KR100433741B1 - Strain producing remarkable amount of ε-poly-L-lysine and process for producing ε-poly-L-lysine by using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 통상적인 ε-폴리-L-라이신 생산 균주 또는 이의 개량된 변이체와 비교하여 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 능력이 개선되어 있으며, ε-폴리-L-라이신 생산성을 증가시킬 수 있는 균주 및 당해 균주를 사용함으로써 ε-폴리-L-라이신을 현저한 양으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있고, 스트렙토마이세스 알불러스(Streptomyces albulus) 종에 속하는 미생물을 돌연변이시켜 20㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성이 있고, ε-폴리-L-라이신을 생산할 수 있는 균주를 생성하고, 이러한 균주를 배지에서 호기적으로 배양하고 배양액으로부터 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 포함한다.The present invention improves the ability to produce ε-poly-L-lysine and increases ε-poly-L-lysine productivity compared to conventional ε-poly-L-lysine producing strains or improved variants thereof. And a method capable of producing significant amounts of ε-poly-L-lysine by using the strain, the method being capable of producing ε-poly-L-lysine, Streptomyces albulus Microorganisms belonging to the Streptomyces albulus species produce strains that are resistant to high concentrations of S- (2-aminoethyl) -L-cysteine of 20 mg / ml or higher and capable of producing ε-poly-L-lysine And culturing aerobically these strains in the medium and collecting ε-poly-L-lysine from the culture.
Description
발효법에 의한 εPL의 제조방법으로는, 자연계로부터 분리해낸 εPL 생산 균주이며 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 346-D FERM 3834P 균주를 배지에서 배양하고, 생성된 배양물로부터 εPL을 분리시키고 정제시킴을 포함하는 방법이 공지되어 있다[참조 문헌: 심사된 일본 특허공보 제59-20359호]. 또한, 상기한 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 346-D 균주를 돌연변이(mutagenesis) 처리하여 L-라이신의 유사 물질인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 지닌 돌연변이 균주로 형질전환시켜 생성된 돌연변이 균주, 즉 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 FERM 1109BP를 배지에서 배양하고, 생성된 배양 배지로부터 εPL을 분리시키고 정제시킴을 포함하는 방법이 공지되어 있다[참조 문헌: 심사된 일본 특허공보 제3-42070호 또는 심사된 일본 특허공보 제3-78998호].As a method of manufacturing εPL by fermentation is a εPL production strains came up separate from the natural Streptomyces Streptomyces Al call belonging to the genus (Streptomyces) Srei sinopolri methoxy Russ (Streptomyces albulus lysinopolymerus) 346-D FERM the 3834P strain in a culture medium A method is known which involves culturing and separating and purifying [epsilon] PL from the resulting culture (refer to Japanese Patent Publication No. 59-20359). In addition, the above-described Streptomyces Albulus lysinopolymerus 346-D strain was mutated (mutagenesis), a mutation having resistance to S- (2-aminoethyl) -L-cysteine, a similar substance of L-lysine Mutant strains generated by transformation with strains, ie Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 FERM 1109BP, were cultured in a medium, and εPL was isolated and purified from the resulting culture medium. The method of making it is known (refer to Unexamined Japanese Patent No. 3-42070 or Unexamined Japanese Patent No. 3-78998).
다양하게 적용될 수 있는 저렴한 εPL을 제조하기 위해서는, 심지어는 상기한 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1을 사용하더라도 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율의 관점에서는 충분하지가 않다. 따라서, εPL을 생산하는 능력이 개량된 균주 및 상기한 개량 균주를 사용하여 εPL을 생산하는데 있어 공업적으로 저렴하고 효율적인 방법의 개발이 요구되어 왔다.To produce inexpensive epsilon PL that can be applied in various ways, even using the above-described strain Streptomyces albulus lysinopolymers 11011A-1, it is not sufficient in view of the yield of the epsilon PL and glucose conversion efficiency. Therefore, there has been a demand for the development of an industrially inexpensive and efficient method for producing εPL using strains with improved ability to produce εPL and the above-described improved strains.
본 발명자들은 통상적인 εPL 생산 균주 또는 이의 돌연변이 균주와 비교하는 경우, 보다 향상된 εPL 생산 능력을 지닌 균주를 수득하고자 하는 관점에서 광범위한 조사를 반복했다. 그 결과, 20㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(이후부터는 "AEC"로 언급함)에 대한 내성을 지닌 돌연변이 균주가 εPL을 현저한 양으로 생산할 수 있는 균주일 수 있고, 배지에서 상기 균주를 호기적으로 배양함으로써 εPL을 현저한 양으로 생산할 수 있음을 밝혀내었다. 이러한 발견을 근거로 하여, 본 발명을 완성하였다.The inventors have repeated extensive investigations in terms of obtaining strains with improved εPL production capacity when compared to conventional εPL producing strains or mutant strains thereof. As a result, a mutant strain resistant to high concentrations of S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (hereinafter referred to as "AEC") of 20 mg / ml or more was a strain capable of producing a significant amount of εPL. It has been found that εPL can be produced in significant amounts by aerobic culturing the strain in the medium. Based on these findings, the present invention has been completed.
