KR100417632B1 - A novel Trichoderma harzianum YC459 active against plant fungal pathogens and process for preparation of microbial pesticide thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주요 식물병원균에 길항적인 신규한 트리코데르마속 미생물 균주를 토양으로부터 분리하고 이를 트리코데르마 하르지아눔 YC459(KCTC 0772BP)로 명명하고 식물병을 방제하기에 적합한 미생물 제제로 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명 균주의 포자 현탁액을 주요 작물의 잎이나 재배토양에 처리할 경우 잿빛곰팡이병, 모잘록병, 잎곰팡이병과 겹둥근무늬병을 50% 이상 억제시키는 뛰어난 효과가 있다.The present invention is directed to a method for the isolation of novel Trichoderma microorganism strains antagonistic to major phytopathogens from soil and named it Trichoderma harzianum YC459 (KCTC 0772BP) and the preparation of microbial agents suitable for controlling plant diseases. When the spore suspension of the strain of the present invention is treated to the leaves or cultivated soil of the main crop, there is an excellent effect of suppressing more than 50% of gray mold disease, mozzarella disease, leaf fungal disease and polyposis.
Description
본 발명은 트리코데르마속 미생물 균주를 이용한 식물병 방제용 미생물 제제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 식물병원균에 길항적인 트리코데르마속 미생물 균주를 토양으로부터 분리하여 이를 트리코데르마 하르지아눔 YC 459로 명명하고 이를 대량 배양하여 제조한 포자 현탁액을 주요 작물의 잎이나 재배토양에 처리하므로써 잿빛곰팡이병(gray mold rot), 모잘록병(damping-off), 잎곰팡이병(leaf mold)및 겹둥근무늬병(early blight)등 다양한 식물병원진균을 방제하는 생물학적 방제용 미생물 제제 및 그 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microbial preparation for controlling plant diseases using a Trichoderma microorganism strain and a method for manufacturing the same, and more particularly, the present invention isolates the Trichoderma microorganism strain antagonistic to phytopathogenic bacteria from the soil and trichoderma Spore suspensions, named harzianum YC 459 and mass-cultured, are treated on the leaves or cultivated soils of major crops, resulting in gray mold rot, damping-off, and leaf mold diseases. And it relates to a biological control microbial agent for controlling various phytopathogenic fungi such as early blight and a method of manufacturing the same.
식물병원진균에 의한 작물의 병은 해충, 잡초와 더불어 작물의 안정적 생산에 매우 큰 제한요인이 되고 있다. 여러 종류의 식물병원진균 중에서도 보트리티스 시네리아(B. cinerea),리족토니아 솔라니(R. solani)와 같이 균핵을 형성하는 병균은 대부분이 토양전염성으로 여러 종류의 작물에 광범위하게 병을 일으켜 많은피해를 가져온다. 이들 병원균들은 균핵상태로 월동하여 다음해에 균핵이 1차 감염원이 되는데 균핵은 병든조직이나 토양 중에 있으면서 좋지않은 환경조건에서도 생존이 가능하고 포자나 균사형태보다 이웃 길항미생물에 의한 분해 및 포자나 억제에도 강하기 때문에 효과적인 방제가 더욱 어렵다. 잎곰팡이병균 크라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum), 겹둥근무늬병균 알터나리아 솔라니(Alternaria solani)도 여러 채소작물에 병을 일으켜 많은 피해를 유발한다. 특히 이들 병원진균들의 방제를 위해 현재 여러 종류의 살균제가 사용되고 있지만, 살균제의 오용과 남용으로 약제 내성으로 인하여 방제효과가 감소함에 따라 안전하고 효과적인 방제방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.Crop diseases caused by phytopathogenic fungi are very limiting factors for stable production of crops along with pests and weeds. Among many phytopathogenic fungi Botrytis CeriaB. cinerea),Lijotton Solani (R. solaniMost of the germ-forming bacteria, such as), are soil contagious, causing a wide range of diseases in a wide variety of crops, causing a lot of damage. These pathogens overwinter in the state of mycobacterium and become the primary source of infection in the following year. The microbial cells can survive in unfavorable environmental conditions in diseased tissues or soil, and can be degraded by neighboring antagonists and suppressed by spores or mycelium. Because it is strong, effective control is more difficult. Leaf fungus Cradosporium full boomCladosporium fulvum), Double-pattern germ Alternaria Solani (Alternaria solani) Causes a lot of damage to various vegetable crops. In particular, various types of fungicides are currently used for the control of these pathogens, but the development of safe and effective control methods is urgently required as the effectiveness of the drug decreases due to drug resistance due to misuse and abuse of the fungicides.
