KR100446977B1

KR100446977B1 - 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법

Info

Publication number: KR100446977B1
Application number: KR10-2002-0004843A
Authority: KR
Inventors: 곽해수; 이준범
Original assignee: 곽해수
Priority date: 2002-01-28
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2004-09-01
Also published as: US20030148483A1; US7018820B2; KR20030064519A

Abstract

본 발명은 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서 미세캡슐이 함유되어 있는 효소 분산액에 오존을 처리하여 미세캡슐화되지 못하고 남아있는 잔류효소를 불활성화시킴과 동시에 인체에 유해한 미생물을 제거하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서, 자외선 램프( 150-200nm의 파장)에서 발생 된 오존 1-10 ppm을 1-10분 동안 미세캡슐이 함유되어 있는 효소 분산액에 처리하여 잔류효소를 불활성화시켜 제거하는 방법을 제공한다.

Description

효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법{A method for removing residual enzymes in enzyme microencapsulation}

우유는 보편적이면서도 영양가가 풍부한 식품이지만, 전세계 인구의 대다수가 인체내에 충분한 양의 유당분해효소(lactase ; β-galactosidase)를 보유하고있지 않는 관계로 소화시키기가 어려운 문제가 있기 때문에, 이러한 문제를 해결하기 위하여 우유 제조공정 중에 락타아제를 첨가시켜 준다.

그러나, 락타아제에 의한 유당(lactose)의 가수분해로 락타아제가 첨가되지 않은 보통의 우유 보다 몇배의 단맛을 지니기 때문에, 효소가 첨가된 우유는 대부분의 소비자들로 부터 호응을 받지 못하고 있다.

우유의 이러한 단맛을 막기 위하여 효소를 고정화하는 한가지 방법으로 미세캡슐화(microencapsulation) 방법이 사용되는데, 효소를 미세캡슐화할 경우 일부의 효소는 미세캡슐화 되지 않고 분산액에 잔류하고 있어 이효소의 활성에 의한 유당의 가수분해로 우유의 단맛을 증가시키는 문제가 있기 때문에 잔류효소를 제거시켜 주어야 한다.

잔류효소를 제거하는 방법으로는 원심분리하여 제거하는 방법(Kwak, H. S., M. R. Ihm, and J. Ahn., 2001. Microcapsulation of β-galactosidase with fatty acid esters. J. Dairy Sci. 84:1576-1582.)이 있는데, 이러한 방법은 첫째 산업화함에 있어 큰 용량의 원심분리기가 필요하므로 설비비용이 많이 들고, 둘째 본 방법에 비해 2∼3번의 원심분리를 필요로 하므로 생산원가의 상승을 초래하는 단점이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행하여 효소의 미세캡슐화시 원심분리기를 이용하여 잔류효소를 제거하는 방법 대신에 오존을 처리하여 미세캡슐화되지 못하고 남아있는 잔류효소를 제거함과 동시에 인체에 유해한 미생물을 제거할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서 미세캡슐화되지 못하고 남아있는 잔류효소를 제거함과 동시에 인체에 유해한 미생물을 제거하는 새로운 방법을 제공함에 있다.

도 1은 본 발명에 의한 효소의 미세캡슐화시 잔류효소 제거방법의 공정도,

도 2는 오존처리에 의한 미세캡슐화 되지 않은 유당분해효소의 활성변화,

도 3은 오존처리에 의한 미세캡슐화된 유당분해효소의 활성변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 수단으로 미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서, 미세캡슐이 함유되어 있는 효소 분산액에 오존을 처리하여 미세캡슐화되지 못하고 남아있는 잔류효소를 불활성화시켜 제거하는 방법을 제공한다.

오존(O₃)은 분자량 48의 산소분자체로서, 세균이나 바이러스와 같은 미생물의 살균 또는 불활성화에 상당히 효율적이기 때문에 상수도 및 하수도의 살균(불활성화), 식품의 보존 등에 이용되고 있으며, 오존처리는 미국식품의약품 안정청(FDA)로 부터 식품의 살균방법으로 안전하다고 인정받고 있다.

