KR100432851B1 - 인슐린-분비세포주,그의제조방법및용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학, 특히 세포생물학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 정상적인 β세포에 필적할만한 수준으로 글루코키나제 및 글루코스 담체 글루트(Glut) 2를 발현시킬 수 있고, 유전자 조작에 의해 IGF II-발현 의존 증식을 할 수 없는, β-세포주(INS-I)라고 표기되는 신규한 글루코스-민감성 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 신규한 세포주의 제조방법, 그의 가섬 형태의 응집방법, 생물학적으로 적합한 하이드로겔에서의 고정화 방법, 경화 용액에 의한 경화 방법 및 인슐린-분비 β세포 이식물에의 응용에 관한 것이다.

Description

인슐린-분비 세포주, 그의 제조방법 및 용도

본 발명은 생물학, 특히 세포생물학 분야에 관한 것이다.

본 발명은 특히 신규한 세포주에 관한 것이며, 상기 신규한 세포주는 인간 기관에 이식되어 그 세포주가 정상적으로 배양물내에서 발현하는 생물학적 산물을 발현하도록 할 수 있다.

본 발명은 구제척으로는 주요 성질이 글루코스에 대한 민간성인 β-세포주(INS-I)라고 표기되는 신규한 글루코스-민감성 세포주에 관한 것이다. 이 세포는 인슐린 함량이 높고, 정상적인 β-세포에 필적할만한 수준으로 글루코키나제 및 글루코스 담체 글루트(Glut) 2를 발현시킬 수 있음을 특징으로 하며, 이들 세포는 유전공학적으로 비증식적이도록 제조될 수 있다.

그러므로, 상기 세포주는 인슐린-결핍 환자의 기관에 이식될 수 있고 인슐린-결핍 당뇨병의 경우 혈당증의 "생리학적" 조절을 제공할 수 있다.

기관 이식 또는 조직 이식은 많은 질환의 치료 방법의 일부이다. 보다 최근에는, 현재까지 치료하지 못했던 질환의 치료가 유전공학적 방법으로 인해 가능하게 되고 있다.

그러므로, 진성 당뇨병의 치료를 위해 이식 방법과 유전학적 치료법을 병행하는 연구 과제가 제안된다. 실제로, 본 출원인은 β-세포주인 INS-I주를 제조하였다. 상기 세포주는 글루코스의 생리학적 농도에 반응하여 인슐린을 분비하며, 유전공학적 조작을 거친후, 이식에 사용될 수 있고 인슐린-결핍 당뇨병에서의 혈당증의 "생리학적" 조절에 사용될 수 있다.

지난 10년간 이루어진 치료 노력에도 불구하고, 당뇨병의 치료는 매우 불만족스럽다. 이러한 이유 때문에 신규한 치료 방법들이 개발되었으며, 췌장 또는 세포덩어리(islet)의 이식이 그 방법의 일부이다(Hellerstrom C, Andersson A, Groth C-G, Sandler S, Jansson L, Korsgren O, Swenne I, Petersson B, Tollemar J, Tydn G - Diabetes Care 11(Suppl. 1) 45-53 1988)(Pipelleers DG, Pipelleers-Marichal M, Hannaert J-C, Berghmans M, In't Veld PA, Rozin J, Van de Winkel M, Gepts W - Diabetes 40:908-919 1991). 세계적으로 수천개 이상의 전췌장 이식 및 수십개의 세포덩어리 이식이 행해져 왔다. 이러한 신뢰할만하나 성가신 방법은 면역학적 및 논리학적인 두가지 유형의 문제점을 야기시킨다.

