KR100430534B1 - 단일가닥 디엔에이 분해효소를 이용하여 키메라 디엔에이라이브러리를 만드는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소를 이용하여 각종 DNA 염기서열 간의 재조립을 유발시킴으로써 유용한 특성을 갖는 유전자를 얻는 효율을 증진시키는 방향 진화 방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 재조립하고자 하는, 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥들을 혼성화하는 단계; 2) 상기 부분적으로 혼성화된 이종 DNA에서 상보적 결합에 참여하지 않은 부분을 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소로 제거하여 이종 DNA간에 완전하게 상보적 결합을 이룬 이중가닥 DNA 절편을 생성하는 단계; 3) 생성된 이중가닥 DNA 절편을 변성시켜 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 만드는 단계; 4) 상기 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하여 중합효소 반응을 통해 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계; 및 5) 재조립하고자 하는 유전자의 양쪽 말단 부분의 염기서열에 해당하는 말단 프라이머를 첨가하여 중합효소 연쇄 반응으로 재조립 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 기원이 다른 DNA로부터 키메라 DNA 라이브러리를 제작하는 방법에 관한 것이다.

Description

단일가닥 디엔에이 분해효소를 이용하여 키메라 디엔에이 라이브러리를 만드는 방법{METHOD FOR CONSTRUCTING A CHIMERIC DNA LIBRARY USING A SINGLE STRAND SPECIFIC DNASE}

본 발명은 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소를 이용하여 서로 다른 기원을 갖는 이종 DNA 염기서열 간의 재조립을 유발시킴으로써 키메라 DNA 라이브러리를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 유용한 특성을 갖는 유전자를 얻는 효율을 증진시키는 방향 진화 방법에 관한 것이다.

생물체 내에 존재하는 수천 종의 효소는 생명체의 기능을 유지하기 위해 필요한 복잡하고 다양한 반응을 매우 효율적으로 진행시키도록 진화되어 왔다. 따라서, 이러한 효소를 실제 산업적으로 활용하기 위해서는 반응 조건이나 목적에 맞게 효소의 기능을 개량하여야 한다. 효소의 특성을 개량하기 위하여 현재까지 다양한 연구가 진행되어 왔는데, 주로 무작위로 효소의 유전자에 변이를 유도하는 방법이나 효소의 구조 또는 기능과 구조와의 관련성 등 이미 알려진 정보를 기반으로 하는 단백질 공학 (protein engineering)에 의존하여 왔다. 그러나, 이러한 방법은 효소의 기능을 산업적 이용이 가능한 수준까지 효율적으로 개량하는데 한계가 있다. 최근에는 기존의 방법보다 매우 빠르게 효소의 기능을 개량할 수 있는 방법으로서 효소 유전자 뿐 아니라 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발시킴으로써 유용한 특성을 가지는 유전자를 얻기 위한 생체 내 진화 혹은 방향 진화 (directed mutagenesis) 기술이 개발되어 이의 활용에 관한 연구가 급속도로 증가하고 있다.

이러한 방향 진화는 각종 유용 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 가하여 돌연변이 라이브러리 (mutant library)를 구축하는 것으로부터 시작되는데, 돌연변이 라이브러리를 구축하여 다양한 유용 단백질을 창출하는 방법을 기술하면 하기와 같다.

1) 화학적 돌연변이화 (chemical mutagenesis)

화학적 돌연변이 유도방법은 핵산에 손상을 줌으로써 시험관 내 DNA 합성 또는 생체 내 DNA 복제 동안에 잘못된 염기 삽입 (misincorporation)을 유발하는 방법이다. 상기 방법은 유전자 내 적은 수의 돌연변이를 유발시킬 때 많이 이용되어 온 방법으로 주로 EMS (methylsulfonate ethylester), NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) 등의 화학물질이 돌연변이원 (mutagen)으로 이용되고 있다.

2) 오류-경향 PCR (Error-prone PCR, mutagenic PCR)

PCR 방법에 일반적으로 사용되는 Taq 중합효소 (Taq polymerase)는 핵산 중합반응을 수행하는 동안 뉴클레오티드 당 0.1 ~ 2 ×10^-4의 빈도로 잘못된 염기를 삽입할 가능성이 있는데, 높은 농도의 염을 첨가해주면 이러한 돌연변이 빈도가 더욱 높아진다. 이를 이용한 방법이 오류-경향 PCR로서 돌연변이 빈도를 높이기 위하여 MgCl₂의 농도를 7 mmol/ℓ까지 증가시키거나, 0.05 mmol/ℓ의 MnCl₂를 첨가하거나, dCTP와 dTTP의 농도를 1 mmol/ℓ로 올려주고 Taq 중합효소를 5 units 정도 첨가함으로써 중합과정 중에 돌연변이 발생 빈도를 증가시켜 돌연변이 라이브러리를 구축하게 된다. 그러나, 오류-경향 PCR에 사용되는 중합효소의 낮은 DNA 합성 능력 (processability)으로 인해 평균 크기 1.0 kb 이상 되는 유전자를 무작위적으로 돌연변이화 시키기에는 그 효율성이 매우 떨어지며, 유전자의 정보 함량이 증가할수록 기능이 저하된 돌연변이의 비율이 높아져 기능이 향상된 클론의 선별이 어려울 뿐 아니라 돌연변이가 완전히 무작위적으로 일어나지 않기 때문에 특정부위에만 돌연변이가 편중될 가능성이 크다.

3) 무작위적 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이성 PCR (Mutagenic PCR)

특정위치에 4가지 뉴클레오티드의 무작위적 조합을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 효소를 코딩하는 유전자 부분을 바꾸는 방법으로 유전자 다양성 (diversity)을 얻는데 매우 유용하다. 상기 방법에 의하면 원하는 위치의 염기(base)가 무작위적으로 바뀐 재조립 플라스미드 라이브러리를 구축할 수 있다.

이와 같이 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 유발 방법은 미리 합성한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 짧은 염기서열을 치환하는 방법으로 주로 3차원 구조 분석이나 기타 방법을 통하여 단백질의 구조를 알고 있는 상태에서 계획된 치환을 얻고자 할 때 사용할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 염기서열 상 멀리 떨어진 위치에 동시에 돌연변이를 도입하는 것이 불가능하며 이것을 얻기 위해서는 돌연변이 유발, 클로닝, 염기서열 확인의 과정을 여러 번 반복해야 하기 때문에 시간, 비용 및 노동력이 많이 들어가는 단점을 가지고 있다.

4) 포화 돌연변이화 (saturation mutagenesis)

유전자의 특정 아미노산을 가능한 모든 아미노산으로 치환하여 변이를 유발시키는 방법으로, 가장 직접적인 방법은 특정 부위 치환법 (site-directed mutagenesis)을 통하여 모든 아미노산에 치환될 뉴클레오티드 변형 (exchange)을 도입하는 것이다.

