KR100433280B1

KR100433280B1 - 돼지정자 동결용 희석액 및 돼지정자 동결정액 제조방법

Info

Publication number: KR100433280B1
Application number: KR10-2000-0055634A
Authority: KR
Inventors: 박창식; 이영주; 임기순; 천용민
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2004-05-31
Also published as: KR20020023001A

Abstract

동결정액의 운동성과 정상첨체비율을 개선하여 실용화를 이룰 수 있도록, 100㎖를 기준으로 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, N-아세틸-D-글루코사민 0.01∼1.5g, 나머지 증류수를 포함하는 돼지정자 동결용 희석액을 제공한다.

또 100㎖를 기준으로 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, 글리세롤 4%, 오이피 1.0%, N-아세틸-D-글루코사민 0∼0.05g, 나머지 증류수를 포함하는 돼지정자 동결용 희석액을 제공한다.

그리고 농후정액을 실온에서 서서히 냉각시키고, 15㎖ 튜브에 정자의 최종 농도가 10×10⁸/㎖로 되도록 11㎖의 농후정액을 취하여 원심분리하는 것에 의하여 정장을 제거하고, 락토스 수화물, 난황, N-아세틸-D-글루코사민에 증류수를 가하여 만든 1차 희석액을 사용하여 5.5㎖로 되도록 재부유시키고, 5℃에서 120분 보관한 다음, 락토스 수화물, 난황, 글리세롤, 오이피, N-아세틸-D-글루코사민에 증류수를 가하여 만든 2차 희석액 5.5㎖로 2차 희석하여 11㎖로 만들고, 이를 스트로에 나누어 주입 및 봉인하고, 스트로를 공기층을 가운데로 오게한 상태로 수평으로 적재하여 5℃에서 글리세롤 평형을 실시하고, 액체질소에서 5㎝ 떨어진 곳에서 동결시키는 공정으로 이루어지는 돼지정자 동결정액 제조방법을 제공한다.

Description

돼지정자 동결용 희석액 및 돼지정자 동결정액 제조방법{Diluent for Boar Sperm Freezing}

본 발명은 돼지정자 동결용 희석액 및 돼지정자 동결정액 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수용성 키틴(chitin)인 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)을 첨가하는 것에 의하여 돼지정자를 동결하고 이를 융해하는 경우에 정자의 생존성과 정자운동성을 향상시키는 돼지정자 동결용 희석액 및 이를 이용한 돼지정자 동결정액 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 가축의 인공수정은 사람이 기계적으로 추출한 정액을 액상정액 또는 동결정액 상태로 보관하였다가 필요할 때에 이를 이용하여 수정을 행하는 방식이다.

상기에서 동결정액은 가축으로부터 추출한 정액을 동결시켜 보관하고 필요할 때에 이를 융해시켜 사용하는 것을 말한다.

최근에는 장기간 정액을 보관할 수 있기 때문에 동결정액에 대한 연구와 개발이 많이 이루어지고 있다.

상기한 동결정액은 종모돈으로부터 분리 채취한 농후정액(sperm-rich fraction)을 희석액으로 희석시킨 다음, 스트로(straw)에 주입하고 봉인하여 액체질소를 이용하여 동결시켜 보관한다.

상기와 같이 스트로에 동결시켜 보관중인 동결정액은 융해하였을 때 정자의 운동성과 정상첨체비율이 좋을수록 인공수정의 성공가능성이 높다.

따라서 상기한 희석액은 인공수정이 가능한 범위안에서 동결-융해후 정자의 운동성과 정상첨체비율을 확보할 수 있도록 선택하여야 한다.

국내에서는 현재까지 동결정액에 관한 연구가 미비한 실정이고 발표된 논문도 매우 적다.

국내에서 발표된 논문중에서 김 등이 1975년에 발표한 논문(Kim, J.K., G.S. Suh, W.J. Shin, K.S. Im, D.S. Sul and Y.B. Lee. 1975. Effects of freezing processes of boar semen on motility of spermatozoa and conception rate. The Research Reports of ORD, 17:11∼20)에 의하면 티씨에프지(TCFG) 희석액을 이용하여 0.5㎖ 및 1㎖ 스트로와 앰플을 액체질소 표면에서 2∼3㎝ 떨어진 곳에서 동결하여 액체질소통에 보관한 다음, 동결-융해후의 정자운동성은 24%였다.