본 발명에 의한 방법에 사용되는 오존은 자외선 램프(150-200nm의 파장)에 의한 오존발생기(ozone generator)를 이용한 것으로서, 오존처리는 1-10 ppm의 오존을 미세캡슐이 함유되어 있는 효소 분산액에 1-10분 동안 처리하여 잔류효소를 불활성화 시키는데, 0.4-0.6kg/㎠의 공기압력하에서 5-15ℓ/분의 유속으로 처리하는 것이 바람직하다.

미세캡슐은 효소와 코팅재용액의 혼합액을 계면활성제가 용해된 분산액에 분무하고 이 분산액을 원심분리한 후 상등액과 여액으로 분리하여 제조하는데, 효소를 분산액에 분사시키면 일부의 효소가 미세캡슐화 되지 않고 분산액에 존재해 있다.

본 발명에서는 효소 분산액에 상기와 같은 방법으로 오존처리를 하여 미세캡슐화되지 못한 효소의 활성을 조사하는 한편, 미세캡슐화된 효소가 받을 수 있는 영향 및 오존의 기능중의 하나인 살균효과를 검증하기 위하여 오존에 의한 미생물제어 효과를 측정하였을 뿐만 아니라, 오존처리한 미세캡슐을 우유에 첨가하여 저장중의 관능적 특성을 평가하였는 바, 이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> (미세캡슐의 제조)

유당분해효소(lactase)를 PGMS(polyglycerol monostearate)로 미세캡슐화 하기 위하여 PGMS는 실온에서 거의 고체상태이므로 그 자체만으로 분무하기 어렵기 때문에 우선 PGMS에 일정량의 증류수를 혼합하여 분무가 가능한 상태까지 녹여 주어야 하는 관계로 PGMS와 증류수를 5 : 4로 혼합한 PGMS용액을 55℃로 20분간 정치한 후 1200 Xg로 1분 정도 교반하였다.

유당분해효소의 활성을 높이기 위하여 55℃에서 2분간 예열한 후 PGMS용액과 유당분해효소를 15 : 1로 혼합한 다음, 상기의 혼합액을 스프레이 건(W-300 spray gun ; Wagner Spray Tech. Co., Markdorf. Germany)으로 0.05%의 트윈-60(Tween-60)이 용해된 5℃의 분산액에 분무하였다.

상기의 분산액을 24900 Xg에서 10분간 원심분리한 후, 상등액과 여액으로 분리하여 미세캡슐을 제조하였다.

본 발명에 사용된 유당분해효소는 Vita Netural Lactase VNL 5000( Culture Systems Inc, Mishawake Indiana, USA)이고 활성도는 504 lactase unit/g 이며, 코팅재(coating material)로 사용된 PGMS는 지방산 에스테르(fatty acid ester)의 일종으로서 ㈜일신유화에서 구입하였다.

<실시예 2> (오존처리)

오존발생기(ozone generator ; Korea Ozone Tech.,AOP type, KOREA)를 이용하여 자외선 램프에서 발생되는 150-200nm의 파장을 지니는 오존 1ppm을 관을 통하여 0.5kg/㎠의 공기압력과 10ℓ/분의 유속의 조건하에서 실시예 1에서 제조한 미세캡슐이 함유되어 있는 유당분해효소 분산액 100㎖에 직접 버빙시키면서 각각 1분, 5분 및 10분 동안 처리하였다.

<실시예 3> (오존처리)

오존발생기(ozone generator ; Korea Ozone Tech.,AOP type, KOREA)를 이용하여 자외선 램프에서 발생되는 187nm의 파장을 지니는 오존 5ppm을 관을 통하여 0.5kg/㎠의 공기압력과 10ℓ/분의 유속의 조건하에서 실시예 1에서 제조한 미세캡슐이 함유되어 있는 유당분해효소 분산액 100㎖에 직접 버빙시키면서 각각 1분, 5분 및 10분 동안 처리하였다.

<실시예 4> (오존처리)

오존발생기(ozone generator ; Korea Ozone Tech.,AOP type, KOREA)를 이용하여 자외선 램프에서 발생되는 187nm의 파장을 지니는 오존 10ppm을 관을 통하여 0.5kg/㎠의 공기압력과 10ℓ/분의 유속의 조건하에서 실시예 1에서 제조한 미세캡슐이 함유되어 있는 유당분해효소 분산액 100㎖에 직접 버빙시키면서 각각 1분, 5분 및 10분 동안 처리하였다.