환경적으로 안전하고 효과적인 방제 방법으로는 미생물 제제를 이용한 생물학적 방제가 중요한 바, 1970년대 초반 이후로 국내외에서 이에 관한 연구가 여러 연구자에 의해 많이 수행되고 있다. 최근 세계적으로 10종 이상의 미생물 제제가 상품화되었고 환경적으로 안전한 지속농업(Sustainable Agriculture)을 지향하는 사회적 인식변화로 미생물 제제 개발에 대한 연구가 급격히 증가하고 있다. 현재 외국에서 개발되어 상품화된 대표적인 미생물 제제는 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum)과 트리코데르마 폴리스포룸(T. polysporum)으로 만들어져 목재부후균을 억제하는 BINAB T(1988, E.R. Butts International), 글리오클라디움 비렌스(Gliocladium virens)를 이용한 온실화훼작물 유묘의 병 방제제인 GlioGard (1990, W. R. Grace Co.), 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)을 이용한 F-stop(1991, Kodak), Trichodex(1997년, 이스라엘에서 개발)과 길항세균 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용한 종자처리제인 KODIAK (1990, Gustafson), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 이용하여 목화의 리족토니아, 피티움(Rhizoctonia,Pythium) 모잘록병을 방제하는 DAGGER(1990, Ecogen Inc.), 슈도모나스 세파시아(P. cepacia)를 이용한 여러작물의 종자처리제인 BLUE CIRCLE(1990, Stine Microbial Products), 그리고 길항방선균 스트렙토마이세스 그리세오비리디스(Streptomyces griseoviridis)를 이용한 푸사리움 (Fusarium) 시들음병, 모잘록병 방제제인 MYCOSTOP(1985, Kemira Oy Biocontrol of Finland)등이 있다. 이 중에서도 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) 을 이용한 미생물 제제가 병 방제효과나 제품의 안정성 등이 뛰어나 여러 나라에서 지역 특성에 맞는 균주를 분리하여 상품으로 개발하고자 노력하고 있다. 국내에서는 1970년대 초반부터 인삼뿌리썩음병의 생물학적 방제연구를 시작으로 고추역병, 오이 딸기 시들음병, 참깨 모잘록병과 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제에 관한 연구가 계속적으로 수행되어 왔으나 트리코데르마 종(Trichodermasp.)을 이용하여 상품화된 것은 아직 없다. 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)은 병원균의 균사와 접촉하여 구멍을 내어 침입한 뒤 병원균을 죽이는데, 접촉시 분비되는 효소로는 키티나제(chitinase), β-1,3-글루카나제(glucanase)가 있고 순수분리된 효소가 리족토니아 솔라니(R. solani)와 보트리티스 시네리아(B. cinerea)를 비롯한 여러종류의 식물병원 진균에 대한 억제효과가 있음이 밝혀졌다. 이 외에도 트리코데르마 비리데(T. viride), 글리오클라디움 로세움(Gliocladium roseum), 페니실린 종(Penicilliumsp.)도 온실 및 포장실험에서 보트리티스 시네리아(B.cinerea),리족토니아 솔라니(R. solani)의 방제효과가 있음이 보고되었다. 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)의 환경내 잔효력을 높이기 위해서는 이 균이 독특하게 이용할 수 있는 기질을 선택하여 제제화 하거나 또는 기질자체를 길항미생물이 충분히 차지하여 다른 미생물이나 대상병원진균이 이를 이용할 수 없도록 사전에 처리해야만 한다. 길항미생물의 대량생산 및 제제화에 있어서도 생산시 경제성을 고려하여 배양재료를 선택해야 한다.As an environmentally safe and effective control method, biological control using a microbial agent is important. Since the early 1970s, many studies have been conducted by many researchers at home and abroad. Recently, more than 10 kinds of microbial products have been commercialized in the world, and research on the development of microbial products is rapidly increasing due to the change of social awareness toward environmentally safe sustainable agriculture. Currently, representative microbial agents developed and commercialized in foreign countries are Trichoderma harzianum (Trichoderma harzianum) And Trichoderma PolysporumT. polysporumBINAB T (1988, E.R. Butts International), glycodium viens which are made ofGliocladium virensGlioGard (1990, W. R. Grace Co.), Trichoderma harzianumT. harzianumF-stop (1991, Kodak), Trichodex (1997, developed in Israel) and antagonistic bacillus subtilis (Bacillus subtilisSeed treatment agent KODIAK (1990, Gustafson), Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens) Using cotton lizhatonia and phytium (Rhizoctonia,PythiumDAGGER (1990, Ecogen Inc.), Pseudomonas SephaciaP. cepaciaSeed treatment of several crops using BLUE CIRCLE (1990, Stine Microbial Products), and the antagonistic Streptomyces griseoviridis ()Streptomyces griseoviridisFusarium withFusariumMYCOSTOP (1985, Kemira Oy Biocontrol of Finland). Among them, Trichoderma harzianum (Trichoderma harzianum), Microbial preparations have excellent disease control effects and stability of products, and various countries are trying to develop strains that are suitable for local characteristics. In Korea, research on biological control of ginseng root rot has been undertaken since the early 1970s.Trichodermahas not been commercialized using sp.). Trichoderma Harzianum (T. harzianum) Is in contact with the mycelia of the pathogen, punctures and invades and kills the pathogen. Lijotton Solani (R. solani)Wow Botrytis CeriaB. cinereaIt has been shown to have an inhibitory effect on several types of phytopathogenic fungi, including. In addition, Trichoderma Biride (T. viride), Gliocladium RoseGliocladium roseum), Penicillin species (Penicilliumsp.) is also used in greenhouse and field experiments.B.cinerea),Lijotton Solani (R. solani) Has been reported to have a control effect. Trichoderma Harzianum (T. harzianumIn order to increase the residual potency in the environment, it is necessary to select and formulate a substrate which can be used uniquely by the bacterium, or to pre-treat the substrate itself so that the antagonistic microorganisms occupy enough and cannot be used by other microorganisms or pathogens. In mass production and formulation of antagonistic microorganisms, it is necessary to select culture materials in consideration of economical efficiency in production.
