KR100434118B1

KR100434118B1 - 카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드, 그의발현벡터 및 이를 이용한 세포예정사의 억제방법

Info

Publication number: KR100434118B1
Application number: KR10-2001-0057353A
Authority: KR
Inventors: 이균민; 김노수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2004-06-04
Also published as: JP3641259B2; DE60207798T2; ATE312170T1; JP2003180380A; EP1293563B1; EP1293563A1; US6943022B2; US20030060443A1; KR20030024290A; DE60207798D1

Abstract

본 발명은 카스파제(caspase)-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide), 그의 발현벡터 및 이를 이용한 재조합 CHO(chinese hamster ovary) 세포의 세포예정사(apoptosis) 억제방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 카스파제-3의 발현을 억제하는서열번호 1의 염기서열로 구성된 안티센스 뉴클레오타이드, 상기 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 재조합 세포에 도입하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현시켜 카스파제-3의 발현을 억제함으로써 재조합 세포예정사를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 세포예정사에 관여하는 카스파제-3의 활성을 효과적으로 억제시켜 세포예정사를 방지할 수 있고, 또한 세포예정사를 방지함으로써 상기 세포가 생산하는 목적단백질의 질을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드, 그의 발현벡터 및 이를 이용한 세포예정사의 억제방법{Inhibition of apoptosis by the expression of antisense RNA of caspase-3}

본 발명은 카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드, 그의 발현벡터 및 이를 이용한 재조합 CHO(chinese hamster ovary) 세포의 세포예정사 억제방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 카스파제-3의 발현을 억제하는서열번호 1의 염기서열로 구성된 안티센스 뉴클레오타이드, 상기 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 재조합 세포에 도입하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현시켜 카스파제-3의 발현을 억제함으로써 재조합 세포예정사을 억제하는 방법에 관한 것이다.

CHO(chinese hamster ovary) 세포주는 현재 재조합 항체를 비롯한 인간 인터페론 감마(interferon-gamma, Goldman, et al.,1997,Cytotechnology, 23, 103-111), 제 8 인자(factor Ⅷ, Ganne and Mignot,1991,Cytotechnology, 6, 233-40) 트롬보포이에틴(thrombopoietin, Kim, et al,2000,Biotechnol Prog, 16, 775-781) 등의 목적 단백질을 생산하는데 가장 많이 이용되고 있다. 재조합 CHO 세포를 사용하여 목적 단백질을 생산할 때에는 단위시간 당 살아있는 세포로부터 얼마나 많은 양의 단백질이 생산되는가를 표시하는 비생산속도가 중요한데 이러한 비생산속도를 증가시키기 위해서 외래유전자의 전사 속도를 증가시킴으로써 단백질의 생산성을 증가시킬수 있는 것으로 알려진 소디움 부티레이트(NaBu, sodium butyrate, Palermo, et al,1991,J Biotechnol, 19, 35-47)를 사용하고 있다. 그러나 NaBu는 세포의 전사속도를 증가시켜줌으로써 비생산속도를 증가시킬 수는 있지만 동시에 그 자체의 세포독성에 의해 세포예정사(apoptosis)를 유도하기 때문에 실제적으로 높은 농도의 NaBu를 사용하기에는 문제가 있다. 따라서, 이러한 NaBu에 의해 유도되는 세포예정사을 억제할 필요성이 대두되는데 기존의 방법은 세포예정사을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 알려져 있는 Bcl-2 단백질과 같은 생존단백질을 재조합 CHO 세포로부터 과발현시킴으로써 세포사멸을 억제하는 실험이 시도된 바 있으며(Tey, et al.,2000,Biotechnol. Bioeng., 68, 31-43) 실제로 본 발명자들은 Bcl-2를 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO세포에서 과발현시켜 세포사멸을 효과적으로 억제시킴으로써 최종 항체 농도를 증가시키는데 성공한 바 있다(Kim and Lee,2001,Biotechnol. bioeng., 71, 184-193). 그러나 Bcl-2와 같은생존단백질들은 세포사멸을 억제함으로써 세포로부터 암을 유발시킬 수 있는 종양유발(oncogenic) 효과가 있는 것으로 밝혀져 있기 때문에 실험실 수준에서 재조합 세포를 이용하여 외래 목적 단백질의 발현량을 증가시킬 수는 있을지라도 상업적으로 진단용 단백질이 아닌 인체 내에 주입하게 되는 치료용 단백질을 생산하는 측면에서는 정제과정에서 Bcl-2의 완벽한 제거가 입증되어야하는 어려움이 있다. 따라서, Bcl-2와 같은 생존단백질이 아닌 다른 세포예정사 저해제의 개발이 필요하다.