상기한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 목적은 통상적인 εPL 생산 균주 또는 이의 개량 균주와 비교하여, 보다 높은 εPL의 생산 능력을 가져서 εPL의 생산성을 향상시킬 수 있는 균주, 및 또한 당해 균주를 사용하여 저렴하게 현저한 양으로 εPL을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.As is apparent from the above description, an object of the present invention is to use a strain having a higher production capacity of εPL and improving the productivity of εPL as compared to conventional εPL producing strains or improved strains thereof, and also using the strains. It is to provide a method for producing ε PL in a significant amount at low cost.
본 발명은 ε-폴리-L-라이신(이후부터는 "εPL"로 언급함)을 현저한 양으로 생산하는 균주 및 당해 균주를 사용하는 발효법에 의해 εPL을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to strains which produce significant amounts of ε-poly-L-lysine (hereinafter referred to as "εPL") and to methods of producing εPL by fermentation methods using the strains.
εPL은 필수 아미노산인 L-라이신의 중합체이기 때문에, 안정성이 높고, 또한 양이온 함량이 높으며, 특이한 물리적 특성을 지닌다. 따라서, 욕실용품, 화장품류, 사료 첨가물, 의약, 농약, 식품 첨가물, 전자 재료 등에서 유용할 것으로 기대된다. 특히, 식품 첨가물 분야에서 천연 발생의 첨가제로서 주목받고 있다.Since epsilon PL is a polymer of the essential amino acid L-lysine, it has high stability, high cation content, and has specific physical properties. Therefore, it is expected to be useful in bathroom products, cosmetics, feed additives, medicine, pesticides, food additives, electronic materials and the like. In particular, it is attracting attention as a naturally occurring additive in the field of food additives.
본 발명은 하기의 기술적 수단으로 구성된다:The invention consists of the following technical means:
(1) ε-폴리-L-라이신을 생산하는 능력을 가진 스트렙토마이세스 알불러스(Streptomyces albulus) 종의 미생물을 돌연변이 처리함으로써 수득되고, 20㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는, ε-폴리-L-라이신을 현저한 양으로 생산할 수 있는 균주.(1) obtained by mutating microorganisms of Streptomyces albulus species having the ability to produce ε-poly-L-lysine, and a high concentration of S- (2-aminoethyl of 20 mg / ml or more; A strain capable of producing significant amounts of ε-poly-L-lysine, resistant to) -L-cysteine.
(2) 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 FERM 1109BP 균주를 돌연변이 처리함으로써 수득되고 20㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 갖는, ε-폴리-L-라이신을 현저한 양으로 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 FERM 5926BP 균주.(2) obtained by mutating the Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 FERM 1109BP strain and subjected to high concentrations of S- (2-aminoethyl) -L-cysteine of 20 mg / ml or more; Streptomyces albulus lysinopolymers B21021 FERM 5926BP strain capable of producing significant amounts of ε-poly-L-lysine with resistance to.
(3) 20㎎/㎖ 이상의 고농도의 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성을 가지고 있으며 ε-폴리-L-라이신 생산 능력을 갖는 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물을 배지에서 호기적으로 배양하고, 배양액중에서 생성되어 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로 하는, ε-폴리-L-라이신의 제조방법.(3) Aerobic microorganisms belonging to the genus Streptomyces with resistance to high concentrations of S- (2-aminoethyl) -L-cysteine of 20 mg / ml or more and having the ability to produce ε-poly-L-lysine And ε-poly-L-lysine, which is generated and accumulated in the culture medium, to collect ε-poly-L-lysine.
(4) 배지에서 상기(2)에서 기술한 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 FERM 5926BP 균주를 호기적으로 배양하고 배양액중에서 생성되어 축적된 ε-폴리-L-라이신을 수집함을 특징으로 하는, ε-폴리-L-라이신의 제조방법.(4) culture the Streptomyces albulus lysinopolymer B21021 FERM 5926BP strain described in (2) above in aerobic medium and collect and accumulate ε-poly-L-lysine produced and cultured in the culture medium. The manufacturing method of (epsilon) -poly-L-lysine made into.
본 발명에서 사용되는 AEC는 L-라이신과 구조적으로 유사한 물질(유사체)이고, L-라이신과는 4-위치에서의 탄소원자가 황원자로 치환된 것만이 상이한 구조를 갖는 화합물이다. AEC를 배지에 첨가하면 미생물의 생육 저해를 유발시키고, 이를 L-트레오닌과 혼합하여 사용하는 경우, 생육 저해는 보다 명백해지고 강력해진다.The AEC used in the present invention is a substance (analogue) similar in structure to L-lysine, and a compound having a different structure from L-lysine in which only a carbon atom in the 4-position is substituted with a sulfur atom. The addition of AEC to the medium leads to inhibition of the growth of microorganisms and, when used in combination with L-threonine, growth inhibition becomes more apparent and potent.