각 유형의 이식법에 고유한 문제점인 내성 문제외에도, 당뇨병은 자가면역질환이며, 당뇨병 피이식자가 이식된 β-세포를 파괴시킬 가능성을 갖는다는 것을 상기해야 한다. 따라서 이식법과 함께 면역억제 치료법의 병행이 절대적으로 필요하다. 상기 면역억제 치료법을 사용하지 않기 위해서, 어떤 저자들은 캡슐화된 세포덩어리의 이식법을 제안한다(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE-Science 254:1782-1784 1991)(Chicheportich D, Reach G-Diabetologia 31:54-57 1988). 상기 보호법, 특히 캡슐화의 본질적인 장점은 이식된 조직을 면역계의 공격으로부터 보호할 수 있다는 것이다. 그러나, 세포덩어리의 이용가능성이낮기 때문에 치료목적에 충분한 양의 세포덩어리를 제조하는 것이 어렵다. 따라서, 지난 10년간 인슐린 분비 및 당뇨병의 연구 모델로서 β-세포주를 제조하는데 막대한 노력이 기울여져 왔다. 이들 세포주 대부분은 그들의 본질적인 β-세포주의 기능, 즉 글루코스에 감응하여 인슐린을 분비하는 기능을 상실하며, 이러한 상실은 계대 배양 및 후속 세포 주기중에 일어난다. 그러므로, 본 출원인은 정상 β-세포의 특성과 매우 유사한 특성을 갖는, 고도로 분화된 β-세포주(INS-I)를 제조할 수 있었고(Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB-Endocrinology 130:167-178 1992), 이는 본 발명의 핵심을 이룬다.

상기 세포의 주목할만한 성질중에서 특히 고함량의 인슐린, 정상 β-세포와 필적할만한 수준의 글루코키나제 및 글루코스 담체 글루트 2의 발현성, 및 생리학적 농도의 성장 호르몬, 프롤락틴 IGF-I 및 IGF-II와 같은 분화 또는 성장 인자에 대한 반응성을 언급할 수 있다. 상기 세포의 본질적인 장점은 주로 그의 글루코스에 대한 민감성이다. 본 출원인은 글루코스 농도를 3mM에서 20mM으로 증가시키면 cAMP의 세포간 농도를 증가시키는 물질의 존재하에 INS-I 세포의 인슐린 분비가 4배 증가된다는 것을 이미 밝힌 바 있다.

최근에는 또한, 상기 세포를 생리학적 농도의 글루코스와 함께 배양시키면(5mM에서 48시간동안) 글루코스 농도의 변화에 더욱 민감하게 된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 특성 때문에 상기 세포는 생물학적으로 적합한 캡슐의 형태로 당뇨병 환자의 이종이식에 가장 적당한 후보가 된다.

그러나, 이식전에 상기 세포를 비증식성으로 만드는 것이 중요하다. 실제로,조절할 수 없을 정도의 성장을 피하고자 하거나, 보호 캡슐의 파괴를 막고자 할때는 증식을 반드시 억제할 필요가 있다. 이는 세포 증식에 (직접적 또는 간접적으로) 연관되는 유전자를 파괴시킴으로써 수행된다. 최근에는 IGF-II가 상기 세포에서 다량 발현됨이 밝혀졌다. IGF-II는 본질적으로 자가분비 방식으로 세포 성장을 조절하는 성장 인자이다. 따라서, 후술될 최근 결과에 근거하여, IGF-II는 상기 세포의 조절할 수 없을 정도의 성장에 연관되므로, (IGF-II 유전자를 파괴시킴으로써) IGF-II 유전자 발현을 억제하여 세포 증식을 억제할 수 있거나 상당히 감소시킬 수 있다고 생각할 수 있다. 이러한 유전공학적 조작에 의해서 INS-I 세포를 캡슐화 및 이식에 적합화시킴으로써 췌장 세포덩어리의 이식 및 제조에서 일어나는 임의의 복잡성 및 난점을 방지할 수 있다.