세포예정사는 특정 아미노산의 서열에 특이적으로 반응하는 카스파제(caspase)라는 일종의 단백질 분해 효소들의 순차적인 활성화에 의해서 일어나게 되는데 현재 동물 세포에서 발견된 10 가지의 카스파제 중에서 카스파제-3는 카스파제 활성화의 마지막 단계에서 작용하는 효소(effector caspase)로 알려져 있다. 세포예정사를 유도하는 세포독성을 갖는 물질들은 그 종류에 따라서 다양한 경로로 세포예정사를 진행시키게 되는데 이러한 다양한 경로의 세포예정사는 최종적으로 카스파제-3와 같은 에펙터 카스파제(effector caspase)의 활성화를 유도하기 때문에 결과적으로 다양한 형태의 세포예정사 신호가 한 두 가지 카스파제 효소의 활성화로 모여지는 것이다. 또한 카스파제-3의 세포내 기질은 여타의 에펙터 카스파제들 보다 많은 것으로 알려져 있다. 따라서, 카스파제-3에 대한 안티센스(antisense) RNA 발현을 유도할 경우 세포예정사를 억제할 수 있다. 안티센스 RNA는 펩타이드를 인코딩(encoding)하게 되는 센스(sense) mRNA의 염기서열에 특이적으로 결합하여 리보좀에 의하여 mRNA 정보가 펩타이드로 전환되는 번역단계를 억제하거나 안티센스-센스(antisense-sense) RNA 이중 나선 구조에 특이적인 RNase에 의해서 mRNA가 분해되어 목적 단백질의 발현을 억제하게 된다. 따라서, 이러한 안티센스 RNA 기술을 이용한 카스파제-3 단백질의 발현 억제는 Bcl-2와 같은 생존단백질의 과발현 시스템에서 유발되는 문제를 없앨 수 있으며, 원하는 특정 유전자의 발현만을 억제시킬 수 있다는 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 B 형 간염 바이러스의 S 표면 항원에 특이적인 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포에 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA의 전사를 유도할 수 있는 발현벡터를 도입할 경우 NaBu에 의한 세포예정사가 억제되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로써, 세포예정사에 관여하는 카스파제-3의 발현을 효과적으로 억제시켜 CHO 세포의 세포예정사를 효과적으로 방지할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드, 이의 발현벡터 및 상기 세포가 생산하는 목적단백질의 질을 향상시킬 수 있는 세포예정사의 억제방법을 제공함을 목적으로 한다.

도 1은 B형 간염 바이러스의 S 표면 항원에 대한 인간화된 항체의 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)를 CHO(chinese hamster ovary) 세포내에서 동시에 발현할 수 있도록 고안된 발현 벡터의 구조를 나타내는 모식도이고,

도 2는 B형 간염 바이러스의 S 표면 항원에 대한 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포내에서 CHO 세포의 카스파제-3 효소에 대한 안티센스 RNA를 발현시킬수 있도록 고안된 발현 벡터 ASCASP3-200의 구조를 나타내는 모식도이고,

도 3의A는 대조군(control) 세포와 발현벡터 ASCASP3-200를 도입하여 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별하여 웨스턴 블라팅(Western blotting)을 수행하여 카스파제-3의 발현이 억제된 ASCASP3-200 B3(이하“B3”라 한다) 세포를 얻는 과정을 보여주는 전기영동 사진이고,

