KR100429001B1 - A Gene Coding for Intracellular Polyhydroxyalkanoate(PHA) Depolymerase from Alcaligenes latus - Google Patents

A Gene Coding for Intracellular Polyhydroxyalkanoate(PHA) Depolymerase from Alcaligenes latus Download PDF

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Abstract

본 발명은 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자의 아미노산 서열, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소는 다른 미생물 유래의 PHA 분해효소보다 분해능력이 우수하므로, 전기 유전자와 PHA 생합성효소계를 포함하는 재조합 미생물을 이용하면 효율적이고 경제적으로 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조할 수 있으며, PHA의 합성과 (R)-하이드록시카르복실산으로의 분해가 동시에 이루어져서 배양액으로 방출되므로, 전체공정을 크게 간소화하고 연속공정이 가능하여 전체 수율의 증가도 기대할 수 있다.The present invention provides a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alcaligenes latus , an amino acid sequence of an electric gene, a recombinant expression vector comprising an electric gene, and an optically pure (R) -hydride using the same. A method for mass production of oxycarboxylic acids. Since the intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkali generatus of the present invention is superior to the PHA degrading enzyme derived from other microorganisms, using a recombinant microorganism including an electric gene and a PHA biosynthetic enzyme system effectively and economically optically Pure (R) -hydroxycarboxylic acid can be prepared, and the synthesis of PHA and decomposition into (R) -hydroxycarboxylic acid are simultaneously released into the culture solution, greatly simplifying the overall process and allowing continuous processing. In addition, an increase in overall yield can be expected.

Description

알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소 유전자{A Gene Coding for Intracellular Polyhydroxyalkanoate(PHA) Depolymerase from Alcaligenes latus}A Gene Coding for Intracellular Polyhydroxyalkanoate (PHA) Depolymerase from Alcaligenes latus}

본 발명은 세포내 폴리하이드록시알칸산(PHA) 분해효소(intracellularpolyhydroxyalkanoate depolymerase)를 암호화하는 유전자 및 이를 이용하여 (R)-하이드록시카르복실산((R)-hydroxycarboxylic acid)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자의 아미노산 서열, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gene encoding intracellular polyhydroxyalkanoate depolymerase and a method for producing (R) -hydroxycarboxylic acid using the same. will be. More specifically, the present invention provides a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alcaligenes latus , an amino acid sequence of an electric gene, a recombinant expression vector comprising an electric gene, and optically pure using the same. A method for mass production of (R) -hydroxycarboxylic acid.

(R)-하이드록시카르복실산은 두개의 기능기 즉, 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)를 동시에 가지고 있어, 유용물질의 유기합성에 용이하고 합성물에 키랄 중심(chiral center)을 손쉽게 제공할 수 있으며, 또한 이 두 기능기는 전환도 용이하기 때문에 정밀화학분야에서 키랄성 전구체로서 다양하게 이용될 수 있다. 또한, (R)-하이드록시카르복실산은 항생제, 비타민, 향료, 페로몬(pheromone) 등의 합성을 위한 전구체와 의약품 디자인에 사용되는 비펩타이드 리간드(nonpeptide ligand) 개발 및 신규 의약품 개발을 위한 전구체 등으로의 폭넓은 응용이 기대되고 있으며, 특히 페니실린을 대체할 항생물질로 주목을 받고 있는 카바페넴계(carbapenem) 항생물질들의 전구체로 사용될 수 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 예를 들면, (R)-3-하이드록시부탄산-메틸 에스터(methy-(R)-3-hydroxybutyrate)로부터 카바페넴계 항생제 중 하나인 티에나마이신((+)-thiennamycin)을 합성하는 방법이 개발되어 보고된 바 있다(참조: Chiba and Nakai, Chem. Lett., 651-654, 1985).The (R) -hydroxycarboxylic acid has two functional groups, ie, a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH) at the same time, which facilitates organic synthesis of useful materials and provides a chiral center in the composite. It can be easily provided, and since these two functional groups are easy to convert, they can be variously used as chiral precursors in the fine chemical field. In addition, (R) -hydroxycarboxylic acid is a precursor for the synthesis of antibiotics, vitamins, flavors, pheromone and the like, as well as precursors for the development of nonpeptide ligands used in drug design and new drug development. It is expected to be widely used as a precursor to carbapenem antibiotics, which are particularly noteworthy as antibiotics to replace penicillin (Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65: 363-368, 1999). For example, a method of synthesizing thienamycin ((+)-thiennamycin), one of carbapenem antibiotics, from (R) -3-hydroxybutanoic acid-methyl ester (meth)-(R) -3-hydroxybutyrate Has been developed and reported (Ciba and Nakai, Chem. Lett., 651-654, 1985).

한편, PHA는 미생물에 의해 세포내에서 합성 및 축적되는 에너지 및 탄소원저장물질군으로서 하이드록시카르복실산들이 에스터(ester) 결합으로 연결된 폴리에스터이다. 생합성효소계의 광학특이성으로 인해 PHA를 구성하는 단량체인 하이드록시카르복실산은 4-하이드록시부탄산(4-hydroxybutyric acid) 등의 몇몇 광학이성질체가 존재하지 않는 경우를 제외하고 모두 R-형의 광학활성을 가지므로, 생합성된 PHA를 분해함으로써 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산할 수 있다. PHA의 일종인 폴리하이드록시부탄산(poly-(3-hydroxybutyrate), PHB) 또는 폴리하이드록시부탄산/하이드록시발레르산 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHB/V)를 화학적 방법으로 분해하여, (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드록시부탄산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxybutyrate), 또는 (R)-3-하이드록시발레르산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxyvalerate)를 생산하는 방법이 연구되어 보고된 바 있다(참조: Seebach et al., Org. Synth., 71:39-47, 1992; Seebach and Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65:495-503, 1982). 그러나, 전술한 (R)-하이드록시카르복실산의 화학적 분해방법에 의한 제조는 미생물 배양, 균체회수, 고분자 분리, 분해반응 및, 분리·정제로 이어지는 복잡한 공정으로 인한 수율의 감소와 다량의 유기용매 사용의 필요성 등의 문제점을 지니고 있다. 또한, 미생물 세포물질이 부산물로 다량 발생하게 되며, 현재까지 생산이 시도된 물질도 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산에 국한되어 있다.PHA, on the other hand, is a group of energy and carbon storage materials synthesized and accumulated in cells by microorganisms, and hydroxycarboxylic acids are polyesters connected by ester bonds. Due to the optical specificity of the biosynthetic enzyme system, hydroxycarboxylic acid, a monomer constituting PHA, is an R-type optical activity except that some optical isomers such as 4-hydroxybutyric acid are not present. Therefore, optically pure (R) -hydroxycarboxylic acid can be produced by decomposing the biosynthesized PHA. Polyhydroxybutyrate (PHB) or polyhydroxybutyrate / hydroxyvaleric acid copolymer (poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHB / V ) Is decomposed by chemical method, and (R) -3-hydroxybutanoic acid, (R) -3-hydroxybutanoic acid-alkylester (alkyl- (R) -3-hydroxybutyrate), or (R) -3 A method for producing alkyl- (R) -3-hydroxyvalerate has been studied and reported (see Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, 1992). Seebach and Zuger, Helvetica Chim.Acta, 65: 495-503, 1982). However, the above-mentioned preparation by the chemical decomposition method of (R) -hydroxycarboxylic acid can reduce the yield and a large amount of organic matter due to the complex process leading to microbial culture, cell recovery, polymer separation, decomposition reaction and separation and purification. There is a problem such as the need to use a solvent. In addition, a large amount of microbial cell material is generated as a by-product, and materials that have been produced until now are limited to (R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxy valeric acid.