대상이 되는 길항미생물은 국내 토양에서 분리한 진균으로 실내온실과 포장 실험에서 보트리티스 시네리아(B. cinerea), 리족토니아 솔라니(R. solani), 크라도스포리움 풀붐(C. fulvum), 알터나리아 솔라니(A. solani)에 대하여 탁월한 방제효과를 보였다. 종래의 길항미생물을 이용한 미생물 제제는 식물병원성 진균, 선충 및 바이러스(virus) 병의 방제와 해충방제, 넓게는 잡초방제하는 것이 공지되어 있다. 이들 공지된 문헌에 의하면 길항미생물에 의한 생물학적 방제의 원리는 이들이 생산하는 항생물질에 의한 항생작용, 세포벽 분해효소에 의한 기생 또는 포식작용, 그리고 영양물 경쟁이나 거점(niche) 경쟁 등을 통한 병원균의 밀도감소 또는 발병능력감소 및 비병원성 균주 또는 약병원성 균주를 이용하는 교차보호(cross protection)와 기주저항성 유도 등에 주된 작용기작을 두고 있다. 예를 들어, 트리코데르마 속(Trichodermasp.)과 글리오클라디움 속(Gliocladiumsp.)이 분비하는 항생물질 또는 휘발성물질, 독소, 특수한 저해물질에 의한 진균병의 억제작용이 공지되어 있다. 한편, 기생 또는 포식작용에 의한 길항작용은 최근 들어 활발하게 연구되고 있는데 길항세균들이 분비하는 진균의 세포벽 분해효소인키티나제(chitinase), 글루카나제(glucanase), 셀룰라제(cellulase) 등에 의한 병원균의 용해작용이 주된 작용기작으로 알려져 있다.Antagonist microorganisms are fungi isolated from domestic soil.B. cinerea), Lijotton Solani (R. solani), Cradosporium full boom (C. fulvum), Alternaria Solani (A. solani) Showed excellent control effect. Conventional microbial preparations using antagonistic microorganisms are known to control phytopathogenic fungi, nematodes and virus diseases, pest control, and broadly weed control. According to these well-known documents, the principle of biological control by antagonist microorganisms is based on the density of pathogens through antibiotics produced by antibiotics, parasitic or phagocytosis by cell wall degrading enzymes, and nutrient competition or niche competition. The main mechanisms of action include reducing or reducing pathogenicity, cross-protection using non-pathogenic strains or weakly pathogenic strains, and inducing host resistance. For example, Trichoderma genus (Trichodermasp.) and the genus GliocladiumGliocladiumInhibition of fungal diseases by antibiotics or volatiles, toxins or special inhibitors secreted by sp.) is known. On the other hand, antagonism by parasitic or phagocytosis has been actively studied in recent years. Pathogens caused by chitinase, glucanase, and cellulase, which are fungal cell secreting enzymes secreted by antagonists Dissolution of is known as the main mechanism of action.
본 발명자는 여러 가지 주요 식물병의 효과적인 생물학적 방제를 위해 상기 식물병원균의 억제능력이 우수한 길항 미생물을 분리하여 제제화함으로써 새로운 형태의 환경친화형 미생물 제제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by preparing a new type of environment-friendly microbial preparation by separating and formulating antagonistic microorganisms excellent in inhibiting ability of the phytopathogens for effective biological control of various major plant diseases.
따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 길항작용에 착안하여 종래 보트리티스 시네리아(B. cinerea), 리족토니아 솔라니(R. solani), 크라도스포리움 풀붐(C. fulvum), 알터나리아 솔라니(A. solani)에 의해 발병하는 잿빛곰팡이병, 모잘록병과 벼잎집무늬마름병, 잎곰팡이병, 겹둥근무늬병의 방제가 약제저항성 병원균의 발현으로 인해 효율적이지 못하므로, 식물병원균에 길항적인 신규한 트리코데르마속 미생물 균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주를 함유하는 식물병원균 방제용 미생물 제제를 제공함에 있다.Therefore, the object of the present invention focuses on the antagonism as described above, conventional Botrytis cinerea ( B. cinerea ), Li footonia solani ( R. solani ), C. fulvum , Alternaria Control of gray mold, mozzarella and rice leaf blight, leaf fungus, and double-ply disease caused by A. solani is not effective due to the expression of drug-resistant pathogens. The present invention provides a novel Trichoderma microorganism strain. Another object of the present invention is to provide a microbial agent for controlling phytopathogens containing the Trichoderma harzianum YC459 strain.
본 발명의 상기 목적은 식물병원진균 보트리티스 시네리아(B. cinerea), 리족토니아 솔라니(R. solani), 크라도스포리움 풀붐(C. fulvum), 알터나리아 솔라니(A. solani)에 대한 억제능력이 있는 우수한 길항미생물 트리코데르마속 미생물 균주를 토양으로부터 분리하여 이를T. harzianumYC459로 명명하고 이를 순수 배양하여 미생물 제제화한 다음 식물병원균 방제효과를 평가함으로써 달성하였다.The above object of the present invention is phytopathogenic fungi Botrytis Ceria (B. cinerea), Littoonia Solani (R. solani), Cradosporium full boomC. fulvum), Alternaria Solani (A. solaniIsolation of the superior antagonistic trichoderma microorganism strain with the ability to inhibitT. harzianumName it YC459 This It was achieved by culturing the pure microorganisms and then evaluating the phytopathogen control effect.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명하였다.Hereinafter, the configuration and operation of the present invention.