심사된 일본 특허공보 제3-42070호에 기재되어 있는 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1은 L-라이신 유사 물질인 AEC에 대한 내성을 지닌 εPL 생산 균주이긴 하지만, 2㎎/㎖ 농도의 AEC의 존재하에 선별되고, AEC의 농도가 단지 5㎎/㎖ 이하인 경우에는 생육하지만 10㎎/㎖ 이상의 AEC 농도에서는 생육하지 않는다.The strain Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 described in Japanese Patent Publication No. 3-42070 examined was an εPL producing strain resistant to AEC, an L-lysine-like substance. However, it is selected in the presence of 2 mg / ml of AEC and grows when the concentration of AEC is only 5 mg / ml or less, but not at AEC concentrations of 10 mg / ml or more.
본 발명에 따른 개량 균주는 20㎎/㎖ 이상의 AEC의 농도하에서 선별함으로써 수득되고, 스트렙토마이세스 속에 속하고 40㎎/㎖의 AEC의 농도에서도 생육할 만큼 이에 대한 내성을 가진 미생물이다. 또한, 개량 균주는 모 균주인 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 균주와는 균학적인 특성이 부분적으로 상이한 것으로 인지된다.The improved strain according to the present invention is a microorganism obtained by screening at a concentration of AEC of 20 mg / ml or more, and belonging to Streptomyces and resistant to it so as to grow at a concentration of AEC of 40 mg / ml. In addition, it is recognized that the improved strain is partially different from the parent strain Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 strain.
상기한 개량 균주를 수득하는데 사용되는 모 균주로는, 스트렙토마이세스 속에 속하고 εPL을 생산할 수 있는 미생물을 사용할 수 있다. 이들중에서, 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 FERM 1109BP 균주가 바람직하다.As the parent strain used to obtain the above-described improved strain, microorganisms belonging to the genus Streptomyces and capable of producing εPL can be used. Among these, the Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 FERM 1109BP strain is preferred.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이 처리"는 스트렙토마이세스 속에 속하고 εPL을 생산할 수 있는 미생물(균주)의 돌연변이를 유발시켜 20㎎/㎖ 이상의 고농도에서의 AEC에 대해 내성을 지닌 개량된 균주를 수득하기 위한 처리를 의미하며, 이러한 돌연변이 처리 방법의 예로는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(이후부터는 "NTG"로 언급함)을 가하여 완충액 ㎖당 0.1 내지 3㎎의 농도로 만들고, 균주를 10분 내지 2시간 동안 NTG와 접촉시키는 방법; 균주를 100 내지 1000J/cm2의 조사량으로 자외선에 노출시키는 방법, 균주를 5-브로모라우실과 같은 화학약품으로 처리하는 방법: 및 기타 통상적으로 사용되는 화학적 또는 물리적 돌연변이 처리 방법이 포함된다.As used herein, the term "mutant treatment" is intended to cause mutations in microorganisms (strains) belonging to Streptomyces and capable of producing εPL to obtain improved strains resistant to AEC at high concentrations of 20 mg / ml or higher. And an example of such a mutation treatment method is N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (hereinafter referred to as "NTG") to make a concentration of 0.1 to 3 mg per ml buffer Contacting the strain with NTG for 10 minutes to 2 hours; Exposure of the strain to ultraviolet radiation at a dosage of 100-1000 J / cm 2 , treatment of the strain with chemicals such as 5-bromoraucil, and other commonly used chemical or physical mutation treatment methods.
돌연변이 처리에 사용되는 균주를 선별하는 방법의 예로는 배지 ㎖당 각각 AEC를 가하여 20㎎ 이상의 농도로 만들고, L-트레오닌을 가하여 1㎎의 농도로 만든 최소 한천 배지에 균주를 접종한 다음, 배지에서 생육한 균주를 수집하는 방법이 포함된다.An example of a method for screening strains used for mutation treatment is to inoculate a strain to at least 20 mg of AEC by adding AEC per ml of medium, and to a concentration of 1 mg by adding L-threonine, and then A method of collecting the grown strains is included.
본 발명은 이후에 보다 상세하게 설명될 것이다.The invention will be described in more detail later.