본 발명자들은 PHA를 생산하는 미생물들이 PHA 생합성효소계와 함께 자체적으로 가지고 있는 PHA 분해효소를 이용하여 자가분해함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산을 포함하는 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산들을 생산하는 방법을 연구하여 발표한 바 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999; 이상엽 외, 대한민국 특허등록 제 250830호; Lee et al., PCT 국제특허출원 제 PCT/KR98/00395호, 1998). 전기 자가분해법은 종래의 화학적 방법에 비하여 훨씬 효율적인 바, 한 예로서 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)를 사용하는 경우 배양에 의해 PHB를 과량 축적시킨 후, pH를 적절히 맞추어 37℃로 30분간 방치함으로써 축적된 PHB의 95% 이상을 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시부탄산으로 분해·방출한다. 이러한 자가분해법은 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산 제조에 응용될 수 있으나, 근본적으로 PHA 축적공정과 분해공정을 개별적으로 진행하는 회분식 공정을 요하고 있다. 만약, 연속적으로 PHA 축적과 분해가 동시에 일어날 수 있다면, 부산물인 미생물 세포물질을 많이 줄일 수 있으며, 결과적으로 기질로부터의 하이드록시카르복실산 수율의 증가도 기대할 수 있을 것이다.The present inventors have found that various microorganisms (R) -3-hydroxy including (R) -3-hydroxybutanoic acid are synthesized by PHA-producing microorganisms by using PHA degrading enzymes that have their own PHA biosynthetic enzymes. A method for producing carboxylic acids has been studied and published (Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65: 363-368, 1999; Sang-Yeop et al., Republic of Korea Patent No. 250830; Lee et al., PCT International Patent Application No. PCT / KR98 / 00395, 1998). The electro-autolysis method is much more efficient than the conventional chemical method. For example, when Alcaligenes latus is used, the pH is accumulated excessively by culturing, and the pH is properly adjusted and left at 37 ° C. for 30 minutes. Thus, at least 95% of the accumulated PHB is decomposed and released into optically pure (R) -hydroxybutanoic acid. This autolysis can be applied to the production of various (R) -3-hydroxycarboxylic acids, but essentially requires a batch process in which the PHA accumulation process and the decomposition process are performed separately. If PHA accumulation and degradation can occur simultaneously, the by-products of microbial cell material can be greatly reduced, and consequently, an increase in the yield of hydroxycarboxylic acid from the substrate can be expected.

미생물내에서 PHA의 일반적인 합성 및 분해기작은 다음과 같다. 미생물이 탄소원은 충분하나 질소, 인산염 또는 마그네슘 등의 성장에 필수적인 요소가 제한된 불균형적인 성장 환경에 처하게 되면, PHA 생합성효소계가 발현하여 여분의 탄소원으로부터 PHA를 합성, 세포내에 축적한다(참조: Lee, Biotechnol. Bioeng., 49:1-14, 1996). 이후, 환경여건이 변화하여 제한되었던 성장요소가 다시 공급되면, 세포내 PHA 분해효소와 (R)-3-하이드록시카르복실산 올리고머 가수분해효소 등의 작용으로 PHA가 그 단량체인 (R)-3-하이드록시카르복실산으로 분해된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993).The general synthesis and degradation mechanisms of PHA in microorganisms are as follows. When microorganisms are in an imbalanced growth environment with sufficient carbon sources but limited growth factors such as nitrogen, phosphate or magnesium, the PHA biosynthesis system expresses and synthesizes PHA from extra carbon sources and accumulates intracellularly. , Biotechnol.Bioeng., 49: 1-14, 1996). Subsequently, when the growth factor, which was restricted due to environmental conditions, was supplied again, PHA is a monomer of (R)-under the action of intracellular PHA degrading enzyme and (R) -3-hydroxycarboxylic acid oligomer hydrolase. Degradation to 3-hydroxycarboxylic acids (Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 477-502, 1993).

이들의 미생물내 대사회로에서의 재사용을 위한 기작은 (R)-3-하이드록시부탄산의 경우만이 자세하게 연구되어 다음과 같이 밝혀졌다. 제조된 (R)-3-하이드록시부탄산은 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 작용에 의해 아세토아세테이트(acetoacetate)로 변환되고, 이는 미생물 대사회로에 재사용 된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 따라서, 미생물에 의한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 생산을 위하여 PHA 합성효소와 PHA 분해효소가 필요하며, (R)-3-하이드록시부탄산 생산의 경우, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 활성이 억제되거나 제거된 상황이 바람직하다.The mechanism for re-use in these microbial metabolic cycles was studied in detail only for (R) -3-hydroxybutanoic acid and found as follows. The prepared (R) -3-hydroxybutanoic acid is converted into acetoacetate by the action of (R) -3-hydroxybutanoic acid dehydrogenase, which is reused in the microbial metabolic circuit (see Muller and Seebach). , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 477-502, 1993; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65: 363-368, 1999). Therefore, PHA synthase and PHA degrading enzyme are required for the production of (R) -3-hydroxycarboxylic acid by microorganisms, and (R) -3 for (R) -3-hydroxybutanoic acid production. A situation in which the activity of hydroxybutanoic acid dehydrogenase is suppressed or eliminated is preferred.

본 발명자들을 비롯한 많은 연구진들에 의해 재조합 대장균을 이용하여 PHA를 효율적으로 생산하는 방법에 대한 연구가 진행되어 왔으며, PHB나 PHB/V의 경우 건조균체 질량의 80% 이상까지도 축적할 수 있는 기술 수준에까지 이르렀다(참조: Slater et al., J. Bacteriol., 170:4431-4436, 1988; Schubert et al., J. Bacteriol., 170:5837-5847, 1988; Kim et al., Biotechnol. Lett., 14:811-816, 1992; Fidler and Dennis, FEMS Microbiol. Rev., 103:231-236, 1992; Lee et al., J. Biotechnol., 32:203-211, 1994; Lee et al., Ann. NY Acad. Sci., 721:43-53, 1994; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1347, 1994; Lee and Chang, J. Environ. Polymer Degrad., 2:169-176, 1994; Lee and Chang, Can. J. Microbiol., 41:207-215, 1995; Yim et al., Biotechnol. Bioeng., 49:495-503, 1996; Lee and Lee, J. Environ. Polymer Degrad., 4:131-134, 1996; Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769, 1997; Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng.,58:325-328, 1998; Lee, Bioprocess Eng., 18:397-399, 1998; Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998; Wong and Lee, Appl. Microbial. Biotechnol., 50:30-33, 1998; Lee et al., Int. J. Biol. Macromol., 25:31-36, 1999).Many researchers, including the present inventors, have been researching how to efficiently produce PHA using recombinant E. coli, and in the case of PHB or PHB / V, the level of technology that can accumulate more than 80% of the dry cell mass (Slater et al., J. Bacteriol., 170: 4431-4436, 1988; Schubert et al., J. Bacteriol., 170: 5837-5847, 1988; Kim et al., Biotechnol. Lett. 14: 811-816, 1992; Fidler and Dennis, FEMS Microbiol. Rev., 103: 231-236, 1992; Lee et al., J. Biotechnol., 32: 203-211, 1994; Lee et al., Ann. NY Acad. Sci., 721: 43-53, 1994; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994; Lee and Chang, J. Environ.Polymer Degrad., 2: 169- 176, 1994; Lee and Chang, Can.J. Microbiol., 41: 207-215, 1995; Yim et al., Biotechnol.Bioeng., 49: 495-503, 1996; Lee and Lee, J. Environ.Polymer Degrad., 4: 131-134, 1996; Wang and Lee, Appl. Environ.Microbiol., 63: 4765-4769, 1997; Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng., 58:32 5-328, 1998; Lee, Bioprocess Eng., 18: 397-399, 1998; Choi et al., Appl.Environ.Microbiol., 64: 4897-4903, 1998; Wong and Lee, Appl.Microbial.Biotechnol. , 50: 30-33, 1998; Lee et al., Int. J. Biol. Macromol., 25: 31-36, 1999).