<시험예 1> (미세캡슐화 되지 않은 유당분해효소의 활성)

실시예 2 내지 실시예 4와 같이 오존처리한 후 24900Xg에서 10분간 원심분리하여 상등액과 여액으로 분리한 다음, 상등액을 적당량 취하여 미세캡슐 외부용액에 존재하는 유당분해효소의 활성을 측정하였다.

효소활성의 측정은 취해진 상등액을 화트만(Whatman) No.540 여과지(Whatman International Limited, Maidstone, England)로 1차 여과한 후 1,0㎕의 막필터(membrane filter ; Whatman International Limited, Maidstone, England)로 2차 여과하였다.

그리고, 0.05M의 ONPG 용액 (Ortho-nitrophenol-β-D-galactopyranoside ; Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo. USA)을 37℃에서 15분 정도 예열한 다음 2차 여과된 미세캡슐 외부용액 0.5㎖를 첨가하여 20분 동안 반응시킨 후 0.5M의 Na₂CO₃용액( Shinyo Pure Chemical Co, Ltd., Osaka ,Japan) 0.5㎖를 첨가하여 유당분해효소의 반응을 중지시켰다.

이 반응용액은 스펙트로미터(Beckman Du 650 spectrophotometer ; Beckman Instrument, Inc, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 420㎚에서 흡광도를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 1ppm의 오존을 1분 동안 처리시 효소의 활성(%)은 초기효소의 활성을 100%로 하였을 경우 94.3%로 약 5.7%정도 감소하였고, 5분 동안 처리한 것은 56.4%로 감소, 10분 처리한 것은 26.5%로 감소되었음을 알 수있다.

같은 방법으로 5ppm의 오존농도로 1분간 처리한 것은 효소활성(%)이 100%에서 82%로 감소하였고, 5분 처리시에는 42.8%, 10분간 처리한 것은 20%로 감소되었으며, 10ppm 농도의 오존을 분산액에 처리한 결과는 1분 처리시에는 57.8%로 급격한 감소를 보였고, 5분간 처리한 것은 32.8%, 10분 동안 처리한 것은 9.7%로 감소되었음을 알 수 있다.

<시험예 2> (오존처리가 미세캡슐화된 유당분해효소에 미치는 영향)

오존처리가 미세캡슐화된 유당분해효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시예 2 내지 실시예 4와 같이 오존처리한 후 미세캡슐만을 취하여 신등(한국특허등록 제 88465호)의 수율 측정방법 중 가열처리에 의한 방법을 이용하여 미세캡슐화된 효소의 활성변화를 조사하였다.

효소활성은 0.05M ONPG 용액 2㎖를 50℃에서 10분간 예열한 후 미세캡슐화된 효소용액 0.5㎖를 첨가하여 반응을 일으킨 다음, 5분 후에 0.5M의 Na₂CO₃용액 0.5㎖를 첨가하여 반응을 중지시킨 반응용액을 스펙트로미터(Beckman Du 650 spectrophotometer ; Beckman Instrument, Inc, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 420㎚에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 1ppm의 오존농도로 1분 동안 처리한 결과 초기효소의 활성을 100%로 하였을 경우 97%로 약 3%정도 감소하였고, 5분 처리시 91%, 10분 처리시 74%정도 유당분해효소의 활성이 감소한 것으로 나타났다.

5ppm의 오존농도로 1분, 5분, 10분간 처리했을 때의 효소활성(%)은 각각 96%, 82%, 67%로 역시 활성이 감소됨을 보였으며, 10ppm의 오존농도로 처리한 결과는 1분 처리시 93%, 5분 처리시 79%, 10분 처리시에는 65%로 나타났다.

이처럼 1분간 오존처리를 하는 동안은 1ppm과 5ppm의 낮은 오존농도에서 거의 비슷한 효소활성(%)을 보였으나 처리시간이 증가됨에 따라 5ppm과 10ppm의 높은 오존농도에서 효소활성(%)이 비슷한 비율로 감소됨을 알 수 있다.

위와 같은 결과로 미루어 보아 미세캡슐화된 효소도 오존에 의해 영향을 받아 활성이 감소된다는 것을 알 수 있었고, 오존에 의해 감소된 활성을 수율로 계산하여 보면 오존처리전의 수율은 78%, 오존처리 후 미세캡슐의 수율은 51%로 약 27%의 수율이 감소됨을 나타내었는데, 아래 식에 의해 수율을 계산하였다.

