KR100438822B1 - Device for assaying mutation of nucleic acids and Method for assaying nucleic acids using the device - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플 저장부(sample reservoir); 상기 샘플 저장부와 직접 연결되어, 샘플의 유입 통로가 되는 미세가공채널; 및, 상기 미세가공채널 내부에 하나이상의 핵산 고정의 MOSFET형 트랜지스터 및 히터와 온도센서가 동시에 장착된 온도제어-검출부를 포함하는 핵산 분석 장치 및 이를 이용한 핵산 분석 방법에 관한 것이다.The present invention includes a sample reservoir; A micro processing channel directly connected to the sample storage part and serving as an inflow passage of a sample; And, the nucleic acid analysis apparatus and nucleic acid analysis method comprising the temperature control-detection unit is mounted at the same time one or more MOSFET-type transistor and a heater and a temperature sensor at the same time inside the "micro processing channel".
본 발명에 따르면, MOSFET형 트랜지스터에 부착된 핵산의 Tm 온도에서 변성된 이중가닥 핵산(denatured double-stranded nucleic acid) 또는 복원된 이중가닥 핵산(renatured double-stranded nucleic acid)을 검출함으로써, 핵산의 돌연변이, 특히 핵산의 단일염기변이(SNP)를 효과적으로 검출할 수 있다.According to the present invention, nucleic acid mutations are detected by detecting denatured double-stranded nucleic acid or renatured double-stranded nucleic acid at the Tm temperature of the nucleic acid attached to the MOSFET transistor. In particular, it is possible to effectively detect a single nucleotide variation (SNP) of the nucleic acid.
Description
본 발명은 핵산의 돌연변이, 특히 핵산의 단일염기변이(SNP)를 검출하는데 유용한 핵산 분석 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 샘플 저장부(sample reservoir); 상기 샘플 저장부와 직접 연결되어 샘플의 유입 통로가 되는 미세가공채널; 및, 상기 미세가공채널 내에 하나 이상의 핵산 고정의 MOSFET형 트랜지스터 및 히터와 온도센서가 동시에 장착된 온도제어-검출부를 포함하는 핵산 분석 장치 및 이를 이용하여 핵산의 돌연변이를 분석하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid analysis apparatus useful for detecting mutations in nucleic acids, in particular single nucleotide variations (SNPs) of nucleic acids, more particularly sample reservoirs; A micro-processing channel directly connected to the sample storage part to be an inflow passage of a sample; And a temperature control-detection unit equipped with at least one 'nucleic acid' fixed MOSFET transistor and a heater and a temperature sensor in the micro-processing channel, and a method for analyzing a mutation of nucleic acid using the same.
핵산의 단일염기변이(SNP)는 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 단일 염기쌍의 차이(single base-pair variation)로 DNA 서열 다형성(polymorphism)중에서 가장 많이 존재하는 형태이다(약 1개/1kb). 이러한 SNP는 개개인의 질병에 대한 민감성 차이의 원인이 되므로, 유전질환의 진단, 치료 및 예방에 효과적으로 이용될 수 있다. 따라서, 유전자에서 개인차, 인종간 차이와 질병에 대한 민감성 차이 등을 가져오는 부분인 SNP를 빠르고 간편하게 찾아내는 방법에 대한 필요성이 제기되어 왔다.Single nucleotide variation (SNP) of nucleic acid is the single base-pair variation in DNA between individuals and is the most common form of DNA sequence polymorphism (about 1kb). Since SNPs cause a difference in sensitivity to individual diseases, they can be effectively used for diagnosis, treatment and prevention of genetic diseases. Therefore, there has been a need for a quick and easy way to find SNPs, which are parts of genes that bring about individual differences, race differences, and "sensitivity" differences to diseases.
SNP를 감지해 내기 위해서는 온도에 따른 DNA 이중가닥 구조의 분리에 따른 관찰이 가장 보편화되어 있다. 온도가 약 96℃ 이상에서는 이중가닥을 이루고 있는 DNA의 수소결합들이 모두 끊어져 분리된다. 이러한 특성을 이용해서 돌연변이된 DNA 염기서열을 밝혀 낼 수 있지만， 각기 다른 장비와 기계를 사용해야 하고 정확하고 정밀한 온도제어에 의한 DNA의 분리를 실시간에 측정해 내는 기술은 매우 어려운 상황이다In order to detect SNPs, the observation of separation of DNA double-stranded structure with temperature is most common. At temperatures above 96 ° C, all the hydrogen bonds in the double stranded DNA are broken and separated. These traits can be used to identify mutated DNA sequences, but using different equipment and machinery, and the technology to measure the separation of DNA in real time by accurate and precise temperature control is very difficult.