대장균은 원래 균체 내에 에너지 저장물질로서 PHA를 합성할 수 없고, 이를 분해하는 효소 또한 가지고 있지 않다. 아울러, (R)-3-하이드록시부탄산을 아세토아세테이트로 변환시키는 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소도 가지고 있지 않을 것으로 여겨진다. 다른 미생물의 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 도입하여 작제한 PHA 합성 재조합 대장균의 경우에도, PHA 생합성효소계만을 도입하였기 때문에, 균체 내에 합성, 축적된 PHA는 분해되지 않는다(참조: Lee, Trends Biotechnol., 14:98-105, 1996; Lee, Nature Biotechnol., 15:17-18, 1997). 따라서, 본 발명자들은 이러한 효율적인 PHA 합성 재조합 대장균에 세포내 PHA 분해효소를 동시에 도입, 발현시킴으로써 (R)-3-하이드록시카르복실산, 특히 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있으며, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소가 존재하지 않거나 활성이 없으면 (R)-3-하이드록시부탄산이 아세토아세테이트로 변환되지 않기 때문에 더 이상 대사에 사용되지 않을 것이라는 점에 착안하여, PHA 생합성 효소계와 세포내 PHA 분해효소를 동시에 도입한 재조합 미생물 및 이를 이용한 (R)-하이드록시카르복실산의 제조방법을 개발하였다(참조: 대한민국 특허출원 제 10-2000-0026158호). 그러나, 본 발명자들에 의하여 제공된 전기 (R)-하이드록시카르복실산의 제조방법은 배양 후 미생물 내에 분해되지 않고 남아 있는 PHA가존재하고, 이는 수율 감소 및 기질의 낭비로 인한 생산단가의 상승을 야기할 수 있다는 문제점이 지적되어 왔다.Escherichia coli cannot synthesize PHA as an energy storage material in its original cells, and it does not have an enzyme that degrades it. In addition, it is considered that it does not have (R) -3-hydroxybutanoic acid dehydrogenase which converts (R) -3-hydroxybutanoic acid into acetoacetate. Even in the case of PHA-synthesized recombinant E. coli prepared by introducing a gene encoding a PHA biosynthetic enzyme system of another microorganism, only PHA biosynthetic enzyme system was introduced, so that PHA synthesized and accumulated in the cells was not degraded (Lee, Trends Biotechnol. , 14: 98-105, 1996; Lee, Nature Biotechnol., 15: 17-18, 1997). Therefore, the present inventors are able to efficiently produce (R) -3-hydroxycarboxylic acid, especially (R) -3-hydroxybutanoic acid, by simultaneously introducing and expressing intracellular PHA degrading enzyme in such efficient PHA synthetic recombinant E. coli. Note that if (R) -3-hydroxybutanoic acid dehydrogenase is not present or inactive, it will no longer be used for metabolism because (R) -3-hydroxybutanoic acid is not converted to acetoacetate. Thus, a recombinant microorganism having a PHA biosynthetic enzyme system and an intracellular PHA degrading enzyme was introduced at the same time, and a method for preparing (R) -hydroxycarboxylic acid using the same was developed (see Korean Patent Application No. 10-2000-0026158). However, the method of preparing the electric (R) -hydroxycarboxylic acid provided by the present inventors has PHA remaining undecomposed in the microorganisms after culture, which increases production cost due to reduced yield and waste of substrate. It has been pointed out that it can cause.

한편, 세포내 PHA 분해효소 중 랄스토니아 유트로파 유래의 세포내 PHA 분해효소가 최근 클로닝되어 그 기작이 밝혀졌다(참조: Saegusa et al., J. Bacteriol., 183:94-100, 2001). 또한 본 발명자들은 최근에 랄스토니아 유트로파 유래의 세포내 PHA 분해효소를 PHA 생합성효소계와 함께 대장균에 도입하여 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있음을 발표한 바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 2000-0026158호).Meanwhile, the intracellular PHA degrading enzyme derived from Ralstonia eutropa has recently been cloned and its mechanism has been revealed (see Saegusa et al., J. Bacteriol., 183: 94-100, 2001). ). In addition, the present inventors recently announced that the intracellular PHA degrading enzyme derived from Ralstonia eutropa can be introduced into E. coli together with the PHA biosynthetic enzyme system to efficiently produce (R) -3-hydroxybutanoic acid. (Reference: Korean Patent Application No. 2000-0026158).

본 발명에서와 같이, PHA 생합성효소계를 세포내 PHA 분해효소와 함께 미생물 내에 발현하는 생물학적 공정에 의해 (R)-하이드록시카르복실산을 효율적으로 생산하는 생물학적 공정의 개발은 매우 최근에 시작된 것으로, PHA의 단량체로 사용될 수 있는 다양한 하이드록시카르복실산들을 효율적으로 생산하기 위해 더 깊고 지속적인 연구가 반드시 필요하고, 미생물 내에서 합성되는 PHA를 그 단량체로 분해하는데 가장 핵심이 되는 세포내 PHA 분해효소 신규 유전자의 클로닝과 그의 응용이 매우 중요하게 여겨져 왔다. 특히, PHA 합성효소들이 그 유래 미생물에 따라 성능이 다르기 때문에, 다른 미생물 종으로부터 유래한 PHA 분해효소들도 서로 다른 활성을 가질 것으로 예측할 수 있다. 본 발명자 그룹은 이전 연구의 결과로 알칼리게네스 레이터스 유래의 PHA 생합성효소계가 가장 뛰어난 PHA 합성능력을 가지고 있음을 보고한 바 있다(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998).As in the present invention, development of a biological process for efficiently producing (R) -hydroxycarboxylic acid by a biological process of expressing a PHA biosynthetic enzyme system in a microorganism with an intracellular PHA degrading enzyme is very recently started. In order to efficiently produce various hydroxycarboxylic acids that can be used as monomers of PHA, deeper and more continuous research is essential, and intracellular PHA degrading enzyme is the key to break down PHA synthesized in microorganism into its monomers. Cloning of genes and their applications have been considered very important. In particular, since PHA synthetases differ in performance depending on the microorganisms derived from them, it can be predicted that PHA degrading enzymes derived from different microbial species may have different activities. As a result of previous studies, the inventors have reported that the PHA biosynthetic enzyme derived from Alkali generasus has the highest PHA synthetizing capacity (see Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 4897-4903, 1998).

따라서, 연속적인 공정을 적용하여 보다 효율적이고 경제적으로 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하기 위한 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 요구되어 왔다.Therefore, there is a constant need to develop a method for producing (R) -3-hydroxycarboxylic acid more efficiently and economically by applying a continuous process.