5) 카세트 돌연변이화 (Cassette mutagenesis)

일반적으로 카세트는 한 개에서 수백 개의 아미노산을 코딩하는 3개에서 수백 개의 뉴클레오티드로 정의된다. 이를 이용한 카세트 돌연변이 방법은 먼저 순열식 카세트 돌연변이화 (combinatorial cassette mutagenesis, CCM)를 통해 이미 알려진 3차원적 구조의 정보를 이용하여 유전자의 특정 부위를 치환하는 것으로, CCM은 무작위적 코돈 (randomized codon)을 함유한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 유전자의 특정 부위에 돌연변이성 카세트 (mutagenic cassette)를 도입함으로써 돌연변이를 유발시킨다. 그러나, 카세트 돌연변이 방법의 경우 무작위적 서열 블록의 크기와 개수의 한계로 인하여 다른 중요한 부분을 놓칠 가능성이 많다는 한계가 지적되고 있다.

6) 증량성 절단 (Incremental truncation)

하나의 유전자 (ORF1)를 파지미드 (phagemid) 벡터에 클로닝하고 동일한 방법으로 다른 유전자 (ORF2)를 같은 복제 기원 (replication origin)을 갖는 벡터에 클로닝한다. 이때 용이한 선별을 위해 각각의 벡터는 서로 다른 항생제 내성을 갖도록 구축한다. 상기 벡터의 제한 효소 절단부위를 이용하여 3'말단으로부터 내부 절단 (internal truncation)을 수행한 ORF1과 5' 말단으로부터 내부 절단을 수행한 ORF2를 확보한 후 이로부터 하나의 라이브러리 유전자 단편을 분리하여 다른 라이브러리 유전자에 융합시켜 돌연변이 라이브러리를 구축하는 것이다.

7) 동종 재조합 (Homologous recombination)

먼저 대상이 되는 하나의 유전자 (ORF1)를 특정한 벡터에 클로닝한다. 동종 재조합을 유도하기 위하여 다른 하나의 유전자 (ORF2) 자체를 이용하여 두개의 유전자를 전기-형질전환 (electro-transformation)을 통해 동시에 하나의 숙주세포에서 발현시킴으로써 돌연변이 라이브러리를 구축하는 방법이다. 이때 숙주세포로는 동종 재조합에 필요한 효소가 발현되는 시스템을 이용하여야 한다.

8) 세균성 돌연변이 균주 (Bacterial mutator strain)

DNA 회복 시스템 (DNA repair system)을 차단시킨 숙주 내에서 유전자의 돌연변이를 유발하는 방법으로 생체 내 돌연변이 (in vitromutation), 형질전환 과정 등을 생략할 수 있다는 장점이 있다.

9) DNA 재조립 (DNA reassembly)

최근에는 상기와 같은 통상적인 방법의 문제점을 해결하기 위하여 스테머 (Stemmer W. P. C.,Nature370:389-391, 1994)에 의해서 DNA 재조립 방법 (DNA shuffling)이 개발되었으며, 상기 방법은 현재 돌연변이 라이브러리를 구축하는데 가장 효율적인 방법으로 알려져 있다. 스테머의 DNA 재조립 방법은 임의로 유발된 돌연변이간에 재조립을 일으킴으로써 기존의 방법에 비하여 훨씬 다양한 DNA 라이브러리를 구축할 수 있는 방법으로, 먼저 DNase I 효소를 사용하여 두 가지 이상의 DNA를 임의로 절단한 후 일부분이 혼성화된 DNA 단편들이 서로에 대해 각각 주형인 동시에 프라이머로서 작용할 수 있도록 함으로써 다양한 재조립 DNA를 얻는 방법이다. 상기 DNA 재조립 방법은 시험관 내에서 여러 종의 기원으로부터 유래한 서열들 뿐 아니라 한 서열의 무작위적 돌연변이까지 다양한 조합을 만들 수 있기 때문에 유전자의 방향 진화에 매우 효과적이다. 무작위적 돌연변이를 가진 다양한 재조립 DNA 단편을 포함한 라이브러리는 적당한 선별과정을 거쳐서 다음 단계의 뒤섞임 (shuffling)에 이용된다 (USP 6,165,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; 5,837,458). 스테머는 상기 방법을 이용하여 베타-락타메이즈 (beta-lactamase)를 방향 진화시켰으며 이를 통하여 세포탁심 (cefotaxime)에 대한 내성을 32,000배 향상시킬 수 있었다.

한편, US 5,965,408에는 UV, 부가물 (adduct) 또는 돌연변이 유발 화학물질 등을 이용하여 DNA 합성을 중지시킴으로써 다양한 길이의 단일가닥 DNA를 생성시킨후 이들 사이의 재조립을 유도하는 방법이 개시되어 있다.

이외에도 PCR 반응시간, 반응온도 등의 반응조건을 조절하여 한 사이클 동안 짧은 조각의 DNA를 합성한 후 주형 교환 (template switching)을 통하여 재조립을 유도하는 StEP 방법 (Zhaoet al.,Nature Biotechnol. 16:258-261, 1998)과 무작위적 헥사머 (Random hexamer)를 사용하여 주형 DNA로부터 짧은 DNA 조각을 만들어 PCR 반응을 통해서 재조립을 유발하는 RPR 방법 (Shaoet al.,Nucl. Acids Res. 26:681-683, 1998) 등이 개발되었다.

그러나 이러한 방법들은 염기서열의 유사도가 낮은 경우에는 효율이 낮은 것으로 알려져 있는데, 이는 재조립된 DNA 가닥 사이의 염기서열이 다를 경우 DNA 중합반응이 잘 일어나지 않기 때문이다.

이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 기원이 서로 다른 DNA 단일가닥들을 혼성화시켜 상보적 결합을 하는 부위만을 선택적으로 선별하고 이를 PCR 프라이머로 사용하여 서로 다른 유래의 DNA 부위로 구성되는 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는 방법을 개발하였고 이를 통해 유사도가 낮은 서열간에도 재조합 효율을 획기적으로 높일 수 있고 비교적 큰 크기의 유전자에 대해서도 다양한 DNA 라이브러리를 제작할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효소 유전자, 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발시켜 산업적으로 유용한 단백질, DNA 또는 RNA를 얻기 위한 방법으로서 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소를 이용하여 각종 DNA 염기서열 간의 재조립을 유발시켜 키메라 DNA 라이브러리를 형성하는 방향 진화 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 있어서, 부분적으로 혼성화된 이종 DNA에 S1 뉴클리아제 (S1 nuclease)를 처리하여 온전하게 상보적 결합을 이룬 이중가닥 DNA 절편을 제조하는 단계 및 이를 프라이머로 하고 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하여 중합효소 반응을 통해 재조립 DNA 가닥을 생성시키는 단계를 나타낸 것이고,

도 2는도 1의단계 4 과정을 보다 상세히 나타낸 것으로, 이종 DNA를 주형으로 하고 내부 프라이머를 이용하여 생성되는 다양한 절편 DNA (C, F, J)와, 이들을 다시 주형으로 하고 내부 프라이머를 이용하여 생성되는 DNA 절편 (D, G), 그리고 이들로부터 생성되는 재조립 DNA를 나타낸 것이고,