상기에서 티씨에프지 희석액의 주요 성분은 100㎖를 기준으로 트리스-아미노메탄(tris-aminomethane) 0.2M, 트리스-아미노메탄의 PH를 7.0으로 적정하기 위한 구연산(citric acid), 과당(fructose) 1.5중량%, 글루코스(glucose) 1.5중량%, 글리신(glycine) 0.47중량%, 카탈라제(catalase) 0.2중량%, 난황(egg yolk) 20중량%, 나머지 증류수이다.

또 퍼셀과 박이 1987년에 발표한 논문(Pursel, V.G. and C.S. Park. 1987. Duration of thawing on post thaw acrosome morphology and motility of boar spermatozoa frozen in 5㎖ maxi-straws. Theriogenology. 28(5):683∼690)에 의하면 락토스-난황 희석액(LEY diluent:Lactose-Egg yolk diluent)을 이용하여 5㎖ 스트로에 동결-융해후 정상첨체비율을 51%, 정자운동성은 37%였다.

상기에서 락토스-난황 희석액의 주요 성분은 100㎖를 기준으로 락토스(lactose) 11.0g, 난황 25.0㎖, 나머지 증류수이다.

그리고 김 등이 1989년에 발표한 논문(Kim, H.K., M.S. Ko, I.C. Kim, H.K. Chung, K.W. Lee, D.S. Son, H. Kim, S.H. Chee and C.S. Park. 1989. Deep freezing of boar semen in liquid nitrogen container. Korean J. Animal Sci., 31(2):155∼157)에 의하면 락토스-난황 희석액을 이용하여 5㎖ 스트로에 동결-융해후 정상첨체비율은 50∼56%, 정자운동성은 49∼57%였다.

또 프램즐 등의 논문(Premzl, B., M.H. Pavuna, R. Sci, M. Sukalic and M. Torre. 1983. Procjena valjanosti duboko amrznute sperme nerastova obzirom na promjene na akrosomima. Stocarstvo. 37:219∼221)에 의하면 동결정액의 융해후 정자운동성과 정상첨체비율이 각각 20%, 30%이면 인공수정이 가능하다.

그리고 현재 세계적으로 펠레트(pellet) 동결정액 제조를 위해서는 비에프파이브(BF₅) 희석액, 스트로 동결정액 제조를 위해서는 락토스-난황 희석액이 상업적으로 사용된다.

상기에서 펠레트 동결정액 제조를 위해 주로 사용되는 비에프파이브 희석액의 성분은 1차 희석액이 100㎖를 기준으로 글루코스 3.2g, 티이에스(TES) 1.2g, 트리스(Tris) 0.2g, 난황 20㎖, 나머지 증류수이고, 2차 희석액이 1차 희석액 성분에글리세롤 3중량%, 오이피(OEP:Orvus Es Paste) 1.0중량%를 더 포함한다.

또 스트로 동결정액 제조를 위해 주로 사용되는 락토스-난황 희석액의 성분은 1차 희석액이 100㎖를 기준으로 락토스 수화물(Lactose hydrate) 11.0g, 난황 20㎖, 나머지 증류수이고, 2차 희석액이 1차 희석액에 글리세롤 6중량%, 오이피 1.0중량%를 더 포함한다.

그러나 최근에는 펠레트 동결정액은 개체의 식별이 어렵고, 표면에 세균의 오염을 막기가 어려울 뿐만아니라, 취급이 불편하여 상업적으로 거의 이용되고 있지 않다.

그리고 동결정액이 액상정액처럼 실용화되기 위해서는 새로운 희석액과 동결방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 동결정액의 정자운동성과 정상첨체비율을 개선하여 동결정액의 실용화를 이룰 수 있는 새로운 방법의 돼지정자 동결용 희석액 및 이를 이용한 돼지정자 동결정액 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 제안하는 돼지정자 동결용 희석액은 100㎖를 기준으로 락토스 수화물(Lactose hydrate) 11g, 난황(egg yolk) 20㎖, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0.01∼1.5g, 나머지 증류수를 포함한다.

또 본 발명이 제안하는 돼지정자 동결용 희석액은 100㎖를 기준으로 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, 글리세롤(glycerol) 4중량%, 오이피(OEP:Orvul Es Paste) 1.0중량%, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0∼0.05g(더 구체적으로는 0.025~0.05g을 사용할 수 있음), 나머지 증류수를 포함한다.

상기에서 글리세롤과 오이피가 포함된 것은 2차 희석액으로 글리세롤과 오이피가 포함되지 않은 것은 1차 희석액으로 사용한다.