이에, 본 발명자들은 광학활성을 갖는 (R)-하이드록시카르복실산을 연속공정이 가능하며 효율적이고 간단하게 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 알칼리게네스 레이터스 유래의 신규한 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자를 포함하는 발현벡터를 작제하여 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계의 발현 유전자를 포함하는 발현벡터와 함께 미생물을 형질전환하여 배양함으로써, (R)-하이드록시카르복실산이 생성, 배양액으로 방출되어 효율적이고도 경제적으로 (R)-하이드록시카르복실산을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made diligent research efforts to develop a method for continuously and efficiently and simply producing (R) -hydroxycarboxylic acid having optical activity. Cloning a gene encoding the PHA degrading enzyme, and constructing an expression vector containing the electric gene to transform the microorganism with the expression vector containing the expression gene of Alkali generatus or Ralstonia utropa PHA biosynthesis system By inverting and culturing, it was confirmed that (R) -hydroxycarboxylic acid was produced and released into the culture solution, thereby producing (R) -hydroxycarboxylic acid efficiently and economically, thereby completing the present invention.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkaligenus Rhesus.

본 발명의 두번째 목적은 전기 유전자의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide the amino acid sequence of the electric gene.

본 발명의 세번째 목적은 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a recombinant expression vector containing the electric gene.

본 발명의 네번째 목적은 전기 발현벡터 및 PHA 생합성효소계를 암호화하는유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 동시에 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.A fourth object of the present invention is to provide a recombinant microorganism simultaneously transformed with a recombinant expression vector comprising a gene encoding an electric expression vector and a PHA biosynthetic enzyme system.

본 발명의 다섯번째 목적은 전기 형질전환된 미생물을 배양하는 공정을 포함하는 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is a fifth object of the present invention to provide a method for preparing (R) -hydroxycarboxylic acid, which comprises the step of culturing an electrotransformed microorganism.

도 1은 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 4.8 kb 크기의 염색체 유전자부분의 제한효소 지도이다.1 is a restriction map of a 4.8 kb sized chromosomal gene portion containing a gene encoding an intracellular polyhydroxyalkanoic acid degrading enzyme derived from Alkali genes Rhesus of the present invention.

도 2는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pUC19Ald의 제한효소 지도이다.Figure 2 is a restriction map of the recombinant expression vector pUC19Ald containing a gene encoding an intracellular polyhydroxyalkanoic acid degrading enzyme derived from Alkali genes Rhesus of the present invention.

도 3은 랄스토니아 유트로파의 폴리하이드록시알칸산 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 p5184의 제한효소 지도이다.3 is a restriction map of a recombinant expression vector p5184 containing a gene encoding a polyhydroxyalkanoic acid biosynthetic enzyme system of Ralstonia utropa.

본 발명은 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)에서 유래된 세포내 PHA(polyhydroxyalkanoate) 분해효소를 암호화하는 유전자(서열번호 3) 및 전기 유전자와 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터 및 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 미생물을 동시에 형질전환시킨 재조합 미생물을 제공한다. 이때, 세포내 PHA 분해효소 유전자와 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터는 전기 유전자 고유의 발현 프로모터, trc, T7, trp, tac 또는 bad 유도발현 프로모터를 포함하고, 형질전환되는 미생물은 대장균(Escherichia coli) B, HB101, JM101, W3110 또는 XL1-Blue를 포함한다. 또한, 본 발명은 전기 형질전환된 미생물을 배양하여 균체 내에서 PHA의 합성과 분해가 동시에 이루어지게 함으로써, (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다. 이때, 제조되는 (R)-하이드록시카르복실산은 단량체 혹은 이량체 형태의 (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산을 포함한다.The present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene (SEQ ID NO: 3) encoding an intracellular PHA (polyhydroxyalkanoate) degrading enzyme derived from Alcaligenes latus and a promoter operably linked to an electric gene. It provides a recombinant microorganism transformed at the same time with a recombinant expression vector containing a gene encoding a PHA biosynthetic enzyme system. At this time, a promoter that can be operably linked to the intracellular PHA degrading enzyme gene includes an electric gene-specific expression promoter, trc, T7, trp, tac or bad induced expression promoter, and the transformed microorganism is Escherichia coli B, HB101, JM101, W3110 or XL1-Blue. In addition, the present invention comprises the step of culturing the electro-transformed microorganism to simultaneously synthesize and degrade PHA in the cells, to obtain (R) -hydroxycarboxylic acid, optically pure (R) Provided are methods for preparing hydroxycarboxylic acids. At this time, the (R) -hydroxycarboxylic acid to be prepared includes (R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxyvaleric acid in monomer or dimer form.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 클로닝하기 위하여, 알칼리게네스 레이터스의 유전체 DNA를 제한효소 BamHI으로 절단한 후, 많은 복제수(high copy number)를 갖는 플라스미드 벡터인 pUC19(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 클로닝하여 작제하였다. 또한, 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성효소계인 PHA 합성효소(synthase, PhaC), 베타-케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA) 그리고 환원효소(reductase, PhaB)를 암호화하는 오페론(operon)으로 구성된 유전자(서열번호 1)와parB(hok/sok)locus(서열번호 2)(참조: Gedes, Bio/Technology, 6:1402-1405, 1988)를 포함하는 DNA 조각은 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994)를 제한효소XbaI으로 절단하여 수득하고, 이를 중간 복제수(medium copy number)를 가지며 pUC19 유래의 플라스미드와 상호존재가 가능한 플라스미드인 pACYC184(New England Biolabs, USA)의 제한효소XbaI위치에 삽입하여 p5184를 작제하여, 전기 알칼리제네스 레이터스 염색체 DNA 조각을 포함하는 재조합 발현벡터와 함께 대장균을 형질전환하여 플라스미드 라이브러리(plasmid library)를 구축하였다. 전기 형질전환된 대장균을 20g/L의 포도당이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하고, (R)-3-하이드록시부탄산을 생산하는 재조합 대장균을 선별하여 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 가진 플라스미드 pUC19Ald를 수득하였다. 전기 플라스미드 pUC19Ald를 제한효소 BamHI으로 절단하여 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 4.8 kb 크기의 DNA 절편을 수득하였다. 본 발명에서 전기 유전자는 알칼리게네스 레이터스 고유의 항시적 발현 프로모터에 의해 발현되었으나, 전기 프로모터를 대장균에서 작동하는 다른 항시적 발현 프로모터로 치환하여 사용하여도 유사한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 또한, 항시적 발현 프로모터가 아니더라도 유도발현 프로모터를 이용하여 전기 유전자를 발현시킬 수도 있을 것이다.In order to clone the intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkalines Rhesus, the genome DNA of Alkaliness Rhesus was digested with restriction enzyme BamHI, followed by pUC19, a plasmid vector having a high copy number. : Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). In addition, it is an operon encoding PHA synthase (synthase, PhaC), beta-ketothiolase (PhaA), and reductase (PhaB), which is a Ralstonian eutrophic PHA biosynthetic enzyme. DNA fragments containing the constructed gene (SEQ ID NO: 1) and parB ( hok / sok) locus (SEQ ID NO: 2) (Gedes, Bio / Technology, 6: 1402-1405, 1988) are plasmid pSYL105 (Lee et. al., Biotechnol.Bioeng., 44: 1337-1347, 1994), was obtained by cleavage with restriction enzyme Xba I, which had a medium copy number and was interleaved with a plasmid derived from pUC19, pACYC184. P5184 was constructed by inserting the restriction enzyme Xba I position of New England Biolabs, USA, and transforming Escherichia coli with a recombinant expression vector containing an electroalkogenase chromosomal DNA fragment to construct a plasmid library. It was. The transformed Escherichia coli was cultured in LB (Luria-Bertani) medium to which 20 g / L of glucose was added, and recombinant Escherichia coli which produced (R) -3-hydroxybutanoic acid was selected to obtain an E. coli strain. Plasmid pUC19Ald was obtained with a gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme (SEQ ID NO: 3). The plasmid pUC19Ald was digested with restriction enzyme BamHI to obtain a 4.8 kb DNA fragment containing a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkali generatus. In the present invention, the electric gene was expressed by the constant expression promoter, which is unique to Alkgen gene Rhesus, but similar results may be obtained by substituting the electric promoter with other constitutive expression promoters operating in E. coli. In addition, even if it is not a constant expression promoter, it is also possible to express an electric gene using an induction promoter.