B3: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입된 카스파제-3의 발현이 억제된 세포주,

C1: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입되었으나 카스파제-3의 발현 억제가 안된 세포주,

E1: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입되었으나 카스파제-3의 발현 억제가 안된 세포주,

F5: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입되었으나 카스파제-3의 발현 억제가 약한 세포주,

H3: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입되었으나 카스파제-3의 발현 억제가 약한 세포주

도 3의B는 대조군(control) 세포와 발현벡터 ASCASP3-200를 도입하여 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별하여 웨스턴 블라팅(Western blotting)을 수행하여 그 밴드의 밀도(intensity)를 수치화함으로써 카스파제-3의 발현이 억제된 ASCASP3-200 B3(이하“B3”라 한다) 세포를 얻는 과정을 보여주는 그래프이고,

E1: 발현벡터 ASCASP3-200이 삽입되었으나 카스파제-3의 발현 억제가 안된 세포주

도 4는 대조군 세포를 여러 농도의 소디움 부티레이트(NaBu, sodiumbutyrate)를 첨가한 상태에서 회분배양 하였을 때 나타나는 세포성장, 세포생존률 및 항체의 발현 정도를 나타내는 그래프이고,

도 5는 B3 세포를 여러 농도의 NaBu를 첨가한 상태에서 회분배양 하였을 때 나타나는 세포성장, 세포생존률 및 항체의 발현 정도를 나타내는 그래프이고,

도 6은 대조군 세포와 B3 세포를 5 mM의 NaBu를 첨가한 상태에서 회분배양을 하였을 때 죽은 세포의 세포막이 깨짐으로써 세포배양 배지로 흘러나오는 락테이트 디하이드로게나제(LDH, lactate dehydrogenase)의 효소 활성도의 변화량을 나타내는 그래프이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카스파제-3의 발현을 억제하고서열번호 1의 염기서열로 구성된 안티센스 뉴클레오타이드, 상기 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 CHO 세포에 도입하고 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현시켜 카스파제-3의 활성을 억제함으로써 CHO 세포의 세포예정사를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 카스파제-3의 발현을 억제하고서열번호 1의 염기서열로 구성된 카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터(ASCASP3-200)는 다음의 방식에 의해 제조된다. cDNA 풀(pool)을 CHO 세포로부터 RT-PCR 기법을 이용하여 얻는다. 카스파제-3의 cDNA 조각은 cDNA 풀과 카스파제-3 유전자의 시작암호(start codon)와 종결암호(stop codon)를 포함하는 두 개의 프라이머(casp3L 및 casp3R)를 사용하여 PCR 기법을 통하여 증폭하였다. 사용된 두 개의 프라이머 염기 서열은 CHO 세포와 염기 서열에 있어서 유사성이 있을 것으로 추정되면서 기존에 알려져 있던 인간 주르캣 T-임파구(Jurkat T-lymphocyte)의 카스파제-3 염기 서열을 사용하였다(Fernandes-Alnemri, et al.,1994,J. Biol. Chem., 269, 30761-30764). 전체 길이의 카스파제-3의 cDNA 조각을 pBluescript Ⅱ SK (-) 클로닝 벡터(Stratagene)에 존재하는 다중 클로닝 부위(multicloning site)에 삽입한 다음, 카스파제-3의 5'쪽 약 200 bp를 포함하는 부분적인 cDNA 조각은 종결암호와 5' 시작암호로부터 약 200 bp 떨어진 카스파제-3 cDNA의 안쪽부위를 포함하는 두 개의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 증폭된 카스파제-3의 부분적인 cDNA 조각을 pcDNA3.1-zeo(+)(InVitrogen)에 존재하는 다중 클로닝 부위 사이에 역방향으로 삽입함으로써 최종적으로 ASCASP3-200을 제조하였다.

본 발명자들은 상기 발현벡터 ASCASP3-200을 2001년 8월 13일부로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10038BP).

