KR100417566B1 - 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 핵이 제거된 성숙된 난자와 분화가 이루어진 체세포 유래 핵을 전기자극에 의해 융합하고 1 ∼ 6시간 정도 난자의 재구성 시기를 부여한 다음 수득된 체세포 핵치환 복제수정란에 2차 전기자극을 주어 활성화시킴으로써, 핵치환 복제수정란이 착상 전단계인 부화 배반포기까지 효과적으로 발생할 수 있게 하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 아직까지 성공하지 못한 돼지 복제의 필수적인 단계인 착상단계로 진입할 수 있는 결정적인 방법으로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 인공장기용 형질전환동물의 개발하는 데에도 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법{A mass production method of embryos by nuclear transfer using somatic cells}

본 발명은 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 핵이 제거된 성숙된 난자와 분화가 이루어진 체세포 유래 핵을 전기자극에 의해 융합하고 1 ∼ 6시간 정도 난자의 재구성 시기를 부여한 다음 수득된 체세포 핵치환 복제수정란에 2차 전기자극을 주어 활성화시킴으로써, 핵치환 복제수정란이 착상 전단계인 부화 배반포기까지 효과적으로 발생할 수 있게 하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법에 관한 것이다.

전통적으로 사용된 종자개량의 방법은 1개체간의 교배에 의존하여 우수한 형질을 갖고 있는 가축을 육종하는 것이었고, 이는 교배시점까지 가축을 성장시켜야 하므로 육종에 장기간이 소요될 뿐만 아니라, 그에 따른 개량의 속도도 매우 낮은 문제점을 가지고 있었다.

또한, 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 우수한 형질을 나타내는 개체로부터 유래된 할구세포의 핵을 치환하는 방법이 있다[Willadsen,Nature,320, 63 (1986)]. 그러나, 상기 방법은 공여세포의 수가 극히 제한되어 있다는 문제점과 많은 경험을 통한 고도의 숙련을 요구한다는 문제점이 있었다.

그래서, 1997년 복제된 양 돌리와 같이, 미성숙된 난자를 대상으로 유선상피세포 또는 태아 섬유아세포 등 분화가 이루어진 세포의 핵을 치환하는 체세포 복제기술이 개발되어, 우수한 형질을 갖는 가축, 인공장기 생산용, 질환모델 동물 및 희귀 또는 멸종상태의 동물 등을 대상으로 무한히 복제할 수 있게 되었다[Wilmut et al.,Nature,385, 810 (1997)]. 이러한 예로는, 태아 섬유아세포, 난구세포, 협막세포의 핵을 치환하여 소를 복제하는 방법이 보고되어 있고[Cibelli et al.,Science,280, 1256 (1998); Kato et al.,ibid,282, 2095 (1988); Wells et al.,Biol. Reprod.,60, 996 (1999)], 생쥐의 경우 난구세포를 이용하여 복제하는 방법이 보고된 바 있다[Wakayama et al.,Nature,394, 369 (1998)]. 그러나, 이들 방법들은 여전히 체세포 핵치환 복제수정란의 체외발달율이 저조하여 실제 복제에 성공할 확률이 매우 낮은 실정이었으며, 특히, 돼지의 경우에는 핵치환된 복제수정란의 배반포기까지의 체외 발달율이 5% 미만으로 매우 저조할 뿐만 아니라,세포수가 적으며, 이들 복제수정란의 계속적인 발달이 이루어지지 못하는 등, 아직까지도 복제에 성공하지 못하는 실정이다[Du et al.,Theriogenology,282, 2095 (1999); Tao et al.,Cloning,1, 55 (1999)].

따라서, 체세포 핵치환 복제수정란을 효과적으로 생산하기 위하여 핵치환된 복제수정란의 착상 전단계인 배반포기까지의 체외 발달율을 증가시킬 수 있는 새로운 개선방법의 필요성이 지대하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 체외발달율이 저조한 문제점을 해결하기 위하여, 핵이 제거된 성숙된 난자와 분화가 이루어진 체세포 유래 핵을 전기자극에 의해 융합하고 1 ∼ 6시간 정도 난자의 재구성 시기를 부여한 다음 수득된 체세포 핵치환 복제수정란에 2차 전기자극을 주어 활성화시킴으로써, 복제수정란의 체외발달율이 월등히 개선된 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명은 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법을 제공하는 데 그 주된 목적이 있다.