전기 작제한 재조합 발현벡터들은 전기용출(electroporation)에 의해 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 전기 PHA 생합성효소계를 암호화하는 유전자와 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물은 배양시 전기 효소들의 발현에 의해 (R)-3-하이드록시카르복실산의 단량체 및 이량체를 제조하여 배양액으로 분비하게 된다. 이때, 사용될 수 있는 PHA 생합성효소계와 세포내 PHA 분해효소는 같은 미생물에서 유래된 것이나 또는 다른 미생물에서 유래된 것이어도 무관하다. PHA 생합성효소계와 세포내 PHA 분해효소를 가지는 재조합 미생물을 작제한 다음, 적절한 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 (R)-하이드록시카르복실산이 효율적으로 생산될 수 있음을 확인하고, 전기 재조합 미생물을 배양함에 있어, 배양시간은 (R)-3-하이드록시부탄산의 생산은 30 내지 70시간, (R)-3-하이드록시부탄산/(R)-3-하이드록시발레르산의 생산은 15 내지 70시간이 바람직하다. 재조합 미생물에서 분비된 (R)-하이드록시카르복실산은 특정조건의 LC 또는 HPLC로 분리할 수 있다. 필요한 경우, 이량체를 염기조건에서 가열함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산으로 분해할 수도 있다.The recombinantly constructed recombinant expression vectors were transformed into E. coli XL1-Blue by electroporation. Recombinant microorganisms transformed with the gene encoding the electric PHA biosynthetic enzyme system and the gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme are used to express monomers and dimers of (R) -3-hydroxycarboxylic acid by expression of the electric enzymes in culture. It is prepared and secreted into the culture solution. At this time, the PHA biosynthetic enzyme system and the intracellular PHA degrading enzyme which may be used may be derived from the same microorganism or from another microorganism. A recombinant microorganism having a PHA biosynthetic enzyme system and an intracellular PHA degrading enzyme was constructed, and then cultured in a medium containing an appropriate carbon source to confirm that (R) -hydroxycarboxylic acid can be efficiently produced. In culturing, the incubation time was 30 to 70 hours for the production of (R) -3-hydroxybutanoic acid, and the production of (R) -3-hydroxybutanoic acid / (R) -3-hydroxyvaleric acid was 15. To 70 hours is preferred. (R) -hydroxycarboxylic acids secreted from recombinant microorganisms can be separated by LC or HPLC under specific conditions. If necessary, the dimer can be decomposed into (R) -3-hydroxybutanoic acid by heating under basic conditions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예 1: 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자의 클로닝 Example 1 Cloning of a Gene Encoding Intracellular PHA Degrading Enzyme from Alkali Generus

알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자(PHA depolymerization gene)를 클로닝하기 위하여, 먼저 마머(Marmur)의 방법으로 알칼리게네스 레이터스 염색체 DNA를 분리하였다(참조: Marmur, J. Mol. Biol., 3:208-218, 1961). 전기 분리한 알칼리게네스 레이터스 염색체 DNA를 제한효소BamHI으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 실시하여 4 내지 9kb 크기의 유전자 절편들을 분리하였다. 이들을 제한효소BamHI로 절단한 높은 복제수의 플라스미드 pUC19(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 클로닝하여, 플라스미드 라이브러리를 구축하였다. 또한, 랄스토니아 유트로파 유래의 PHA 생합성효소계인 PHA합성효소(synthase, PhaC), 베타-케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA) 그리고 환원효소(reductase, PhaB)를 암호화하는 오페론(operon)으로 구성된 유전자(서열번호 1)와parB(hok/sok)locus(서열번호 2)(참조: Gedes, Bio/Technology, 6:1402-1405, 1988)를 포함하는 DNA 조각은 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1347, 1994)를 제한효소XbaI으로 절단하여 수득하고, 이를 중간 복제수(medium copy number)를 가지며 pUC19 유래의 플라스미드와 상호존재가 가능한 플라스미드인 pACYC184(New England Biolabs, USA)의 제한효소XbaI위치에 삽입하여 p5184를 작제하였다. 도 1은 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 4.8 kb 크기의 염색체 유전자부분의 제한효소 지도이다. 전기 알칼리게네스 레이터스의 DNA 조각을 포함하는 플라스미드 라이브러리를 전기용출(electroporation)에 의해 플라스미드 p5184를 가지고 있는 재조합 대장균 XL1-Blue(Stratagene Cloning System, USA)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 50㎎/L)과 클로람페니콜(chloramphenicol, 50mg/L), 및 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 두 종의 플라스미드를 함께 갖는 재조합 대장균들을 1차 선별하였다. 선별된 재조합 대장균들을 20g/L의 포도당이 첨가된 LB 배지에 접종하여, 37℃ 온도에서 250rpm 속도로 3일간 배양하였다. 배양액 2㎖씩을 취하여 14,000rpm으로 5분간 원심분리한 후, 상등액을 취하여 극공 크기가 0.2㎜인 필터로 여과한 다음, HPLC로 분석하여 (R)-3-하이드록시부탄산을 생산하는 재조합 대장균을 선별함으로써, 알칼리게네스레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하였다. 선별된 재조합 대장균으로부터 염기용해법(alkaline lysis method)에 의해 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 다량분리하였다. 전기 분리한 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 ‘pUC19Ald’라 명명하였다. 도 2는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pUC19Ald의 제한효소 지도이다.In order to clone the PHA depolymerization gene from the Alcaligenes latus , which encodes the intracellular PHA degrading enzyme, firstly, the Almergenes chromosomal DNA was isolated by the method of Marmur (see Marmur, J. Mol. Biol., 3: 208-218, 1961). Alkaligenase Rhesus chromosome DNA was isolated by digestion with restriction enzyme Bam HI and subjected to agarose gel electrophoresis to separate gene fragments of 4 to 9 kb in size. These were cloned into high copy number plasmid pUC19 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) digested with restriction enzyme Bam HI, The plasmid library was constructed. In addition, operon encoding PHA synthase (synthase, PhaC), beta-ketothiolase (β-ketothiolase, PhaA) and reductase (PhaB), which are PHA biosynthetic enzymes derived from Ralstonia eutropa. DNA fragments comprising genes (SEQ ID NO: 1) and parB ( hok / sok) locus (SEQ ID NO: 2) (Gedes, Bio / Technology, 6: 1402-1405, 1988) are plasmid pSYL105 (see: Lee et al., Biotechnol.Bioeng., 44: 1337-1347, 1994), was obtained by cleavage with restriction enzyme Xba I, which had a medium copy number and was able to coexist with plasmids derived from pUC19. P5184 was constructed by inserting the restriction enzyme Xba I position of pACYC184 (New England Biolabs, USA). 1 is a restriction map of a 4.8 kb sized chromosomal gene portion containing a gene encoding an intracellular polyhydroxyalkanoic acid degrading enzyme derived from Alkali genes Rhesus of the present invention. A plasmid library containing DNA fragments of electroalkaliencers was introduced into recombinant Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene Cloning System, USA) carrying plasmid p5184 by electroporation, and then ampicillin (50 mg / kg). L) and LB flat media (yeast extract, 5 g / L; tryptone, 10 g / L; NaCl, 10 g / L) with chloramphenicol (50 mg / L) and bacto-agar (15 g / L) Recombinant E. coli with two plasmids together in L) were first screened. Selected recombinant E. coli were inoculated in LB medium to which 20 g / L of glucose was added and incubated at 37 ° C. at 250 rpm for 3 days. Take 2 ml of the culture solution, centrifuge at 14,000 rpm for 5 minutes, filter the supernatant, filter it with a filter with a pore size of 0.2 mm, and analyze it with HPLC to produce (R) -3-hydroxybutanoic acid. By selection, the gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkaligenerators was cloned. From the selected recombinant E. coli, a large number of plasmids containing a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkali generasus was analyzed by an alkaline lysis method. The plasmid containing the gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme derived from the electrogenerated Alkali genes Rhesus was named 'pUC19Ald'. Figure 2 is a restriction map of the recombinant expression vector pUC19Ald containing a gene encoding an intracellular polyhydroxyalkanoic acid degrading enzyme derived from Alkali genes Rhesus of the present invention.

