탈염 크로마토그래피, 흡착, 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 또는 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 선택적으로 이용하여 분리정제할 수 있다.As a method for purifying the active type hG-CSF obtained through the regeneration process, the separation method may be selectively performed using acetone precipitation, desalting chromatography, adsorption, ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, or gel filtration chromatography. It can be purified.
재생된 활성형의 hG-CSF를 정제하는 종래의 방법으로는 대한민국 특허공개 제 96-14343 호에서 개시한 바와 같이 재생된 hG-CSF를 산 침전법으로 대장균 유래 불순물과 재생시 발생되는 hG-CSF 유래 이성체 등을 제거시킨 후 양이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 방법이 공지되어 있다.As a conventional method for purifying the regenerated active hG-CSF, as disclosed in Korean Patent Publication No. 96-14343, the regenerated hG-CSF is acid precipitated to generate an E. coli-derived impurity and hG-CSF. It is known to purify by removing the derived isomers and the like followed by cation exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography.
그러나, 상기와 같은 정제 방법은 재생된 hG-CSF를 산 침전법으로 일차 처리할 때 대장균 유래 불순물과 재생시 발생되는 hG-CSF 유래 이성체 등이 침전물로 형성되는 과정에서 재생된 hG-CSF가 함께 침전되면서 손실을 가져올 수 있다.However, in the above purification method, when the regenerated hG-CSF is first treated with an acid precipitation method, the regenerated hG-CSF is combined with impurities formed from E. coli-derived impurities and hG-CSF-derived isomers generated during regeneration. Settling can cause losses.
그리고, 상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행할 때, 비교적 높은 염화나트륨 농도로(0.2∼0.3 M) 용출시키기 때문에 용출한 hG-CSF 함유 분획을 황산암모늄 침전, 원심분리 회수 및 투석 등의 복잡한 일련의 공정을 수행한 다음에 최종적으로 겔 여과 크로마토그래피를 수행해야 하는 문제점이 있다.In addition, since the method elutes at a relatively high sodium chloride concentration (0.2-0.3 M) when performing a cation exchange chromatography process, the eluted hG-CSF-containing fraction is subjected to a complex series of ammonium sulfate precipitation, centrifugation recovery and dialysis. There is a problem that the gel filtration chromatography should be finally performed after the process of.
한편, 가용화 변성제를 사용하여 재생시킨 활성형의 hG-CSF를 정제할 경우에는 재생시 사용된 가용화 변성제를 제거하는 공정이 선행되어야 한다(미국특허 제 4,810,643호, 대한민국 특허 제 133561호 등).On the other hand, when purifying the active type of hG-CSF regenerated using a solubilization modifier, a step of removing the solubilization modifier used during regeneration should be preceded (US Pat. No. 4,810,643, Korean Patent No. 133561, etc.).
미국특허 제4,810,643호에는 재생된 시료에 함유된 가용화 변성제로 사용된 살코실(N-라우로일살코신)을 제거하기 위해 아세톤 침전, 구아니딘 염산으로 용해,탈염 크로마토그래피 공정을 수행하여 살코실을 제거한 다음, 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피 등을 수행하여 활성형의 hG-CSF를 정제하는 방법이 개시되어 있다.U.S. Patent No. 4,810,643 describes the removal of salcosyl by performing acetone precipitation, dissolving with guanidine hydrochloric acid, and desalting chromatography to remove salcosyl (N-lauroyl sarcosine) used as a solubilizing modifier contained in the regenerated sample. Next, a method of purifying the active hG-CSF by performing cation exchange chromatography, gel filtration chromatography, and the like is disclosed.
그러나, 상기 방법은 재생시 사용된 살코실을 제거하기 위한 아세톤 침전, 구아니딘 염산으로 용해 및 탈염 크로마토그래피 등의 공정은 살코실의 제거에는 우수하나 탈염 크로마토그래피 과정에서 아세톤 침전유도 후 회수한 hG-CSF 침전물을 녹이는 구아니딘 염산이 제거될 때 상당량의 활성형의 hG-CSF가 다시 침전되어 많은 손실을 초래하기 때문에 수율이 낮은 문제점이 있다.However, the above method is excellent in removing salcosyl, but the process such as acetone precipitation, dissolution with guanidine hydrochloric acid and desalting chromatography to remove the salkosyl used during regeneration, but recovered after acetone precipitation induction in the desalting chromatography process. When guanidine hydrochloric acid, which melts the CSF precipitate, is removed, a significant amount of hG-CSF is precipitated again, causing a lot of losses, which causes a low yield.
대한민국 특허 제133561호에는 재생시 사용된 살코실을 도웩스(Dowex) 이온 교환 수지를 이용하여 제거한 후, 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 활성형의 hG-CSF를 정제하는 방법이 개시되어 있다.Korean Patent No. 133561 discloses a method for purifying active hG-CSF by removing the salcosyl used during regeneration using a Doexex ion exchange resin and then performing anion exchange chromatography and cation exchange chromatography. Is disclosed.
그러나, 상기 방법은 살코실이 제거된 hG-CSF시료를 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행할 경우에 용출되는 hG-CSF 양이 적어 수율이 낮은 문제점이 있다. 그리고, 다음 단게인 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위하여 pH를 5.4로 조절하는데, 이 과정에서 일부 침전현상이 일어나 전체적인 수율에 부정적 영향을 미치는 문제점이 있다.However, the method has a low yield because the amount of hG-CSF eluted when performing the anion exchange chromatography process for the salgyl-free hG-CSF sample. And, in order to perform the next step cation exchange chromatography to adjust the pH to 5.4, there is a problem that some precipitation occurs in this process negatively affect the overall yield.
이에, 본 발명자들은 재생된 hG-CSF로부터 가용화 변성제, 대장균 유래의 펩타이드, DNA 및 엔도톡신 등의 불순물을 효율적으로 제거시켜, 고수율 및 고순도로 활성형의 hG-CSF를 정제하는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 재생된 hG-CSF를 흡착 크로마토그래피를 수행하여 가용화 변성제를 제거한 다음, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 정제방법을 개발하게 되었다.Accordingly, the present inventors have conducted studies to develop a method for purifying active hG-CSF with high yield and high purity by efficiently removing impurities such as solubilizing denaturant, E. coli-derived peptide, DNA and endotoxin from regenerated hG-CSF. As a result, the purified hG-CSF was subjected to adsorption chromatography to remove the solubilizing denaturant, and then a purification method was performed to sequentially perform ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.
또한, 본 발명자들은 대장균 유래의 엔도톡신을 효과적으로 제거하기 위하여, 가용화 변성제가 제거된 시료를 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 다음, 시료의 전처리 과정 없이 음이온 교환 크로마토그래피를 연속적으로 연결하여 통과시키는 공정을 개발하게 되었다.In addition, the present inventors have developed a process for carrying out cation exchange chromatography of a sample from which a solubilizing modifier has been removed in order to effectively remove endotoxin derived from E. coli, followed by continuous connection of anion exchange chromatography without pretreatment of the sample. Was done.
제 1도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자와 필그라스팀(Filgrastim : 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자, Amgen사, 이하 "필그라스팀"이라 표시한다)을 비변성 조건에서 전기영동(SD-PAGE, non-reducing) 한 결과를 나타낸 것이다(A : 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF, B : 필그라스팀(Filgrastim, 암젠 사, 미국)Figure 1 shows the non-denatured conditions of the human granulocyte leukocyte colony stimulator and filgrastim (Filgrastim: human granule leukocyte colony stimulator, Amgen, hereinafter referred to as "filgrastim") obtained after the purification process according to the present invention Electrophoresis (SD-PAGE, non-reducing) in (A: hG-CSF purified according to the present invention, B: filgrastim (Filgrastim, Amgen, USA)
제 2도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자와 필그라스팀을 등전집속시험(isoelectricfocusing)을 한 결과를 나타낸 것이다. A : 등전점 마커(pI marker), B : 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF, C : 필그라스팀(Filgrastim, 암젠 사, 미국)Figure 2 shows the results of the isoelectric focusing test of human granulocyte leukocyte colony stimulating factor and filgrastim obtained after the purification process according to the present invention. A: pI marker, B: hG-CSF purified according to the present invention, C: Filgrastim (Amsen, USA)
제 3도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 역상 고속 액체 크로마토그래피(reverse phase - HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다(215nm)Figure 3 shows the results of analyzing the human granulocyte leukocyte colony stimulator obtained after the purification process by reverse phase high performance liquid chromatography (215 nm).
제 4도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 역상 고속 액체 크로마토그래피(reverse phase - HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다(280nm)Figure 4 shows the results of analyzing the human granulocyte leukocyte colony stimulator obtained after the purification process by reverse phase high performance liquid chromatography (280 nm)
제 5도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피로(size exclusion - HPLC) 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the results of the analysis of the human granulocyte leukocyte colony stimulator obtained after the purification process by gel filtration high performance liquid chromatography (size exclusion-HPLC).
제 6도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 이온 교환 고속 액체 크로마토그래피로(ion exchange - HPLC) 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the results of analysis of the human granulocyte leukocyte colony stimulator obtained after the purification process by ion exchange high performance liquid chromatography (ion exchange-HPLC).