그리고 본 발명이 제안하는 돼지정자 동결정액 제조방법은 가축으로부터 분리 채취한 농후정액(sperm-rich fraction)을 실온에서 대략 90∼150분 정도 서서히 냉각시키고, 15㎖ 튜브(tube)에 정자의 최종 농도가 대략 10×10⁸/㎖ 정도로 되도록 11㎖의 농후정액을 취하여 1,500rpm으로 대략 5∼15분 정도 원심분리하는 것에 의하여 정장을 제거하고, 정장을 제거한 정액을 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, N-아세틸-D-글루코사민 0.01∼1.5g에 증류수를 가하여 100㎖로 만든 1차 희석액을 사용하여 5.5㎖로 되도록 재부유시키고, 재부유시킨 1차 희석정액을 대략 4∼6℃ 정도의 냉장실에서 대략 90∼150분 정도 보관한 다음, 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, 글리세롤 4중량%, 오이피 1.0중량%, N-아세틸-D-글루코사민 0∼0.05g(더 구체적으로는 0.025~0.05g을 사용할 수 있음)에 증류수를 가하여 100㎖로 만든 2차 희석액 5.5㎖를 사용하여 1차 희석정액을 2차 희석하여 11㎖로 만들고, 2차 희석정액을 소정의 양씩 스트로(straw)에 나누어 주입 및 봉인하고, 스트로를 공기층을 가운데로 오게한 상태로 수평으로 선반에 적재하여 대략 4∼6℃ 정도의 냉장실에서 대략 150∼210분 정도 글리세롤 평형을 실시하고, 글리세롤 평형이 끝난 스트로를 액체질소 표면에서 5㎝ 떨어진 곳에 수평으로 놓아 대략 20분간 동결시키는 공정으로 이루어진다.

상기와 같이 제조된 동결정액은 대략 영하 196℃ 정도의 액체질소통에 보관하고, 필요시에는 스트로를 52℃의 수조에서 45초 융해한 다음 사용한다.

다음으로 상기와 같이 이루어지는 돼지정자 동결용 희석액을 이용하여 돼지정자를 동결-용해후 정상첨체비율과 운동성을 검정하였다.

먼저 N-아세틸-D-글루코사민 농도에 의한 영향을 알아 보기 위하여 100㎖ 중에 N-아세틸-D-글루코사민을 각각 0g, 0.05g, 0.1g, 0.5g, 1.0g씩 포함하는 본 발명에 따른 돼지정자 동결용 희석액을 1차 희석액으로 사용하여 돼지정자를 동결-용해후 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의 표 1에 나타낸다.

N-아세틸-D-글루코사민의 첨가량 (g)	0	0.05	0.1	0.5	1.0
정상첨체비율 (%)	44.8^b	72.8^a	63.8^ab	57.8^ab	56.8^ab
운동성 (%)	56.3^ab	66.3^a	63.8^a	53.3^ab	47.5^b

상기한 표1에서 위첨자로 나타낸 알파벳문자는 동일한 행에서 동일한 문자로 표시(예를 들면 a 또는 ab 등)하는 경우 평균간에 0.05%수준에서 유의성이 인정되는 것을 의미한다(이하 같다).

상기한 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상첨체비율은 N-아세틸-D-글루코사민을 0.05g 첨가하였을 때 가장 좋고, 첨가량을 증가시킬수록 점점 낮아지지만 1.0g을 첨가한 경우에도 첨가하지 않은 경우보다 좋다.

그리고 운동성은 N-아세틸-D-글루코사민을 0.05g 첨가하였을 때 가장 좋고,첨가량을 증가시킬수록 점점 낮아져 0.5g 이상을 첨가하면 첨가하지 않은 경우보다 더 낮아진다.

따라서 1차 희석액의 경우에는 N-아세틸-D-글루코사민의 첨가량을 0.05g으로 하는 것이 정상첨체비율과 운동성이 가장 우수하므로 바람직하다.

그리고 N-아세틸-D-글루코사민의 첨가량을 0 이상 0.5g 미만으로 유지하는 것이 정상첨체비율과 운동성 모두를 고려할 때 바람직하다.

또 N-아세틸-D-글루코사민을 1차 희석액과 2차 희석액에 각각 다른 방식으로 첨가하여 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의 표 2에 나타낸다.