계산식 =

물론, 이러한 수율의 감소에 영향을 주는 요인들은 오존처리 외에도 미세캡슐 제조시 압력에 의한 활성감소, 수율측정시 가열에 의한 효소활성의 감소 등도 포함될 수 있지만, 이와 같은 수율의 감소는 오존처리로 미세캡슐화 되지 않는 효소를 제어하는 방법의 가장 큰 단점이라 할 수 있다.

<시험예 3> (오존처리후 미생물의 제어효과)

미세캡슐화 되지 않은 유당분해효소를 제어하면서 미세캡슐화된 유당분해효소에 최소한의 영향을 미친 오존농도(10ppm)로 미생물의 제어도 가능한지, 그 제어효과는 어느 정도인지를 알아보기 위하여 미생물에 대한 오존처리의 효과를 조사하였다.

오존처리에 앞서 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양 받은 식품위생관련 세균 6종( Escherichia. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes)을 50% 글리세롤(glycerol)에 냉동보관된 균주들을 활성화시키기 위하여 세균은nutrient broth(NB),S. aureus는 tryptic soy broth(TSB)를 각각 사용하여 배양하였고, 배양된 각각의 액체배지에서 균주을 미량 취하여 분산액에 접종한 후 잘 혼합해 주었다.

균주가 혼합된 분산액을 오존발생기를 이용하여 10ppm의 오존을 20℃에서 10ℓ/분의 유속으로 직접 버빙시키면서 일정시간 동안 처리하였다. 이렇게 처리된 분산액을 적절히 희석하여 평판배지에 접종 후 최적온도로 1∼3일 배양한 다음, 콜로니(colony)를 계수하여 조사한 결과를 표 1에 나타내었다.

<표 1>. 오존처리후 미생물의 제어효과

균주	오 존 처 리 시 간 (분)
균주	0	1/2	1	5	10
Escherichia coli	2.4X 10⁹(100)	8.9X 10⁷(3.7)	3.1X 10⁷(1.3)	9.0X 10⁶(0.3)	0(0)
Bacillus subtilis	1.6X 10⁸(100)	9.6X 10⁷(60)	2.2X 10⁷(14)	6.0X 10⁶(3.7)	0(0)
Staphylococcus aureus	6.8X 10⁸(100)	1.0X 10⁸(15)	6.4X 10⁷(9.4)	1.2X 10⁷(1.8)	1.1X 10⁵(0.01)
Salmonella typhimurium	2.5X 10⁹(100)	8.4X 10⁸(34)	1.1X 10⁷(0.4)	1.5X 10⁶(0.06)	0(0)
Pseudomonas aeruginosa	3.4X10⁸(100)	1.2X 10⁸(35)	7.5X 10⁷(22)	3.6X 10⁶(1.0)	0(0)
Enterobacter aerogenes	1.4X 10⁷(100)	5.4X 10⁶(38)	1.0X 10⁶(7.1)	2.4X 10⁵(1.7)	0(0)

상기의 표 1에서 보는 바와 같이,Staphylococcus aureus를 제외한 모든 세균들은 10분 처리 후 생존율이 0%로 나타났고, 각 세균들의 오존에 대한 감수성을 살펴보면 우선E.Coli는 30초간의 오존처리에도 세균의 생존율이 3.7%로 감소되어 분산액에서 오존에 대한 감수성이 가장 높게 나타났다.

Salmonella. typhimurium은 30초간의 오존처리로 34%의 생존율을 보였으나 1분 동안의 처리로 0.4%의 급격한 감소의 생존율을 나타내었으며,Pseudomonas. aeruginosa는 1분간의 오존처리로 22%의 생존율을 나타냈으나 5분 동안의 처리로 1%의 생존율을 보였다.

Bacillus. subtilis와Enterobacter. aerogenes의 경우는 30초간의 오존처리로 생존율이 각각 60%와 38%로 급격히 감소하였으나, 1분 및 5분간 처리하는 동안은 급격한 감소 없이 일정하게 생존율이 감소되는 현상을 보였다.

