KR100416120B1

KR100416120B1 - 천연물로부터 분리한 신규 리그난계통의 항종양 물질

Info

Publication number: KR100416120B1
Application number: KR1019970060255A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 임영희; 신동혁; 임문정; 이덕근
Original assignee: 동화약품공업주식회사
Priority date: 1997-11-15
Filing date: 1997-11-15
Publication date: 2004-05-07
Also published as: KR19990039985A

Abstract

본 발명은 전호(Anthriscus sylvestris HOFFMANN, Umbelliferae)에서 분리한 리그난 계통의 신규 화합물로서 항종양 활성이 우수한 다음 화학식 1의 안젤로일 포도필로톡신(Angeloyl podophyllotoxin) 및 그 추출방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

Description

천연물로부터 분리한 신규 리그난계통의 항종양 물질

본 발명은 전호(Anthriscus sylvestris HOFFMANN, Umbelliferae)에서 분리한 리그난(lignan) 계통의 신규 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 전호의 뿌리에서 분리한 항종양 활성을 갖는 다음 화학식 1의 안젤로일 포도필로톡신(Angeloyl podophyllotoxin) 및 이 물질의 추출방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

악성 종양 치료를 위한 다각적인 치료 방법이 개발되고 있으며 수술요법, 방사선요법과 같은 국소요법과, 화학요법 및 면역요법 등의 전신요법 등이 사용되고 있는데, 이 중 항암 화학요법은 생존율을 높이는 데 큰 역할을 하고 있다. 그러나 화학요법제들은 암세포 뿐만 아니라 골수세포와 같이 활발히 분열하는 세포에 대해 독성 및 부작용이 강하여 빈혈이나 기타 진균 등의 기회 감염증과 소화기장애, 신장애 등을 유발시키는 문제점이 있다.

새로운 작용, 골격구조를 갖는 화합물과 독성 및 부작용이 적은 신물질이 합성 화합물보다는 전통적으로 사용해온 천연물에서 발견될 가능성과 확률이 매우 높기 때문에 천연물, 특히 생약으로부터 신약을 창출하려는 시도가 공통된 연구 추세이며, 이러한 시대적 흐름에 부응하여 본 발명자들은 연구에 착수하게 되었다.

전호는 유럽과 아시아 대륙에서 야생하는 다년생 초본으로 어린 잎은 식용하며, 그 뿌리를 우리나라에서는 전호라 하여 이것을 끓여 만든 전제는 천식, 타박상및 부종의 치료에 사용하여 왔다.

본 발명자들은 이러한 전호의 헥산 및 클로로포름 추출물이 인간 종양세포주에 대해 세포독성이 있음을 발견하고 일련의 용매추출법과 크포마토프래피를 이용하여 활성을 가진 물질을 추적한 결과, 동물(쥐)의 암세포에 대해 세포독성이 있는 것으로 공지된 화합물인 안쓰리신(Anthricin) 뿐만 아니라 다른 천연물의 성분으로 공지된 화합물인 몰렐레신(Molelensin), 팔카린디올(Falcarindiol) 및 부르세헤르닌(Bursehernin)과 함께 리그난 계통의 신규 화합물인 안젤로일 포도필로톡신(Angeloyl podophyllotoxin)을 분리하였다. 또한 이 물질들의 인간 종양세포주에 대한 활성을 검정한 결과, 활성이 우수한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 안젤로일 포도필로톡신의 모핵인 포도필로톡신은 항암활성이 있으나 독성이 매우 강한 화합물로서 의약으로 개발될 수 없는 화합물로 알려져 있다. 일찍이 이러한 문제를 해결하기 위하여 많은 유도체들의 개발이 이루어졌으며, 이에 의해 에토포사이드 등이 개발된 것도 잘 알려져 있으나 안젤로일기를 갖는 유도체는 아직 알려지지 않았다.