미국 특허 제6,171,850호 (Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses)에서는 열교환기를 사용해서 각각 반응기의 내부와 외부에 직접 온도제어를 하였다. 반응시스템은 가열기와 하나 이상의 열교환기를 이용해서 구성되어져 있다. 하지만 이 시스템에서는 단지 여러개 반응기의 온도제어에 관해서만 언급이 되어 있으며 열교환기를 포함하고 있어 DNA의 감지 및 유로상에서의 특성을 기대하기 어렵다.In US Pat. No. 6,171,850 (Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses), heat control was used to direct temperature control inside and outside the reactor, respectively. The reaction system consists of a heater and one or more heat exchangers. However, the system only mentions the temperature control of several reactors, and includes a heat exchanger, making it difficult to expect DNA detection and channel characteristics.
미국 특허 제6,174,675호 (Electrical current for controlling fluid parameters in micro- channels)에서는 유로에 직접 전기제어식 가열기와 냉각기를 장착하고 있으며 여러 가지 형태의 가열기를 나타내었다. 그러나, 이 특허에서는 PCR 등에 사용되는 온도제어장치만을 개시할 뿐 온도에 따른 DNA 이중가닥 구조의 분리를 검출하는 장치에 대하여는 전혀 언급되지 않았다.U.S. Patent No. 6,174,675 (Electrical current for controlling fluid parameters in micro-channels) is equipped with an electrically controlled heater and a cooler directly in the flow path and shows various types of heaters. However, this patent discloses only a temperature control device used for PCR and the like, and mentions no device for detecting the separation of DNA double strand structure with temperature.
미국 특허 제5,683,657호 (DNA meltometer)에서는 온도가 일정하게 유지되고 버퍼 용액을 운반할 수 있는 온도조절 챔버, 챔버의 온도제어를 위한 가열과 냉각수단, 그리고 Tm의 온도에서 분리된 이중가닥 구조의 DNA를 형광물질로 표지하여 검출해내는 수단으로 구성된 핵산 분석 장치를 개시하고 있다. 그러나, 이 장치는 DNA 검출수단이 온도조절 챔버와 별도로 존재하여 구성이 복잡하며 검출시간이 지연되는 문제점이 있었다.U.S. Patent No. 5,683,657 (DNA meltometer) discloses a double-stranded DNA separated at a temperature of Tm, a temperature control chamber that maintains a constant temperature and can carry buffer solutions, heating and cooling means for temperature control of the chamber, and Tm. Disclosed is a nucleic acid analysis device composed of means for labeling with a fluorescent material and detecting the same. However, this device has a problem in that the DNA detection means is separate from the temperature control chamber and thus the configuration is complicated and the detection time is delayed.
이에, 본 발명자들은 이중가닥 구조로 형성이 되어있는 DNA는 온도가 올라감에 따라 두가닥으로 나누어진다는 원리를 이용하여 소형의 장치상에 다양한 온도제어 및 DNA 검출이 가능한 시스템을 구축하여 DNA의 돌연변이(SNP) 측정 장치를 완성하였다. 본 발명에 따르면, DNA가 분리되었는지 아닌지를 유로에 직접 제작된 검출장치를 통해 실시간으로 판별할 수 있다.Thus, the present inventors constructed a system capable of various temperature control and DNA detection on a small device using a principle that the DNA formed in a double-stranded structure is divided into two strands as the temperature increases, thereby mutating the DNA. The (SNP) measuring device was completed. According to the present invention, it is possible to determine in real time whether the DNA is separated or not through a detection device manufactured directly in the flow path.
따라서, 본 발명의 목적은 유로에 직접 온도제어장치와 검출장치를 미세가공함으로써 정확하고 정밀한 온도제어에 의한 돌연변이 DNA의 검출을 실시간으로할 수 있는 새로운 핵산 분석 장치를 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a novel nucleic acid analysis apparatus capable of real time detection of mutant DNA by accurate and precise temperature control by micro-processing a temperature control device and a detection device directly in a flow path.
또한, 본 발명의 목적은 상기 핵산 분석 장치를 이용하여 SNP를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.It is also an object of the present invention to provide a method that can effectively detect the SNP using the nucleic acid analysis device.
도 1은 미세가공채널 내의 저면에 온도제어-검출부를 포함하는 본 발명의 핵산 분석 장치를 개략적으로 나타낸 도면이고,1 is a schematic view of a nucleic acid analysis device of the present invention including a temperature control-detection unit on a bottom surface of a microfabrication channel.