제 7도는 본 발명에 따른 정제과정 후 얻은 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 원편광 이색성 스펙트럼 분석(circular dichroism spectrin analysis)을 한 결과를 나타낸 것이다.Figure 7 shows the results of circular dichroism spectrin analysis of the human granulocyte leukocyte colony stimulating factor obtained after the purification process according to the present invention.
제 8도는 본 발명으로 정제된 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자 및 NIBSC(National Insitute for Biological Standards & Control) 국제 표준 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 마우스 골수세포를 이용하여 콜로니 형성능을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. A : NIBSC 국제 표준 hG-CSF, B : 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF8 shows the results of observing colony forming ability of the human granulocyte leukocyte colony stimulator and NIBSC (National Insitute for Biological Standards & Control) international standard human granulocyte leukocyte colony stimulator purified by the present invention using mouse bone marrow cells. will be. A: NIBSC international standard hG-CSF, B: hG-CSF purified according to the present invention
제 9도는 본 발명으로 정제된 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자를 이용한 비활성 역가(Unit/mg)의 측정 시 NIBSC 국제 표준 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자의 양과 역가에 대한 표준검량선을 작성한 결과를 나타낸 것이다.Figure 9 shows the results of preparing a standard calibration curve for the amount and titer of NIBSC international standard human granulocyte leukocyte colony stimulator when measuring inactive titers (Unit / mg) using the human granulocyte leukocyte colony stimulator purified by the present invention .
본 발명은 재조합 숙주세포에서 발현된 봉입체 형태의 hG-CSF를 가용화 변성제의 존재하에서 재생시킨 활성형의 hG-CSF를 흡착 크로마토그래피를 통과시키는 단계, 앙이온 및 음이온 교환 크로마토그래피를 연속적으로 수행하는 단계, 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 순차적으로 수행하는 활성형 hG-CSF의 정제방법에 관한 것이다.The present invention comprises the step of passing through the active chromatography hG-CSF in the form of inclusion bodies expressed in recombinant host cells regenerated in the presence of a solubilizing modifier, adsorption chromatography, anion and anion exchange chromatography It relates to a method for purifying active hG-CSF, which is performed sequentially, performing a step of performing gel filtration chromatography.
본 발명에 따른 정제방법에 출발물질로 사용되는 시료는 유전자 재조합된 대장균에 의해 생산된 hG-CSF를 가용화 변성제를 사용하여 재생시켜 활성화된 hG-CSF를 사용할 수 있으며, 본 발명자들에 의하여 유전자 재조합된 대장균(출원번호 제 98-27475, 균주기탁번호 KCTC 8893P)에 의해 제조되어 가용화 변성제로 재생된 hG-CSF가 바람직하다. 여기서, 재생시 사용되는 가용화 변성제는 도데실 황산나트륨 또는 N-라우로일살코신이 바람직하다.The sample used as a starting material in the purification method according to the present invention may use the hG-CSF activated by regenerating the hG-CSF produced by the genetically recombined Escherichia coli using a solubilizing denaturant, and the present invention recombines genes by the present inventors. Preferred is hG-CSF prepared by E. coli (Application No. 98-27475, Strain Accession No. KCTC 8893P) and regenerated with a solubilizing denaturant. Here, the solubilization modifier used during regeneration is preferably sodium dodecyl sulfate or N-lauroyl sarcosine.
본 발명에 따른 정제방법에 있어서, 재생된 활성형의 hG-CSF 용액은 재생과정에서 사용된 가용화 변성제를 제거하기 위하여, 통상의 엠벌라이트(Amberate) 겔, 도웩스 이온 교환 수지, 또는 흡착 크로마토그래피를 수행할 수 있는 바이오-비드 SM2(Bio-Bead SM2, Bio-Rad 사) 겔을 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바이오-비드 SM2 겔을 사용하여 흡착 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직하다. 바이오-비드 SM2 겔은 고분자물질인 폴리스티렌-디비닐-벤젠(polystyrene-divinyl-benzene)으로 구성된 겔이다. 흡착 크로마토그래피를 수행하기 위하여 겔을 평형화시킬 때 사용하는 용액은 포타지움포스페이트(potassium phosphate)을 함유한 용액이 바람직하며, 이 경우 포타지움포스페이트을 함유한 용액의 농도는 10 mM, pH는 7.0 내지 9.0이 바람직하다. 또한, 재생된 활성형의 hG-CSF 용액도 포타지움포스페이트을 10 mM 농도가 되게 첨가하고, pH는 7.0 내지 9.0이 되도록 조절하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 여기서 바이오-비드 SM2 흡착 크로마토그래피는 재생시 사용된 가용화 변성제를 제거시켜줄 뿐 아니라 산성 pH에서 침전을 형성하는 대장균 유래의 불순물도 상당량 제거시켜 주기 때문에 다음 단계인 이온 교환 크로마토그래피를 효과적으로 수행할 수 있다.In the purification method according to the present invention, the regenerated active hG-CSF solution is used to remove the solubilization modifier used in the regeneration process. A bio-bead SM2 (Bio-Bead SM2, Bio-Rad) gel that can be used may be used. In the present invention, it is preferable to perform adsorption chromatography using a bio-bead SM2 gel. Bio-bead SM2 gel is a gel composed of polystyrene-divinyl-benzene. The solution used to equilibrate the gel in order to perform the adsorption chromatography is preferably a solution containing potassium phosphate, in this case the concentration of the solution containing potassium phosphate is 10 mM, pH is 7.0 to 9.0 This is preferable. In addition, it is more preferable that the regenerated active hG-CSF solution is added with potassium phosphate to a concentration of 10 mM, and the pH is adjusted to 7.0 to 9.0. Here, bio-bead SM2 adsorption chromatography not only removes the solubilizing denaturant used during regeneration, but also removes considerable amounts of E. coli-derived impurities that form precipitates at acidic pH, so that the next step, ion exchange chromatography, can be effectively performed. .
흡착 칼럼 크로마토그래피를 통과시켜 회수한 시료는 동일부피의 증류수로 희석시키고, 희석된 용액과 동일부피의 1 % 내지 6 %(v/v)의 초산 용액과 다시 혼합한 다음 이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 이온 교환 수지로는 통상의 CM-세파로스(CM-shepharose), SP-세파로스(SP-sepharose) 등의 양이온 교환수지를 이용할 수 있으나, 칼럼 작업시 유속, pH 안정성 및 내구성 등이 우수한 마크로-프렙 하이 S(Macro-Prep High S, Bio-Rad사) 양이온 교환 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 마크로-프렙 하이 S 양이온 교환 수지는 설포네이트(sulfonate, -SO3 -)를 작용기로 갖는 수지이다. 마크로-프렙 하이 S 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위하여 겔을 평형화시킬 때 사용하는 완충용액은 초산나트륨(sodium acetate)을 함유한 완충용액으로 농도는 5 mM 내지 50 mM, pH는 3.0 내지, 4.0이 바람직하며, 15 mM 내지 30 mM, pH는 3.6 내지 3.9이 되도록 제조하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다.Samples recovered by passing through adsorption column chromatography were diluted with distilled water in the same volume, mixed again with the same volume of 1% to 6% (v / v) acetic acid solution and subjected to ion exchange chromatography. do. As the ion exchange resin, conventional cation exchange resins such as CM-shepharose and SP-sepharose may be used, but macro-excellent flow rate, pH stability, and durability when performing column operations. Preference is given to using a Prep High S (Macro-Prep High S, Bio-Rad) cation exchange resin. Macro-Prep High S cation exchange resins are sulfonate (sulfonate, -SO 3 -) a resin having a functional group. The buffer used to equilibrate the gel in order to perform macroprep high S cation exchange chromatography is a buffer solution containing sodium acetate. The concentration is 5 mM to 50 mM and the pH is 3.0 to 4.0. Preferably, 15 mM to 30 mM, pH is more preferably prepared to use 3.6 to 3.9.
한편, 시료주입 후 상기용액으로 충분히 칼럼을 세척한 후 50 mM 내지 150 mM, pH는 6.1 내지 7.5의 초산나트륨 완충용액으로 hG-CSF를 용출시키는 것이 바람직하며, 초산나트륨 농도를 75 mM 내지 125 mM, pH는 6.1 내지 6.5의 완충용액으로 hG-CSF를 용출시키는 것이 더욱 바람직하다.On the other hand, after sample injection, after washing the column sufficiently with the above solution, it is preferable to elute hG-CSF with sodium acetate buffer solution of 50 mM to 150 mM, pH of 6.1 to 7.5, sodium acetate concentration of 75 mM to 125 mM , pH is more preferably eluted hG-CSF with a buffer solution of 6.1 to 6.5.