암의 발생은 내부적 또는 외부적인 원인에 의해 정상세포의 DNA가 체세포 변이를 일으키면서, 유전적 이상이 생긴 세포가 복제되고 이때 여러 가지 요인들 즉, 호르몬이나 화학물질에 의해 유전적 이상이 촉진되고 유전자의 발현 양상이 바뀌어 증식하기에 좋은 조건의 세포들이 우선적으로 선택되어 자라면서 세포의 이상증식이 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 암 치료는 비정상적인 증식을 하는 암세포를 정상세포와 구별하여 선택적으로 파괴하는 방법인, 화학요법(chemotherapeutics : 항암제(anticancer))과 발암물질(carcinogen)에 노출되어 발암현상(carcinogenesis)이 시작되고(initiation), 촉진되는(promotion)단계에서 더 이상의 진행(progression)을 차단하는 화학억제법(chemoprevention)으로 대별될 수 있다. 항암제로 사용할 수 있는 화합물 중 현재 임상에서 사용하고 있는 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxurubicin), 에토포사이드(etoposide) 등의 항암제들과 화학억제제(chemopreventive agent)로서 각광을 받고 있는 물질인 레티노이드류(retinoid), 비타민류(vitamin), 폴리페놀(polyphenol), 플라보노이드(flavonoid) 등은 천연물로부터 개발된 물질들이다. 천연물에서 항암 화학억제제(anticancer chemopreventive agent)를 개발하기 위한 실험적 접근법은 활성 추적 분획법(bioassay-directed fractionation)이다. 다양한 경로로 선택된 식물 추출물을 적절한 활성계(bioassay system)에서 시험한 후 활성을 보이는 분획의 성분연구에 들어가 분획(frationation)한 후 같은 검색계(assay system)에서 활성을 따라가며 분리한 물질은 그 물질 자체로나 선구물질로서 중요한 역할을 할 수 있다.

본 발명의 출원인들은 MTT 검색법을 생물검색계(bioassay system)로 이용하여 200여종의 식물추출물의 활성을 측정한 결과 전호 추출물에서 높은 활성을 나타냈다. 전호를 연구재료로 선정한 후 생물검정 추적 분획법(bioassay-directed fractionation)방법으로 활성물질 안젤로일 포도필로톡신(angeloylpodophyllotoxin)이라는 리그난계 신물질을 분리 정제하였다. 이 신물질은 현재 임상에 사용되는 독소 루비신 및 에토포사이드(etoposide)와 MTT 검색법으로 활성을 측정한 결과 동등이상의 활성을 나타내어 항암제로서 높은 개발 가능성이 기대된다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연물인 전호로부터 추출한 신규 리그난계의 상기 화학식 1의 화합물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물의 추출방법을 제공하는 것이다.

도 1은 화합물 V의 결정된 구조를 나타낸 그림이다.

도 2는 화합물 V의 HMQC 및 HMBC스펙트럼에서 얻어진 C-H을 상관을 나타낸 그림이다.

도 3은 화합물 V의 NOESY 상관을 나타낸 그림이다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

전호로부터 활성물질의 분리정제

세절한 전호의 뿌리를 냉각순환장치가 달린 추출기를 사용하여 메탄올로 5회 추출하였다. 메탄올 추출액을 헥산, 클로로포름, 아세트산에칠, 부탄올 및 물로 용매 분획한 다음 추출액 및 분획물의 인간 종양 세포주에 대한 세포독성 시험을 하였다. 여기서 얻어진 활성분획을 실리카겔, 세파덱스 및 RP-18 등을 이용하여 크로마토그래피로 정제하여, 시험관내 세포독성을 더블(double)간격으로 암세포 균주에 대하여 MTTT검색법으로 세포독성시험 결과 항종양물질 5종이 존재함을 알 수 있었으며, 분취용 고성능 액체크로마토 그래피(prep HPLC)에 의해 전술한 5종의 항종양 물질을 정제하였다.

화합물의 구조결정

본 발명의 항종양 물질 중 화합물 V (Angeloyl podophyllotoxyl)의 구조는질량(mass) 분광기, 적외선(IR)분광기, 2D 핵자기공명(NMR)에 의해 결정되었으며, 이 화합물의 분광학적 성상은 다음과 같다.

C₂₇H₂₈O₉, IR ν_maxcm_-1: 2923(C-H strech), 1774(C=O), 1712(C=O), 1488(C=C aromatic ring), 1234(C-O), 1126(C-O)

이 물질의 선광도

는 -109.1(클로로포름)의 값을 갖는다.

¹H-NMR에서 공지의 포도필로톡신에 의한 피크(참조 : C.Fred Brewer at al., J. Medicinal Chwmiarey, 22, 1979, 215∼221)인 세 개의 메톡시(3.68 및 3.73 ppm)외에 안젤산에 의한 특징적인 2개의 메틸기(1.86 및 1.96 ppm)와 3급 탄소에 결합된 수소(6.14 ppm)가 확인되었다.