고농도의 AEC에 내성이 있는 균주인, 본 발명의 개량 균주를 수득하는 구체적인 방법 중의 하나는, εPL 생산 균주인 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 균주의 포자를 트리스-말레에이트 완충액(pH 6.0)에 현탁시키고, 생성된 현탁액에, NTG를 당해 완충액 ㎖당 1.5㎎의 농도가 되는 양으로 가하고, 포자와 NTG를 37℃에서 60분 동안 접촉시킨다. 생성된 포자를 원심분리로 수집하고, 인산염 완충액(0.05M, pH 7)으로 세척하고, 액체 영양 배지(글루코스: 5%, 황산암모늄: 1%, 효모 추출물: 0.5%, K2HPO4: 0.08%, KH2PO4: 0.136%, MgSO4·7H2O: 0.05%, ZnSO4·7H20: 0.004%, FeSO4·7H2O: 0.003%, pH 6.8, 여기서 %는 g/㎗를 의미한다)에서 밤새 배양한다. 배양 후, 생성된 세포는 원심분리에 의해 수집하고, 인산염 완충액(0.05M, pH 7)으로 세척하고, 배지 1ml를 기준으로 AEC 20㎎ 및 L-트레오닌 1ml를 각각 함유하는 최소 한천 배지(글루코스: 5%, 황산암모늄 1%, K2HPO4: 0.08%, KH2PO4: 0.136%, MgSO4·7H2O: 0.05%, ZnSO4·7H20: 0.004%, FeSO4·7H2O: 0.003%, pH 6.8, 한천: 1.5%, 여기서 %는 g/㎗를 의미한다)에 적용하고, 30℃에서 3일 내지 4일 동안 배양하고, 이어서 생육된 콜로니를 수집한다. 고농도의 AEC에 대해 내성있는 수득된 균주에 관하여 εPL의 생산성을 평가한 결과, 가장 높은 생산성을 나타내는 균주는 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) B21021[통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고), 국제 수탁 번호: FERM BP-5926, 부다페스트 조약하에 1997년 4월 18일자로 원 기탁(FERM P-15193, 원 기탁일: 1995년 9월 20일)에서 국제 기탁으로 이전됨] 균주이고, 이어서 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) B22107 및 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) B22201 균주이다.One specific method for obtaining the improved strain of the present invention, which is a strain resistant to high concentrations of AEC, is the spores of Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 strain, an εPL producing strain. Suspension in Tris-maleate buffer (pH 6.0) and to the resulting suspension are added NTG in an amount of 1.5 mg per ml of the buffer and contacting spores with NTG for 60 minutes at 37 ° C. The resulting spores were collected by centrifugation, washed with phosphate buffer (0.05M, pH 7), liquid nutrient medium (glucose: 5%, ammonium sulfate: 1%, yeast extract: 0.5%, K 2 HPO 4 : 0.08 %, KH 2 PO 4 : 0.136%, MgSO 4 · 7H 2 O: 0.05%, ZnSO 4 · 7H 2 0: 0.004%, FeSO 4 · 7H 2 O: 0.003%, pH 6.8, where% is g / ㎗ Incubate overnight). After incubation, the resulting cells are collected by centrifugation, washed with phosphate buffer (0.05M, pH 7) and minimal agar medium (glucose: 1 mg of AEC 20 mg and 1 ml of L-threonine, respectively) based on 1 ml of medium. 5%, ammonium sulfate 1%, K 2 HPO 4 : 0.08%, KH 2 PO 4 : 0.136%, MgSO 4 7H 2 O: 0.05%, ZnSO 4 7H 2 0: 0.004%, FeSO 4 7H 2 O : 0.003%, pH 6.8, agar: 1.5%, where% means g / dl), incubated at 30 ° C. for 3-4 days, and then grown colonies are collected. As a result of evaluating the productivity of εPL with respect to the obtained strains resistant to high concentrations of AEC, the highest yielding strain was Streptomyces albulus lysinopolymerus B21021 . Institute of Engineering and Technology (Hanshi 1-chome, 1st, Higashi, Tsukuba-shi, Japan), International Deposit No .: FERM BP-5926, won on April 18, 1997 under the Treaty of Budapest (FERM P-15193, date of deposit: Transferred to International Deposit on September 20, 1995], followed by Streptomyces albulus lysinopolymerus B22107 and Streptomyces albulus lysinopolymerus B22201 strain.
개량된 균주인 고농도-AEC-내성 균주의 AEC에 대한 내성은 다음과 같이 측정한다. AEC를 하기 표 1에 기술하는 바와 같은 농도로 가하고 L-트레오닌을 배지 ㎎당 1㎖의 양으로 가한 최소 한천 배지(상기한 바와 같음)에 각각의 내성 균주를 도포하고, 30℃에서 2 내지 7일 동안 배양한 다음, 생육을 육안으로 관찰함으로써 내성을 비교한다. 결과는 표 1에 나타내었다. 모 균주인 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) 11011A-1 균주는 5㎎/㎖ 농도의 AEC에서는 생육이 확인되지만 10㎎/㎖의 농도에서는 전혀 생육하지 않는 반면, 고농도 내성 균주인 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) B21021 균주는 심지어 40㎎/㎖의 AEC 농도에서도 생육이 확인된다. 본 발명에 따른 개량 균주는 고농도의 AEC에 대해 내성을 가지며, 이러한 측면에서 모 균주와 확실하게 구별될 수 있다.Resistance of the improved strain, high concentration-AEC-resistant strain, to AEC is measured as follows. AEC was added at the concentration as described in Table 1 below and each resistant strain was applied to at least agar medium (as described above) with L-threonine added in an amount of 1 ml per mg of medium, and 2 to 7 at 30 ° C. After incubation for 1 day, the growth is compared by visual observation of resistance. The results are shown in Table 1. The parent strain Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1 was found to grow in AEC at 5 mg / ml but did not grow at 10 mg / ml, but was highly resistant. The strain Streptomyces albulus lysinopolymerus B21021 strain was found to grow even at an AEC concentration of 40 mg / ml. The improved strains according to the invention are resistant to high concentrations of AEC and can be reliably distinguished from the parent strains in this respect.