도 2는 미세가공채널 내의 측벽이나 모서리에 핵산 고정의 MOSFET형 트랜지스터를 가지고，미세가공채널 내의 상면에 히터와 온도센서를 가지는， 온도제어-검출부를 포함하는 본 발명의 핵산 분석 장치를 개략적으로 나타낸 도면이고Fig. 2 schematically shows the nucleic acid analysis device of the present invention including a temperature control-detection unit having a MOSFET-type transistor of fixed nucleic acid on a side wall or an edge of a microprocessing channel and having a heater and a temperature sensor on the upper surface of the microprocessing channel. Drawing
도 3은 본 발명의 MOSFET 트랜지스터의 제작과정을 나타낸 도면이다.3 is a view showing a fabrication process of the MOSFET transistor of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 온도에 따른 DNA의 분리 및 그에 따른 검출을 위해서 유체가 흘러갈 수 있는 유로(미세가공채널)에 직접 히터, 온도센서 및 DNA 검출센서(MOSFET 형)를 빌트인(built-in)으로 동시에 제작한다. 이에 따르면, 히터와 온도센서로 DNA에 미치는 온도를 제어하면서 동시에 DNA 검출기로 DNA가 이중가닥구조인지 단일가닥구조인지를 실시간으로 판별할 수 있다.In order to achieve the above object, in the present invention, a heater, a temperature sensor, and a DNA detection sensor (MOSFET type) are directly built in a flow path (micro-processing channel) through which a fluid can flow for separation and detection of DNA according to temperature. Produced at the same time with (built-in) According to this, while controlling the temperature on the DNA with a heater and a temperature sensor, it is possible to determine in real time whether the DNA is a double-stranded or single-stranded structure with a DNA detector.
구체적으로, 본 발명은 ① 샘플 저장부(sample reservoir);② 상기 샘플 저장부와 직접 연결되어, 샘플의 유입 통로가 되는 미세가공채널; 및, ③ 상기 미세가공채널 내에 하나 이상의 핵산 고정의 MOSFET형 트랜지스터와 히터 및 온도센서가 동시에 장착된 온도제어-검출부를 포함하며, 상기 히터 및 온도센서는 그 트랜지스터 상에 부착된 핵산(nucleic acid)에 영향을 미치는 온도를 제어하고, 상기 각 트랜지스터는 그 위에 부착된 핵산의 Tm 온도에서 변성된 이중가닥 핵산(denatured double-stranded nucleic acid) 또는 복원된 이중가닥 핵산(renatured double-stranded nucleic acid)를 검출하는 것을 특징으로 하는 핵산 분석 장치를 제공한다.Specifically, the present invention includes: ① a sample reservoir; ② a micro-processing channel is directly connected to the sample reservoir, the inlet passage of the sample; And a temperature control-detection unit simultaneously equipped with at least one nucleic acid-fixed MOSFET-type transistor, a heater, and a temperature sensor in the microprocessing channel, wherein the heater and the temperature sensor are nucleic acid attached to the transistor. Controlling the temperature at which each of the transistors is denatured double-stranded nucleic acid or renatured double-stranded nucleic acid at the Tm temperature of the nucleic acid attached thereto. It provides a nucleic acid analysis device characterized in that the detection.
본 발명에 있어서, 이중가닥 핵산(double-stranded nucleic acid)의 분리전과 분리후의 전하량(charge) 변화를 알아내기 위한센서(sensor)로서 MOSFET(Metal-Oxide-Semiconductor Field-Effect-Transistor) 트랜지스터를 이용하였다. In the present invention, a metal-oxide-semiconductor field-effect transistor (MOSFET) is used as a sensor for detecting charge changes before and after separation of a double-stranded nucleic acid. It was.