도 1은 성숙난자의 핵을 체세포의 핵으로 치환하여 복제수정란을 생산하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 2의 A는 임신 40 일령 한국재래돼지의 태아를 나타낸 것이고, B는 이들 태아로부터 구축한 태아섬유아세포를 보여주는 사진(×200)이다.

본 발명은 융합이 유도된 체세포 핵치환 복제수정란의 재구성 공정, 및

상기 공정에서 재구성된 복제수정란에 전기자극을 부여하는 활성화 공정을 포함하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법에 관한 것이다.

이하, 이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

우선, 본 발명은 융합유도된 체세포 핵치환 복제수정란에 재구성시기를 부여한다. 이때, 공여세포로서의 체세포는 인간을 제외한 포유동물, 바람직하기로는 돼지, 소, 양, 마우스 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종의 태아섬유아세포, 난구세포 등이다. 또한, 수란난자로는 돼지의 난소로부터 회수한 미성숙된 난포란을 체외성숙을 유도하여 이 중 제 1극체가 돌출한 성숙난자만을 선택한 후, 핵을 제거한 난자를 사용한다. 이렇게 수득된 체세포를 제핵난자의 위란강 내에 각 체세포를 하나씩 주입하여 재구성된 복제수정란을 제조하고, 1차 전기자극으로 150 V/㎜의 전장을 30 μsec 동안 1회 공급하여 핵이 제거된 난자의 세포질과 공여세포인 체세포 핵과의 융합을 유도하여 상기의 체세포 핵치환 복제수정란을 수득한다. 그런 다음, 상기 복제수정란을 소태아혈청이 함유된 인산완충용액에서 1 ∼ 6 시간 동안 배양시켜 재구성되도록 한다.

다음 공정으로 본 발명은 상기 공정에서 융합유도후 재구성된 복제수정란에 전기자극을 부여하여 체세포 핵치환 복제수정란을 활성화시킨다. 이때, 전기자극은 120 ∼ 150 V/㎜의 전장을 30 μsec 동안 부여하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 전기 자극의 세기가 120 V/㎜ 미만이면 활성화 비율이 낮아지는 문제가 있고, 150 V/㎜를 초과하는 경우에는 난자에 대한 손상이 높아지는 문제가 있기 때문이다.

다음으로, 상기 공정에서 활성화 처리된 핵치환된 복제수정란을 통상적인 방법에 따라 체외배양액에서 배양함으로써, 핵치환된 복제수정란에 단지 1차례의 전기자극을 가하던 기존 방법에 의한 체외 발달율이 5%미만이었던 것에 반해, 본 발명에 따라 2차 전기자극을 받은 체세포 핵치환 복제수정란 경우의 체외 발달율이 11.6%까지, 즉, 종래 방법보다 130%이상 향상되는 획기적인 효과를 나타낸다.

이와 같은 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 공여세포로 태아섬유아세포의 준비

임신 40 일령의 한국산 재래돼지(Sus scrofa domesticusL.)의 자궁으로부터 태아를 회수하고, 인산완충액으로 3회 세척한 다음, 태아의 머리, 간, 소화기관을 제거하고 남은 태아조직을 인산완충액으로 2회 세척하고, 지름 100 mm의 배양용 접시에 옮겼다. 외과용 칼을 사용하여 세절한 다음, 0.25% 트립신을 함유한 3.65 mM EDTA 용액 10 ㎖을 첨가하여 39℃에서 30분간 처리하고, 15% 소태아혈청을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Midium)배지 10 ㎖을 첨가하여 세포부유액을 제조하였다. 세포부유액을 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 세포를 15% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지에 분산시켜 2×10⁶세포수/㎖로 조정하였다. 175 cm²의 플라스크에 옮기고, 5% 탄산가스를 공급하는 39℃ 배양기에서 배양하여 재래돼지 태아섬유아세포를 공여세포로 준비하였다(참고: 도 2B).