1차 희석액의N-아세틸-D-글루코사민 첨가량 (g)	0	0.05	0	0.025	0.05
2차 희석액의N-아세틸-D-글루코사민 첨가량 (g)	0	0	0.05	0.025	0.05
정상첨체비율 (%)	37.3^b	56.8^a	44.3^b	58.0^a	55.3^a
운동성 (%)	53.3^b	66.3^ab	57.5^cd	68.3^a	61.3^bc

상기한 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 1차 희석액과 2차 희석액에 N-아세틸-D-글루코사민의 첨가량을 0.025g으로 하여 동결-융해한 경우가 정상첨체비율과 운동성 모두 가장 향상되며, 2차 희석액에만 0.05g의 N-아세틸-D-글루코사민을 첨가한 경우에는 그다지 효과가 없었다.

따라서 2차 희석액에 N-아세틸-D-글루코사민을 첨가하는 경우에는 첨가량을 0.05g 미만으로 유지하는 것이 바람직하다.

또 난황의 농도가 정상첨체비율과 운동성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 N-아세틸-D-글루코사민을 0.05g 첨가한 1차 희석액을 사용하고 난황의 최종 농도가 0%, 5중량%, 10중량%, 15중량%, 20중량%, 25중량%로 되도록 난황의 첨가량을 다르게 하여 돼지정자를 동결-융해한 다음 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의표 3에 나타낸다.

난황의 최종 농도 (%)	0	5	10	15	20	25
정상첨체비율 (%)	0.0^d	27.0^c	48.1^b	50.5^b	61.6^a	46.9^b
운동성 (%)	0.0^d	31.9^c	45.6^bc	58.8^ab	63.8^a	56.3^ab

상기한 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 난황의 최종 농도가 증가하여 20중량%가 될때까지 정상첨체비율과 운동성이 향상되지만 25중량%에서는 다시 감소한다.

따라서 난황의 첨가량은 최종 농도가 대략 15∼25중량% 정도 되도록 유지하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 난황의 최종 농도가 20중량% 정도 되도록 난황의 첨가량을 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 1차 희석액 100㎖ 중에 난황이 20㎖ 포함되도록 첨가하고, 2차 희석액 100㎖ 중에 난황이 20㎖ 포함되도록 첨가하는 것에 의하여 최종 농도가 20중량%를 유지하도록 구성한다.

그리고 2차 희석액 중 오이피(OEP)의 첨가량이 정상첨체비율과 운동성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 오이피의 농도가 0%, 1중량%, 2중량%, 3중량%, 5중량%로 되도록 오이피의 첨가량을 다르게 하여 동결-융해한 다음, 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의 표 4에 나타낸다.

오이피의 농도 (%)	0	1	2	3	5
정상첨체비율 (%)	18.2^d	59.7^a	48.2^b	36.3^c	13.2^d
운동성 (%)	10.8^c	57.5^a	41.2^b	41.7^b	4.2^c

상기한 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 2차 희석액 중의 오이피 농도가 1중량%일 때 정상첨체비율과 운동성이 가장 좋고, 오이피의 농도가 1중량% 이상으로 증가될수록 감소한다.

따라서 오이피의 첨가량은 대략 1중량% 정도 되도록 유지하는 것이 바람직하고, 0.5∼3중량%의 범위에서 선정하는 것도 가능하다.

본 발명에서는 2차 희석액 100㎖ 중에 오이피가 1㎖ 포함되도록 첨가한다.

또 글리세롤의 농도가 정상첨체비율과 운동성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 글리세롤의 최종 농도가 0%, 1중량%, 2중량%, 3중량%, 4중량%, 5중량%로 되도록 첨가량을 다르게 하여 동결-용해후 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의 표 5에 나타낸다.

글리세롤의 최종 농도 (%)	0	1	2	3	4	5
정상첨체비율 (%)	48.6^b	59.8^a	62.9^a	60.3^a	45.8^b	45.0^b
운동성 (%)	46.3^b	58.8^ab	63.8^a	61.3^a	61.9^a	64.4^a

상기한 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 글리세롤의 최종 농도가 2중량%일 때 정상첨체비율과 운동성이 가장 좋고, 글리세롤의 최종 농도가 4중량% 이상으로 증가될수록 감소한다.

따라서 글리세롤의 최종 농도가 대략 1∼3중량% 정도 유지되도록 글리세롤을 첨가하는 것이 바람직하고, 글리세롤이 1차 희석액에는 포함되지 않고 2차 희석액에만 포함되므로 2차 희석액 100㎖ 중에 포함되는 글리세롤의 첨가량은 대략 2∼6㎖의 범위에서 선정하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 2차 희석액 100㎖ 중에 글리세롤이 4㎖ 포함되도록 첨가하여최종 농도가 2중량%로 되도록 한다.