E: A를 주형으로 생성된 D 절편을 프라이머로 하고, 주형을 B로 바꾸어 일어난 재조립의 예;

H, I: 내부 프라이머를 이용하여 A 및 B를 주형으로 만들어진 중간 산물인 DNA 절편끼리 상호간에 교차 프라이밍을 통해 일어난 재조립의 예;

L: 1회의 재조립이 일어난 DNA 절편이 다시 원래의 주형 A에 프라이머로 작용하여 일어난 재조립의 예

도 3및도 4는 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 의해 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자로부터 제작된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론-A1 및 클론-A2를 선별하여 재조립 DNA의 염기서열과 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이고,

도 5,도 6,도 7및도 8은 제한효소로 절단한 DNA를 혼성화 반응에 이용한 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 의해 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자로부터 제작된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론-B62, 클론-B63, 클론-B67 및 클론-B69를 선별하여 재조립 DNA의 염기서열과 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이고,

도 9,도 10및도 11은 급격한 냉각에 의한 변성화와 65℃에서의 반응 등 두 단계 혼성화를 이용한 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 의해 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자로부터 제작된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론-B28, 클론-B29 및 클론-B32를 선별하여 재조립 DNA의 염기서열과 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이고,

도 12,도 13및도 14는 양쪽 말단을 절단한 DNA를 주형으로 사용한 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 의해 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자로부터 제작된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론-B1, 클론-B5 및 클론-B6를 선별하여 재조립 DNA의 염기서열과 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이고,

도 15는 본 발명의 재조립 DNA 형성 방법에 의해 낮은 염기서열 유사도를 나타내는 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)와 에어로모나스 펀크타타 (KCTC 2944)의 키티나아제 유전자로부터 제작된 재조립 DNA로 대장균을 형질전환시킨 후 재조립이 일어난 클론-B10을 선별하여 재조립 DNA의 염기서열과 천연형 키티나아제 유전자의 염기서열을 비교한 결과이다.

본 발명에서 "재조립 (reassembly)"이라 함은 서로 다른 종류의 유전자로부터 기원하는 DNA 조각들이 연결되어 하나의 유전자를 이루는 것을 의미하며, 상기와 같이 이종 DNA가 교차적으로 연결된 형태로 재조립된 DNA를 "키메라 DNA (chimeric DNA)"라 한다.

또한, "내부 프라이머" 또는 "상보적 내부 프라이머"라 함은 이종 DNA 간에 재조립을 유발하기 위하여 사용하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 이종 DNA 단일가닥을 혼성화시킨 후 상보적 결합에 참여하지 않은 단일가닥 부분만을 절단하여 상보적 결합을 하는 공통 염기서열 부분만을 분리한 뒤 변성시켜 제작되거나 인공합성을 통해서 생산할 수 있으며, 잘려지지 않은 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 PCR함에 있어 프라이머로 사용될 수 있는 것을 말한다. 특히, 서열을 알고 있는 유전자에 대해 재조립 DNA를 만들고자 할 경우에는 혼성화, 단일가닥 DNA의 분해 및 변성화 과정을 거치지 않고 상보적 내부 프라이머로 이용할 수 있다. 이러한 경우 내부 프라이머의 농도를 정교하게 조절하는 것이 가능하므로 반응조건의 최적화 등에 유용하게 이용될 수도 있다.

본 발명에서 "말단 프라이머"라 함은 재조립시키고자 하는 목적 유전자의 양 말단 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로서, 본 발명의 DNA 재조립 과정에서 1차 PCR에서는 소량으로, 2차 PCR에서는 과량으로 첨가하여 전체 길이를 갖는 유전자를 생성하기 위한 용도로 사용된다.

한편, 본 발명에서 "키메라 DNA 라이브러리"란 이종 DNA 간에 재조립이 일어난 다양한 DNA들을 총칭하며, 상기 재조립 DNA를 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 대장균 등의 숙주세포 집단을 가리킬 수도 있다.

본 발명에서 "방향 진화 (directed mutagenesis)"란 돌연변이 등을 통해 보다 나은 특성을 갖는 유전자를 만드는 것을 말하는데, 여기서 돌연변이란 본 발명의 방법을 통해 유사한 특성을 갖는 단백질을 생성하는 이종 DNA를 재조립하여 키메라 DNA 라이브러리를 제작함으로써 이루어지며, 상기 키메라 DNA 라이브러리로부터 목적하는 특성을 나타내는 유전자를 선별하는 과정을 통해 기능이 향상되거나 유리한 특성을 갖는 유전자를 얻는 과정을 의미한다.

또한, 본 발명에서 "이종 DNA (heterologous DNA)"라 함은 재조립시키고자 하는 유전자를 포함하는 DNA로서 서로 다른 세포로부터 유래한 것 또는 같은 종류의 세포로부터 분리된 서로 다른 종류의 DNA 또는 오류-경향 PCR등을 통해서 동일한 유전자에 돌연변이가 도입되어 서로 다른 염기서열을 갖게 된 DNA를 의미한다. 상기 "이종 DNA"로 바람직하게는 방향 진화시키고자 하는 같은 종류의 유전자를 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 유사한 활성을 갖는 동종 세포의 단백질을 만드는 유전자 또는 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화하되 다른 종류의세포에서 유래하는 유전자를 이용할 수도 있다. 나아가 완전히 다른 활성을 나타내는 단백질이라도 그들의 특성을 혼합하여 새로운 활성을 나타내는 유전자를 얻고자 할 때에는 전혀 무관한 단백질을 암호화하는 유전자를 이용할 수도 있다. 단, 이 경우에도 내부 프라이머의 생성을 위한 최소한의 공통 서열은 존재하여야 하므로, 최소한 50% 이상의 염기서열 유사도를 나타내는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서 "단일가닥 (특이적인) DNA 분해효소"란 단일가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 단일가닥 부분에 선택적으로 작용하는 DNA 분해효소를 말한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제작 방법은 크게 3개의 과정으로 구성되는데,

1) 이종 DNA 간에 상보적인 결합을 이루는 부분만을 선별하는, 내부 프라이머 제조 과정;

2) 상기 내부 프라이머를 이용하며 잘려지지 않은 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하는 1차 PCR 과정; 및

3) 상기 과정에서 생성되는 부분적으로 신장된 PCR 산물과 과량의 말단 프라이머를 이용하는 2차 PCR 과정이 그것이다.

이를 보다 상세히 살펴보면, 내부 프라이머를 제조하는 과정은

1) 이종 DNA 가닥을 혼성화하는 단계;

2) 부분적으로 혼성화된 이종 DNA를 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소로 절단하는 단계; 및

3) 상보적 결합을 이루고 있는 이종 DNA 이중가닥 절편을 변성하여 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계로 세분할 수 있다.