마지막으로, 일반적으로 유전학적으로 변형되고 혈청의 부재하에서 배양되는 β-세포의 증식은 세포가 결합 단백질 IGFBP-3의 존재하에서 배양될때 상당히 감소된다(Gopinath R, Walton PE, Etherton ED-Endocrinol 120:231-236 1989). 출원인이 개발한 IGFBP-3 모델에서 분리 IGF-II의 생물학적 활성이 감소된다. IGFBP를 첨가하면 INS-I 세포의 증식이 억제된다. 이러한 관찰에 근거하였을때, 결합 단백질(BP), 특히 BP3의 유일하게 공지된 기능은 IGF에 결합하는 것이므로, IGF-II는 INS-I 세포의 증식에 중요한 역할을 수행한다는 것을 알 수 있다.

수많은 간접적 증거들로부터 IGF-II가 자가분비-타가분비의 방식으로 종양세포주에서의 세포 증식을 자극한다는 결과가 지지된다(El-Bardy OH, Romanus JAI, Helman LH, Cooper MH, Rrchler MM, Israel MA-J. Clin. Invest. 84:829 1989). 이는 형질전환된 세포(Park JHY, MaCusker RH, Vanderhoof JA, Mohammadpour H, Harty RF, MacDonald RG-Endocrinology 131:1359-1368 1992) 및 1차 β-세포덩어리 배양(Rabinovith A, Quigley C, Russel T, Patel Y, Mintz DH-Diabetes 31:160-164 1982)(Hill DJ, Hogg J- E. M. Spencer(ed), Elsvier Science Publishing CO, INC 1991 235-240)에서 입증되었다.

본 발명은 또한, 이식의 측면에서 볼때 유전학적으로 변형 및 캡슐화된 세포주 INS-I의 제조에 관한 것이다.

예비 결과

이 결과는 필수적으로 IGF-II, 배지내의 글루코스의 농도 및 세포 증식 사이의 관계에 관한 것이다.

글루코스 농도가 5mM일때, 세포 증식은 개선된 것으로 보이지 않는다. 5mM 내지 20mM일때, 72시간 이하의 배양 기간동안 증식의 증가가 관찰되었다. 마찬가지로, 10 내지 20mM의 글루코스 농도일때, IGF-II 전령 RNA의 증가가 관찰되었다.

상기 세포에서 IGF-I 단백질(방사선면역분석법)(Binoux M, Seurin D, Lassarre C, Gourmelen M - J. Clin. Endocrinol. Metab. 59:453-462 1984)이나 이의 전형 RNA는 성장 호르몬에 장기간 노출된 후에도 검출되지 않았다.

방법의 원리

조작은 2가지 단계로 수행된다:

- 글루코스에 대한 민감성을 유지하면서 불활성 IGF-II 유전자를 포함하여 비증식성인 세포주 INS-I를 제조하는 단계;

- 상기 세포를 캡슐화시키고 당뇨병을 앓는 동물에게 이식하는 단계(이는 후속적으로 동일한 절차에 의해 인간에게 이식을 수행하기 위해서이다).

실험 방법

1 부

IGF-II 유전자의 영구한 불활성화는 동종 재조합 기술에 의해서 수행되었다(Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A-Nature 384:649-651 1990)(Pennington S, Wilson JH-Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9498-9502 1991), 본 출원인은 플라스미드 pUC 119에 있는 클로닝된 IGF-II 유전자(Dr HOLTHUIZEN)를 이용한다(Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS-Biochem Biophys. Acta 1087:341-343 1990). IGF-II를 암호화하는 4가지의 상이한 유형의 전령 RNA중에서, 주로 3.6kb의 전령 RNA가 INS-1 세포에서 발현된다. 상기 전령 RNA는 P3 프로모터를 사용하여 전사된다(Matsuguchi T, Takahashi K, Ikejiri K, Ueno T, Endo H, Yamamoto M-Biochem Biophys Acta 1048: 165-170 1990).