실시예 2: 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자의 염기서열 분석 Example 2 Sequence Analysis of a Gene Encoding Intracellular PHA Degrading Enzyme from Alkali Generus

실시예 1에서 클로닝한 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 분석하기 위하여, 먼저 상기 분리한 플라스미드 pUC19Ald를 염기용해법에 의해 다량 분리하였다. 전기 분리한 pUC19Ald를 주형 DNA로 하여 자동 DNA 염기서열분석기(ABI Prism 377, Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 전체 염기서열을 분석하였다.In order to analyze the nucleotide sequence of the gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkaligenes Rhesus cloned in Example 1, first, the isolated plasmid pUC19Ald was isolated by a large amount of lysis. Using the isolated pUC19Ald as the template DNA, the entire sequence was analyzed using an automatic DNA sequencing machine (ABI Prism 377, Perkin-Elmer Co., USA).

전기 분석한 염기서열로부터 NCBI(The National Center for Biotechnology Information)에서 온라인으로 제공하는 ORF finder(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/) 및 Promoter predicter(참조:http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 등을 이용하여 전기 분석된 염기서열 내에 존재하는 개방형 해독구조(open reading frame, ORF)를 분석한 결과, 1.4 kbp 크기의 알칼리게네스 레이터스 유패의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자를 확인하였다. 전기 분석된 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소의 유전자 지도 및 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자가 포함된 영역을 도 3에 나타내었다. 도 3은 랄스토니아 유트로파의 폴리하이드록시알칸산 생합성효소계를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 p5184의 제한효소 지도이다. 또한, 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 염기서열(서열번호 3) 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열(서열번호 4)을 서열목록에 나타내었다.ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/) and Promoter predicter available online from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) //www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html), etc., analyzed the open reading frame (ORF) present in the electrically analyzed sequencing. Genes encoding intracellular PHA degrading enzymes were identified. FIG. 3 shows a gene map of the alkaline PHA degrading enzyme derived from Alkali generacus and the region encoding the gene encoding the intracellular PHA degrading enzyme. 3 is a restriction map of a recombinant expression vector p5184 containing a gene encoding a polyhydroxyalkanoic acid biosynthetic enzyme system of Ralstonia utropa. In addition, the nucleotide sequence encoding the intracellular PHA degrading enzyme (SEQ ID NO: 3) and the amino acid sequence translated therefrom (SEQ ID NO: 4) are shown in the sequence listing.

전기 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 염기서열 및 아미노산 서열은 이미 보고된 랄스토니아 유트로파 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 염기서열 및 아미노산 서열과 모든 보고된 다양한 미생물 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 염기서열 및 아미노산 서열과 상동성 검사를 실시한 결과, 전혀 상동성(homology)이 없음을 알 수 있었다.Nucleotide and amino acid sequences encoding intracellular PHA degrading enzymes derived from electroalkaliencers have already been reported, and all reported sequences and amino acid sequences encoding intracellular PHA degrading enzymes derived from Ralstonia eutropa As a result of homology with the nucleotide sequence and amino acid sequence encoding intracellular PHA degrading enzymes derived from various microorganisms, it was found that there is no homology at all.

실시예 3: 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소와 랄스토니아 유트로파 유래의 PHA 생합성효소계를 동시에 도입한 재조합 대장균의 배양에 의한 (R)-3-하이드록시부탄산의 제조 Example 3 Preparation of (R) -3-hydroxybutanoic Acid by Culture of Recombinant Escherichia Coli Introduced by Intracellular PHA Degrading Enzyme Derived from Alkali Geneus Rhesus and PHA Biosynthetic System Derived from Ralstonia Eutropa