바람직하게는, 본 발명의 MOSFET형 트랜지스터는 미세가공채널의 측벽 또는 모서리(convex corner)에 위치하는 것을 특징으로 한다. 현재까지 제작된 FET을 이용한 바이오 분자(bio molecule) 센서는 모두 평면상에 제작되었다. 그러나, 본 발명에서 제작한 바이오 분자 센서는 벌크 미세가공(bulk micromachining) 및 확산(diffusion)을 이용한 3차원 MOSFET 형태로서 주로 미세가공채널의 모서리(convex corner)에 위치한다. 이러한 구조의 바이오 분자 센서는 핵산이 흘러가는 유로에 직접 위치되어 검출시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출기가 차지하는 공간을 크게 줄일 수 있어서 작은 공간에 더 많은 센서를 장착할 수 있다는 장점을 가지고 있다(참조： 본 출원인이 출원한 대한민국 특허출원 제２００１－21752호）.Preferably, the MOSFET transistor of the present invention is characterized in that it is located at the sidewall or convex corner of the microfabricated channel. All biomolecular sensors using FETs manufactured to date have been fabricated on a plane. However, the biomolecular sensor fabricated in the present invention is a three-dimensional MOSFET form using bulk micromachining and diffusion, and is mainly located at the convex corner of the micromachining channel. The biomolecular sensor of this structure is located directly in the flow path where the nucleic acid flows, which not only significantly shortens the detection time but also greatly reduces the space occupied by the detector, so that more sensors can be installed in a small space. (Reference: Korea Patent Application No. 201-21752, filed by this applicant).
본 발명에 있어서, MOSFET형 트랜지스터는 소스(Source)와 드레인(Drain) 영역에 골드(gold) 박막이 형성되었으며, 그 골드 표면에 SAM(self-assembled monolayers) 방법으로 고정화된 티올(thiol)기 부착의 핵산을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 센서(Sensor)는 소스와 드레인의 두 단자를 가지며 두 단자의 표면에 얇은 산화막을 가지고 있으며, 그 위에 Au를 부착시키면 MOS(Metal-Oxide-Semiconductor)의 구조를 형성하게 된다. 또한, Au와 산화막의 사이에 높은 선택성을 가지면서 핵산 분자가 흡착될 수 있도록 핵산 분자의 끝단에 thiol을 부착시킨다. Thiol을 부착시킨 핵산 분자는 SAM(Self-Assembled Monolayers)법으로금 표면에 흡착될 수 있다. SAM은 기질 표면위에 자발적으로 입혀진 규칙적으로 잘 정렬된 유기 단 분자 막이란 뜻으로, 기질과 유기분자와의 직접적인 화학결합을 이용하기 때문에 외부의 다른 제작 장치를 필요로 하지 않는다. 현재까지 제작된 바이오 분자(bio molecule) 센서들은 바이오 분자를 특정영역에만 부착시키기 어렵고, 부착력도 약한 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명에서 사용하는 SAM 방법을 이용한 thiol기 치환된 바이오 분자의 금에 대한 선택적인 흡착방법은 이와 같은 문제점들을 해결할 뿐만 아니라, 센서의 표면에 직접 부착되므로 반응 전후의 전하(charge)량 변화를 알아내는 데도 우수한 특성을 나타낸다.In the present invention, the MOSFET type transistor has a gold thin film formed in the source and drain regions, and a thiol group immobilized on the gold surface by a self-assembled monolayers (SAM) method. It is characterized by having a nucleic acid of. In the present invention, the sensor has two terminals, a source and a drain, and a thin oxide film on the surfaces of the two terminals, and when Au is attached thereto, a structure of MOS (metal-oxide-semiconductor) is formed. In addition, thiol is attached to the ends of the nucleic acid molecules so that the nucleic acid molecules can be adsorbed with high selectivity between Au and the oxide film. Thiol-attached nucleic acid molecules can be adsorbed onto gold surfaces by SAM (Self-Assembled Monolayers) method. SAM stands for regularly ordered organic monomolecular membranes spontaneously coated on the substrate surface and does not require any external fabrication equipment because of the direct chemical bonds between the substrate and organic molecules. Bio-molecule sensors manufactured to date have difficulty in attaching biomolecules only to specific regions and have weak adhesion. However, the selective adsorption method of thiol-substituted biomolecules on gold using the SAM method used in the present invention not only solves these problems, but also directly changes the amount of charge before and after the reaction because it is directly attached to the surface of the sensor. It is also excellent in finding out.
본 발명에 있어서, MOSFET형 트랜지스터에 고정화된 핵산(nucleic acid)은 단일가닥(single stranded) DNA, 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 PNA인 것을 특징으로 한다. 이들 단일가닥(ss) 핵산은 샘플 저장부에 주입된 표적 핵산과 혼성화하는 프로브(probe)로서의 역할을 한다. 상기 트랜지스터에는 각기 다른 염기서열의 핵산이 부착되는 것이 바람직하다.In the present invention, the nucleic acid (nucleic acid) immobilized on the MOSFET-type transistor is characterized in that the single stranded (single stranded) DNA, single stranded RNA or single stranded PNA. These single stranded nucleic acids serve as probes to hybridize with the target nucleic acid injected into the sample reservoir. It is preferable that nucleic acids of different base sequences are attached to the transistor.