본 발명은 보트리티스 시네리아(B. cinerea), 리족토니아 솔라니(R. solani), 크라도스포리움 풀붐(C. fulvum), 알터나리아 솔라니(A. solani)에 길항력이 있는 미생물 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주를 토양으로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 포자 현탁액을 오이에 처리한 후 곰팡이 병균을 접종하고 발병정도를 측정하여 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 길항력을 식물체를 이용하여 직접 검정하는 단계; 분리된 길항미생물 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 대량배양과 제제화 단계; 감자, 토양 및 증류수 혼합물에 모잘록병균을 배양하여 접종원을 만들어 토양에 접종한 후 무종자를 파종하고 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주를 처리한 다음, 모잘록병균의 발병정도를 조사하여 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 모잘록병 발병억제 효과를 조사하는 단계; 온실포장에서 토마토를 재배하면서 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주 처리군과 무처리군의 잿빛곰팡이병 발병정도를 조사하여 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 잿빛곰팡이병 발병억제 효과를 조사하는 단계; 온실포장에서 토마토를 재배하면서 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주 처리군과 무처리군의 잎곰팡이병 발병정도를 조사하여 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 잎곰팡이병 발병억제 효과를 조사하는 단계; 포장에서 감자를 재배하면서 본 발명 트리코데르마 하르지아눔YC459 균주 처리군과 무처리군의 겹둥근무늬병 발병정도를 조사하여 본 발명 트리코데르마 하르지아눔 YC459 균주의 겹둥근무늬병 발병억제 효과를 조사하는 단계로 구성된다.The present invention Botrytis CeriaB. cinerea), Littoonia Solani (R. solani), Cradosporium full boom (C. fulvum), Alternaria Solani (A. solaniSeparating the microbial Trichoderma harzianum YC459 strain antagonistic) from the soil; After treating the spore suspension of the isolated Trichoderma harzianum YC459 strain to cucumber, inoculating fungal pathogens and measuring the incidence of the trichoderma harzianum YC459 strain using the plant directly assay Doing; Mass culture and formulation of the isolated antagonist Trichoderma harzianum YC459 strain; After inoculating seedlings with potato, soil and distilled water mixture to inoculate the soil, inoculate the seedlings, sowing seedlings and treating the present invention Trichoderma harzianum YC459 strain, and then investigated the incidence of seedlings Investigating the effect of inhibiting the onset of Mozolox disease of Trichoderma harzianum YC459 strain; Investigating the incidence of gray mold disease of Trichoderma harzianum YC459 strains of the present invention and the untreated group of Tricotherma harzianum YC459 strains while cultivating tomatoes in greenhouse packaging. Investigating; Investigating the incidence of leaf fungal disease of Trichoderma harzianum YC459 strain treated and untreated group of the present invention while growing tomatoes in greenhouse packaging to control the effect of leaf fungal disease on the Trichoderma harzianum YC459 strain Investigating; Investigation of the incidence of double rounded pattern disease of Trichoderma harzianum YC459 strain of the present invention by investigating the incidence of double rounded pattern disease of the Trichoderma harzianum YC459 strain treated and untreated group It consists of investigating.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 상기 균주로부터 유래하는 진균은 물론 이들 실시예와 실험예를 변경하는 어떠한 발명도 포함하는 것이다.Hereinafter, specific examples of the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples, but the scope of the present invention includes any invention that changes these Examples and Experimental Examples as well as fungi derived from the strain.
실시예 1: 길항미생물의 분리 및 길항력 검정Example 1: Isolation and Antagonistic Assay of Antagonist Microorganisms
실험예 1: 길항미생물 분리동정 및 길항력 검정(배양기내 검정)Experimental Example 1: Isolation identification and antagonism assay (incubator assay)
본 실험예에서는 보트리티스 시네리아(B. cinerea)에 길항력이 있는 미생물을 분리하기 위하여 경남 진주시, 남해군, 밀양군 등 5개 지역에서 토양 및 퇴비시료를 채취하였다. 채취한 시료 5g과 멸균수 45mL를 혼합하여 28℃에서 30분간 진탕한 후, 토양 희석 한천평판법으로 104배까지 희석하여 희석액 0.1mL를 100 ppm의 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 감자설탕한천(PDA, Difco)에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음, 28℃ 항온기에서 5일간 배양하였다. 배양후 자란 진균의 단일 콜로니(single colony)를 순수 분리하여 PDA 사면배지에 옮겨 4℃에서 보관하였다. 분리된 진균의 길항력 검정은 병원균B. cinerea, R. solani, C. fulvum, A. solani와의 대치배양방법에 의하여 수행하였으며, 병원균과 길항균의 접촉면 균사의 분해와 억제정도를 현미경으로 관찰하여 가장 많이 억제하는 진균 YC459 균주를선발하였다. 선발된 균주의 균총과 분생포자, 분생포자경의 형태적 특성을 현미경으로 관찰, 동정한 결과 트리코데르마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum)으로 확인되었으며 이 균주를T. harzianumYC459로 명명하고 대전시 소재 생명공학원(KIRRB) 유전자은행에 2000년 4월 29일자 수탁번호 KCTC 0772BP로 기탁하였다.In this experiment, Botrytis Ceria (B. cinerea)Soil and compost samples were collected from five regions, including Jinju-si, Namhae-gun, and Miryang-gun, to isolate microorganisms with antagonistic activity. 5 g of the collected sample and 45 mL of sterile water were mixed and shaken at 28 ° C. for 30 minutes, followed by dilution with soil agar plate method.4Diluted up to 2 times, 0.1 mL of the dilutions were dispensed onto 100 ppm of potato sugar agar (PDA, Difco) containing streptomycin, and evenly spread over the medium, followed by incubation at 28 ° C. for 5 days. Single colonies of fungi grown after incubation were purely separated and transferred to PDA slope medium and stored at 4 ° C. Antagonistic test of isolated fungiB. cinerea, R. solani, C. fulvum, A. solaniThe fungal YC459 strain was selected by observing the degree of degradation and inhibition of the contact surface hyphae of pathogens and antagonists under a microscope. Microscopic observation and identification of the morphological characteristics of the flora, conidia and conidia of the selected strains Tricoderma Harzianum (Trichoderma harzianum) And this strainT. harzianumIt was named YC459 and was deposited with KIRC 0772BP dated April 29, 2000 to KIRB Gene Bank of Daejeon.