따라서, 본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제조 방법은,

1) 재조립시키고자 하는, 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥들을 혼성화하는 단계;

2) 상기 부분적으로 혼성화된 이종 DNA에서 상보적 결합에 참여하지 않은 부분을 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소로 제거하여 이종 DNA간에 완전하게 상보적 결합을 이룬 이중가닥 DNA 절편을 생성하는 단계;

3) 생성된 이중가닥 DNA 절편을 변성시켜 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 만드는 단계;

4) 상기 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 내부 프라이머로 하고, 단계 1의 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하여 중합효소 반응을 통해 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계; 및

5) 재조립하고자 하는 유전자의 양쪽 말단 부분의 염기서열에 해당하는 말단 프라이머를 첨가하여 중합효소 연쇄 반응으로 재조립 DNA를 증폭하는 단계를 포함한다.

상기에서 본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제작 방법은, 무작위적으로 DNA 조각들을 혼합하여 우연히 부분적으로 상보적 결합을 이루는 방법에 의존하는 것이아니라, 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소를 사용하여 이종 DNA간에 상보적인 결합을 이룰 수 있는 공통 서열만을 선별하고 이를 PCR 증폭의 프라이머로 이용함으로써, 낮은 서열 유사도를 보이는 이종 DNA 간에도 높은 효율로 재조립을 일으킨다는 데에 그 특징이 있다. 본 발명의 키메라 DNA 라이브러리 제작 과정 및 이를 이용한 방향 진화 방법을 상세히 살펴보면 다음과 같다.

1. 제 1 과정: 내부 프라이머의 제조

단계 1 : 이종 DNA 단일가닥들의 혼성화

이종 DNA를 혼성화시키는 방법으로는, 재조립시키고자 하는 유전자를 포함하는 기원이 서로 다른 이종 DNA를 혼합하여 고온에서 가열함으로써 DNA를 변성시키고, 온도를 서서히 낮추면서 DNA간의 혼성화를 유발하는 방법이 사용될 수 있다. 또한, 급격한 변성 조건과 비교적 높은 온도에서의 혼성화를 이용할 수도 있는데, 예를 들어 90℃ 이상에서 약 10분간 가열하여 변성시킨 후 가열한 DNA 용액을 급속히 얼음에 넣어 냉각시킴으로써 변성을 고정시키고 염을 첨가한 상태에서 약 50∼70℃, 바람직하게는 약 65℃로 1 내지 12시간 반응시키는 방법을 이용할 수 있다. 이외에도 높은 염 농도 상태에서 DNA를 변성시킨 후 2 내지 3시간에 걸쳐 서서히 냉각시킴으로써 혼성화 반응을 일으킬 수도 있다.

상기에서 혼성화시키는 DNA로는 일반적으로 방향 진화를 이루고자 목적하는 유전자를 사용하는데, 예를 들어 보다 높은 키틴 (chitin) 분해활성을 갖는 키티나아제를 만들고자 할 때에는 다양한 종류의 세포에서 키티나아제 유전자를 분리하여이들을 키메라 DNA 라이브러리 제작의 출발물질로 사용할 수 있다. 여기서 출발물질로 사용되는 이종 DNA를 혼성화시킴에 있어, 각각의 키티나아제 유전자를 잘려지지 않은 완전한 형태로 사용할 수도 있지만, 둘 중 하나의 유전자를 제한효소 등으로 절단하여 이용할 수도 있다. 이처럼 이종 DNA 중 한 종류를 제한효소로 절단하여 사용하는 경우 혼성화 반응이 보다 효율적으로 일어나게 된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila,KCTC 2358), 판토에아 글로메란스 (Pantoea glomerans,KCTC 2578), 에어로모나스 펀크타타 (Aeromonas punctata,KCTC 2944)의 세 종류 균주에서 분리한 키티나아제 유전자를 이용하여 재조립 실험을 수행하였는데, 실시예 2 내지 5에서는 비교적 서열 유사도가 높은 에어로모나스 히드로필라와 판토에아 글로메란스의 유전자를 이용하였으며, 실시예 6에서는 비교적 서열 유사도가 낮은 판토에아 글로메란스와 에어로모나스 펀크타타의 유전자를 이용하여 실험하였다. 한편, 실시예 3에서는 혼성화 효율을 높이기 위해 한 종류의 DNA를 제한효소로 절단하여 혼성화 반응을 수행하였다.

단계 2 : 단일가닥 DNA 분해효소의 처리

상기와 같이 혼성화된 이종 DNA는 염기서열이 완전히 동일하지 않기 때문에 상보적인 서열을 갖는 부분에서만 혼성화되어 이중가닥을 형성하게 되고, 나머지 서로 다른 서열에서는 단일가닥 형태로 존재하는 부분적 혼성화 상태에 있게 된다. 여기에 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소를 처리함으로써 완전하게 혼성화된 부분만을 선별할 수 있다.

이러한 목적으로 사용될 수 있는 단일가닥 DNA 분해효소로는 S1 뉴클리아제가 대표적이나, 이에 한정되는 것은 아니며, 멍 빈 뉴클리아제 (Mung Bean nuclease) 등이 동일한 목적으로 사용될 수 있다.

예를 들어, S1 뉴클리아제를 사용하는 경우, 상기 효소를 500 units/㎖ 이상의 고농도로 사용하여 40℃ 이상의 고온에서 반응시키는 것이 상보적 결합을 이루고 있는 부분을 제외한 단일가닥 부분을 완전히 자르는 데 효과적이다. 보다 바람직하게는 S1 뉴클리아제 약 1,000 units/㎖을 처리하여 약 45℃에서 반응시킬 수 있다.

상기 단계 1 및 단계 2의 과정을도 1에 나타내었다.도 1에서 굵은 실선은 재조립하고자 하는 이종 DNA간에 서열이 동일한 부분을 나타내며, 실선 및 점선은 염기서열이 상이한 부분을 나타낸다.

단계 3 : 내부 프라이머 제조를 위한 변성화

본 단계에서는 상기에서 단일가닥 DNA 분해효소를 처리하여 얻어진 이중가닥 DNA 절편들을 변성시켜 각각의 단일가닥 올리고뉴클레오티드로 분리한다. 상기 과정은 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시키는 일반적인 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 예를 들어 고온으로 가열한 후 얼음에서 급속히 냉각시켜 변성을 고정화하는 방법이 있다.

상기와 같은 과정을 통해 만들어진 단일가닥 올리고뉴클레오티드들은 이후의DNA 재조립 과정에서 재조립시키고자 하는 유전자의 내부 프라이머로서 이용된다.

제 1 과정의 단계 3에 의해서 만들어지는 올리고뉴클레오티드는 인공적으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의해서 대체될 수 있다. 이때 이종 DNA간에 보존된 염기서열을 기준으로 서로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 합성하여 사용할 경우 상기에서 설명된 방법으로 얻어진 올리고뉴클레이티드와 동일한 효과를 얻을 수 있다.