주) +: 생육이 관찰됨Note) +: Growth is observed
-: 생육이 관찰되지 않음-: No growth observed
±: 경미한 생육이 관찰됨±: slight growth observed
균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스(Streptomyces albulus lysinopolymerus) B21021의 균학적인 특성은 다음과 같다:The bacteriological properties of the strain Streptomyces albulus lysinopolymerus B21021 are as follows:
(1) 형태학적 특성(1) morphological characteristics
① 포자형성 균사의 분지법 및 형태① Branching method and form of spore forming mycelia
단순 분지, 폐쇄 나선Simple basin, closed spiral
② 포자의 수: 수십개의 포자② Number of spores: dozens of spores
③ 포자의 표면 구조 및 크기③ Surface structure and size of spores
각각의 포자는 구형이거나 크기가 약 1.2 내지 1.5㎛인 달걀형이고, 가시(Spiny) 표면 구조를 갖는다.Each spore is spherical or egg-shaped, about 1.2-1.5 μm in size, and has a spiny surface structure.
④ 편모, 균핵 및 포자낭의 유무: 인지되지 않음④ The presence of flagella, fungal nucleus and spore sac: not recognized
⑤ 포자 끝의 접착 위치: 기체 균사상⑤ Splice end of spore tip: gas hyphae
(2) 각각의 배지의 배양 성상(2) Culture characteristics of each medium
표 2에서 나타낸 바와 같은 각각의 배지 상에서의 성상은 30℃에서 10일 내지 14일 동안 배양한 후에 관찰한 결과이다.The appearance on each medium as shown in Table 2 is the result observed after incubation for 10 to 14 days at 30 ℃.
(3) 생리학적인 특성(3) physiological characteristics
① 생육 온도 범위① Growth temperature range
약 15 내지 40℃, 최적 생육 온도: 약 30℃.About 15 to 40 ° C., optimum growth temperature: about 30 ° C.
② 젤라틴의 액화, 전분의 가수분해 및 탈지 우유의 펩톤화② Liquefaction of gelatin, hydrolysis of starch and peptonization of skim milk
각각 양성임.Each is positive.
③ 탈지 우유의 응고작용: 음성.③ coagulation of skim milk: negative.
④ 멜라닌형 색소의 형성④ Formation of melanin pigment
티로신 한천 배지에서 갈색 색소가 형성된다.Brown pigment is formed in tyrosine agar medium.
⑤ 세포벽의 조성⑤ Composition of cell wall
세포벽의 조성물중의 성분에서 디아미노피멜산 형태는 벡커(Becker) 등의 방법에 따른 분석의 결과로서 L,L 형으로 나타난다[참조 문헌: Applied Microbiology, Vol. 13, p. 236 (1965)].The diaminopimelic acid form in the components of the cell wall composition appears in L, L form as a result of analysis according to Becker et al. [Applied Microbiology, Vol. 13, p. 236 (1965).
(4) 탄소 공급원의 이용성[프리드햄-고틀리브(Pridham-Gottlieb) 한천 배지](4) Availability of Carbon Sources [Pridham-Gottlieb Agar Badges]
L-아라비노스 -L-Arabinose-
D-크실로스 -D-Xylose-
D-글루코스 +D-glucose +
D-프럭토스 +D-fructose +
L-람노스 -L-Rhamnose-
D-갈락토스 +D-galactose +
수크로스 -Sucrose-
라피노스 -Rafinos-
D-만니톨 +D-mannitol +
이노시톨 +Inositol +
살리신 +Raised +
+: 이용함, -: 이용하지 않음+: Used,-: not used
상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 개량 균주 중 하나인 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021은 모 균주인 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1과는 몇몇 균학적인 특성이 상이하다. 예를 들어, 탄소 공급원의 이용성과 관련하여, 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1은 살리신을 이용할 수 없지만 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021은 이용할 수 있다. 배양학적 특성과 관련하여, 회갈색의 기체 균사는 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1이 적용된 수크로스·니트레이트 한천 배지에서 형성되지만, 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021의 경우에는 형성되지 않는다. 흰색 기체 균사는 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1이 적용된 영양 한천 배지에서 풍부하게 형성되지만, 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021의 경우에는 기체 균사는 약간만 형성된다. 가용성 색소는 글루코스·아스파라긴 한천 배지 및 글리세롤·아스파라긴 한천 배지 둘다에서 관찰되지만, 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021의 경우에는 배지 둘다에서 관찰되지 않는다. 따라서, 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021은 또한 모 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1과 형태학적 특성면에서 분명하게 구별될 수 있다.As indicated above, one of the improved strains according to the present invention, the strain Streptomyces albulus lysinopolymerus B21021, is a few strains from the parent strain strain Streptomyces albulus lysinopolymerus 11011A-1. The characteristics are different. For example, with regard to the availability of a carbon source, strain Streptomyces Albulus lysinopolymers 11011A-1 cannot use salicycin, but strain Streptomyces Albulus lysinomeromer B21021 can be used. Regarding the culture characteristics, greyish brown gas hyphae is formed in sucrose-nitrate agar medium to which strain Streptomyces Albulus lysinopolymer 11011A-1 has been applied, but strain Streptomyces albulus lysinopolymerus It is not formed in case of B21021. White gas hyphae is abundantly formed in nutrient agar medium with strain Streptomyces Albulus lysinopolymer 11011A-1, but only slight gas hyphae is formed with strain Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021. . Soluble pigments are observed in both glucose-asparagine agar medium and glycerol-asparagine agar medium, but not both in the case of strain Streptomyces Albulus lysinopolymers B21021. Thus, strain Streptomyces Albulus lysinopolymers B21021 can also be clearly distinguished in terms of morphological characteristics from the parent strain Streptomyces Albulus lysinopolymers 11011A-1.