실험예 2: 본 발명의 길항미생물의 식물체 상의 길항력 검정(생체내 검정)Experimental Example 2: Antagonistic Assay on Plants of Antagonist Microorganisms of the Present Invention (In Vivo Assay)
본 실험예에서는 상기 실험예 1에의 배지상에서 분리된 본 발명의 길항 미생물 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum) YC459가 실제 식물의 표면에 처리되었을 때 병원균의 억제효과를 조사하기 위하여 길항미생물을 잎에 먼저 처리하고, 1일 경과 후, 병원균을 접종하여 발병억제 정도를 조사하였다. 분리된 길항미생물을 PDA 배지에 옮기고 28℃ 항온기에서 10일간 배양 후 배양기 표면에 생겨난 포자를 수확하기 위하여 살균증류수를 4~5mL씩 첨가하면서 긁어 모아 포자현탁액을 만들었다. 이때 포자현탁액의 포자 농도는 평균 106-7개/ mL이 되도록 조절하였다. 이렇게 수확한 포자현탁액을 플라스틱 폿트에서 재배한 2엽기 오이 잎에 흘러내리도록 분무하고 실온에서 1일 둔 뒤에 잿빛곰팡이병균 보트리티스 시네리아(B. cinerea)의 포자현탁액(포자농도는 106-7개/ mL)을 흘러 내리도록 접종하였다. 병균을 접종한 오이 유묘가 담긴 폿트를 20℃의 습실상에 넣고 3일 둔 뒤에 잎에서의 발병정도를 병반면적율(%)로 조사하였다. 이때 사용된 병원균은 본 연구실에서 1994년도에 병든토마토잎에서 분리하여 보관 사용하고 있는 균주(JM42)를 이용하였으며, 배양 및 포자수확은 20℃ 항온기에서 14일간 배양 후 배양기 표면에 생겨난 포자를 상기 길항미생물의 현탁액 조제방법과 동일하게 준비하였다. 길항미생물의 병억제 효과(방제가)는 하기 식으로 계산하였고, 모든 실험은 1폿트 당 오이 2주씩 식부하고 총 4폿트를 심어 실시하였다. 유의성 검정은 Duncan's Multiple Range Test(DMRT)를 이용하였다. 실험실내 결과 얻어진 발병억제효과는 표 1과 같았다.In this Experimental Example, antagonist microorganisms were examined to investigate the inhibitory effect of pathogens when the antagonist Trichoderma harzianum YC459 of the present invention isolated on the medium of Experimental Example 1 was treated on the surface of a plant. The leaves were treated first, and after 1 day, pathogens were inoculated to investigate the degree of inhibition. The isolated antagonist microorganisms were transferred to PDA medium, incubated for 10 days at 28 ° C. incubator, and then scraped together by adding 4-5 mL of sterilized distilled water to harvest spores formed on the incubator surface. At this time, the spore concentration of the spore suspension was adjusted to an average of 10 6-7 / mL. The spore suspension thus harvested was sprayed onto a two-leaf cucumber leaf grown in a plastic pot and left for 1 day at room temperature, followed by a spore suspension of B. cinerea (spore concentration of 10 6-). 7 mL / mL) was inoculated to flow down. Pots containing cucumber seedlings inoculated with the bacterium were placed on a 20 ° C. wet place, and left for 3 days. At this time, the pathogen used was a strain (JM42) stored and stored in diseased tomato leaves in 1994 in this laboratory. The culture and spore harvesting were carried out for 14 days at 20 ° C. incubator, and the spores generated on the surface of the incubator were antagonized. It prepared like the suspension preparation method of microorganisms. The inhibitory effect (control value) of the antagonist microorganisms was calculated by the following equation, and all experiments were carried out by planting cucumbers per pot for 2 weeks and planting a total of 4 pots. Significance test was performed using Duncan's Multiple Range Test (DMRT). Inhibitory effects obtained in the laboratory were shown in Table 1.
방제가(%) = [1-(처리구의 발병률/무처리구의 발병률)] ×100Control value (%) = [1- (Incidence rate of treatment / Infection rate of untreated)] × 100
본 발명 길항미생물을 처리하지 않은 무처리구의 경우 발병률이 97%로 거의 모든 잎이 죽어버렸으나 길항미생물 포자처리시는 포자농도가 높아질수록 발병률이 감소하였으며 107개/ mL 현탁액 포자처리시 89.8%의 높은 발병억제 효과를 보였다.For untreated it not treated with the present invention antagonistic microorganism incidence but abandoned almost all leaves are dying in 97% antagonistic microorganism spores processed with the higher the spore concentration was decreased the incidence of 10 7 / mL suspension of the spores processed with 89.8% It showed a high onset suppression effect.