2. 수란난자의 준비

일반 도축장에서 공급된 난소로부터 18 게이지 바늘을 장착한 주사기를 사용하여 미성숙된 난포란을 회수하여 TL-HEPES 용액[Prather et al.,Theriogenology,43, 1001 (1995)]으로 3회 세척한 다음, 체외성숙 배양액[NCSU 23; Petters & Wells,J. Reprod. Fertil. Suppl. 48, 61 (1993)]에서 44시간 배양시켰다. 체외성숙을 유도한 후, 난포란이 들어있는 배양액에 히아루로니데아제 (hyaluronidase; Sigma사)를 0.1%가 되도록 첨가하고, 2 ∼ 3분간 진탕한 다음, 난자를 골라낸 후 체외성숙이 유도된 난자들 중에서 제 1극체가 돌출한 난자(이를 성숙난자라 함)만을 회수하여 수란난자로 사용하였다.

3. 성숙난자로부터 핵제거

상기 수란난자로 회수된 성숙난자의 제1극체 부위의 투명대를 부분적으로 절개하고, 내경 20 ∼ 25 ㎛의 미세피펫을 사용하여 극체와 주변의 세포질을 제거하는 방법으로 핵을 제거하였다. 그런 다음, 이들 난자들을 5 μM 훽스트 (Hoechst 33342: DNA 염색물질)가 첨가된 배양액에서 5 분간 염색한 후 형광 현미경하에서 관찰하면서 난자의 핵이 완전히 제거되었는지를 확인하였다. 최종적으로 인산완충액으로 3회 세척하여 핵이 제거된 난자를 준비하였다. 그 결과, 제핵율 90.3%로 성숙난자 310개중 제핵난자 280개를 수득하였다. 이렇게 핵이 제거된 난자들은 체세포를 이식하는 실험시까지 10% 소태아혈청을 함유한 인산완충액에서 보관하였다.

4. 공여핵을 이식하여 재구성란 제조

상기 제 1 공정에서 준비한 토종돼지의 태아 섬유아세포중 직경 10 ∼ 15 ㎛ 정도의 세포를 회수하여 상기 제 3 공정에서 준비한 제핵난자의 위란강 내에 하나씩 주입하였다. 아울러 핵치환 전과정에는 7.5 ㎍/㎖의 싸이토칼라진 B가 첨가된 인산완충용액(Phosphate Buffer Saline; PBS)을 사용하였다.

5. 1차 전기자극에 의한 공여핵과 수란난자의 융합

상기 공정이 완료된 난자들을 전기융합 용액인 0.3M 만니톨(pH 7.0) 용액(0.1 M MgCl2, 0.1 M CaCl2, 0.01% BSA 함유)에 1분 정도 처리한 후, 두 전극 사이에 배열하고, ECM 2001(BTX사 제품) 상에서 150 V/mm의 전장을 30 μsec 동안 1회 공급하여 제핵난자의 세포질과 공여세포와의 융합을 유도하였다. 융합 유도 후 1 시간째 현미경하에서 융합을 확인하였다.

6. 핵치환 복제수정란의 활성화를 위한 2차 전기자극 부여

상기에서 제조한 핵치환된 수정란을 10% 소태아혈청이 함유된 인산완충용액에 1시간 정도 배양한 다음, 상기 과정의 기기를 사용하여 교류 3 V/mm의 전장을 5초간, 직류 120 V/mm의 전장을 30 μsec동안 공급하였다

7. 핵치환된 복제수정란의 체외배양

상기 제 6공정에서 활성화된 복제 수정란을 4 mg/㎖ 소혈청알부민(BSA; Sigma사)를 첨가한 NCSU 23 배양액에서 39℃, 5% 탄산가스를 공급하는 상태에서 3일간 배양하고, 10% 소태아혈청을 첨가한 NCSU 23 배양액에서 3일간 더 배양하였다. 그리고, 도립현미경 및 형광현미경(×200)을 사용하여 배반포기까지 발달율 및 각각 배반포기의 평균 세포수를 측정하였다.