그리고, 용출시 음이온 교환 수지인 마크로-프렙 하이 Q(Macro-Prep high Q, Bio-Rad 사) 칼럼을 마크로-프렙 하이 S 칼럼에 연속적으로 연결하여 사용하는 것이 바람직하다. 마크로-프렙 하이 Q 수지는 4차아민(quaternary amine, -N+(CH3)3)을 작용기로 갖는 수지이다. 마크로-프렙 하이 S 칼럼에서 용출되어 나오는 시료가 연속적으로 마크로-프렙 하이 Q 칼럼을 통과하도록 하면 대장균 세포 유래의 엔도톡신을 더욱더 효과적으로 제거할 수 있다.In addition, it is preferable to use a macro-prep high Q (Macro-Prep high Q, Bio-Rad) column that is an anion exchange resin during elution in series with the macro-prep high S column. Macro-prep high Q resin is a resin having a functional group of quaternary amine (-N + (CH 3 ) 3 ). Samples eluted from the macro-prep high S column can be passed through the macro-prep high Q column to remove endotoxin from E. coli cells more effectively.
이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 시료는 분자량 제한 크기(molecular cut off size)가 10,000인 멤브레인(membrane)을 사용하여 단백질 농도가 최종 약20 mg/ml 내지 50 mg/ml가 되도록 농축하는 것이 바람직하며, 초산을 가하여 최종 1 % 내지 6 %(v/v)가 되도록 한 다음, 농축하는 것이 더욱 바람직하다. 농축된 시료는 10 mM, pH 4.0의 초산나트륨 완충용액으로 평형화된 세파덱스 G-75 슈퍼파인(Sephadex G-75 superfine, pharmacia사) 겔 여과 칼럼을 통과시켜 정제하며, 이 경우 상기 완충용액에 최종 0.004 %되게 폴리소르베으트 80을 첨가하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다.Samples eluted by ion exchange chromatography are preferably concentrated to a protein concentration of about 20 mg / ml to 50 mg / ml using a membrane having a molecular cut off size of 10,000, More preferably, acetic acid is added to bring the final 1% to 6% (v / v) and then concentrated. The concentrated sample is purified by passing through a Sephadex G-75 superfine (pharmaco) gel filtration column equilibrated with sodium acetate buffer at 10 mM, pH 4.0, in which case the final solution More preferably, polysorbate 80 is added to be 0.004%.
상기와 같은 본 발명에 따른 조건으로 재생된 활성형의 hG-CSF를 정제하는 방법은 대장균에서 생산된 hG-CSF를 재생하는데 사용된 가용화 변성제를 효과적으로 제거할 수 있으며, 아울러 산성조건에서 침전을 형성하는 숙주세포 유래의 불순물도 상당량 제거할 수 있다.The method for purifying the active type hG-CSF regenerated under the conditions according to the present invention as described above can effectively remove the solubilizing modifier used to regenerate the hG-CSF produced in Escherichia coli, and also form precipitates under acidic conditions. It can also remove a considerable amount of impurities derived from the host cell.
또한, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위하여 흡착 크로마토그래피를 통과한 시료를 초산을 사용하여 본 발명에 따른 방법으로 처리하면 다량의 침전물이 형성되지 않기 때문에 활성형의 hG-CSF의 손실이 생기지 않고, 침전물을 제거하기 위한 원심분리 공정이 필요 없기 때문에 대량생산에 효율적이다.In addition, when the sample passed through the adsorption chromatography to perform ion exchange chromatography by the method according to the present invention using acetic acid does not form a large amount of precipitate does not cause the loss of the active hG-CSF, It is efficient for mass production because there is no need for a centrifugation process to remove deposits.
한편, 양이온 교환 칼럼(마크로-프렙 하이 S)에서 hG-CSF를 용출할 때, 음이온 교환 칼럼(마크로-프렙 하이 Q)을 마크로-프렙 하이 S 칼럼에 연결하여 마크로-프렙 하이 S 칼럼에서 용출된 hG-CSF 용액이 음이온 교환 칼럼을 연속적으로 통과하도록 하므로써 대장균 유래의 발열성 물질인 엔도톡신을 효과적으로 제거할 수 있다. 이 경우 두 칼럼을 사용하는데 따른 hG-CSF의 손실은 없으며, 본 공정은 양이온 교환 칼럼에서 용출된 시료가 음이온 교환 칼럼을 직접 통과하는 하나의 연속적인 공정이므로 공정상의 어려움도 전혀 없다.On the other hand, when eluting hG-CSF in a cation exchange column (macro-prep high S), an anion exchange column (macro-prep high Q) was connected to the macro-prep high S column and eluted from the macro-prep high S column. By allowing the hG-CSF solution to continuously pass through the anion exchange column, endotoxin, an exothermic substance derived from E. coli, can be effectively removed. In this case, there is no loss of hG-CSF due to the use of two columns, and this process is a continuous process in which the sample eluted from the cation exchange column passes directly through the anion exchange column.
이온 교환 크로마토그래피 과정에서 hG-CSF의 용출시, 염화나트륨을 사용하지 않고 pH 조절 및 낮은 이온 강도의 초산나트륨 용액만을 사용하므로 이후 과정의 겔 여과 크로마토그래피에서 요구되는 농축된 시료의 준비시 투석 등의 탈염공정을 통한 별도의 염화나트륨의 제거과정 없이 농축과정 만으로 충분히 시료를 준비할 수 있기 때문에 공정상의 효율성을 이룰 수 있으며, 염화나트륨 제거과정에서의 hG-CSF의 손실도 줄일 수 있어 고수율로 hG-CSF를 정제할 수 있다.For elution of hG-CSF during ion exchange chromatography, only sodium acetate solution of pH control and low ionic strength is used without using sodium chloride, so dialysis, etc., in preparation of concentrated sample required in subsequent gel filtration chromatography As the sample can be sufficiently prepared by the concentration process without removing the sodium chloride through the desalination process, the efficiency of the process can be achieved, and the loss of hG-CSF during the sodium chloride removal process can be reduced, so that the high yield of hG-CSF Can be purified.
또한, 초산을 최종 약 3 %가 되도록 첨가하여 농축하면 약 50 mg/ml 농도의 고농도로 농축하더라도 hG-CSF의 고농도에 따른 중합체(multimer) 형성을 방지할 수 있어 활성형의 hG-CSF의 손실 없이 겔 여과 크로마토그래피를 수행할 수 있는 농축된 시료를 준비할 수 있으며, 효과적인 농축으로 겔 여과 주입 시료의 부피를 최소화 할 수 있어, 정제도를 위하여 통상 느린 유속으로 작업해야 하는 겔 여과 칼럼 공정에서 시료 주입시 소요되는 시간을 절약할 수 있고, 아울러 주입 시료의 부피에 따라 정제도에서 차이를 보이는 겔 여과 크로마토그래피의 특성에 부합되어 우수한 정제효과를 이룰 수 있다.In addition, concentration of acetic acid to about 3% of the final concentration prevents the formation of polymers due to the high concentration of hG-CSF even when concentrated to a high concentration of about 50 mg / ml, thus losing the active type of hG-CSF. Concentrated samples can be prepared without gel filtration chromatography, and effective concentrations can minimize the volume of gel filtration injected samples, thus allowing samples to be processed in gel filtration column processes, which typically require a slow flow rate for purification. The time required for the injection can be saved, and the excellent purification effect can be achieved in accordance with the characteristics of gel filtration chromatography, which shows a difference in the degree of purification according to the volume of the injected sample.
이하 본 발명을 참조예, 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Examples, and Test Examples. However, the present invention is not limited thereto.
참조예 1Reference Example 1
단계 1)Step 1)
봉입체 형태의 hG-CSF를 함유한 대장균 세포 배양액 18L를 회수하고 100 mM 트리스 염산(Tris-HCl : pH 8.0)과 10 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(Ethylenediamine tetra acetate, EDTA), 1 %(w/v) 트라이톤 엑스-100(Triton X-100) 및 20 %(w/v) 설탕(sucrose)이 함유된 용액 5 L에 현탁시키고 4℃에서 약 12시간 반응시킨 후 10,000 g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 100 mM Tris-HCl(pH 8.0)과 10 mM EDTA 및 lysozyme(0.4 ㎎/㎖)을 함유한 용액 5 L에 현탁시키고 4℃에서 2시간 반응시킨 후 여기에 트라이톤 엑스-100(Triton X-100)과 소디윰 디옥시클레이트(sodium deoxycholate)를 각각 최종 1 % 및 2 %(w/v)되게 첨가한 다음 초음파 파쇄기로 10분간 파쇄시키고 얻어진 세포파쇄액을 10,000 g에서 30분간 원심분리하여 hG-CSF를 함유한 봉입체 침전물을 회수하였다.18 L of Escherichia coli cell culture containing hG-CSF in inclusion body form was recovered and 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 mM Ethylenediamine tetra acetate (EDTA), 1% (w / v) Suspended in 5 L solution containing Triton X-100 and 20% (w / v) sucrose, reacted for about 12 hours at 4 ° C and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes to precipitate the precipitate. Recovered. The recovered precipitate was suspended in 5 L of a solution containing 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA and lysozyme (0.4 mg / mL), and reacted at 4 ° C for 2 hours, followed by Triton X-100 (Triton). X-100) and sodium deoxycholate were added to the final 1% and 2% (w / v), respectively, and then crushed for 10 minutes with an ultrasonic crusher, and the resulting cell lysate was centrifuged at 10,000 g for 30 minutes. Separation recovered the inclusion body precipitate containing hG-CSF.