본 발명에 있어서, 히터는 온도제어-검출부의 온도를 높이는 기능을 하며, 온도센서는 히터의 동작을 제어하는 기능을 한다. 이러한 히터 및 온도센서는 상기 트랜지스터 상에 부착된 핵산(nucleic acid)에 영향을 미치는 온도를 효과적으로 제어하기 위해, 그 트랜지스터에 근접하여 위치하는 것이 바람직하다.In the present invention, the heater functions to increase the temperature of the temperature control-detecting unit, and the temperature sensor functions to control the operation of the heater. Such heaters and temperature sensors are preferably located in close proximity to the transistor in order to effectively control the temperature affecting the nucleic acid attached to the transistor.
또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 ① MOSFET형 트랜지스터의 표면 금속(metal)에 단일가닥 핵산 프로브를 고정화시키는 단계; ② 고정화된 프로브와 반응하는 표적(target) 핵산을 샘플 저장부(sample reservoir)에 주입하고, 미세가공채널의 유로를 따라 MOSFET형 트랜지스터로 이동시키는 단계; ③ 표적 핵산을 상기 트랜지스터의 핵산 프로브와 혼성화(hybridization)하는 단계; ④ 이중가닥(ds) 핵산을 단일가닥(ss)으로 분리시키기 위하여 온도를 점차 상승시키는 단계; 및, ⑤ MOSFET형 트랜지스터의 게이트(gate)에 걸리는 전기장을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 돌연변이 분석 방법을 제공한다.In order to achieve another object, the present invention comprises the steps of: immobilizing a single-stranded nucleic acid probe on the surface metal of the MOSFET-type transistor; (2) injecting a target nucleic acid reacting with the immobilized probe into a sample reservoir, and moving the target nucleic acid along the flow path of the microprocessing channel to the MOSFET transistor; ③ hybridizing a target nucleic acid with a nucleic acid probe of the transistor; ④ gradually raising the temperature to separate the double stranded (ds) nucleic acid into single stranded (ss); And (5) measuring the electric field applied to the gate of the MOSFET transistor.
이는 저온에서 핵산을 혼성화(hybridization)한 후 온도를 상승시키면서 돌연변이(mutation)를 검지하는 방법으로서, 미세가공된 유로에 제작된 온도제어장치와 검출장치는 정확하고 정밀한 온도제어에 의해 핵산의 돌연변이를 실시간으로 분석할 수 있다.It is a method of detecting mutations while raising the temperature after hybridization of nucleic acid at low temperature.The temperature control device and the detection device manufactured in the microfabricated flow path are used to detect the mutation of nucleic acid by precise and precise temperature control. Analyze in real time.
이와 선택적으로, 본 발명은 ① MOSFET형 트랜지스터의 표면 금속(metal)에 단일가닥 핵산 프로브를 고정화시키는 단계; ② 고정화된 프로브와 반응하는 표적(target) 핵산을 샘플 저장부(sample reservoir)에 주입하고, 미세가공채널의 유로를 따라 MOSFET형 트랜지스터로 이동시키는 단계; ③ 표적 핵산과 핵산 프로브를 혼성화(hybridization) 방지에 효과적인 온도에서 유지시키는 단계; ④ 단일가닥(ss) 핵산을 이중가닥(ds)으로 하기 위하여 온도를 차츰 하강시키는 단계; 및,⑤ MOSFET형 트랜지스터의 게이트(gate)에 걸리는 전기장을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 돌연변이 분석 방법을 제공한다.Alternatively, the present invention comprises the steps of: immobilizing a single stranded nucleic acid probe on a surface metal of a MOSFET-type transistor; (2) injecting a target nucleic acid reacting with the immobilized probe into a sample reservoir, and moving the target nucleic acid along the flow path of the microprocessing channel to the MOSFET transistor; ③ maintaining the target nucleic acid and the nucleic acid probe at a temperature effective to prevent hybridization; ④ gradually lowering the temperature to make single stranded (ss) nucleic acid double stranded (ds); And (5) measuring an electric field applied to a gate of the MOSFET transistor.
이는 고온에서 핵산을 변성(denatruaration) 시킨 후 온도를 내리면서 돌연변이(mutation)를 검지하는 방법이다.This is a method of detecting mutations by lowering the temperature after denaturing the nucleic acid at a high temperature.