그리고 글리세롤의 평형 시간이 정상첨체비율과 운동성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 글리세롤의 평형 시간을 0, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간으로 다르게 하여 동결-용해후 정상첨체비율과 운동성을 검정하여 다음의 표 6에 나타낸다.

글리세롤의 평형 시간 (시간)	0	1	2	3	4	5
정상첨체비율 (%)	44.8^c	66.8^a	66.5^a	69.3^a	59.0^ab	48.0^bc
운동성 (%)	53.8^b	58.8^ab	60.0^ab	65.0^a	60.0^ab	60.0^ab

상기한 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 글리세롤의 평형 시간이 3시간일 때 정상첨체비율과 운동성이 가장 좋고, 글리세롤의 평형 시간이 길어질수록 정상첨체비율은 점진적으로 감소하지만 운동성은 크게 변화되지 않는다.

따라서 글리세롤의 평형 시간을 대략 1∼4시간 정도로 유지하는 것이 바람직하고, 3시간으로 유지하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서는 글리세롤의 평형 시간을 150∼210분으로 설정하여, 대략 2시간 30분에서 3시간 30분 사이에서 설정한다.

상기에서는 본 발명에 따른 돼지정자 동결용 희석액을 돼지정자의 동결정액을 제조하기 위하여 사용하는 것으로 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 소나 닭 등의 다른 가축의 동결정액을 제조하는 데 사용하는 것도 가능하다.

상기에서는 본 발명에 따른 돼지정자 동결용 희석액의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명의 범위 안에서 여러가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다.

상기와 같이 이루어지는 본 발명에 따른 돼지정자 동결용 희석액에 의하면, 종래의 락토스-난황 희석액에 수용성 키틴인 N-아세틸-D-글루코사민을 첨가하는 것에 의하여 정상첨체비율과 운동성을 크게 향상시키는 것이 가능하다.

그리고 본 발명에 따른 돼지정자 동결정액 제조방법에 의하면, 수용성 키틴인 N-아세틸-D-글루코사민을 첨가하는 희석액을 사용할 때에 가장 적당한 동결방법을 제공하여 정상첨체비율과 운동성을 향상시키는 효과를 극대화한다.

따라서 본 발명에 따른 돼지정자 동결용 희석액을 사용하면, 인공수정의 성공율을 높일 수 있으며 실용화에 큰 진전을 볼 수 있다.

Claims

100㎖를 기준으로 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, N-아세틸-D-글루코사민 0.01∼1.5g, 나머지 증류수를 포함하는 돼지정자 동결용 희석액.

100㎖를 기준으로 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, 글리세롤 4중량%, 오이피 1.0중량%, N-아세틸-D-글루코사민 0.025~0.05g, 나머지 증류수를 포함하는 돼지정자 동결용 희석액.

가축으로부터 분리 채취한 농후정액을 실온에서 90∼150분 서서히 냉각시키고,

15㎖ 튜브에 정자의 최종 농도가 대략 10×10⁸/㎖ 정도로 되도록 11㎖의 농후정액을 취하여 1,500rpm으로 5∼15분 원심분리하는 것에 의하여 정장을 제거하고,

정장을 제거한 정액을 락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, N-아세틸-D-글루코사민 0.01∼1.5g에 증류수를 가하여 100㎖로 만든 1차 희석액을 사용하여 5.5㎖로 되도록 재부유시키고,

재부유시킨 1차 희석정액을 4∼6℃의 냉장실에서 90∼150분 보관하고,

락토스 수화물 11g, 난황 20㎖, 글리세롤 4중량%, 오이피 1.0중량%, N-아세틸-D-글루코사민 0.025~0.05g에 증류수를 가하여 100㎖로 만든 2차 희석액 5.5㎖를 사용하여 1차 희석정액을 2차 희석하여 11㎖로 만들고,

2차 희석정액을 소정의 양씩 스트로에 나누어 주입 및 봉인하고,

스트로를 공기층을 가운데로 오게한 상태로 수평으로 선반에 적재하여 4∼6℃의 냉장실에서 150∼210분 글리세롤 평형을 실시하고,

글리세롤 평형이 끝난 스트로를 액체질소 표면에서 5㎝ 떨어진 곳에 수평으로 놓아 20분간 동결시키는 공정으로 이루어지는 돼지정자 동결정액 제조방법.