단계 2)Step 2)
단계 1에서 얻은 봉입체 침전물을 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA 및 0.3%(w/v) 도데실 황산나트륨을 함유한 용액 5L에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 10분간 파쇄한 다음 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 상기 초음파 파쇄과정을 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)과 10 mM EDTA를 함유한 용액하에서 1회 더 수행한 후 Triton X-100과 소디윰 디옥시클레이트를 각각 최종 1 % 및 2 %(w/v)되게 첨가한 다음 10분간 상온에서 교반시키고 10,000 g에서 30분간 원심분리하여 hG-CSF를 함유한 봉입체 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물은 약 0.02∼0.04 g/㎖ 농도로 0.15 MNaCl 용액을 가하여 현탁시킨 다음 상온에서 1시간 반응시킨 후 10,000 g에서 30분간 원심분리하여 hG-CSF를 함유한 봉입체를 세척하였다.Inclusion body precipitate obtained in step 1 was suspended in 5 L of a solution containing 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, and 0.3% (w / v) sodium dodecyl sulfate, crushed by an ultrasonic crusher for 10 minutes, and then centrifuged. To recover the precipitate. The ultrasonic crushing process was performed once more in a solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 mM EDTA, followed by the final 1% and 2% (w) of Triton X-100 / v) was added and then stirred at room temperature for 10 minutes and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes to recover the inclusion body precipitate containing hG-CSF. The recovered precipitate was suspended by adding 0.15 MNaCl solution at a concentration of about 0.02 to 0.04 g / ml, and then reacted at room temperature for 1 hour, followed by centrifugation at 10,000 g for 30 minutes to wash the inclusion body containing hG-CSF.
단계 3)Step 3)
단계 2에서 제조한 봉입체 침전물을 200 mg/ml 농도로 50 mM 트리스 염산, 1 M 요소(urea), 2 %(w/v) 도데실 황산나트륨 및 20 mM DTT를 함유한 완충용액에 현탁시키고 5 N 수산화나트륨을 가하여 pH를 12.0 ± 0.5로 조절한 후 상온에서 30분간 교반하여 완전히 용해시켰다. 상기 용해된 봉입체 용액을 다시 10,000 g에서 30분간 원심분리한 후 0.45 ㎛의 포아사이즈(pore size)를 갖는 멤브레인으로 여과하여 재생에 사용할 시료로 준비하였다.Inclusion body precipitate prepared in step 2 was suspended in a buffer solution containing 50 mM Tris hydrochloric acid, 1 M urea, 2% (w / v) sodium dodecyl sulfate and 20 mM DTT at a concentration of 200 mg / ml and Sodium hydroxide was added to adjust the pH to 12.0 ± 0.5, followed by stirring at room temperature for 30 minutes to dissolve completely. The dissolved inclusion body solution was again centrifuged at 10,000 g for 30 minutes and then filtered through a membrane having a pore size of 0.45 μm to prepare a sample for regeneration.
단계 4)Step 4)
30 μM 황산구리(CuSO4)와 50 mM 트리스 염산을 함유한 용액에 0.3 % 도데실 황산나트륨을 첨가하여 pH 8.0의 완충용액(또는 재생용액)을 제조하고, 이 완충용액으로 세파덱스(Sephadex) G-75 (5.0×70 ㎝) 칼럼을 평형화시킨 다음, 단계 3에서 제조한 시료용액을 이 칼럼에 통과시키면서 분획하였다. 칼럼을 통과한 시료는 각 분획별로 0.1 % 초산트리플루오로(trifluoracetic acid)을 함유한 20 % 아세토니트릴(acetonitrile)용액과 0.1% 초산트리플루오로을 포함한 70 % 아세토니트릴 용액을 직선농도구배로 흘려주면서 역상 고속액체크로마토그래피(C4, 4.6mm×15 cm)를 수행한 후 필그라스팀(Amgen 사, 미국)과 동일한 피크(peak) 양상과 유지시간(retention time)을 같는 분획을 회수하여 재생된 hG-CSF를 제조하였다.To a solution containing 30 μM copper sulfate (CuSO 4 ) and 50 mM tris hydrochloric acid, 0.3% sodium dodecyl sulfate was added to prepare a buffer solution (or regeneration solution) at pH 8.0, and Sephadex G- was used as the buffer solution. The 75 (5.0 × 70 cm) column was equilibrated, and the sample solution prepared in step 3 was fractionated while passing through this column. The sample passed through the column was flowed in a straight line using a 20% acetonitrile solution containing 0.1% trifluoracetic acid and a 70% acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid in a straight line. After performing reverse phase high performance liquid chromatography (C4, 4.6 mm x 15 cm), the recovered hG was recovered by recovering fractions having the same peak pattern and retention time as those of filgrastim (Amgen, USA). -CSF was prepared.
참조예 2Reference Example 2
참조예 1의 단계 3)의 2 %(w/v) 도데실 황산나트륨대신 2 % 살코실을 사용하고, 단계 4)의 0.3 % 도데실 황산나트륨 대신 2 %살코실을 사용하여 참조예 1의 제조방법과 동일하게 수행하여 재생된 hG-CSF를 제조하였다.Preparation method of Reference Example 1 using 2% salcosyl instead of 2% (w / v) sodium dodecyl sulfate in step 3) of Reference Example 1 and 2% salcosyl instead of 0.3% sodium dodecyl sulfate in step 4) In the same manner as in the regenerated hG-CSF was prepared.
실시예 1Example 1
단계 1)Step 1)
참조예 1의 단계 4)에서 회수한 재생된 hG-CSF를 함유한 용액에 최종 10 mM 되게 포타지움포스페이트를 첨가한 다음 pH를 7.2로 조절한 후 10 mM 포타지움포스페이트 완충용액(pH 7.2)으로 평형화시킨 바이오-비드 SM2 칼럼(5.0×30 ㎝)에 통과시킨면서 시료를 회수하였다. 회수한 시료는 동일 부피의 증류수(4 ℃)로 2 배 희석시킨 다음 다시 희석된 시료와 동일 부피의 2 %(v/v)의 초산용액(4 ℃)과 혼합하여 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 위한 시료로 준비하였다. 이 경우 시료는 2.0 mΩ 이하의 이온 강도와 3.9 이하의 pH를 유지하여 본 발명에 따른 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하기에 별도의 pH나 이온강도의 조절 없이도 적합하였다.To the solution containing the regenerated hG-CSF recovered in step 4) of Reference Example 1 was added potassium phosphate to the final 10 mM, and then the pH was adjusted to 7.2, followed by 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2). Samples were recovered while passing through an equilibrated bio-bead SM2 column (5.0 × 30 cm). The recovered sample was diluted twice with the same volume of distilled water (4 ° C) and then mixed with the diluted volume with 2% (v / v) acetic acid solution (4 ° C) in the same volume for ion exchange column chromatography. Prepared as a sample. In this case, the sample was suitable to maintain the ionic strength of 2.0 mPa or less and the pH of 3.9 or less to perform cation exchange column chromatography according to the present invention without adjusting the pH or ionic strength.
단계 2)Step 2)
4 ℃에서 15 mM 초산나트륨 완충용액(pH 3.9)으로 평형시킨 마크로-프렙 하이 S 칼럼(5.0×30 cm)에 단계 1에서 준비한 시료를 주입한 후 동일 완충용액으로 겔 부피의 약 10 배를 흘려주면서 세척한 다음 다시 15 mM 초산나트륨, pH 5.0의 완충용액으로 겔 부피의 약 40배를 통과시켜 세척하였다. 세척이 끝난 후 15 mM 초산나트륨 용액으로 평형시킨 마크로-프렙 하이 Q 칼럼(2.5×30 cm)을 마크로-프렙 하이 S 칼럼에 연결시킨 후 100 mM 초산 나트륨, pH 6.3의 완충용액을 흘려주면서 마크로-프렙 하이 S 칼럼에서 용출된 hG-CSF가 연속적으로 마크로-프렙 하이 Q 칼럼을 통과하도록 하면서 hG-CSF를 회수하였다. 이 경우 용출된 시료는 양이온 교환 칼럼인 마크로-프렙 하이 S 칼럼만을 사용할 때보다 더욱 효과적으로 대장균 유래의 엔도톡신을 제거할 수 있었으며, 용출 시 사용되는 완충용액의 pH가 재조합 hG-CSF의 등전점(pI 6.1)보다 높아 마크로-프렙 하이 S 칼럼에서 일차적으로 용출되는 hG-CSF의 표면전하가 음이온을 띠게되어 음이온 교환 칼럼인 마크로-프렙 하이 Q 칼럼에는 결합되지 않고 통과되므로 본 칼럼 사용으로 인한 hG-CSF의 손실은 없었다.Inject the sample prepared in Step 1 into the Macro-prep High S column (5.0 × 30 cm) equilibrated with 15 mM sodium acetate buffer (pH 3.9) at 4 ° C, and flow about 10 times the volume of the gel with the same buffer. After washing with water, it was washed again by passing about 40 times the volume of gel with 15 mM sodium acetate, pH 5.0 buffer. After washing, macro-prep high Q column (2.5 × 30 cm) equilibrated with 15 mM sodium acetate solution was connected to the macro-prep high S column, and then macro-prepared with 100 mM sodium acetate, pH 6.3 buffer solution. HG-CSF was recovered while allowing the hG-CSF eluted from the Prep High S column to pass through the Macro-Prep High Q column. In this case, the eluted sample was able to more effectively remove endotoxin derived from E. coli than the macro-prep high S column, which is a cation exchange column, and the pH of the buffer solution used for the elution was equal to the isoelectric point of the recombinant hG-CSF (pI 6.1). The surface charge of hG-CSF eluted from the macro-prep high S column is higher than that of the negative ion, which is not bound to the macro-prep high Q column. There was no loss.