본 발명에 따른 장치와 방법은 핵산 돌연변이, 특히 핵산의단일염기변이(SNP)를 검출하는 것을 효과적으로 이용될 수 있다. DNA는 이중가닥구조로 되어있으며 이것은 온도가 약 96도 정도 이상이 되면 두 개의 가닥으로 갈라진다(denaturation). 두개의 가닥이 서로 각각 완벽하게 염기쌍이 맞으면(match) 상대적으로 높은 온도에서 변성(denaturation) 되며 그중 맞지 않은 염기쌍이 있다면(mismatch) 상대적으로 낮은 온도에서 변성이 된다. 이러한 원리에 MEMS기술을 접목시켜 각각 다른 온도로 조절할 수 있는 초소형 온도제어장치와 검출장치를 같이 구성한 시스템을 제작한다. 이러한 시스템을 이용하여 각각의 MOSFET형 트랜지스터에，핵산의 염기배열이 하나씩 다르게 배치시키면 각각의 온도제어장치에서 몇도의 온도에서 변성이 되었는지를 알 수 있고 이것을 이용하여 핵산의 단일염기 돌연변이(single point mutation) 등을 분석할 수 있다.The apparatus and method of the present invention can be effectively used to detect nucleic acid mutations, in particular single nucleotide mutations (SNPs) of nucleic acids. DNA is double-stranded, which splits into two strands when the temperature is above 96 degrees. The two strands each denature at a relatively high temperature if they perfectly match the base pairs, and denature at relatively low temperatures if there are mismatches. By combining MEMS technology with this principle, we make a system that consists of a very small temperature control device and a detection device that can be controlled at different temperatures. Using such a system, each MOSFET type transistor can be arranged differently by one by one to find out how many degrees of denaturation has occurred at each temperature control device, and can be used to determine the single point mutation of nucleic acid. mutations), and the like.
도 １은 본 발명의 핵산분석장치의 일예로서，온도제어-검출부가 미세가공채널 내의 저면에 장착된 경우를 개략적으로 나타낸 도면이다． (a)는 match한 상태를 나타내고, (b), (c) 및 (d) mismatch한 상태를 나타낸다. 도 2는 본 발명의 핵산분석장치의 다른 일예로서，온도제어-검출부를 구성하는 MOSFET형 트랜지스터(Electrode, Gold Gate)는 미세가공채널 내의 측벽이나 모서리에 장착되고，히터(Micro heater)와 온도센서(Micro Tmperature Sensor)는 미세가공채널 내의 상면에 장착된 경우를 개략적으로 나타낸 도면이다． Fig. 1 is a diagram schematically showing a case where the temperature control-detecting unit is mounted on the bottom of the micro-processing channel as an example of the nucleic acid analyzing apparatus of the present invention. (a) shows a matched state and (b), (c) and (d) mismatched states. Fig. 2 shows another example of the nucleic acid analysis device of the present invention, in which a MOSFET-type transistor (Electrode, Gold Gate) constituting a temperature control-detecting unit is mounted on a side wall or an edge in a micro processing channel, and a heater and a temperature sensor are shown. (Micro Tmperature Sensor) is a diagram schematically showing the case where it is mounted on the upper surface of the micro processing channel.
이하, 본 발명의 핵산 분석 장치의 제조방법을 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, a method for manufacturing a nucleic acid analysis apparatus of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
1. 미세가공채널의 제조1. Preparation of micro processing channel
본 발명 장치의 몸체는 일반적으로 미세조립 기술(microfabrication techniques)에 적합한 방법 및 재료를 사용하여 조립될 수 있다. 예컨대, 본 발명 장치의 몸체는 다양한 폴리머 재료로 사출성형된 부분 또는 실리콘, 유리 등의 결정성 기질으로 된 다수의 평면 막을 포함할 수 있다. 실리카, 유리 또는 실리콘과 같은 결정성 기질의 경우에, 장치내의 웰과 다양한 채널을 생성하기 위해 에칭, 밀링, 드릴링 등을 사용할 수 있다. 반도체 산업분야에 사용되는 미세조립 기술이 이들 재료나 방법에 적용될 수 있다. 이들 기술은 예컨대, 전기침착(electrodeposition), 저압증착(low-pressure vapor deposition), 광석판인쇄술(photolithography), 에칭, 레이저 드릴링 등을 포함한다.The body of the device of the present invention may be assembled using methods and materials that are generally suitable for microfabrication techniques. For example, the body of the device of the present invention may comprise a plurality of planar membranes of injection molded portions of various polymer materials or crystalline substrates such as silicon, glass, and the like. In the case of crystalline substrates such as silica, glass or silicon, etching, milling, drilling and the like can be used to create wells and various channels in the device. Microassembly techniques used in the semiconductor industry can be applied to these materials or methods. These techniques include, for example, electrodeposition, low-pressure vapor deposition, photolithography, etching, laser drilling and the like.