CMV 초기 유전자의 프로모터의 조절하에, IGF-II 유전자의 엑손(exon) 4와 동일상으로 네오마이신(neo) 내성 유전자를 암호화하는 카세트(cassette)를 삽입시킨다. 상기 구조물의 하류에 단순포진 바이러스의 티미딘 키나제(thymidine kinase)를 암호화하는 카세트를 삽입시킨다. 상기 구조물은 랜덤 삽입이 아닌 동종 재조합 방법에 의해 IGF-II-neo 구조를 갖는 희귀 클론을 선택할 수 있다. 실제로, 동종 재조합에 의한 클론은 네오마이신 및 간시클로버에 내성이 있는 반면, 랜덤 재조합에 의한 클론은 네오마이신에는 내성이 있으나 간시 클로버에는 민감하다.

형질감염후의 세포는 네오마이신, 간시클로버 및 IGF-II의 존재하에 배양된다. 내성이 있는 클론을, 내인성 IGF-II는 없으나 외인성 IGF-II가 존재할때의 증식 능력에 대해 시험하고, 써던 블롯(Southern blot)방법에 의해 연구하고 제대로 조립이 이루어졌는지를 검사할 목적으로 PCR로 분석한다. IGF-II의 발견은 전령 RNA 및 단백질의 수준에서 각각 노던(Northern) 및 웨스턴(Western) 블롯 방법에 의해 연구될 것이다. 단지 IGF-II 유전자의 부계 대립유전자만이 활성이 있고(De Chaiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A-Cell 64:849-859 1991), 동종 재조합 방법은 전사 활성이 있는 DNA 단편의 수준에서 더욱 효과적이므로(Nickoloff JC-MEB 12:5311-5318 1992), 단일 형질감염/선택 단계에서 IGF-II를 더이상 발현시키지 않는 INS-I 세포를 수득할 것을 기대할 수 있다. 그러나, 이 경우가 아니라면, IGF-II 유전자의 2차 복제물이 파괴될 수도 있다(Riete H, Maandag En, Clarke A, Hooper M, Berns A-Nature 384:649-651 1990). 상기 조작의 각 단계에서, 글루코스가 인슐린의 분비를 유도하는 능력을 검사해야 한다.

2 부

IGF-II 유전자의 파괴(녹-아웃(knock-out))가 성공적일 경우, INS-I 세포주의 성장을 위한 IGF-II의 외인성 투여에 완전히 또는 높은 정도로 의존하는 INS-I 세포주가 최종적으로 수득되야 한다. 이론상으로는, 상기 신규한 세포주는 부계 세포주와 동일한 방식으로 글루코스에 감응할 것이다. 그러므로 이 경우, 상기 세포는 캡슐화 및 이식에 사용될 수 있을 것이다.

1. INS-I 세포주의 캡슐화

(a) 효과적인 캡슐화를 위해서, 세포를 "의사 세포덩어리(pseudoislet)(PI)" 형태의 응집체로 만들어야 한다. 이는 세포를 비접착성 배양 접시에서 배양시킴으로써 수행될 수 있다. 응집체(="의사 세포덩어리")의 크기는 배양시 세포의 밀도에 의해 결정할 수 있다. 한편 응집체내의 세포의 갯수는 수확된 "의사 세포덩어리"를 트립신 처리 한 후에 결정할 수 있다.

(b) 500 내지 1,000개의 성숙한 랫트 세포덩어리(2-4 x 10⁸세포)에서 발견될 수 있는 양과 동량의 인슐린을 함유하는 공지된 수의 PI를 알긴산 나트륨 용액에 현탁시키고(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE-Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL-Proc. Natl. Acad Sci, 88:11100-11104 1991), 칼슘염 수용액을 사용하여 생체적합성 하이드로겔에 캡슐화시킴으로써 고정화시킨다. 캡슐화된 PI를 50,000 내지 80,000 미만의 분자량을 갖는 분자에 대해 투과성인 관상 아크릴 멤브레인에 놓는다(lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE-Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL-Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11100-11104 1991).

(c) 캡슐화된 PI를 관류시킴으로써 "시혐관내" 연구를 수행하여 그들이 다양한 글루코스 농도에 감응하여 인슐린 분비를 변화시킬 수 있는 세기 및 속도를 결정한다. 이 실험이 만족스럽다면, 섬유내에 함유된 PI를 이식에 사용할 것이다.