단계 3)Step 3)
단계 2에서 회수한 시료는 최종 3 % 되게 초산을 첨가한 다음 분자량 제한크기가 10,000인 멤브레인을 사용하여 겔 여과 칼럼 부피의 5 % 이하로 농축하였다. 농축된 시료는 0.004 % 폴리소르베이트 80을 함유한 10 mM 초산 나트륨, pH 4.0의완충용액으로 평형시킨 세파덱스 G-75 슈퍼파인 칼럼(2.5×120 cm)에 12 ml/시간의 유속으로 통과시키면서 분획하였다. 분획 중 hG-CSF 분획만을 모아 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 등으로 분석한 결과 99 % 이상의 순도를 보였다(제 1도, 제 3도, 제 4도).The sample recovered in step 2 was added to the final 3% acetic acid and then concentrated to 5% or less of the gel filtration column volume using a membrane having a molecular weight limit of 10,000. The concentrated sample was passed through a Sephadex G-75 superfine column (2.5 × 120 cm) at a flow rate of 12 ml / hour, equilibrated with a buffer solution of 10 mM sodium acetate, pH 4.0 containing 0.004% polysorbate 80. Fractionated. Only hG-CSF fractions in the fractions were collected and analyzed by dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), high performance liquid chromatography (HPLC) and the like. 4th).
실시예 2Example 2
참조예 2에서 제조한 재생된 hG-CSF를 사용하여 실시예 1의 정제방법과 동일하게 정제하였다.Purified in the same manner as in Example 1 using the regenerated hG-CSF prepared in Reference Example 2.
시험예 1. 확인시험Test Example 1. Confirmation Test
시험예 1-1. 전기영동시험(SDS-PAGE, non-reducing)Test Example 1-1. Electrophoresis test (SDS-PAGE, non-reducing)
실시예 1의 정제방법에 따라 정제된 hG-CSF와 필그라스팀을 2X 전기영동용 시료용액(Novex사, 미국)과 1:1로 혼합한 후 10 ∼20 %의 농도구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔(Novex사, 미국)을 사용하여 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 겔을 코마씨 블루 염색법에 의해 염색하여 얻은 결과는 제 1도와 같다.Polyacrylamide having a concentration gradient of 10-20% after mixing hG-CSF and filgrastim purified according to the purification method of Example 1 with a 2X electrophoretic sample solution (Novex, USA) 1: 1 Electrophoresis was performed using a gel (Novex, USA). After electrophoresis, the result obtained by staining the gel by Coomassie blue staining is shown in FIG.
제 1도에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 필그라스팀과 동일 위치에서 단일 단백질 밴드(protein band)를 보이고 있어 재생된 활성형의 hG-CSF가 고순도로 정제되었음을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 1 hG-CSF purified according to the present invention shows a single protein band (protein band) at the same position as the filgrastim confirms that the purified active hG-CSF was purified with high purity Could.
시험예 1-2. 등전집속시험(Isoelectricfocusing)Test Example 1-2. Isoelectric focusing
실시예 1의 정제방법에 따라 정제된 hG-CSF와 필그라스팀을 2X 등전집속시험용 시료용액(Novex사, 미국)과 1:1로 혼합한 후 pH 3.0∼10.0 범위의 이소일렉트릭포커싱 겔(Novex사, 미국)을 사용하여 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 겔을 코마씨 블루 염색법에 의해 염색하여 얻은 결과는 제 2도와 같다.HG-CSF and filgrastim purified according to the purification method of Example 1 were mixed 1: 1 with a 2X isoelectric focusing sample solution (Novex, USA) and then isoelectric focusing gel having a pH of 3.0 to 10.0 ( Electrophoresis using Novex, USA). After electrophoresis, the result obtained by staining the gel by Coomassie blue staining is shown in FIG.
제 2도에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 필그라스팀과 동일 위치에서 단일 단백질 밴드(protein band)를 보이고 있어 필그라스팀과 동일한 등전점을 갖으며 hG-CSF 유래의 전하이성체가 없는 고순도의 hG-CSF임을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 2 hG-CSF purified according to the present invention shows a single protein band (protein band) at the same position as the pillgrass team has the same isoelectric point as the filgrassteam and derived from hG-CSF It was confirmed that the high purity hG-CSF without the charge isomer.
시험예 2. 순도시험Test Example 2 Purity Test
시험예 2-1. 역상 고속 액체 크로마토그래피 시험(reverse phase - HPLC)Test Example 2-1. Reverse Phase Liquid Chromatography Test (reverse phase-HPLC)
실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF을 50 ㎕(1 ㎎/㎖) 취하여 C4 칼럼(300 Å, 4.6 mm×25 ㎝, Vydac, 214TP54, 미국)에 주입 후 0.1 % 초산트리플루오르액과 90 % 아세토니트릴을 함유한 0.1 % 초산트리플루오르액을 70 분간 0.7 ㎖/분의 유량속도를 유지하며 직선농도구배로 흘려주면서 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 수행한 결과 제 3도 및 제 4도에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 215 nm, 280 nm 모두에서 단일 피이크를 보여 100 %의 순도를 보였다.50 μl (1 mg / ml) of hG-CSF purified according to the purification method of Example 1 was injected into a C4 column (300 μs, 4.6 mm × 25 cm, Vydac, 214TP54, USA), and then 0.1% trifluoroacetic acid solution. Reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was performed by flowing a 0.1% trifluoroacetic acid solution containing 90% acetonitrile and flowing in a linear concentration tool at a flow rate of 0.7 ml / min for 70 minutes. And as can be seen in Figure 4 hG-CSF purified according to the present invention showed a single peak at both 215 nm, 280 nm showed a purity of 100%.
시험예 2-2. 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피 시험(size exclusion - HPLC)Test Example 2-2. Gel Filtration High Speed Liquid Chromatography Test (size exclusion-HPLC)
실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF을 50 ㎕(1 ㎎/㎖) 취하여 도데실 황산나트륨을 함유한 초산나트륨 완충액(pH5.4)으로 평형화 시킨 TSK-Gel G3000 SW 칼럼(7.5 mm×60 ㎝, TOSOH, 05103, 일본)에 주입한 후 동일 완충액으로 1 ㎖/분의 유량속도로 흘려주면서 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피(size exclusion - HPLC)를 수행한 결과 제 5도에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 본 분석에서 단일 피크를 보여 hG-CSF 유래의 중합체(multimer)가 없는 단량체(monomer)만으로 정제된 것을 알 수 있었다.A TSK-Gel G3000 SW column (7.5 mm ×) was taken in 50 μl (1 mg / ml) of purified hG-CSF according to the purification method of Example 1 and equilibrated with sodium acetate buffer solution (pH5.4) containing sodium dodecyl sulfate. 60 cm, TOSOH, 05103, Japan) and subjected to gel filtration high-performance liquid chromatography (size exclusion-HPLC) with the same buffer at a flow rate of 1 ml / min as shown in FIG. Likewise, hG-CSF purified according to the present invention showed a single peak in this analysis and it was found that only the monomer (monomer) without the polymer (multimer) derived from hG-CSF.
시험예 2-3. 이온 교환 고속 액체 크로마토그래피 시험(ion exchange - HPLC)Test Example 2-3. Ion exchange high performance liquid chromatography test (ion exchange-HPLC)
실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF을 50 ㎕(1 ㎎/㎖) 취하여 TSK-Gel SP-NPR 칼럼(4.6 mm×35 mm, TOSOH, 13076, 일본)에 주입한 후 20 mM 초산나트륨 완충액(pH 5.4)과 100mM 염화나트륨을 함유한 20 mM 초산나트륨 용액(pH 5.4)을 20분간 1 ㎖/분의 유량속도를 유지하며 직선농도구배로 흘려주면서 이온 교환 고속 액체 크로마토그래피(size exclusion - HPLC)를 수행한 결과 제 6도에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 본 분석에서 단일 피이크를 보여 hG-CSF 유래의 전하이성체가 없는 고순도의 hG-CSF 만으로 정제된 것을 알 수 있었다.50 μl (1 mg / ml) of hG-CSF purified according to the purification method of Example 1 was injected into a TSK-Gel SP-NPR column (4.6 mm × 35 mm, TOSOH, 13076, Japan), followed by 20 mM acetic acid. Ion-exchange high-speed liquid chromatography (size exclusion) with a 20 mM sodium acetate solution (pH 5.4) containing sodium buffer (pH 5.4) and 100 mM sodium chloride (pH 5.4) for 20 minutes at a flow rate of 1 ml / min. As shown in FIG. 6, the hG-CSF purified according to the present invention showed a single peak in this analysis and was purified with only high purity hG-CSF without charge isomers derived from hG-CSF. Could know.