마지막으로 본 발명의 세포예정사의 억제방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

세포예정사는 특정 아미노산 서열에 특이적으로 반응하는 카스파제라는 일종의 단백질 분해효소들의 순차적인 활성화에 의해서 일어나는데 현재 동물세포에서 발견된 10여 가지의 카스파제 중에서 카스파제-3은 카스파제 활성화의 마지막 단계에서 작용하는 효소(effector caspase; 이하 "에펙터 카스파제"라고 함)로 알려져 있다. 세포예정사를 유도하는 세포독성을 갖는 물질들은 그 종류에 따라서 다양한 경로의 세포예정사를 진행시키게 되는데 이러한 다양한 경로의 세포예정사는 최종적으로 카스파제-3과 같은 에펙터 카스파제의 활성화를 유도하기 때문에 결과적으로 다양한 형태의 세포예정사의 신호가 한 두 가지의 카스파제의 활성화로 모아지는 것이다. 또한 카스파제-3의 세포내 기질은 여타의 에펙터 가스파제들 보다 많은 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명에서는 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA 발현을 유도하였다. 본 발명에서 상술한 바와 같이 제조된 카스파제-3에 대한 안티센스뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 CHO 세포에 도입하여 발현시키면 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA가 발현되어 카스파제-3를 코딩하는 센스 RNA의 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합하여 리보솜에 의하여 mRNA 정보가 카스파제-3으로 전환되는 번역단계를 억제하거나, 안티센스-센스 RNA 이중나선 구조에 특이적인 RNase에 의해서 mRNA가 분해되어 카스파제-3의 발현을 억제함으로써 결국은 세포예정사를 방지할 수 있게 된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 B형간염 바이러스의 S 표면항원에 특이적인 인간화된 항체를 생산하는 재조합 CHO 세포를 사용하였고, 상기 세포에 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA의 전사를 유도할 수 있는 발현벡터를 도입하여 NaBu에 의한 CHO 세포의 세포예정사를 방지하였다.

이하 본 발명을 실시예를 참고하여 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터 (ASCASP3-200)의 제조

본 발명자들은 하기의 과정을 통하여 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터인 ASCASP3-200을 제조하였다. 구체적으로, CHO 세포의 cDNA 풀(pool)은 CHO 세포(DUKX-B11, ATCC CRL-9096)로부터 Marrathon^TMcDNA 증폭킷 (Clontech)을 이용하여 얻었으며, 전체 길이의 카스파제-3의 cDNA 조각은 cDNA를 주형(template)으로 하고 두 개의 프라이머, 즉 casp3L(서열번호 2) 및 casp3R(서열번호 3)을 사용하여 PCR(Perkin Elmer)로 증폭하였다. 사용된 두 개의 프라이머 염기 서열은 CHO 세포와 염기 서열에 있어서 유사성이 있을 것으로 추정되면서 기존에 알려져 있던 인간 주르캣 T-임파구의 카스파제-3 염기 서열을 사용하였다(Fernandes-Alnemri, et al.,1994,J. Biol. Chem., 269, 30761-30764). casp3L 프라이머에는 XbaI 제한효소 절단 부위와 5' 시작암호가, casp3R 프라이머에는 BamHI 제한효소 절단 부위와 3' 종결암호가 들어있다. 전체 길이의 카스파제-3의 cDNA 조각을 pBluescript Ⅱ SK(-) 클로닝 벡터(Stratagene)에 존재하는 다중 클로닝 부위의 XbaI과 BamHI 사이에 삽입한 다음 자동화된 DNA 시퀀서(ABI prism model 377, Perkin-Elmer)를 사용하여 삽입된 전체 길이의 카스파제-3 cDNA 염기 서열을 확인하였다. 카스파제-3의 5'쪽 약 200 bp를 포함하는 부분적인 cDNA 조각은 두 개의 프라이머, 즉 casp3L과 casp3R200(서열번호 4)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. casp3R200 프라이머에는 EcoRI 제한효소 절단 부위와 5' 시작암호로부터 약 200 bp 떨어진 카스파제-3 cDNA의 안쪽부위를 포함하고 있다. 증폭된 카스파제-3의 부분적인 cDNA 조각을 pcDNA3.1-zeo(+)(InVitrogen)에 존재하는 다중 클로닝 부위의 XbaI과 EcoRI 사이에 CMV 프로모터로부터 유도되는 전사 방향과 역방향으로 삽입하여 최종적으로 ASCASP3-200을 제조하였다.