광석판인쇄술을 이용한 기판의 에칭이 본 발명의 미세조립에 특히 적합하다. 예컨대, 제1 기판을 포토레지스트로 중첩시키고, 석판인쇄술 마스크를 통해 전자기 광선을 조사하여 포토레지스트를 장치의 챔버 및/또는 채널과 같은 패턴으로 노출시키고, 노출된 기판을 에칭하여 원하는 웰과 채널을 생성한 다음, 다른 평면 막을 제1 기판 위에 덮어 결합시킨다. 일반적으로 바람직한 포토레지스트는 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 및 그 유도체와, 폴리(올레핀 술폰)과 같은 전자빔 레지스트 등을 포함한다.Etching of the substrate using ore plate printing is particularly suitable for the microassembly of the present invention. For example, the first substrate is overlaid with a photoresist, irradiated with electromagnetic light through a lithography mask to expose the photoresist in a pattern such as chambers and / or channels of the device, and the exposed substrate is etched to provide the desired wells and channels. After that, another planar film is covered over the first substrate and bonded. Generally preferred photoresists include polymethyl methacrylate (PMMA) and derivatives thereof, electron beam resists such as poly (olefin sulfone), and the like.
바람직하게는, 본 발명의 몸체는 사출성형된 플라스틱 등의 부분과 에칭된 실리카 또는 실리콘 평면 막의 부분이 조합되어 이루어질 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 샘플 저장부는 사출성형기술에 의해 형성되는 반면, 미세가공채널과 온도제어 검출부는 평면 유리, 실리카 또는 실리콘 칩 또는 기판상에서 에칭에 의해 미세조립될 수 있다.Preferably, the body of the present invention may be made by combining a portion of an injection molded plastic or the like and a portion of an etched silica or silicon planar film. For example, the sample reservoir of the present invention is formed by injection molding technology, while the micromachining channel and temperature control detector can be microassembled by etching on flat glass, silica or silicon chips or substrates.
2. 온도제어부의 제조2. Manufacturing of temperature control unit
본 발명에서는 미세가공채널 내에 DNA 검출부(MOSFET 형 트랜지스터) 상에 부착된 핵산에 영향을 미치는 온도를 제어하기 위해 히터와 온도센서를 내장시킨다.In the present invention, a heater and a temperature sensor are built in the microprocessing channel to control the temperature affecting the nucleic acid attached to the DNA detection unit (MOSFET transistor).
히터로는 당업계에 제조방법이 알려진 박막 저항성 히터(thin film resistive heater) 등을 사용할 수 있다. 이 히터는 미세가공채널 내의 저면， 상면 또는 내부에 전원과 연결된 금속 필름을 도포함으로써 제조될 수 있다. 또한, 온도센서로는 온도의존성 전동기력(EMF)을 생성하는 바이메탈 접합을 갖는 서모커플, 온도 비례의 전기 저항을 갖는 재료를 포함하는 저항성 서모미터, 서미스터(thermistors), IC 온도센서, 콰르츠(quartz) 서모미터 등을 사용할 수 있다.As the heater, a thin film resistive heater or the like, which is known in the art, may be used. This heater can be manufactured by applying a metal film connected to a power source to the bottom, top or inside of the micromachining channel. Temperature sensors also include thermocouples with bimetal junctions that produce temperature-dependent electric motor forces (EMFs), resistive thermometers including materials with a temperature proportional electrical resistance, thermistors, IC temperature sensors, and quartz ( quartz) and the like can be used.