시험예 2-4. 엔도톡신시험Test Example 2-4. Endotoxin Test
바이오휘태커(Biowhittaker)사의 내독소 정량 키트(Limulus AmebocyteLysate, Cat. # 50-648U)를 사용하여 실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF에 대한 엔도톡신 함유량을 측정하였다.The endotoxin content of the hG-CSF purified according to the purification method of Example 1 was measured using Biowhittaker's endotoxin quantification kit (Limulus Amebocyte Lysate, Cat. # 50-648U).
가. 검액의 조제end. Preparation of Samples
정제품(1 ㎎/㎖) 200 ㎕에 0.3 N 수산화나트륨 용액 10 ㎕를 가하여 pH를 중성으로 조절하였다.The pH was adjusted to neutral by adding 10 µl of 0.3 N sodium hydroxide solution to 200 µl of the purified product (1 mg / ml).
나. 표준 엔도톡신의 조제I. Preparation of Standard Endotoxin
키트에 공급되는 표준 엔도톡신을 랄(LAL) 시약 증류수를 사용하여 초기 표시농도(X)의 배수(1/X)로 희석하여 1.0 EU/㎖ 농도의 표준 엔도톡신을 제조한 후 다시 랄 시약 증류수로 희석하여 0.5, 0.25, 0.1 EU/㎖의 표준 엔도톡신을 조제하였다.The standard endotoxin supplied in the kit was diluted to a multiple of the initial indicated concentration (X) (1 / X) using LAL reagent distilled water to prepare a standard endotoxin of 1.0 EU / ml concentration, and then diluted again with the Ral reagent distilled water. To prepare standard endotoxins of 0.5, 0.25, and 0.1 EU / ml.
다. 시 험All. exam
① 평저 마이크로플레이트(96 웰)의 각 웰(well)에 랄 시약 증류수(공시험 : blank), 표준 내독소 및 검액 50 ㎕씩을 분주하고 여기에 랄(LAL) 50 ㎕를 가하였다.① 50 µl of Lal reagent distilled water (blank), standard endotoxin and sample solution were dispensed into each well of a flat microplate (96 wells), and 50 µl of LAL was added thereto.
② 5∼6회 흔들어 주면서 혼합시킨 후 37±1.0 ℃에서 10분간 방치하였다.② After mixing 5-6 times shaking, it was left for 10 minutes at 37 ± 1.0 ℃.
③ 기질용액 100 ㎕를 각 웰에 가하고 5∼6회 흔들어 주어 혼합시킨 후 37±1.0 ℃에서 6분간 반응시켰다.③ 100 μl of substrate solution was added to each well and shaken 5-6 times to mix, followed by reaction at 37 ± 1.0 ° C. for 6 minutes.
④ 반응종료시약 100 ㎕를 각 웰에 가하여 반응을 종료시킨 후 Plate Reader로 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.④ 100 μl of reaction termination reagent was added to each well to terminate the reaction, and the absorbance was measured at 410 nm with a plate reader.
라. 계산 및 결과la. Calculation and result
표준 엔도톡신 및 검액의 흡광도 값을 랄 시약 증류수(공시험)를 사용한 웰(well)의 흡광도 값으로 보정한 후 각 표준 엔도톡신의 농도에 대한 흡광도로 직선 희귀식을 구하고 검량선을 작성하였다. 검액에서 얻은 흡광도를 검량선에 대입하여 검액의 엔도톡신 농도를 구한 후 검액 조제 시 사용된 수산화나트륨에 의한 희석 배수(1.05)를 곱하여 정제된 시료(1 ㎎/㎖)에 함유된 최종 엔도톡신 농도를 산출한 결과, 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 1 mg 당 0.1 EU(0.1 EU/mg/ml) 이하의 엔도톡신 양을 나타내었다.Absorbance values of the standard endotoxin and the sample solution were corrected to the absorbance values of the wells using LAL reagent distilled water (a blank test), and a straight line rare equation was obtained by absorbance for each standard endotoxin concentration, and a calibration curve was prepared. The final endotoxin concentration contained in the purified sample (1 mg / ml) was calculated by substituting the absorbance obtained from the sample solution into the calibration curve to determine the endotoxin concentration of the sample solution and multiplying by the dilution factor (1.05) with sodium hydroxide used when preparing the sample solution. As a result, hG-CSF purified according to the present invention showed an amount of endotoxin of 0.1 EU (0.1 EU / mg / ml) or less per mg.
시험예 2-5. 대장균 유래 펩타이드 시험Test Example 2-5. E. coli-derived peptide test
시그너스테크로러지(Cygnus Technologies, 미국) 사의 효소 면역학적 측정 키트(ELISA kit, Cat.# F010)을 이용하여 실시예 1의 정제방법에 따라 정제된 최종액 중 대장균 유래의 불순단백질 혼입 여부를 확인하였다.Using the enzyme immunological measurement kit (ELISA kit, Cat. # F010) of Cygnus Technologies (USA) to confirm the incorporation of E. coli-derived impurities in the final solution purified according to the purification method of Example 1 It was.
가. 검액의 조제end. Preparation of Samples
정제액(1 ㎎/㎖) 360㎕에 1M 트리즈마 베이스 용액(pH 8.0) 40 ㎕를 가하여 pH를 중성으로 조절하였다.The pH was adjusted to neutral by adding 40 µl of 1M Trisma base solution (pH 8.0) to 360 µl of the purified solution (1 mg / ml).
나. 대장균 유래 표준 이종단백질I. E. coli-derived standard heterologous protein
1 ng/㎖, 4 ng/㎖, 20 ng/㎖, 75 ng/㎖ 농도의 표준 이종단백질을 사용하였다. 시험Standard heteroproteins at concentrations of 1 ng / ml, 4 ng / ml, 20 ng / ml and 75 ng / ml were used. exam
① 준비된 이종단백질 표준액, 검액 및 공시험액(blank)을 200 ㎕씩을 각 웰에 넣은 후 25 ℃에서 2시간 정치하였다.① 200 μl each of the prepared heterologous protein standard solution, sample solution and blank (blank) were placed in each well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours.
② 세척용액으로 3회 세척하였다.② washed three times with a washing solution.
③ 대장균 유래 단백질에 대한 항체와 알카라인 포스포타제가 결합된 접합체(anti-E.coli-Alkaline Phosphatase Conjugates)를 200 ㎕씩 각 웰에 분주한 후 25 ℃에서 2시간 정치하였다.③ 200 μl of the antibody conjugated to the E. coli-derived protein and the alkaline phosphatase conjugated (anti- E.col i-Alkaline Phosphatase Conjugates) were dispensed into each well and allowed to stand at 25 ° C for 2 hours.
④ 세척용액으로 4회 세척하였다.④ Washed four times with a washing solution.
⑤ 기질용액을 각 웰에 200 ㎕씩 분주한 후 25 ℃에서 1시간 반응시켰다.⑤ 200 μl of the substrate solution was dispensed into each well, followed by reaction at 25 ° C. for 1 hour.
⑥ Plate Reader로 405/490 nm에서 각 웰의 흡광도 값을 측정하였다(405nm : 시험 파장(test wavelength), 490nm : 참고 파장(reference wavelength)).⑥ The absorbance values of each well were measured at 405/490 nm with a plate reader (405 nm: test wavelength, 490 nm: reference wavelength).
라. 결과la. result
표준액, 검액의 각 흡광도 값을 공시험(blank)의 흡광도 값으로 보정한 후 각 표준 이종단백질의 농도에 대한 흡광도로 직선희귀식을 구하고 검량선을 작성하였다. 검액에서 측정된 흡광도를 검량선에 대입하여 검액의 대장균 유래 이종단백질의 농도를 구한 후 검액 조제 시 사용된 트리즈마 베이스 용액에 의한 희석배수(약 1.1)를 곱하여 정제액(1 ㎎/㎖) 중에 함유된 최종 숙주세포 유래 이종단백질 양을 산출한 결과, 본 발명에 따라 정제한 hG-CSF는 1 mg 당 1 ng(1 ng/mg/ml) 이하였다.After adjusting the absorbance values of the standard solution and the sample solution to the absorbance values of the blank test (blank), the linear rare equation was obtained by absorbance for the concentration of each standard heterologous protein, and a calibration curve was prepared. Substitute the absorbance measured in the sample solution into the calibration curve to determine the concentration of E. coli-derived heterologous protein, and then multiply by the dilution factor (about 1.1) by the Trisma base solution used to prepare the sample solution. As a result of calculating the final host cell-derived heterologous protein amount, hG-CSF purified according to the present invention was 1 ng (1 ng / mg / ml) or less per mg.
시험예 2-6. 대장균 유래 DNA 시험Test Example 2-6. E. coli-derived DNA test
실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 최종 정제액 내의 대장균 유래 DNA 함유 여부를 확인하기 위하여 보링거 맨하임(Boehringer Mannheim(BM), 독일) 사의 디그난래디오액티브누크레익에시드레이블링 디텍션시스템(Dig Nonradioactive Nucleic acid labeling & Detection System)을 이용한 DNA 하이브리드화(DNA hybridigation) 방법을 이용하여 DNA 양을 정량하였다.Dignonradioactive labeling detection system (Dig Nonradioactive) of Boehringer Mannheim (BM), Germany to confirm the presence of E. coli-derived DNA in the final purification solution purified according to the purification method of Example 1 DNA amount was quantified using DNA hybridization using Nucleic acid labeling & Detection System.