전기 실시예 1에서 작제한 플라스미드 pUC19Ald와 플라스미드 p5184를 전기용출로 대장균 XL1-Blue에 동시에 도입하여 재조합 대장균을 구축하였다. 전기의 재조합 대장균은 '대장균(E. coli) XL1-Blue/pUC19Ald;p5184'라 명명하고, 2001년 11월 22일 국제 기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10127BP로 기탁하였다. 전기 재조합 대장균을 50㎎/L의 엠피실린과 50mg/L의 클로람페니콜을 첨가한 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖의 배양액을 취해 20g/L의 포도당과 20㎎/L의 티아민(thiamine)을 첨가한 100㎖의 R배지(참조: Lee and Chang, Biotechnol. Lett., 15:971-974, 1993) 또는 20g/L의 포도당을 첨가한 100㎖의 LB배지를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하여, 플라스크 배양실험을 수행하였다. 이때, R배지는 (NH4)2HPO4, 4g/L; KH2PO4, 13.5g/L; 시트르산, 1.7 g/L; 및, 미량의 금속용액, 10㎖/L을 함유하며, 미량의 금속용액 조성은 5M HCl 수용액 1L당 10g의 FeSO4·7H2O; 2g의 CaCl2; 2.2g의 ZnSO4·7H2O; 0.5g의 MnSO4·4H2O; 1g의 CuSO4·5H2O; 0.1g의 (NH4)6Mo7O24·4H2O; 및, 0.02g의 Na2B4O7·10H2O를 함유하며, 배양은 37℃ 온도에서 250rpm의 속도로 수행하였다. 클로닝된 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자는 항시적(constitutive) 발현 프로모터를 함유하고 있기 때문에 유도발현은 필요하지 않았다. 이 경우 프로모터를 다른 종류의 항시적 프로모터나, trc 프로모터(참조: Amann and Brosius, Gene, 40:183-190, 1985), T7 프로모터(참조: Caton and Robertson, Nucleic Acids Res., 7:1445-1456, 1979), trp 프로모터(참조: Yanofsky et al., Nucleic Acids Res.,9:6647, 1981), tac 프로모터(참조: de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:21-25, 1983), bad 프로모터(참조: Smith and Schleif, J. Biol. Chem., 253:6931-6933, 1978) 등 대장균에서 단백질 발현을 가능하게 하는 다른 유도발현 프로모터로 바꾸면, 유도발현에 의한 시스템의 작제도 가능할 것이다. 배양시간에 따라 배양액을 취하여 제조된 (R)-3-하이드록시부탄산을 HPLC로 분석하였으며, 51시간 배양 후에 얻은 건조균체의 농도, PHB 농도, PHB 함유량, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도, 이량체 농도 등을 하기 표 1에 나타내었다. 이때, 표 1의 PHB 함유량은 단위 건조균체 무게 당 축적된 PHB의 무게로, 최종 수율은 단위 포도당 질량당 생산된 단량체 농도와 단량체 농도로 환산한 이량체 농도의 합으로 정의하였다. 재조합 미생물에서 이량체가 생성되는 이유는 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소가 대장균 세포내에 축적된 PHB의 에스터 연결고리(ester bond)에 작용하여, 연결고리를 절단함과 동시에 PHA가 이량체 이하의 크기가 되면 쉽게 균체 밖으로 배출되기 때문으로 추측되었다.The plasmid pUC19Ald and plasmid p5184 prepared in Example 1 were simultaneously introduced into E. coli XL1-Blue by electrolysis to construct recombinant E. coli. Recombinant Escherichia coli is named as E. coli XL1-Blue / pUC19Ald; p5184, and it was established on November 22, 2001 in the Genetic Bank of Korea Institute of Biotechnology (KCTC, 52, Eeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea). Deposited with accession number KCTC 10127BP. The recombinant E. coli was incubated for 12 hours in LB medium containing 50 mg / L of empicillin and 50 mg / L of chloramphenicol, and then 1 ml of the culture medium was taken and 20 g / L of glucose and 20 mg / L of thiamine were added. Inoculated into a 100 ml R medium (Lee and Chang, Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993) or a 250 ml flask containing 100 ml of LB medium containing 20 g / L of glucose. , Flask culture experiment was performed. At this time, the R medium (NH 4 ) 2 HPO 4 , 4g / L; KH 2 PO 4 , 13.5 g / L; Citric acid, 1.7 g / L; And a trace metal solution, 10 ml / L, wherein the trace metal solution composition is 10 g of FeSO 4 · 7H 2 O per 1 L of 5 M HCl aqueous solution; 2 g CaCl 2 ; 2.2 g ZnSO 4 7H 2 O; 0.5 g MnSO 4 4H 2 O; 1 g CuSO 4 .5H 2 O; 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .4H 2 O; And 0.02 g of Na 2 B 4 O 7 .10H 2 O, and the culture was performed at a rate of 250 rpm at a temperature of 37 ° C. The gene encoding the cloned PHA degrading enzyme contained a constitutive expression promoter, so no induction was required. In this case, the promoter may be a different type of continual promoter, trc promoter (Amann and Brosius, Gene, 40: 183-190, 1985), or T7 promoter (Caton and Robertson, Nucleic Acids Res., 7: 1445-). 1456, 1979), trp promoter (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647, 1981), tac promoter (de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 21- 25, 1983), bad promoters (Smith and Schleif, J. Biol. Chem., 253: 6931-6933, 1978) and other inducible promoters that allow protein expression in Escherichia coli. May be possible. The (R) -3-hydroxybutanoic acid prepared by taking the culture medium according to the incubation time was analyzed by HPLC, and the concentration of dry cells, PHB concentration, PHB content, and monomer (R) -3- produced after 51 hours of incubation. The concentration of hydroxybutanoic acid, dimer concentration, and the like are shown in Table 1 below. In this case, the PHB content in Table 1 is the weight of PHB accumulated per unit dry cell weight, the final yield was defined as the sum of the dimer concentration converted into monomer concentration and monomer concentration produced per unit glucose mass. The reason for the formation of dimers in recombinant microorganisms is that intracellular PHA degrading enzymes derived from Alkaligenerrass act on the ester bonds of PHB accumulated in E. coli cells, resulting in cleavage of the linkages and at the same time It was presumed that it was easily discharged out of the cell when the size was below the sieve.

표 1: 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 도입한 재조합 대장균의 배양에 의한 (R)-3-하이드록시부탄산의 제조Table 1: Preparation of (R) -3-hydroxybutanoic acid by culturing recombinant Escherichia coli with an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkali generatus

배지badge 배양온도/배양시간Incubation temperature / culture time 건조균체의농도(g/L)Dry cell concentration (g / L) PHB의농도(g/L)PHB concentration (g / L) PHB의함유량(%)Content of PHB (%) 단량체의농도(g/L)Monomer concentration (g / L) 이량체의농도(g/L)Dimer Concentration (g / L) 최종수율(%)Final yield (%) R+포도당+티아민R + Glucose + Thiamine 37℃/51시간37 ℃ / 51 hours 2.232.23 0.070.07 33 1.21.2 7.17.1 4848 LB+포도당LB + Glucose 37℃/51시간37 ℃ / 51 hours 3.323.32 1.711.71 5252 0.20.2 3.63.6 2222

또한, 다른 종류의 대장균에서도 상기 플라스미드 시스템들이 작동하는 것을 확인하기 위하여, 대장균 B(ATCC 11303), HB101(참조: Boyer and Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 41:459-472, 1969), JM101(참조: Messing et al. Nucleic Acids Res., 9:309-321, 1981), W3110(ATCC 27325) 등을 각각 전기용출에 의해 2종의 플라스미드들로 함께 형질전환하여 총 4종의 재조합 대장균을 구축하였다. 구축한 재조합 대장균들을 100㎎/L 엠피실린을 첨가한 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖을 취해 20g/L의 포도당을 첨가한 100㎖의 LB배지를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하여 플라스크 배양을 수행하였다. 51시간 배양 후, 약 0.1 내지 0.3g/L의 (R)-3-하이드록시부탄산 단량체와 약 1 내지 3g/L의 이량체가 제조되어 배지 내로 방출됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 전기 작제한 플라스미드는 다양한 대장균 균주에 사용할 수 있으며, 본 실시예에서 사용한 4종의 대장균 이외의 다른 다양한 대장균에서도 사용될 수 있음은 자명하다.In addition, to confirm that the plasmid systems work in other types of E. coli, E. coli B (ATCC 11303), HB101 (Boyer and Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 41: 459-472, 1969) , JM101 (Messing et al. Nucleic Acids Res., 9: 309-321, 1981), W3110 (ATCC 27325), etc., were transformed together into two plasmids by electroelution, respectively, for a total of four recombinants. Escherichia coli was constructed. The recombinant E. coli were constructed and incubated for 12 hours in LB medium containing 100 mg / L empicillin, and then 1 ml was taken and inoculated into a 250 ml flask containing 100 ml LB medium containing 20 g / L of glucose. Was performed. After incubation for 51 hours, about 0.1 to 0.3 g / L of (R) -3-hydroxybutanoic acid monomer and about 1 to 3 g / L of dimer were prepared and released into the medium. Therefore, it is apparent that the previously constructed plasmid can be used in various E. coli strains, and can be used in various E. coli other than the four E. coli strains used in this example.