실시예 2: 본 발명 길항미생물의 대량배양 및 제제화Example 2 Mass Culture and Formulation of the Antagonist of the Invention
본 실시예에서는 상기 실시예에서 분리된 본 발명의 길항 미생물 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum) YC459를 PDA에 접종하여 28℃에서 7일 동안 배양하여 많은 양의 포자를 형성시킨 후 실험예 2와 동일한 방법으로 포자현탁액을 만들어 대량배양용 종자 접종물(seed inoculum)로 사용하였다. 본 배양은 농산부산물인 밀기울, 톱밥, 미강, 왕겨 등을 밀기울 + 왕겨, 톱밥 + 왕겨, 미강 + 왕겨, 미강 + 톱밥 등으로 동량 혼합하고 효모추출물 0.5%(부피비)을 넣어 잘 섞은 후 수분함유량이 40%가 되도록 물을 넣은 뒤 살균 가능한 5L 용량의 비닐봉지 또는 삼각 프라스크 또는 봉인 가능한 통에 넣고 121℃에서 1시간 살균하였다. 배지를 살균한 후 무균적으로 포자현탁액 200mL를 넣고 잘 섞은 후 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 배양과정에서 2일에 한번 흔들어 주면서 균사의 고른 생장과 대량의 포자형성을 유도하였다. 배양된 길항미생물 균체를 상온에서 3일간 음건한 후 분쇄하여 구멍크기 1mm체로 걸러서 체를 통과한 미세한 균사 및 포자분말을 수확하였다. 수확 후 초탄(peat moss), 질석(vermiculite) 또는 활석(talc), 비석(zeolite), 고령토(kaolinite) 등의 증량제를 첨가하여 제제화하였다. 이때, 제제화에는 통상 미생물 제제에 사용되는 부형제이면 어느 것이나 사용 가능하다.In this example, the antagonist trichoderma harzianum YC459 of the present invention isolated in the above example was inoculated in PDA and incubated at 28 ° C. for 7 days to form a large amount of spores. Spore suspension was prepared in the same manner as 2 and used as seed inoculum for mass culture. In this culture, the same amount of agricultural by-products of wheat bran, sawdust, rice bran, rice husk, etc., are mixed with bran + chaff, sawdust + rice bran, rice bran + rice bran, rice bran + sawdust, etc., and the yeast extract 0.5% (volume ratio) is mixed well. Water was added to 40% and placed in a sterilizable 5L plastic bag or Erlenmeyer flask or sealable container and sterilized at 121 ° C for 1 hour. After sterilizing the medium, aseptically added 200mL of the spore suspension and well mixed and incubated for 7 days at 28 ℃. Shaking once every two days during the incubation process induced even growth of mycelia and large spore formation. The cultured antagonist microorganisms were dried for 3 days at room temperature, and then pulverized and filtered through a 1 mm sieve to obtain fine mycelia and spore powder passing through the sieve. After harvest, it was formulated by adding extenders such as pea moss, vermiculite or talc, zeolite, kaolinite, and the like. In this case, any of the excipients usually used in microbial preparations can be used for formulation.
실시예 3: 본 발명의 길항미생물에 의한 모잘록병균의 발병억제 효과Example 3: Effect of inhibiting the onset of Mozolox bacterium by antagonist microorganism
본 실시예에서 모잘록병균 억제효과는 무를 이용하여 검정하였다. 접종용 병원균은 감자 썰은 조각 50g, 밭토양 450g과 증류수 100mL을 혼합하여 2L 삼각플라스크에 담고 121℃에서 1시간동안 멸균한 뒤 PDA에서 5일간 배양한 리족토니아 솔라니(R. solani) 균사절편 20개를 접종하여 28℃에서 14일간 배양한 것을 그늘에서 건조후 분쇄하여 4℃에서 보관하면서 접종원으로 사용하였다. 병균 접종원 0.5g과 실험예 2와 동일한 방법으로 만든 길항미생물 포자 현탁액을 비닐봉지에 담긴 상토 1L와 잘 섞어서 4개의 프라스틱 폿트(가로, 세로 각 7cm)에 담고 무 종자를 10개씩 파종한 후 온실에서 1주일간 재배하였다. 1주일 간 재배 후 발병되는 정도를 4단계(1: 건전, 2: 갈색병징이 약간 보이는 것, 3: 발병되어 발아후 죽은 것, 4: 발아전 발병되어 발아가 되지 않은 것)로 구분하여 조사하고, 백분율(%)로 환산하여 발병률을 계산하였다. 방제가는 실험예 2와 동일한 방법으로 계산하였다. 실험결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 첨가한 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum) YC459의 포자현탁액 농도가 높아질수록 발병이 억제되었으며 50mL, 100mL를 첨가하였을 때 각각 67%, 75.5%의 방제가를 나타내었다.In this example, the inhibition of Mozolox bacterium was assayed using radish. For the inoculation pathogen, 50 g of potato slices, 450 g of field soil, and 100 mL of distilled water were mixed in a 2 L Erlenmeyer flask, sterilized at 121 ° C. for 1 hour, and cultured on a PDA for 5 days, followed by R. solani mycelia fragment 20 Dogs were inoculated and incubated at 28 ° C. for 14 days, dried in the shade, crushed, and stored at 4 ° C. to be used as inoculum. Mix 0.5 g of bacterial inoculum and antagonist spore suspension prepared in the same way as Experimental Example 2 with 1 liter of topsoil in a plastic bag, put them in four plastic pots (horizontal, 7 cm each), and sowing 10 radish seeds in a greenhouse. Cultivation was done for 1 week. The degree of onset after one week of cultivation is divided into four stages (1: healthy, 2: slightly visible browning, 3: onset and dead after germination, 4: onset and not germinated). The incidence rate was calculated in terms of percentage (%). The control value was calculated in the same manner as in Experiment 2. Experimental results, as shown in Table 2 below, the higher the spore suspension concentration of the added T. harzianum YC459, the onset was suppressed, 67%, 75.5% of 50mL, 100mL were added, respectively The control agent was shown.