가. 검액의 제조end. Preparation of Sample Liquid
정제액(1 ㎎/㎖) 500 ㎕에 10 N NaOH 2 ㎕를 가하여 준비하였다.500 µl of the purified solution (1 mg / ml) was prepared by adding 2 µl of 10 N NaOH.
나. 표준 DNA 제조I. Standard DNA Manufacturing
대장균 표준 DNA(100 ㎍/㎖)을 DNA 희석 완충액(10 mM 트리즈마 베이스 + 1 mM EDTA + 50 ㎍/㎖ herring sperm DNA)으로 1 ㎍/㎖까지 희석한 다음 0.5, 1,5, 10, 50, 100, 500 ng/㎖되게 희석하여 준비하였다.E. coli standard DNA (100 μg / ml) was diluted to 1 μg / ml with DNA dilution buffer (10 mM Trisma base + 1 mM EDTA + 50 μg / ml herring sperm DNA) and then 0.5, 1,5, 10, 50 Prepared by diluting to 100, 500 ng / ml.
각 희석 표준액에 10 N 수산화나트륨 2 ㎕를 첨가하여 100℃에서 10 분간 끓여 변성시킨 후 얼음에 방치하였다.2 μl of 10 N sodium hydroxide was added to each diluted standard solution, boiled at 100 ° C. for 10 minutes, denatured, and left on ice.
다. 시험All. exam
다-1. 검액 처리C-1. Sample processing
① 검액을 500 ㎕ 취하였다.① 500 µl of the test solution was taken.
② 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(24:1:1)을 각각 동일부피 첨가하여 2회 추출하였다.② Phenol / Chloroform / Isoamyl Alcohol (24: 1: 1) was added twice and extracted twice.
③ 클로로포름/이소아밀알콜(24:1)을 동일부피 첨가하여 1회 추출하였다.③ Chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added once and the same volume was extracted.
④ TE 용액(10 mM 트리즈마 베이스 용액(pH 8.0) + 1 mM EDTA 용액)으로 추출액을 500 ㎕로 조정한 다음 2배 부피의 무수에탄올과 0.1 부피의 4 M 염화리듐(LiCl)를 가하여 -70 ℃ 초저온기에 30분간 방치하였다.④ Adjust the extract to 500 μl with TE solution (10 mM Trisma base solution (pH 8.0) + 1 mM EDTA solution), add 2 volumes of anhydrous ethanol and 0.1 volume of 4 M lithium chloride (LiCl) to add -70. It was left to stand for 30 minutes at ultra low temperature.
⑤ 4 ℃, 12,000 rpm에서 30분간 원심분리한 다음 형성된 침전물을 70 % 에탄올로 세척하고 말렸다.⑤ After centrifugation at 4 ° C. and 12,000 rpm for 30 minutes, the formed precipitate was washed with 70% ethanol and dried.
⑥ DNA 희석 완충액 10 ㎕를 가하여 완전히 녹인 다음 10N 수산화나트륨 1 ㎕를 가하였다.⑥ 10 μl of DNA dilution buffer was added to dissolve completely, and then 1 μl of 10N sodium hydroxide was added.
⑦ 95 ℃ 이상에서 10분간 끓여 변성시킨 후 얼음에 방치하였다.⑦ boiled above 95 ℃ for 10 minutes, denatured and left on ice.
다-2. DNA 점적(Dot Blotting)C-2. DNA Blotting
① 나일론 멤브레인을 적당한 크기로 잘라 2× SSC 용액에 10분간 적신다음 왓트만(Whatman) 여과지 위에 놓고 완전히 건조시켰다.① Cut the nylon membrane into a suitable size, soak it in 2 × SSC solution for 10 minutes, place it on Whatman filter paper and dry it completely.
② 건조된 나일론 멤브레인 위에 DNA 각 표준액은 1 ㎕씩 그리고 검액은 4 ㎕를 각각 점적하였다.② On the dried nylon membrane, 1 μl of each standard solution and 4 μl of the sample were instilled.
③ UV-크로스링커(UV-cross linker)를 이용하여 3분간 고정시켰다.③ fixed for 3 minutes using a UV-cross linker (UV-cross linker).
다-3. DNA 혼성화 반응C-3. DNA hybridization reaction
① 다-2에서 준비된 멤브레인을 혼성화기에 넣고 디곡시게닌 이이지 하이브리드화 용액(DIG Easy Hyb 용액, BM 사, Cat # 1603558) 10 ㎖를 첨가한 후 42℃에서 2시간 이상 반응시켰다.① The membrane prepared in C-2 was added to the hybridizer, and 10 ml of digoxigenin easy hybridization solution (DIG Easy Hyb solution, BM Co., Cat # 1603558) was added and reacted at 42 ° C. for 2 hours or more.
② 탐침자(디곡시겐닌-11-dUTP : digoxigenin-11-dedxyuridine triphosphate)를 95℃ 이상에서 10분간 가열하여 변성시킨 후 얼음에 방치한 다음 적당량을 취하여 적당량의 DIG Easy Hyb 용액에 혼합하였다.② The probe (digoxigenin-11-dUTP: digoxigenin-11-dedxyuridine triphosphate) was heated and denatured for 10 minutes at 95 ° C. or higher, left on ice, and then mixed with an appropriate amount of DIG Easy Hyb solution.
③ ②의 DIG Easy Hyb 용액 적당량을 나일론 멤브레인이 들어있는 혼성화기에 첨가하고 42℃에서 하룻밤동안(16∼24 시간) 반응시켰다.③ The appropriate amount of DIG Easy Hyb solution of ② was added to the hybridizer containing nylon membrane and reacted overnight at 42 ° C. (16-24 hours).
④ 반응이 끝난후 DIG Easy Hyb 용액을 버리고 2×SSC/0.1 % SDS 용액 50 ㎖로 상온에서 5분씩 2회 세척하였다.④ After the reaction, the DIG Easy Hyb solution was discarded and washed twice with 5 ml of 2 × SSC / 0.1% SDS solution at room temperature for 5 minutes.
⑤ 0.1×SSC/0.1% SDS용액 50 ㎖을 가하여 68℃에서 15분간 2회 세척하였다.(5) 50 ml of 0.1 × SSC / 0.1% SDS solution was added and washed twice at 68 ° C. for 15 minutes.
다-4. 검 출C-4. detection
① 0.1× SSC/0.1 % SDS 용액으로 세척한 멤브레인을 다시 디곡시게닌-세정액(Dig-세정액, BM 사, Cat # 1585762)으로 2분간 교반하면서 세척하였다.① Membrane washed with 0.1 × SSC / 0.1% SDS solution was washed again with digoxigenin-cleaning solution (Dig-cleaning solution, BM, Cat # 1585762) for 2 minutes with stirring.
② 디곡시겐닌-차단액(Dig-차단액, BM 사, Cat # 1585762)으로 30분간 차단시켰다.② Digoxigenin-blocker (Dig-blocker, BM, Cat # 1585762) was blocked for 30 minutes.
③ 항 디곡시겐닌 알카라인 포스포타제(anti-digoxigenin-alkaline phosphatase) 2 ㎕를 취하여 10 ㎖의 Dig-차단액에 혼합하여 1:5,000으로 희석하였다.③ 2 μl of anti-digoxigenin-alkaline phosphatase was taken, mixed in 10 ml of Dig-blocker, and diluted 1: 5,000.
④ ②의 차단반응이 끝난 멤브레인을 ③에서 준비된 용액으로 30분간 반응시킨 후 용액을 버리고 Dig-세정액으로 15분간 2회 세척하였다.After the reaction of the block ④ in ② was reacted with the solution prepared in ③ for 30 minutes, the solution was discarded and washed twice with Dig-cleaning solution for 15 minutes.
⑤ Dig-세정액을 버리고 디곡시게닌-감지액(Dig-감지액, BM 사, Cat # 1585762)에서 2분간 반응시킨 다음 멤브레인을 적당한 크기의 일반 비닐 백(bag)에 넣은 다음 발광시약 용액(CDP-StarTM, BM 사, Cat # 1685627) 2 ㎖을 첨가한 후 봉인하고 5분간 반응시킨 다음, 암실에서 X-ray 필름에 일정시간 노출시켰다.⑤ Discard the Dig-cleaning solution, react for 2 minutes in Digoxigenin-sensing solution (Dig-sensing solution, BM, Cat # 1585762), and place the membrane in an appropriate sized ordinary plastic bag. 2 ml of StarTM, BM, Cat # 1685627) was added, sealed and allowed to react for 5 minutes, and then exposed to X-ray film for a period of time in a dark room.
⑥ 덴서토미터(Densitometer)로 각 반응점(dot)의 강도(intensity)를 측정하였다.⑥ The intensity of each reaction point was measured with a densitometer.