수득된 개량 균주로부터 εPL을 생산하는 경우, 개량 균주를 배지에 접종하고 배양한 다음, 이로써 생성되고 축적된 εPL을 배양액으로부터 분리시키고 정제시킨다. 배지로는, 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기물 및 기타 영양분을 적절한 양으로 포함하는 한 임의의 배지를 사용할 수 있다. 탄소 공급원으로서, 개량 균주에 의해 동화될 수 있는 것(예: 글루코스, 프럭토스, 글리세린 및 전분)이라면 제한없이 사용할 수 있다. 첨가되는 양은 바람직하게는 1 내지 5%이다(%는 g/㎗ %를 의미함). 질소 공급원으로는 임의의 펩톤, 카제인 가수분해물, 아미노산, 무기 암모늄염, 바람직하게는 황산암모늄 등을 사용할 수 있다. 질소 공급원은 바람직하게는 0.2 내지 2%(%는 g/㎗ %를 의미함)의 양으로 가한다. 배양 동안에, 탄소 공급원 및 질소 공급원은 연속적으로 가할 수 있다. 무기물의 예는 인산 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 망간 이온, 니켈 이온 및 황산 이온을 포함한다. 0.1 내지 0.5%(%는 g/㎗ %를 의미함)의 양으로 효모 추출물을 혼입시키는 것이 미생물의 생육을 증진시키고 εPL의 생산에 우수한 효과를 가져온다.When εPL is produced from the obtained improved strains, the improved strains are inoculated and cultured, and the resulting and accumulated εPLs are separated from the culture and purified. As the medium, any medium can be used as long as it contains an appropriate amount of carbon source, nitrogen source, minerals and other nutrients. As a carbon source, any one that can be assimilated by an improved strain (eg, glucose, fructose, glycerin and starch) can be used without limitation. The amount added is preferably 1 to 5% (% means g / dl%). As the nitrogen source, any peptone, casein hydrolyzate, amino acid, inorganic ammonium salt, preferably ammonium sulfate or the like can be used. The nitrogen source is preferably added in an amount of 0.2 to 2% (% means g / dl%). During the cultivation, the carbon source and nitrogen source can be added continuously. Examples of minerals include phosphate ions, potassium ions, sodium ions, magnesium ions, zinc ions, iron ions, manganese ions, nickel ions and sulfate ions. Incorporation of the yeast extract in an amount of 0.1 to 0.5% (% means g / dl%) enhances the growth of microorganisms and has an excellent effect on the production of εPL.
배양은 배양액을 진탕시키고 교반시킴으로써 호기성 조건하에 수행한다. 25 내지 35℃의 배양 온도가 바람직하다. 배지의 pH는 바람직하게는 중성(pH 6 내지 8)에 가깝지만, 배양이 시작된 후 미생물이 생육함에 따라 pH는 낮아진다. pH가 4까지 떨어지면, 알칼리를 가하여 pH를 4에서 유지시킨다. 첨가하는 알칼리로는 암모니아수가 바람직하지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 사용할 수도 있다. 일반적으로 1 내지 7일 내에 배양액중에서 εPL이 축적된다.Cultivation is carried out under aerobic conditions by shaking and agitating the culture. Incubation temperatures of 25 to 35 ° C are preferred. The pH of the medium is preferably close to neutral (pH 6-8), but the pH decreases as the microorganism grows after the incubation begins. When the pH drops to 4, alkali is added to maintain the pH at 4. As an alkali to add, although ammonia water is preferable, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. can also be used. In general, ε PL accumulates in the culture within 1 to 7 days.
원심분리 또는 여과에 의해 배양액으로부터 세포를 제거한 후, 잔류 용액을 정제시키고 탈색시키고 농축시킨다. 농축물로부터 아세톤 또는 에탄올과 같은 유기 용매 속에서 εPL을 결정화시킴으로써 이를 수득할 수 있다.After removing the cells from the culture by centrifugation or filtration, the remaining solution is purified, bleached and concentrated. This can be obtained by crystallizing [epsilon] PL from the concentrate in an organic solvent such as acetone or ethanol.