* 방제가(%) = [1-(처리구의 발병률/무처리구의 발병률)] ×100* Control value (%) = [1- (Incidence rate of treatment / Infection rate of untreated)] × 100
실시예 4: 본 발명 길항미생물 처리에 의한 온실포장효과Example 4 Greenhouse Packaging Effect by Antagonistic Microbial Treatment of the Present Invention
실험예 1: 본 발명 길항미생물 처리에 의한 토마토 잿빛곰팡이병균의 발병억제 효과Experimental Example 1: Inhibitory effect of tomato gray mold fungi by the present invention antagonist treatment
본 실험예에서는 본 발명의 길항 미생물 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)YC459 처리가 온실내에서 잿빛곰팡이병(병원균:B. cinerea)발생을 어느 정도 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 토마토를 재배하면서 방제실험을 수행하였다. 온실은 일반 농촌에서 사용하는 비닐하우스(길이 23.7m× 폭 7.0m× 높이 2.3m, 166m2)를 만들어 사용하였으며 재배는 하기와 같은 방법으로 수행하였다.In this experimental example, the cultivation of tomato to see how the antagonist Trichoderma harzianum YC459 treatment of the present invention can suppress the development of ash fungus (pathogen: B. cinerea) in the greenhouse A control experiment was performed. The greenhouse was used to make a plastic house (23.7 m in length × 7.0 m in width × 2.3 m in height and 166 m 2 ) used in rural areas. Cultivation was carried out in the following manner.
1999. 9. 30. 토마토 파종 (품종: 서광)Sept. 30, 1999 Sowing of Tomato
10. 10. 제1차 가식10. 10. First meal
10. 22. 제2차 가식10. 22. Second Fake
11. 2. 정식(20cm간격으로 2조)11. 2. Formal (two sets at 20cm intervals)
12. 22. 수정시작(토마토톤 처리)12. 22. Start of modification (tomato treatment)
2000. 2. 11. 제1차 길항미생물 처리 (살포량 300l/10a기준)2000. 2. 11. First antagonistic microorganism treatment (based on spray amount 300l / 10a)
2. 20. 제2차 길항미생물 처리 (살포량 300l/10a기준)2. 20. Second antagonistic microorganism treatment (based on spray amount 300l / 10a)
3. 2. 제3차 길항미생물 처리 (살포량 300l/10a기준)3. 2. Third antagonist microorganism treatment (based on spray amount 300l / 10a)
3. 22. 발병률 조사3. 22. Incidence Survey
이때 1 처리구 면적은 5.4m2였고, 3반복, 난괴법으로 수행하였으며, 대조약제로는 스미렉스(Procymidone)를 상용농도로 분무 사용하였다. 길항미생물 처리는 상기 실시예 2에서 조제한 포자 제제를 물로 500배, 1000배로 희석하여 분무하였고, 발병률은 처리구의 모든 토마토의 감염여부를 하나하나 조사하였다. 유의성 검정은 Duncan's Multiple Range Test(DMRT)를 이용하였다.At this time, the treatment area 1 was 5.4m 2 , was carried out by three repetition, ingot method, and used as a control agent was sprayed at a commercial concentration of Smirex (Procymidone). Antagonist microbial treatment was sprayed by diluting the spore preparation prepared in Example 2 to 500 times, 1000 times with water, the incidence was investigated one by one whether all tomatoes in the treatment. Significance test was performed using Duncan's Multiple Range Test (DMRT).
본 발명 길항 미생물 처리의 토마토 잿빛곰팡이병 발병억제 효과는 하기 표 3과 같았다. 무처리구의 이병과율은 평균 17.4% 이었으며, 길항미생물 제제를 500배, 1,000배로 희석하여 처리시 각 처리구의 이병과율은 각각 5.4%, 6.6% 이었다. 대조약제인 스미렉스(Procymidne)의 경우 평균 발병률이 10.4%였다. 방제가로 보면 길항미생물 처리구가 평균 65.6%로 무처리나 스미렉스 처리구보다 유의성 있게 높았다.Inhibitory effect on the development of tomato gray mold disease of the present invention antagonistic microbial treatment was as Table 3 below. The average morbidity of the untreated group was 17.4%, and when the antagonist microorganisms were diluted 500 and 1,000 times, the morbidity of each group was 5.4% and 6.6%, respectively. The average incidence of procymidne was 10.4%. In terms of control value, antagonist microbial treatments averaged 65.6%, which was significantly higher than untreated or Smirex treated.
* 방제가(%) = [1-(처리구의 발병률/무처리구의 발병률)] ×100* Control value (%) = [1- (Incidence rate of treatment / Infection rate of untreated)] × 100
실험예 2: 본 발명 길항미생물처리에 의한 잎곰팡이병균의 발병억제 효과Experimental Example 2: Inhibition effect of leaf fungal pathogen by the present invention antagonist microbial treatment
본 실험예에서는 본 발명의 길항미생물 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)YC459 처리가 온실내에서 잎곰팡이병(병원균:C. fulvum) 발생을 어느 정도 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 실험예 1과 같은 방법으로토마토를 재배하면서 방제실험을 수행하였다. 3반복, 난괴법으로 수행하였으며, 대조약제로는 프로피(propineb)를 상용농도로 분무하였다. 발병조사는 반복 당 토마토 20주씩을 조사하였으며, 발병도는 다음과 같이 계산하였다.In the present experimental example 1 to see how the antagonist trichoderma harzianum YC459 treatment of the present invention can suppress the development of leaf fungal disease (pathogen: C. fulvum ) in the greenhouse Control experiment was performed while cultivating tomatoes in the same manner. Three repetitions were performed by the ingot method, and as a control drug, propineb was sprayed at a commercial concentration. The incidence survey was conducted 20 tomato per repetition, the incidence was calculated as follows.