2. 제 2 과정: 내부 프라이머를 이용한 DNA 재조립 (1차 PCR 반응)

상기에서 제조된 내부 프라이머를 이용하여 중합반응을 수행하여 DNA간의 재조립을 유발하는 과정으로서, 재조립된 DNA를 증폭시키기 위하여 과량의 말단 프라이머를 첨가하여 수행되는 2차 PCR 반응과 구별하기 위하여 본 과정을 1차 PCR이라 한다.

주형으로는 내부 프라이머 제조를 위해 최초에 사용되었던 이종 단일가닥 DNA를 사용하고, 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소에 의해 제조된 내부 프라이머와 0.1 pmole/50 ㎕ 이하 정도로 소량의 말단 프라이머를 첨가하여 반응시킨다. 상기에서 주형 DNA로는 내부 프라이머 제조를 위해 최초 사용되었던 이종 단일가닥 DNA를 제한효소 등으로 처리하여 양쪽 혹은 한쪽 말단 서열을 절단한 DNA를 사용할 수 있다. 바람직하게는 두 종류의 주형 DNA에서 각각 다른 방향의 한쪽 말단을 절단하여 사용할 수 있는데, 이와 같이 함으로써 마지막 단계에서 생성되는 재조립 DNA의 비율을 높일 수 있다. 즉, 양쪽 말단이 각각 잘려진 주형 DNA를 이용하는 경우에는, 과량의 말단 프라이머를 이용한 2차 PCR 과정에서 처음 넣어준 주형 DNA가 증폭되지 아니하고 재조립이 일어난 DNA만 증폭될 수 있기 때문이다.

PCR 조건은 일반적인 방법을 그대로 사용할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 5초의 반응을 45회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 추가로 반응시키는 방법을 사용하였다.

상기 1차 PCR 반응을 통하여 서로 다른 DNA 사이에서 염기서열이 보존된 부분, 즉 내부 프라이머로부터 시작되는 단일 염기 가닥이 양쪽 방향으로 생성된다. 이 때, 재조립하고자 하는 DNA 염기서열의 양 말단이 보존적인 경우에는 추가로 프라이머를 첨가할 필요가 없으며 그렇지 않은 경우에는 소량의 말단 프라이머 (0.1 pmole/50 ㎕ 이하)를 첨가해 주어야 한다. 양 말단에 프라이머가 작용할 경우에 내부 프라이머로부터 생성된 DNA와 동일한 크기의 단일가닥 DNA가 생성된다. 이 과정에서 S1 뉴클리아제에 의해서 생성된 내부 프라이머가 앞 단계에서 생성된 DNA와 반응하여 중합반응이 일어날 경우 양 말단의 염기서열이 포함되지 않은 DNA 가닥이 생성될 수 있다 (도 1참조).

도 2에 나타난 바와 같이 이종 DNA를 주형으로 하여 생성된 PCR 산물들은 공통 서열을 갖는 내부 프라이머를 이용하여 신장된 것이므로, 이들은 상호간에 부분적 혼성화를 통해 서로에 대한 프라이머인 동시에 주형으로 작용할 수 있으며, PCR을 통해 변성과 혼성화를 반복하는 과정에서 서로 다른 종류의 DNA로 주형 교환이 일어나거나, 부분적으로 합성된 DNA 절편이 새로운 주형으로 작용할 수도 있다.이러한 과정을 통해 공통 서열 부분을 제외한 나머지 부분에서 서로 다른 이종의 DNA 절편들이 교차되어 연결된 형태로 가능한 모든 종류의 변이 부분 재조립이 일어날 수 있다. 또한, 말단 프라이머 서열을 포함하는 DNA 단편간에 교차 프라이밍 (cross-priming)을 통해 추가적인 재조립이 일어날 수 있으며, 말단 프라이머 서열을 포함하지 않는 DNA 사이의 교차 프라이밍에 의해 2번 이상 재조립이 일어날 수 있다.

상기 반응이 일어나기 위해서는 변성화, 혼성화, 중합반응을 2번 이상 거쳐야 하는데 이 과정에서 교차 프라이밍이나 주형 교환 등을 통해서 전체 크기의 재조립된 DNA가 생성되며 변이 부분이 3개 이상인 경우에도 변성화, 혼성화, 중합반응의 횟수를 증가시켜 주면 모든 종류의 재조립이 가능해진다.

3. 제 3 과정: 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA 증폭 (2차 PCR 반응)

과량의 말단 프라이머를 첨가하여 재조립된 전체 길이의 DNA를 증폭하는 과정으로서, 본 발명에서는 앞서의 PCR 반응과 구별하기 위해 2차 PCR이라 한다. 1차 PCR과 2차 PCR을 분리하여 수행하는 이유는 처음부터 다량의 말단 프라이머가 존재할 경우, 재조립 DNA 보다는 주형 DNA 혹은 초기에 생성된 온전한 크기의 DNA가 보다 우세하게 증폭되고, 반응후기에 주로 생성되는 재조립 DNA는 적은 양으로 증폭되어 상대적으로 여러 번 재조립된 DNA의 양이 적어지기 때문이다.

상기 1차 PCR에서 생성된 다양한 재조립 DNA가 말단 프라이머를 이용하여 증폭되는데, 첨가되는 말단 프라이머의 양은 20 pmole/50 ㎕ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 25 pmole/50 ㎕이다.

상기와 같은 방법으로 제조된 다양한 재조립 DNA 절편들은 적당한 벡터에 도입된 후 대장균 등에 형질전환시켜 이용할 수 있다. 상기 키메라 DNA 라이브러리는 목적에 따라 효소 단백질 유전자, 프로모터, 바이러스 유전자 등 다양한 종류의 유전자에 대해 적용할 수 있다. 궁극적으로 상기 키메라 DNA 라이브러리는 원하는 특성을 갖는 유전자를 탐색하는 방향 진화 방법의 재료로서 이용된다. 즉, 다양하게 재조립된 DNA 라이브러리로부터 목적하는 특성을 갖는 유전자를 스크리닝할 수 있으며, 스크리닝 방법은 목적하는 특성에 따라 공지된 방법을 이용할 수 있다. 한편, 구축된 키메라 DNA 라이브러리를 다시 출발물질로 하여 이들 키메라 DNA로부터 앞서 설명한 방법으로 새로운 키메라 DNA 라이브러리를 제작할 수도 있으며, 이러한 과정은 목적하는 특성의 유전자를 찾을 때까지 반복될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 주형 DNA의 제조

서로 다른 생물체에서 분리한 DNA로부터 키메라 DNA 라이브러리가 효율적으로 만들어지는지 확인하기 위하여 키티나아제 유전자를 대상으로 재조립 실험을 수행하였다.