이와 같이 오존처리에 대한 세균수의 감소현상을 보면 Broadwater 등(Broadwater et al., 1973, Sensitivity of three selected bacterial species to ozone, Applied microbiology. 26(3):391-393)은 오존의 농도가 적으면 세균이 별다른 영향이 없다가 일정농도에 도달하면 일시에 미생물이 사멸된다는 threshold dose 현상이 오존에 대해서도 적용된다고 주장하였는데 이 본 시험에서도 이와 유사한 유형을 나타내었으며, 또한 본 시험에서 세균의 종류에 따라 오존의 농도와 처리시간은 각각 다르게 나타냄을 알 수 있다.

<시험예 4> (미세캡슐이 첨가된 우유의 저장중의 관능적 특성)

오존처리 된 미세캡슐화한 유당분해 효소를 우유에 2%와 4%의 농도로 첨가하여 일정기간(1일, 3일, 5일, 8일 및 12일)동안 저장하면서 나타나는 이미와 단맛의 정도, 기호도 등의 관능적 특성변화를 알아보기 위하여 5점법의 다시료 비교법에의해 관능검사를 실시하였는데, 이때 대조군으로는 시중에 유통중인 일반우유를 사용하였다.

관능검사 요원은 우유의 맛을 구별할 수 있는 사람들을 선발한 후 일정기간동안 훈련을 시킨 다음 본 검사에 임하게 하였는데, 관능적 특성의 평가는 평점법으로 하였으며 관능검사로 얻은 결과의 분석은 SAS를 이용하여 분산분석과 최소유의차 검정으로 통계처리한 결과를 표 2에 나타내었다.

<표 2> 미세캡슐이 첨가된 우유의 저장중의 관능적 특성

미세캡슐농도(%)	저 장 기 간 (일)
미세캡슐농도(%)	1	3	5	8	12
0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
2	1.0	1.0	1.0	1.12	1.38
4	1.0	1.0	1.38	1.63	1.75

표 2에서 보는 바와 같이, 관능적 특성점수는 우유에 첨가된 미세캡슐의 양에 따라 약간의 차이를 나타냈으나 전반적으로 단맛은 저장기간이 증가함에 따라 증가함을 보였다.

미세캡슐이 2% 첨가된 우유의 경우 5일 저장시 까지는 유의적 차이를 보이지 않았으나(P 〉0.05), 8일 이후 유의성의 차이를 보이며(P〈 0.05) 증가하였으며, 4%를 첨가한 경우 3일 저장시까지는 유의적 차이가 나타나지 않았으나(P 〉0.05), 5일 이후부터 유의성의 차이를 보이며(P〈 0.05) 역시 증가하였다.

이상의 결과로부터 오존처리한 미세캡슐을 우유에 첨가하여 저장기간 동안의단맛의 변화는 관능적으로 양호하게 평가되었는데, 이러한 결과는 오존처리에 의해 오존이 가진 기능중의 하나인 살균기능에 의해 미세캡슐 첨가시 발생 할 수 있는 오염물들을 제거하여 우유의 신선도에 영향을 주어 이미가 덜 나도록 신선도를 유지시켰기 때문이다.

본 발명에 의한 방법은 미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서 미세캡슐화되지 못한 효소를 효율적으로 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 식품에 위해를 줄 수 있는 여러 미생물의 제어가 가능하며 또한 미세캡슐이 첨가된 우유의 저장중의 관능적 특성이 양호하기 때문에 식품산업, 의약품산업, 세제산업 등 효소를 사용하는 산업 전반에 걸쳐 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

미세캡슐화하여 효소를 고정화함에 있어서,

미세캡슐이 함유되어 있는 효소 분산액에 오존을 처리하여 미세캡슐화되지 못하고 남아있는 잔류효소를 불활성화 시킴을 특징으로 하는 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법.
제 1항에 있어서,

오존처리는 1-10 ppm의 오존을 1-10분 동안 처리함을 특징으로 하는 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

오존은 자외선 램프에서 150-200nm의 파장으로 발생하는 것임을 특징으로 하는 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

오존처리는 0.4-0.6kg/㎠의 공기압력하에서 5-15ℓ/분의 유속으로 처리함을 특징으로 하는 효소의 미세캡슐화시 잔류효소의 제거방법.