발병도(%)= [∑(발병주수x계수)/4x총조사수] x 100 (계수 0: 발병이 안됨, 1: 전체 잎의 1/4 정도가 발병, 2: 전체 잎의 1/2 정도가 발병되고 때로는 일부의 잎이 고사, 3: 전체 잎의 3/4 정도가 발병되고 완전 고사된 잎이 1/2 정도, 4: 전체 잎의 2/3 이상이 완전 고사)Incidence (%) = [∑ (occurrence x coefficient) / 4x total irradiance] x 100 (coefficient 0: no outbreak, 1: about 1/4 of all leaves, 2: 1/2 of all leaves) Degree of onset and sometimes some leaves die, 3: about 3/4 of all leaves die, and about half of the leaves die completely, 4: more than 2/3 of all leaves die completely)
본 발명 길항미생물 처리의 토마토 잎곰팡이병 발병억제 효과는 하기 표 4와 같았다. 무처리구의 발병도는 평균 21.9% 이었으며, 길항미생물 제제를 500배, 1,000배로 희석하여 처리시 각 처리구의 발병도는 각각 6.6%, 6.8% 이었다. 대조약제인 프로피(propineb)의 경우 평균 발병률이 21.9% 이었다. 방제가로 보면 길항미생물 처리구가 평균 69-70%로 무처리나 프로피 처리구보다 유의성 있게 높았다.Inhibitory effect on the development of tomato leaf fungal disease of the present invention antagonist microorganisms was as shown in Table 4. The incidence of untreated group was 21.9% on average, and the incidence of each treatment group was 6.6% and 6.8%, respectively. In the case of the control drug propineb, the average incidence was 21.9%. In terms of control value, antagonist microbial treatments averaged 69-70%, which was significantly higher than untreated or prophylactic treatments.
* 방제가(%) = [1-(처리구의 발병률/무처리구의 발병률)] ×100* Control value (%) = [1- (Incidence rate of treatment / Infection rate of untreated)] × 100
실험예 3: 본 발명 길항미생물처리에 의한 겹둥근무늬병균의 발병억제 효과Experimental Example 3: Inhibitory Effect of Double Rounded Pattern Bacteria by the Antagonism of the Present Invention
본 실험예에서는 본 발명의 길항미생물 트리코데르마 하르지아눔(T. harzianum)YC459 처리가 포장에서 겹둥근무늬병(병원균:A. solani) 발생을 어느 정도 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 포장에서 감자를 재배하면서 방제실험을 수행하였다. 3반복, 난괴법으로 수행하였으며, 대조약제로는 오티바(azoxystrobin)를 상용농도로 분무하였다. 발병조사는 반복 당 감자 20주씩을 조사하였으며, 발병도는 실험예 2와 같이 계산하였다.In this experimental example, to determine the extent to which the antagonist Trichoderma harzianum YC459 treatment of the present invention can suppress the development of double pattern disease (pathogen: A. solani ) in the package, A control experiment was carried out while growing. Three repetitions were performed by the ingot method, and the control agent was sprayed at a commercial concentration with ortiba (azoxystrobin). The onset was investigated 20 weeks potato per repetition, the incidence was calculated as in Experiment 2.
2000. 5. 4. 감자 파종 (품종: 대지마)May 4, 2000 Sowing of Potatoes (Breed: Tajima)
6. 28. 제1차 길항미생물 처리 (살포량 300l/10a기준)6. 28. The first antagonist treatment (based on spray amount 300l / 10a)
7. 5. 제2차 길항미생물 처리 (살포량 300l/10a기준)7. 5. Second antagonist microorganism treatment (based on spray amount 300l / 10a)
7. 13. 발병률 조사7. 13. Incidence Survey
본 발명 길항미생물 처리의 감자 겹둥근무늬병 발병억제 효과는 하기 표 5와 같았다. 무처리구의 발병도는 평균 21.7% 이었으며, 길항미생물 제제를 500배, 1,000배로 희석하여 처리시 각 처리구의 발병도는 각각 9.2%, 9.5% 이었다. 대조약제인 오티바(azoxystrobin)의 경우 평균 발병률이 21.7% 이었다. 방제가로 보면 길항미생물 처리구가 평균 56.2-57.6으로 무처리보다 유의성 있게 높았다.Inhibitory effect on the development of potato double round pattern disease of the present invention antagonist microorganisms was as Table 5 below. The incidence of the untreated group was 21.7% on average, and the incidence of each treated group was 9.2% and 9.5%, respectively, when the antagonist was diluted 500 and 1,000 times. The average incidence was 21.7% for the control agent azoxystrobin. In terms of control value, antagonist microbial treatments averaged 56.2-57.6, which was significantly higher than no treatment.
* 방제가(%) = [1-(처리구의 발병률/무처리구의 발병률)] ×100* Control value (%) = [1- (Incidence rate of treatment / Infection rate of untreated)] × 100
이상 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 토양에서 분리한 본 발명길항 미생물 균주 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) YC459(수탁번호 0772BP)는 식물병원균 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea),리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 크라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani) 등에 길항력을 나타내 잿빛곰팡이병, 모잘록병, 잎곰팡이병 또는 겹둥근무늬병의 발병을 현저하게 억제하는 뛰어난 효과가 있어 환경친화적인 무공해 생물농약으로 사용할 경우, 생태계 파괴 및 인축 독성 문제를 해소할 수 있으므로 농약산업 및 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above Examples and Experimental Examples, the present invention antagonist microorganism strain Trichoderma harzianum ( Trochoderma harzianum ) YC459 (Accession No. 0772BP) is a plant pathogen Botrytis cinerea , Botrytis cinerea , Antagonists such as Rhizoctonia solani , Cladosporium fulvum , Alternaria solani , etc. have been shown to cause the development of gray mold, mozzarella, leaf fungus, or lamellae It is a very useful invention for the pesticide industry and environmental industry because it can be used as an environmentally friendly, pollution-free biopesticide, because it can solve the destruction of ecosystems and human toxicity.
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