실시예 4: 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소를 도입한 재조합 대장균의 배양에 의한 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산의 동시 제조 Example 4 Simultaneous Preparation of (R) -3-hydroxybutanoic Acid and (R) -3-hydroxyvaleric Acid by Culture of Recombinant Escherichia Coli Introduced by Intracellular PHA Degrading Enzyme Derived from Alkali Generus

재조합 대장균을 이용하여 (R)-3-하이드록시부탄산 외의 다른 하이드록시카르복실산도 제조할 수 있는지 여부를 확인하고자, 전기 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Ald;p5184(KTCT-10127BP)를 10g/L의 포도당과 1g/L의 프로피온산, 및 20mg/L의 티아민을 첨가한 R배지에서 37℃의 온도 및 250rpm의 속도로 48시간동안 플라스크 배양하였다. 배양 후 얻은 건조균체의 농도, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도, 및 (R)-3-하이드록시발레르산의 농도는 각각 0.72 g/L, 1.32 g/L, 및 0.25 g/L였다. 이로 부터, 재조합 대장균을 이용하여 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산을 함께 효율적으로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 재조합 대장균에 의해 합성될 수 있는 다른 종류의 PHA들도 본 발명의 방법과 같은 방법으로 분해를 하게 되면, 다양한 (R)-하이드록시카르복실산을 생산할 수 있는 것은 자명하다.To determine whether other recombinant hydroxycarboxylic acids other than (R) -3-hydroxybutanoic acid can be prepared using recombinant E. coli, the recombinant E. coli XL1-Blue / pUC19 Ald; p5184 (KTCT-10127BP) 10g / L The flasks were incubated for 48 hours at a temperature of 37 ° C. and a speed of 250 rpm in an R medium to which glucose and 1 g / L propionic acid and 20 mg / L thiamine were added. The concentration of the dry cells obtained after the culture, the concentration of the resulting monomer (R) -3-hydroxybutanoic acid, and the concentration of (R) -3-hydroxyvaleric acid were 0.72 g / L, 1.32 g / L, and 0.25 g / L. From this, it was confirmed that (R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxy valeric acid can be efficiently produced using recombinant E. coli. In addition, it is obvious that other types of PHAs that can be synthesized by recombinant E. coli can produce various (R) -hydroxycarboxylic acids if they are degraded by the same method as the method of the present invention.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 유래의 세포내 PHA 분해효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자의 아미노산 서열, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 대량생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 세포내 PHA 분해효소는 다른 미생물 유래의 PHA 분해효소보다 분해능력이 우수하므로, 전기 유전자와 PHA 생합성효소계를 포함하는 재조합 미생물을 이용하면 효율적이고 경제적으로 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조할 수 있으며, PHA의 합성과 (R)-하이드록시카르복실산으로의 분해가 동시에 이루어져서 배양액으로 방출되므로, 전체공정을크게 간소화하고 연속공정이 가능하여 전체 수율의 증가도 기대할 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a gene encoding an intracellular PHA degrading enzyme derived from Alcaligenes latus , an amino acid sequence of an electric gene, a recombinant expression vector comprising the electric gene, and using the same. Provided are methods for mass production of optically pure (R) -hydroxycarboxylic acids. Since the intracellular PHA degrading enzyme derived from Alkali generatus of the present invention is superior to the PHA degrading enzyme derived from other microorganisms, using a recombinant microorganism including an electric gene and a PHA biosynthetic enzyme system effectively and economically optically Pure (R) -hydroxycarboxylic acid can be prepared, and the synthesis of PHA and decomposition into (R) -hydroxycarboxylic acid are simultaneously released to the culture medium, greatly simplifying the whole process and allowing continuous processing. In addition, an increase in overall yield can be expected.

Claims (14)

알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)에서 유래되었으며, 서열번호 3의 염기서열로 나타내어지는 PHA(polyhydroxyalkanoate) 분해효소 유전자.PHA (polyhydroxyalkanoate) degrading enzyme gene derived from Alcaligenes latus and represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 제 1항의 유전자로부터 번역되어, 서열번호 4의 아미노산 서열로 나타내어지는 PHA 분해효소.A PHA degrading enzyme translated from the gene of claim 1 and represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO. 제 1항의 PHA 분해효소 유전자와 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터.A recombinant expression vector comprising a promoter operably linked to the PHA degrading enzyme gene of claim 1. 제 3항에 있어서,The method of claim 3, 프로모터는 PHA 분해효소 유전자 고유의 발현 프로모터, trc, T7,The promoter is an expression promoter specific to the PHA degrading enzyme gene, trc, T7, trp, tac 및 bad 유도발현 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종임을 특징으로 하는trp, tac, and bad induced expression promoter characterized in that the one selected from the group consisting of 재조합 발현벡터.Recombinant Expression Vector. 제 1항의 PHA 분해효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pUC19Ald.Recombinant expression vector pUC19Ald comprising the PHA degrading enzyme gene of claim 1. PHA 합성효소 유전자와parB(hok/sok)locus(서열번호 2)를 포함하는 재조합 발현벡터 p5184.Recombinant expression vector p5184 comprising a PHA synthase gene and parB (hok / sok) locus (SEQ ID NO: 2). 제 3항의 재조합 발현벡터 및 PHA 생합성효소계 유전자(서열번호 1)를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물.A microorganism transformed with a recombinant expression vector comprising a recombinant expression vector of claim 3 and a PHA biosynthetic enzyme gene (SEQ ID NO: 1). 제 7항에 있어서,The method of claim 7, wherein 미생물은 대장균(E. coli) B, HB101, JM101, W3110 및 XL1-Blue로 구 성된 그룹으로부터 선택되는 1종임을 특징으로 하는Microorganism is one species selected from the group consisting of E. coli B, HB101, JM101, W3110 and XL1-Blue 미생물.microbe. 재조합 발현벡터 pUC19Ald 및 재조합 발현벡터 p5184로 형질전환된 대장균(E. coli) XL1-Blue/pUC19Ald;p5184(KCTC-10127BP). E. coli XL1-Blue / pUC19Ald; p5184 (KCTC-10127BP) transformed with the recombinant expression vector pUC19Ald and the recombinant expression vector p5184. 제 7항의 미생물을 배양하고, 그로부터 (R)-3-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는, 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.A method of producing optically pure (R) -3-hydroxycarboxylic acid, comprising culturing the microorganism of claim 7 and obtaining (R) -3-hydroxycarboxylic acid therefrom. 제 10항에 있어서,The method of claim 10, 배양은 연속식 또는 회분식 배양으로 수행됨을 특징으로 하는 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.The process for producing optically pure (R) -3-hydroxycarboxylic acid, characterized in that the culturing is carried out in a continuous or batch culture. 제 10항에 있어서,The method of claim 10, (R)-3-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드 록시발레르산인 것을 특징으로 하는(R) -3-hydroxycarboxylic acid is characterized in that (R) -3-hydroxybutanoic acid, (R) -3-hydroxy valeric acid 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.Process for preparing optically pure (R) -3-hydroxycarboxylic acid. 제 12항에 있어서,The method of claim 12, (R)-3-하이드록시부탄산 및 (R)-3-하이드록시발레르산은 단량체 또는이량체의 형태인 것을 특징으로 하는(R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxyvaleric acid are characterized in that they are in the form of monomers or dimers. 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.Process for preparing optically pure (R) -3-hydroxycarboxylic acid. 대장균 (E. coli) XL1-Blue/pUC19Ald;p5184(KCTC-10127BP)를 배양하고, 그로부터 (R)-3-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순순한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법.Optically pure (R) -3- comprising culturing E. coli XL1-Blue / pUC19Ald; p5184 (KCTC-10127BP) and obtaining (R) -3-hydroxycarboxylic acid therefrom Process for preparing hydroxycarboxylic acid.
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