<실험예 1> 세포예정사의 억제

<1-1> 카스파제-3의 발현이 억제된 CHO 세포의 선별

본 발명자들은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr, dihydrofolate reductase) 음성인 CHO 세포(DUKX-B11, ATCC CRL 9096)를 1% 하이폭산틴/티미딘(hypoxanthine/thimidine, Gibco)과 10%(V/V) FBS(fetal bovine serum, Gibco)가 포함된 5 ㎖의 DMEM/F12 배지(Gibco)가 담겨진 60 ㎜ 배양접시에서 1x10⁵세포/㎖의 농도로 24시간 동안 배양한 후 인간화 항체 발현벡터(pKC-dhfr-HC-huS,도 1)를 리포좀(liposome)을 이용하여 도입하였다. 벡터를 도입한 후 정확하게 48시간이 지난 다음 550 ㎍/㎖의 G418 항생제(Gibco)와 10%(V/V)의 투석된 FBS(dFBS)가 포함된 MEM-알파 배지에서 항생제에 저항성을 가지는 세포를 2-3주에 걸쳐 선별하였다. 선별된 세포에 MTX(Sigma)를 20, 80 및 320 nM의 농도로 처리하여 비항체생산성의 증가를 유도한 후 320 nM 처리군에서 가장 높은 값의 비항체생산성을 갖는 세포주를 확보하여 “SH2-0.32”라 명명하였다. SH2-0.32 세포에 CHO 세포의 카스파제-3 효소에 대한 안티센스 RNA를 전사하는 발현벡터(ASCASP3-200,도 2)를 리포좀을 사용하여 도입하였다. 500 ㎍/㎖의 제오신(zeocin, InVitrogen) 항생제가 들어있는 배양 배지에서 항생제에 저항성을 가지는 세포를 선별하여 웨스턴 블라팅을 통하여 카스파제-3의 발현이 억제된 재조합 CHO 세포를 선별하였다.

그 결과, 카스파제-3의 발현이 현저히 억제된 세포주를 선별하여 이를 ASCASP3-200 B3(이하 “B3”라 한다)라 명명하였으며 상기의 B3 세포주를 하기의 실험에 사용하였다(도 3). 이때, 안티센스 RNA가 삽입되어 있지 않은 벡터pcDNA3.1-zeo(+)를 SH2-0.32에 도입한 세포를 대조군 세포로 사용하였다.

<1-2> 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA 발현을 통한 세포예정사의 억제

본 발명자들은 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현시킴으로써 NaBu에 의해 유도된 세포예정사가 억제되는지를 확인하였다. 구체적으로, 상기<1-1>에서 수득한 대조군 세포와 B3 세포를 320 nM의 MTX와 5% dFBS가 첨가된 5 ㎖의 MEM-알파 배지가 들어있는 6 웰 배양접시에 4x10⁴세포/㎖ 농도로 72시간 동안 배양한 후 최종 농도가 0-5 mM 의 NaBu가 첨가된 새로운 배양 배지로 교환하였다. 일정한 시간 간격을 두고 배양배지와 배양접시에 존재하는 세포를 취한 다음 트리판 블루(trypan blue, Sigma)를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하여 세포 생존률을 구하고 ELISA 방법을 이용하여 배양배지내의 항체 농도를 결정하였다.