3. DNA 검출부의 제조3. Preparation of DNA Detection Part
도 ３은 본 발명에서 제작한 DNA 검출 센서(MOSFET 트랜지스터)의 제작과정을 나타낸 것이다. 우선 reservoir에서 연결된 유로(micro channel)에 의해 센서의 검출부위까지 핵산이 이동된다. 검출부의 센서는 n-type 실리콘 기판을 이용해서 wet etching 한 다음, 식각된 측벽에 boron을 확산시켜 p-type 실리콘 영역으로 만든다. 다시 습식 실리콘 식각을 이용해서 연결되어 있는 boron 영역을 절단하면 source와 drain이 형성된다. MOSFET 구조를 형성하기 위해서 source와 drain영역에 얇은 건식산화막을 성장시키고, 산화막위에 금의 산화막에 대한 부착특성을 높이기 위해 크롬을 부착시키고, 그 위에 금을 부착시킨다. 센서의 표면에 핵산 probe 들을 고정시키기 위해서 핵산의 끝에 thiol기를 치환시킨다. Thiol기를 가진 핵산은 SAM 방법을 통해 센서 표면에 존재하는 금 영역에만 선택적인 결합을 한다. 따라서 MOSFET형 DNA 센서위에 금 박막을 형성하고 그 위에 핵산을 부착시킴으로써 검출센서를 제작할 수 있다. 특히 금 박막위에 부착된 thiol SAM막은 박막을 만들기가 용이하고 재현성이 있다는 점과 thiol의 다른 쪽 반응기를 다양하게 바꾸어서 응용성을 최대한 가질 수 있다. 또한 다른 SAM 박막에 비해 상대적으로 더 치밀하고 잘 정렬된 박막을 얻을 수 있으며 그 결합력이 강하여 SAM 박막 형성 이후의 다양한 반응에도 안정하다는 점들 때문에 많이 사용되고 있다.Fig. 3 shows the fabrication process of the DNA detection sensor (MOSFET transistor) fabricated in the present invention. First, the nucleic acid is moved to the detection site of the sensor by a micro channel connected to the reservoir. The sensor of the detector is wet etched using an n-type silicon substrate, and then diffuses boron into the etched sidewall to form a p-type silicon region. When the boron region is cut again by wet silicon etching, a source and a drain are formed. To form a MOSFET structure, a thin dry oxide film is grown in the source and drain regions, and chromium is deposited on the oxide film to increase the adhesion property of the gold oxide film, and then gold is deposited thereon. To fix the nucleic acid probes on the surface of the sensor, substitute a thiol group at the end of the nucleic acid. Nucleotides with thiol groups selectively bind only to the gold region present on the sensor surface by SAM method. Therefore, a detection sensor can be manufactured by forming a gold thin film on a MOSFET-type DNA sensor and attaching nucleic acid thereon. In particular, the thiol SAM film attached on the gold thin film can be easily made and reproducible, and can have the maximum applicability by varying thiol's other reactor. In addition, relatively thinner and more aligned thin films can be obtained than other SAM thin films, and because of their strong bonding strength, they are widely used because they are stable to various reactions after forming SAM thin films.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 유체가 흘러갈 수 있는 유로에 직접 히터, 온도센서 및 DNA 검출센서를 빌트인(built-in)으로 동시에 제작함으로써 온도에 따른 핵산의 변성(denatuation) 현상을 실시간으로 판별할 수 있고, 많은 종류의 핵산의 돌연변이, 특히 핵산의 단일염기변이(SNP)를 효과적으로 검출할 수 있다.As described above, according to the present invention, by directly building a heater, a temperature sensor, and a DNA detection sensor in a built-in simultaneously in a flow path through which a fluid can flow, the denaturation phenomenon of nucleic acid according to temperature is generated in real time. It is possible to discriminate and to effectively detect mutations of many kinds of nucleic acids, especially single nucleotide variations (SNPs) of nucleic acids.
즉, 종래에 돌연변이 된 DNA 염기서열을 밝혀 내기 위해서는 온도에 따른 DNA 이중가닥 구조의 분리와 관찰을 위한 각기 다른 장비와 기계를 사용해야 했을 뿐만 아니라, 정확하고 정밀한 온도제어에 의한 DNA의 분리를 실시간에 측정하는 것이 매우 어려웠으나, 본 발명에 따르면， 미세가공된 유로에 제작된 온도제어장치와 검출장치가 미세가공된 유로에 DNA를 주입하기만 하면 정확하고 정밀한 온도제어에 의한 돌연변이 DNA의 검출을 실시간으로 할 수 있다. 또한, 온도분포는 미세영역에서 더욱 정확하게 나타나기 때문에 훨씬 정확한 특성을 얻을 수 있다.In other words, in order to uncover the mutated DNA sequences, it was necessary to use different equipment and machines for separating and observing the DNA double-strand structure according to the temperature, and to separate the DNA by accurate and precise temperature control in real time. Although it was very difficult to measure, according to the present invention, the detection of mutant DNA by accurate and precise temperature control was performed in real time by simply injecting DNA into the microfabricated flow path and the temperature control device fabricated in the microfabricated flow path. You can do In addition, the temperature distribution appears more precisely in the micro-domain, which results in much more accurate characteristics.
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