라. 결과la. result
표준 DNA로부터 각 표준 DNA 양에 대한 강도(intensity)를 측정하여 직선회귀식을 구하고 검량선을 작성한 후 검액에서 얻은 강도(intensity)를 검량선에 대입하여 검액의 숙주유래 DNA 함유량(pg/0.5 ㎖)을 구하고 검액 1 ㎖중의 양으로 환산한 결과, 본 발명에 따라 정제한 hG-CSF 내의 대장균 유래 DNA 양은 hG-CSF 1 mg 당 1.0 pg(1.0 pg/mg/ml) 이하로 측정되었다.From the standard DNA, the intensity of each standard DNA is measured, and a linear regression equation is obtained. A calibration curve is prepared, and the intensity obtained from the sample is substituted into the calibration curve to determine the host-derived DNA content of the sample (pg / 0.5 ml). The amount of E. coli-derived DNA in hG-CSF purified according to the present invention was determined to be 1.0 pg (1.0 pg / mg / ml) or less per 1 mg of hG-CSF.
시험예 3. 원편광 이색성 스펙트럼 분석(Circular Dichroism Spectrin analysis)Test Example 3 Circular Dichroism Spectrin Analysis
자기원 이색성 분산계(Jasco 사, Model J-715, 일본)를 이용하여 200 ∼ 250 nm의 파장에서 실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF에 대한 원편광 이색성 스펙트럼을 관찰한 결과 제 7도에서와 같이 정제한 hG-CSF은 200 nm-250 nm의 far UV지역(region)에서 높은 비율의 알파-헬릭스(α-helix) 구조를 갖는 구형 단백질(globular protein)의 전형적인 원편광 이색성 스펙트럼(Circular Dichroism Spectrum) 특성을 보였으며 203∼210nm와 220∼225nm에서 부의 극치(negative extrema)가 관찰되어 통상 알려진 hG-CSF의 원편광 이색성 스펙트럼과 같은 양상을 보이고 있어 본 발명에 따라 정제한 hG-CSF는 기존의 알려진 hG-CSF와 동일한 2 차 구조를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.Circular dichroism spectra of hG-CSF purified according to the purification method of Example 1 using a magnetic dichroic dispersion system (Jasco, Model J-715, Japan) at a wavelength of 200-250 nm. As shown in FIG. 7, purified hG-CSF is a circular circular dichroism of globular protein having a high ratio of alpha-helix structure in the far UV region of 200 nm-250 nm. Circular Dichroism Spectrum and negative extrema were observed at 203-210nm and 220-225nm, showing the same characteristics as the circular dichroism spectra of hG-CSF. One hG-CSF was confirmed to have the same secondary structure as the known hG-CSF.
시험예 4. 비활성 역가시험Test Example 4 Inert Activity Test
생후 10주 되는 생쥐의 대퇴골로부터 22G 주사기를 사용하여 골수세포를 채취한 후 약 13㎖의 엠이엠알파(MEM-α) 배지로 현탁시켰다. 현탁된 세포배양액을15㎖ 튜브에 넣고 4℃에서 10분간 방치한 후 상층부를 취하여 400g에서 10분간 원심분리하여 골수세포를 회수하였다. 회수한 골수세포를 밀도가 1.09 g/㎖인 퍼콜(percoll)용액 3㎖에 현탁시켜 15㎖ 튜브에 분주한 후 그 상층부에 밀도 1.075 g/㎖인 퍼콜(percoll)용액 4㎖ 및 밀도 1.063 g/㎖인 퍼콜(percoll)용액 5㎖을 밀도구배가 되도록 순차적으로 충진하였다. 이어 1,000g에서 20 분간 원심분리한 후 밀도가 1.063 g/㎖과 1.075 g/㎖ 층 사이에 모인 세포를 취하고 상기 원심분리 과정으로 MEM-α 배지를 사용하여 2회 세척하였다. 세척한 골수세포는 10%(w/v) 소 혈청과 1%(w/v) 메틸셀루로즈(methylcellulose)을 함유한 MEM-α 배지에 약 1.5 x 105 cells/㎖되게 현탁시켜 역가시험에 이용할 골수세포로 준비하였다. NIBSC 국제 표준 hG-CSF(National Institute for Biological Standards & Control : NIBSC, 10,000U/㎖, 100 ng/㎖)는 2배씩 연속희석하여 6가지 농도의 표준품을 준비하고, 실시예 1의 정제방법에 따라 정제한 hG-CSF는 50 ng/㎖되게 희석 시킨 후 다시 2배씩 연속희석한 3가지의 시료를 준비하였다. 표준품 및 시료를 12 소공 평저(12 well plate)에 50㎕씩 분주한 후 상기에서 구한 골수세포를 1㎖씩 가하고 5% 이산화 탄소와 37℃가 유지되는 배양기에서 약 7 내지 10 일간 배양한 후 약 20 내지 50 개의 세포로 형성된 콜로니를 관찰한 결과, 제 7도에서와 같이 본 발명에 따라 정제된 hG-CSF는 NIBSC 표준 hG-CSF와 같은 콜로니 형성능을 보였으며 제 8도에서와 같이 NIBSC 국제 표준 hG-CSF에서 계수한 콜로니를 이용하여 검량선을 작성한 후 정제된 hG-CSF의 1 mg 당 비활성 역가를 구하면 1.0×108Unit/mg 으로 측정되어통상 알려진 WHO NIBSC 국제 표준 hG-CSF와 동일한 단위 활성도를 보였다.Bone marrow cells were collected from the femurs of mice at 10 weeks of age using a 22G syringe, and then suspended in about 13 ml of MEM-α medium. The suspended cell culture solution was placed in a 15 ml tube and left at 4 ° C. for 10 minutes. The upper layer was taken and centrifuged at 400 g for 10 minutes to recover bone marrow cells. The collected bone marrow cells were suspended in 3 ml of a percoll solution having a density of 1.09 g / ml, aliquoted into a 15 ml tube, and 4 ml of a percoll solution having a density of 1.075 g / ml and a density of 1.063 g / s at the upper layer. 5 ml of percoll solution (ml) was sequentially filled to have a density gradient. After centrifugation at 1,000 g for 20 minutes, the cells were collected between densities of 1.063 g / ml and 1.075 g / ml, and washed twice using MEM-α medium. The washed myeloid cells were suspended in MEM-α medium containing 10% (w / v) bovine serum and 1% (w / v) methylcellulose to be used for potency testing. Prepared with bone marrow cells. NIBSC National Standard for National Institute for Biological Standards & Control (NIBSC, 10,000 U / mL, 100 ng / mL) was prepared by diluting two-fold consecutively to prepare six concentrations of standard products, according to the purification method of Example 1. After diluting the purified hG-CSF to 50 ng / ㎖ and prepared two samples of serial dilution twice. Dispense 50 μl of the standard and sample into 12 well plates, and add 1 ml of the bone marrow cells obtained above, and incubate for about 7 to 10 days in an incubator maintained at 37 ° C. with 5% carbon dioxide. As a result of observing colonies formed from 20 to 50 cells, hG-CSF purified according to the present invention as shown in FIG. 7 showed colony forming ability as NIBSC standard hG-CSF and as shown in FIG. 8 NIBSC International Standard Using the colonies counted in hG-CSF, the analytical titers per mg of purified hG-CSF were determined to be 1.0 × 10 8 Units / mg and the same unit activity as the known WHO NIBSC international standard hG-CSF. Showed.
본 발명에 따른 일련의 공정으로 대장균에서 제조되어 활성형의 형태로 전환된 hG-CSF를 정제하면, 효율적인 공정에 따른 고수율의 정제가 가능하며, 정제한 hG-CSF 또한 순도면에서 WHO NIBSC hG-CSF와 동일한 생물학적 단위활성도(1.0×108Unit/mg)를 갖고, 0.1 EU/㎎/㎖ 이하의 엔도톡신, 1.0 ng/mg/ml 이하의 숙주세포 유래 펩타이드, 1.0 pg/mg/ml 이하의 숙주세포 유래 DNA를 보이며, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 시, 역상 고속 액체 크로마토그래피(reverse phase - HPLC), 겔 여과 고속 액체 크로마토그래피(size exclusion - HPLC), 이온 교환 고속 액체 크로마토그래피(ion exchange - HPLC)에서 모두 99 % 이상의 순도를 나타내어 의약용으로 적합한 재조합 hG-CSF를 정제할 수 있음을 알 수 있다.Purifying hG-CSF prepared in Escherichia coli and converted into active form by a series of processes according to the present invention enables high yield purification according to an efficient process, and purified hG-CSF is also WHO NIBSC hG in terms of purity. -Have the same biological unit activity as the CSF (1.0 × 10 8 Unit / mg), endotoxin of 0.1 EU / mg / ml or less, host cell-derived peptide of 1.0 ng / mg / ml or less, 1.0 pg / mg / ml or less Host cell-derived DNA, reverse phase high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis, gel filtration high-performance liquid chromatography (size exclusion-HPLC), ion exchange high-performance liquid chromatography (ion) exchange-HPLC) showed a purity of 99% or more, so that it is possible to purify recombinant hG-CSF suitable for medical use.
Claims (7)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR10-1999-0021065A KR100449821B1 (en) | 1999-06-08 | 1999-06-08 | A process for the purificaton of refolded recombinat hG-CSF |
Applications Claiming Priority (1)
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