그 결과, NaBu의 농도에 비례하여 세포성장이 억제되는 것을 확인하였으며 특히 세포예정사를 유도하는 세포독성은 5 mM의 농도에서 관찰할 수 있었다(도 4의A및도 5의A). 대조군의 경우 5 mM의 NaBu를 첨가한 후 24시간 이후부터 급격하게 세포생존률이 저하되었으며 약 3일 경과 후에는 세포생존률이 50% 이하로 감소되었다(도 4의B). B3 세포의 경우는 NaBu에 의해 세포 성장이 둔화되는 모습은 대조군 세포에서와 비슷하게 나타났으나 5 mM의 NaBu를 첨가하였을 경우에는 큰 차이를 보였다. 즉, 대조군의 경우 5 mM의 NaBu를 첨가하였을 경우 세포생존률이 24시간 이후부터 급격하게 감소하였지만 B3 세포의 경우에는 그러한 급격한 세포생존률의 감소는 관찰되지 않았다(도 5의B). 이러한 결과는 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA에 의해서 카스파제-3의 발현이 억제되어 카스파제-3의 활성 정도가 대조군보다 낮기 때문이다. 그러나, 세포생존률의 증가에 의해 살아있는 세포수가 증가하였음에도 대조군과 비교하여 항체생산성에는 큰 차이가 없었다(도 4의C및도 5의C). 세포생존률의 증가에도 불구하고 항체생산성이 증가하지 않는 이유는 NaBu에 의해 미토콘드리아막이 깨져서 미토콘드리아의 탈분극에 의해 세포의 단백질 생산 대사에 필요한 에너지(ATP)의 합성이 저해되었기 때문으로 생각된다.

<실험예 2> 배양배지에서의 LDH 활성도 분석

목적단백질 특히 인체내로 주입하게 되는 치료용 단백질을 생산하는 경우에 있어서 생산성 못지 않게 중요하게 생각되는 부분이 단백질의 무결성(integrity) 문제이다. 회분배양시 단백질의 무결성에 가장 많은 영향을 주는 요인은 죽어나가는 세포, 즉 세포막이 깨짐으로써 세포안에 존재하는 다양한 형태의 가수분해 효소들인데, 리소좀이나 소포체, 골지체에 존재하고 있던 단백질 분해 효소라든가 당쇄화의 구조를 변화시킬 수 있는 글리코시다제(glycosidase) 등이 배양 배지로 흘러나옴으로써 생성된 단백질의 구조를 변화시켜 단백질의 질을 떨어뜨릴 수 있게 된다.

본 발명자들은 이렇게 세포막이 깨지는 현상의 정도를 알아보기 위해서 간접적인 방법으로 세포내 효소인 LDH의 배양배지 내 활성도를 분석하였다.

그 결과, NaBu에 의한 LDH의 증가가 대조군과 비교하여서 B3 세포의 경우 확연하게 저하되고 있음을 확인하였다(도 6). 따라서, 안티센스 RNA를 이용한 카스파제-3 활성의 억제는 단백질 생산성의 증가보다는 단백질의 질을 향상시키는데 그 효용성이 있는 것이다. 이러한 기술은 특히 단백질 분해 효소에 상당히 민감하게 반응하는 목적 단백질들, 예를 들어 인간 인터페론-감마(interferon-gamma), 제 8 인자(factor Ⅷ), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 에리트로포이에틴(erythropoietin)과 같은 단백질을 생산하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 세포예정사에 관여하는 카스파제-3의 활성을 효과적으로 억제시켜 세포예정사를 방지할 수 있고, 또한 세포예정사를 방지함으로써 상기 세포가 생산하는 목적단백질의 질(integrity)을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims

서열번호 1로 기재되는 카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 재조합 세포의 세포예정사 저해제.
카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 발현벡터 ASCASP3-200(수탁번호: KCTC 10038BP)를 유효성분으로 포함하는, 재조합 세포의 세포예정사 저해제.
제 2항 기재의 발현벡터를 재조합 세포에 도입하고, 카스파제-3에 대한 안티센스 RNA를 발현시켜 카스파제-3의 활성을 억제함으로써 재조합 세포의 세포예정사를 억제하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 재조합 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.