본 발명을 수행하는 최상의 형태Best Mode for Carrying Out the Invention
본 발명은 이후 보다 상세히 설명될 것이다.The invention will be described in more detail below.
배양액중의 εPL의 생산량은 이츠하키(Itzhaki) 등의 문헌에 기술되어 있는 방법에 따라 측정했다[참조 문헌: "Analytical Biochemistry, 50, 569 (1972)"]. 즉, 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액 2㎖(εPL: 0 내지 200㎍)를 1mM의 메틸 오렌지 수용액 2㎖와 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 정치시키고, 원심분리하여 생성된 εPL-메틸 오렌지 착물을 제거하고, 465㎚에서 상층액의 흡광도를 측정함으로써 배양액중의 εPL의 양을 측정한다.The production of [epsilon] PL in the culture was measured according to the method described in Itzhaki et al. (See "Analytical Biochemistry, 50, 569 (1972)"). That is, the culture solution was centrifuged to remove cells, and 2 ml of the supernatant (ε PL: 0 to 200 µg) was mixed with 2 ml of 1 mM methyl orange aqueous solution, the resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and centrifuged The amount of epsilon PL in the culture was measured by removing the generated epsilon PL-methyl orange complex and measuring the absorbance of the supernatant at 465 nm.
실시예 및 비교 실시예에서 "%"는 구체적으로 달리 나타내지 않는한 중량(g)/용적(㎗)%를 의미한다.In the examples and comparative examples "%" means weight (g) / volume% unless specifically indicated otherwise.
실시예 1Example 1
3ℓ 용적을 갖는 자(jar)에, 5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 1% 황산암모늄, 0.08% K2HPO4, 0.136% KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H20, 0.04% ZnSO4·7H2O 및 0.003% FeSO4·7H2O로 이루어지고 pH가 6.8인 배지 2ℓ를 충전시키고, 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주, 즉 본 발명에 따라 수득한 개량된 균주의 예비 배양액 100㎖를 배지에 접종시키고, 30℃ 및 700rpm에서 3ℓ/분의 통기량으로 72시간 동안 호기적으로 배양시켰다. 10% 암모니아수를 가하여 pH를 4로 유지시켰다. 글루코스 및 황산암모늄의 잔류 농도가 낮아지는 경우, 이들을 연속적으로 가했다.In a jar of 3 L volume, 5% glucose, 0.5% yeast extract, 1% ammonium sulfate, 0.08% K 2 HPO 4 , 0.136% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 7H 2 0, 0.04% ZnSO Filled with 2 L of medium with 4 · 7H 2 O and 0.003% FeSO 4 · 7H 2 O and having a pH of 6.8 and streptomyces albulus lysinopolymerus B21021 strain, ie the improved strain obtained according to the present invention 100 ml of the preculture was inoculated into the medium and incubated for 72 hours at 30 ° C. and 700 rpm with an aeration of 3 L / min. 10% aqueous ammonia was added to maintain the pH at 4. When the residual concentrations of glucose and ammonium sulfate became low, they were added continuously.
72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "글루코스 전환 효율(%)"은 (εPL 생산량/글루코스 소비량)×100으로 표현되는 값을 의미한다.The yield and glucose conversion efficiency of εPL after incubation for 72 hours are shown in Table 3. As used herein, the term “glucose conversion efficiency (%)” means a value expressed as (εPL production / glucose consumption) × 100.
실시예 2Example 2
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B22107 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정했다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.The culture was carried out in the same manner as described in Example 1, except that the Streptomyces Albulus lysinopolymer B22107 strain was used instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain, The amount of ε PL was measured. The yield and glucose conversion efficiency of εPL after incubation for 72 hours are shown in Table 3.
실시예 3Example 3
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B22201 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정했다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.The culture was carried out in the same manner as described in Example 1 except that the Streptomyces Albulus lysinopolymer B22201 strain was used instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain, The amount of ε PL was measured. The yield and glucose conversion efficiency of εPL after incubation for 72 hours are shown in Table 3.
비교 실시예 1Comparative Example 1
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1 균주, 즉 모 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행했다. 72시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 3에 나타내었다.Cultured in the same manner as described in Example 1 except for using the Streptomyces Albulus lysinopolymer 11011A-1 strain, ie the parent strain, instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain Was done. The yield and glucose conversion efficiency of εPL after incubation for 72 hours are shown in Table 3.