먼저, 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila,KCTC 2358), 판토에아 글로메란스 (Pantoea glomerans,KCTC 2578), 에어로모나스 펀크타타 (Aeromonas punctata,KCTC 2944)로부터 게놈 DNA prep kit (Promega사)를 이용하여 전체 핵산을 분리하였다. 분리한 핵산을 주형으로 하고서열번호 1로 기재되는 Chi600f 프라이머와서열번호 2로 기재되는 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 (chitinase) 유전자를 증폭하였다. 유전자의 증폭은 Vent 중합효소 (NEB사)와 Taq 중합효소 (Bioneer사)를 혼합하여 사용하였으며, 94℃에서 3분 동안 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 30회 반복하고 72℃에서 30분 동안 더 반응시켰다. 이로부터 얻은 증폭된 유전자를 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 염기서열을 결정하였다.

염기서열 결정 결과, 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358), 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578), 에어로모나스 펀크타타 각각으로부터 분리된 키티나아제 DNA는 각각서열번호 3,서열번호 4및서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다. 이들 간의 염기서열 유사성을 조사하여 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.표 1에서 왼쪽 아래의 수치는 유사도를 의미하며 오른쪽 위의 수치는 전체 염기 개수 중 서로 다른 염기 개수의 비율 (서로 다른 염기의 수/전체 염기의 수)을 나타낸다.

표 1에 나타난 바와 같이, 판토에아 글로메란스와 에어로모나스 히드로필라의 키티나아제 유전자가 약 95%로 가장 높은 염기서열 유사도를 나타내었다.

이후의 DNA 재조립 실험은 키티나아제 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 정제한 후SacII와SpeI 제한효소로 절단하고 아가로스 겔로부터 키티나아제 유전자 부분을 추출하여 사용하거나 정제된 플라스미드를 주형으로 하여 PCR로 증폭한 후 Wizard PCR prep kit (Promega사)를 이용하여 정제된 DNA를 사용하였다.

<실시예 2> 재조립 실험 1

(2-1) 이종 DNA의 혼성화

실험에 사용할 DNA는 상기 실시예 1에서 얻은 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 클론을SacII와SpeI 제한효소로 절단하고 아가로스 겔로부터 키티나아제 유전자 부분을 추출하여 준비하였다. 상기 두 종류의 DNA 각각 0.2 ㎍씩에 S1 뉴클리아제 완충용액 (S1nuclease buffer) [30 mM sodium acetate, 1 mM zinc acetate, 5% (v/v) glycerol] 및 300 mM의 NaCl를 첨가하여 30 ㎕로 만든 후, 95℃에서 10분 동안 반응시킨 뒤 천천히 냉각시켜서 DNA간의 혼성화를 유발시켰다.

(2-2) 내부 프라이머의 제조

상기 반응액에 1,000 units/㎖ 농도로 S1 뉴클리아제를 첨가한 후 45℃에서 1시간 동안 반응시켜 상보적 결합을 이루지 못한 단일가닥 DNA 부분만을 절단함으로써, 이종 키티나아제 유전자 내부에 동일한 염기서열을 갖는 부분만을 선택적으로 분리하여 이중가닥 DNA 절편의 형태로 생산하였다. 페놀:클로로포름 (phenol:chloroform)을 이용하여 반응액으로부터 상기 이중가닥 키티나아제 유전자 절편을 추출하고 에탄올을 첨가하여 회수한 후 이를 15 ㎕의 증류수에 용해시켰다. 상기와 같은 방법으로 얻어지는 DNA 절편은 이종간 동일 염기서열을 갖는 유전자 절편으로서, 이들은 이후의 DNA 재조립 과정에서 재조립하고자 하는 유전자의 상보적인 내부 프라이머로 이용된다.

(2-3) 내부 프라이머를 이용한 DNA 재조립

아가로스 겔로부터 추출한 전체 길이의 두 종류 키티나아제 유전자 각각 1 ng, 말단 프라이머로서서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머 각각 1 pmole, 상기 (2-2)에서 S1 뉴클리아제에 의해서 생산된 상보적인 내부 프라이머 5 ㎕를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 5초의 반응을 45회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다.

(2-4) 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA의 증폭

상기 반응액에서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 각각 25 pmole 추가하여 PCR 증폭반응을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 30회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 두 단계의 PCR 반응에 의해서 생성된 약 600 bp의 DNA를 아가로스 겔로부터 추출하여 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.

(2-5) 재조립 DNA의 확인

형질전환된 콜로니 중 임의로 5개를 선택하여 이들로부터서열번호 1의 Chi600f 및서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 증폭된 DNA를서열번호 1의 Chi600f 및서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이중 2개의 클론 (클론-A1, 클론-A2)에서 DNA 재조립이 발견되었으며 이들을 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 절단 형태의 염기서열과 비교하였다 (도 3및도 4). 클론-A1 및 클론-A2는 각각서열번호 6및서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

도 3및도 4에 나타낸 염기서열 정렬에서 점으로 표시한 것은 기준으로 사용한 클론의 염기서열과 동일한 염기서열을 의미한다. 클론-A1의 경우 52번째 자리에서 단일자리 돌연변이 (C →T)가 일어났으며, 337번째 자리에서 한 염기의 삭제가 일어났다. 그리고 244번째 염기와 269번째 염기 사이에서 주형 교환이 일어나서 DNA가 재조립된 것을 확인하였다. 클론-A2의 경우 244번째 염기와 269번째 염기 사이, 307번째 염기와 348번째 염기 사이에서 각각 한번씩 주형교환이 일어나 DNA가 재조립된 것을 확인하였다. 141번째 자리의 경우에는 단일자리 돌연변이 때문인지 주형교환에 의한 것인지 확인할 수 없었다.

<실시예 3> 재조립 실험 2: 제한효소로 절단한 DNA를 혼성화 반응에 이용

(3-1) 이종 DNA의 혼성화 및 내부 프라이머의 제조

실시예 1에서 제조한 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 유전자를서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 증폭하여 준비하였다. S1 뉴클리아제 완충용액 [30 mM sodium acetate, 1 mM zinc acetate, 5% (v/v) glycerol], 300 mM의 NaCl 및 에어로모나스 히드로필라와 판토에아 글로메란스의 키티나아제 DNA를 각각 0.5 ㎍씩 첨가한 용액을 20 ㎕로 조제한 후 95℃에서 10분간 반응시킨 다음 천천히 냉각시켜서 DNA간의 혼성화를 유발시켰다. 상기에서 에어로모나스 히드로필라 DNA는 Chi600f와 Chi1200r 프라이머로 증폭된 전체 키티나아제 유전자를 그대로 사용하였고, 판토에아 글로메란스의 키티나아제 DNA는 증폭시킨 키티나아제 유전자를HpaⅡ 제한효소로 절단하여 이용하였다.

이후 S1 뉴클리아제를 처리하여 상보적인 내부 프라이머 DNA를 회수하는 방법은 상기 실시예 (2-2)와 동일하게 수행하였다.