이 화합물의 전체적인 구조는¹³C-NMR과 2차원 NMR인¹H-¹H COSY,¹H-¹³C HMQC,¹H-¹³C HMBC 실험에 의해서 확인되었으며 입체구조는 수소의 짝지움 상수 값과 NOESY실험에 의해서 결정되었다. 또한 (Z)-2-메틸-2-부테노익산(안젤산)과 이성체인 (E)-2-메틸-2-부테노익산(티글린산)과의 구별은 NOESY 실험에서 2개의 메틸기 사이에 서로 NOE 신호가 없는 것으로 확실히 확인되었다.

[실시예]

이하 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한 되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

전호로부터 활성물질의 분리정제

식물 분류학적으로 검정된 미나리과(Umbelliferae)의 전호는 상업적으로 입수하였다. 잘게 썰어 말린 2kg의 전호 뿌리를 냉각기가 달린 추출기를 사용하여 메탄올을 추출용매로 5회 이상 추출하였다. 메탄올 추출액을 온시에 여과한 후 40℃ 이하에서 적당히 감압 농축하여 침전물을 형성케 하였다. 농축액을 여과한 후 침전물을 재결정을 반복하여 화합물 I 을 얻을 수 있었으며, 여액은 거의 완전 농축하여 물에 현탁시킨 다음 현탁액을 헥산, 클로로포름, 아세트산에칠 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 용매 분획하였다. 분획물중 헥산 및 클로로포름 분획물에서 활성을 나타내었으므로, 각 분획물을 실리카겔 및 RP-18을 이용하여 칼럼 클로마토그라피(C.C)를 실시하였다. 헥산 분획물은 실리카겔을 써서 C.C를 실시하여 18개로 분획하였다. 용출 용매는 헥산과 아세트산에칠을 사용하여 용매구배로 실시하였다(헥산:아세트산에칠=10:0→0:10). 이중 22번 Fraction을 MPLC(Medium Pressure Liquid Chromatography), VCC(Vaccum Column Chromatography) 및 prep HPLC를 이용하여 활성물질의 분리정제를 시도한 결과 화합물 Ⅱ를 얻었다. 또한 24번 분획(Fraction)을 MPLC, VCC 및 prep HPLC를 이용하여 활성물질의 분리정제를 시도하여 화합물 Ⅲ을 얻었다.

클로로포름 분획물은 실리카겔을 이용하여 칼럼크로마토그라피로 31개로 분획(fractionation)하였다. 용출 용매는 헥산과 아세트산에칠을 사용하여 용매구배로 실시하였다(헥산:아세트산에칠=10:1→0:10). 이중 22번 분획을 MPLC, VCC 및 prep HPLC를 이용하여 활성물질을 분리 정제한 결과 화합물 Ⅳ, 화합물 V를 얻을 수 있었다. 얻어진 활성물질들은 화합물 Ⅰ은 안쓰리신(Anthricin), 화합물 Ⅱ는 팔카린디올(Falcarindiol), 화합물 Ⅲ은 몰렐렌신(Molelensin), 화합물 Ⅳ는 부르세헤르닌(Bursehernin)으로 4종의 기지물질과 화합물 V는 안젤로일 포도필로톡신(Angeloyl podophyllotoxin)으로 본 발명이 목적하는 신물질이었다.

[실시예 2]

암세포에 대한 세포독성 시험

전호 추출액, 용매분획물 및 정제된 항종양물질에 대한 시험관내 세포독성을 더블(double)간격으로 암세포균주에 대하여 MTT 검색법으로 측정하였다. MTT법은 생존세포의 미토콘드리아 석시네이트 디하이드로게나제에 의해 MTT 가 포르마잔 결정으로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하여 이로부터 항암제에 의해 세포가 사멸 또는 증식억제되는 정도를 결정하는 실험법으로, 암세포의 성장을 50% 억제하는 각 시험약물의 농도(IC₅₀)를 구하여 에토포사이드 및 독소루비신과 세포독성을 비교하였다. 각각의 시험약물을 DMSO(디메틸설폭사이드)에 20mg/ml 의 농도로 용해시키고 0.22㎛ 필터로 여과한 후 , RPMI 1640 배지를 사용하여 40㎍/㎖에서 0.00256㎍/㎖까지 공비를 5로 하여 적정농도로 희석하여 사용하였다. 본 시험에는 A549 인간폐암세포, K562 인간혈액암세포, 및 Colo205인간대장암세포가 실험용 암세포로 사용되었다. RPMI 1640 배지에 현탁된 각각의 암세포의 현탁액 100㎕(10,000 세포/웰)를 96 웰 마이크로플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO₂에 24시간 동안 배양한 후 각 웰에 상기에서 희석한 시험약물 100㎕를 최종 약물농도가 20㎍/㎖에서 0.00128㎍/㎕가 되도록 가하고 대조군에는 동량의 RPMI 1640 배지를 접종하였다. 여기에서 세포배양에는 10%(V/V) 소태자혈청, 페니실린, 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640배지를 사용하였다. 암세포를 72시간 동안 약물에 노출시킨 후 각 웰에 MTT 용액(2㎎/㎖식염수 용액)25㎕씩을 첨가하고, 다시 4시간 동안 배양한 후 원심분리(1,000rpm,10분)하여 상등액을 제거하고 생성된 포르마잔 결정을 100㎕의 디메틸설폭사이드에 용해시켰다. 이를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 비해 암세포의 성장을 50% 억제시키는 시험약물의 농도(IC₅₀)를 계산하였다.