실시예 4Example 4
3ℓ 용적을 갖는 자에, 5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 1% 황산암모늄, 0.08% K2HPO4, 0.136% KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H20, 0.04% ZnSO4·7H2O 및 0.003% FeSO4·7H2O로 이루어지고 pH가 6.8인 배지 2ℓ를 충전시켰다. 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주, 즉 본 발명에 따라 수득한 개량된 균주의 예비 배양액 100㎖를 배지에 접종시키고, 30℃ 및 700rpm에서 3ℓ/분의 통기량으로 168시간 동안 호기적으로 배양시켰다. 10% 암모니아수를 가하여 pH를 4로 유지시켰다. 글루코스 및 황산암모늄의 잔류 농도가 낮아지는 경우, 이들을 연속적으로 가했다.To a 3 liter volume, 5% glucose, 0.5% yeast extract, 1% ammonium sulfate, 0.08% K 2 HPO 4 , 0.136% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 7H 2 0, 0.04% ZnSO 4 2 L of medium consisting of 2O and 0.003% FeSO 4 .7H 2 O and having a pH of 6.8 were charged. 100 ml of pre-culture of Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain, i.e., the improved strain obtained according to the present invention, was inoculated into the medium and treated for 168 hours at a flow rate of 3 l / min at 30 ° C and 700 rpm. Cultured by miracles. 10% aqueous ammonia was added to maintain the pH at 4. When the residual concentrations of glucose and ammonium sulfate became low, they were added continuously.
168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.The yield and glucose conversion efficiency of ε PL after incubation for 168 hours are shown in Table 4.
실시예 5Example 5
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B22107 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정했다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.The culture was carried out in the same manner as described in Example 4, except that the Streptomyces Albulus lysinopolymer B22107 strain was used instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain, The amount of ε PL was measured. The yield and glucose conversion efficiency of ε PL after incubation for 168 hours are shown in Table 4.
실시예 6Example 6
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B22201 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행하고, 배양액중의 εPL의 양을 측정했다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.The culture was carried out in the same manner as described in Example 4 except for using the Streptomyces Albulus lysinopolymer B22201 strain instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain, The amount of ε PL was measured. The yield and glucose conversion efficiency of ε PL after incubation for 168 hours are shown in Table 4.
비교 실시예 2Comparative Example 2
스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주 대신에 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1 균주, 즉 모 균주를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 배양을 수행했다. 168시간 동안 배양한 후의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율은 표 4에 나타내었다.Cultured in the same manner as described in Example 4 except for using the Streptomyces Albulus lysinopolymer 11011A-1 strain, ie the parent strain, instead of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain Was done. The yield and glucose conversion efficiency of ε PL after incubation for 168 hours are shown in Table 4.
실시예 7Example 7
168시간 동안 배양함으로써 실시예 4에서 수득한 배양액을 원심분리하여 세포를 제거한 다음, pH를 7.5로 조정했다. 이어서, 잔사를 IRC-50(양이온 교환 수지), IRA-402(음이온 교환 수지) 및 XT-1006(양이온 교환 수지)을 각각 사용하여 분리시키고 정제시킨 다음, 역삼투막(RO)을 통해 농축시켜 εPL을 수득했다. εPL의 수율은 표 5에 나타내었다.The culture obtained in Example 4 was centrifuged to remove cells by incubation for 168 hours, and then the pH was adjusted to 7.5. The residue was then separated and purified using IRC-50 (Cation Exchange Resin), IRA-402 (Anion Exchange Resin) and XT-1006 (Cation Exchange Resin), respectively, and then concentrated through reverse osmosis membrane (RO) to obtain εPL. Obtained. The yield of εPL is shown in Table 5.
비교 실시예 3Comparative Example 3
168시간 동안 배양함으로써 비교 실시예 2에서 수득한 배양액을 실시예 7에서와 같이 원심분리하여 세포를 제거한 다음, pH를 7.5로 조정했다. 이어서, 잔사를 IRC-50(양이온 교환 수지), IRA-402(음이온 교환 수지) 및 XT-1006(양이온 교환 수지)을 각각 사용하여 분리시키고 정제시킨 다음, 역삼투막(RO)을 통해 농축시켜 εPL을 수득했다. εPL의 수율은 표 5에 나타내었다.The culture obtained in Comparative Example 2 was centrifuged as in Example 7 to remove cells by culturing for 168 hours, and then the pH was adjusted to 7.5. The residue was then separated and purified using IRC-50 (Cation Exchange Resin), IRA-402 (Anion Exchange Resin) and XT-1006 (Cation Exchange Resin), respectively, and then concentrated through reverse osmosis membrane (RO) to obtain εPL. Obtained. The yield of εPL is shown in Table 5.
표 3, 4 및 5의 결과로부터 명백한 바와 같이, 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 B21021 균주의 εPL의 생산량 및 글루코스 전환 효율 둘다가 균주 스트렙토마이세스 알불러스 라이시노폴리메러스 11011A-1과 비교시 현저하게 증가된 것으로 나타났다.As is evident from the results of Tables 3, 4 and 5, both the production and glucose conversion efficiency of εPL of the Streptomyces Albulus lysinopolymer B21021 strain were determined by the strain Streptomyces Albulus lysinopolymer 11011A-1 It was found to be significantly increased in comparison.
본 발명의 고농도의 AEC에 대해 내성이 있는 개량 균주는 고수율로 εPL을 생산할 수 있는 능력을 가지며, 당해 εPL 생산 균주를 사용하여 고생산성 및 고수율로 εPL을 제조할 수 있다.The improved strain resistant to the high concentration of AEC of the present invention has the ability to produce εPL in high yield, and can be produced εPL in high productivity and high yield using the εPL producing strain.
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