(3-2) 내부 프라이머에 의한 DNA 재조립 및 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립DNA 증폭

PCR 증폭에 의해서 준비된 두 종의 키티나아제 유전자를 각각 1 ng, 말단 프라이머로서서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머 각각 0.1 pmole, 상기 실시예 (3-2)에서 S1 뉴클리아제에 의해 생산된 상보적인 내부 프라이머 4 ㎕를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 20초의 반응을 45회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 반응액을 실시예 (2-4)와 동일한 방법으로 다시 PCR 증폭반응하여 생성된 약 600 bp의 DNA를 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.

(3-3) 재조립 DNA의 확인

형질전환된 콜로니 중 임의로 6개를 선택하여서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 이들의 염기서열을 결정하였다. 6개의 클론 중 4개의 클론에서 DNA 재조립이 발견되었으며, 이들 중 클론-B62와 클론-B67은 모두 72번째 염기와 147번째 염기 사이에서 주형교환이 일어난 것으로 나타났다 (도 5및도 6). 상기 두 클론은 주형교환이 일어난 부분은 동일하지만, 클론-B62에서는 2개의 단일염기 치환이 일어나고 클론-B67에서는 1개의 단일염기 치환이 일어나서 총 3개의 염기서열 차이를 보여준다. 클론-B63과 클론-B69 또한 72번째 염기와 147번째 염기 사이에서 주형교환이 일어났으며, 클론-B63의 경우 210번째 염기와 225번째 염기 사이에서 추가로 주형교환이 일어난 것으로 나타났다 (도 7및도 8). 한편, 클론-B69의 경우에는 312번째 염기와 351번째 염기사이에서 주형교환이 한번 더 일어난 것으로 나타났다. 클론-B62, 클론-B67, 클론-B63 및 클론-B69는 각각서열번호 8,서열번호 9,서열번호 10및서열번호 11로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

<실시예 4> 재조립 실험 3: 급격한 냉각에 의한 변성화와 65℃에서의 반응의 두 단계 혼성화

(4-1) DNA의 2 단계 혼성화 및 내부 프라이머의 제조

에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 DNA를 각각 0.5 ㎍씩 첨가한 후 95℃에서 10분간 가열하고 얼음으로 옮겨 DNA의 변성화를 유도하였다. 상기 용액에 S1 뉴클리아제 완충용액과 300 mM의 NaCl를 첨가하여 65℃에서 2시간 동안 반응시켜 혼성화를 유도하였다. 이후 S1 뉴클리아제를 처리하여 상보적인 내부 프라이머 DNA를 회수하는 방법은 상기 실시예 (2-2)와 동일하게 수행하였다.

(4-2) 내부 프라이머에 의한 DNA 재조립 및 과량의 말단 프라이머를 이용한 재조립 DNA의 증폭

PCR 증폭에 의해서 준비된 두 종의 키티나아제 유전자를 각각 1 ng, 말단 프라이머로서서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머 각각 0.1 pmole, 상기 (4-1)에서 S1 뉴클리아제에 의해 생산된 상보적인 내부 프라이머 4 ㎕를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃ 20초의 반응을 45회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 반응액에서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 각각 25 pmole 추가하여 PCR 증폭반응을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 20초의 반응을 30회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 두 단계의 PCR 반응에 의해서 생성된 약 600 bp의 DNA를 아가로스 겔로부터 추출하여 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.

(4-3) 재조립 DNA의 확인

형질전환된 콜로니 중 임의로 6개를 선택하여 Chi600f 프라이머와 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 이들의 염기서열을 결정하였다. 상기 6개의 클론 중 3개의 클론에서 DNA 재조립이 발견되었으며, 이들 중 클론-B28은 273번째 염기와 306번째 염기 사이, 351번째 염기와 360번째 염기사이, 417번째 염기와 430번째 염기 사이 등 총 3번의 주형교환이 일어났다 (도 9). 클론-B29는 147번째 염기와 207번째 염기사이, 312번째 염기와 351번째 염기사이, 363번째 염기와 399번째 염기사이, 430번째 염기와 450번째 염기사이 등 총 4번의 주형교환이 일어났다 (도 10). 클론-B32는 312번째 염기와 351번째 염기사이에서 한번의 주형교환이 일어난 것으로 나타났다 (도 11). 클론-B28, 클론-B29 및 클론-B32는 각각서열번호 12,서열번호 13및서열번호 14로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

<실시예 5> 재조립 실험 4: 양쪽 말단을 절단한 DNA를 주형으로 사용

잘려지지 않은 온전한 길이의 DNA를 주형으로 사용하면, 말단 프라이머를 과량 사용하는 2차 PCR 과정에서 재조립이 일어나지 않은 원래의 DNA가 동시에 증폭될 수 있으므로, 재조립 DNA의 생성율이 감소하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 PCR 주형으로 말단 프라이머의 결합 부위가 절단된 DNA를 주형으로 사용하여 실험하였다.

(5-1) 재조립 DNA 라이브러리의 제조

실험에 사용할 DNA는 에어로모나스 히드로필라 (KCTC 2358)와 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)의 키티나아제 클론으로부터서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하여 준비하였다. S1 뉴클리아제 완충용액 (30 mM sodium acetate, 1 mM zinc acetate, 5% [v/v] glycerol), 300 mM의 NaCl 및 상기 두 가지 DNA를 각각 2.5 ㎍씩 첨가한 용액을 50 ㎕로 조제한 후 95℃에서 10분간 반응한 후 천천히 냉각시켜 DNA간의 혼성화를 유발시켰다. 이후 S1 뉴클리아제를 처리하여 상보적인 내부 프라이머 DNA를 회수하는 방법은 상기 실시예 (2-2)와 동일하게 수행하였고 회수된 DNA를 20 ㎕의 증류수에 용해시켰다.

각각의 DNA 5' 말단 쪽을 절단하는 효소인BglⅡ로 처리된 DNA와 3' 말단 쪽을 절단하는 효소인HinfI으로 처리된 DNA를 혼합하여 주형으로 사용하였으며 두 종의 키티나아제 유전자 각각 1 ng을 주형으로 하고, 상기 S1 뉴클리아제에 의해 생산된 상보적인 내부 프라이머를 2 ㎕ 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 20초의반응을 45회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 반응액을 실시예 (2-4)와 동일한 방법으로 다시 PCR 증폭반응하여 생성된 약 600 bp의 DNA를 T-벡터 (Promega사)에 삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.