다음 표 1에는 제 6공정에서 직류 전장의 크기를 각각 120 V/mm과 150 V/mm으로 부여하였을 때의 난자 활성화에 대한 결과를 나타내었다.

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 난자활성화 유기시 전장(120 V/mm vs 150 V/mm)에 따른 통계적인 차이는 120 V/mm 처리군이 유의하게 높게 나타났다.

또한, 다음 표 2에는 상기 제 6공정에서 활성화전 인산완충액내 유기시간을 각각 1시간, 2시간, 4시간, 6시간으로 하였을 때, 복제수정란의 배반포기까지 체외발달율에 대한 차이를 보여주고 있다.

상기 표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 1 및 2시간 동안 배양한 다음 전기자극을 부여하여 활성화를 유도하였을 때 핵치환된 수정란의 배반포기까지의 발달율은 각각 10.1±1.6%, 11.3±2.3%로, 4 및 6시간의 6.9±2.2%, 8.1±3.3%보다 높았다.

또한, 배반포의 평균 세포수도 1 및 2시간 처리군이 각각 29.7±10.3, 30.4±10.4로서, 4시간 처리군의 24.6±10.1 및 6시간 처리군의 16.5±7.4보다 높았다.

비교예 1

상기 실시예 1의 6단계 즉, 2차 전기자극을 부여하는 단계를 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 나머지 단계만을 실시하였다. 그 결과, 돼지 체세포와 핵이 제거된 난자의 융합율은 69.7%(212/304)로 나타났으며, 핵치환된 복제수정란의 배반포기까지의 체외 발달율은 5% 미만으로 나타났다.

실시예 2

상기 실시예 1의 두 번째 단계에서 수란난자를 골라내고, 나머지 난구세포가 함유된 용액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거한 후 침전물을 인산완충액에 부유시켰다. 이와 같이 하여 공여세포로 난구세포를 준비하였다. 그리고, 상기에서 준비한 난구세포를 대상으로 공여세포 준비과정을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 복제실험을 실시하였고, 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.

상기 표 3의 결과에서 보여지듯이, 난구세포와 핵이 제거된 난자의 융합율은 66.8%, 이들 핵치환 복제수정란의 난할율은 70.6±9.9, 배반포기까지의 발달율은 9.9±2.4%이었으며, 배반포의 평균 세포수는 28.9±11.4개로 태아섬유아세포를 복제했을 때와 유사한 성적을 얻었다. 따라서, 난구세포로도 돼지 체세포 복제수정란을 생산할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 성숙된 난자를 대상으로 분화가 이루어진 체세포의 핵을 치환한 후 전기 자극에 의해 융합을 유도하고, 1 ∼ 6시간 정도 난자의 재구성 시기를 부여한 다음 재차 2차 전기자극을 주어 활성화시킴으로써, 핵치환된 돼지 복제수정란의 체외발달율을 현저히 개선시켜 핵치환 수정란이 착상 전단계인 부화 배반포기까지 최대 11.3±2.3%의 발달율과 평균 배반포 세포수 30.4±10.4개까지 얻을 수 있었다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 아직까지 성공하지 못한 돼지복제의 필수적인 단계인 착상단계로 진입할 수 있는 결정적인 방법으로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 인공장기용 형질전환동물의 개발 등을 하는 데에도 활용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (5)

1. 핵이 제거된 성숙된 난자와 분화가 이루어진 체세포 유래 핵을 1차 전기자극으로 융합유도시켜 체세포 핵치환 복제수정란을 재구성하는 공정 및

   상기 재구성된 복제수정란에 2차 전기자극으로 120 ∼ 150 V/mm의 전장을 부여하여 활성화시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 체세포 핵치환 복제수정란의 대량 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 체세포는 인간을 제외한 포유동물로부터 회수하여 얻어진 태아섬유아세포, 난구세포 중에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지, 소, 양, 마우스인 것을 특징으로 하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 재구성 시기는 1 ∼ 6 시간인 것을 특징으로 하는 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법.
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