MTT 검색법에 의한 화합물들의 인체 암세포에 대한 세포독성의 실험결과는다음 표 1과 같다. 에토포사이드 및 독소루비신을 대조약물로 이용하였다.

[실시예 3]

화합물 V의 구조결정

적외선(IR) 분광기 측정시 시료는 클로로포름에 녹여 KBr판에 얇게 도포하여 측정 하였으며, 선광도는 이 물질 27.5mg을 클로로포름 10ml에 녹여 20℃에서 측정하였다. 400MHz(1H)와 100MHz(¹³C)의 NMR 스펙트럼을 측정하였고 각 피크의 화학 이동값(chemical shift)을 잔류용매인 클로로포름의 화학이동값(7.2ppm, 77.0ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다.

본 발명에서 무정형의 고체로 얻어진 이 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같다:

EIMSm/z(%rel.int) : 496[m]⁺(100.0), 397[M-C₅H₇O₂(angelic acid)]+(14.34), 263(8.7), 229(7.9), 185(22.5), 168(15.6), 135(7.6), 83(17.27), 55(18.86)

C₂₇H₂₈O₉, IR ν_maxcm^-1: 2923, 1774, 1712, 1488, 1234, 1126

선광도

: -109.1(클로로포름)

¹H-NMR 스펙트럼 데이터를 표 2 및 표 1에 나타내었다.

본 발명의 포도필로톡실안젤산 에스테르의 전체적인 구조는 공지의 포도필로톡신[참조 C. Fred Brewer at al., J. Medicinal Chemistry, 22, (1979), 215∼221]의 분석 결과와¹H-¹H COSY, NOESY, HMQC, HMBC 실험 결과에 의해서 결정되었다. 도 1에 결정된 구조를 나타내었다.

이 물질의 HMQC 및 HMBC에서 관찰된 모든 결과는 도 1에 도시된 구조와 잘일치하였고, HMBC 스펙트럼으로부터 얻어진 상관된 C-H를 도 2에 표시하였다.

H-1과 H-2의 짝지움 상수값이 J=4.4Hz로서 이들 수소는 eclipsed cis 형태를이루고 있고 H-2와 H-3은 J=14.7로서 서로 anti trans의 형태, H-3과 H-4는 J=9.1로서 서로 anti trans의 형태를 이루고 있음을 알 수 있었다. 또한, NOESY 실험에서 Me-4"와 Me-5"간의 상관 신호가 없는 것으로 보아 두 메틸기는 서로 trans 형태를 이루고 있는 것으로 확인되었으며 도 3에 NOE 신호와 함께 입체적 구조를 나타내었다.

[실시예 4]

급성독성시험

상기 실시예에서 얻은 화합물을 가지고 마우스에 대한 독성실험을 행하였다. 화합물을 0.5% Na-CMC에 현탁시켜 상기에서 분리한 동물군(군당 5마리)에 각각 투여한 후 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다. 이때, 화합물은 1g/kg, 500mg/kg, 250mg/kg, 125mg/kg 및 62.5mg/kg의 5단계로 투여하였다. 그 결과, 화합물들의 50% 치사량(LD₅₀)은 1g/kg이었다.

따라서, 본원 발명에 따른 화합물은 독성이 거의 없어서 매우 안전한 약물로 확인되었다.

본 발명에 따른 화합물은 현재 임상에 사용되는 대조약물들과 비교하여 동등 이상의 활성을 나타내며 천연물에서 추출된 물질로서 그 독성이 없어서 새로운 항암제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

다음 화학식 1의 화합물.

[화학식 1]
세절한 전호의 뿌리를 메탄올로 추출하고 이 추출액을 클로로포름으로 분획하고 크로마토그라피로 정제하여 다음 화학식 1의 화합물을 추출하는 방법.

[화학식 1]