(5-2) 재조립 DNA의 확인

형질전환된 콜로니 중 임의로 6개를 선택하여서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 이들의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 6개의 클론 중 3개의 클론에서 DNA 재조립이 일어났음을 확인하였다. 클론-B1의 경우에는 222번째 염기와 229번째 염기사이에서 주형교환이 일어났으며 (도 12), 클론-B5의 경우에는 60번째 염기와 66번째 염기 사이에서 주형교환이 일어난 것으로 나타났다 (도 13). 클론-B6의 경우에는 33번째 염기와 47번째 염기 사이 그리고 428번째 염기와 445번째 염기 사이에서 두 번의 주형교환이 일어난 것으로 나타났다 (도 14). 클론-B1 및 클론-B6는 각각서열번호 15및서열번호 16으로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

<실시예 6> 재조립 실험 5: 낮은 염기서열 유사도를 갖는 이종 DNA 간의 재조립

이상에서는 94% 이상의 서열 유사성을 갖는 이종 DNA를 이용한 재조립 DNA 라이브러리 제조와 그 재조립 효율을 확인하였다. 본 실험에서는 비교적 낮은 염기서열 유사도를 갖는 이종 DNA간에도 본 발명의 방법에 의해 효율적인 재조립이 일어나는지 확인하기 위하여 약 78%의 염기서열 유사도를 나타내는 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)와 에어로모나스 펀크타타 (KCTC 2944)의 키티나아제 유전자를이용하여 재조립 실험을 수행하였다.

(6-1) 재조립 DNA 라이브러리의 제조

실시예 1에서 클로닝한 판토에아 글로메란스 (KCTC 2578)와 에어로모나스 펀크타타 (KCTC 2944)의 키티나아제 유전자를서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 증폭하였다. S1 뉴클리아제 완충용액, 300 mM의 NaCl 및 상기 두 종류의 키티나아제 DNA를 각각 2.5 ㎍씩 첨가한 용액을 50 ㎕로 조제한 후 95℃에서 10분간 반응시킨 다음 천천히 냉각시켜서 DNA간의 혼성화를 유발시켰다. 이후 S1 뉴클리아제를 처리하여 상보적인 내부 프라이머 DNA를 회수하는 방법은 상기 실시예 (2-2)와 동일하게 수행하였고 회수된 DNA를 20 ㎕의 증류수에 용해시켰다.

판토에아 글로메란스 (KCTC 2578) 유전자의 경우에는BglⅡ 또는HinfI을 처리하여 말단 부분이 절단된 두 종류의 키티나아제 유전자를 혼합하여 주형으로 사용하였고, 에어로모나스 펀크타타 (KCTC 2944) 유전자는 5' 말단을 절단하는DraI 또는 3' 말단을 절단하는NaeI으로 처리된 DNA를 혼합하여 주형으로 사용하였다. 두 종의 키티나아제 유전자를 각각 1 ng씩 주형으로 사용하였으며 S1 뉴클리아제에 의해 생산된 상보적인 내부 프라이머를 2 ㎕ 첨가하여 1차 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 20초의 반응을 45회 반복 실시한 후 72℃에서 30분간 추가로 반응시켰다. 상기 반응액에 과량의 말단 프라이머를 첨가하여 실시예 (2-4)와 동일한 방법으로 다시 2차 PCR 증폭반응을 수행하였으며, 생성된 약 600 bp의 DNA를 T-벡터 (Promega사)에삽입한 후 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다.

(6-2) 재조립 DNA의 확인

형질전환된 콜로니 중 임의로 6개를 선택하여서열번호 1의 Chi600f 프라이머와서열번호 2의 Chi1200r 프라이머를 이용하여 키티나아제 유전자를 증폭하였으며 이들의 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 결정한 6개의 클론 중 1개의 클론에서 DNA 재조립이 발견되었으며, 클론-B10의 경우에는 327번째 염기사이와 332번째 염기사이에서 주형교환이 일어난 것으로 나타나, 본 발명의 방법에 따르면 낮은 유사도의 이종 DNA 간에도 효과적으로 재조립이 일어날 수 있음을 확인하였다 (도 15). 클론-B10은서열번호 17로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조립 DNA 라이브러리 제조 방법은 이종 DNA간에 존재하는 공통 서열을 프라이머로 사용하므로 염기서열의 유사도가 낮은 경우에도 이종 DNA간의 우수한 DNA 재조립 효율을 나타낸다. 따라서, 효소 유전자, 프로모터, 바이러스 등 각종 DNA 염기서열간의 재조립을 유발하여 유용한 특성을 가지는 유전자를 얻는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1) 재조립시키고자 하는, 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥들을 혼성화하는 단계;

2) 상기 부분적으로 혼성화된 이종 DNA에서 상보적 결합에 참여하지 않은 부분을 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소로 제거하여 이종 DNA간에 완전하게 상보적 결합을 이룬 이중가닥 DNA 절편을 생성하는 단계;

3) 생성된 이중가닥 DNA 절편을 변성시켜 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 만드는 단계;

4) 상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 단계 1의 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥을 주형으로 하여 중합효소 반응을 통해 길이가 신장된 재조립 DNA 가닥을 만드는 단계; 및

5) 재조립하고자 하는 유전자의 양쪽 말단 부분의 염기서열에 해당하는 말단 프라이머를 첨가하여 중합효소 연쇄 반응으로 재조립 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 기원이 다른 DNA로부터 키메라 DNA 라이브러리를 제작하는 방법.

제 1항에 있어서, 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥의 혼성화는 기원이 서로 다른 이종 DNA를 혼합한 용액을 가열한 다음 급속히 냉각시켜 변성을 고정시키고, 염을 첨가한 후 50∼70℃에서 1∼12시간 반응시킴으로써 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 단일가닥 특이적인 DNA 분해효소는 S1 뉴클리아제 (S1 nuclease) 또는 멍 빈 뉴클리아제 (Mung Bean nuclease)의 내부 절단 단일가닥 특이 DNA 분해효소인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2는 S1 뉴클리아제를 500 내지 1,000 units/㎖ 농도로 사용하여 40 내지 45℃의 온도에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4는 재조립시키고자 하는 유전자의 양쪽 말단 부분 염기서열에 대한 말단 프라이머를 추가적으로 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

제 6항에 있어서, 말단 프라이머를 0.1 pmole/50 ㎕의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 5의 말단 프라이머를 20 내지 25 pmole/50 ㎕의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 기원이 서로 다른 이종 DNA 단일가닥들 중 한 종류의 DNA 단일가닥은 제한효소로 미리 절단된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4의 주형 DNA는 단계 1의 혼성화 반응에서 사용한 전체 길이 유전자 DNA에서 양쪽 말단 염기서열 일부가 절단된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 증폭된 재조립 DNA로 원핵생물 또는 진핵세포를 형질전환시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1 내지 단계 3에 의해 생성된 내부 프라이머 대신 재조립시키고자 하는 이종 DNA들간의 보존적인 염기서열에 상보적인 서열을 갖도록 인공적으로 합성한 프라이머가 대체 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항의 방법에 따라 제조된 키메라 DNA 라이브러리로부터 재조립 DNA를 검색하는 단계 및 이로부터 목적하는 성질을 갖는 DNA를 선별하는 단계를 포함하는 방향 진화 (directed mutagenesis) 방법.

제 13항에 있어서, 키메라 DNA 라이브러리로부터 선별되는 서로 다른 재조립 DNA를출발물질로 하여 제 1항의 단계들을 반복하는 것을 특징으로 하는 방향 진화 (directed mutagenesis) 방법.