2. 이식

캡슐화된 PI는 피하 또는 복강내로 이식된다. 인간 인슐린-결핍 당뇨병의 동물 모델에서 정상 혈당치를 유지하는데 효과적인 방법에는 두가지가 있다. 생물학적 교배(Bio-breeding: BB) 래트 및 자연발생적인 당뇨병을 앓는 비비만성 당뇨병(nonobese diabetic: NOD) 마우스는 특이 조직적합성 유전자형과 연관되어 있고, 면역학적 관점에서 볼때, 이식받은 당뇨병 동물(세포독성 T 림프구의 존재)과 유사한 결함을 나타낸다(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE-Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL-Proc. Natl. Acad, Sci. 88:11100-11104 1991). 복강내로 이식하는 방법이, 이식된 세포를 위해서 생물학적으로 좋은 환경을 보장하므로 더욱 유리한 것처럼 보인다.

상기 방법은 유사한 방식으로 인슐린-결핍 환자에 응용할 수 있다. 효과적인 인슐린 농도에 도달하기 위해서는 50,000 내지 200,000개의 PI를 이식해야 한다.

Claims (10)

1. 형질전환된 β-세포를 포함하고, 상기 β-세포가 글루코스에 감응하여 인슐린을 발현하고, 상기 β-세포에서 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II) 유전자의 발현이 이 유전자의 완전한 억제에 의해 영구적으로 저해되는 고도로 분화된 인슐린-분비 β-세포주의 제조방법으로서,

   (i) 고도로 분화된 인슐린-분비 β-세포주의 β-세포를 변형된 IGF-II 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질감염시키는 단계(여기서, 상기 변형된 IGF-II 유전자에는 네오마이신 내성 유전자를 암호화하는 카세트가 액손 4와 동일상으로 삽입되어 있고, 바이러스성 티미딘 키나제를 암호화하는 카세트가 상기 네오마이신 유전자의 하류에 삽입되어 있다);

   (ii) 상기 형질감염된 β-세포를 네오마이신, 간시클로버 및 IGF-II의 존재하에 배양하는 단계; 및

   (iii) 네오마이신 및 간시클로버에 내성이 있는 형질전환된 β-세포를 단리하는 단계를 포함하며, 이때 상기 변형된 IGF-II 유전자가 동종 재조합에 의해 도입되고, 상기 β-세포가 증식을 위한 IGF-II의 외인성 투여에 대해 의존성인,

   β-세포주의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   생성된 β-세포주를, 비접착성 배양 접시에서 세포를 배양시킴으로써 추가로의사 세포덩어리 형태의 응집체로 만드는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   의사 세포덩어리를 겔화제의 현탁액에서 응집시키고 고정화제를 첨가함으로써 생체적합성 하이드로겔로 고정화시키는 방법.
4. 제 3 항에 있어서,

   겔화제가 알긴산 나트륨인 방법.
5. 제 3 항에 있어서,

   고정화제가 칼슘염 수용액인 방법.
6. 제 3 항에 있어서,

   의사 세포덩어리를 생체적합성 하이드로겔로 캡슐화시킴으로써 고정화시키고 칼슘염 수용액을 첨가함으로써 경화시킨 후 50,000 내지 80,000 미만의 분자량을 갖는 분자에 대해 투과성인 관상 아크릴 멤브레인에 놓는 방법.
7. 제 6 항에 있어서,

   고정화시키고 경화시킨 의사 세포덩어리를 이식가능한 섬유에 도입시키는 방법.
8. 제 3 항에 있어서,

   응집시키고 고정화시킨 의사 세포덩어리가 성숙한 래트의 500 내지 1,000개의 세포덩어리(islet)에서 발견되는 인슐린의 양과 동량의 인슐린을 함유하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서,

   고도로 분화된 인슐린-분비 β-세포주가 INS-I 세포주인 방법.
10. 제 1 항에 있어서,

    플라스미드가 pUC 119로부터 유도되는 방법.